Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние белокмодифицирующих агентов на энергопреобразующие комплексы сопрягающих мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние белокмодифицирующих агентов на энергопреобразующие комплексы сопрягающих мембран"

ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ я4 АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

УДК 577.121 + 577,345

БЕЛЯНОВИЧ Лидия Михайловна

г

ВЛИЯНИЕ БЕЛОКМОДИФИЦИРУЮЩИХ АГЕНТОВ НА ЭНЕРГОПРЕОБРАЗУЮЩИЕ КОМПЛЕКСЫ СОПРЯГАЮЩИХ ' - МЕМБРАН

03.00.02 - Бнофнзнка

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1995

Работа выполнена в лаборатории биофизики и фотобиологии мембран Института фотобиологии АН Беларуси (зав. лаб. - академик АН Беларуси С.В.Конев).

Научный руководитель: д.б.н., академик АН Беларуси С.В.Конев

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Е.А.Черницкий, к.х.н., в.Н.с. С.П.Марцев

Оппонирующая организация: . кафедра биофизики Белорусского государственного университета

Защита состоится "22." АСКДбрЯ 1995 г. в У^ ~часов на заседании Совета по защите диссертаций (Д.01.37.01) в Институте' фотобиологии АН Беларуси по адресу г. Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси.

"Автореферат разослан "й{"НОЯБРЯ 1995г.

Ученый секретарь Совета по защите дисерТаций кандидат биологических наук

Л Ф" Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Изучение механизмов преобразования энергии живыми клетками относится к одной из важнейших и до конца не решенных проблем современной биологии. Как стало очевидным в последние десятилетия, основной зоной преобразования энергии света и окисляемых субстратов в доступную для клетки форму - макроэргическую связь АТФ, являются специализированные, так называемые, сопрягающие мембраны. К настоящему времени строение и физиологические свойства указанных структур, содержащих различные цепи транспорта электронов и особую ферментную систему, синтезирующую АТФ, исследованы достаточно полно. Общепризнано, что энергия электронов, переносимых от окисляемых субстратов на конечный акцептор, как Правило кислород, первоначально преобразуется в трансмембранный : электрохимический градиент протонов (АцН+), который служит движущей силой синтеза АТФ в АГФ-синтетазном комплексе. Если в изучении функционирования Н+-АТФ-сицтетааного комплекса достигнут значительный прогресс, то механизмы трансмеибраннаго переноса прогонов комплексами дыхательной цепи остаются в значительной степени неустановленными. Господствующая до настоящего момента хемиосмотическая теория сопряжения /МиЬеН, 1966/ сегодня все больше противоречит новейшим данным о строении энергопреобразующих комплексов сопрягающих мембран. В последнее время все активнее привлекаются представления о конформационной подвижности белков сопрягающих комплексов чак ключевом этапе Преобразования энергии. Именно с этих позиций Интерпретируется механизм функционирования АТФ-синтегазного комплекса сопрягающей мембраны. Экспериментальное обоснование роли конформационных перестроек в сопряжении энергии потока электронов и синтеза АТФ представляется, таким образом, актуальной и значимой задачей современной биофизики.

Связь работы с крупными научными программами

Различные этапы настоящей работы' выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследовании (регистрационный № 01.89036810) и МП-07 Фонда Фундаментальных Исследований Республики Беларусь.

Цель и задачи исследования

В рамках данного исследования предполагалось выяснить роль конформационной подвижности энергопреобразующих комплексов сопрягающей мембраны митохондрий в акте трансформации энергии. С этой целью был использован ряд химических и физических воздействий, модифицирующих структуру белков, участвующих в процессах преобразования энергии.

- определение влияния бифункциональных белоксшивающих реагентов на параметры функциональной активности компонентов алектронтранспортной цепи как в составе интактных митохондрий и искусственных протеолипосом, так и в растворе с детергентом.

- установление модифицирующего действия ограниченного протеолиза на физиологические характеристики белковых комплексов дыхательной Цепи митохондрий, участвующих в реакциях преобразования энергии;

выяснение механизма фотодеблокирования 9лектронтранспортной и протонпереносящей функций дыхательной цепи митохондрий, ваингибированной цианидом, а также фотодеблокирования изолированной цитохромоксидазЫ в присутствии других ингибиторов дыхания;

- определение зависимости эффекта фогодеблокйрования цитохром-с-оксидазы в составе митохондрий от осмотического потенциала среды;

- определение действия физиологических концентраций АТФ на каталитические и спектральные параметры изолированной цитохромоксидазЫ в присутствии ингибиторов;

- анализ влияния видимого света на спектральные свойства изолированной оксидазы как в присутствии, так и в отсутствие малых лигандов окисленной формы гема аз-

Научная ноинвпа полученных результатов

Установлено, что ограничение конфирмационной подвижности белков дыхательной цепи Митохондрий как В составе интаитных органелл, так и встроенных в искусственные протеолипосомЫ, не затрагивает их алектронт^анспортную, но блокирует электрогенную (протонпереносящую) функцию.

Впервые показано активирующее действие видимого света на функциональную активность цитохромоксидазЫ митохондрий в присутствии ингибиторов - лигандов окисленной формы гема аз-

Показано выраженное дейнгибирующее действие физиологических концентраций АТФ на каталитическую активность солюбилйзированной цитохромоксидазЫ.

Обнаружено, что облучение видимым светом существенно модифицирует спектроскопические параметры окисленной формы изолированной оксядазы.

Ограниченный протеолиз интакгНых митохондрий мало влияет На скорость переноса электронов, Но полностью подавляет трансмембранный выброс протонов в дыхательной цепи.

Установлено, что кинетические параметры взаимодействия цитохромоксидазЫ ..митохондрий с цианидом зависят от осмотическогопотенциала среды.т.егиаходятся" под мембранным контролем.

Практическая в экономическая значимость полученных результатов

Результаты работы существенно расширяют и углубляют современные представления о функционировании' энергоПреобразуюсЦИХ комплексов митохондрий. Помимо этого, Полученные данные позволяют предположить, что некоторые патологические состояния, сопровождающиеся локальным снижением уровня энергетического Метаболизма за. счет угнетения его ключевого звена цитохромоксидазЫ, могут корректироваться световым воздействием, либо другими модуляторами активности фермента.

Основные положении диссертации, выносимые на защиту

1. Ограничение конформащионной подвижности с помощью коаалентнмх сшивок, либо ограниченный протеолиз энёргопреобразующих комплексов митохондриальной мембраны мало отражается на их алектронгранспортной активности и полностью подавляет функцию утилизации энергии.

2. Трансмембранный осмотический потенциал существенно влияет на кинетические параметры взаимодействия интегрального белка сопрягающей мембраны •• цитохромоксидазы, с ингибитором.

3. Видимый свет и . АТФ в физиологических концентрациях меняют кинетические параметры взаимодействия оксидаэы с малыми лигандами-ингибиторами.

4. Видимый свет реактивирует электронтранспортную и протонпереносящую функции цианидного комплекса оксидазы как в составе митохондрий, так и встроенной в искусственные протеолипосомы.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен при решающем участий автора. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.

Апробации результатов диссертации

Результаты исследований апробированы на I Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 22-23 ноября 1994 г.).

Опубликованность результатов

По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезис.

Структура и объем диссертации'

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение (2 главы); заключения, выводов и списка использованных источников, содержащей 186 наименований. Работа изложена на 135 страницах, содержит 38 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основных обтн-ктоп исследования использовали изолированные митохондрии нгчени крмсы, искусственные протеолипосомы со встроено"! цитохром-с-оксиданои и нчолироппнную ПО в растворе с детергентом.

Митохондрии получены из печени крыс методом дифференциального центрифугирования. Протеолипосомы со встроенной ЦО (1,3 мг белка в мл) получены диализным методом. Изолированная цитохром-с-оксидаза выделялась из сердечной мышцы быка по методу Ионетани /Yonetani, 1960/. Дыхательную активность препаратов (электронтранспортная функция) измеряли полярографическим методом по потреблению кислорода. Скорость потребления кислорода расчитывали по полярографическим кривым и выражали в нг атомов От на мг белка в минуту. Электрогенную (протонпереносящую) функцию образцов оценивали потенциометрическим методом по Са2+/Н+-обмену (для изолированных митохондрий) и методом проникающих ионов с использованием ТРР+-чувствительного электрода. Спектральные изменения образцов регистрировались методом дифференциальной абсорбционной спектрофотометрии.

Количественное определение белка выполняли по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Облучение препаратов видимым светом использовалось в опытах по изучению эффекта фотодеблокирования дыхательной цепи митохондрий и изолированной ЦО в присутствии ингибиторов, а также по влиянию видимого света на спектральные параметры солюбилизироваиного фермента. Источником света служила галогеновая лампа накаливания мощностью 300 Вт. Продолжительность облучения составляла 35 минут с интенсивностью 1-1,2 кВт/м2.

Химическая модификация митохондриальных белков и изолированной ЦО проводилась с использованием бифункциональных сшивающих реагентов различной природы: дициклогексилкарбодиимиД (ДЦКД) и глутаровьш альдегид фирмы "Merk", диметил-3,3-дитио-бис-пропионимидат (ДТБП), дитио-бис-сукцинимидилпроминат (ДСП), ■ 1,10 - фенантролин фирмы "Sigma" и диметилсуримидат (ДМС) фирмы "Serva".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние химической модификации сшивающими реагентами на функциональные параметры дыхательной цепи митохондрий

Согласно конформационной гипотезе сопряжения, энергия потока электронов первоначально акцептируется в форме конформационно-напряженного состояния -белков -переносчиков —/ Конев,—1967~Вауе1~1Л ~а] —1977/—Предполагается—что~их~

релаксация в исходное состояние сопряжена с актом трансформации энергии в стабильную и доступную форму: формирование мембранного потенциала и синтез

АТФ.

Использование модифицирующих реагентов различной химической природы, ограничивающих подвижность белков митохондриальной мембраны, позволило получить данные об их влиянии на Функциональные параметры митохондрий /Конев и др., 1986/. При этом можно предполагать, что ограничение конформационной подвижности белков-переносчиков сильнее скажется на переносе протонов, чем на электронном транспорте, поскольку первый процесс прямо определяется

динамическими свойствами белка, в то время как для второго конформационнаи подвижность может быть несущественым, либо даже тормозящим фактором вследствие "децентровки" донорно-акцепторных групп комплексов редокс-цепи.

Как видно из рисунка 1, классический бифункциональный сшивающий реагент, диметилсуберямидат (кривая .2), образующий сшивки по аминогруппам, в концентрации 5' мМ вызывает выраженную активацию потребления кислорода. Другой сшивающий агент, ДЦКД (кривая 2), формирующий дополнительные внутри- и Ыежбелковые пептидные связи, вызывает сходный эффект - стимулирует влектронтранспортную цепь в концентрации 50 мкг/мл после 10- минутной инкубации. Лишь высокие концентрации ДЦКД - 200 мкг/мл (кривая 3), вызывали видимое снижение скорости потребления кислорода. Более низкие концентрации агентов (1 мМ и 10 мкг/мл, соответственно) заметным образом не влияют на скорость дыхания митохондрий. Полученные данные свидетельствуют о некритичности динамической подвижности белков ДЦ для переноса электронов при достаточно "мягких" условиях сшивания, а наблюдаемая стимуляция дыхания может быть следствием оптимизации ■ взаимоориентации переносчиков. Глутаровый альдегид, также классический сшивающий реагент по аминогруппам, в 0,1% концентрации несколько снижал скорость потребления кислорода митохондриями (кривая 4), однако, можно подобрать такие условия сшивания (2,5 мМ, 5 минут инкубации), при которых не будет наблюдаться угнетения электронгранспортной функции митохондрий.

Обратимо сшивающие реагенты: полярный диметил-3,3-дитио-бис-пропионимидат (ДТБП) в концентрации 1 мМ повышал скорость дыхания митохондрий (кривая 5), а более гидрофобный дитио-бис-сукцинимидилпропионат (ДСП) также в концентрации 1 мМ несколько замедлял этот процесс (кривая 6). Добавка Д11, расщепляющего -Б-в-связь внутри молекулы сшивающего реагента, обращала действие обоих веществ (ие показано). Таким образом, на основании результатов, полученных с использованием ДТБП, можно полагать, что формирование ковалентных мостиков в полярной области белковых энергопреобразующих комплексов не приводит к связыванию тех аминогрупп, которые сами по себе существенны для алектронтранспортной функции. Медь-фенантролиновый комплекс, М-Ф2 (кривая 7) образующий короткие Б-Б -"мостики" из 2-х ЭН - групп после двухминутной прединкубации заметно' стимулировал дыхание митохондрий в концентрации 10 мкМ. При содержании 5 мкМ он не оказывал подобного действия. Качественно сходные изменения скорости дыхания под влиянием ДТБП И М-Ф2 наблюдались у митохондрий и при утилизации аскорбата в присутствии антимнцина А, т.е. когда тестировалась электронтраиспортная активность голи ко терминального участка ДЦ.

Таким образом, ограничение подвижности белков ДЦ за счет "мягкого сшивания не снижает, а* в большинстве случаев повышает скорость транспорта электронов, что может ' указывать на фиксацию оптимальной для редокс-преьращсшш пространственной взаимоориентацип-переносчиков электронов.

- Рис. 1 Влияние бифункциональных сшивающих ' реагентов на скорость дыхания митохондрий при температуре 20°С. \ Í - контроль в отсутствие сшивающих реагентов;

2 - скорость дыхания при добавлении 50 мкг/мл _ j ДЦКД либо 5 мМ ДМС; 3 - при добавлении 200 ■Э мкг/мл ДЦКД; 4 - При добавлении 0,1% ГА; 5-1 Ч мМ ДТБП; 6 - 1 мМ ДСП; 7 - 5 мкМ М-Ф2.

Мгх - митохондрии (1,8 мг белка в мл), Р - ротенон "6 (3 мкМ), Са2+ -200 мкМ, С - сукцинат натрия (5 мМ).

Вопрос о молекулярных механизмах переноса протонов в энергосопрягающих мембранах в рамках хемиосмотическок теории до настоящего времени остается невыясненным. Экспериментальные данные последних лет делают все более' обоснованной точку зрения, согласно которой перенос протонов обеспечивается энергией напряженного конформационного состояния белков элекгронтранспортной цепи, формирующегося при редокс-превращениях переносчиков электронов /Wikstrom et al, 1984/. В связи с этим, нами изучалось влияние химических агентов, ограничивающих конформационную подвижность белков, и на эффективность трансмембранного переноса протонов в митохондриях.

На рисунке 2 представлены данные о влиянии всех перечисленных выше химических реагентов, ограничивающих подвижности белков мигохондриальной мембраны, на трансмембраиныи выброс протонов. Поскольку, как ранее показано /Конев и др, 1986/, при снижении температуры инкубации от 25 до Ю-14°С величена закисления среды за счет кальций-протонного обмена возрастает в 3 раза, измерения проводились при 12,5 "С. ДЦКД в концентрация 50 мкг/мл и ДМС в концентрации 5 мМ на 90% ингибировали энергозапасающую функцию митохондрий (кривая 2). Несколько в большей степени проявляется ингибирующее действие глутарового альдегида, формирующего короткие сшивки (кривая 3): 2,5 мМ ГА ингибирует• энергозапасание в митохондриях на 95%. Полученные данные подтверждают предположение о том, что выброс протонов на уровне митохондриальной мембраны прямо определяется динамическими свойствами белков электронтранспортной цепи.

ДТБП и ДСП в концентрациях 1 мМ (кривая 4) вызывали почти полное подавление энергозапасающей функции электронтранйюртной цепи митохондрий,-~ которая в значительной мере (на 50-80%) восстанавливалась после расщепления сшивок с помощью ДТТ. Из этрго следует, что энергозапасание подавляется не за счет химической модификации белка (связывание аминогрупп), а в результате ограничения конформацнонной подвижности макромолекулы.

В то же время, М-Ф^ в концентрации 5 мкМ после двухминутной предыикубации (кривая 5) полностью блокировал выброс протонов митохондриями. Столь высокая, по сравнению с ДСП и Д Г БП эффективность М-Ф2 вероятно, обусловлена не только более жестким сшиванием белков за счет образования

коротких дисульфидных мостиков, но и модификацией существенных для процессов трансформации энергии SH-rpyrai.

ftx PQq^

Рис. 2 Интенсивность индуцированного кальцием эакисления инкубационной среды митохондрий в присутствии различных концентраций сшивающих реагентов.

"TÍO ri 1 - контроль в отсутствие сшивающих реагентов;

1Ш 2 ' 10 "^А" ДЦКД или 1 мМ ДМС; 3 - ГА 2,5 мМ; 4 - 1 мМ ДТБП или 1 мМ ДСП; 5 - 5

икМ М-Ф2. Мтх - митохондрии (1,8 мг белка мл), С - сукцинат натрия (5 мМ), Р - ротенон (Ъ мкМ), Са2+ 200 мкМ, температура - 12,5"С.

Таким образом, трансмембранный перенос протонов оказался намного более чувствительным к ограничению подвижности белков по сравнению с электронпереносящей функцией, что свидетельствует в пользу прямого участия конформационной динамики белков-переносчиков в транслокации протонов с созданием их электрохимического потенциала. Полученные данные подтверждают представления о необходимости определенного уровня динамической подвижности белков алектронтранспортной цепи митохондрий для трансмембранного переноса протонов.

2. Модификация реакций преобразования энергии в результате

ограниченного протеолиза митохондрий

Протеолиз, как метод исследования молекулярной организации структурных элементов клетки, весьма успешно применяется в биохимии и используется при изучении структуры и функций как изолированных ферментов, так и биологических мембран /Уаташою ¿1 а1, 1972/. В качестве протеиназы, модифицирующей мембрану, нами использовался трипсин (250 мкг/мл), гидролизующий пептидные связи, в образовании которых принимают участие карбоксильные группы основных аминокислот - аргинина и лизина. На рисунке 3 отражено действие ограниченного протеолиза митохондрий на скорость потребления кислорода последними. Видно, что даже после 30 минут (кривая 3) переваривания, дыхание митохондрии остается Практически на одном уровне с контрольным и лишь через час их алектршггранспортная функция несколько снижается (кривая 4). Совершенно иная картина наблюдается "рис; 4" при исследовании протонпереносящей функции митохондрий в условиях ограниченного протеолиза: уже через 20 минут (кривая 2) инкубирования с трипсином размах закисления среды составляет лишь 30% от контрольного значения, а через 30 минут - падает до нуля. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в ^результате протеолиза преимущественно нарушается протонпереносящая функция полипептидных комплексов сопрягающих мембран, в то время как транспорт электронов к атому воздействию менее чувствителен. Наиболее вероятно, это свидетельствует о том, что трансмембранный выброс протонов в. большей степени зависит от интегративной целостности

энергопреобразующих белковых ансамблей, чем транспорт электронов: Возможно также, протонпереносящая функция ассоциирована с цитозольными доменами упомянутых комплексов, доступных протеолитическому ферменту.

Р С

Рис. 3 Влияние ограниченного протеолиза на электронтранспортную функцию дыхательной цепи митохондрий.

1 - контроль. 2-20 минут инкубирования с трипсином (250 мкг/мл), 3 - 30 минут, 4 - 60 минут. Содержание митохондрий - 1,8 мГ белка в 1 мл, Цс - цитохром с (15 мкМ). Среда содержала 5 мМ сукцнната натрия,- -температура 20°С. .

\lm¡»

J

W1 '

Рис. 4 Влияние ограниченного протеолиза на протонпереносящую функцию дыхательной цепи митохондрий.

1 - контроль, 2 - после 20 минут инкубирования с трансином (250 мкг/мл). С - сукцинат натрия (5 мМ), Са2+ - 200 мкМ, Температура 20°С.

Опыты показали, что ' мягкий протеолиз изолированных митохондрий не затрагивает барьерные свойства их внутренней мембраны, а также электронтранспортные параметры редокс-цепи, полностью нарушая при этом ее протонпереносящую .функцию. Данные свидетельствуют о критичности расщепления незначительного числа пептидных связей в белках ДЦ для энергозапасающей, но не для электронтранспортной функции последней.

3. Влияние ограничения конформационной подвижности цитохромоксндазы, встроенной в протеолипосомы, на скорость потребления кислорода в формирование мембранного потенциала

Чтобы подтвердить полученные результаты, свидетельствующие о роли конформационной подвижности белков-переносчиков ДЦ в механизмах энергосопряжеиия, исследования были продолжены на. модельной системе - ЦО-содержащих искусственных фосфолипидных везикулах - протеолипосомах. На этом объекте (при утилизации аскорбата в качестве источника восстановительных эквивалентов) исследовались электрон- и протонпереносящая функции ЦО, а также -влияние—ограничения "Конформационной подвижности > цитохромоксндазы на "указанные функции. В сравнении с другими энергосопрягающими комплексами. ЦО имеет то несомненное преимущество, что ее функциональные параметры могут реметрироваться достаточно просто и надежно.

Как видно из рисунка 5, ограничение конформационной подвижности белковой области ЦО в составе протеолипосом (при помощи ГА в различных концентрациях) мало влияет на скорость потребления кислорода в случае "мягкого" сшивания (кривая 2), но подавляет указанный процесс снижается (до 20% от контрольного значения) при более жестком сшивании (кривая 3). Ковалентное сшивание ЦО,

f

включенной в протеолнпосомы, как и в случае митохондрий "см. рис. 2", блокирует ее электрогенную (протонпереносящую) функцию "рис. 6*.

Полученные данные согласуются с представлениями о том, что ограничение конформационной подвижности электронтранспортных белков митохондриалыюй мембраны (в частности ЦО) существенно отражается на их энергопреобразующен функции.

До ТШ к i

Рис. 5 Влияние ко валентно го сшивания, вызываемого глутаровым альдегидом, на электронтранспортную функцию цитохромоксидазы, включенной в фосфолшшдные везикулы (протеолнпосомы; 1,3 мг белка ЦО в 1 мл). Скорость потребления кислорода после 5-минутной экспозиции с 2 мМ ГА (2) и после 3 -минутной экспозиции с 10 мМ (ок. 0,1%) ГА (3); 1 -контроль. Цс - цитохром с (15 мкМ), А - лскорбат натрия (5 мМ), ТМФД - тетраметилфениленднамин (0,15 мМ), температура - 20°С.

Цо Д

Рис. 6 Влияние ковалентного сшивания, вызываемого

глутаровым альдегидом, на протонпереносящую функцию цитохромоксидазы, включенной в фосфолипидиые везикулы (протеолнпосомы; 1,3 мг белка ЦО в 1 ил). Генерация мембранного потенциала протеолипосомами в присутствии 2 мМ ГА, 5 минут инкубации (2) и 10 мМ ГА, 2 минуты инкубации (3); 1 - контроль. Цс -цитохром с (15 мкМ), ТМФД - тетраметилфенвлендиа-мин (0,15 ыМ), А - аскорбат натрия (5 мМ), температура 20°С.

4. Влияние видимого света на функциональные параметры дыхательной цепи митохондрий в присутствии ингибитора (аффект фотодеблокнрования )

Действие различных дыхательных ядов на редокс-цепи митохондрий как животного, так и растительного происхождения, а также бактерий, как правило, необратимо. Известным исключением является окись углерода (СО), ингибитор терминального комплекса цепи переноса электронов, цитохром-с-оксидазы. При действии видимого света СО диссоциирует из мест связывания, в результате чего функциональная активость ДЦ восстанавливается /Denis et al, 1985/. Подобного, деингнбирующего, эффекта видимого света, вероятно, можно ожидать и для других дыхательных ядов терминального участка ДЦ митохондрий, что и исследовалось в последующей работе.

Как видно из рисунка 7 (кривая 1), электронтранспортнак функция митохондрий, зацнгпбиропашшх цианидом, обратимо восстанавливается при действии видимого света. Фотодеблокирование наблюдалось как при использовании еукшшата - источника восстановительных эквивалентов начального звена ДЦ, так и аскорбагл, локирующего электроны на уровне ЦО, что дополнительно

подтверждает цитохромоксидазную природу эффекта. Фотодеингибирование дыхания митохондрий оказалось зависимым от температуры среды инкубации: оно более выражено при 15°С (кривая 1), чем при 30°С (кривая 2).

|Мя ,В6ео+

" * Рис.7 Фотодсблокирование дыхания митохондрий

при 20°С (125мкМ KCN, кривая 1), при 15°С (50 I мкМ КСЫ. кривая 2) и при 30°С (250мкМ КСИ, ^ кривая 3) при утилизации 5 мМ сукцината натрия .' (кривая 1) и 5 мМ аскорбата натрия (кривая 1а). " Мтх-митохондрии (1,2 мг белка в мл-кривая 1; <| 0,75 мг белка в мл-кривые 2 и 3), ТМФД-тетраметилфенялендиамин (0,15 мМ).

В результате исследований была установлена характерная особенность: с повышением температуры повышается также и минимальная ингибирующпя концентрация цианида. Если при 15°С для ингибирования ДЦ на 80-90% (по отношению к контролю) необходимо было 50 мкМ КС1Ч, то при 20°С требовалось уже 125 мкМ ингибитора, а при 30°С - 250 мкМ КСГ"<1. Иными словами, с повышением температуры в ДЦ. понижается сродство к ингибитору, что, по-видимому, подтверждает роль равновесной динамики белков-переносчиков в функционировании ДЦ митохондрий.

Закономерным представлялось выяснить, каким же образом сказывается действие видимого света и на энерГозапасающей функции ДЦ митохондрий в присутствии цианида, оцениваемой по тесту трансмембранного переноса протонов. Как показали опыты "рис. 8", у прочно сопряженных митохондрий фотодеблокирование дыхания сопровождается деингибированием также и протонпереносящей функции электронтранспортной цепи.

411 тН

1ШП

Рис.8 Фотодеблоктроваиие энергозависимого Са /Н+ ^ обмена митохондрии в присутствии 250 мкМ КСМ (2). В отсутствие ингибитора (1). Мтх-митохондрии (1,8 мг белка в мл), С-сукцинат мш £ натрия температура 20°С.

1 аким образом, фотодеблокирование дыхательной цени митохондрий приводит

-к—фотодеблокированию функции энергозапасания (трансмембранныи перенос протонов).

5. Влияние белокмоднфицирующих агентов и осмотическоого потенциала среды на выраженность эффекта фотодеблокирования дыхательной цепи митохондрий в.присутствии цианида.

Как показано выше, именно цитохром-с-окскдаза, заингибированная цианидом, в составе энергосопряжающих мембран реактивируется видимым светом. Для выяснения механизма обнаруженного феномена и, нрегкде »сего, его связи с уровнем молекулярной динамики митохондриальной мембраны и .самой полипептидной

матрицы фермента, деблокирующее действие света оценивалось в условиях воздействия реагентов, формирующих жесткие внутри, и межполипептидные ковалентные сшивки.

. Как видно из рисунка 9, после обработки митохондрий глугаровым альдегидом (в концентрации 2,5 мМ, время инкубации - 5 минут) скорость дыхания митохондрий не снижалась заметным образом, т,е,, электронтранспортная функция Ц О не подавлялась. Однако, характер взаимодействия обработанных ГА митохондрий с цианидом, как в темноте, так и на свету, существенно менялся. В условиях сшивания величина эффекта фотодеблокирования снижалась в 3,7 раза. Этот результат свидетельствует о том, что процесс фотодеблокирования не может быть сведен лишь к реакции фотохимичеркого расщепления связи гем-цианид, а реализуется с участием лолипептидных структур фермента. Помимо этого, падало также и "темповое" сродство цитохромоксидазы к цианиду: для равновеликого ингибирования дыхания (на 80-90%) были необходимы его концентрации, Приблизительно в 10 раз более высокие (около 1,5 мМ). Полученные данные о снижении уровня фотодеингибирования посредством ГА свидетельствуют о том, что ограничение конформационной подвижности фермента за счет внутри- и межполипептидных сшивок, препятствующие фотоиндуцированному изменению структурного состояния лигандсвязывающего центра, является причиной падения деблокирующей эффективности света. То обстоятельство, что коваленгные сшивки преимущественно в полярных областях апофермента столь значительно влияют на свойства простетической группы,' локализованной в гидрофобном кармане олигомерного комплекса, свидетельствует о высокой степени структурного и функционального единства и кооперативносп" компонентов ЦО.

. РФ*- - Рис.9 Влияние ковалентных сшивок белков

ттгохоидрий на деблокирующую эффективность сйета.

1 - фотодеблокироование дыхания митохондрий, не обработанных ГА, КСЫ-0,25 мМ; 2 - то же после воздействия 2 мМ ГА, КСЫ - 125 мМ; 3 - дыхание митохондрии в отсутствие КСЫ и ГА. Мтх -митохондрии (1,2 мг белка в мл). Среда содержала 5 мМ сукцината натрия, температура - 20°С.

Таким образом, степень восстановления дыхательной активности заингибированных цианидом митохондрий при действии видимого света сниижается после обработки сшивающими реагентами, т.е. Процесс фотодеингибирования не может быть сведен лишь к простой диссоциации цианида от возбужденного гема: на него существенно влияет уровень конформационной дннамики белка. Иными словами, локальная фотохимическая реакция в геме ЦО находится под контролем апофермента. -

Однако ЦО, как интегральный мембранный белок, испытывает влияние и других компонентов внутренней мембраны митохондрий, В результате чего могут изменяться каталитические и лигандсвязывающие параметры фермента, в частности,

степень фотодеблокирования и сродство к цианиду. Так, существуют данные о весьма значительных различиях (на гри порядка) митохондриальной и очищенной цитохромоксидазы в способности связывать цианид /Van Buuren et al., 1972/. Как полагают, влияние мембранноого окружения на свойства ЦО могут реализовываться в результате взаимодействия последней с фосфолипидным бислоем, а также с белками, контактирующими с ЦО в мембране /Андреев и др., 1983/. Нами исследовалась зависимость эффективности фотодеблокирования ЦО изолированных митохондрий от величины осмотического потенциала инкубационной среды, т.е. степени "растяжения" мембран "рис. 10". Оказалось, что этот процесс испытывает влияние трансмембранного осмотического градиента, т.е. находятся под мембранным контролем.

Рис ,t0 Зависимость скорости дыхания митохондрий от осмолярности среды (в присутствии 200 мкМ П KCN) при действии видимого ср-та. Среда Ujl содержала 0,75 М (1), 0,25 М (2), 0,05 М (3) I сахарозы. К - контрольное дыхание мигохондрий в I изоосмотическон среде (0,25 М сахарозы) в отсутствие цианида. Мтх - митохондрии (1,2 мг белка'в мл), температура 15°С.

Как видно из рисунка 10, инкубационные среды разной осмолярности на основе сахарозы влияют и на степень ннгибирования дыхания митохондрий цианидом: наибольшее ингибирование дыхания наблюдается в гипертонической, наименьшее - в гипотонической среде. Выраженность эффекта снятия цианидного блока видимым светом (фотодеблокирование) также оказалась неодинаковой в средах различной осмолярности (кривые 1, 2, 3). Максимально эффект проявляется в изоосмотической среде (кривая 3).

Таким образом, можно полагать, что обнаруженные эффекты - результат прямого влияния осмотического потенциала среды на сеть силовых взаимодействий и структуру мембраны, которое отражается на конформации и свойствах интегрального мембранного комплекса ЦО.

6. Влияние видимого света и физиологических концентраций АТФ на

каталитическую активность изолированной ЦО в присутствии цианида

Как было показано выше, при действии видимого света скорость дыхания и полированных "митохондрий в присутствии ингибитора (цианид) возрастает, причем аффект обусловлен деблокированием цитохромоксидазы. Для более детального изучения механизма обнаруженного эффекта, исследования были продолжены на препаратах изолированной цитохром-с-оксидазы в растворе детергента, где формировалась модельная система переноса электронов (как и в случае протеолипосом): изолированная ЦО в среде с детергентом инкубировалась с цианидом 5 минут, а затем вносились субстраты дыхания: аскорбат, ТМФД и нигохром с. Из литературных данных /Андреев, Константинов, 1983/ известно, ■но хотя ЦО и является типичным мембранным белком, все же большая млеть

свойств очищенного фермента, в присутствии детергента, близка к характеристикам ЦО в интактной мембране митохондрий. В нашем случае, как видно из рисунка И, для изолированной ЦО также характерно деингибирование каталитической функции (в присутствии цианида) под действием видимого света, как и для ЦО в составе митохондрий. Скорость потребления кислорода ЦО, заингибированной 125 мкМ циаНида приблизительно на 90% от контроля, под действием видимого света возрастает более, чем в 3 раза (кривая 2). Указанный эффект выявляется не сразу, а лишь после 1-1,5 минут освещения и достигает' максимального развития через 3 минуты. Фотодеблокирование изолированной цитохромоксидазы наблюдалось в достаточно узком диапазоне концентраций ингибитора:, 100-200 мкМ, - при Повышении указанной концентрации освещение становилось неэффективным (кривая

Рис.11 Деблокирующее действие видимого света я 5 мМ АТФ (кривая 4) на итнндннй (125 мкМ, кривая 2; 300 мкМ, кривая 3) комплекс изолированной ЦО. 1 - контроль, дыхание в отсутствие! КСГЧ. Среда содержала 15 мкМ цитохрома с, 5 мМ аскорбата натрия и 0,15 мМ • ТМФД, температура 20°С.

Предполагается, что фотодеблокироваяие дыхательной активности цитохромоксидазы в присутствии цианида может происходить в результате инициированных светом Перестроек • в полипептидном окружении лигандсвязывающего центра с переключением его сродства к ингибитору. Световое воздействие адресовано непосредственно гемовым группам ЦО, поглощающим в видимой области. Как показано для других гемопротеидов, в частности миоглобина и гемоглобина, под действием видимого света происходит разрыв координационной связи центрального атома железа с лигандом и его дйссоцмация. Отрыв лиГанда сопровождается измемением спинового состояния атома железа и его делакатизацией из плоскости ПорфирИнового . цикла. В свою очередь, смещение Железа, а следовательно, и его проксимального лиганза - гистйДинасообщается связанной с последним полипептидной Цепи, что инициирует конформационные изменения всей белковой макромолекулы. Есть все основания полагать, что сходные события развиваются и в случаё светового облучения комплекса гем а^ - цианид в молекуле ЦО. Фотоиндуцированный переход олигомерного комплекса ЦО в неравновесное конформационное состояние должен привести к модификаций 'стерических условий в области лигандсвязывающего гема а} и падению его сродства к ингибитору.

Таким образом, показано, что эффект" снятия видимым светом цианидного блока цитохром-с-оксидазы обнаруживаете« не только для ЦО, связанной С митохондриальной мембраной, Но и для солйбилнзированного фермента.

Как стало очевидным в последние годы, АТФ способен модифицировать каталитическую активность ЦО, как изолированной, так И в составе митохондрий, связываясь с особыми центроми на некоторых из ее субьединиц /Моп1есиссо е1 а1..

1986/, причем физиологические концентрации АТФ стимулируют функциональную активность ЦО, а высокие - тормозят, что имеет регуляторньш смысл.

Как видно из "рис.11" (кривая 4), в присутствии АТФ ингибирующая эффективность цианида, существенно снижается, я для достижения торможения дыхания на 95% последний необходим, по меньшей мере, в два раза более высоких концентрациях (кривая 3). Потребление кислорода заингибированной оксидазой стимулировалось после прибавления АТФ не менее, чем в пять раз, что согласуется с результатами, полученными на митохондриях /Андреев и др., 1979/, где прибавление к митохондриям АТФ заметно снижало скорость образования комплекса а33+-СЫ, предположительно, за счет конформационных изменений ЦО. Таким образом, очевидно, что видимый свет и АТФ оказывают на дыхательную активность ЦО, заингибированной цианидом, сходное деблокирующее действие "рис.11" (кривые 2 и 4). Столь значительное сходство эффектов видимого света и АТФ дают основания полагать, что они, вероятно, реализуютсг по общему, либо очень близкому механизму, т.е. путем структурной перестройки полипептидного окружения гемовых группировок. Эти изменения стерических условий отражаются и на сродстве активного центра к лиганду за счет того, что АТФ, связываясь с периферическими субъединицами оксидазного комплекса, инициирует генерализованные конформационнме перестройки- полипептиднон области фермента, затрагивающие и непосредственное микроокружение простетических групп, локализованных в актирном центре.

7. Влияние видимого света на спектральные параметры изолированной

ЦО

Как известно, молекула ЦО содержит два гема,. вследствие чего способна эффективно поглощать свет в видимой области. Нами обнаружена способность видимого света вызывать электрснноконформацнонные эффекты на изолированном . ферменте (в отсутствие ингибиторов) с модификацией абсорбционныхх спектров последнего "рис. 12" (кривая 1). Непродолжительное (3 мин) световое воздействие инициирует спектральные изменения у т.н. покоящейся формы окисленной ЦО (в отсутствие цианида): красный сдвиг максимума полосы Соре от 418 нм до 445 нм и а-полосы .от 600 нм до 603 им. После прекращения светового воздействия наблюдается "затухание" (обращение) эффекта в минутном диапазоне (30 мин) "рис. 12" (кривые 2 и 3).

Рис. {¿"Влияние видимого света (3 минугы (1)) на спектр поглощения окисленной цитохром-0*000- окендазы (5мкМ). Дифференциальный спектр

-0РС4 • освещенной ЦО против контрольного

-0.1Х&* ("темновато") образца окисленного фермента:

2 - через 5 минут после светового воздействия,

3 - через 15 минут, 4 - базовая линия.

Изучалось (спектрофотометрически) также действие видимого спета и на комплексы изолированной ЦО с. ингибиторами окисленного гема' а}: цианидом,

азидом и формиатом. Трехминутное освещение каждого из описанных комплексов оксидазы приводит к заметной модификации спектров поглощения "рис. 13" каждого из них: красному сдвигу пика в полосе Соре до 445 нм и возрастанию поглощения в а-полосе (до 602-603 нм) для цианидного (кривая 1) и азидного (кривая 2) комплексов. В случае комплекса ЦО-формиат (кривая 3) под действием видимого света наблюдается отчетливое возрастаниие поглощения как в полосе Соре (445 нм), так^и в видимой области (603 нм).

Рис. 13 Влияние видимого света на спектры „¿I поглощения цианидного (1 мМ КСЫ (1)), азкдного (1 мМ аэнда (2)) и формнагного (5 мМ формната (3)) комплексов изолированной цигохромоксидаэы (5 мкМ). 4 - базовая линия.

и-•--' ' ■ '

Наиболее вероятно, что эффекты светового воздействия, адресованного гемовым группам, локализованным в глубине молекулы ЦО, реализуются, по-видимому, за счет конформационной перестройки белковой области фермента с изменением стерических условий в области лигандсвязывающего центра - гема а3.

выводы

1. Ограничение конформационной подвижности белков митохондрий с помощью бифункциональных необратимо и обратимо сшивающих реагентов различной природы ингибирует энергозависимый трансмембранный перенос протонов, но не дыхание. Это указывает на решающую роль равновесной подвижности белков в формировании электрохимического градиента Протонов.'

2. Протеолиз изолированных митохондрий, не затрагивая барьерные свойства их внутренней мембраны и электронный транспорт, полностью нарушает протонпереносящую функцию, что свидетельствует о большей чувствительности функции протонной помпы к конформационному состоянию белка.

3. Обнаружена новая фотобиологическая реакция - деблокирование видимым светом дыхательной и эиергозапасающей функций электронгранспортной цепи митохондрий, заиНгибированной цианидом, азидом и формиатом. Эффективность фотодеблокирования снижается после ограничения конформационной подвижности белков сшивающими реагентами.

4. Эффект фотодеблокирования зарегистрирован на препаратах изолированной ЦО и ферменте в составе протеолипОсом.

5. Локальная фотохимическая реакция отщепления цианида от гема а3 при деблокировании дыхания регулируется осмотической напряженностью внутренней мембраны митохондрий. .

6. В темноте АТФ в физиологических концентрациях, комплексируясь с -периферическими субъединицами, подобно видимому свету, повышает эдектронгранспортную активность цианидного комплекса ЦО.

7. Установлена ' способность видимого света вызывать обратимые конформационные перестройки изолированной ЦО в минутном диапазоне как в свободном состоянии, так и в комплексе с цианидом.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рудзянок А.М., Выб|ранец Л.М., Конеу C.B. Фотадзблагараванне дыхальнага ланцуга м1тахондрьш у прысутнасц! цыяшду//Весц1 АН Беларуси Сер.

б1ял. навук.-1992-N. 2.-е. 70-74.

2. Конев C.B., Рудснор А.Н., Выбиранец Л.М. Фотореактивация цитохромоксидазы, заблокированной цианидом//Доклады АН Беларуси.- 1992.- Т.

36,- С. 660-663.

3. Конев C.B., Руденок А.Н., Выбиранец Л.М. Влияние осмотического ппотенциала среды на взаимодействие цитохромоксидазы митохондрий с . ннгибитором//Доклады АН Беларуси.- 1993,- Т. 37.- С.67-71.

4. Конев C.B., Руденок А.Н., Выбиранец Л.М. Мембранный контроль реакции фотодеблокирования цитохромоксидазы в электронтранспортной цепи митохондрий.//Биофизика.- 1993,- Т.-38. С. 1043-1046.

5. Белянович Л.М., Руденок А.Н. Фотореактивация цитохромоксидазного комплекса в присутствии цианида//! съезд белорусского общества фотобиологов и биофизиков. Тезисы докладов.-Мн., 1994.-С. 18.

РЭЗЮМЕ

Белянов1Ч Лшя М>хяйлауна

Уздзеянне бялокмадыфшыруючых агентау на энергаутваральныя

комплексы спалучаючых мембран.

Ключавыя словы: мгсахондрьп, цытахром-с-акадаза, протэалшасомы, сшываючыя рэагенты, электронтранспартная функцыя, транслакацыя пратонау, фотадэблаюраванне.

Асноуным вышкам дадзенай работы можна Л1'чыць экперымементальнае абгрунтаванне рол! канфармацыйнай pyxoMaciji бялкоу энергаспалучаючых комплексау мггахандрыяльнай мембраны як ключавога звяна пераутварэння энергй. 3 выкарыстаннем абарачальных ¡ неабарачальных б!функцыянальных бялоксшываючых рэагентау паказана, што абмежаванне структурная лаГлльнасц1 зазначаных комплексау тольи незначна уплывае на электронтранспартную функцыю дыхальнага ланцуга, аднак практычна поунасцю бламруе электронзапасальную -трансмембранны перанос пратонау. Падобным чынам, расшчапленне незначнай крытычнай колькаси» пептыдных сувязей пры абмежаваным пратэолЫе спалучаючых комплексау прыгнечвае 'электрагенную (пратонпераноснаю), але не закранае электронтранспартную функцыю М1гахондрый. Упершыню было паказана, што фотаадчувальнасцю валодаюць не толью комплексы адноуленай цытахромака'дазы з воюсам вугляроду ¡ юслародам, але i акюлеиай формы фермента, як! уза!мадзейгачае з цыяшдам, азщам, фарм1атам. Уздзеянне 6.v jara святла мадыф!цыруе спектральньш параметры ¡заляванай аксдазы: як свабоднай яе формы, так i комплексау з ¡Hri6ÍTapaMÍ. Паказана, што у прысутнасц! АТФ значна змяняецца характер узаемадзеяння ЦО з Л1га)!дам1 -inri6¡rapaM¡. На падстве атрыманых рэзультатау зроблен вывад, што эфекты бачнага святла i АГФ рэал!зук>цца па прынцыпова бл!зкаму механ!зму - за кошт канфармацыйнай перабудовы бялковай час™ ферменту са змяненнем стэрычных умоу у вобласщ лн-андзвязываючага цэнтра -тема aj ЦО. Паказана так-сама, што параметры узаемадзелння -ЦО з малым! л!гандам1 у складзе мггахондрый змяняюцца пры Bap'ipaBaHHi асматычнага патэнцыяла асяроддзя. Гэта сведчыць аб тым, што л!гандзвязьшаючыя уласгувасщ цытахромакс!дазы абумоул1ваюцца станам унутранай мембраны мггахондрый у цэлым. ■

BbiniKÍ працы могуць быць выкарастаны пры высвятленш мехамзма эфекта фотадэблаюравання цытахром-с-акс!дазы (у прысутнасцГ розных лнтшдау аюсленая формы тема аз), уздзеяння бачнага святла i АТФ на структурныя i функцянальныя параметры ¡заляванай ЦО:

РЕЗЮМЕ

Велянович Лилия Михаиловна

Влияние белокмодифнцврующих агентов на энергообразующие

комплексы сопрягающих мембран

Ключевые слова.' митохондрии, цитохром-с.-оксидаза, протеолипосомы, сшивающие реагенты, алектронтранспортная функция, транслокация протонов, фотодеблокирование.

Основным результатом настоящей работы можно считать экспериментальное обоснование" роли конформационной подвижности белков энергосопрягающих комплексов мнтохондриальной мембраны как ключевого звена преобразования энергии. С : использованием необратимых и обратимых бифункциальных белоксшивающих реагентов показано, что ограничение структурной подвижности указанных комплексов лишь незначительно влияет на электронтранспортную функцию дыхательной цеп;;, но практически полностью блокирует энергозапасающую - трансмембранный перенос протонов. Сходным образом, расщепление незначительного, критического числа пептидных связей при ограниченном протеолизе сопрягающих комплексов подавляет электрогенную (протонпереносящую), но не затрагивает электронтранспортную функцию митохондрий.. Впервые было показано, что фоточувствительностью обладают не только комплексы восстанновленной цитохромоксидазы с окисью углерода и кислородом, но и окисленной формы фермента, взаимодействующей с цианидом, азидом и формиатом. Облучение видимым светом модифицирует. спектральные параметры изолированной оксидазы; как свободной ее формы, так и комплексов с ингибиторами. Показано, что в присутствии АТФ существенно меняется характер взаимодействия ЦО с лигандами-ингибиторами.

На основании полученных результатов сделан вывод, что эффекты видимого света и АТФ реализуются по принципиально близкому механизму - за счет конформационной перестройки белковой области фермента с изменением стерических условий в области лигандсвязьшающего центра - гема а3 ЦО. Показано также, что параметры взаимодействия ЦО с малыми легандами в составе митохондрий меняются при вариировании осмотического потенциала среды. Это свидетельствует о том, что лигандсвязывающие свойства цитохромоксидазы определяются состоянием внутренней мембраны митохондрий в целом.

_Результаты_работы—могут—быть—использованы—для выяснения механизма^

эффекта фотодеблокирования цитохром-с-оксидазы (в присутствии различных лигандов окисленной формы гема а3), влияния видимого света и АТФ на структурные и функционнальные параметры изолированной ЦО.

SUMMARY

Belyanovicb Liliya Mikhailovna

Effect pritein modifying agents on energy transforming

complexes of mitochondrial membranes.

KeY words: mitochondria, cytochrome c oxidase, proteoliposomes, crosslink reagents, electron transport function, proton translocation, photodeblockage.

The main result of the present work is an experimental confirmation of role of conformation latility of proteins in energy Coupling complexes of mitochondrial membranes as a key element of energy transformation.. Using proteincrosslinking reagents including those capable of cleavage it is shown that, a limitation of structural lability of these complexes has a negligible effect on electron transporting function of. respiratory chain whereas transmembrane proton transfer is completely blocked under such conditions, in a similar way a proteolytic splitting of a critical number of peptide bonds results in a suppression of proton transfer without affecting election transport in mitochondria. It was demonstrated for a first tiriie that photosensitivity is typical riot only for a complexe "reduced cytochrome oxidase - carbon monoxide or oxygen", but for a oxidered form of enzyme binding cyanide, aade and formiate. Irradiation by visible light Causes a modification of spectral parameters of isolated oxidase both in a free and in inhibitor-bound states. It is shown that interaction of cytochrome oxidase with inhibiting ligands is strongly dependent on the presence on ATP. On the basis of results obfaired it was concluded that the effects of visible light and ATP are realised through an universal i.e. conformational rearrangement of the protein part cf enryine with a change. of steric conditions at a ligand binding site of the fteriie a3. lt is shown also that interactions small ligands with cytochrome oxidase incorporated in the inner mitochondrial tntmbrane are changed when osmotic potential of a medium is varied. Tlus suggests thai iigand binding properties of cytochrome oxidase are controlled hy a state of the inner membrane as a whole.

The results of the work may by used for finding oat tile mechanism of the effects of photodeblockage in cytochrome oxidase (in the presence of various ligands of oxidized heme aj), as well as of visible light mid ATP on structural and functional parameters of isolated cytochrome oxidase.