Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма протонирования вторичного хинонного акцептора в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гопта, Оксана Александровна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Гопта Оксана Александровна

Изучение механизма протонирования вторичного хинонного акцептора в реакционных центрах

КНОООВАСТЕЯ 8РНАЕЯОЮЕ8

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д. б. н. А.Ю.Семенов

Москва - 1999. г.

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................... 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Фотосинтетический циклический перенос электронов у пурпурных бактерий.......................................................................................... 8

1.2. Структура реакционных центров ЛЬ. зркаего1ёез ................................ 12

1.2.1. Строение РЦ..............................................................................................................................................................12

1.2.2. Структура сайта связывания Од..........................................................................................................17

1.2.3. Структура сайта связывания Ов..........................................................................................................17

1.2.4. Связывание ингибиторов переноса электронов в сайте (^в РЦ..........................19

1.2.5. Молекулы воды в структуре РЦ........................................................................................................20

1.3. Электрохимические свойства хинонов..........................................................................................23

1.4. Перенос электронов и протонов в РЦ пурпурных бактерий................................27

1.4.1. Цикл восстановления хинона..........................................................................................................27

1.4.2. Двухтактные колебания концентрации семихинона ..........................................29

1.4.3. Взаимодействие семихинонов с экзогенными акцепторами....................................31

1.4.4. Рекомбинация зарядов с хинонных акцепторов на окисленный пигмент 32

1.4.5. Перенос первого электрона от ^на Ов................................................................................34

1.4.6. Перенос второго электрона от О)А"_ на ............................................................................39

1.4.7. Поглощение протонов РЦ в ответ на освещение................................................................43

1.4.8. Корреляция между кинетиками переноса электронов и поглощения протонов..................................................................................... 45

1.4.9. Обмен и (3Н2 с хинонами пула................................................... 46

1.5. Влияние направленного мутагенеза на кинетику переноса протонов и электронов......................................................................................47

1.5.1. Мутации, влияющие на перенос протонов........................................ 48

1.5.2. Мутации, не влияющие на перенос протонов.................................... 51

1.6. Электрогенные реакции при функционировании РЦ.......................... 52

1.7. Проблематика изучения РЦ........................................................... 53

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 55

2.1. Выращивание несерных пурпурных бактерий ЯНойоЬасЬег зркаегогёез и КкойоЬасЬег сарзиЫЬт...................................................................... 55

2.2. Выделение хроматофоров.............................................................. 55

2.3. Спектрофотометрические измерения............................................... 57

2.4. Регистрация светоиндуцированной кинетики генерации трансмембранного потенциала в хроматофорах........................................................... 61

2.5. Кинетический анализ сигналов....................................................... 64

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 65

3.1. рН-зависимость константы равновесия (реакции

Ра* Ов о ОаОв' в РД хроматофоров с убихиноном-50 и децил-убихиноном в качестве хинонного акцептора <3В............................... 65

3.1.1. Определение ЬАВ с помощью импульсной спектрофотометрии.............. 65

3.1.2. Определение Ьдв с помощью прямого электрометрического метода........ 68

3.1.3. Чем определяется характер рН-зависимости Ьдв................................ 75

3.2. Определение оптимальных концентраций ингибиторов для электрогенных фаз В1 и В2........................................................... 76

3.3. Корреляция между кинетиками переноса второго электрона (к2дв) > электрогенного поглощения протонов (Дувг) и защелачивания среды в ответ на вторую вспышку света...................................................... 76

3.3.1. Влияние рН-буфера на кинетику электрогенной фазы В2.................... 80

3.3.2. Влияние рН-буфера на кинетику ответа рН-красителя........................ 82

3.4. Возможный механизм обмена протонов между Ов-сайтом РЦ хроматофоров ИЬ. зркаего1ёез и внешней водной фазой.................... 84

3.5. Зависимость кинетики электрогенной фазы В1, сопряженной с переносом первого электрона (С}а* Ов ОаОв" X от рН и температуры................................................................................ 91

3.5.1. Перенос первого электрона между хинонными акцепторами................. 91

3.5.2. Чем определяется перенос первого электрона?................................... 95

3.5.3. Какое рКтемн у остатка С1и-Ь212 в РЦ?............................................ 98

3.6. Влияние температуры, рН и ионной силы на электрогенное поглощение протонов при восстановлении Ов'" (Оа" Ов* ** РаОвНЬ)................. 98

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................... 112

5. ВЫВОДЫ ....................................................................................... 113

6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 114

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

РЦ - фотосинтетический бактериальный реакционный центр

Р, Р870 - специальная пара, димер бактериохлорофилла а, первичный донор

электронов

БФео. - бактериофеофитин

БХл - мономерный бактериохлорофилл а

ЭТЦ - электронтранспортная цепь хроматофоров

ФС I - реакционные центры фотосистемы 1 растений и цианобактерий

ФС II - реакционные центры фотосистемы 2 растений и цианобактерий

Ы11, ЬН2 -1-й и 2-й светособирающие антенные комплексы хроматофоров (), и(} - убихинон-50 (коэнзим (^ю, 2,3-диметокси-5-метил-б-декаизопренил-

1,4-бензохинон)

с1() - децил-убихинон (2,3-диметокси-5-метил-6-децил-1,4-бензохинон)

(^Н2 - убихинол

О а" " окисленная и восстановленная одним элетроном (анион семихинона) формы первичного хинонного акцептора,

Ов, 0в* > 0в2> ОвН > ОвНз - окисленная форма, восстановленная одним

электроном, протонированный радикал семихинона, дважды восстановленная непротонированная форма, дважды восстановленная частично протонированная и полностью восстановленная протонированная форма (хинол) вторичного хинонного акцептора

Д^АВ1 " изменение свободной энергии при переносе 1-го электрона между

хинонами (Оа/Оа" и Ов/Ов")

■^ав1 - константа равновесия переноса первого электрона между хинонными

акцепторами ()а и (^в

М1 - кажущаяся константа равновесия для кинетически сопряженной

реакции присоединения второго электрона и первого протона к <3в*~ М - константа равновесия суммарного процесса восстановления,

протонирования и диссоциации хинона после второй вспышки света. АцН+ - трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода

А\[/ - трансмембранная разность электрических потенциалов, одна из

составляющих Д|дН+

Ет - стандартный потенциал полувосстановления (в мВ, относительно

стандартного водородного электрода)

Еь - кажущийся окислительно-восстановительный потенциал среды

р.Кгемн, рКсвет - значения рК аминокислотного остатка, когда в сайте связывания О в находится хинон в полностью окисленном состоянии и в виде аниона семихинона соответственно

АрК - изменение кажущегося рК группы (рКсвет - рКтеМн)

т - характеристическое время релаксации переходного процесса

9 - интервал времени между 1-й и 2-й вспышками света

5 - скорости обмена в сайте связывания <3в

А1, А2, В1, В2 - амплитуды кинетических фаз удь Уа2> ¥въ Ч'вз

Н+1, Н+п - первый и второй протоны при восстановлении (^в

кдв1, кАв2 - наблюдаемые константы скорости переноса 1-го и 2-го электрона

кн1, кц2 - наблюдаемые константы скорости захвата протона в ответ на 1-ю

и 2-ю вспышки

квь кв2 -наблюдаемые константы скорости кинетических фаз \|/bi и \|/в2

кдр, квр - наблюдаемые константы скорости рекомбинации зарядов между Р+ и Qa'~, и Р*+ и Qb'~

pi -значение рН в изоэлектрической точке белка РЦ

CAPS - З-циклогексиламино-1-пропансульфоновая кислота

CHES - 2-[циклогексиламино]этансульфоновая кислота

MES - 4-морфолинэтансульфоновая кислота

MOPS - 3-[М-морфолино]-пропансульфоновая кислота

HEPES - 4-[2-гидроксиэтил]-1-пиперазинэтансульфоновая кисолта

Tris-HCl - М-трис-[гидроксиметил]-аминометан

ЛДАО - лаурилдиметиламиноксид

МС - метиленовый синии

ТМФД - М,1Ч,1\Г',№-тетраметил-р-фенилендиамин

дМФ - диметилферроцен.

ферроцианид - гексоцианоферрат(П) калия

БКП - бромкрезоловый пурпурный

НК - нейтральный красный

КК - крезоловый красный

ИК - инфрокрасная спектроскопия

КД - круговой дихроизм

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ДЭЯР - двойной электронно-ядерный резонанс

-6-

ВВЕДЕНИЕ„

Фотосинтетические реакционные центры (РЦ) пурпурных бактерий представляют собой мембранные пигмент-белковые комплексы, в которых осуществляется фотоиндуцированное разделение зарядов, сопряженное с восстановлением хинонных акцепторов (Од и С^в), и генерация трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода (ДрН+). Основным результатом работы РЦ является образование разности электрических потенциалов на сопрягающей мембране (Д\|/) и восстановление убихинона О в до убихинола (ОвНз), универсального переносчика протонов и электронов в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) бактериальных хроматофоров, митохондрий и тилакоидов хлоропластов. В дальнейшем ОНг диссоциирует в мембранный пул хинонов и окисляется убихинолщитохром-с^-оксидоредуктазой (цитохромным 6с/-комплексом) до хинона в ходе Q-циклa, предложенного П. Митчелом. Этот процесс сопровождается переносом двух протонов с цитоплазматической на периплазматическую сторону хроматофорной мембраны и поступлением электронов в ЭТЦ. Таким образом, протонирование (}в можно рассматривать как важный этап в процессе образования Д|Ш+, играющего роль интермедиата в процессе синтеза АТФ.

Фотоактивация РЦ приводит к разделению зарядов и трансмембранному переносу электрона от димера бактериохлорофилла а (Р) через ряд акцепторов (мономерный бактериохлорофилл а - БХл, бактериофеофетин а - БФео и первичный хинонный акцептор (}А) на вторичный хинонный акцептор <2в-Фотоактивация РЦ вторым квантом света приводит к образованию дважды восстановленного хинона. Этот процесс кинетически сопряжен с присоединением к нему двух протонов из водной фазы с цитоплазматической стороны. Весь процесс восстановления в РЦ можно свести к двум уравнениям:

1-я вспышка: дА<Зв -» <2а'"Ов ОаРеГ (1)

2-я вспышка: 0а'~0в'~ + 2Н+ о ОаОвНз о 0а + 0Н2 (2)

Перенос первого электрона между хинонами(с ()А на Ов) осуществляется с характерным временем ~ 50 мкс (хроматофоры ШюйоЬасЬег sphaeroid.es, рН 4 -10), что приводит к образованию кинетически стабильного семихинона Ов' -Кинетика этой реакции не зависит от величины движущей силы (Дв^в) между редокс-парами (Оа/Оа* ) и (Ов/Ов'~)> как было показано экспериментально при варьировании среднеточечного потенциала пары (Оа/Оа' ) [Graige et а1., 1998], что позволило сделать вывод о лимитировании кинетики образования (За*~

конформационными изменениями белка РЦ.

Скорость переноса второго электрона между хинонами осуществляется с х ~ 100 мкс (хроматофоры Rb. sphaeroides, pH 7.0) и зависит от pH [см. обзоры: Shinkarev and Wraight, 1993; Okamura and Feher, 1995]. Кинетика этой реакции чувствительна к изменению ДСдв® между редокс-парами (Qa/Qa°") и ( Qв"" / QßH2) и лимитируется переносом электрона в широком диапазоне pH [Graige et al, 1996].

Значительный прогресс в изучении бактериальных РЦ обусловлен проведением рентгеноструктурного анализа кристаллов РЦ из пурпурных бактерий Rhodopseudomonas fno новой номенклатуре Blastochloris) viridis [Deisenhofer et al., 1984; Lancaster and Michel, 1997] и Rb. sphaeroides [Allen et al., 1986; Chang et al., 1986; Stowell et al., 1997] с атомным разрешеним. Было показано, что хшгошше акцепторы Qt\ и Qb локализованы с цитоплазматической стороны РЦ на расстоянии ~ 15 А от поверхности белка и напрямую не контактируют с водной фазой, С помощью направленного мутагенеза было показано, что замена вблизи Qb таких аминокислотных остатков, как Ser-L223, Glu-L212 и Asp-L213 (расположенных в L-субъединице РЦ) на непротонируемые приводит к существенному замедлению кинетики протонироваиия Qb [Shinkarev and Wraight, 1993; Okamura and Feher, 1995]. Это позволило рассматривать вышеперечисленные остатки в качестве непосредственных участников протон-переносящих цепочек в процессе протонироваиия Qb-

В данной работе основное внимание уделено кинетическим и термодинамическим особенностям образования QII2 в процессе функционирования РЦ хроматофоров Rb. sphaeroides. Изучение влияния таких параметров, как температура, pH, ионная сила и буферная емкость на реакции с участием протонов, вносит значительный вклад в понимание механизма восстановления Qb- Процесс переноса электронов и протонов к хинонным акцепторам РЦ сопровождается генерацией разности электрических потенциалов (Avj/) на сопрягающей мембране хроматофоров, что позволяет изучать эти процессы с помощью прямого электрометрического метода. Важным подходом является также сопоставление кинетических параметров внутрибелковых электрогенных процессов за время одного каталитического оборота белка РЦ с известными данными рентгеноструктурного анализа и традиционной импульсной спектрофотометрии, а также использование кинетического анализа и моделирования для описания процесса кинетического сопряжения переноса электронов и протонов, а также

генерации А\|/ при восстановлении Qg.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Фотосинтетический циклический перенос электронов у пурпурных бактерий.

В зависимости от природы соединений, предпочтительнее используемых в качестве доноров электронов и источников углерода, различают 4 семейства фототрофных бактерий:

1) Rhodospirillaceae (пурпурные несерные бактерии),

2) Chromatiaceae (пурпурные серные бактерии),

3) Chloroflexaceae (зеленые несерные бактерии),

4) Chlorobiaceae (зеленые серные бактерии).

Представители первых трех семейств синтезируют реакционные центры, структурные и функциональные свойства которых гомологичны и сходны с ФС II высших растений и цианобактерий, в которых в качестве акцепторов электронов выступают хиноны. Убихинон-50 обнаружен у всех групп пурпурных бактерий, но некоторые, в основном облигатные анаэробы, содержат также менахинон. У Rhodospirillum rubrum и ряда других бактерий обнаружен родохинон (аминохинон). Как было показано [см. обзор Parson, 1978], на один РЦ приходится в среднем ~ 25-30 молекул хинона, что сильно зависит от условий выращивания бактерий. РЦ представителей четвертого семейства гомологичны и сходны с ФС I высших растений и цианобактерий, у которых в качестве акцепторов электронов функционируют низкопотенциальные железо-серные кластеры (Fe-S)n. Среди семейства Rhodospirillaceae наиболее изученными являются такие виды, как Rb. sphaeroides, Rps. viridis, Rhodospirillum rubrum и Rhodobacter capsulatus.

По типу метаболизма представителей семейства Rhodospirillaceae относят к фотоорганогетеротрофам и факультативным микроаэрофилам. Эти бактерии могут расти на свету при полном анаэробиозе (фотогетеротрофный рост) и аэробно в темноте (органогетеротрофный рост). Оба типа роста встречаются в экологических нишах, характерных для этих бактерий. В качестве Н-доноров эти бактерии обычно используют восстановленные соединения серы (включая саму S) или Н2 и органические субстраты, в качестве источника углерода - в основном органические субстраты (например, сукцинат и малат). Эти бактерии способны также к ассимиляции С02 и фиксации молекулярного азота (диазотрофия). В дальнейшем будут рассматриваться только грамотрицательные пурпурные несерные бактерии на примере Rb. sphaeroides.

Фотосинтетический аппарат Rb. sphaeroides организован в виде внутриплазматической мембранной системы, образующейся в результате инвагинаций цитоплазматической мембраны, а также в виде отшнуровавшихся от нее мембранных пузырьков. Мембранные фрагменты представляют собой замкнутые везикулы (хроматофоры), диаметром ~ 30-100 нм по данным электронной микрофотографии [Драчев и др., 1979], с одинаково ориентированными фотосинтетическими комплексами - донорной частью (Р) внутрь хроматофоров (на периплазматичес.кую сторону мембраны), акцепторной частью (сайтами связывания хинонов) - на внешнюю сторону хроматофоров (на цитоплазматическую сторону мембраны). Такую ориентацию имеют не менее 97 % хроматофоров [Lommen and Takemoto, 1978]. По линидному составу мембрана хроматофоров Rb. sphaeroides состоит в основном из фосфатидилэтаноламина (40-45.%), фосфатидилглицерола (30-35 %) и фосфатидилхолина (15-20 %). В разных штаммах этих бактерий отмечено присутствие минорных количеств других липидов, например, кардиолипина, N-ацилфосфатидилсерина и др. [Говинджи, 1987].

Хроматофоры являются наименьшей фотосинтетической единицей, в которой осуществляются процессы сопряжения трансформации световой энергии, образования трансмембранной разности элетрохимических потенциалов (ДцН+) и ее потребление. Несложность выделения, высокая стабильность делают хроматофоры удобным объектом не только для изучения РЦ, но и функционирования других

nadh/nair

Н+

SucH/FumH Н+

адф/атф к

Н2ОЮ2 Н+

f ¡"л / л

»

IV (qox) 1 1

(сох) 1 1

V

Н+

в

©

Рис. 1. Схема электрон-транспортной цепи сопрягающей мембраны хроматофоров кЬ. зр1гаег01^е.ч. Символами обозначены: I - N Л О Н - С о О - р е д у к т аз а ( N А О Н - д е г и р о г сн аз а, комплекс I), II - сукцинат-СоР-редуктаза (сукцинатдегидрогеназа, комплекс II), РЦ -фотосинтетический реакционный центр, III - Со()н2-тштохром с-редукта