Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

—СО-

§?

О "*—

О ^ Биологический факультет

■ \

На правах рукописи

СИЛЕЦКИЙ Сергей Алексеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОГЕННОГО ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В ЦИТОХРОМОКСИДАЗЕ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998.

Работа выполнена в отделе биоэнергетики и новых физических методов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник А.А.Константинов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В. Д. Самуилов

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.М.Андреев

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН.

Защита состоится "Л " ¿¿¿-О/*«/ 1998 года в часов на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан л^-^ЛлА 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

М.В.Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В процессе дыхания энергия окислительно —восстановительных реакций превращается дыхательной цепью в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране. Цитохром с оксидаза (ЦО) является терминальным ферментом дыхательной цепи и играет ключевую роль в аэробном дыхании и преобразовании энергии у большинства эукариотов и многих микроорганизмов.

Фермент переносит электроны от цитохрома с на молекулярный кислород, восстанавливая последний до воды, и использует свободную энергию этой сильно экзергонической реакции для электрогенной транслокации протонов через мембрану. ЦО содержит 4 редокс — центра: 2 входных (СиА и гем а) и двухядерный железо —медный кислородоредуктазный центр (Сив и гем а3), который расположен в глубине фермента.

Каталитический цикл фермента длится несколько миллисекунд, в течение которых, как полагают, двухядерный центр ЦО проходит ряд промежуточных состояний, соответствующих последовательному 4-х электронному восстановлению молекулы кислорода до двух молекул воды (схема 1).

Схема 1

О 1? оху —> Р и О

Оз3+ а3-+ аз2+-С>2 а33+- Ог2' аз^-ОН"

На схеме изображены состояния тема а3, □ комплексе с которым происходят редокс — превращения кислорода.

С наружной стороны мембраны в железо — медный центр последовательно поступают 4 электрона, а из матрикса навстречу электронам поперек мембраны переносятся 4 протона, необходимые для образования воды (т.н. "химические" протоны), в результате чего образуется трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода (ДцН + ). Кроме того, цитохромоксидазная реакция сопровождается транспортом через всю мембрану еще 4-х протонов на каждую молекулу восстановленного кислорода ("помповые" протоны). Динамика внутрибелкового переноса протонов и образования трансмембранного потенциала является, возможно, наиболее важной и в то же время наименее изученной областью исследований механизма работы цитохромоксидазы, а также других белков — генераторов ДцН"1".

Перспективным подходом в этом направлении является изучение с временным разрешением каждого из одноэлектронных переходов фермента. Такая возможность появилась в 1992 году, после того как Т.Нилсон впервые применил трис-бипиридиловый комплекс рутения(П) (ЯиВру) для одноэлектронного фотовосстановления ЦО (ГМ^ои, 1992).

Кроме того, в лаборатории Ф.Миллетта (США) был получен ряд производных цитохрома с — физиологического субстрата цитохромоксидазной реакции, ковалентно модифицированного фотоактивными комплексами рутения. Результатом освещения лазерной вспышкой таких производных является фотовосстановление цитохрома с, что позволяет использовать их, как и ЛиВру, для запуска светом цитохромоксидазной реакции.

В каталитическом цикле [ДО каждый из четырех одноэлектронных переходов включает в себя ряд частных электрогенных реакций. Такими реакциями могут быть: перенос электрона между редокс — центрами фермента, электрогенный захват протонов из внутренней водной фазы, а также электрогенный выброс протонов на другую сторону мембраны (если переход сопряжен с трансмембранным переносом протонов).

В 1993 году в нашей лаборатории удалось впервые реализовать измерение кинетики электрогенного переноса зарядов в ЦО (электрона и протонов), используя фотовосстановление фермента ЯиВру в сочетании с разработанным Л.А.Драчевым "прямым" электрометрическим методом регистрации трансмембранной разности электрических потенциалов (ДЧ^). Были зарегистрированы электрогенные реакции, сопровождающие переход ЦО из соединения И фермента в окисленную форму (перенос 4 — го электрона в каталитическом цикле). В настоящее время исследование кинетики генерации трансмембранного потенциала в каталитическом цикле ЦО представляет собой одну из самых актуальных и интересных проблем в изучении этого фермента.

Принято различать в механизме протонного насоса ЦО два основные узла. Во —первых: расположенные вокруг двухядерного центра редокс —сопряженные группы, меняющие значения рК в зависимости от восстановленности редокс —центров. Для каждого из одноэлектронных переходов важно выявить окислительно — восстановительные превращения редокс — центров, которые сопряжены с электрогенными реакциями захвата и выброса протонов этими группами.

Во —вторых: для проведения протонов внутри белка необходимы протонные "каналы", служащие для сообщения внутренней и внешней водной фазы с редокс—сопряженными группами. В 1995— 1996 годах с помощью рентгеноструктурного анализа параллельно в двух лабораториях была получена трехмерная кристаллическая структура ЦО с разрешением 2.8 А. В гидрофобной толще белка выявлено существование как минимум двух разных протонпроводящих структур, соединяющих отрицательно заряженную водную фазу с двухядерным кислородоредуктазным центром и образуемых гидрофильными аминокислотными остатками и связанной водой.

В этих входных протонных "каналах" фермента обнаружено несколько высококонсервативных протонируемых аминокислотных остатка Е286, 0132, К362 и Т359 (здесь и далее нумерация соответствует последовательности субъединицы [ цитохромоксидазы из Ш\оЛоЬас1ет 5р1\асго1ёез), замена которых путем направленного мутагенеза приводит к существенному снижению каталитической активности фермента .шбо полностью ингибирует ее. К362 и Т359 принадлежат к одному и тому же

протон — проводящему пути, который пересекает мембрану перпендикулярно ее поверхности и подходит непосредственно к одному из лигандов Сив, в то время как аминокислотные остатки 0132 и Е286 локализованы в другом протонном "канале", идущем "мимо" кислородоредуктазного центра. Прямое измерение кинетики электрогенной транслокации протонов оксидазами с мутациями по аминокислотным остаткам в протонных "каналах" предоставляет возможность выявить роль данного остатка и "канала" в целом в переносе протонов внутри фермента.

Целью настоящей работы являлось выяснение механизма электрогенного внутрибелкового переноса протонов в цитохромоксидазной реакции. Для этого были поставлены следующие задачи:

Исследовать кинетику окисления — восстановления редокс — центров в Р-Ю переходе митохондриальной ЦО и сравнить ее с кинетикой электрогенного переноса зарядов на этой стадии каталитического цикла.

Используя фотовосстановление ЦО с помощью ЯиВру, выявить и охарактеризовать отдельные стадии электрогенного переноса электрона и протонов в переходе фермента из соединения Р в соединение И (т.е. в ходе переноса на кислород в каталитическом цикле ЦО третьего электрона).

Разрешить электрогенные стадии переноса электрона и протонов, сопровождающие переход Р—Ю в каталитическом цикле бактериальной ЦО дикого типа из НкайоЬагЛст sphacroid.es.

Используя возможности направленного мутагенеза исследовать на примере ЦО из Я. зркаетёез роль отдельных аминокислотных остатков в предполагаемых входных протонных "каналах" ЦО в электрогенном переносе протонов в ферменте.

Научная новизна работы. Показано, что при одноэлектронном фотовосстановлении соединения И цитохромоксидазы из сердца быка, переход оксоферрильного интермедиата гема а3 в окисленное состояние (соединение О) и трансмембранный перенос протонов оказываются разделены во времени. В этих условиях редокс — превращения в ЦО завершаются переносом электрона от гема а к гему а3 с характеристическим временем I мс в реакции {а2+ а34+=02~} —> {ааз3""" —ОН-}.

Синхронно с этой редокс —реакцией фермент образует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по величине переносу одного протона (предположительно "химического") из матрикса в двухядерный центр на половину "электрической" толщины мембраны. Основная часть переноса протонов в ЦО, характеризующаяся значением т~4 мс, происходит уже после завершения окислительно — восстановительных превращений гема а3 и соответствует по амплитуде транспорту одного протона через всю мембрану и переносу на половину толщины мембраны еще одного протона. Предполагается, что восстановление кислородного аддукта гема а3 в И-Ю переходе

сопровождается первоначальным запасанием энергии в "напряженной" конформации белка, последующая релаксация которой сопряжена с трансмембранным переносом протонов ферментом.

Впервые описана кинетика генерации .мембранного потенциала цитохромоксидазой из сердца быка на стадии восстановления кислорода 3 —им электроном (переход Р—»-И). Фермент переводили в соединение Р предобработкой окисью углерода в аэробных условиях. Регистрируемый фотоэлектрический ответ содержит микросекундную нечувствительную к цианиду часть с характеристическим временем 40 — 50 мкс, соответствующую электрогенному восстановлению тема а входной медью (СиА), а также миллисекундную часть, несколько более быструю, чем в случае Р—>0 перехода. Аппроксимация экспериментальных кривых суммой трех экспонент дает: микросекундную компоненту с характеристическим временем -45 мкс и относительной амплитудой 30 — 35%, и две миллисекундные (чувствительные к цианиду) компоненты с т~0.6 мс и -3 мс и близкими вкладами в фотоэлектрический ответ.

Суммарный вклад миллисекундной цианид —чувствительной части кинетики генерации потенциала при одноэлектронном фотовосстановлении соединения Р соответствует переносу в двухядерный центр из матрикса 1 протона, необходимого для образования молекулы воды, и транспорту двух протонов поперек мембраны: одного протона через всю толщину мембраны и другого — на 1/2 ее толщины.

Впервые измерена кинетика генерации мембранного потенциала бактериальной ЦО дикого типа и мутантных форм из К.зрЛаепл'йея при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении фермента с помощью ЯиВру. Регистрируемый фотоэлектрический ответ ЦО дикого типа в условиях одноэлектронного фотовосстановления соединения И фермента содержит три компоненты набора потенциала с характеристическими временами -15 мкс, ~0.4 мс и -1.5 мс и вкладами -30%, -20% и -50%.

Быстрая микросекундная фаза наблюдается для всех мутантных ЦО из Я. $рЬаего1'с1ез и отражает векторный перенос электрона с СиА на гем а. Медленные фазы генерации потенциала отражают внутрибелковый перенос протонов, сопряженный с восстановлением оксоферрильного интермедиата гема а3 (Б) гемом а до окисленного состояния, и включают захват "химического" протона с цитоплазматической стороны мембраны, необходимого для образования Ре3+—ОН- из ре-1+=02~ и трансмембранный перенос "помповых" протонов. Замены аминокислотных остатков К362М и Т359А в канале, предназначенном, как полагают, для переноса субстратных ("химических") протонов, практически не влияют на кинетику генерации потенциала ЦО, тогда как мутации остатков в "помповом" канале (0132Ы и в особенности Е2860) полностью подавляют миллисекундную часть фотоэлектрического ответа.

Для объяснения полученных результатов предлагается модель, основанная на раздельном функционировании протонных "каналов" на стадиях восстановления кислорода в цитохромоксидазе.

Практическое значение работы. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон —транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров.

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва 1997). Результаты также были представлены на 9 —ой Европейской Биоэнергетической конференции (Лувен —ла —Нев, Бельгия 1996), на 2 —ом Европейском Биофизическом конгрессе (Орлеан, Франция, 1997), а также на двух Гордоновских конференциях по биоэнергетике (1995, 1997).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 5 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 схемами и 23 рисунками.

Материалы и методы.

Препарат цитохромоксидазы, выделенной из митохондрий бычьей сердечной мышцы по методике (Fowler et al., 1962), был любезно предоставлен Т.В.Выгодиной и A.B.Кириченко.

Мембраны и, в ряде случаев, препараты выделенных бактериальных цитохромоксидаз дикого типа и мутантных форм из Rhodobacter sphaeroides были предоставлены группой Р.Генниса (Иллинойский университет, Урбана, США) в рамках совместного проекта по изучению механизма переноса протонов в цитохромоксидазе. Выделение из мембран бактериальной цитохромоксидазы, содержащей полигистидиновую ручку, проводили методом аффинной хроматографии на Ni —NTA агарозе (Mitchell et al., 1995). Активность ЦО определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ КН2Р04 буфере (рН = 6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25® С.

Дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку cys—102 трис —бипиридил—рутениевым комплексом был предоставлен Ф.Миллетом (Арканзасский университет, Файетвилль, Арканзас, США.).

Протеолипосомы, содержащие ЦО из митохондрий сердца быка либо из R.sphaeroides, получали методом диализа (Raker, 1972). Раствор фосфолипида ("азолектин") в холате смешивали с белком в соотношении около 40:1.

Электрометрические измерения:

Быструю кинетику образования разности потенциалов митохондриальным и бактериальными ферментами на мембране протеолипосом регистрировали прямым электрометрическим методом с разрешением 100 не (Drachev et al., 1989), адаптированным д\я измерений на цитохромоксидазных протеолипосомах (Zaslavsky et al.. 1993).

На отверстие (d = 4 мм), разделяющее 2 отсека тефлоновой ячейки для электрометрических измерений, наносили коллодиевую пленку, смоченную в декановом растворе фосфолипида (99 % лецитина, 50 мг/мл, и стеариламина, 1мг/мл). Ячейку заполняли 10 мМ HEPES —К.ОН, рН = 7.4. В один из отсеков ячейки вносили липосомы с цитохромоксидазой, добавляли в оба отсека 30 мМ сульфата магния и инкубировали 3 — 5 часов при постоянном перемешивании.

В этих условиях липосомы со встроенным ферментом сорбировались на поверхности мембраны, разделяющей два отсека ячейки. После инкубации липосомы, не связавшиеся с коллодиевой пленкой, удалялись путем замены объема ячейки с помощью перистальтического насоса, и оба отсека заполнялись конечной буферной средой для измерений (5 мМ Трис/ацетат, рН = 8.1).

Разность потенциалов в отсеках регистрировали при помощи защищенных от света Ag/AgCI электродов. Сигнал поступал в операционный усилитель (Burr—Brown) и затем через аналого-цифровой преобразователь DL—1080 (Datalab, England) в компьютер (РС486).

Для одноэлектронного фотовосстановления цитохромоксидазы в электрометрическую ячейку непосредственно перед измерением добавляли трис —(2,2'бипиридил)рутений(Н)хлорид (RuBpy) (Nilsson, 1992). RuBpy, как катион, связывается с ЦО в месте посадки на фермент цитохрома с. Фотовозбуждение RuBpy достигалось лазерной вспышкой (вторая гармоника YAG — лазера (Quantel, 481): длина волны 532 нм, длительность импульса 15 не, мощность 40 мДж). В ответ на вспышку возбужденный RuBpy восстанавливает входную медь цитохромоксидазы (Cu^) менее, чем за 1 мкс. Образующийся окисленный RuBpy(III) ревосстанавливается присутствующим в среде анилином (10 мМ), что делает фотовосстановление цитохромоксидазы необратимым.

Для изучения кинетики генерации мембранного потенциала в P->F переходе фермент переводили в перекисное состояние

(Соединение Р). Для этого через липосомный отсек электрометрической ячейки в течение 1 минуты продували окись углерода (Nicholls, 1981).

Для обработки кинетических кривых и разложения их на экспоненты использовали программу "Discrete" (Provencher, 1976) и GIM (Grafic Interactive Managment), разработанную А.Л.Драчевым.

Оптические измерения:

Кинетику спектральных изменений при фотохимическом восстановлении ЦО RuBpy регистрировали на препарате изолированной митохондриальной цитохромоксидазы, переведенной в обессоленный буфер (Fry et al., 1978).

Измерения проводили в кварцевой микрокювете с длиной оптического пути (3*3 мм либо 4*4 мм). Мониторный свет от галогеновой лампы мощностью 70 вт попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора фирмы Jobin YV011 с шириной щели 2 — 3 мм. Измерения проводились в об,ласти 410 — 450 нм. Пройдя через образец свет поступал через призменный монохроматор на фотоумножитель. Оцифровка сигнала с фотоумножителя происходила с помощью аналого-цифрового преобразователя DL— 1080 (Datalab, England). Далее сигнал заводился в компьютер.

Д\я возбуждения RuBpy, также как и в электрометрических измерениях, использовалась вторая гармоника YAG — лазера (Quantel). Мощность вспышки составляла 50—100 мДж. Для увеличения отношения сигнал/шум проводили накопление 50 — 250 кривых с интервалом 5 секунд. Возбуждающий свет с помощью отражающего зеркала подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света перпендикулярно последнему.

Стационарные спектры поглощения препарата фермента регистрировали на спектрофотометре SLM — Aminco DW2000, используя кювету с длиной оптического пути 1 см.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Роль входных протонных каналов в транслокации протонов цитохромоксндазой.

На рисунке 1А показана кинетика образования разности электрических потенциалов (ДТ) цитохромоксндазой из митохондрий сердца быка, встроенной в протеолипосомы. В случае ЦО, переведенной предварительно избытком перекиси в оксоферрильное состояние, набор трансмембранной разности потенциалов, содержит 3 компоненты: "быструю", "среднюю" и "медленную". Характеристические времена компонент: 40 мкс, 1 мс и 4 мс, а относительные вклады в суммарный фотоэлектрический ответ составляют: соответственно 20, 20 и 60%, что согласуется с (2аз!аузку е1 а!., 1993).

А. Кинетика генерации трансмембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО при одноэлектронном фотовосстаковлении соединения Я.

Условия: буфер 5 мМ Трис —ацетат (рН = 8.1). 40 мкМ 1*и8ру, 10 мМ анилин, 4 мМ

Здесь и далее стрелками изображены моменты лазерной вспышки. Б. Кинетика генерации трансмембранного потенциала ЦО при фотовосстановлении ЯиВуп —производным цитохрома с. На вставке показана начальная часть фотоэлектрического ответа:

Условия: буфер 5 мМ трис —ацетат (рН = 8.1). (0 мМ анилин. 5мкМ Яи —102 —Су1 с.

Микросекундная ("быстрая") компонента генерации потенциала отвечает электрогенному восстановлению тема а входной медью (СиА). При этом электрон переносится с внешней стороны в глубину мембранной части фермента примерно на половину толщины электрического слоя. Основной вклад в генерацию трансмембранного потенциала (80%) вносят миллисекундные фазы (с т~1 мс и т~4 мс), которые отражают стадии векторного переноса протонов в ферменте за счет свободной энергии реокисления гема а кислородоредуктазным центром. Поскольку гем а расположен на том же расстоянии от поверхности мембраны, что и двухядерный центр (1\лга1а е1 а1., 1995;

Рисунок 1

н2о2.

Hinkle & Mitchell, 1970), перенос электрона между ними идет вдоль мембраны и сам по себе не проявляется в электрогенезе.

Вклады 1 мс и 4 мс компонент в суммарный фотоэлектрический ответ (20% и 60%, соответственно) согласуются с электрогенным захватом из внутренней водной фазы в двухядерный центр одного протона, необходимого для протонирования восстановленного кислородного атома в F—Ю переходе, а также электрогенной транслокацией двух "помповых" протонов: одного — через всю мембрану и еще одного — на половину ее толщины (Zaslavsky et al„ 1993).

На рисунке 1Б представлена кинетика генерации трансмембранной разности потенциалов окисленной ЦО при использовании в качестве фотовосстановителя природного субстрата цитохромоксидазной реакции — цитохрома с из дрожжей (Ru —102 — Cyt с), содержащего ковалентно пришитый к остатку цистеина 102 трис — бипиридиловый комплекс рутения. В условиях низкой ионной силы Ru—102 —Cyt с электростатически связывается с ЦО, образуя фермент — субстратный комплекс. В ответ на короткую лазерную вспышку, также как и в случае с RuBpy, ЦО генерирует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по знаку переносу отрицательного заряда внутрь протеолипосом.

В быстрой части фотоэлектрического ответа, также как и в опытах с RuBpy, наблюдается микросекундная компонента (т—40 мкс), отвечающая переносу электрона с СиА на гем а (вставка к рис. 15). В медленной части ответа доминирует фаза, отсутствующая в случае с RuBpy, и характеризующаяся субсекундным значением т~0.5 с, слишком медленным для каталитического цикла фермента. Необычно медленная компонента набора ЛТ является результатом реакции второго порядка между ЦО и избытком восстановленного Ru—102 —Cyt с, образовавшегося в растворе в ответ на лазерную вспышку.

В случае фотовосстановления ЦО с помощью RuBpy не происходит переноса электронов на ЦО в диффузионном режиме (в субсекундной временной шкале). В ответ на вспышку лазера молекула ЦО восстанавливается только от RuBpy, предсвязанного с ней до вспышки. Несвязанные с ЦО фотовозбужденные молекулы RuBpy в растворе возвращаются в основное состояние в наносекундной временной шкале, не успевая прореагировать с ЦО. Далее в работе, для одноэлектронного фотовосстановления ЦО мы использовали RuBpy.

В 1995—1996 годах был сделан рентгено — структурный анализ кристаллов цитохромоксидазы из митохондрий сердца быка и бактериальной ЦО из Paracoccus denitrificans, в результате которого в мембранной гидрофобной части фермента обнаружены две структуры, потенциально способные к проведению протонов из матрикса в двухядерный железо — медный центр. В функционировании этих входных протонных путей (протонных "каналов") ключевое место отводится консервативным аминокислотным остаткам, способным к

протонированию/депротонированию и образующим водородные связи друг другом и с молекулами связанной воды.

В первом протон — проводящем пути — это аминокислотные остатки К362 и Т359, локализованные на полпути между внутренней водной фазой и двухядерным центром, во втором — остатки Б132 и Е286, располагающиеся соответственно в начале и в конце протонного канала. Далее в тексте протон — проводящие пути, содержащие К362 и 0132, будут называться соответственно К —канал и О —канал.

Мы исследовали влияние мутаций по этим аминокислотным остаткам на светоиндуцируемую кинетику электрогенного переноса электронов и протонов в цитохромоксидазе. Мы использовали ЦО из Я. зрЛаегойез дикого типа и мутантов с одиночными заменами ключевых высоко консервативных аминокислотных остатков в протонных "каналах".

Все исследованные мутанты нормально синтезируются и собираются в клетке, и демонстрируют значительное либо полное ингибирование цитохромоксидазной активности в стационарных условиях (табл.).

ТАБЛИЦА

Каталитическая активность цитохромоксидазы дикого типа и мугантных форм из ШюЛоЬаМег яр/ше/чл^ев.

Электрогенная активность цитохромоксидазы дикого типа из Я.зр11аего111е5.

В присутствии ИиВру цитохромоксидаза из дикого типа ПярИавгоШез, как и фермент из сердца быка, генерирует разность электрических потенциалов на мембране липосом (рис.2). Перед вспышкой фермент переводили в соединение И добавлением 1 мМ Н2О2. В этих условиях ЦО дикого типа и мутанты (К362М, 0132М и Т359А) образуют соединение И без сколь —либо значительной продукции соединения Р (УудосНпа е! а!., 1996).

Фотоэлектрический ответ ЦО дикого типа напоминает таковой фермента из сердца быка и содержит быструю микросекундную часть (т~15 мкс при одноэкспоненциальном приближении) и миллисекундную часть, которая аппроксимируется двумя экспонентами с характеристическими временами -0.4 мс и ~1.5 мс, соответствующими "средней" и "медленной" электрогенным фазам в фотоэлектрическом

Фермент

Дикий тип

Число оборотов, с"1 (%)

Т359А 0132И К362М Е2860

1500 (100) 250 (17) 50 (3.3) <5 (<0.3) <5 (<0.3)

ответе ЦО из сердца быка. Таким образом, все три фазы генерации потенциала бактериальной ЦО в 2 — 3 раза быстрее соответствующих компонент для фермента из быка, что коррелирует с более высокой активностью бактериальной ЦО (750 S-1 против 200 s_I при рН = 8).

Относительные вклады в фотоэлектрический ответ состовляют: для "быстрой" компоненты — 30—35%, для "средней" — 15 — 20%, и для "медленной" — 45 — 50%. Полученные значения близки к соответствующим вкладам фаз генерации потенциала ЦО из сердца быка (соответственно 20, 20 и 60%). Цианид калия связывается с гемом а3, стабилизирует его в окисленном состоянии и препятствует переносу электрона от гема а в двухядерный центр. Можно видеть, что KCN полностью ингибирует "среднюю" и "медленную" компоненты генерации ДЧ* в светоиндуцированном переходе F-Ю (рис.2). В соответствии с результатом полученным на цитохромоксидазе из митохондрий сердца быка можно думать, что цианид —нечувствительная микросекундная компонента отвечает переносу электрона поперек мембраны с СиА на гем а, в то время как цианид —чувствительные миллисекундные компоненты отражают электрогенный внутрибелковый перенос протонов, термодинамически сопряженный с восстановлением соединения F гема а3.

Рисунок 2. Цианид калия ингибирует медленные (миллисекундные) компоненты генерации ДЧ' цитохромоксидазой дикого типа из И.зрИаегоШея.

Условия: буфер 5 мМ Трис —ацетат (рН = 8.1), 40 мкМ ЯиВру, 10 мМ анилин, I иМ НЬСЬ; где указано — добавлен 2 мМ КС1М.

Ответы нормированы к амплитуде микросекундной (т-15 мкс) компоненты фотоэлектрического отпета.

Электрогенная активность ЦО с мутациями по остаткам в Б-канале.

Замена консервативных аминокислотных остатков Э132 и Е286 в Э — канале на соответствующие амиды подавляет активность ЦО либо полностью, как в случае с Е2860, либо почти полностью (013214). Нами найдено, что в оксидазе с мутацией Е2860 микросекундная фаза генерации потенциала не изменяется, однако миллисекундные

компоненты, т.е. электрогенный перенос протонов, мутации полностью исчезают (рис.3).

в результате

Двнйтжо

в

X

< 1.5

/

2

Рисунок 3.. Одиночная замена аминокислотного остатка Е286 приводит к исчезновению КС!4' — чувствительной части фотоэлектрического ответа ЦО. Основные условия те же. что и на рис. 2. Для поддержания тема а в окисленном состоянии был добавлен 0.2 мМ феррицианид калия

Кинетические кривые нормированы по амплитуде микросекундной компоненты.

К сожалению неизвестно, образует ли оксидаза с заменой Е286<Э оксоферрильный комплекс тема аз при добавлении перекиси водорода, поскольку спектр выделенного из мембран фермента уже походит на спектр соединения Р. Сходный абсолютный спектр имеет также окси — комплекс ЦО (соединение Оху на схеме 1), в котором восстановленный гем аз связан с молекулой кислорода. Таким образом, не ясно до конца чем объясняется ингибирование миллисекундных фаз генерации потенциала: влиянием мутации Е2860 собственно на перенос протонов внутри фермента или же неспособностью данного фермента образовывать соединение И.

Замена аминокислотного остатка Э132 в устье О —канала на соответствующий амид также не влияет на микросекундную (т~15 мкс) фазу генерации потенциала (рис.4). Однако амплитуда фотоэлектрического ответа мутантного фермента в миллисекундной шкале снижена в 8 — 10 раз, по сравнению с амплитудой ответа дикого типа.

1.5

I

0.5

г

Рисунок 4. Действие замены аминокислотного остатка 0132 во входном протонном О —канале ЦО на кинетику образования мембранного потенциала. Основные условия те же, что и на рис. 2. Где указано — добавлен 1 мМ КСМ

Остаточная медленная часть кинетики у мутанта 0132Ы полностью убирается цианидом и хорошо описывается одной зкспонентой с т~0.6 мс, что довольно близко к характеристическому времени "средней" фазы в фотоэлектрическом ответе ЦО дикого типа (0.4 мс). Если нормировать ответы по амплитуде микросекундной компоненты, го величина цианид—чувствительной компоненты мутантного фермента примерно в 2 раза меньше величины "средней" электрогенной фазы ЦО дикого типа. Медленную компоненту генерации потенциала у мутантной П132Ы ЦО, близкую по скорости к медленной электрогенной фазе для ЦО дикого типа (т~1.5 мс) обнаружить не удается.

Электрогенная активность ЦО с аминокислотными заменами в К-

канале.

Одиночные замены консервативных протонируемых остатков в К —канале приводят к значительной (83% для Т359А) либо полной инактивации фермента (в случае К362М). Однако в отличие от мутаций в О — канале, исследованные замены в К — канале не приводят к существенным изменениям кинетики генерации потенциала при одноэлектронном фотовосстановлении соединения Б. Как можно видеть из данных, приведенных на рисунке 5 фотоэлектрические ответы ЦО с заменой Т359А и ЦО дикого типа практически накладываются друг на друга.

ША

Рисунок 5.. фотоэлектрический ответ ЦО с одиночной заменой Т359А во входном протонном К —канале практически не отличается от ответа ЦО дикого типа. Основные условия те же. что и на рис. 2.

Фермент с мутацией по К362 в отсутствие перекиси водорода образует лишь небольшой фотоэлектрический ответ (рисунок 6, кривая 1), что связано со значительной степенью исходной восстановленности тема а. Окисление тема а в мутантной ЦО феррицианидом разрешает его быстрое фотовосстановление рутением через СиА и приводит к появлению быстрой фазы фотоэлектрического ответа, нечувствительной к цианиду (кривая 2 на рисунке б). Перекись водорода переводит ЦО, мутантную по К362, в соединение И и приводит к появлению в "мертвом" мутанте полностью развитой миллисекундной цианид — чувствительной фазы генерации потенциала (рисунок 6, кривая 3).

1

Рисунок 6. Генерация трансмембраного потенциала ЦО с одиночной мутацией К362М во входном протонном К — канале.

Основные условия те же, что и на рисунке 2. Кинетические кривые были зарегистрированы в следующей последовательности:

1, в отсутвие добавок; 2, после 5 минут инкубации с 0.2 мМ феррицианида калия: 3, после добавления I мМ ; 4, после добавления 0.5 мМ КС(М.

Нечувствительная к цианиду часть ответа мутантной ЦО (т~12 мкс) немного быстрее, чем у ЦО дикого типа. В цианид — чувствительной части кинетики выявляются две компоненты с характеристическими временами, близкими к наблюдаемым в случае ЦО дикого типа. Относительные амплитуды компонент генерации потенциала мутантного фермента состовляют для "быстрой" компоненты ~ 25%, "средней" ~ 5 — 10% и "медленной" ~ 65 — 70%.

Быстрая кинетика окисления-восстановления гемов и ее связь с кинетикой переноса зарядов в цитохромоксидазе на стадии восстановления кислорода четвертым электроном.

Чтобы выяснить природу "средней" и "медленной" компонент генерации А1Р, отражающих электрогенную транслокацию протонов в фотоиндуцированном И->0 переходе, необходимо в первую очередь установить с какими из реакций переноса электрона в ферменте они сопряжены. За переносом электрона между редокс — центрами ЦО можно следить по изменению спектра оптического поглощения фермента.

При фотовосстановлении с помощью ЯиВру оксоферрильного комплекса ЦО из митохондрий сердца быка кинетика изменения экстинкции при длине волны 445 нм (максимум поглощения восстановленного гема а) содержит 3 фазы: микросекундную и две миллисекундные. Микросекундная (т~40 мкс) компонента нарастания поглощения А445, не разрешаемая на рис.7А. соответствует восстановлению гема а входной медью. Достигнув максимума, поглощение А445 спадает в миллисекундой временной шкале, отражая реокисление гема а двухядерным центром (рис.7А). Снижение абсорбции А445 хорошо приближается суммой двух экспонент с теми же величинами т, что и характеристические времена "средней" и "медленной" электрогенных компонент в электрометрических измерениях: 1 мс и 4 мс. Однако, вклады компонент в суммарную кинетику снижения А445, составляют 85% и 15%, что резко отличается от их относительных амплитуд при регитрации Д'Р (соответственно, 20 и 60%).

4

\

X

щ

0-м

- 29 КС -

ДУ

ЛА«5

•рое

9

10

время, мс

Рисунок 7.

А. Кинетика изменения оптического поглощения в полосе восстановленного тема а при фотоиндуцированном одноэлектронном фотовосстановлении ЦО из соединения Я.

Условия: 20 мкМ ЦО, 5 мМ Трис —ацетат (рН = 8.1), 0.05% додецил — мальтозид, 80 мкМ Е1иВру, 0.2 мМ феррицианид калия, 4 мМ Н202

Б. Сравнение скорости электрогенного переноса протонов в Р-Ю переходе фермента со скоростью реокисления тема а.

Миллисекундная цианид—чувствительная часть кинетики генерации потенциала нормирована по амплитуде к кинетике снижения А445.

Таким образом, основной вклад (80 — 90%) в спад абсорбции А445 принадлежит 1 мс компоненте, тогда как ее вклад в фотоэлектрических измерениях состовляет лишь 1/4. Соответственно, кинетика падения А445 (т.е. окисления гема а) значительно опережает чувствительные к цианиду фазы нарастания трансмембранного потенциала и электрогенный перенос протонов (рис.7Б). За время практически полного реокисления гема а происходит четверть суммарного электрогенного переноса протонов в И-Ю переходе. Основная же часть переноса протонов поперек мембраны в ферменте ("медленная" электрогенная компонента с т~4 мс) имеет место после завершения редокс — превращений гема а.

В дальнейших опытах мы попытались выяснить, куда уходит электрон с гема а при его окислении — на гем а3 или на Сив- С этой целью мы проследили за кинетикой редокс — превращений гема а3 в ходе той же фотохимической реакции. На рисунке 8 (кривая 1) представлено изменение поглощения цитохромоксидазы при 438 нм. Эта длина волны близка к максимуму поглощения в разностном спектре оксоферрильного комплекса гема а3 относительно окисленного гема а3, а с другой стороны близка к изобестической точке для окисления — восстановления гема а. Таким образом, регистрация при 438 нм позволяет избирательно следить за превращением гема а3 в И-Ю переходе. Снижение поглощения при 438 нм, отражающее исчезновение полосы поглощения оксоферрильного комплекса гема а3, происходит с характеристическим временем 1,5—1.7 мсек.

N

4

Т^Нтт^

врема

Рисунок 8. Кинетика превращения оксоферрильного комплекса тема а3 в окисленное

состояние при фотовосстановлении фермента ЯиВру.

Условия:

1. 20 чкМ ЦО. буфер 5 мМ Трис-адетат (рН = 8.1), 40 мкМ ЯиВру, 0.2 мМ феррицианида калия. 4 мМ Н^Ог

2. То же что и 1. в присутствие I мМ КСЫ.

Амплитуда изменений оптического поглощения при 438 нм в 2 раза меньше величины ответа при 445 нм, что соответствует ожидаемому соотношению при условии, что на каждый окисленный гем а восстанавливается один гем а3.

Цианид калия разрушает оксоферрильный комплекс тема аз, связываясь с окисленным гемом а3. Как можно видеть из данных на рисунке 8 (кривая 2) добавление цианида препятствует восстановлению гема а3 гемом а в ответ на фотовосстановление от ЯиВру, и ингибирует спад поглощения на длине волны 438 нм.

Низкое отношение сигнал—шум для кинетики изменения А^зд вследствие значительного поглощения фермента на данной длине волны не позволяет выявить достоверных отличий между одно и двухэкспоненциальным приближением экспериментальной кривой. Следует отметить, что при одноэкспоненциаоьном приближении кинетика снижения А445 также характеризуется значением т~1.5 мс. Наложение друг на друга нормированных кривых уменьшения поглощения при 438 нм и 445 нм показывает, что они практически совпадают.

Шнм

«Инн

Лк*"

Рисунок 9. Сравнение скоростей реокисления тема а (445 нм), исчезновения оксоферрильного комплекса гема аз (438 км) и появления окисленного состояниня гема аз (412 нм) в Ь-Ю переходе фермента.

Для удобства сравнения амплитуда кинетической кривой изменения А4Ч5 уменьшена в 2 раза. Условия: те же что и на рисунке В (кривая 1).

Минимум в разностном спектре оксоферрильного комплекса гема аз относительно окисленного гема аз находится вблизи длины волны 412 нм и отражает исчезновение у-полосы высокоспинового гема аз при ~414 нм. Вклад редокс — изменений гема а на этой длине волны минимален. Как видно из рисунка 9 увеличение поглощения при 412 нм (возникновение окисленного гема а3) происходит с той же скоростью (т—1.5 мс), с какой падает экстинкция при 438 нм (исчезновение оксоферрильного комплекса гема а3).

Таким образом, изменения поглощения цитохромоксидазы в миллисекундной временной шкале при 445, 437 и 412 нм (рис.9) в ответ на фотохимическую подачу одного электрона в оксоферрильный комплекс ЦО с помощью ЯиВру происходят со скоростями, совпадающими с точностью до ошибки измерения, т.е. кинетика окисления гема а совпадает с кинетикой восстановления гема а3 Исходя из этого можно утверждать, что при одноэлектронном фотовосстановлении цитохромоксидазы тем а восстанавливает Соединение Р гема а3 до состояния свободной окисленной формы с характеристическим временем около 1.5 мс. Одновременно с этой редокс —реакцией встроенная в протеолипомы ЦО образует трансмембранный потенциал, величина которого соответствует электрогенному переносу 1 протона на половину "электрической" толщины мембраны. В то же время окислительно — восстановительные превращения гемов заметно опережают главную по амплитуде электрогенную стадию транслокации протонов с т~4 мс.

Электрогенные события в цитохромоксидазе на стадии восстановления кислорода третьим электроном

Разработанный ранее подход (Za.slav.sky е1 а1„ 1993) к измерению кинетики генерации трансмембранного потенциала на стадии И-Ю перехода (перенос 4 —го электрона) позволил нам в данной работе исследовать электрогенные стадии, сопряженные с переносом на 02 третьего электрона в каталитическом цикле ЦО (переход Р-Я?).

Прежде всего необходимо было подобрать способ перевести встроенную в липосомы ЦО в соединение Р. Известно, что при продувке окиси углерода в аэробных условиях через детергентный препарат выделенной цитохромоксидазы значительная часть фермента переходит в форму Р (МсЬоИэ & С1гапас1у, 1981). Как показано на рисунке 10 после продувания СО через препарат цитохромоксидазных протеолипосом в разностном спектре развивается симметричный ответ с пиком 438 нм и провалом 414 нм, соответствующий сдвигу полосы Соре тема а3.

Рисунок 10. Спектральные изменения, возникающие при реакции цитохромоксидазы, встроенной в протеолипосомы, с окисью углерода в аэробных условиях (разностный спектр: после обработки окисью углерода "минус" до обработки).

Условия: Липосомы с цитохромоксидазой из митохондрий сердца быка (конечная концентрация оксидазы 1.2 мкМ) в среде, содержащей 75 мМ КНгР04 (рН = 8.0), 1.5 чМ Мд504, а также 0.2 мМ феррицианид калия. 1 мкМ полилизин и каталазу (Ю-8 М, 80 у.е.). Через кювету (не применяя специальных мер для удаления кислорода) продували окись углерода в течение 1 минуты.

В "видимой" области разностного спектра происходит увеличение поглощения с максимумами при 607 и 566 нм. Данные спектральные изменения аналогичны тем, что наблюдаются при обработке окисью углерода детергентного препарата фермента и отражают появление

соединения Р. Используя коэффициент экстинкции 12 мМ" 'см~1 для Аво7 - 630 (Wikstгom1 1992), можно оценить выход соединения Р в препарате протеолипосом величиной 50 — 60% что несколько меньше, чем для детергентного препарата фермента (70%).

Соотношение интенсивностей у и а - полос в разностном спектре показывает, что в этих условиях не образуется сколь —либо заметного количества оксоферрильного состояния ЦО.

Двухядерный центр цитохромоксидазы, прединкубированной в присутствии феррицианида и каталазы (чтобы убрать эндогенную Н202), находится в основном в окисленном состоянии. Светоиндуцированная кинетика генерации Д1? при этом характеризуется преобладающим вкладом микросекундной цианид— нечувствительной компоненты нарастания потенциала с т-40 мкс, отражающей электрогенный перенос электрона с СиА на гем а (рисунок 11, кривая 1). Небольшая медленная часть ответа связана с наличием в препарате окисленного фермента примеси Р и Р соединений (10— 15%).

ч«

Рисунок П. Кинетика генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой на стадии восстановления молекулы кислорода в ферменте 3 —им электроном (одноэлектронное фотовосстаноаление соединения Р). Условия:

I, буфер Трис—ацетат (рН = 8.1), 40 мкМ (*иВру, 0.2 мМ феррицианида калия, каталаза (10-3М, 80 у.е.); 2, после продувания через кювету окиси углерода в течение 1 минуты:. 3, после добавления 1мМ цианида калия.

Продувание через электрометрическую ячейку СО в течение минуты приводит к значительному возрастанию миллисекундных цианид—чувствительных (рисунок 11, кривые 2 и 3) компонент генерации потенциала, отражающих перенос протонов поперек мембраны. Аппроксимация экспериментальных кривых суммой трех экспонент дает: микросекундную компоненту с характеристическим временем ~45 мкс и относительной амплитудой 30 — 35%, и две миллисекундные (чувствительные к цианиду) компоненты с т-0.6 мс и ~3 мс и близкими вкладами в фотоэлектрический ответ. Важно

отметить, что компоненты с т~0.6 мс и т~3 мс несколько быстрее "средней" (т~1 мс) и "медленной" (т~4 мс) компонент генерации потенциала в переходе И-Ю. Кроме того соотношение их амплитуд составляет 1:1, а не 1:3, как в переходе Я-Ю. В результате, как видно из рисунка 12. электрогенный перенос протонов в случае одноэлектронного фотовосстановления соединения Р ЦО заметно быстрее, чем в И—Ю переходе.

Рисунок 12. Электрогенный перенос протонов, сопряженный с переходом фермента из соединения Р а соединение F (кривая 1) быстрее переноса протонов на стадии перехода F-+0 (кривая 2).

Приведены миллисекундные цианид —чувствительные компоненты кинетики генерации потенциала при фотовосстановлении соединений Р и F ЦО.

1, условия те же, что и на рисунке 11 (кривая 2).

2, условия те же, что и на рисунке 1А.

Считая, что выход соединения Р при обработке окисленной ЦО окисью углерода равен 60%, суммарная амплитуда миллисекундных цианид—чувствительных компонент для P->F (80%), оказывается в 4 раза больше амплитуды "быстрой" электрогенной компоненты (20%) что совпадает с соотношением амплитуд электронной и протонной электрогенных фаз в переходе F-Ю. Если векторный перенос электрона от СиА к гему а в быстрой фазе (20% фотоэлектрического ответа) — соответствует переносу 1 заряда на 1/2 толщины мембраны (Iwata et al., 1996; Hinkle & Mitchell, 1970), то остальные 80% — соответствуют захвату в двухядерный центр из матрикса 1 протона, участвующего в образовании воды, и электрогенной транслокации 2-х "помповых" протонов: одного — через всю мембрану и еще одного на 1/2 толщины мембраны.

Обсуждение результатов.

Механизм электрогенного переноса протонов.

Нами исследована кинетика внутрибелкового электрогенного переноса электрона и протонов в ЦО из митохондрий сердца быка при одноэлектронном фотовосстановлении фермента с помощью ИиВру, стартуя с состояний О, Р и Р (перенос 1-го, 3 —го, и 4 —го электронов, соответственно). Перенос 2—го электрона пока не удается наблюдать. Можно утверждать, что скорость переноса электрона между Сил и гемом а (цианид — нечувствительная компонента) практически одинакова в этих соединениях фермента и характеризуется значением т~40 мкс. Напротив, чувствительная к цианиду часть кинетики генерации потенциала, отражающая электрогенный перенос протонов за счет энергии восстановления гема а3, зависит от исходного состояния двухядерного центра. Цианид —чувствительные компоненты заметно отличаются по скоростям и относительным амплитудам для переходов Р—^ и И—Ю, и практически отсутствуют при фотовосстановлении окисленного фермента, (т.к. в соединении О электрон не переносится с гема а в двухядерный центр (Шзбоп, 1992).

В настоящее время большинство авторов схем работы ЦО связывает перекачку "помповых" протонов через мембрану в Р->Р и И-Ю переходе цитохромоксидазы с редокс — превращениями Сив. Полагают, что электрон с гема а переносится сначала на Сив и лишь затем к гему а3, при этом восстановление Си в гемом а и реокисление ее затем гемом а3 сопровождается соответственно захватом протонов с одной стороны мембраны и выбросом их на другую. В противоположность этой точки зрения нами установлено, что в светоиндуцированном переходе Б-Ю митохондриальнон ЦО кинетика реокисления гема а и восстановления оксоферрильного интермедиата гема практически совпадают. Это несколько неожиданное

наблюдение заставляет пересмотреть сложившиеся представления о механизме работы фермента.

Другое важное наблюдение заключается в том, что основная часть генерации потенциала (фаза с т~4 мс) происходит после завершения редокс — превращений гемов а и а3. Мы полагаем, что восстановление гемом а оксоферрильного состояния гема а3 сопровождается возникновением "напряженной" конформации белка. В 4 мс электрогенной фазе свободная энергия редокс — реакции между темами а и а3, первоначально запасенная в белке в виде неустойчивой конфигурации лигандного окружения гема а3 и Сив, используется для трансмембранной транслокации "помповых" протонов.

Электрогенные реакции в цитохромоксидазе, происходящие на стадии восстановления кислорода в ферменте 3 —им электроном, изучены впервые. По нашей оценке амплитуда миллисекундной части

кинетики генерации потенциала для Р->Р и Б-Ю переходов отвечает в каждом случае переносу через мембрану двух "помповых" протонов: одного протона через всю мембрану и еще одного протона на 1/2 ее толщины. Это наблюдение находится в согласии с данными экспериментов по обращению цитохромоксидазной реакции (МЛкзиот, 1981) и по стационарным исследованиям пероксидазной полуреакции ЦО (УудоШпа е1 а1., 1997), из которых следует, что перенос всех "помповых" протонов в оксидазе происходит в Р-»Р и И—Ю стадиях каталитического цикла.

Интересно, что Р-+Р переход цитохромоксидазы, регистрируемый при окислении кислородом полностью восстановленного фермента (т~150 мкс) происходит намного быстрее, чем кинетика переноса зарядов, отвечающая реокислению гема а в Р-»Р переходе в условиях наших опытов.

Причиной данного отличия является разная структура соединения Р в двух типах экспериментов. В соединении Р, образующемся при окислении полностью востановленного фермента, Сид находится в восстановленном состоянии, а в состоянии Р, получающемся при обработке ЦО окисью углерода, — в окисленном. При фотовосстановлении соединения Р ЦО с помощью ЯиВру 3 —а электрон поступает в двухядерный центр с гема а, что может быть медленнее, чем непосредственный перенос электрона в двухядерном центре от Сид на кислородный аддукт гема а3. Другим возможным объяснением является то, что редокс — состояние Си3 может контролировать входной протонный канал, влияя на скорость Р—^ перехода через ускорение протонирования связанного с гемом а3 восстановленного кислородного атома.

Роль протон-проводящих путей цитохромоксидазы в электрогенной транслокации протонов.

Один из наиболее важных и, пожалуй, наименее исследованных вопросов, касающихся механизма работы ЦО — это каким образом протоны переносятся через гидрофобную внутримембранную часть ЦО с одной стороны мембраны на другую. Помимо "помповых" протонов внутри белка должны переносится также и протоны, участвующие в образования воды ("химические" протоны), поскольку двухядерный центр, в котором происходит восстановление 02, спрятан в глубине белка на примерно равном расстоянии от обеих сторон мембраны.

Как уже упоминалось, в субъединице I ЦО выявлены два участка, потенциально способные к проведению протонов внутри ЦО из матрикса к двухядерному центру (К— и О —каналы). По мнению авторов рентгено — структурного анализа один из них (К —канал) служит для проведения "химических" протонов, а О —канал необходим для переноса "помповых" протонов. Согласно принятой модели каталит1гческого цикла ЦО химическая реакция в Р-Ю переходе сопряжена с транслокацией протонов обоих типов, поэтому мутации,

блокирующие как О, так и К канал должны ингибировать переход Р-Ю.

Действительно, мутации в обоих каналах полностью или почти полностью подавляют энзиматическую стационарную активность фермента, однако, как установлено нами, ингибирующее действие двух типов мутаций сильно различается. Замены в О — канале приводят к подавлению чувствительных к цианиду миллисекундных компонент генерации потенциала и, соответственно, электрогенного переноса протонов на стадии Р-Ю. В то же время блокирование К —канала практически не влияет на эту стадию каталитического цикла.

Соответственно, мутации в К —канале не влияют на быструю кинетику окисления полностью восстановленного фермента кислородом (5\уепзБоп е! а1., 1995), тогда как в случае фермента с заменами в О — канале реакция заканчивается восстановлением кислорода двумя электронами и образованием интермедиата, возможно соответствующего соединению Р. Исследования, выполненные недавно в нашей лаборатории совместно с лабораторией Р.Генниса (Урбана, США) свидетельствуют, что мутации в К —канале блокируют восстановление двухядерного центра (переход 0->И), предшествующее связыванию кислорода и требующее захвата протонов из матрикса.

Совокупность перечисленных результатов можно объяснить следующим образом. В каталитическом цикле ЦО различаются две следующие друг за другом полуреакции: собственно оксидазная (или эу —оксидазная), включающая перенос двух электронов в двухядерный центр и захват двух протонов, связывание кислорода и его восстановление двумя электронами до связанной перекиси, и пероксидазная (восстановление связанной перекиси до воды 3 —им и 4 —ым электронами) (схема 2). Можно предположить, что протонный О —канал обслуживает пероксидазную полуреакцию, обеспечивая перенос и "химических", и "помповых" протонов в одноэлектронных переходах Р->Р и Р-Ю. Что касается К —канала, то он необходим для доставки двух протонов, сопровождающих начальное двухэлектронное восстановление двухядерного центра и, возможно, также для переноса двух протонов при образовании первой молекулы воды.

Схема 2.

Каталитический цикл цитохромоксидазы Эу-оксидазная полуреакция Пероксидазная полуреакция.

О Я

Оху

«г

—й в 4

о

нр

>

р

р

1

2Н

Ш

¡Н

Н-О

1И

работает К — канал работает О — канал

Подобно соединениям I и II в пероксидазах интермедиаты Р[ и Рц в данной схеме содержат гем а3 в оксоферрильном состоянии, характеризующемся степенью окисления гемового железа +4, что отличает интермедиаты пероксидазной полуреакдии от эу — оксидазной. Образование оксоферрильного состояния тема а3 с оксеном в качестве сильного аксиального лиганда гемового железа может вызывать изменение конформации фермента (аналогично переходу Я —Т в гемоглобине), сопровождающееся переключением протонных "каналов".

ВЫВОДЫ

1. Методом фотохимического восстановления с применением ЯиВру исследована кинетика образования мембранного потенциала и внутрибелкового переноса электронов на разных стадиях каталитического цикла ЦО из митохондрий быка и И.5рИасго1с1сз.

2. Перенос электрона между СиА и гемом а в цитохромоксидазе из митохондрий сердца быка при фотохимическом одноэлектронном восстановлении соединений О, Р и И не зависит от состояния двухядерного центра и характеризуется значением т~40 — 50 мкс.

2. Фотоиндуцированный переход ЦО из состояния Р в состояние Я сопровождается электрогенным переносом двух "помповых" протонов: одного — через всю мембрану и еще одного — на половину ее толщины.

3. В переходе И->0 цитохромоксидазы из митохондрий сердца быка перенос электрона от гема а на гем а3 характеризуется значением т~1.5 мс. Синхронно с редокс — реакцией фермент образует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по величине переносу одного протона (предположительно "химического") на половину толщины мембраны. В то же время окислительно — восстановительная реакция между темами заметно опережает основную часть электрогенного переноса протонов ферментом, характеризующуюся значением т~4 мс и соответствующую транспорту одного протона через всю мембрану и еще одного на половину ее толщины.

4. Фотовосстановление встроенной в липосомы ЦО дикого типа из й.5рЛсге/о/£?е5 сопровождается образованием трансмембранной разности потенциалов, содержащей три стадии внутрибелкового электрогенного переноса электрона и протонов, похожие на те, что наблюдаются в случае митохондриальной ЦО. Соответствующие фазы генерации Д47 ферментом из Н.зр1гаего1с1ез примерно в 2 раза быстрее, чем в случае ЦО из митохондрий, что согласуется с более высокой энзиматической активностью бактериальной ЦО.

5. Входные протонные пути цитохромоксидазы, связывающие внутреннюю водную фазу с двухядерным центром (И —канал и К — канал) обслуживают разные стадии цитохромоксидазной реакции. Б — канал необходим для электрогенного переноса протонов на стадии перехода Р-Ю и, возможно Р-*Р, в то время как К — канал не нужен для

И-Ю перехода и, предположительно, работает на более ранних стадиях каталитического цикла.

Список печатных работ

1. Zaslavsky, D.L., Smimova, I.A., Siletsky, S.A., Kaulen, A.D., Millett, F. and Konstantinov, A.A. Rapid kinetics of membrane potential generation by cytochrome c oxidase with photoactive Ru( II) — iris — bipyridyl derivative of cytoclirome c as election donor. FEBS Lett., 1995. v.359, p.27-30.

2. Siletsky, S.A., Kaulen, A.D., Mitchell, D., Gennis, R.B., Konstantinov, A.A. Resolution of two proton conduction pathways in cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 1996, v.9, p.90.

3. Mitchell, D., Siletsky, S.A., Kaulen, A.D., Konstantinov, A.A., Fetter, D A.. Mills, D.A., Ferguson — Miller, S.. Gennis, R.B. The use of mutants to study the putative proton — conducting channels in the heme —copper oxidases. EBEC Short Reports (List of participant and late abstract), 1996, p.3.

4. Siletsky, S.A., Kaulen, A.D.. Konstantinov, A.A. Electrogenic events associated with peroxy— to— ferryl —oxo state transition in cytochrome c oxidase. Eur. Biophys. J., 2nd European Biophysics Congress, 1997, v.26, p.98.

5. Konstantinov, A.A., Siletsky, S., Mitchell, D., Kaulen, A, Gennis, R.B. The roles of the two proton input channels in cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides probed by the effects of site — directed mutations on time — resolved electrogenic intraprotein proton transfer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, v.94, p.9085-9090.

1. ЦО — цитохром с оксидаза.

2. RuBpy — трис —(2,2'бипиридил)рутений(П)хлорид.

3. Ru— 102 — Су! с — цитохром с из дрожжей, меченный RuBpy по остатку цистеина — 102.

4. Д'Р — трансмембранная разность электрических потенциалов.

5. ДцН+ — разность электроохимических потенциалов ионов водорода на мембране.

6. Трис — трис(гидроксиметил)метиламин.

7. НЕРЕБ — Ы — 2 — Гидроксиэтилпиперазин — Ы' — 2 — этансульфоновая кислота.

Список используемых сокращений.