Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансмембранный перенос зарядов в фотосинтетических реакционных центрах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Трансмембранный перенос зарядов в фотосинтетических реакционных центрах"

РГБ ОД

1 6 П- г"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

МЛМЕДОВ Махир Джафар оглы

ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ПЕРЕНОС ЗАРЯДОВ

В ФОТОСИНТЕШЧЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

(ОЗ.ОО.М — биологическая химия)

МОСКВА-1995

Диссертационная работа выполнена в отделе биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук В.А. Шувалов доктор биологических наук, профессор P.A. Звягильская

доктор биологических наук П..С. Венедиктов

Ведущая организация: Институт проблем передачи информации РАН

Защита состоится " /I " " е ^ $ " 1995 года в часов на заседании Специализированного биологического Совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: II9899 Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 1995

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Ю.Н. Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Мтуа^ностьл_уе^_и_задата_иссле2ования.

Одним из основных вопросов современного естествознания является изучение фундаментальных вопросов фотосинтеза. Фотосинтез-процесс, с помощью которого растения, цианобактерии и фотосинте-зирукхцие бактерии превращают энергию излучения в энергию химически стабильных соединения. Путь происходящего при этом превращения энергии весьма сложен и осуществляется с участием множества компонентов. Преобразование энергии света в энергию трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода (дн+) является одной из важных проблем в области физико-химической биологии.

Первичное превращение световой энергии на планете происходит в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ), которые с высокой

квантовой (юо%) и энергетической (50%) эффективностью осуществляют разделение зарядов, иницируэдие все последующие биохимические реакции в клетке.

Наиболее изученными на сегодняшний день белковыми генераторами разности электрических потенциалов (дф) являются реакционные центры из пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Для ряда из них получены кристаллы и осуществлен рентгеноструктурный анализ, дающий координаты всех атомов в РЦ.

Сложность устройства реакционных центров говорит о том, сколь непросто обеспечить высокую скорость и высокую эффективность разделения зарядов при фотосинтезе.

Сходство между фотосинтезирукцими бактериями и растениями

оказывается гораздо более глубоким и важным, чем различие между ними. Многие основные представления сформировались в результате сравнительного изучения "бактериального" и "растительного" фотосинтеза.

Параллели между бактериями и растениями существуют на многих уровнях структуры и функции, и только способность к светозависи-мому окислению воды можно считать единственным важным отличием фотосинтеза растений. При этом нельзя забывать, что цианобакте-рии, являнциеся несомненно прокариотами, в отличие от фотосинте-зирувдих бактерий, способны к эффективному выделению кислорода, и в этом по сути не отличимы от высших растений.

Помимо этого, прокариотический тип строения клетки, способность некоторых штаммов к генетической трансформации делают возможным применение методов генной инженерии к цианобактериям, что пока остается сложной проблемой для высших растений.

Целью настоящей работы явилось выяснение молекулярных механизмов генерации мембранного потенциала, сопоставление структуры и функции различных фотосинтетических реакционных центров. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить механизм взаимодействия между фотосинтетическим реакционным центром и цитохромным ьсх-комплексом в хроматофорах;

2. Выявить злектрогенные реакции при переносе зарядов в реакционных центрах зеленых термофильных бактерий сихогоПехиз

аиг&пЫасиз\

3. Определить природу электрогенных стадий при переносе зарядов в реакционных центрах фотосистемы и цианобактерий Апа-

сувЫв i2iduians;

4. Выявить электрогенные стадии при переносе зарядов в реакционных центрах фотосистемы I цианосактерий Anacystis nidulans.

Настоящая работа проводилась в НИИ физико-химической

биологии им. А.Н. Белозерского МГУ с 1984 г.

Наутаая_нощзна_и_научно-прщстотеск На

хроматофорах несерных пурпурных бактерий Uhodobactcr sphaeroides с помощью прямого электрометрического метода проведено исследование электрогенных реакций, связанных с переносом зарядов в комплексах реакционных центров и цитохромных Ьсх-комплексах. Показано, что в окислительных условиях кинетики восстановления цито-хрома ь-561 и образования фазы лц>, отражающей перенос электронов в ьсj-комплексе, не зависят ни от количества функционально-активных ьс1-комплексов, ни от количества образупцегося в РЦ убихинола. Предложена модель, предполагающая существование в мембранах хроматофоров локальных пулов хинонов, обмен между которыми происходит медленнее, чем время восстановления высокопотенциального цитохрома ь-561. Выявлено наличие двух электрогенных стадий в реакционных центрах зеленых термофильных бактерий chiorofiexus aurantiacus, обусловленных: а) разделением зарядов между первичным донором электронов р и первичным хинонным акцептором qa и б) протонированием дважды восстановленного вторичного хинонного акцептора qb< Сделан вывод о том, что н-субъединица не является необходимой в реакции, обусловленной протонированием

Исследование быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов в частицах фотосистемы и (ФС щ из цианобакте-рий Anacystis nidulans показало наличие как минимум трех злектро-генных реакций, обусловленных; а) разделением зарядов между первичным донором электрона peso и хинонным акцептором qa; б) пере-

носом электрона между редокс- активным остатком тирозина (тиро-зин-161 в 01-субъединице) и фотоокисленным рбво+ и в) протониро-ванием дважды восстановленного вторичного акцептора электронов (}в в РЦ ФС и. Показано, что, в отличие от высших растений, в реакционных центрах ФС и цианобактерий низкопотенциальная форма <эА (Ещ< -200 мВ) отсутствует. Показано стабилизирующее влияние глицинбетаина на кислород-выделяицую активность ФС и у циано-бактерий, которое обусловлено предотвращением удаления атомов мп из комплекса окисления воды фотосистемы и. Продемонстрировано, что электрогенные реакции в РЦ фотосистемы I (ФС I) ^lnacystís п1(1и1апБ, обусловлены: а) разделением зарядов между первичным донором электронов Р7оо и железо-серным кластером к,,; б) перено-

л

сом электронов между железо-серными кластерами и р./р_ и в)

л А Ь

восстановлением фотоокисленного Р700+ цитохромом с553.

Все изложенные результаты получены впервые и часть из них подтверждена в позднейших исследованиях ряда зарубежных лабораторий. Полученные данные имеют большое теоретическое значение для выяснения молекулярных механизмов преобразования энергии в биологических мембранах. Они могут также являться основой для создания искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергии, в том числе осуществляпцих фотолиз вода с образованием н2 и

Апробация. Результаты диссертационной работы были доложены на Межреспубликанских школах-конференциях по биоэнергетике (1985-1988), на научных семинарах Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, XVI съезде ФЕБО (Москва, 1984), I Всесоюзной конференции по кинетике переноса электронов в биологических системах и их моделях (Вильнюс, 1985), V Всесоюзном

биохимическом съезде (Киев, 1986), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная биология мембранных комплексов фототрофшх бактерий" (Фрайбург, ФРГ, 1989), 31-ом Симпозиуме японских обществ физиологов растений (Окайямя, Япония, 1991), 23-ой конференции Национального института общей биологии (Оказаки, Япония, 1992), гх Международном конгрессе по фотосинтезу (Нагоя, Япония, 1992), 32-ом Симпозиуме японских обществ физиологов растений (Кумамото, Япония, 1992), на Российско-Германском биоэнергетическом симпозиуме (Оснабрюк, ФРГ, 1994), на конференции стран НАТО по клеточным взаимодействиям (Еспинхо,

Португалия, 1994).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Быструю кинетику генерации трансмембранной разности электрических потенциалов регистрировали с помощью прямого электрометрического метода. Метод заключается во встраивании препаратов в искусственную липидную мембрану и регистрации дч> с помощью хлор-серебряных макроэлектродов обычной электрометрической техникой.

Кинетику индуцируемых лазерной вспышкой изменений поглощения регистрировали с помощью однодучевого дифференциального спектрофотометра (временное разрешение юо не). Сигнал с фотоумножителя (ФЭУ-38) поступал на регистратор переходных процессов оь-юао, соединенный с ЭВМ, что позволило производить накопление и усреднение фотоиндуцированных ответов.

Редокс-потенциад среды измеряли с помощью хлорсеребрякого и платинового электродов, соединенных с вольтметром В7-27/А1. Титрование проводили в аэробных и в анаэробных условиях. Для созда-

ния анаэробиоза использовалась глюкозо-глюкозооксидазная система.

Хроматофоры ИЗ бактерий Rb. spbaeroides (дикий тип, штамм R2) получали, как было описано ранее (Самуилов, Кондратьева,

1969).

За основу выделения РЦ сы. aurantiacus была взята методика, описанная В работе (Ovchinnikov et al. 1988).

Препараты ФС и и ФС i получали с помощью ультразвуковой обработки тилакоидных мембран с последующей солюбилизацией их в присутствии соответствующих детергентов (ЛДАО в случае ФС и, октилглюкозид/холат натрия в случае ФС i).

Цитохром cg53 из клеток а. niduians получали согласно работе

(Но et al. 1979) С НебоЛЬВШМИ МОДИфИКаЦИЯМИ.

Скорость выделения кислорода препаратами ФС и измеряли амперометрически на полярографе с помощью электрода Кларка.

Протеолипосомы, содержащие реакционные центры нь. spbaeroides и СЫ. aurantiacus ШЛУЧЭЛИ МвТОДОМ ДИЭЛИЗа (Racker 1972) И

гель-фильтрации, соответственно. Получение протеолипосом с ФС и и i осуществлялось путем смешивания фосфолипидных липосом с препаратами ФС и и 1 в соотношении липид:хлорофилл равным 40:1. Все процедуры приготовления протеолипосом проводились при 0-4°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЕКТОРНЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОНОВ В ХРОМАТОФОРАХ

Rhodobacter spbaeroides

Несмотря на то, что в последнее время во многом стала ясной последовательность переноса электронов в РЦ и комплексе цитохро-мов ьс1? механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием д^н+ при функционировании этих комплексов, остаются невыяс-

ненными. Основное достоинство используемого нами прямого электрометрического метода заключается в том, что он позволяет проводить измерения кинетики генерации ьу с разрешением юо не, и, таким образом, дает возможность исследовать механизм генерации разности электрических потенциалов в режиме однократного срабатывания, обеспечивающего по сравнению со стационарными процессами значительно большую легкость интерпретации наблюдаемых явлений.

Весьма удобным объектом для изучения механизма генерации дч> являются хроматофоры - замкнутые мембранные везикулы у фотосинтезирувдих бактерий. Процесс светозависимого переноса зарядов в мембранах хроматофоров осуществляется при участки двух основных белковых блоков - комплексов РЦ и цитохромов ьсг.

Разделение зарядов между Р870 и

. а

На рисл.А показан типичный фотоэлектрический.ответ хромато-

фОрОВ !1Ьо(1оЬасЬег арйаег<Ийе5, ИНДуЦИрОВвННЫЙ ВСПЫШКОЙ СВвТа.

Видно, что в ответ на вспышку света происходит быстрое (г < о,1 мке) нарастание электрического потенциала со знаком плюс внутри хроматофоров и его спад в миллисекундной шкале времени (т~бо мс). Как было показано ранее (Драчев и др. 1981), наблюдаемое быстрое образование мембранного потенциала обусловлено разделением зарядов между даыером бактериохлорофилла Р8 70 и первичным хлнонным акцептором Этот вывод подтверждается данными, полученными при редокс-титровании фотоэлектрического ответа, амплитуда которого падает согласно уравнению Нернста для одноэлектрон-ного перехода в окислительных (Еь = + 45о мВ) условиях и соответствует значению средаеточечного потенциала для редокс-пары Р870/Р870+ (рис.1,Б). Дополнительным свидетельством объяснения природы быстрой фазы генерации ьу является и тот факт, что в

25-, 25.

20- 20-

15- 15-

И

X « 10- А 10-

*

< 5- 1 5-

0- * V 0-

не — 1с—з|

25-,

20- А-^-Д- А ч 2.4-

&

я 15- Л 1

I Б 1 1.2-

* * <3 10- А А

5- 1 А

0- ■■111 ■ 11 г| Л " 1 ■ ■ 1 ■ ■ 1 0-

5—1 НС—$—1 с

в -а

чз

а

_0-,

1111; I 11 гг111 1 I 1 и

200 300 400 500 100 200 300 400

Е^.иВ

Рис.1. А,В - Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в хроматофорах НЬ. ярЛаего^еэ в ответ на вспышку. Редокс-титрование быстрой (Б) и "цитохромной" (Г) стадии нарастания д1?. В - без добавок (кривая 1); 2 мМ аскорбата натрия и 1 мкМ ТМФД (кривая г). Среда инкубации: го мМ нереб, рн 7,5. Стрелкой здесь и далее отмечен момент лазерной вспышки.

\

Г

отсутствие доноров для фотоокисленного Р870+ и акцепторов для <э~ образовавшийся диполь Р870+<з~ реконбинирует в исходное состояние за бо мс. Хочется отметить, что время разрешения нашей аппаратуры не позволяет регистрировать электрогенные стадии, происходящие быстрее чем за о,1 мкс.

Восстановление фотоокисленного Р87о+ цитохромом с2.

Согласно имеющимся в литературе данным (ои^оп е! а1. 1975), в препаратах хроматофоров из яь. зрЬаегогс/еэ частично сохраняется непосредственный донор электронов для фотоокисленного Р8 70+ -цитохром с2. Поскольку в эксперименте (рис.1,В, кривая 1) спад /нр полностью определяется восстановлением фотоокисленного Р87о+ от , было предположено, что эндогенный цитохром с2 находится в окисленном состоянии и не способен восстанавливать р87о+. Поэтому в среду инкубации был добавлен аскорбат натрия вместе с редокс-медиатором ТМФД в малой концентрации. Такая комбинация необходима для восстановления цитохрома с2, поскольку он локализован вблизи внутренней поверхности хроматофорной мембраны и, таким образом, практически не взаимодействует с плохо проникающим через мембрану аскорбатом. На рис.1,В (кривая 2) видно, что восстановление цитохрома с9 приводит к росту амплитуда быстрой фазы образования электрического потенциала, появлению дополнительной электрогенной стадии и замедлению спада д^. Анализ кинетики фотоответа показывает, что т дополнительной экспоненциальной фазы нарастания ду> равно 250 мкс, а ее амплитуда составляет юх от амплитуды фазы, соответствуицей образованию р870+д~. В то же время спад Ду характеризуется двумя экспоненциальными фазами с г1 = ео мс и т2= 1,5 с, причем с равными вкладами. Можно предположить, что наблюдаемая в таких условиях двухфазность кинетики спада лф обусловлена двумя

различными путями восстановления фотоокисленного Р870+. Вероятно, около половины молекул Р870 в комплексах реакционных центров взаимодействует с цитохромом с2. Следовательно, при полном содержании цитохрома с2 амплитуда соответствущей злектрогенной стадии составляла бы 20% от амплитуды фотоэлектрического ответа, обусловленного образованием р870+<з~. Данная электрогенная стадия нечувствительна к ингибитору переноса электронов между хинонными акцепторами, о-фенантролину (данные не приведены).

На рис.1,Г приведено окислительно-восстановительное титрования электрогенной стадии, обусловленной восстановлением фотоокисленного первичного донора электронов Р870. Экспериментальные точки хорошо аппроксимируются теоретической Нернстовской кривой для одноэлектронного перехода сЕш = + зоомВ.

Амплитуда дополнительной электрогенной фазы нарастания д^ зависела от содержания цитохрома с2 в препаратах хроматофоров. Так, наибольшая амплитуда данной фазы наблюдалась в препарате хроматофоров дь. зрь&егогбев, полученных в среде с низкой ионной силой с помощью Френч пресса, а наименьшая - при многократном озвучивании клеток в среде с высокой ионной силой.

Таким образом, полученные данные наглядно свидетельствуют об электрогенном восстановлении фотоокисленного димера бактериохло-рофилла Р870+ эндогенным цитохромом с2-

Восстановление вторичного хинонного акцептора <зв.

Известно, что вторичный акцептор <зв является двухэлектронным переносчиком, и поэтому в определенных условиях наблюдаются двухтактные колебания концентрации его семихинонной формы, сопровождающиеся захватом протонов препаратами РЦ на каждую четную вспышку света (мгахд^ 1979). Поэтому представлялось необходимым исс-

ледовать электрогенные реакции хинонного комплекса в условиях его двухтактного функционирования.

Как было показано ранее (Семенов и др. 1984), при ассоциа-_ ции хроматофоров с пропитанной декановым раствором фосфолипидов коллодиевой пленкой происходит экстракция вторичного хинонного акцептора <зв< В этой работе также было показано, что реконструкция функции <5В достигается путем добавления убихинона-ю в раствор фосфолипида, используемый для пропитывания коллодиевой пленки. О реконструкции <зв судили по степени замедления спада индуцированного лазерной вспышкой электрического ответа (данные не приведены).

На рис.2,А показаны индуцированные первой (1) и второй (2) лазерными вспышками фотоэлектрические ответы хроматофоров яь. БрЬа.его1с1е5. Видно, что под действием второй вспышки света наблюдается дополнительная злектрогенная фаза с г-0,1 мс (Рн=7,о), ингибируемая о-фенантролином. Характерное время этой дополнительной фазы зависит от Рн и уменьшается при его понижении (рис.2,Б). Чувствительность этой фазы к о-фенантролину, зависимость ее амплитуды от четности вспышки света, уменьшение ее характерного времени при понижении Рн, а также зависимость ее амплитуды от временного интервала между вспышками света свидетельствуют о том, что она обусловлена дисмутацией и с последующим протониро-ванием дважды восстановленной молекулы убихинона: <г?е~ + 2 н+ -->

А 13

вАвВИ2'

Кинетика генерации мембранного потенциала, обусловленной

электрогенной "хинонной" фазы, наблюдаемой в ответ на вторую вспышку света зависит также от концентрации различных солей (данные не приведены). Одной из возможных причин этой зависимости

№, иВ

25-, I

20151050

Т, НС

101 8642

1 ис

11111111111111 111

-1 I I ч 11 111 11111111 I 11

Н 5 6 7 8 9 10 Р"

10"

« 10

д ю3-

10'

1 11 ■'■ 11 " I " 11 " ' Г" Ч

4 5 Б 7 8 9 10

Рис.2. А - Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в хроматофорах яъ. врЬявтохаев под действием первой (К и второй (2) лазерных вспышек света, з - разница между кривыми 2 и 1. Б - рн-зависимость времени нарастания электрогенной "хинонной" фазы в ответ на вторую вспышку света. Среда инкубации: 20 мМ нереэ, Рн 7,0, 50 мкМ ТМФД, 5 мкМ метиленового синего. В -рн-зависимость константы скорости "хинонной" фазы в присутствии 20 мМ (□ ) и 2 М кс1 (д ).

является изменение плотности поверхностных зарядов, которая модулирует концентрацию протонов вблизи поверхности белка РЦ.

Рис. 2, В демонстрирует рн-зависимость константы скорости

электрогенной "хинонной" фазы в присутствии 20 мМ и г М кс1. Как видно при увеличении концентрации солей Г зависимость" константы скорости "хинонной" фазы от Рн становится более выраженной. Константа скорости для 20 мМ и г 11 ксг отличается на порядок при щелочных значениях Рн. Это отличие исчезает при Рн 5,5.

Следует отметить, что полученные данные довольно хорошо объясняют причины приведшие к появлению в литературе несогласующихся результатов, касающихся Рн-зависимостей константы скорости реакции 9д<Зр--> 9А9ВН2 (wraight, 1979; К1ео.пГе1а et а1. 1985).

Механизм взаимодействия между фотосинтетическим реакционным

центром и цитохромным Ьсх- комплексом.

На рис.з,а в двух временных масштабах показано образование

ду на мембранах хроматофоров яь. зрЬаегохЫев под действием первой и второй вспышек света в условиях двухтактного режима работы РЦ. Видно, что под действием первой вспышки света (кривая 1) наблюдается быстрое (х< юо не) нарастание электрического потенциала, обусловленное разделением зарядов между Р870 и сзд, и фаза, связанная с восстановлением р870+ цитохромом с2> Медленный спад обусловлен разрядкой хроматофорной мембраны за счет пассивной утечки ионов. Фотоэлектрический ответ, наблюдаемый после второй вспышки света (рис.з,а, кривая 2), существенно отличается от ответа, индуцированного первой вспышкой света. Наряду с очень быстрой фазой генерации дч> появляются более медленные фазы нарастания электрического потенциала в микро- (т~о,15 мс) и миллисе-

a g

г г

- 1 t 1 1 ■ 1 1 1 1

Шике даме _ m м*с ев к

Рис.з. Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в хроматофорах нь. БрЬаего1<1ег под действием первой (1) и второй (2) лазерных вспышек света в отсутствие (а) и в присутствии 4 мкМ антимицина А (б). Среда инкубации: зо мМ нереб, рн ?,5, 1 мМ ферроцианид калия, зо мкМ ТМФД.

Рис.4, Зависимость разности фотоэлектрических ответов хроматофо-

ров Rb. sphaeroides, ИНДУЦИрОВЭННЫХ ВТОрОЙ И ПерВОЙ ВСПЫШКЭМИ

света, от интенсивности второй вспышки (а) и от времени между первой и второй вспышками (б); в - зависимость характерного времени нарастания антимицин-нечувствительной фазы ду от амплитуда электрогенной "хинонной" фазы (нижняя шкала). Среда инкубации: зо мМ mes, рн 6,1, 2 мМ ферроцианид калия, 5о мкМ ТМФД, s мкМ антимицина А, 1 мкМ метиленового синего.

кундных (т^-20 мс) временных диапазонах, которые могут быть обусловлены как электрогенной реакцией, связанной с образованием убихинола в РЦ, так и функционированием ьсх-комплекса, соответственно.

Антимицин А, не влияя на быструю фазу, частично "подавляет ^ ускоряет медленную (рис.з.б), блокируя злектрогенные реакции убихинол-редуктазного центра и повторные обороты ьсх-комплекса. Остающаяся после добавления антимицина А миллисекундная фаза &ч> связана с окислением убихинола в убихинол-оксидазном центре г и восстановлением высокопотенциального гема. Эта фаза полностью подавляется миксотиазолом - ингибитором убихинол-оксидазного центра (данные не приведены).

Амплитуда фазы ьу с г-од5 мс пропорциональна количеству образованного под действием второй вспышки света убихинола, в то время как амплитуда нечувствительной к антимицину А фазы ^ с г ю мс пропорциональна количеству прореагировавших ьс^-комплексов. Таким образом, анализ одной кинетической кривой позволяет регистрировать события, происходящие как в РЦ, так и в ьс 1-комплексе.

Для выяснения характера взаимодействия между РЦ и ьс1-комплексом количество образуемого в РЦ убихинола варьировали двумя способами. В первом случае (рис.4,а) этого достигали, уменьшая с помощью светофильтров интенсивность второй вспышки света. Другой способ уменьшения количества образующегося убихинола состоял в увеличении временного интервала между первой и второй вспышками (рис.4,6) (что приводит к росту количества окисленных медиатором молекул <з~). Соответствующие кривые представлены на рис.4,6. Видно, что они практически не отличаются от приведенных на рис.4,а.

Если бы взаимодействие выходящего из РЦ убихинола и Ьсг-комплекса носило бимолекулярный характер, то скорость образования аф в Ьс1-комплексе существенно снижалась бы при уменьшении количества убихинола. На рис.4,в показана зависимость времени нарастания (г) миксотиазол-чувствительной злектрогенной фазы Ьсг-комплекса (в присутствии антимицина А) от амплитуда "хинонной" злектрогенной фазы. Уменьшение количества образующегося убихинола в ю раз приводит лишь к незначительному замедлению нарастания фазы генерации дч> ьсг-комплексом.

Другим подходом к изучению механизмов взаимодействия РЦ и Ьс ^-комплексов, является анализ кинетики фотоиндуцированного восстановления цитохрома ь-561 в присутствии антимицина А в суспензии хроматофоров. На рис.5,а представлены кинетические кривые, отражающие восстановление цитохрома ь-561 при различных интенсив-ностях вспышек. За счет измеряющего света перед каждой вспышкой примерно половина вторичных акцепторов находится в семихинонной форме. Поскольку на один ьс^-комплекс приходится 2 РЦ, то в ответ на каждую насыщающую вспышку света образуется в среднем одна молекула убихинола на один ьс .¡-комплекс. С уменьшением интенсивности вспышек света снижается количество восстанавливающегося цитохрома ь-561 (рис.5,а), однако время его восстановления практически не меняется (рис.5,6).

Если бы реакция между убихинолом и Ьс1-комплексом имела бимолекулярный характер, то ее скорость уменьшалась бы как при снижении концентрации убихинола, выходящего из РЦ, так и при уменьшении концентрации функционально-активных ьсх-комплексов. На рис.5,в представлены данные опыта, в котором количество функционально-активных Ьс1-комплексов варьировали, добавляя ингибитор

ЛА561-569

/о ^ б ~

5 6 -

I ч -

I- 2 "

—I-!—1—I—>—1—I—1—1—1

о ог ом о,в е.в I

[мпкротпазол], мкМ

Рис.5. Влияние интенсивности вспышки света на кинетику восстановления цитохрома ь-561 (а) и на зависимость времени его восстановления (б). Цифры у кривых указывают интенсивность вспышки света (%) от максимальной. Влияние концентрации миксотиазола на кинетику фотоиндуцированного восстановления цитохрома ь-561 (в) и на характерное время его восстановления (г). Среда инкубации, как на рис.з : 1 - контроль; 2-о,з мкМ миксотиазола; з-з мкМ миксотиазола. Каждая кривая получена усреднением г с кривых.

хинол-оксидазного центра z - миксотиазол. Как видно из представленных данных, добавление миксотиазола уменьшает количество восстанавливающегося цитохрома ь-561 (рис.5,в), но практически не влияет на скорость его восстановления (рис.5,г).

В настоящее время общепринятым является представление о бимолекулярном характере взаимодействия убихинола и цитохромного bcj-комплекса (crofts, wraight 1983). Об этом свидетельствует увеличение скорости фотоиндуцированного восстановления цитохрома ь-561 как при повышении количества равновесно-восстановленного убихинола (Eh < 200 мВ), так и при увеличении количества qh2, образованного в РЦ при освещении препаратов хроматофоров в окислительных условиях (Eh = 200 мВ) не одной, а двумя последовательными ВСПЫШКаМИ СВета С Интервалом " 0,7 MC (Crofts et al. 1983). Существенно, однако, заметить, что все эти эксперименты были проведены в условиях, когда концентрация убихинола превышает концентрацию Ьсх-комплексов. Вместе с тем представленные выше данные по скорости восстановления цитохрома ь-561 и образования Ац) убедительно свидетельствуют о том, что в условиях, когда концентрация убихинола не превосходит концентрацию ьс.¡-комплекса, реакция между ними носит практически мономолекулярный характер.

Объяснением обнаруженного нами мономолекулярного характера реакции между убихинолом и ьС]1-комплексом, когда rQH2j:rbcxj<i, и ее бимолекулярного характера в условиях, когда [qh2i:[Ьс^]>1, может служить предположение об отсутствии быстрого обмена между хинонами, "обслуживающими" различные ь^-комплексы, т.е. убихи-нол, образованный в РЦ, поступает в "свой" локальный пул и далее окисляется лишь "своим" (видимо ближайшим) ьсх-комплексом. Поскольку в данный локальный пул на вспышку света могут поступить

две, одна или ни одной молекулы ян2 (учитывая стехиометрию РЦ :ьсг = 2:1), то наблюдаемая скорость восстановления цитохрома ь-561 может измениться максимум в г раза в отличие от бимолекулярного механизма, при котором наблюдаемая скорость восстановления цитохрома ь-561 может изменяться во много раз (практически и бесконечное число раз).

Теоретические кривые, приведенные на рис.4,в, соответствуют наличию суперкомплекса между РЦ и ьсх-комплексом (кривая 1), взаимодействию между РЦ и ьс^-комплексом через локальный мембранный пул хинонов (кривая 2) и бимолекулярному взаимодействию уби-хинола и ьсх-комплекса (кривая з). Во втором случае время восстановления (т) цитохрома ь-561 зависит от вероятности («) образования убихинола в РЦ после второй вспышки света и может быть рассчитано по следующей приближенной формуле:

а2х/2 + 2а(1-ос)г т(4-3а) Т(а) = —- = -

а + 2«(1-а) 4-2ог

где г - характерное время восстановления цитохрома ь-561 при наличии в пуле лишь одного убихинола. При расчете теоретической кривой полагали т=14 мс.

Точность представленных данных не позволяет исключить непосредственного переноса убихинола между РЦ и ъс -комплексом, например при образовании суперкомплекса между этими ферментами (о'кееГе е! а1. 1981), однако экспериментальные данные лучше согласуются с гипотезой "локального пула" (см. кривые 1 и 2 на рис.4,в). Вместе с тем они противоречат модели, согласно которой скорость взаимодействия между образующимся в РЦ убихинолом и ьсг-комплексом пропорциональна произведению их концентраций (кривая з на рис.4,в).

Бимолекулярный характер реакции между равновесно-восстановленным убихинолом и ьс ^-комплексом в рамках рассматриваемой модели объясняется изменением числа восстановленных молекул убихинона данного локального мембранного пула.

Таким образом, полученные результаты не могут быть объяснены в рамках общепринятой модели циклического транспорта электронов у пурпурных бактерии, согласно которой все молекулы хинонов в хро-матофорах рассматриваются в качестве мембранного пула, обобщенного всеми РЦ и Ьс^комплексами, поскольку в этом случае уменьшение концентрации убихинола привело бы к многократному замедлению скорости фотоиндуцированного восстановления цитохрома ь-561. В то же время они хорошо соответствуют модели, предполагающей существование локальных пулов хинонов, обмен между которыми происходит медленнее, чем время восстановления цитохрома ь-561.

ГЕНЕРАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННОЙ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ

В ПРОТЕОЛИПОСОМАХ, СОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСЫ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ

ИЗ СЫогоЫехиз аигапЫасив

Изучение фотосинтетического аппарата зеленых термофильных бактерий сыогоПехив auraпt¿acus представляет интерес с различных точек зрения. Во-первых, сы. аигапЫнсиэ относятся к одной из древнейших ветвей эубактерий, и информация об организации их фотосинтетического аппарата существенна для понимания эволюции фотосинтеза. Во-вторых, фотосинтетический реакционный центр сы. аигапИасив - наиболее просто устроенный РЦ из охарактеризованных к настоящему времени - относится к так называемому хиноновому типу, и, следовательно, может служить простейшей моделью РЦ фото-синтезирупцих бактерий, а также фотосистемы и цианобактерий и растений. Кроме того, РЦ сы. аигал^асиэ, обладая повышенной

термостабильностью по сравнению с близкими к нему по структуре РЦ пурпурных бактерий, мог бы оказаться удобным объектом для изучения механизмов стабилизации пространственной структуры мембранных

белков термофильных микроорганизмов.

Как видно из рис.к,Л (кривая О. кинетика темпового восстановления фотоокисленного первичного донора (р+), регистрируемая по изменению поглощения препаратов фотосинтетических реакционных центров сы. аигапНясив при 600 нм, хорошо описывается одной экспонентой с характерным временем 65 мс, обусловленной возвратом электрона от первичного хинонного акцептора (эд.

Реконструировать функцию (зв можно путем добавления экзогенного убихинона (рис.6,А, кривая г). При этом кинетика ревосстано-

вления р+ становится медленнее и отражает реакцию р+<а~ —>Р0„.

В в

Поскольку возврат электрона от <з~ к р+ происходит только через (3А, можно определить константу равновесия ьдв переноса электронов между первичным и вторичным хиноннкми акцепторами:

ьАВ^ твр/тАр, где твр - константа скорости переноса электрона от ввкрц гдр - константа скорости переноса электрона от дд к р.

Как видно из рис.е,Б, константа равновесия ьдв между <зд и (зв равна 4 5 при Рн > 8,5, в то время как при кислых значениях Рн, она увеличивается приблизительно в два раза.

По сравнению с РЦ ль. зрйаего^сгеэ кинетика реакции р+(з~ в препаратах РЦ сы. аигапЫасиг является более медленной. Константа равновесия ьдв в РЦ сы. аигапЫасиБ значительно превышает таковую для препаратов РЦ дь. ярЛаего^е.?;. Это обусловлено, вероятно, тем, что в РЦ рассматриваемого вида бактерий функцию первичного хинонного акцептора выполняет менахинон, имеющий более низкий окислительно-восстановительный потенциал, чем убихинон,

4 & —

В

рН = 9.1

рн

11111

в—о—о—о

11111

I_1—I—I—1—I—I_I_»—■—I

Рис.6. Индуцированные единичной вспышкой света изменения поглощения препаратов РЦ сы. аигапЫасиБ при 600 нм. А - Кинетические кривые в отсутствие (1) и в присутствии 5 мкм убихинона <3-6 (2) ; Б - Зависимость характерного времени восстановления р+ и константы равновесия ьдв от рн в присутствии убихинона. Среда инкубации:

А - 50 ММ Тг1з-НС11 рн 8,3; Б - 20 ММ МЕБ, НЕРЕБ, Ыв-^б-

ргорапе. Концентрация РЦ 1,з мкМ. В - Индуцированные последовательными вспышками света двухтактные изменения поглощения препаратов РЦ при 450 нм. Среда инкубации как на рис.6,А. Кроме того, добавлены 5 мкМ убихинон о-б и то мкМ ТМФД.

ЯВЛЯЮЩИЙСЯ первичным акцептором электронов В РЦ НЬ. врЬаегогвев.

На рис.6,В приведены индуцированные последовательными вспышками света двухтактные изменения поглощения при 450 нм, обусловленные образованием семихинона под действием нечетных вспышек света и убихинола « н под действием четных вспышек света. Видно, что при значениях Рн > 8, двухтактные колебания концентрации семихинонной формы <зв значительно снижаются.

На рис.т,А показаны индуцированные первой (1) и второй (2) лазерными вспышками фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих комплексы реакционных центров сы. aura.ntia.cus. Максимальная по амплитуде быстрая фаза, время нарастания которой короче времени разрешения нашего прибора (г < юо не) и наблюдаемая под действием как первой, так и второй вспышек света, соответствует разделению зарядов между первичным донором электрона р и первичным хинонным акцептора (эА.

Как видно из рис.7,А (кривая 2), в кинетике фотоэлектрического ответа на вторую вспышку появляется дополнительная электрогенная стадия. Амплитуда этой фазы зависит от временного интервала между вспышками света (данные не приведены).

На рис.7,Б показана рн-зависимость амплитуды дополнительной фазы в ответ на вторую вспышку света. Амплитуда данной фазы составляет г-14% от амплитуды фотоэлектрического ответа, обусловленного разделением зарядов между р и и практически постоянна в диапазоне Рн от 5 до 7,5, а затем резко уменьшается при дальнейшем повышении Рн. Этот эффект, вероятно, обусловлен уменьшением константы связывания <зв при щелочных Рн, поскольку уменьшение количества образуемого в ответ на первую вспышку (рис.7,Б, ромбики) имеет такую же рн-зависимость как электрогенная "хинон-

о

6 .100

М

го

ю

о

о

"гг

Лв

\

и?

0.01

0.005

рн

о

10

ю го зо «1 50

[О-10] , лпд/т!

О

5

Рис.7. А - Образование разности электрических потенциалов в про-теолипосомах, содержащих РЦ из сы. аигапИасив в ответ на первую '(1) и вторую (г) вспышку света. Среда инкубации: 25 мМ нереб, рн 7,5 и юо мкМ ТМФД. В декановый раствор фосфолипидов добавлен убихинон о-ю (15 мг/нл). Б - рн-зависимости амплитуды "хинонной" фазы, индуцированной второй вспышкой света (квадраты) и изменений поглощения при 450 нм, соответствующих образованию на первую вспышку (ромбики). В - Зависимость амплитуды "хинонной" .фазы от концентрации ч-ю.

ная" фаза. Значение Рк для обеих зависимостей составляет 8,8. ЗаМеТИМ, ЧТО аналогичная ЗаВИСИМОСТЬ ДЛЯ РЦ ИЗ ЯЬ. sphaeroides характеризуется рК 9,8 (Kleinfeld et al. 1984).

На рис.7,В показана зависимость величины дополнительной электрогенной фазы от концентрации экзогенно добавленного убихи-нона. В отличие от РЦ вь. sphaeroides, для полной реконструкции функции вторичного хинонного акцептора необходима большая концентрация хинона. Возможными причинами этого различия могут быть: а) высокая концентрация комплексов РЦ в протеолипосомах, и б) разница между константами связывания убихинона-ю и менахинона, являющегося вторичным ХИНОННЫМ акцептором ДЛЯ РЦ Chi. aurantia-cus. Максимальная амплитуда хинонной фазы достигается при концентрации убихинона-ю выше 4о мг/мл.

Таким образом, полученные результаты позволили предположить, что наблюдаемая электрогенная реакция в ответ на вторую вспышку света обусловлена дисмутацией q~ и q~ с последующим протонирова-нием дважды восстановленной молекулы убихинона: q"q~ + 2 н+ —>

а в

^неинтересным является сравнение электрогенных реакций в хинов-

аКЦеПТОрНОМ КОМПЛеКСе РЦ ПУРПУРНЫХ бактерий я Ь. sphaeroides и

сы. aurantiacus так как последние не содержат н-субъеданицу. Поскольку "хинонные" электрогенные фазы в РЦ этих двух бактерий близки по амплитуде, можно полагать, что н-субъеданица, вероятно, не является необходимой для реакции q~q~ + 2 н+ --> QaQbh2.

ГЕНЕРАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННОЙ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ В ПРОТЕОЛИПОСОМАХ, СОДЕРЖАЩИХ ФОТОСИСТЕМЫ и ИЗ ЦИАНОБАК -ТЕРШ

Разделение зарядов между рбво и <зд и электрогенное

восстановление Р680+ редокс-активным остатком тирозина у2.

Обнаруженное в настоадее время сходство между фотосинтетическими реакционными центрами пурпурных бактерий и фотосистемой и ставит вопрос о сравнении между собой различных аспектов их функционирования. Особенно полезным при исследовании электрогенных реакций РЦ пурпурных и зеленых термофильных бактерий оказался прямой электрометрический метод.

На рис.в,а приведен типичный фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих частицы фотосистемы и из термофильных циано-бактерий Аласуе<;д5 ii.idu.Zans* индуцированный лазерной вспышкой. Видно, что под действием вспышки света наблюдается образование трансмембранной разности электрических потенциалов со знаком минус внутри протеолипосом и кинетикой, более быстрой, чем временное разрешение нашей установки.

В отсутствие экзогенного марганца в наших препаратах комплекс разложения воды находится в неактивном состоянии, поэтому наиболее вероятно, что быстрая фаза генерации мембранного потенциала обусловлена первичным разделением зарядов в РЦ:

Р680<5Д ---> Р680+в~ .

Указанием в пользу того, что наблюдаемая нами фотоэлектрическая активность протеолипосом обусловлена функционированием ФС и, явилось бы уменьшение амплитуды фотоответа на вторую вспышку света в присутствии диурона. Однако этот эффект наблюдался и в отсутствие диурона (не показано), что связано с отсутствием вторичного хинона на его специфическом месте связывания в используемой нами системе измерения щ>. Шесте с тем, насыщение измерительной мембраны экзогенным пластохиноном не привело к реконструкции функции <зв в РЦ ФС и из термофильных цианобактерий.

№, нб

№, «В

-5-

-10-

-5-

-10

400 икс

Я

400 икс

-51 -10

400 икс

0.6 0.4 0.2

Я

400 икс

—

Рис.в. Фотоэлектрические ответы протеолипосом. содержащих частицы ФС ц из л. гпс1и1яг.я, индуцированные вспышками света без добавок (а); в Присутствии 1 ММ МпСХ „ (б) ; 1 ММ МпС1„ и 2 мМ гидроксил-

2 ......" 2

амина (в), г - разность фотоэлектрических ответов (б)-(а)

инкубации: 5О мМ НЕРЕБ (рН 7,5).

Среда

Тот факт, что лазерная вспышка индуцирует образование Дч> со знаком минус внутри протеолипосом, предполагает преимущественную ориентацию препаратов РЦ ФС и донорной стороной наружу.

На рис.8,6 показан индуцированный единичной вспышкой света фотоэлектрический сигнал, наблюдаемый в присутствии ионов мп2+ во внешней среде. Видно, что в отсутствие Мп2+ наблюдалась небольшая по амплитуде фаза спада дц> с характерным временем ^ 5 о мкс (рис.8,а), которая исчезала при добавлении 1 тм мпсх2 (рис.8,б).

При добавлении в препараты экзогенного марганца восстанавливается активность комплекса разложения вода, поэтому скорость переноса электрона от тирозина у2 к Р680+ возрастает на три порядка (Сегкеп et а1. 1988) И СТЭНОВИТСЯ Неразрешимой ДЛЯ НЭШеГО

метода. В этих условиях амплитуда быстрой фазы увеличивается на 18% и исчезает фаза с характерным временем 50 мкс (рис. 8,6). Быстрое образование состояния у*рб80в~ предотвращает рекомбинацию первичного диполя Рб80+<з~, а то, что быстрая фаза в этих условиях увеличивается на 18%, означает, что реакция у2Р68о+—> у*р680 дает соответствующий электрогенный вклад в быструю фазу образования дц>.

Для наглядности на рис.8,г приведена разность фотоэлектрических ответов в присутствии и в отсутствие мп2+.

Добавление гидроксиламина приводит к уменьшению амплитуда быстрой фазы генерации лр и появлению фазы темновой релаксации с характерным временем ^ 50 мкс (рис.8,в). Эффект гидроксиламина является еще одним аргументом в пользу предположения о том, что перенос электрона между остатком тирозина у2 и рбво+ является электрогенным.

Следует отметить, что в нативных РЦ с нормально функциони-

рувдим комплексе»! разложения воды восстановление рбво+ тирозином Yz происходит за 25-300 НС В зависимости ОТ S - СОСТОЯНИЯ (Bret-tei et ai. 1984), тогда как при инактивированном марганцевом

комплексе время восстановления рбво+ от чг увеличивается до 50! 00 МКС (Savs.'in et al . 1986В ПОСЛвДНеМ СЛуЧЭв В МШфОСвКуНДНОЙ шкале времени должно протекать два близких по скорости процесса: восстановление рбво+ тирозином yz (yzp68o+ --> y*p68o) с характерным временем 50-100 мке и рекомбинация первичного диполя (p680+q7 -->p680q.) с характерным временем 200-220 мке

A A Q

(schiodder et ai. 1985). Для используемого нами препарата РЦ ФС XI характерные времена ту и tq могут быть вычислены на основании полученных экспериментальных данных.

Амплитуда фазы темнотой релаксации л} составляет примерно 8% от амплитуды первичного разделения зарядов aq. Характерное время этой фазы т1 = 50 мке. Скорость темновой релаксации является суммой скоростей обоих процессов, поэтому :

V (rY_1 + rQ_lrl- (1)

Амплитуда фазы может быть рассчитана по следующей формуле:

а1 = ay ay + aq aq' (2)

где ду и aq - амплитуды восстановления peso"1" от y2 и q~, соответственно (отметим, что ду имеет тот же знак, что и первичное разделение зарядов а , а аа равна а , но имеет противоположный знак

о у о

), ау И aQ - ДОЛИ РЦ, В КОТОрЫХ ПРОИЗОШЛО ВОССТЭНОВЛеНИе Р680+ от

г, и а", соответственно.

L А

Если предположить, что в рассматриваемых препаратах марганец

отсутствует во всех центрах, тогда доля центров, в которой произошел перенос электрона yzp680+ —> y*p680, составляет

ау=тух 7 ( V1 + = Т1/ТУ (3)

а доля центров, в которой произошла рекомбинация рбво+в~,

составляет

а = г /т . (4 )

<3 ГС}' к '

Амплитуда Ау Фазы восстановления Р680+ от у2 была определена выше и составляет 18% от ао. Несложно показать, что времена гу и Гд можно получить из выражений (1)-(4). Опуская промежуточные вычисления, находим:

ту = тг (1+ Ау)/(1 + А1); (5)

Т<3 = Х1 (1+ Ау)ДАу" А1Ь (б)

Подставляя в (5) и (6) экспериментально найденные величины, получаем ту = 65 мкс, х^ = 220 мкс, которые хорошо согласуются с кинетикой реакции переноса электрона между редокс-активным остатком хг и фотоокисленным Р680+ и скоростью рекомбинации электрона между Р680+ и <э~, соответственно.

Электрогенное восстановление вторичного хинонного акцептора.

В акцепторной части фотосинтетического реакционного центра фотосистемы и, как и несерных пурпурных бактерий, содержатся две молекулы хинона - одноэлектронный первичный акцептор <зд и двух-электронный вторичный акцептор При импульсном возбуждении фотохимически активного пигмента РЦ под действием первой вспышки образуется долгоживущая форма <э~, которая после второй вспышки превращается в полностью восстановленную молекулу «вн2, захватывая два н+-иона.

На рис.э,а приведены индуцированные первой (1) и второй (2) вспышками света фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих частицы ФС и с неактивным кислород-выделящим комплексом из

? -30-] *

<3

-60

4 ис

д*, г от рУ А

БО 50 40 30 20 10

,сиг 13

Йв О 3

I ' ' '

Т, N0

2.5ч 2

1.5 1

0.5

1" р "I > "I" ч1 "II

5 6 7 8 9 10 11

-400 -200 0 200

Еь. ¡¡В

о а

о а

1 I 1 1 '1 1 1 1 I ' 1 Ч 1 1 ч

5 6 7 8 9 10

рн

Рис.з. Образование разности электрических потенциалов в протео-липосомах, содержащих частицы ФС и из л. п!ви1апз под действием первой (кривая 1) и второй (кривая 2) лазерных вспышек света, и разница между кривыми (2-1) (А). Редокс титрование быстрой фазы генерации т> (Б). Зависимость от Рн амплитуды (В) и времени нарастания (Г) "хинонной" электрогенной фазы. В декановый раствор фосфолипидов добавлен децилпластохинон (5 мг/мл).

Б

□

□

мезофильных цианобактерий Anacystis nidulans При pH 7,0 В ПРИСУТСТВИИ децилпластохинона. Максимальная по амплитуде быстрая фаза, время нарастания которой короче времени разрешения нашего прибора, наблюдаемая под действием как первой, так и второй вспышек света, соответствует разделению зарядов между первичным донором электронов Р680, и первичным хинонным акцептором <зд. Под действием второй вспышки света наблюдается дополнительная фаза генерации &ч>. Разность между кинетиками фотоответов, индуцированных второй и первой вспышками приведена на рис.9,А (кривая 2-1). Амплитуда этой фазы зависит от временного интервала между вспышками света и становится максимальной, когда интервал между вспышками меньше, чем г с (не показано). Максимальная амплитуда этой фазы с тгл-о,27 мс при рн 7,о составляет 4% от величины быстрой фазы фотоэлектрического ответа, обусловленной разделением зарядов между Р680 и qa. Эта фаза полностью исчезает при добавлении ингибитора переноса электронов от ед к qr- диурона (не показано).

На рис.9,Б приведено редокс-титрования быстрой фазы фотоэлектрического ответа, амплитуда которого падает согласно уравнению Нернста для одноэлектронного перехода, и Е^ соответствует значению среднеточечного потенциала для <зд/ в РЦ ФС ri, равному -loo мВ. Следует обратить внимание на то, что в полученной нами кривой титрования отсутствует какой-либо переход в области -240-г- - 330 мВ, наблюдаемый обычно у ВЫСШИХ растений (Horton, егозе 1979). Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии низкопотенциальной формы qa в РЦ ФС и цианобактерий.

На рис.9,В и Г представлены зависимости амплитуды и кинетики диурон-чувствительной фазы от рн. Амплитуда фазы составляет 4% от амплитуды p68o+q~ в интервале Рн от е,о до 8,5 и резко умень-

шается при дальнейшем повышении рн. Видно, что г этой фазы имеет слабую Рн-зависимость при Рн < э,о и сильную при Рн > 9,о.

Таким образом, чувствительность этой фазы к диурону, зависимость ее амплитуды от номера вспышки света, а также зависимость ее амплитуды и кинетики от Рн свидетельствуют о тем, что наблюдаемая в ответ на вторую вспышку света фаза обусловлена протони-рованием дважды восстановленной формы qb в РЦ ФС ц.

Следует отметить, что эти Рн-зависимости по своему характеру аналогичны соответствующим зависимостям электрогенной "хинонной" фазы, наблюдавшейся на хроматофорах и реакционных центрах из пурпурных и зеленых термофильных бактерий.

Таким образом, полученные с помощью прямого электрометрического метода результаты наглядно свидетельствуют о наличии по крайней мере трех электрогенных стадий в РЦ ФС и цианобактерий. Основной электрогенной стадией является перенос электрона от peso на q, (т < ioo не). Следующая стадия обусловлена восстановлением фотоокисленного рсзо+ посредством редокс-активного остатка y2 (г зо-зоо не). Эта фаза по амплитуде составляет 18% от фазы, обусловленной разделением зарядов между Р680 и q , Наиболее медленной электрогенной стадией является протонирование дважды восстановленного вторичного хинонного акцептора qb в ответ на вторую вспышку света (т 270 МКС, рН 7,о).

Следует обратить внимание на то, что фаза, обусловленная протонированием q„, в случае РЦ ФС и значительно меньше по амплитуде (4%), чем аналогичная фаза, наблюдавшаяся в бактериальных РЦ (15-20%) (см. рис.2,А и 7,А). Это различие может быть связано: а) с меньшим расстоянием между qb и поверхностью мембраны (или белка); 6} с большей диэлектрической постоянной на этом участке

или в) меньшей степенью реконструкции функции <зв. Последнее объяснение представляется более вероятным, поскольку изолированные частицы ФС и характеризуется частичным повреждением места связывания чв как в РЦ высших растений, так и в цианобактерий

(Tanaka-Kitatani еЪ а1. 1990).

Стабилизация мп-кластера комплекса окисления воды ФС и

Как известно, кислород-выделяиций комплекс является самым лабильным участком в фотосинтетической электрон-транспортной цепи в ТИЛЭКОИДНЫХ мембранах (Мига1а еЬ а1. 1978).

Как следует из данных, приведенных на рис.ю.А и Б, в присутствии глицинбетаина, являюцегося эффективным осморегулятором для галофильных растений, как тилакоидные мембраны, так и частицы фотосистемы и из цианобактерий обладают высокой активностью выделения кислорода в течение б ч и 4 ч инкубации при 24°С в темноте, соответственно.

Детальное изучение отдельных специфических реакций в электрон-транспортной цепи тилакоидов из цианобактерий вупесЬосузИз РСС6803 свидетельствует о способности глицинбетаина влиять только на активность водоразлагапцего комплекса фотосистемы п, а не на какие-либо другие реакции (данные не приведены).

Что касается стабилизирующего влияния глицинбетаина на активность кислород-выделяющего комплекса, то оно, вероятно, связано с предотвращением удаления атомов мп из комплекса окисления воды ФС и, поскольку в отсутствие глицинбетаина активность комплекса окисления воды и содержание мп падают параллельно, в то время как в его присутствии обе эти характеристики не меняются в исследуемом временном диапазоне (данные не приведены). Вероятно, в данном

• 100 * 100 3

I □ 0 П О ---------------------------- 0

к » 80 -, .. д С с о о о -во-.

д д

N д

о 60- д 60-

® А л 40- 5 д

I 40- д

9) д

С

« 20 " 2 20- д

и 0-1 1Р1 р 0- I . 1 1 111 1 1 [ 11 1 1 , ,, 1 1 1

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 бремя инкубации, ч Врш инкубации, ч

Рис.ю. Изменение скорости выделения кислорода в тилакоидных мембранах и в частицах ФС и из зупесьосувыв рссбаоз при 24°с в темноте в отсутствие (л ) и в присутствии (а ) 1 И глицинбетайна. Мембраны были получены в присутствии глицинбетаина. Концентрация хлорофилла 8 мг/мл. Среда инкубации: 5о мМ тг 1с1г1е/МзОН (рН 7,5), ю мМ сас12, 600 мМ сахароза, юо мкМ рво. юо % соответствуют 250 и 410 мкМ о2 / (мг • хлорофилла - ч) в тилакоидных мембранах и частицах ФС и, соответственно.

случае важны особенности взаимодействия глицинбетаина с участками связывания марганца в частицах ФС и. По-видимому, защитное действие глицинбетаина обусловлено предотвращением структурных перестроек в водоразлагащем комплексе ФС ц, которые приводят, в частности, к удалению марганца.

ГЕНЕРАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННОИ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ В ПРОТЕОЛИПОСОМАХ, СОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСЫ ФОТОСИСТЕМЫ i ИЗ ЦИАНОБАК-ТЕРИИ

Известно, что терминальными акцепторами электронов в РЦ ФС i высших растений и цианобактерий, а также в РЦ зеленых серных бактерий и гелиобактерий являются железо-серные кластеры, обозначаемые Fa И Fg (Nitschke, Rutherford 1991).

Как правило, в изолированных црепаратах ФС i отсутствуют непосредственные доноры электрона для фотоокисленного р700+ -пластоцианин и /или цитохром с553- В этих условиях кинетика тем-нового восстановления р700+ определяется возвратом фотомобилизованного электрона от терминального акцептора fa/f0.

Как видно из рис.11,А, кинетика темнового восстановления, регистрируемая по изменению поглощения препаратов ФС i из л. niduians при 703 нм, хорошо описывается одной экспонентой с характерным временем r^ so мс.

Функция непосредственного донора электронов для Р700+ может быть в значительной степени восстановлена добавлением экзогенного цитохрома с553. Последний был выделен нами из a. niduians. Как видно из рис.11,Б (кривая 2), в присутствии цитохрома с553 происходит значительное ускорение восстановления Р7оо+. Кинетика этого процесса характеризуется двумя экспоненциальными фазами с г^ 25 икс (зох) и г700 мкс (70%). Можно предположить, что наблюдаемая в таких условиях деухфазность кинетики восстановления Р700+ обусловлена тем, что только небольшая часть молекул цитохрома с-,,

О t> о

образует комплекс с РЦ ФС г.

На рис.11,В приведен типичный фотоэлектрический ответ про-теолипосом, содержащих комплексы ФС i из a. niduians. Как и в

г

П О

N <

С

Г

-10 «сч

-5

с -10-1

X

■ -15 <

-20 ^ -25

20

1 «С—4—1 с —¡1

151 10 5-1

"Ъ.

Ч

^ Е,,кВ

200 300 400 500 600

V

Рис.п. А,Б - Индуцированные вспышками света изменения поглощения препаратов фотосистемы I а. шЫиЛалз при 7оз нм. Б - в отсутствие (1) и в присутствии (г) 2 мМ аскорбата и г мкМ цитохрома с553< Каждая кривая получена усреднением 5 кинетических кривых. В -Образование йц> в протеолжгосомах с ФС I в ответ на лазерную вспышку. 1 - без добавок, г - г мМ аскорбата и г мкМ цитохрома с553> Г - Редокс титрование быстрой стадий нарастания ду>. Среда инкубации содержала 50 мМ нереб, рн 7,о.

случае ФС ц лазерная вспышка вызывала генерации мембранного потенциала со знаком минус внутри протеолипосом. Образование ¿р происходит за время более короткое, чем временное разрешение нашей установки (г < юо не), а спад фотопотенциала в отсутствие добавок характеризуется в основном кинетикой с о мс, соответствующей рекомбинации р7оо+(р. (кривая 1).

А) о

В соответствии со знаком фотоэлектрического ответа р7оо должен быть расположен вблизи наружной поверхности мембраны и в этом случае первичный донор электронов должен быть доступен для гидрофильных восстановителей. Вследствие доступности Р700 со стороны внешней водной фазы протеолипосомы с ФС I представляют собой удобную модель для исследования электрогенных реакций, сопряженных с взаимодействием между РЦ ФС х и цитохромом с553. В процессе выделения тилакоидных мембран из-за потери большей части эндогенного цитохрома сд53 и /или пластоцианина изучение этой реакции на тилакоидах сталкивается с существенными трудностями.

Как явствует из рис.11,В (кривая г), экзогенно добавленный цитохром с553 влияет не только на кинетику спада фотопотенциала, но и на кинетику генерации ду. Добавление окисленного цитохрома с не вызывает подобных эффектов (данные не приведены). Компьютерный анализ кинетики фотоэлектрических ответов показывает, что нарастание дч> характеризуется двумя кинетически различными фазами с х^гь мкс (36 %) и т^"200 мкс (64 %). Их суммарная амплитуда составляет 1/4 от быстрой фазы, обусловленной разделением зарядов между р7оо и железо-серным кластером (г < 0,1 мкс).

В исследованном диапазоне концентраций цитохрома с553 наличие быстрой реакции (г^25 мкс) первого порядка между цитохромом с2+ и фотоокисленным р700+ свидетельствует о предобразованном

комплексе (Hervas et al. 1992). СИГМОИДаЛЬНЭЯ ЗЭВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ реакции более медленной фазы (т2) от концентрации цитохрома с553 показывает, что она, вероятно, не обусловлена реакцией второго порядка между р700+ и растворенным или адсорбированным на мембране протеолипосом нитохромом с..... Можно полагать. что существует положительное кооперативное взаимодействие между несколькими центрами связывания на поверхности белка донора.

В целом реакция между р7оо+ и восстановленным донором электронов имеет довольно сложный характер. Помимо концентрации цитохрома кинетика этой реакции зависит от природы липидов, наличия в ФС i дополнительных хлорофилл-содержащих белков, присутствия MOHO- И дивалентных солей, а также Рн (Hervas et al. 1992).

На рис.íi,Г приведены результаты редокс-титрования быстрой фазы фотоэлектрического ответа в протеолипосомах, содержащих частицы ФС i. При повышении редокс-потенциала среды амплитуда фотоэлектрического ответа падает согласно уравнению Нернста для одноэлектронного перехода, и Ет соответствует значению среднето-чечного потенциала для редокс-пары р700/р?00+, равному + 460 мВ,

Весьма интересным является вопрос о природе реакции перекоса электрона между fv и f./fd. Согласно рентгеноструктурному анализу

а А 13

кристаллов ФС I ИЗ Synechocococcus sp. (h'rauss et al. 19ЭЗ),

расстояния между центральными атомами fx и двух других fe-s центрами составляют is и 22 Я, хотя невозможно различить fv и fr.

На рис. 12,А показаны светоиндуцированные изменения поглощения при 7оз нм в условиях, когда f^/fb окислен (кривая i) и восстановлен (кривая 2). Как следует из кривой 2, при восстановлении конечных акцепторов в присутствии избытка датионита при Рн ю кинетика спада становится монофазной с характерным временем «1,5

ДА, 703 нн М, нВ

Рис.12. А - Индуцированные вспышками света изменения поглощения препаратов ФС i a. niduians при 703 нм. Б - Образование ду в протеолипосомах, содержащих частицы ФС i. 1- без дополнительных добавок, 2 - 25 мМ дитионит натрия. Среда инкубации: юо мМ caps, рн ю, ю мМ N'aci, го мкМ метилвиологен, о,5 мМ бензилвиологен, 5 мМ аскорбат натрия, 4 мкМ феназинметасульфат.

мс, и вероятно, отражает реакцию рекомбинации между р700+ и f~.

На рис.12,Б показаны фотоэлектрические ответы в протеолипосомах, содержащих ФС i в условиях, когда fa/fb окислен (кривая i) и восстановлен (кривая г). Уменьшение амплитуда фотоэлектрического ответа (кривая 2), вероятно, связано с электрогенным переносом электрона между железо-серными центрами fx и fa/fb-Однако временное разрешение используемого нами метода измерения Д¥> не позволило нам наблюдать реальную кинетику реакции переноса

электрона между и Гд/Тд.

Таким образом, данные по исследованию быстрой кинетики генерации Ду в протеолипосомах, содержащих частицы фотосистемы I,

продемонстрировали злектрогенные реакции, обусловленные: а) разделением зарядовмежду Р70(ги (г <~юо не) \ бУ переносом электрона между железо-серными кластерами и к./к,, (г < юо-зоо не)

л А о

и в) восстановлением фотоокисленного Р700 цитохромом с553 (т1~25 мке, и т2~200 мкс). Фазы б) и в) по амплитуде составляют 20% и 25?; от фазы, обусловленной разделением зарядов между р700 и рх, соответственно.

ВЫВОДЫ

1. На хроматофорах несерных пурпурных бактерий вьоёоьа.сьег врЛае-го^с/ез с помощью прямого электрометрического метода продемонстрированы электрогенные реакции, связанные с переносом зарядов как в фотосинтетических реакционных центрах, так и в цитохромных Ьс^ -комплексах.

2. Показано, что при высоких значениях редокс-штенциала среды, когда образование убихинола в РЦ происходит только после второй вспышки света, кинетики восстановления цитохрома ь-561 и образования фазы д^, отражающей перенос электронов в ьс}-комплексе , не зависят ни от количества функционально-активных Ьс1-комплексов, ни от количества образующегося в РЦ убихинола. Сделан вывод о том, что реакция между убихинолом, выходящим после второй вспышки света из РЦ, и ы^-комплексом является мономолекулярной. Для объяснения мономолекулярного характера этой реакции в окислительных условиях и бимолекулярного характера в восстановительных условиях предложена модель, согласно которой обмен хинонами между

РЦ и beх-комплексом происходит в пределах локального пула, а обмен между различными локальными пулами хинонов осуществляется за время, превышающие время восстановления цитохрома ь-561.

3. Исследование быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов на протеолипосомах, содержащих реакционные центры из зеленых термофильных бактерий chiorofiexus aurantiacus, показало, что основной электрогенной стадией является перенос электрона от первичного донора электронов р на первичный хинонный акцептор вд. Следующая стадия обусловлена протонированием дважды восстановленного вторичного хинона qb в ответ на вторую вспышку света. Сопоставление электрогенных фаз, связанных с протонированием дважды восстановленного вторичного хинонного акцептора <эв в хро-

матофорах ДЬ. sphaeroides И В реакЦИОННЫХ центрах Chi. aurantiacus, позволило сделать вывод о том, что н-субъединица РЦ, вероятно, не является необходимым компонентом для реакции q~q~ + 2 н"

"> WV

4. Исследование быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов на протеолипосомах, содержащих комплексы Ю п из цианобактерий Anacystis niduians, показало наличие электрогенных реакций, обусловленных: а) разделением зарядов между первичным донором электронов рбво и первичным хинонным акцептором <зд; б) переносом электрона от редокс-активного остатка тирозина (тирозин- 16 i в Di субъединице) к фотоокисленному Рбво+ и в) дисмута-цией семихинонной формы qa и qb с последующим протонированием дважды восстановленного убихинона q^"-. q~q~ + 2 н+ — > QaQbh2.

5. Окислительно-восстановительное титрование быстрой фазы генерации мембранного потенциала на протеолипосомах с ФС ц показало, что в отличие от высших растений низкопотенциальная форма пер-

вичного хинонного акцептора (Ет< - 200 мВ) в реакционных центрах фотосистемы и цианобактерий отсутствует.

е. Показано стабилизирующее влияние глицинбетаина на кислород-

выделякхцуго активность фотосистемы ц у цианобактерий, которое обусловлено предотвращением удалешя^а^ошв^^из^комплекса окисления воды ФС II.

7. Исследование быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов на протеолипосомах, содержащих ФС г из цианобактерий АпасувИз Л1с1и1апз, позволило выявить злектрогенные реакции, обусловленные: а) разделением зарядов между первичным донором электронов ртоо и железо-серным кластером гх; б) переносом электрона между железо-серными кластерами гх и рд/кв и в) восстановлением фотоокисленного Р700+ цитохромом с553.

Автор выражает свою искреннюю благодарность Владимиру Петровичу Скулачеву, Лелю Александровичу Драчеву, Алексею Юрьевичу Семенову, Андрею Дмитриевичу Каулену и Елене Аврамовне Котовой, а также всем сотрудникам отделов биоэнергетики и новых физических методов, без поддержки и помощи которых не могла быть выполнена настоящая работа.

Сокращения : РЦ - фотосинтетический реакционный центр: Ъс^- комплекс - убихинол:цитохром с2 оксидоредуктаза; д^ - разность электрических потенциалов; <зд, <зв - первичный и вторичный хинонные акцепторы электронов в РЦ; г - время, за которое амплитуда изменяется в е раз; ТМФД - - тетраметил-п-фенилендиамин; Е}) - редокс-потенциал среды-, Е - среднеточечный редокс-потенциал переносчика; ч? - редокс-активный остаток тирозина-161 в В1 субъединице РЦ фотосистемы и.

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ РАБОТ, опубликованных по теме диссертации:

1. Драчев Л.А., Каминская О.П., Константинов A.A., Котова Е.А., Мамедов М.Д., Самуилов В.Д., Семенов A.D., Скулачев В.П. Влияние цитохрома с, гексааминорутения и убихинона-ю на кинетику фотоэлектрических ответов реакционных центров ИЗ Rhodospirillum rubrum. Биол. мембраны, 1985, Т.2, с.1060-1080.

2. Семенов A.D., Чаморовский С.К., Мамедов М.Д. Фотоэлектрические процессы при переносе электронов в фотосинтетических реакционных центрах пурпурных бактерий. В сб. материалов х Всесоюзной конференции "Кинетика и механизмы электронного переноса в белковых системах и их моделях". Вильнюс, 1985, с.37.

3. Драчев Л.А., Каминская О.П., Константинов A.A., Мамедов М.Д., Самуилов В.Д., Семенов A.D., Скулачев В.П., Гинс В.К., Мухин E.H. Влияние доноров и акцепторов электронов на кинетику спада фотоэлектрического ответа В хроматофорах Rhodospirillum rubrum И flhodopseudomonas sphaeroides. Биол. мембраны, 1986, т.з, С.213-228.

4. Мамедов М.Д., Драчев Л.А., Кондрашин A.A., Семенов A.D. Ориентация комплексов реакционных центров фотосинтезирующих бактерий в мембранах протеолипосом. В сб. материалов i Всесоюзного биохимического съезда, 1986, Т.З, С.57.

5. Мамедов М.Д., Захарова Н.И., Кондрашин A.A., Семенов А.Ю. Влияние о-фенантролина на электрогенез при первичном разделении зарядов в реакционных центрах Rhodopseudomonas sphaeroides. БИОЛ. мембраны, 1986, Т.З, с.513-518.

6. Семенов A.D., Мамедов М.Д., Минеев А.П., Чаморовский С.К., Гришанова Н.П. Электрогенные стадии в электронтранспортной цепи хроматофоров ИЗ Rhodapseudomonas sphaeroides. Биол. мембраны, 1986, Т.З, С.1011-1019.

7. Drachev L.A., Kaminskaya О.Р., Konstantinov A.A., Mamedov M.D. , Samuilov V.D., Semenov A.Y., Skulachev V.P. Effects of electron donors and acceptors on the kinetics of the photoelectric responses in Rhodospirillum rubrum and Rhodopseudomonas sphaeroides chromatophores. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v.850, p.1-9.

8. Drachev L.A., Kaminskaya O.P., Konstantinov A.A., Kotova E.A., Mamedov M.D., Samuilov V.D., Semenov А.У., Skulachev V.P. The

effect of cytochrome c, hexaaminoruthenium and ubiquinone-10 on the kinetics of photoelectric responses of Rhodoapirillum rubrum reaction centers, Biochim. Biophys. Acta, 1986, v.848, p.137-146.

9. Drachev L.A., Mamedov M.D., Semenov A,Y. The antimycin-

sensitive electrogenesis in Rhodobacter sphaeroides chromatopho-res. FEBS.-Lett.,-1987, v.213, p.128-132. _

10. Драчев JI.А., Мамедов М.Д., Семенов А.Ю. Электрогонсз при трансмембранном переносе зарядов в убихинол:цитохром с2 оксидоре-дуктазном комплексе хроматофоров Rhodopseudomonas sphaeroides. Биол. мембраны, iзет, т.4, с.825-830.

11. Drachev L.A., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Y., Semenov A.Y., Shinkarev V.P., Vex-khovsky M.I. Phase 2 of carotenoid bandshift is mainly due to the electrogenic protonation of the secondary quinone acceptor. FEBS Lett., 1988, v.233, p.315-318.

12. Верховский М.И., Драчев Л.A., Мамедов М.Д., Мудкиджанян А.Я., Семенов А.Ю., Шинкарев В.П. Образование трансмембранной разности электрических потенциалов цитохромным комплексом пурпурных бактерий. БИОЛ. мембраны, 1988, Т.5, С.51-64.

13. Drachev L.A., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Y., Semenov A.Y., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.I. Transfer of ubiquinol from the reaction center to the bc^-complex in Rhodobacter sphaeroides

chroraatophores under oxidizing conditions. FEBS Lett., 1989, v.245, p.43-46.

14. Mulkidjanian A.Ya., Mamedov M.D., Semenov A.Y., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.T., Drachev h.A. Reverse electrogenic. reaction of Rhodobacter sphaeroides bc^-complex under the neutral and alkaline conditions. Abstracts of International symposium "Molecular organization of biological structures", 1989, Moscow, v.1, p.26.

15. Drachev Г..А., Kaurov B.S., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Y., Semenov А.У., Shinkarev V.P., Skulachev V.P., Verkhovsky M.I. Flash-induced electrogenic events in the photosynthetic reaction center and be^-complexes of Rhodobacter sphaeroides chromatopho-res. Biochim. Biophys. Acta, 1989, v.973, p.189-197.

16. Верховский М.И., Драчев Л.А., Мамедов М.Д., Мулкиджанян А.Я., Семенов А.Ю., Шинкарев В.П. Электрогенное протонирование убихино-на реакционного центра в хроматофорах пурпурных бактерий. Докл.

АН СССР, 1989, Т.304, С.209-212.

17. Kondrashin А.А., Semenov A.Y., Drachev L.A. , Mamedov M.D., Zakharova N.I. Orientation of reaction center from Rhodobacter sphaeroides proteoliposomes and the effect of o-phenanthroline on electrogenesis during primary photochemical reaction. J. Bio-energ. Biomembr., 1989, v.21, p.519-526.

18. Drachev L.A., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Y., Semenov A.Y., Shinkarev V.P. , Verkhovsky M.I. Electrogenesis associated with proton transfer in the reaction center protein of purple bacteria Rhodobacter sphaeroides. FEBS Lett., 1990, v.259, p.324-326.

19. Semenov A.Y. , Mamedov M.D., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.I., Zakharova N.I. The electrogenic event associated with the reduction of secondary quinone acceptor in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. In: Molecular Biology of Membrane-bound complexes in Phototrophic Bacteria. Drews G., ed., 1990, Plenum Press, New York, p.329-335.

20. Shinkarev V.P., Drachev A.L., Drachev L.A., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Y., Semenov A.Y., Verkhovsky M.I. Light-induced electron transfer and electrogenic reactions in the bc^ complex of photosynthetic purple bacteria. In: Molecular Biology of Membrane-bound complexes in Phototrophic Bacteria. Drews G., ed., 1990, Plenum Press, New York, p.346-351.

21. Верховский М.И., Гршанова Н.П., Мамедов М.Д., Мулкиджанян А.Я., Семенов А.Ю., Шинкарев В.П. Механизм взаимодействия между фотосинтетическим реакционным центром и цитохромным be.-комплексом у несерных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides. БИОХИМИЯ, 1990, Т.55, ВЫП.7, С.1202-1209.

22. Верховский М.И., Драчев Л.А., Мамедов М.Д., Мулкиджанян А.Я., Семенов А.Ю., Шинкарев В.П. Электрогенная стадия, связанная с образованием семихинонов вторичного акцептора фотосинтетического реакционного центра. Биохимия, 1990, т.55, вып.з, с.з87-зэ4.

23. Мамедов М.Д., Шинкарев В.П., Семенов А.Ю., Верховский М.И. Электрогенная стадия, обусловленная восстановлением qb в протео-липосомах, содержащих фотосинтетические реакционные центры. Биол. мембраны, 1990, т.7, с.730-735.

24. Kutuzov M.I., Mamedov M.D., Semenov A.Yu., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.I., Abdulaev N.G., Drachev L.A. Functioning of the

quinone acceptors in the reaction center of green photosynthetic bacteria Chloroflexus aurantiacus. FEBS Lett., 1990, v.289, p. 179-182.

25. Semenov A.Yu., Kutuzov M.A., Mamedov M.D., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.X. Functional characteristics of the Chloroflexus aurantiacus reaction centers. EBEC Reports, 1990, v.6, p.43.

26. Mulkidjanian A.Ya., Mamedov M.D., Semenov A.Yu., Shinkarev V.P., Verkhovsky M.I., Drachev L.A. Partial reversion of the electrogenic reaction in the ubiquinol:cytochrome c^ oxidoreduc-tase of Rhodobacter sphaeroides under the neutral and alkaline conditions. FEBS Lett., 1990, v.277, p. 127-130.

27. Mulkidjanian A.Ya., Mamedov M.D., Drachev L.A. Slow electro-genie events in the cytochrome bc^-complex of Rhodobacter sphaeroides. FEBS Lett., 1931, v.284, p.227-231.

28. Mamedov M.D., Hayashi H., Wada li. , Mohanty P.C., Papageorgiou G.C Murata N. Glycinebetaine enhances and stabilizes the evolution of oxygen and the synthesis of ATP by cyanobacterial thyla-koid membranes. FEBS Lett., 1991, v.294, p.271-274.

29. Mulkidjanian A.Y., Mamedov M.D., Semenov A.Yu., Drachev L.A. Transmembrane charge transfer in the cytochrome bc^ complex of Rhodobacter sphaeroides. EBEC Short Reports, 1992, v.7, p.68.

30. Mamedov M.D. Stabilization of the oxygen-evolving activity m cyanobacterial photosystem II. Proc. Annual Meeting on Plant Physiol., 1992, v.l, p.2-5.

31. Mamedov M.D., Hayashi H., Murata N. Heat stability of photo-synthetic electron transport in thylakoid membranes from the cyanobacterium. Proc. IXth International Congress on Photosynthesis, 1992, v.4, p.35-38.

32. Shinkarev V.P., Drachev L.A., Mamedov M.D., Mulkidjanian A.Ya., Semenov A.Yu., Verkhovsky M.I. Effect of pH and surface potential on the rate of electric potential generation due to proton uptake by secondary quinone acceptor of reaction centers in Rhodobacter sphaeroides chromatophores. Biochim. Biophys. Acta, 1993, v.1144, p.285-294.

33. Mamedov M.D., Hayashi II., Murata N. Effects of glycinebetaine and unsaturation of membrane lipids on heat, stability of photosynthetic electron-transport and phosphorylation reactions

in Synechocystis PCC6803. Biochim. Biophys. Acta, 1993, v.1142, p.1-5.

34. Мамедов М.Д. Влияние тилаковдных липидов на активность комплекса цитохромов bf. БИОХИМИЯ, 1994, Т.59, С.844-847.

35. Мамедов М.Д., Ловягина Е.П., Верховский М.И., Семенов А.Ю., Черепанов Д.А., Шинкарев В.П. Генерация разности электрических потенциалов фотосистемой и термофильных ционабактерий. Биохимия, 1994, Т.59, С.916-922.

36. Mamedov M.D., Beshta O.E., Samuilov V.D., Semenov A.Yu., Electrogenicity at the secondary quinone acceptor site of cyano-bacterial photosystem II. FEBS Lett., 1994, v.350, p.96-98.

37. Мамедов М.Д., Гаджиева P.M., Драчев Л.A., Заспа A.A., Семенов A.D. Генерация разности электрических потенциалов в препаратах ФС I из цианобактерий. Биохимия ( в печати ).