Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные перестройки мембранных энергопреобразующих комплексов и функционирование терминальных оксидаз

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конформационные перестройки мембранных энергопреобразующих комплексов и функционирование терминальных оксидаз"

^ АКАДЕМИЯ НАУК ВЕЛАРУСИ

С^ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

ъ ^ •Л/

УДК 577.111 + 577.345

РУДЕНОК Александр Николаевич

КОНФОРМАЩГОШШЕ ПЕРЕСТРОЙКИ МЕМБРАННЫХ ЭНЕРГОПРЕОБРАЗУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ТЕРМННАЛЬПЫХ ОКСНДАЗ

03.00.02 -Бисфишкя

Автореферат( диссертации н* соискянне ученой степени доктора биологических няук

Минск - 1997

Работа выполнена в Институте фотобиологии Академии наук Беларуси

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, академик АН Беларуси Конев C.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мажудь В .М. доктор химических наук, профессор Метелиц* Д.И. доктор биологических наук, профессор Титовец Э.П.

Оппонирующая организация - Институт биохимии им. А.Н.Баха

Российской Академии Наук

Защита состоится года в /4" часов на заседании

совета го защите диссертаций ( ДО!.37. 01 ) з Институте фотобиологии АН Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси.

Автореферат разосланi-t/ÛjL [997 года.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук

Л.Ф.Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалмюеть темы диссертации. Универсальной формоП энергии для всей биосферы является махроэргнческая связь молекулы АТО, которая синтезируется полнфер-меитными системами энерлопродукшш трех основных типов: 1) субстратное фосфорн-лирование или гликолиз; 2) окислительное фосфорилирование; 3) фотосинтетнческое фосфорилирование. Два по тедних механизма играют доминирующую роль в энергетическом метаболизме большинства клеток, тогда как гликолиз, в связи с его низкой эффективностью, имеет ограниченное, дополняющее значение.

Окислительное и фотофосфорилнрованне, несмотря на различие в источниках потребляемой энергии (свет и окисляемые химические субстраты), организованы принципиально сходным образом и обычно обозначаются общим термином "мембранное фосфорилирование". В обоих случаях фосфорилирование связано с переносом электронов и осуществляется в особой структуре - сопрягающей мембране. И в том, и в другом случае энергия потока электронов в редокс-цепи первоначально трансформируется в трансмембранный электрохимический градиент протонов (АдН+), который в дальнейшем служит движущей силой синтеза ЛТ<2>.

Минул уже 35 лет с тех пор, как лауреат Нобелевской премии П. Митчелл [Р.МНсЬеН, 1961] постулировал функцию АцН+ в честве центрального энергетического икгермедиата в реакциях окислительного и фотосинтетического фосфорилирования, однако молекулярные механизмы его генерирования и утилизации мембранными мультисубъединичными комплексами, основополагающие принципы их функционирования во многом остаются неясными.

Становится веб более очевидным, что мембранное фосфорилирование представляет собой биофизический процесс и не может быть сведено к последовательности биохимических реакций. Как свидетельствуют новейшие биоэнергетические исследования 2-3-х последних лег, представления об участии белковых конформационных перестроек в актах формирования и потреблен!« протонного потенциала на сопрягающей мембране могут быть наиболее плодотворной и универсальной концепцией молекулярных механизмов преобразования энергии. Конформационная гипотеза сопряжения была предложена ещё в конце 60-х гг. [Воуег, 1%5, Конев, 1969], однако и до настоящего времени не получила широкого признании.

В связи с этим, экспериментальное обоснование роли конформационных переходов энергосопрягающих мембранных комплексов как ключевой, универсальной стадии

процессов трансформации энергии при окислительном фосфорилировании представляет собой актуальную проблему биоэнергетики и биофизики.

Более 90% кислорода, потребляемого в биосфере, приходится на долю терминальных оксндаз аэробных организмов, глазным образом - цитохром-с-оксидазы [ВаЬсоск, \VikstrBm, 1992]. С каталитической активностью оксндаз сопряжена их энергозапасающая функция - в дыхательных цепях самого различного происхождения они служат зоной акцептирования энергии потока электронов и запасания еб в стабильной форме - вначале в форме ЛцН+, а затем - АТФ.

В последние годы исследованию терминальных оксндаз посвящено наибольшее число работ в области биоэнергетики. К настоящему времени у ряда оксида! достаточно полно охарактеризована структура активного цешра, пути внутримолекулярного переноса электронов, ингермедиаты кислородного цикла. Однако главная проблема - проблема механизма тpaнcмe^"оанного электрогенного транспорта протонов оксидазными комплексами веб ещ4 остается нерешённой. Таким образом, выяснение закономерностей и механизмов сопряжения каталитической и энергопреобразующей функций терминальных оксндаз представляет собой важнейшую, актуальную задачу биоэнергетики и биофизихи.

Связь работы с крупными научными программами. Различные этапы данного исследования входили в плановые темы Лаборатории биофизики и фотобиологии мембран Института фотобиологии АНБ; "Метастабклькые напряженные состояния биологических мембран как фактор функциональной активности клеток" и "Осмоиндуцированные напряжённые состояния биологических мембран в биоэнергетических процессах и реакции нормализации клеточного объема* (№ госрегистрацш. : 996176), которые включены в государственную программу фундаментальных исследований "Регуляция 03". Часть работы выполнялась в рамках республиканской программы фундаментальных исследований (Л'а горрегистрации 01.89036810) и МП-07 Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь.

Цель н задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось выяснение роли конфориацконных перестроек знергосопрягающнх полипептндных комплексов митохондриальной мембраны в процессах преобразования энергии.

В исследовании предполагалось установить:

- влияние ограничения способности к конформацнонным перестройкам сопрягающих комплексов мнтохондриальной мембраны путем внутрибелкового ковалентного сшивания на их функциональные параметры - скорость транспорта электронов и эффективность утилизации энергии; -

э

• действие прсгтеолиза митохондрнй на барьерные свойства внутренней мембраны, электронтранслортмую и протонпереносящую характеристики их дыхательной цепи;

- возможность накопления АТФ митохондриями в отсутствие окисляемых субстратов за счСт энергии белковых конформацнонных перестроек, вызываемых циклом температурных сдвигов "О - +25°С";

- действие гипоосмотимеского растяжения и гиперосмотического сжатия митохон-дриальной мембраны на п.^аметры взаимодействия ев интегрального комплекса - ци-тохромоксидазы - с лигандом-ингибитором и термоустойчивость белковых ансамблей дыхательной цепи;

- влияние видимого света на функциональную активность дыхательной цепи митохондрий и изолированной цитохромоксидазы, заиигибированных цианидом;

- фотоиидуцированные изменения спектральных параметров окисленной формы изолированной цитохромоксидазы, а также ей цианидного комплекса;

- регуляторное действие физиологических концентраций АТФ на каталитические, лигаг ^связывающие, а также спектральные характеристики изолированной цитохромоксидазы;

- роль альтернативной (цианиднечувствительной) терминальной оксидазы в энергетическим метаболизме дрожжевых клеток.

Научная новизна полученных результатов, (оказано, что различные химические реагенты, формирующие ковалентные сшивки в белках митохондрнй и, тем самым, ограничивающие возможность их конформацнонных перестроек, незначительно влияют на скорость транспорта электронов а дыхательной цепи, но существенно снижают ев способность к трансмембранному (электрогенному) переносу протонов; в условиях ограниченного протеолиза митохондрнй, не затрагивающего барьерную функцию внутренней мембраны и не влияющего на скорость дыхания, знергозаласающая (протонпереносящая) функция электротранспорт ной цепи блокируется.

Установлено, что митохондрии способны накапливать АТФ за счет энергии белковых конформацнонных перестроек,.инициированных серией темпер.иурных уларов "О - +25"С" в условиях, когда отсутствуют окисляемые субстраты и электротранспорта» непь заннгибнрована.

Обнаружено, что параметры взаимодействия лиганд-святывающсго центра цитохромоксидазы митохондрий с ингибитором, а также термоустоичнвость белковых электронтранспортных ансамблей внутренней мембраны существенно модифицируются её осмотической напряженностью.

Впервые показано, что функциональная активность как мембраносвязанной, так и изолированной цнтохромоксидазы, заингибированных цианидом, восстанавливается при облучении видимым ситом.

Выявлены выраженные сгеетра/иные изменения у цианидного комплекса изолированной цитохромоксидазы, а также ей окислеНйой свободной формы после кратковременного светового воздействия; фотоиндуцировййные перестройки спектров поглощения цнтохромоксидазы обратимы и затухают а темноте в минутном диапазоне времени.

АТФ в физиологических концентрациях, незначительно влияя на спектральные свойства изолированной цнтохромоксидазы, оказывает выраженное стимулирующее действие на ев каталитическую активность и резко изменяет параметры взаимодействия с ингибитором, лигандом активного центра фермента - цианидом.

Показано, что альтернативная терминальная окендаза дыхательной цепи дрожжевых клеток в условиях дефицита источников энергии и кислорода существенно повышает эффективность утилизации микроколичеств экзогенных окисляемых субстратов и выживаемость клеток.

Впервые установлено, чгто в условиях продолжительного дефицита энергетических субстратов функцию синтеза АТФ у дрожжевых клеток способна выполнять их "наружная" Н -АТФаза путём обращения реакции за счёт энергии высокого концентрационного градиента протонов на плазматической мембране.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные данные имеют существенное значение для выяснения молекулярных механизмов сопряжения в процессах мембранного фосфорилирования и для разработки мет >в медикаментозной и физиотерапевтической коррекции патологических состояний человека, связанных с нарушениями клеточного дыхания и энергетического метаболизма.

Экономическая значимость полученных результатов. Выявленные закономерности процессов трансформации энергии в сопрягающих мембранах могут быть использованы в коммерческих проектах по созданию новых, высокоэффективных и экологически безопасных источников энергии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Генерация протонного градиента, но не транспорт электронов, связана с кон-формациониыми перестройками энертопреобразукшшх белков сопрягающей мембраны митохондрий.

2. Энергия термоиндуцнрованных белковых конфирмационных перестроек может использоваться для накопления АТФ митохондриями в отсутствие переноса электронов в

дыхательной цепи и трансмембранного градиента протонов.

3. Класс реакций фотоиндуцированной диссоциации "гемсодержащнй белок - лиганд" включает в себя также и реакцию фотодеблокирования функциональной активности цианидного комплекса мембраносвязанной, либо изолированной цитохромоксндазы.

4. Альтернативная терминальна* оксидаза дыхательной цепи дрожжевых клеток существенно повышает эффективность утилизации энергии окисляемых субстратов в условиях их дефицита.

Личный вклад соискателя. Выбор научной проблематики, объектов и методов исследования, условий экспериментов, анализ полученных результатов и их интерпретация выполнялись автором самостоятельно. Экспериментальный материал получен при решающем участии соискателя.

Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации были доложены на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (август 1982, Москва), заседании Московского Общества испытателей природы (июнь 1986, Москва), Всесоюзной конфе-ренп" м "Структурная динамика биологических мембран и её роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (май-июнь 1988, Минск), 1-ом и 2-ом Съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (ноябрь 1994, июнь 1996, Минск).

Опуб.и.^овянность результатов. По теме диссертации опубликовано 23 научные работы (19 статей и 4 тезиса докладов)

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, трех глав, включающих постановку задачи (обзор литературы), результаты и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы (ЪНС, наименований) и приложения (материалы и методы исследования). Работа изложена наЗ-ЭЧ страницах и содержит 61 рисунок и 5 таблиц.

Принятые сокращения. АТФ - аденоэин-5'-трифосфат; БГК - бензгидроксамовая кислота; ГА - глутаровый альдегид; ДМС - диметилсуберимидат; ДСП - дитио-бнс- сук-цинимидилпропионат; ДТБП - диметил-3,3'-дигио-бис-пропионимидат; ДТТ - днтнотрейтол; ДЦКД • Н^-дициклогексилкарбодиимид; М-Фг - медь- фенантролиновый комплекс (1,10-фенантролин и Си5С>4 в соотношении 2:1); ТМФД - Ы^,№,М'-теграметил-п-фенилендиамин; ТФФ+ - тетрафенилфосфоний; ХКФ - карбонилцианнд-т-хлорфенилгидразои; ЦО -цитохром-с-оксидаза; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; ДцН-»- - электрохимический градиент протонов; ДЧС- мембранный потенциал; ЭТЦ - электронтранспортная цепь.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Материалы и методы исследования

Основными объектами настоящего исследования служили дрожжевые клетки Candida utilis (штамм Д II), митохондрии печени крысы, изолированная ЦО из сердца быка и искусственные протеолипосомы со встроенной ЦО. Скорость потребления кислорода (дыхания) дрожжевых клеток, митохондрий и изолированной ЦО определялась полярографическим методом. Параметры процесса преобразования энергии у интактных клеток, митохондрий и ЦО-содержащих протеолипосом оценивались потенцномег-рическими методами, a также по накоплению АТФ с помощью изотопного и люцифе-разного методов.

В работе использовались различные методы спектрофотометрии [Булычев, 1988]. методы триптофановой [Черницкнй, 1972] и зондовой [Булычев, 1988] флуоресценции, метод дифференциаль. -го окрашивания поврежденных дрожжевых клеток [Руденок, Конев, 1973] и некоторые другие.

РОЛЬ КОНФОРМАЦНОННЫХ ПЕРЕСТРОЕК БЕЛКОВ В ПРОЦЕССАХ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ

В рамках хемиосмотической теории энергетического сопряжения при окислительном и фотосинтегическом фосфорилировании остаётся нерешённым чрезвычайно существенный вопрос о молекулярных механизмах акта трансформации энергии потока электронов в электрохимический градиент протонов на мембране. Согласно конформаинонной гипотезе сопряжения, трансмембранный перенос протон обеспечивается энергией конформационных состояний белков электронтранспортной цепи, формирующихся в результате их редокс-превращений.

Представления об участии белковых конформационных переходов в процессах мембранного фос^орилирования в последние годы получили широкое признание [Babcock, Wikstrom, 1992], однако их экспериментальное подтверждение по прежнему является актуальной, нерешённой проблемой биоэнергетики. Единичные сообщения об успешном выявлении функционально-значимых конформационных изменений у энергосопрягающих комплексов оказались либо ошибочными [Copeland, 1987}, либо недостоверными [Das, Mazumdar, 1994].

В настоящей работе для изучения роли белковых структурных перестроек в процессах энергетического сопряжения был использован метод ограничения конформациояиой

лабильности энергозапасающих белков посредством химических реагентов, формирующих внутримолекулярные коваг.ентные сшивки ("мостики").

В исследовании биомембран белок-сшивающие реагенты впервые были использованы в 1974 г. [Wang, Richards, 1974] в экспериментах с эритроцитами и несколько позднее - с сопрягающими мембранами [Smith, 1978]. В ранних работах метод был нацелен на межбелковое сшивание для изучения взаиморасположения белков и строения мембраны в целом, затем стал примен-.ься и для внутрибелкового сшивания, в частности, при определении состава и топологии субъединнц у ЦО [Jarausch, Kadenbach, 1985].

По общему мнению [Скулачгв, 1989], ДЦКД и другие белок-сшивающие реагенты, лодавляющне трансмембранный перенос протонов сопрягающими комплексами, в той же мере ингибируют и электронный транспорт, т.е. на обе указанные функции оказывают симметричное влияние. Это обусловлено не столько экспериментальными данными, сколько теми представлениями, которые сложились в рамках хемиосмотическсй теории (например, схема 2-цикла). Как постулировалось Митчеллом [Mitchell, 1961], перенос электронов и протс 'ов в дыхательной цепи, по меньшей мере на трёх этапах, осуществляется совместно, в форме атома водорода и поэтому не может протекать независимо.

В настоящей работе изучалось влияние белок-сшивающих реагентов на электрон-транспортную и энергопреобраэующую (протонпереносящую) функции дыхательной цепи митохондрий в идентичных условиях. Исследовь я были начаты с использованием классических сшивающих агентов, способных формировать стабильные (нерасщепляемые) внугрибелковые ковалекгные "мостики".

MTX Р Ca С Рис.1. Влияние различных концентраций ДМС,

ДЦКД и ГА на скорость дыхания ("А") и эффективность кальций-индуцированного закисления среды у митохондрий ("Б"). "А": I - 200 мкг/мл ДЦКД (5 мин); 2

- 0,1% ГА (2 мин); 3-50 мкг/мл ДЦКД или 5 мМ ДМС (по 5 мин); 4 - 2 мМ (ок. 0,02%) ГА (5 мин); "Б"; 1 -200 мкг/мл ДЦКД (5 мин) или 0,1% ГА (2мин); 2 - 2 мМ ГА (5 мин); 3-50 мкг/мл ДЦКД или 5 мМ ДМС. К

- контроль. Мтх - митохондрии, 1,2 мг б-ка'мл; Р -ротенон, 3 мкМ; Ca -СаСЬ, 250 мкМ; С - сукцинат.

-i ] 1 1.

"А" . 2

Как видно из "рис. 1", ДЦКД в высокой концентрации и ГА, использованный по общепринятой схеме, практически полностью подавляют энергозавнснмый выброс протонов митохондриями ("Б", кривая I), при этом, однако, существенно угнетая и ихдыхательную активность ("А", кривые 1 и 2). ДЦКД в концентрации 50 мкг/мл и ДМС в меньшей степени влияют на скорость электронного транспорта ("А", кривая 3), но достаточно эффективно (на 85%) снижают амплитуду энергозависимого закисления среды ("Б", кривая 3). Наибольшие различия (ассиметрия) в эффектах ковалснтного сшивания на протонпереносящую и электронтранспортную функции редокс-цепн митохондрий отмечались при воздействии ГА по разработанному нами методу: его концентрация была уменьшена в пять раз (2 мМ вместо 10 мМ), а время экспозиции увеличено до 5 минут. Как свидетельствуют данные "см. рис. 1", в результате такого режима сшшшння, ГА не менее чем на 90% блокирует трансмембранньш перенос протонов ("Б", кривая 2) и лишь весьма незначительно затрагивает электронтранспортную функцию дыхательной цепи ("А", кривая 4).

Таким образом, реагенты различной химической природы, формирующие внутри- и межмолекулярные ковалентные сшивки полипептидов митохондрий и, тем самым, ограничивающие их структурную подвижность, вызывали однотипные изменения • функциональных параметров электронтранспортной цепи: мало влияли на скорость дыхания, но резко угнетали трансмембранный выброс протонов.

Достаточно очевидно, что лишь на основании результатов, представленных на "см. рис.1", не может быть исключена возможность влияния сшивающих реагентов на характеристики дыхательной цепи не ?а счёт ограничения "информационной подвижности белков энергосопрягающих комплексов, а в результате их локальной химической модификации. Вполне допустимо, что блокирование остатков лизина (при связывании ДМС и ГА) или аспартата и глутамата (ДЦКД), удалённых от "электронной тропы" и несущественных ш транспорта электронов, но непосредственно формирующих прогонпереносящий путь (канал) могло иметь те же последствия - ингибирование трансмембранного выброса протонов.

В целях уточнения механизма действия белок-сшивающих соединений на функциональные характеристики ЭТЦ митохондрий в настоящей работе были использованы т.н. обратимо сшивающие реагенты: полярный ДТБП, гидрофобный ДСП й медь-фенантролйновый комплекс (M-Oj). ДТБП и ДСП были отобраны в связи с тем, что они, подобно ГА и ДМС, связываются со свободными аминогруппами, образуя ковалентные "мостики" той же длины, что и у ДМС -11Â. Отметим, что ДТБП близок к ДМС и по своим

физико-химическим свойствам. Под влиянием тиоловых реагентов молекулы-сшивки ДСП и ДГБП легко расщепляются в области центрально расположенной дисульфидной связи с сохранением химической модификации, но утратой функции сшивания, Комплекс М-Фг инициирует формирование дополн1ггельных внутри- и межполипептидных дисульфидных связей из близко расположенных SH-групп и, среди большого числа соединений, наиболее эффективно сшивают белки энергосопрягающих комплексов митохондрий [Jarausch, Kadenbach, 1985). Дисульфидныг "мостики", образованные М-Фг, также обратимы и расщепляются (восстанавливаются) после прибавления тиоловых реагентов.

Рис.2. Влияние обратимо сшивающих реагентов на скорость дыхания митохочдрий. ДТБП (1) и ДСП (2) - по 1 мМ, время экспозиции - 5 мин. М-Ф2 (J) - 1° мкМ, 2 мии. ДТТ - 5мМ, ЭДТА - 1 мМ, ХКФ - 1 мкМ. К - контроль |—jj^ \ Условия те же, что и на рис. i.

Мтх

L

то-2-^-^ ЭДГА

iE2 W ш x

Как в!'-ио из "рис.2", ДТБП и, в особенности, М-Ф2 повышали скорость дыхания "сопряженных" митохондрий, ДСП, напротив, заметно её снижал. Эти изменения устранялись дитиотрейтолом, В концентрации 5 мкМ М-Ф2 крайне незначительно (на 1 -1,5%) стимулировал электронтранспортную функцию митохондрий, но почти полностью подавлял кальций-зависимый трансмембранный выброс протонов, который, однако, в значительной мере (на 90%) восс. инавливался после прибавления ДТТ.

Са_

а

Мтх, Р

т2

120мк1^ HCl .

ч

мин

Рис.3'. Влияние ДТБП (1мМ, 5 мин) на энергозависимый выброс протонов митохондриями (I). 2 - то же после 2-х минутного инкубировання с ДТТ (5 мМ). Р - ротенон, 3 мкМ; митохондрии (Мтх) - 1,8 мг белка/мл. К -контроль.

Из "рис.3" видно, что электрогенная (протонпереносящая) функция ЭТЦ митохондрий, заблокированная ДТБП (кривая 1), восстанавливается после воздействия ДТТ (кривая 2). Очень близкие результаты были получены и с использованием ДСП; в обоих случаях трансмембранный выброс протонов реактивировался не менее чем на 80%. Ещё в большей

степени, почти на 90%, этот процесс восстанавливался после расщепления (с помощью ДТТ) дисульфидных "мостиков", индуцированных двухминутной обработкой медь-фенантролиновым комплексом в концентрации S мкМ.

Таким образом, на оснозании результатов, полученных с использованием ДСП и ДТБП, можно полагать, что формирование ковалентных "мостиков" - как в полярной, так и гидрофобной зонах белков энергопреобразуюишх комплексов - не приводит к блокированию ("выключению") тех аминогрупп, которые сами по себе существенны для электронтраиспортной и протонпереносящей функций митохондрий. Несхольхо сниженная реакция митохондрий на добавку протонофора ХКФ (стимуляция дыхания, кривые 1 п 2, "см. рис.2") и лишь частичное реактивирование кальций-зависимого выброса протонов (кривая 2, "см. рис З") после расщепления бифункциональных реагентов ДСП и ДТБП, наиболее вероятно, может быть отнесена за счёт эффекта объёмных заместителей: снижения уровня внутрибелковой динамики вследствие внедрения инородных продуктов - фрагмечтов расщепленных молекул-сшнзок. Это предположение подтверждается результатами экспериментов, в которых сшивание белков проводилось посредством М-Фг-комплекса. В этом случае восстановление ("расшивание") дополнительных S-Ь-мостиков, инициированных М-Фг, трансформировало мембранные белки в исходное, нативное. состояние без сопутствующей локальной химической модификации и, как следствие -наиболее полное восстановление протонпереносящей н электронтранспортной функций дыхательной цепи.

Одной из тривиальных причин выпадения электрогенной (протонпереносящей) функции редокс-цепи и, соответственно, стимуляции д! кия митохондрий при действии самых различных, в том числе и сшивающих реагентов, могло быть нарушение барьерных свойств, возрастание проницаемости для протонов внутренней мембраны - эффект разобщения. В отношении ГА, ДМС, ДСП и ДТБП известно [De Pont, 1979; Rendon, 1980], что они свойствами протонофоров-разобщителей не обладают и не нарушают барьерную функцию митохондриальной мембраны. Поскольку влияние М-Фг на протонную проницаемость сопрягающей мембраны оставалось не вполне ясным [Torek, 1985], мы исследовали это в специальных экспериментах. Было установлено, что после 2-х-минутной инкубации митохондрий с М-Фг в концентрации 5 мкМ барьерные (протоннзолнрующие) свойства их внутренней мембраны остаются на том же уровне, что и в контроле. Таким образом, есть все основания полагать, что, как и в случае бифункциональных сшивающих реагентов (ГА, ДМС, ДСП и ДТБП), использовавшихся в настоящей работе, эффекты М-Фт -блокирование электрогенного трансмембранного выС, jca протонов и, как следствие,

компенсаторная стимуляция потока электронов в дыхательной цепи - обусловлены снижением конформационной подвижности полипептидов - преобразователей энергии после формирования дополнительных дисульфидных "мостиков-сшивок".

Энергозапасающая (протонпереносящая) функция дыхательной цепи митохондрий тестировалась нами по величине кальций-индуциросанного закиспения инкубационной среды ("см. рис.1,Б", "см. рис.3"). Однако, в экспериментах с белок-сшивающими реагентами существовала ве; ятностъ блокирования Са27Н*-обмена за счёт прямой модификации Саг*-унипортера, имеющего белковую природу, а не сопрягающих комплексов ЭТЦ. В связи с этим, нами был использован и другой, независимый метод оценки члектрогенной функции дыхательной цепи - по распределению синтетического проникающего катиона, тетрафенилфосфония (ТФФ+) в суспензии митохондрий.

М т

X

"Л

с

I

Рис.4. Влияние ГА на способность митохондрий (Мтх, 1,8 мгб-ка/мл) к формированию мембранного потенциала. К - контроль; 1-10 мМ (0,1%) ГА, 2 мин; 2 - 2 мМ ГА, 5 мин. С -

мВ

ТГ^ сукцинат натрия, 5 мМ; ТФФ - 1,5 мкМ.

Как видно из "рис.4", ограничение конфорг. .ионной подвижности белков миго-хондриальной мембраны, вызываемое ГА, влияет на потенциалзависимое распределение ТФФ+ (величину мембранного потенциала у митохондрий) точно также, как и на кальций-протонный обмен '""м. рис.1. Б", "см. рис.3"). Аналогичные результаты с использованием ТФФ-чувствительного электрода были получены также-и в случаях сшивания митохондрий посредством ДМС, ДЦКД ДСП и ДТБП. • •

Эти данные свидетельствуют, что в условиях применяемого нами ограниченного, "дозированного" сшивания белков митохондриальной мембраны блокирование энергозависимого Са27Н*-обмена едва ли может быть связано с инактивированием Са*-унипортера, а наиболее вероятно, обусловлено выпадением лротонпереносящей функции сопрягающих комплексов ЭТЦ вследствие ограничения их внутримолекулярной подвижности. Еще более убедительно эти выводы подтверждаются результатами исследований, выполненных на искусственных протеолипосомах, содержащих только один белок - энергосопрягающий комплекс одного типа - ЦО.

Из "рис 5" видно, что концентрационные различия в эффектах ГА на скорость транспорта электронов ЦО, встроенной в искусственную фосфолипидную мембрану, были

очень сходны с таковыми у митохондрий: если в присутствии 10 мМ ГА 2-х- минутное сшивание приводило к резкому угнетению дыхания, то после его воздействия в концентрации 2 мМ (5 мин) отмечалось весьма незначительное уменьшение дыхательной активности. Однако, как можно чндеть ("см. рис.5, Б"), обработка протеолипосом

К * Аск

ХКФ

Рис.5. Влияние ковалеитного сшивания, вызываемого ГА на электронтранспортную ("А") и протон перенося щую ("£") функции ЦО, включенной в фосфолипидные везикулы -протеолипосомы (¡,3 мкг белка ЦО в 1 мл). "А" -скорость потребления кислорода протеолнпосомами: 1 - после 5-минутной экспозиции с 2 мМ ГА; 2 - после 2 мин с 10 мМ ГА: к - контроль. "Б" - генерирование мембранного потенциала, обзначення те же, что н на панели "А".

ГА в обоих указанных концентрациях приводила к глубокому подавлению электрогеннои (протонпереносящей) функции ЦО.

Для изучения полипептидов сопрягающих мембран, наряду с методом ковалентного сшивания, столь же широко используется и протеолнз. В большинстве случаев он также используется в структурных исследованиях и лишь единичное число работ посвящено его влиянию на функциональные характеристики ЭТЦ [Сарлапю, 1994].

Рнс.6. Влияние ограниченного протеолиза митохондрий (Мтх, !,8 мг белка в 1 мл) на электронтранслортные ("А") и про-тонпереносящие ("Б") параметры их дыхательной цени. "А": К -контроль, 1-10 мин инкубирования с трипсином; 2-20 мин; 3-30 мин. "Б": К -контроль; 1 - 20 мин инкубирования с трипсином. Р - ротснон, 3 мкМ; С - сукшшат, 5 мМ ("А") и 1 мМ ("Б"), Цс - цитохром с, 20 мкМ; ХКФ -1 мкМ ("А"); Са - 250 мкМ, трипсин - 250 мкг/мл;

температура - 20 С.

Из "рис.6" ("А", кривая 1) видно, что скорость дыхания митохондрий после 10-минутного инкубирования с трипсином практически не меняется в сравнении с контролем Единственное отличие состоит и том, что обнаруживается реакция на экзогенный Цс. Более продолжительное "переваривание" митохондрий приводит к появлению выраженной реакции на Цс и снижению, несущественному, после 20 мин и значительному после 30 мин -эффекта стимуляции дыхания разобщителем ("см.рис.6, А", кривые 2 и 3). Достаточно очевидно, что первоначально действию трипсина доступны лишь белки наружной мембраны, в том числе - и наиболее массовый из них - порин. формирующий многочисленные трансмембранные поры [Скулачёв, 1989].

На основании результатов, представленных на "рис.6", можно полагать, что по мере протеолиза происходит прогрессивное возрастание величины пор в наружной мембране, которая становится проницаемой для малых белков: вначале, после 10 мин инкубации, для Цс, молекулярная масса которого 13 кДа, а через 20 мин - и для трипсина (23 кДа). На первой стадии "переваривания" митохондрий (10 мин), когда полипептиды внутренней мемб; мы вероятно ещё недоступны для протеазы, изменений функциональных характеристик дыхательной цепи не наблюдается, однако они становятся явно выраженными при последующем инкубировании. Наибольший интерес представляет асимметричный эффект 20-минутного протеолиза: весьма умеренная модификация параметров электронного транспорта и почти поли. более чем на 90%, блокирование трансмембранного переноса протонов, который оценирался по амплитуде энергозависимого Са2+/Н*-обмена. Поскольку стимулирующее влияние разобщителя на скорость дыхания митохонлрий сохр' члось и после 30-минутного инкубирования с трипсином, этот последний результат не может быть связан с нарушением барьерных свойств внутренней мембраны. •

Парадоксальное, на первый взгляд, совпадение последствии протеолитического расщепления и ковалентного сшивания полипептидных ансамблей дыхательной цепи для её ключевых функций, на наш взгляд, может иметь непротиворечивое объяснение. Согласно представлениям, развиваемым' в рамках конформационной гипотезы сопряжения, трансформирование энергии электронов в форму трансмембранного градиента протонов реализуется а сопрягающих белках по механизму аллостерических взаимодействий, подобных эффекту Бора у гемоглобина. Можно полагать, что для специализированных структур, ответственных за внутримолекулярную дистантную "энергетическую коммутацию" в равной мере критичны конформационная подвижность и интегративная целостность. Очевидно, что вследствие ковалентного сшивания и, тем более.

протеолитическон деструкции "силовой конформационный сигнал" должен блокироваться и не способен достигать исполнительной протонпереносящей системы.

Электрохимический градиент протонов, генерируемый ЭТЦ на сопрягающей мембране, служит движущей силон заключительного этапа трансформации энергии - синтеза АТФ [Mitchell, 1961]. Этот процесс катализируется особой, структурно не связанной с протонными редокс-помпами дыхательной цепи, ферментной системой - т.н. обратимой протонной АТФаюй FoFi-типа или Н -АТФ-синтетазой. Хотя молекулярный механизм преобразования энергии протонного потенциала в форму макроэргической свят ЛТ'Г>, катализируемого комплексами FcFj, нельзя считать окончательно установленным, в последние годы возобладала точка зрения, что решающая роль в этом процессе принадлежит белковым конформационным перестройкам [Boyer, 1977]. Экспериментальное обоснование роли конформацнонных перестроек полипептидов сопрягающего комплекса FoFi ках ключевой- этапа еннтеза АТФ по-прежнему остается актуальной задачей биоэнергетики.

В настоящей работе исследовалась возможность образования АТФ в митохондриях с "выключенной" дыхательной цепью за счет энергии конформацнонных перестроек, индуцированных температурными изменениями. Митохондрии печени крысы прединкубировались в среде стандартного состава, не содержащей окисляемых субстратов н дополненной KCN в конечной концентрации 3 мМ. Непосредственно перед началом опытов в суспензии вносились субстраты фосфорнлирования - АДФ и меченый Фн. Температурное воздействие представляло собой десятикратную серию циклов быстрой смены температуры, контролируемой непосредственно в суспензин, между ,>айними значениями 0 - +25"С, продолжительность одного цикла - 2 мин.

Таблица 1

Влияние температурных колебаний на включение радиоактивного фосфата в аденпловые нуклеотиды митохондриями

Нуклеотиды Активность, имп/мин'мг белка

Опыт: 0°С - +25°С Контроль: +25°С

АТФ Иб±8 , 5516

АДФ 217±14 %±9

У изолированных митохондрий высших животных эффективность реакций окислитель-^

ного фосфорилнрования максимальна при температуре +25°С [Rolhenberg, 1978]. Однако, как видно из "таблицы 1", в "опытных" образцах, где средняя температура составляла около +12°С, изотопная "метка" (Фн) включалась в АТФ (и АДФ) более чем в два раза активнее, чем в контрольных, инкубировавшихся при оптимальной, но постоянной температуре +25°С. Столь значительное содержание "меченого" АДФ (в особенности, в "опыте") -несомненно результат реакции, катализируемой аденилаткиназой: АТФ + АМФ —> 2 АДФ.

Сама по себе маловероят. .л возможность реализации наблюдаемого эффекта по механизму термоиндукции мембранного потенциала или концентрационного градиента протонов может быть полностью исключена, поскольку в аналогичных экспериментах с использовани-< м разобщителя ХКФ различия между опытом и контролем были ещё более выраженными.

В отсутствие химических источников энергии и ионных градиентов на мембране наиболее реальной причиной новообразования макроэргов, наблюдаемого в наших опытах, могут быть инициируемые температурными сдвигами структурные перестройки внутренней мембраны митохондрий в целом, либо ей структурно автономного сопрягающего фактора (T0F|) 1 отдельности. Так, известно [Вагасса, 1989], что охлаждение митохондриального каталитического субкомплекса Fi сопровождается его полнпептидной информационной перестройкой, приводящей к резкому падению сродства к нуклеотидам. Аналогичные изменения фактора 1 i (в составе митохондрий) зарегистрированы и при постоянной температуре (25°С) в ответ на "включение" элекгронтранспортной rm [Tu, 1981].

Таким образом, можно полагать, что накопление АТФ, вызываемое в суспензии митохондрий серией температурных "ударов", осуществляется в результате термоин-дуцированных конформацнонных перестроек в сопрягающем факторе и обусловленным ими переключением сродства центров связывания к нуклеотидам. В конечном итоге, это завершается выходом свободных молекул АТФ в окружающий раствор.

ФОТОАКТИВИРОВАНИЕ ЦМТОХРОМОКСИДАЗЫ, ЗАИНГИБИРОВАНПОЙ ЦИАНИДОМ И КОНФОРМАЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЕЁ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АКТИВНОСТИ

Изучение дыхания как научная проблема имеет "древнюю и благородную исто- ' рию"[Ленинджер, i960]. Оно послужило стимулом для многих наиболее важных достижений в истории химии, физики и биологии. Следует отметить, что феномен дыхания живых организмов, был охарактеризован в значительной мере благодаря эффектам т.н. дыхательных ядов: цианида и окиси углерода, продемонстрированных пионерскими работами Отто Варбурга [Warburg,1948). В своих классических исследованиях он обосновал

концепцию, согласно которой потребление кислорода клетками (дыхание) практически полностью происходит при участии железосодержащего, цианид- и СО-чувствительного "дыхательного фермента", позднее получившего название "цитохром-с-оксидаза".

ЦО и родственные ей оксидазы - терминальное звено ЭТЦ митохондрий и дышащих бактерий. Ей принадлежит фундаментальная роль в жизни аэробных организмов: на её долю приходится более 90% кислорода, потребляемого в биосфере [Babcock, Wikstrom, 1992]. Она является основной зоной преобразования энергни потока электронов в электрохимический градиент протонов на мембране, функционируя в качестве протонной редокс-помгы. ЦО -олигомерный интегральный белок сопрягающей мембраны и, в зависимости от организма, содержит от 3 до 13 субъединиц. Ей четыре простетическне группы представлены двумя медь-содержащими (Сил и Сив) и двумя железопорфнриновыми (гемы а и а,) редокс-центрами. "Входной" центр, Си*, а также гем а формируют внутримолекулярный путь переноса электронов каталитическому, т.н. бинуклеарному центру фермента, который включает в себя две другие редокс-группы, гем а, и Cuu. С кислородом и другими малыми лигандами (цианид, СО и др.) взаимодействует лишь один из гемов, «,; как и в случае гемоглобина, его центральный атом железа образует с ними шестую координационную связь. Активный центр ЦО расположен в гидрофобном ядре ее макромолекулы и в связи с этим, малодоступен для полярных соединений, расггорённых в окружающей водной среде

Каталитическая функция ЦО состоит в активировании молекулярного кислорода и его восстановлении до 2-х молекул НгО за счёт электронов, акцептируемых от ферроцитохрома с: 4фсрроцитс + 02 + 4 Н* -»4 феррицнтс + 2 lliO

Согласно последним представлениям [Babcock, Wiki.mni ,1992; Константинов, 1993), энергозапасающая (протонпереносящая) функция фермента сопряжена с реакциями каталитического центра - интерконверсией продуктов восстановления кислорода В связи с этим, биоэнсргегическг исследования последних лет, направленные на выяснение закономерностей и принципов сопряжения электронтранспортной и протон-насосной функций знергопре-образующих комплексов дыхательной цепи, изучаемых на примере ЦО, в большинстве своём, посвящены анализу событий, связанных с е4 активным центром - параметрам взаимодействия с физиологическим лигандом кислородом и ингибиторами [Einarsdottir, '995].

Ранние быстрые стадии каталитического цикла ЦО (связывания и восстановления О J традиционно исследуются с помощью метода Гибсона и Гринвуда [Gibson, Greenwood, 1963], который основан на способности карбокси-пронзводного фермента к фотодиссоцна-ции. К началу наших исследований было принято считать, что помимо СО-комплекса, фото-

чувстьнтельностью обладает лишь т.н. первичный кислородный аддукт ЦО, образующийся на начальной стадии взаимодействия О] с центром связывания [Orii, 1984, Brunori,I988], Комплексы же оксидазы с азидом, цианидом и другими лйгандами ei окисленной формы (Fe3+ гема аз), как полагали, не фотодиссоциируют, т.е. устойчивы к действию видимого света.

В настоящей работе изучалась возможность фотодеблокирования функциональной актигностн ЦО, как изолированной, так и в составе шгттжондрий либо ингактных клеток в присутствии наиболее luseci .¡ого ей ингибитора - цианида.

Процесс взаимодействия ЦО с цианидом представляет особый интерес по следующей причине.В то время, как кинетические параметры связывания и фотодиссоциации СО и ЦО мало чувствительны к изменениям её структурно-функционального состояния, скорость комплексирования окисленной ЦО с цианидом изменяется на шесть порядков величины при переходах между ев т.н. "покоящейся" и "пульсированной" формами [Brunori, 1988] Отметим, что по данным других методов указанные переходы мало различимы, либо вовсе незаметны. Таким образом, очевидно, что цианид является одним из наиболее чувс чтельных "зондов" каталитического центра оксидазы, наиболее вероятно -стерических условий, определяемых его полипегтгидным микроокружением.

Первые эксперименты выполнялись на митохондриях печени крысы, заингибиро-ванных KCN в общепринятых концентрациях - 1-2 мМ В этих случаях даже продолжительное (до 5 мин) облучение водимым светом i логеновая лампа мощностью 150 Вт, оборудованная тепловыми фильтрами) не приводило к сколько-нибудь заметному активированию дыхания митохондрий. Варьирование температуры (10 - 30°С) и рН (6,0 -8,5) инкубационной среды оказалось неэффективным при содержании ингибитора 1 мМ и выше, В последующем был проведен поиск пороговой ингибирующей (на' 90-95%) концентрации цианида. Как оказалось, в зависимости от рН и температуры среды, это значение находится в пределах 50 - 300 мкМ.

В условиях пороговых концентраций цианида .скорость потребления кислорода ипохондриями восстанавливалась при действии видимого света почти на 20% от контрольного уровня (в отсутствие ингибитора). Эффект развивался после непродолжительного (20-30 сек) лаг-периода и столь же быстро обращался в ответ на выключение света: скорость дыхания снижалась до исходного, "темнооого" уровня. Ингибируюицая активность KCN сохранялась и после семи циклов "свет-темнота". Максимальное деингибирование дыхания наблюдалось при облучении белым светом; эффективность его синей области (светофильтр СЗС-18) составляла 85%, оранжево- красной (ОС-13) - 1,5%. Однако, энергозависимый Са2* /Н* - обмен, даже при оптимальной для этого процесса

температуре (15°С), при освещении митохондрий в присутствии KCN был крайне незначительным. Наиболее вероятно, это объясняется относительно низкой скоростью транспорта электронов при фотостимуляции дыхательной цепи, заингибированной цианидом, которая недостаточна для энергизации внутренней мембраны.

Деблокирующее влияние видимого света на дыхание, заингибированное цианидом, было подтверждено и на другом объекте - клетках дрожжей Candida utilis. Для них пороговая концентрация KCN оказалась значительно выше (300 мкМ), однако световое воздействие той же интенсивности приводило к более выраженной, чем у митохондрий, стимуляции потребления Oj - до 39% в сравнении с интпктными клетками. Другое отличие заключалось в том, что связанное с дыханием и заингибированное цнанидом эакисление среды восстанавливалось при освещении дрожжевых суспензий не менее, чем на 90% (по его скорости). Выброс протонов клетками С. utilis в ответ на включение света наблюдался после "скрытого" периода в 1,5 - 2 мин. Несомненно, это объясняется опосредованием этогс* процесса, катализируемого Н'-АТФазой плазматической мембраны [Serano, J 980], внутриклеточным уровнем АТФ, зависящим от функциональной активности митохондрий.

Наиболее вероятное объяснение представленных выше результатов состоит в том, чт<1 потребление кислорода, наблюдаемое при освещении митохондрий, заингибированны* KCN, обусловлено восстановлением электронтранспортной функции дыхательной цепи эп счет фотодеблокирования е8 терминального, связывающего цианид, комплекса - LIO.

Для детального анализа эффекта фотодеблокирования дыхания, в последующих экспериментах были подобраны условия его максимального проявления. Прежде всего, интенсивность светового воздействия была доведена г - I кВт/мг (галогеновая лампа

Рнс.7. Фотодеблокирование дыхания митохондрий при тепературах 15°С (I и 2), 20°С (3) и 30°С (4) при утилизации сукцината ("С"-1,3,4) либо аскорбата("Аск"- 2), оба субстрата- по 5 мМ. ХКФ -3 мкМ; АА- антимицин А, 5 мкг/мл; цианид- 50 мкМ (1,2), 125 мкМ (3) и 250 мкМ(4). Мтх - митохондрии - 0,75 (4), 1,2 (3) и 1,7 (1 и 2) мг белка/мл. 1к, 2к, Зх, 4к - контроль, в отсутствие KCN. Числа над кривыми - скорость дыхания, выраженная в нгА О/'мг белка/мин.

мощностью 300-Вт).

С свет+

Как и следовало ожидать, при более интенсивном освещении величина фотостимуляции дыхания существенно превышает 20% и в оптимальных температурных условиях (15."С), "рис.7", кривая 1 достигает 65%. Как при понижении температуры инкубации (не показано), так и е4 повышении, эффективность фотодеблокирования заметно уменьшается: при 20°С она составляет 47% ("см. рис.7", кривая 3), при 30°С - всего лишь 19% ("см. рис.7".кривая Отметим, что фотоиндуцированное дыхание митохондрии (в присутствии КСЫ) ингнбируется аптимицином ("см. рнс.7", кривая 1) при окислении сукцнната и нечувствительно к его действию, если в к?., <-стве субстрата используется аскорбат, доннрующий электроны на уровне ЦО.

Температура 15°С является наиболее оптимальной не только д процесса фотодеблокирования дыхания митохондрий, но, как отмечалось ранее, и для энергозависимого Са:* /Н'-обмена. Тем не менее, последний процесс при 15°С реактивировался светом весьма незначительно - не более, чем на 10%; оказались безрезультатными измерения и при 30°С. Однако при 20°С эти эксперименты оказались вполне успешными.

Рмс.8. Фотодеблокиропанне Са-индуцн-рованного энергозависнмого выороса протонов митохондриями (2); К - контроль - в отсутствие (ССМ; 1 и 3 - то же, что и "К" и "2" соотв., но с 3 мкМ ХКФ. КС\' - 250 мкМ, сукцинат ("С") • 1 мМ, Мтх - 1,8 мг б-ка/мл., I - 20°С.

В этом случае ("рис.8", кривая 2), у митохондрий, заингибированных цианидом, под действием света Са17Н*+ -обмен восстанавливался не менее, чем на 68%. Столь З1...ч|пельные температурные различия в эффективности фотодеблокнровання энер-гозапасающей функции ЭТЦ, наиболее вероятно, определяются различиями а скорости транспорта электронов в условиях освещения (после деблокирования ЭТЦ): 58 нгА О/мг б-ка/мин при 30°С, 66 - при 15°С и 114,5 • при 20°С ("см. рис.7"). Можно полагать, что лишь в последнем случае скорость переноса электронов в дыхательной цепи ("число оборотов" протонных редокс-помп) достаточно высока для поддержания мембранного потенциала на уровне, необходимом для протекания кальций-протонного обмена [Мс Согтаск, 1991].

Таким образом, полученные данные - ингибирование антимицнном Л "фотодыханпя" при окислении сукцината, полное воспроизведение эффекта фотодеингибирования дыхания

в присутствии антммнцина и всхзрбэта и, наконец, фотоиндуцироваиное восстановление энергозапасак,щей (протонпсреносящей) функции ЭТЦ - свидетельствуют о том, что светоэависимое потребление кислорода митохондриями в присутствии цианида явлис,-и результатом функционирования реактивированной ЭТЦ, а не формированием фотопндуцированного флавннового "шунта" [Векшнн, Миронов, 1982].

Представлялось вполне вероятным, что "зоной реализации" светового воздействия, приводящего к деблокированию ЭТЦ, является её цианид-связывающин терминальный комплекс - ЦО. Дня обоснования этого предположения, а также в целях дальнейшего исследования обнаруженного фотоэффекта последующие эксперименты выполнялись на изолированном ферменте - ЦО, выделенной из сердца быка. В предварительных опытах было установлено, что только реакционная смесь, приготовленная на основе додецил-мальтсзида (ДМ) устойчива к интенсивному освещению. В глучае же других детергентов, традиционно используемых для солюбнлизации ЦО (Тритон-Х 100, различные твины и др.), отмечалось фотоиндуцироваиное поглощение кислорода и в отсутствие фермента.

СВСТ+

Рис.9. Влияние видимого света (1,2) и АТФ (3) на скорость потребления кислорода ЦО в присутствии цианида Состав среды: 0,1% ДМ, 5 мМ аскорбата (Аск), 0,15 мМ ТМФД, 15 мкМ Цнт с, 50. мМ HEPES-KOH, pH - 7,4, концентрации KCN обозначены на кривых. Содержание ЦО - 1,25 мкМ. Температура - 20°С.

Скорость потребления кислорода ЦО, заингибнрованной цианидом на 93-95%, возрастает под действием видимого спета не менее, чем в три раза ("рис.9", кривая 1) и более, чем в четыре раза - в присутствии 1 мМ АТФ ("см. рис.9", кривая 2). В последнем случае KCN был необходим в более высокой концентрации: как показано "см. рис.9" (кривая 3), АТФ существенно снижает чувствительность ЦО к ингибитору в темновых условиях, подобно свету, оказывая на компло-о ЦО-CN деблокирующее действие. Фо-тоденнтибирование ЦО проявляется после 0,5 - 1 минуты освещения и достигает максимального развития через 3 мннуты. Для достижения того.же уровня ингнбирования фермента, что и в темноте (в отсутствие АТФ), при облучении видимым светом (либо после прибавления АТФ в темноте) и.,анид необходим в 2-2,5 раза более высокой концентрации

("см. рис.9"). Таким образом, фото- к АТФ-1шдуцн;)уемое реактивирование ЦО наблюдается в достаточно узком интервале концентрации ингибитора и исчезает при их увеличении.

. Эффект фотоде&юкированкя каталитической активности цианндного комплекса изолированной ЦО исследовался не только полярографическим, но и спсктрофотомет-рическим методом: было установлено, что после 10-минутного освещения ферроцитохром с (50 мкМ) окнс;,лстся ЦО (1,5 мкМ), заингибированной КСК' (250 мкМ), более, чем на 95%. Контрольный уровень окнеления цчте (в тех же условиях, но в темноте) не превышал 3%.

Как стало очевидным " последние годы ",'ас!епЬас!1, 1995], ключевой пнтермеднат энергетического метаболизма, АТФ, способен оказывать прямое регуляторное влияние на терминальный энергопреобрачующий комплекс дыхательной цепи - Ц' Комплексируясь с особыми центрам» связывания молекулы окендазы. АТФ модифицирует ее каталитическую активность и, как полагают, кон формацией мое состояние, а в случае мембраносвязанной формы - также и эффективность преобразования энергии. По нашнм данным, АТФ в физиологической концентрации (5 мМ) не только снижал чувствительность изолированной ЦО к цианиду ("см. рис.9"), но и повышал её дыхательную активность: на 8-10% в кислой и щелочной областях (рН - 6,0 и 8,5, соотв.) н почти на 50% - при рН 7,4. В соответствии с литературными данными [Кеигапп, 1988], АТФ в более высокой, превышающей физиологическую, концентрации - 20 мМ - оказывал на ката-'пггп'.ескую активность окепдазы противоположное, угнетающее действие, снижая ей на 10%. Однако минимальная ннгибнрующая концентрация цианида в последнем случае резко менялась, возрастая от 125 мкМ (в контроле,"см. рис.9, кривая Г) до 1000 мкМ. Эти и другие данные иллюстрируют высокую чувствительность теста пороговой концентрации КСК к структурно-функциональному состоянию ЦО, что позволило, в частности, обнаружить регуляторно значимые эффекты низких концентраций АТФ.

Рис.10. Влияние АТФ в концентрациях 0,5 - 5 мМ на скорость потребления кислорода изолированной ЦО. К - контроль -скорость дыхания в отсутствие цианида. КСЫ - 75 мкМ. Условия те же, что и на "рис.9".

В работах по изучению влияния на каталитические (по окислению цчт с и поглощению Oj) и спектральные характеристики изолированной ЦО, АТФ обычно используется в концентрациях 10-25 мМ [Kadenbach, 1995), реже - 5-7,5 мМ [Reimann, 1988]. Однако, как

видно из "рис. 10", скорость .дыхания ЦО (с КС\' в допороговои концентрации) существенно, более чем в дм раза, снижается после прибавления 0,5 мМ АТФ и почти в той же мере увеличивается (относительно исходного уровня), если его содержание в среде достигает j мМ (" см. рис.9", кривая 3). Таким образом, АТФ не только в физиологических (5 мМ), но и в бо.-.ее низких концентрациях (0,5 мМ) оказывает на взаимодействие оксидазы с цианидом выраженное, однако противоположно направленное действие. Как принято считать, двухфазная зависимость эффектов малых лигандов от их концентрации указывает на наличие у белка более чем одного центра связывания. У ЦО различного происхождения обнаружено несколько центров связывания АТФ, как полагают [Kadenbach, 1995), регуляторного назначения, которые отличаются не только сродством, но и локализацией на поверхности макромолекулы: с внутренними (матриксными - у митохондрий) доменамн ассоциированы центры высокого сродства, низкого - доступны лишь со стороны наружной водной фазы. По общему мнению, спектральные характеристики ЦО достаточно чувствительны к изменениям состояния не только самого каталитического (лигандсаязывающего) центра, но и его ближайшего микроокружения [Wrigglesworth, 1988).

Нами исследовались абсорбционные спектры (в режиме дифференциальной спсктрофотометрпи) препаратов ЦО, обработанных ГА и АТФ. Было установлено, что ни ГА (2 -мМ, 5 мин), ни АТФ в концентрациях 0,1 - 1 мМ на указанные параметры заметным образом не влияют. После 5-мннутного инкубирования фермента с 5 мМ АТФ обнаруживался трудноразличимый, а при содержаи:::! нуклеогида 20 мМ - несколько более выраженный "синий сдвиг" максимума полосы Соре. Эти данные свидетельствуют, что оба реагента, взаимодействующие с периферической полнпептиднон областью оксидазы существенно не изменяют > уктуру ее хромофоров (гемов) и полярность их непосредственного окружения. Оказалось однако,что "мягкое сшивание" мембраносвязанной ЦО сопровождается не только избирательным блокированием её протонпереносящей функции ("см. рис. 1 и 5"), но и резким, в 5-6 раз, падением сродства к цианиду, которое оценивалась по значению пороговой ингнбирующей концентрации. Ещё значительнее этот показатель менялся у ЦО, "прошитой* ГА в растворе детергента: от 125 мкМ (в контроле) до 1250 мкМ.

Представленные результаты делают обоснованным вывод о том, что столь различные процессы, как связывание ннгибитора и электрогениый выброс протонов могут контролироваться одной и тон же внутримолекулярной структурой оксидазы, очевидно . прямо связанной с каталитическ. м центром. Это согласуется с посленими представлениями о том,что не только связывание лигандов, но и трансмембранный перенос протонов

осуществляются бинуклеарным реакционным центром фермента [Етагейотг, 1095, ¡\vata, 1995; Ус1кЬоу$ку, 1995], Тем не менее, очевидно и другое: связывание ГА и АТФ, т.е. воздействия, влияющие на упомянутые выше события, непосредственно адресованы шггозольной поверхности макромолекулы ЦО, пространственно удаленной от активного центра.

Таким ос, азом, можно полагать, что энергозапасающая и лиганд-связывающая активьости оксидазы не ограничигчются зоной каталитического центра, а вовлекают также и периферические области белковой глобулы. г*^сколы;у наиболее очевидный результат внутрибелкового сшивания - ограничение конформационной подвижности макромолекулы, вполне дочустимо, что такого рода связь осуществляется за счйт дна гных структурных взаимодействий, т.е. по аллосгернческому механизму, подобному эффекту Бора у гемогльбнна. Закономерен и ещё один вывод: протонпсреносящая и лиганд-связавающая функции ЦО зависят, хотя и в разной степени, от уровня межлолспептияноП подвижности даже в периферических, весьма отдаленных от активного центра областях её молекулы. Согласно рент.еноструктурным данным [|\уа;а, 1995], инициирующим и решающим событием акта трансформации энергии у бактериальной ЦО являются, наиболее вероятно, "маятниковые" перемещения и обратимое протонированне одного из гистидпнов, контактирующих с бинуклеарным центром и движимых энергией его редокс-переходов. По мнению авторов, именно "гистиднновый челнок" выполняет функцию Н*-помпы и обеспечивает однонаправленный перенос протонов во всём трансмембранном канале. В связи с тем, что, по нашим данным, ограничение белковой подвижности у поверхности макромолекулы оксидазы сопровождается выпадением ее протон-насосной функции, указанный механизм едва ли может быть сведен лишь к вращению имидазольного кольца вокруг углеводородной цепи аминокислотного остатка и по-видимому включает также движения (вероятно, ротацию) связанного с ним а-спирального сегмента. Возможно и др,. ое объяснение эффекта сшивания - как результата лекального блокирования "воротного устройства" вблизи "наружного терминала" лротонпереносящего пути. Однако, столь же выраженное влияние поверхностного сшивания и на лиганд-связывающую функцию ЦО, ассоциированную с гемом а,, расположенным в гидрофобном ядре макромолекулы, свидетельствуют о роли дистантных, аллостерических взаимодействий в функционировании оксидазы.

Как принято считать [Уопе1аго, 1960; Йошикава, 1996], цианид - лиганд окисленной формы ЦО, с которой он образует прочный комплекс: Кд = 1 мкМ. Тем не менее, НСМ связывается и восстановленной оксидазой, хотя и с существенно более низким сродством:

Кд = 100 мкМ [van Buurcn, 1972]. В последние годы, уже после наших работ [Конев, Рудснок,1989], было показано, что комплекс восстановленной ЦО и цианида (точнее, ее диганд-связывающего центра; гсм а, FeJ* -CN), подобно карбокси-производному фермен.а, также обладает фогочувствительностью [Einarsdoitir, 1995]. Поскольку окисленный комплекс ЦО-CN (ы, FeJ* -CN) не распадается под действием сиета, напрашивается вывод, что наблюдаемый нами эффект фотодеблокпрования оксндазы, заингибированной цианидом реализуется благодаря участию - фотодиссоциации - ei восстановленного, неустойчивого при освещении интермедиата - а, Fe" -CN. Однако известно, что указанный продукт может быть получен лишь в особых условиях: путем прибавления HCN к препаратам ЦО, предварительно восстановленных в бескислородной среде [van Buuren, 1972]. В присутствии же источников электронов и кислорода, т.е. в условиях, аналогичных нашим экспериментам, цианид быстро связывается с окисленным гемом ö, (Fe'* ) и стабилизирует в форме окисленного цианидного комплекса "гем а, Fe'* -CN", препятствуя его восстановлению даже таким сильным восстановителем, как дитионит [Иошикава, 1996] В этих случаях восстанавливается лишь один из гемов ЦО, "входной" гем a [Brunori, Wilson, 1995], таким образом, очевидно, что цианид блокирует внутримолекулярный транспорт электронов на стадии межгемового переноса (а -> а,).

Как оказалось, видимый свет способен активировать восстановление гема о, ЦО за счет его редокс-партнера, физиологического донора,- гема а. Нами была обнаружена выраженная фотостимуляция межгемового переноса электронов у цианидного комплекса оксидазы (в состоянии смешанной валентности: ¿í2' , a,1*-CN), который в темновых условиях протекает с очень шь..он скоростью даже в присутствии дитионита [Verkhovsky, 1995]. По данным спектрофотометр»и, под влиянием света значительная часть а1', a^-CN-комплекса трасформируется в полносл j восстановленную цианидную форму ЦО: <í' , а73' -CN. Можно полагать, что данный процесс реализуется также с участием конформационных изменений в микроокружении гема а„ приводящих к возрастанию его электрон-акцепторных свойств (увеличению значен] с ,>едокс-потенцнала).

Этот последний результат несомненно является решающим для понимания механизма фотодеблокирования ЦО-СМ-комплекса, которое, наиболее вероятно, должно осуществляться в два этапа. Вначале - формирование популяции молекул ЦО, связанных с цианидом, но в полностью зосстановленном состоянии, которые обладают фоточувствительностью и затем, на второй стадии, >« фотодиссоциация, возможно, при повторном фотовозбуждении гема а3.

Есть все основания полагать, что структурные изменения, связанные с процессом фотодеблокирования, вовлекают также и области белковой матрицы, достаточно удаленные от активного центра: об этом свидетельствует тот факт, что после обработки ЦО "периферическим" сшивающим реагентом (ГА, в режиме "мягкого" сшивания - 2 мМ, 5 мин) эффективность фотодеблокирования её цнаиндного комплекса снижалась в 2,8 раза.

Как свиде. льствуют представленные данные, параметры взаимодействия с цианидом являются прямым и высокочучсвительным "зондом" структурно-функционального состояния реакционного центра ЦО. Нами "чло установлено, что ингибнрующая эффективность цианида изменяется не только под влиянием различной природы агентоз, непосредственно адресованных молекуле ЦО, но ;1 за счет воздейсп .1 на мембрану в целом. Так, в гипо- и гипсросмотических услочиях, значение пороговой концентрации КС\' для мемораносчязанной (в составе митохондрий) окендазы различается не менее чем в пять раз, эффективност ь фотодеблокированчя - в 3,7 раза.

Осмотическая напряженность митохондриальной мембраны оказывает выраженное влияние также и на термоустойчнвость её электронтранспортных комплексов, в том числе и ЦО. Так, после прогревания митохондрий в гиперосмотичеекнх условиях при 55°С (5 мин) скорость их дыхания в сравнении с контролем (митохондрии, инкубировавшиеся в тон же срсде п,)и 20"С 5 мин) не только не снижалась, а возрастала не менее, чем в три раза. Их дыхательная активность была также значительно более высокой (в 3,5 раза), чем у препаратов митохондрий после высокотемпературного воздействия (55°С, 5 мин) в изоосмошческой среде. Указанные различия сохранялись и при тестировании каталитической функции лишь терминального звена дыхательной цепи митохондрий - ЦО Отметим, что степень тепловой инактивации (5-минутное нагревание при 45°С, 55°С и оО°С) изолированной ЦО в растворе детергента в гипо-, изо- и гиперосмотических условиях полностью совпадала.

Гаким образом очевидно, что обнаруженная нами новая фотобиологпческая реакция -фотодеблокирование дыхательной активности комплекса ЦО с цианидом - проявляет выраженную зависимость не только от уровня конформационнон подвижности апофермента, но и от состояния мембранной матрицы.

Для выяснения механизма влияния видимого света на структурно-функциональные характеристики изолированной ЦО нами исследовались спектры поглощения (в дифференциальном режиме) её окисленной цианидной формы после трёхминутного освещения. Как и можно было предполагать, это не приводит к появлению спектрально различимых количеств делигандированного фермента. Напротив, как видно из "рис 11",

вместо ожидаемого в такоь: случге "синего сдвига" в полосе Соре (от 436 нм у а/* -С!^-комплекса до 418 нм - свободной формы о,) наблюдался выраженный "красный сдвиг" в этой области (до 445 нм) и в а-полосе (от 600 до 605 нм), по общему представленье, свидетельствующий о формировании популяции молекул оксидазы с восстановленными гемовами группами. Указанные фотоиндуцированные сг.ектрал! ные изменения обратимы -они "выцветают" в темноте в течение 20-30 минут. Неожиданно оказалось, что чрезвычайно сходные спектральные перестройки наблюдаются и после освещения свободной формы окисленной ЦО, т.е. в отсутствие цианида. Амплитуда инициированных светом спектральных изменений у ЦО е обоих случаях была существенно выше в бескислородных условиях ("см. рис. 11", кривая 2).

Одной из возможных причин фотоэффекта, представленного на "см. рис.11", может быть светозависнмое перераспределение электронов в системе "центр связывания - лиганд". В случае ЦО-СК'-комплекса, например - с окисленнем цианида до дициана ((СЬ')2) и восстановлением тема а,. Вполне очевидно, что уровень восстано-тенного о3 в присутствии Ог был бы ниже, поскольку ои мог реокисляться с образованием перокси-интермедиата.

А

Рис.11. Дифференциальные спектры цнанидного комплекса окисленной ЦО после 3-х минутного освещения (относительно "темновото варианта' в присутствии (1) и в отсутствие (2) кислорода. 3 - базовая линия. Содержание ЦО -3,25 мкМ. Состав среды инкубации: 0,1% ДМ, 50 мМ НЕРЯБ-КОН, рН - 7,4. Температура - 20°С.

0,02"

.А

400 нм 600 ны

Однако в случае свободной формы ок -ленной ЦО подобный механизм значительно менее реален. Прежде всего, наличие лиганда у а/' свободной оксидазы, по общему мнению, далеко не очевидно и его химическая природа остаётся неясной [Йошикава, 1996]. Даже если допустить, что, как считают многие угу роль выполняет молекула НгО (либо ОН"), возможность ei фотоокисления - вероятно, до перокси-интермедиата • весьма проблематична. К тому же, в этом случае труднообъясним "тушащий эффект" кислорода.

По нашему мнению, более предпочтительна иная интерпретация результатов, приведенных на "см. рис. 11" Известно, что в свежеприготовленных растворах ЦО находится не в полностью окисленном, а преимущественно в одноэлеюгронно-восста-новленом состоянии (около 1 е на 1 молекулу ЦО) с локализацией элехтрона на "спект-

рально невидимом" центре - Cun [Hallen, 1993). Спектральные характеристики и ре.гжс-параметры ЦО определяются стеримескнми условиями и полярностью вблизи ее просте-тических фупп [Georgiadis, 1994]. Можно полагать, что Лотовозбужденне тема «, сопровождается структурной реорганизацией его непосредственного окружения и, как следствие, существенным возрастанием электрон-акцепторных свойств. Эти события должны инициировать "перескок* электрона с Сив на гем а„ т.е. восстановление последнего: a,-Fe3*, Си и* -> я,-Fe", Си»3*. Ингнбирующее влияние кислорода на этот процесс, наиболее вероятно, обусловлено тем, э он способен комплектироваться с Сив* и стабилизировать его в восстановленной форме.

Таким образом, по.нашему мнению, ключевая стадия в реализации рассматриваемого фотоэффекта - конформационная перестройка в микроокруженин гемов-хромофоров, вовлекающая - в случае дистантных взаимодействий - также и периферические зоны болковой глобулы. Для выяснения такой возможности нами был использован достаточно строгий и простой тест коиформационных состояний полипептидов - протеолиз трипсином [Brzezinski, Anderson,!995]. Как оказалось, при освещении скорость протеолиза ЦО почти в два раза выше, чем в темповых условиях, что прямо подтверждает предположение об участии поверхностных областей полнпептидного матрикса фермента в инициированных светом структурных изменениях.

РОЛЬ ЦИАИИДУСТОЙЧИВОЙ ТЕРМИНАЛЬНОЙ ОКСПДАЗЫ В ЭНЕРГЕТИЧЕСКОМ МЕТАБОЛИЗМЕ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК

Как стало очевидным в последнее десятилетие, ЦО - далеко не единственная терминальная оксилаза редокс-цепей сопрягающих мембран. К настоящему времени эписано более десяти электротранспортных комплексов, использующих в качестве et чных акцепторов электронов не только кислород, но и другие соединения [Акименко, 1989]. Разветвление дыхательной цепи в конечном её участке - распространённое явление не только у бактерий, но и различных клеток-эукариотов. У последних альтернативная или цианидустойчнвая терминальная оксидаза (ЦУТО) связана с .митохондриями; она не ¡одержит гемовых простатических групп и отличается, в связи с этим, нечувствительностью с цианиду. Принято считать, что в отличие от ЦО у ЦУТО отсутствует пункт >нергетического сопряжения [Moore, 1995]. Причины появления и, связанные с ними 1роблемы функционального назначения, ЦУТО до настоящего времени остаются неясными. 3 случае микроорганизмов можно лишь констатировать, что, как правило, она формируется ) ответ на неблагоприятные условия среды: дефицит субстратов и кислорода в присутствии

дыхательных ядов, при нарушении синтеза цнтохромов и т.п. [Акнменко, 1989]. У аэробных дрожжей и некоторых других организмов альтернативная оксидаза неизменно появляется и в физиологических условиях, на стадии перехода из логарифмической в стационарную ф.. / развития.

Б настоящей работе исследовалось влияние ЦУТО на эффективность преобразования энергии у дро;:;жевой культуры Candida utilis, а также выживаемость клеток в условиях продолжительного культивировании. У С. utilis цианидустойчивое дыхание проявлялось после 1-2 суток выращивания и достигало максимального развития после 3-5 суток при дефиците окисляемых субстратов. В полной мере оно сохранялось и поело 7 суток, когда дрожжевые клетки ещё оставались жизнеспособными (не более 5-7% погибших клеток), но уровни их "эндогенного" дыхания к внутриклеточного содержания АТФ резко снижались.

О,г

ел

рм

Рис. 12. Влияние БГК (5 мМ, кривая 3) на величину энергозависимого закисления среды (А) и накопление А1Ч*> (Б) 7-дневными дрожжевыми клетками при утилизации глицерина в микроаэробных условиях(1) и при повышенной аэрации(2).

Как видно из "рис. 12" (кривая 1), длительно голодающие, цианиднечувствительные клетки С. utilis после прибавления 0,005% глицернна (окисляемый субстрат) снижают рН среды приблизительно на 0,3 ед., после чего закисление останавливалось. В условиях высокой аэрации суспензии а- 1чина и скорость закисления уменьшались, однако,и в микроаэробных условиях эффективность выброса протонов клетками ещё более значительно, почти на 1/3, снижалась в присутствии ингнбитора ЦУТО - БГК (кривая 3, "см. рис.12"). Параметры этого процесса, катализируемого у дрожжей Н"-АТФазой плазматической мембраны [Serrano, 1980], коррелируют с уровнем содержания АТФ в клетках. Было также установлено, что ЦУТО имеет существенное значение и для выживания дрожжевых клеток: в случае их 7-сугочж о культивирования в присутствии ЕГК число погибших (окрашенных) клеток превышало 40%, тогда как в контроле оно составляло всего 5-7%. Как известно [Акименко, 1989], гцдроксамовые кислоты, ингибиторы ЦУТО, не влияют на энергетический метаболизм молодых дрожжевых клеток либо митохондрии животных. Таким образом, ^фекгы БГК - снижение величины закисления и внутриклеточного содержания АТФ - свидетельствуют о том, что ингибируемая ею ЦУТО

вей же обладает способностью каким-то образом повышать эффективность трансформации энергии при ¡типизации малых количеств окисляемых субстратов. В связи с .-иложенны.мн выше особенностями альтернативной оксидазы, её "усиливающее" участие в окислительном фосфорилировании едва ли может осуществляться по механизму оксидазной активности, т.е. переноса электроноо из кислород. Это диктует необходимость принципиально пион интерпретации онаруженного явления.

Несомненно, ЦУТО представляет собой "электронный шунт", однако, по нашему мнению, функционирующий в режиме реверп. катализируя обратный перенос части электронов с уровня ЦО по фадиенту редокс-потенциалов на убихинон по замкнутому циклу. Свободная энергии каталитического цикла ЦО (23,8 ккал) до<п "ша не только для трансмембранного выброса протонов, но и обратного транспорта электронов г,о альтернативному пути (10 ккал). Таким образом, предполагается, что более эффективная утилизация энергии окисляемого субстрата достигается благодари ответ(лению потока электронов на цикличный путь: Ко<2 - ее, -ЦО - ЦУТО -К0<2. Каг видно, данная схема подразумевает, что ЦУТО структурно связана с ЦО либо является ее дополнительно» субьединицен. Наиболее вероятно, ЦО донирует электроны альтернативной оксидам м стадии двухэлсктроннорго восстановления, т.е. перокси-ннтермедиата. Как мы полагаем, повышение энергетической эффективности дыхательной цепи при подключении альтернативного цикла обусловлено тем, что каждый электрон, переносимый по редокс-цепи на О;, дважды пересекает один из пунктов сопряжения - цитохромный комплекс «с-;. При утилизации глицерина дрожжевыми клетками, электроны акцептируются на уровне убихннона, т.е. в дыхательной цепи функционируют два пункта сопряжения Ответвление половины электронов по замкнутому циклу через ЦУТО, по-видимому за счет конформационной энергии белка, должно привести к двойной "загрузке" «^-комплекса. В этом случае транспорт двух пар электронов на кислород должен сопровождаться I ктрогенным выбросом шести протонов, а не четырёх, как в обычной (лниейной)

о

дыхательной цепи. Таким образом, при окислении глицерина, энергетическая эффективность трансформации энергии благодаря участию ЦУТО должна возрасти на 1/3, что соответствует результатам, представленным на "см. рис. 12".

После продолжительного культивирования дрожжевых клеток (5-7 суток), приводящего к истощению энергетических субстратов, фаза закисления среды, характерная для молодых культур, сменялась продолжительным и выраженным её защелачиванием (в диапозоне значений рН от 2,2 до 7,5-7,7). Также, как и закисление, процесс защелачивания тормозился ингибиторами "наружной" Н*-АТФазы дрожжевых клеток (ванадат.

дштилстильбэстрол) и отличалгя крутой зависимостью от интенсивности аэрации суспензий. После прибавления ингибиторов Н*-АТФазы, либо отключения аэрации за-щелачизание среды полностью прекращалось. Это сопровождалось также быстрым I значительным, не менее, чем в два раза, падением внутриклеточного содержания АТФ и гибелью всех клеток в теченче 1-2-х часов. В том случае, когда истощенные дрожжевые клетки аэрировались в исходно более щелочной среде (рН 8,5), они также быстро погибали.

Как свидетельствуют полученные данные, в условиях дефицита либо полного исчерпания окисляемых субстратов у длительно культивируемых дрожжей, функцию синтеза АТФ может выполнять Н'-АТФаза плазматической мембраны и, тем оыым. повышать жизнеспособность клеток и выживаемость дрожжевой культуры (до 14 суток). Вероятно высокий концентрационный градиент протонов на плазматической мембране дрожжевых клеток, формирующийся в ¡.ервые сутки культивирования, достаточен для обращения функций "наружной" Н*-АТФазы - обратного, направленного внутрь клетки переноса протонов, сопряженного с синтезом АТФ.

ВЫВОДЫ

1. В развитие хемиосмотическсй теории сопряжения при окислительном фосфо-рилировании установлено, что трансмембранный перенос протонов редокс-помпами М1гтохондрий осуществляется с участием белковых конформациониых перестроек.

2. Обнаружено, что энергия конформациониых переходов белков энергосопрягающих комплексов, ¡¡ндуцированных циклом температурных сдвигов "0 - 25°С", способствует накоплению АТФ митохондр- чн в отсутствие экзогенных окисляемых субстратов. Образование АТФ не связано ни с утилизацией эндогенных субстратов, ни с формированием термоиндуцированного протонного градиента на мембране, поскольку оно наблюдалось в присутствии ингибитора дыхательной цепи и протонофора-разобщителя.

3. Показано, что класс реакций фотодиссоциации "гемсодержащий белок- ингибитор" включает в себя также и реакцию фотодеблокирования функциональной активности цнтохром-с-оксндазы, заингибированной ц,. .нидом.

4. Степень фотодеблокирования цнанидного комплекса цитохромоксидазы снижается после формирования внутрибелковых ковалентных сшивок, уменьшающих структурную лабильность фермента.

5. Обнаружена медленная ч релаксирующая в течение 30 минут) конформацмонная

перестройка цнтохромоксидазы, инициируемая видимым светом, которая реализуется с участием бннуклеарного каталитического центра фермента.

6. Каталитическая и лиганд-связывающая активности, а также температурная устойчивость цитохромоксидазы митохондрий в широких пределах модифицируется г.ри их гипоосмотнческом растяжении либо гнперосмотическом сжатии, что свидетельствует об интенсивных к..«молекулярных взаимодействиях цитохромоксидазы с микроокружением сопрягающей мембраны.

7 Показано, что альтерчтгивная терминала -я оксидаза дыхательной цепи дрожжевых организмов, образуемая в условиях дефицита окисляемых субстратов, существенно (на 30%) повышает эффективность утилизации энергии экзогенных суГ ратов, а также выживаемость клеток в сравнении с дрожжами, у которых альтернативная оксидаза заннгчйиравааа.

8. Установлено, что при длительном дефиците энергетических субстратов функцию синтеза АТФ у дрожжевых клеток способна выполнять протонная помпа их плазматической мембраны благодаря обращению реакции протонной АТФазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДНССЕРТЛ НИИ

1. Конев C.B., Разумов1;ч АН., Гамезо Н.В., Руденок АН.. Роль структурных перестроек при синтезе АТФ в митохондриях// Биофизика,- 1979,- Т. 24,- № 3 - С. 349-350.

2. Матус В.К., Мельникова A.M., Конев С.В , Руденок А Н. Действие озона на мсмбра-нозавнсимые функции дрожжевых клеток//Микробиология - 1982.- Т. 51.- jVL> 2,- С - 220-223.

3. Разуваев B.C., Руденок А Н. Повышение точности определения мертвых клеток дрожжей//Виноделие и виноградарство СССР,- 1982.- Т. 369,- JVs 3,- С. 262-262.

4. Конеу C.B., Рудзянок A.M., Чарнавок М.М. Асаблтасш б^яэнергетычнага працэсу д, ..жджавых клетак у экстрэмальных умовах// BecuiAH БССР.- 1984,- Сер. 5\ял. навук - Ki 6,-С 55-60.

5. Конев C.B., Руденок АН., Черноок Н.Н., Лыскова Т.Н., Аксенцев С,Л. Влияние сшивающих агентов на транспорт электронов и перенос протонов в дыхательной цепи митохондрий//Биофизика.- 1985,-Т. 30,-№ 4,- С. 704-706.

6. Рудзянок А.М., Конеу C.B. Тэмпературныя адрозненш кальцый-пратоннага абмену у мп-ахондрый печаш пацука//Becui АН БССР,- 1986,- Сер. йял. навук,-№ 3.- С. 44-48.

7. Рудзянок AM., Конеу C.B. Роля Н*-АТФ плазматычных мембран у энергетычным метабал1зме працягла галадаючых дражджавых клетак// Becui АН БССК- 1987,- Сер. 61ЯЛ. навук,- -Va 2,- С. 45-ÎS.

8. Конев С.С., Руденок А.Н. Влияние цитохалазина S на энергетические процессы у митохондрий// Becui АН БССР,- 1987,- Сер. &ял. навук.- Га 4,- С.'ИЗ-Ц4.

9. К'фылау У.А., Рудзянок A.M., Горава Л.М., Судн'ж О.М., Конеу C.B. Асаблтасш заселения г.сьроддзя ф|брабластам1 эмбрыенау курэй// Becui АН БССР,- 1988,- Сер. бшл. навук.-X; !.- С. 84-S7.

10. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Руденок А.Н., Конев C.B., Вотяков В.И. Участие Na'/Н' - обмена и диффузии молочной кислоты в кислотозависимом процессе раздевания вируса гриппа// Докл. АН СССР,- 1989,- Т. 309,- N'a 2.- С. 461-463.

11. Конев C.B., Руденок А Н. Эффект снятия видгмым светом цианидного блока дыхательной цепи митохондрий// Докл. АН БССР.- 1982,- Т. 33.- N'a 2,- С. 178-180.

12. Руденок АН., Конев C.B. Влияние обратимо сшивающих реагентов на дыхательную цепь митохондрий//Биофизика,- 1991,- Т. 36,- N'a 2,- С. 291-293.

13. Рудзянок A.M., Въгсиранец Л.М., Конеу C.B. Фотадзблаюраванне дыхальнага лан-цуга м1тахондрый у прысутнасщ цыящду'/ Becui АН Беларуси- 1992,- Сер. б!ял. навук. № 2.-С. 70-74.

14. Конев C.B., Руденок А.Н. Роль конформацнонной подвижности белков » работе электронтранспортной цепа митохондрий//Биофизика,- 1992.-1. 37,- N'a 5,-С. 939-941.

15. Конев C.B., Руденок АН., Выбиранец Л.М. Фотодеблокированне цитохромоксида-зы, заблокированной цпанодом// Докл. АН Беларуси,- 1992,- Т. 33 - N'a 7-8,- С. 660-663.

16. Рудзянок A.M., ЧаГи .:кая 1. А., Талапш В.1., Конеу C.B. Мембранатропнае дзеянне новага антымжробнага злучэння класа ам'жагэрпеношау// Becui АН Беларуси- 1992.-Сер. был. навук,- N'a 3-4,- С. 23-26.

17. Руденок АН., Конев C.B., Выбиранец Л.М. Влияние осмотического потенциала среды на взаимодействие цитохромокендазы митохондрий с инп.юитором// Докл. АН Беларуси,-.1993.-Т. 37,-N» З.-С. 67-71.

18. Конев C.B., Руденок АН., Выи,ранец ЛМ. Мембранный контроль реакции фозодеблокировання цитохромокендазы в электронтранспортной цепи митохондрий// Биофизика -1993,-Т. 38 -№ 6 -С. 1043-1046.

19. Белянович Л.М., Никольская В.П., Руденок АН., Конев C.B. Спектральные характеристики цианидннгнбированной цитохромокендазы при ее фотореактивации и взаимодействии с АТФ// Журнал прикл. спектроскопии,- 1996.- Т. 63,- Л'_> 3,- С. 395-403.

РЭЗЮМЭ

Рудзянок Аляксандр М1калаев1ч

КанфармацыПпыя пераСудовы мембранных эпертаг.сраутвараючых комплекса} I функцыяи{рав>шне т>рм1налъных акс1д»з

Кдючавь'я слоры: ак!сляльнае фасфарытраванме, элеюронтранспортны ланцуг, грансфармацыя энерги, канфармацыйныя перабудовы, мггахондрьм, цытахром-г-ахс1-даза, фотарзактывацыя, аш >рнатыуная тэрм. альная аксщаза.

Трансмембранны перанос пратонау энергаспалучаючь!м1 ко ..илексам1 (пратон-иым! р?докс-помпаМ1) М1тахондрый рэал13укщцг э удзелам канфармацыйнай дынамш бялкоу.

Энерпя тэрмавдуцыраваных канфармаиыйных перабудоу бялкоу можа быць выкарыстана для накаплення АТФ м1тахондрь:ям1, у яюх элекгр0|ггранспарл1ы ланцуг зашпб1равань:,! адсуппчае электраммкны градиент пратонау на мембране.

Юте рэакцый фотадысацыацьп гемурьишвиючых бялкоу з малым! .".¡гандам! змяшчае, тяксама, I рзакцыю фотадэ>лак.равання тэрмшальнага эвяна дыхальнага ланцуга м1тахондршй - цытахромаксиазы. зашпб^раванай цьшмдам. Ступень фота-дэблях1раванля, Л1ганд-звязываючая I хаталпычная лггыунасш, а такса.ма тэмператур-IIая устошпвасш. цытахромаксдазы залежаць ад яе канфармацыйнага стану малеку-дярнага асчроддзя у мембране.

Альгэрнатьфшя (цыяц'щустоПлшая) тэрмшальная акадаэа дыхальнага ланцуга дражджавых М(краяргашзиау ¡стотна павышае эфектыунасць утышзацьи энергп субсгратау, як1я аюсляюцца, ва умоаах IX дэфщыта, а таксами выжывальнасць клетак. При працяглым галаданш дражджавых. клетак (адсутнасщ энергетычных субсгратау) фчнкцыю стнтэза АТФ здольна выхонваць пра^онная АТФаза ¡х плазматычнай мембраны, дзякуючы абарачэнню за кошт энергц аысокага каквднтрацыйнага градиента пратонау на мембране.

Вышк) работы могуць быць выкарыстаны для рапрацоую метадау карэкцы! пару-шэнняу клетачнага дыхания 1 энерггтычнага метабал1зма.

34

РЕЗЮМЕ

Руденок Александр Николаевич

Конформационные перестройки мембранных энер.опреоОразующих комплексов и функционирование терминальных оксида!-

Ключевые слова: окислительное фосфорилирование, трансформация энергии, конформационные перестройки, митохондрии, шггохром-с-оксидаза, фотореактивирование, альтернативная терминальная оксидаза.

Трансмембранный перенос протонов энергосопрягающпми комплексами (протонными редокс-помпами) митохондрий реализуется с участием конформацнонной динамики белков.

Энергия термоиндуцированных белковых конформацно"ных перестроек может использоваться для накопления АТФ митохондриями, у которых электронтранспортная цепь заингибирована, и отсутствует электрохимический градиент протонов на мембране.

Класс реакций фотодиссоциации гемсодержащих белков с малыми лигандами включает в себя также и реакцию фотодеблокирования терминального звена дыхательной цепи митохондрий - шлгохромоксидазы, заингибированной цианидом. Степень фотодеблокирования, лиганд-связывающая и ; .талитическая .активности, а также температурная устойчивость цитохромоксидазы зависят от её конформационного состояния и молекулярного микроокружения в мембране.

Альтернативная (цианид,. тойчивая) терминальная оксидаза дыхательной цепи дрожжевых микроорганизмов существенно повышает эффективность утилизации энергии окисляемых субстратов в условиях ■ с дефицита, а также выживаемость клеток. При длительном голодании дрожжевых клеток (отсутствии энергетических субстратов) функцию синтеза АТФ способна выполнять протонная АТФаза их плазматической мембраны благодаря, обращению реакции за счёт энергии высокого концентрационного градиента протонов на мембране.

Результаты работы могут быть использованы для разработки методов коррекции нарушений клеточного дыхания и энергетического метаболизма.

Summary

Rudenok Alexander Nikolaevich

Conformational transitions of membrane energy-transforming complexes and function

Key words: oxidative phosphorylation, energy transformation, conformational transitions, mitochondria, cytochrome c oxiuase, photoreactivation, alternative terminal oxidase

Transmembrane translocation of protons by the mitochondrial energy-coupling complexes (proton redox-pumps) is realized with a participation of the conformational dynamics of proteins.

The energy of thermoinduced protein conformation transitions can be used for' ATt* accumulation in mitochondria with the electron transport chain being shut off and without' aft" electrochemical proton gradient on the membrane.

. The class of the reactions of photodissociation of the complexes of hemoproteiriiwith'snto'l' ligands includes as well the reaction of photodeblockage of the tirminal unit :of!the mitochondrial respira'ory chain, cytochrome oxidase, while being cyanide-inhibWdv The extent of photodeblockage, ligand-binding and catalytic activities, as well as temperature stability of the cytochrome oxidase depend on its conformational state and molecular irticroenvironment in the membrane.

Alternative (cyanide-resistant) terminal oxidase of the respiratdty chain in yeasts substantially increases both the efficiency of the utilization of the energy of oxidized substrates in conditions of their deficit and cell survival. Under prolonged starvattortofyeasr'cells (lack of energy substrates) the ATP'synthase function can be provided by proton' ATPase of 'the plasma membrane via the re sal of its activity by usingthe energy of high'proton^ontentratitin ftradieTit on the membrane.

The results of the workmaybfcused f6r thfcela&erHtiotr&f lHfctoetfiixfe'of the correction of cell respiration and energy metabolism impairments'.

of terminal oxidases