Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли белок-липидных взаимоотношений в функциональных тилакоидных мембран

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли белок-липидных взаимоотношений в функциональных тилакоидных мембран"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ имени В.Ф.КУПРЕВИЧА

На правах рукописи

МАЛАХ Юрий Ефимович

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МИНСК - 1993

Работа выполнена в Казанском институте биологии КНЦ РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических- наук, ведущий научный сотрудник А. И. ЗАЕОТИН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.М. ИВАНЧЕНКО

кандидат биологических наук Г. Е. САВЧЕНКО

Ведущее учреждение:

Институт физиологии растений РАН Сг. Москва)

Защита диссертации состоится "<//" 1994 г.

в час. на заседании специализированного сбвета К 006. 04. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Ордена Трудового Красного Знамени Институте экспериментальной ботаники им. В. Ф.Купревича АН Беларуси, по адресу: 220072, г.Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке иы.Я. Коласа АН Беларуси.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь специализированного р

совета, кандидат биологических наук ъСгв*1^'11 В. РОГУЛЬЧЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Исследование молекулярной организации клеточных и внутриклеточных (органеллы) мембран и связи между изменениями их структуры и функции•остается одним из ведущих направлений биологии. Основная масса работ посвящена исследованиям изменений структуры клетки и органелл Сих формы, количества, месторасположения и др.) под действием разнообразных внешних факторов и условий. Обнаружено множество важных корреляций между структурой и функцией клеток и органелл. Значительное развитие получили исследования роли физической структуры в'реализации барьерных свойств мембран,определяющих протекание важнейших функций клетки - транспорта органических и неорганических веществ и воды, фосфорилирования и других.

В настоящий момент пристальное внимание уделяется роли межмолекулярных взаимодействий Сбелок-белок, белок-лчпид, катионы-макромолекулы и других) в реализации отдельных функций биологических мембран. В этом отношении исследования физических свойств мембран растительных клеток и их роли в регуляции менее продвинуты. В тилакоидах посредством перестроек мембран может, в частности, реализовываться механизм контроля за распределением энергии между фотосистемами I и II. Такое распределение должно меняться в ответ на внутриклеточные и физиологические потребности системы, например, когда требуется образование определенных пропорций АТФ и НАДФН. Можно считать установленным, что сегрегация важнейших пигмент-белковых комплексов в фотосинтезирующей мембране, существенно меняпщая распределение энергии между ними, реализуется вследствие экранирования поверхностных зарядов мембран и фосфорилирования мембранных белков. Однако до сих пор остается неясной роль гетерогенной по составу липидной фазы мембран тилакоидов в этих перестройках.

Есть основания предполагать, что функционирование АТФ-синтетазы хлоропластов, как и многих других мембранных АТФаз, также опосредовано состоянием ближайшего окружения, то есть липидами, входящими в пограничный слой фермента. Таким образом, выяснение небарьерной роли мембран представляет значительный интерес в понимании механизмов фотофосфорилирования. Без исследования этого комплекса проблем невозможно глу-

-. 1 -

бокое понимание механизмов регуляции фотосинтеза в хлороплас-тах, и весьма актуальным представляется выяснение роли липид-ной фазы тилакоидных мембран в этих механизмах.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось выяснение роли лилидной фазы и белок-липидных взаимодействий в функционировании и организации мембран тилакоидов и их отдельных компонент под действием различных эффекторов, детализация изменений, происходящих в липидной фазе, выяснение роли липидов различного состава в мембранных перестройках. Наряду с исследованием происходящих в фотосинтетических мембранах изменений под действием катионов, вызывающих существенные структурные перестройки, а также эффекторов, действие которых направлено на липидную часть мембраны, изучалась возможность участия в белок-липидных взаимодействиях основного белка фотосинтетической мембраны - светособирающего комплекса и функционально значимого фермента - АТФ-синтетазы.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) изучить характеристики и динамику связывания катионов с мембранами тилакоидов хлоропластов, определить природу центров связывания;

2) исследовать структурные изменения, происходящие в липидной фазе под действием катионов, оценить изменения доли липидов, взаимодействующих с интегральными белками,их состав;

33 выяснить влияние изменений, происходящих в липидной фазе, на ультраструктуру тилакоидных мембран и характер флуоресценции пигмент-белковых комплексов;

4) исследовать взаимодействие гидрофобных лигандов, способных имитировать роль ацильных частей липидов,с изолированным сопрягающим комплексом АТФ-синтетазы хлоропластов, . их влияние на структуру и функцию фермента.

Научная новизна. Проведено исследование количественных характеристик связывания двухвалентных катионов с мембранами тилакоидов. С помощью модификации мембран различными эффекторами показано, что центрами связывания катионов на мембране являются карбоксильные группы белков. Показано, что заполнение катионами центров сильного сродства индуцирует гранообра-зование и рост квантового выхода флуоресценции вследствие усиления взаимодействия ССК и ФС II и восстановления первич-

- о -

ного акцептора. Однако, как следует из данных, полученных при модификации мембран другими эффекторами, эти процессы, определяемые изменениями зарядных взаимодействий мезду различными белками, опосредованы белок-лшшдными взаимодействиями.

В работе впервые с использованием нитроксильных парамагнитных зондов показано, что под действием катионов происходят двухстадийные перестройки структуры мембран тилакоидов,сопровождаемые изменением доли липидов,иммобилизованных интегральными белками. Показано, что модификация фосфолипидов мембран хлоропластсв грамицидином S, специфически взаимодействующим с ними, призодит к разрушению зон иммобилизованных липидов. Это дает основание считать, что эти зоны состоят преимущественно из фосфолипидов, находящихся в мембранах тилакоидов хлоропла-стов.

Показано, что действие эффекторов, нарушающих белок-ли-пидные взаимодействия, одновременно приводит к нарушениям межмембранных, контактов и ультраструктуры тилакоидов. Возникновение и исчезновение вокруг' интегральных белков фотосинте-зирующей мембраны зоны иммобилизованных отрицательно заряженных липидов является функционально значимым. Изменение доли иммобилизованных интегральными белками липидов происходит при экранировании отрицательных зарядов на белках катионами и сопровождается существенными изменениями в распределении энергии между пигмент-белковыми комплексами фотосинтезирующей мембраны.

Впервые в сравнительном плане проведены с помощью метода электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) детальные исследования связывания гидрофобных лигандов, моделирующих ацильные цепи липидов мембраны с изолированным фрагментом АТФ-синтета-зы хлоропластов. Обнаружено, что CF^ специфически и с большими константами сродства связывается с гидрофобными лигандами, которые,заполняя центры связывания, существенно уменьшают его активность. Параметры связывания различаются у различных форм фермента и коррелируют с его вторичной структурой. Это позволяет сделать вывод, что активность CF может регулироваться его взаимодействием с гидрофобными компонентами мембран тилакоидов и, в частности, с липидами этих мембран in situ .

Практическая значимость работы. Полученная информация

- 3 -

может представлять интерес для исследователей, работающих в области изучения молекулярных механизмов фотосинтеза,и вносит определенный вклад в понимание молекулярных механизмов регуляции энергопреобразующих процессов в хлоропластах высших растений.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на I Биофизическом съезде (Москва, 1983), VII Республиканской конференции молодых ученых-химиков (Таллинн, 1985), симпозиуме "Инструментальные методы исследования в физиологии и биохимии" (Ленинград,1985), школе-симпозиуме "Магнитная радиоспектроскопия в биологии и медицине" (Одесса,"1986), на III Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1988), Всесоюзной конференции "Первичные процессы фотосинтеза и механизмы их регуляции" (Ужгород, 1988), на конференциях молодых ученых Казанского института биологии КФАН СССР (1985, 1988), на-отчетных научных конференциях Казанского института биологии КФАН СССР (1985-1990).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в И опубликованных работах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов. Работа содержит 21 рисунок, 2 таблицы и 18 фотографий; Список литературы состоит из 221 наименования, из них 67 - на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объектом исследования служили хлоропласта и изолированный сопрягающий фактор АТФ-синтетазы хлоропластов, полученные из листьев двухнедельных проростков гороха сортов "Ранний-301" и "Неосыпающийся", выращиваемых в водной культуре.

Методы. Хлоропласты извлекали по методу, описанному Гав-риленко и др. (1975). В работе использовались хлоропласты,за-мороженныё при температуре жидкого азота в присутствии 30%-ного глицерина, что позволило производить целые серии экспериментов на идентичных образцах. Выделение сопрягающего фак-

- 4 -

гора CF осуществляли хлороформным методом CYounis et al. , 19773. Очистку белка проводили методом гельпроникающей хроматографии на сефадексе G-200. Чистоту фермента определяли по отношению интенсивности флуоресценции при 305/350 нм CZhest-kova and Molotkovskii, 1981) на флуориметре MPF-44B Perkin Elmer (США).

Катионная индукция флуоресценции наблюдалась при комнатной температуре на спектрофлуориметре MPF-44B на длине волны 686 нм и возбуждении при \=420 нм. Изучение спектров низкотемпературной флуоресценции происходило при температуре жидкого азота.

Состояние липидной фазы тилакоидов исследовалось методом ЭПР на спектрометре РЭ-1306 с использованием б качестве гидрофобных парамагнитных зондов нитроксильных производных гидрофобных соединений. Параметр порядка S характеризует степень упорядоченности липидов в бислсе, параметр полярности Р определяет доступность для молекул воды места, где локализован нитроксильный фрагмент зонда в липидном бислсе. Эти параметры определялись из ЭПР-спектров нитроксильных парамагнитных зондов согласно Hubbel and McConnel С1971). Параметр tg ß характеризует локальную концентрацию зондов в мембране. Он определялся по методу, описанному Дергуновым и др. С1982). Изучение рекомбинации индуцированных УФ свободных радикалов проводилось согласно Львову С1967). который связывает количественные характеристики этой рекомбинации с характеристиками вторичной структуры изучаемых белков. Исследование вторичной структуры изолированного фрагмента АТФ-синтетазы проводилось по методу, описанному Львовым и др. С1978).

Изменение ультраструктуры хлоропластов после соответствующей обработки и фиксации 2,5%-ным глутаровым альдегидом наблюдали на электронном микроскопе ЭМ-200.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение связывания катионов с мембранами тилакоидов хлоропластов

Данные по связыванию парамагнитных ионов Мп^х с тилакои-дами представлены на рис.1 в координатах Клоотца. Из приведенных кривых связывания следует, что существует два типа

- 5 - '

0.2 0.4 I/C своб.-Ю4, M""1

Рис. 1. Кривая связывания Мп2+ с тилакоидами в координатах Клоотца:

I - контроль; II - в присутствии 1,5"Ю-4 М карбодиимида; III - 1,3-10"% грамицидина S; IV - 1,6'10_6М полилизина. Для I: С сильн.=2,0'10"4 М/мг хл., К сильн.=4,0'103 М-1;

С слаб. =8,2' 10~4 М/мг хл. , К слаб. =2,4' 102 М-1. Для II: С сильн.=1,2'10"4 М/мг хл., К сильн. =4,7' 1Ö3 М-1;

С слаб.=3,0'10~4 М/мг хл. , К слаб.=2,0' 102 М-1. Для III: С сильн.=2,0'10~4 М/мг хл., К сильн. =4,0'103 М-1;

С слаб.=8,0"10~4 М/мг хл. , К слаб. =2,4' 102 М-1. Для IV: С сильн.-0,9'Ю-4 М/мг хл., К сильн.=4,0'103 М-1. Концентрация хлоропластов 2,4 мг хл./мл, pH 7,8, t=26°C.

- 6 -

связывания двухвалентных ионов, отличающихся константами связывания. Центры сильного сродства с константой связывания порядка А'103 М-1 имеют концентрации 2'М/мг хлорофилла.Ти-лакоиды содержат также центры более низкого сродства, концентрация которых достигает 8,2"10"^ М/мг хлорофилла, а константа связывания 2,4'10^ Для выяснения природы этих центров была проведена обработка мембран водорастворимым производным карбодиимида - 1-этил 3-СЗ-диыетиламинопропил)карбодиимид,который взаимодействует с отрицательно .заряженными карбоксильными группами белков. Получасовая инкубация тилакоидов в растворе, содержащем 1,5"10"^ М этого соединения, приводила к значительному уменьшении количества центров связывания без существенного изменения константы связывания этих центров. Дальнейшее увеличение концентрации до 4 мМ приводило к почти полному прекращению связывания с тилакоидами. Это позволяет подтвердить,что центрами связывания двухвалентных катионов являются прежде всего карбоксильные" группы белков независимо от степени их сродства с катионами.

К сходному эффекту приводит связывание с тилакоидами органического поликатиона - полилизина. Полилизин, связывание которогст определяется зарядными взаимодействиями уже в концентрации 1,б-10~® М С Ю-4 мономера), в значительной степени уменьшал количество доступных для Мп^+ центров связывания Срис.13. При концентрации полилизина 5"10~® М связывание Мп^+ с мембранами тилакоидов практически не происходило. Это, вероятно, было следствием изменения заряда мембран в примемб-ранном слое,который становился недоступным для катионов Мп^+.

Результаты электронно-микроскопических исследований показали, что процесс гранообразования и стекинга гран завершается при концентрации 1-2 мМ Мп^+. При этом, как следует из приведенных выше данных по связыванию катионов, происходит почти полное С 8550 заполнение центров сильного сродства и лишь 15У. центров слабого сродства. Очевидно, что заполнение первых центров определяет процесс гранообразования. Почти полное экранирование отрицательно заряженных карбоксильных групп положительными группами лизина не приводит к образованию гран и стекингу тилакоидов. Более того, полилизин вытесняет катионы из мест связывания и разрушает структуру тилако-

идов, образовавшуюся при предварительном внесении катионов. К аналогичному эффекту приводит и изменение рН среды инкубации до 4,5. При таком рН заряд на карбоксильных группах отсутствует. Следовательно, гранообразование тилакоидов не может быть объяснено лишь экранированием отрицательных зарядов карбоксильных групп белков катионами и чисто зарядными взаимодействиями между различными белками тилакоидной мембраны. Интерес представляют изменения, происходящие в липидной фазе, суть которых проясняют приведенные ниже данные экспериментов с другим органическим поликатионом - грамицидином 5.

2. Перестройка липидной фазы мембран тилакоидов под действием катионов

Как показано в работе Молотковского и др. С1983), введение катионов в среду суспендирования деионизованных хлоропластов в широком диапазоне концентраций является эффективным экспериментальным приемом, позволяющим вызвать существенное, обратимое изменение их структуры. Использование этого приема дало нам возможность изучить и перестройки, происходящие в липидной фазе тилакоидов. На рис. 2-представлены данные, характеризующие степень изменения упорядоченности липидной фазь мембран тилакоидов в широком интервале физиологических температур при внесении в среду суспендирования катионов. При эток происходит значительное увеличение упорядоченности липидной фазы, по нашим данным соответствующее перестройкам, вызваннык уменьшением температуры на 15-20°С. Аналогичный эффект наблюдается при действии других катионов, в частности, одновалентных. Влияние катионов на липиды мембран может быть опосредовано их действием на мембранные белки, приводящим к измененик белок-липидных взаимодействий.

Представления о возможной роли этих взаимодействий подкрепляются оценкой параметра полярности Р в локусе мембраны, находящемся на границе доступной для воды части липидов и образуемом их ацильными цепями гидрофобного слоя. В отличие ог монотонно меняющегося параметра порядка, величина Р меняете: немонотонно при возрастании концентрации катионов Срис.3) Изменение Полярности среды в окружении зонда можно объяснит: сменой липидного состава вокруг него. Существенно, что в диа пазоне концентраций, соответствующих немонотонным изменениям

- 8 -

0.65-

0.60-

"5 ' ' ' ' ¿0 ' Конц." MnÖI2't мМ Рис. 2. Зависимость параметра порядка S зонда 1 в мембранах тилакоидов от концентрации MnClg при различных температурах:

I - 26°С; II - 30°С; III - 37°С. Среда инкубации содержала 0,2 М сахарозы, 10 мМ трис- HCl, pH 7,8. Концентрация хлоропластов 1,3 мг хл./мл Р

III

1.00

0.95.

Рис. 3. Зависимость параметра полярности Р зонда 1 в"- мембранах тилакоидов от концентрации MnClg при различных температурах: I - 26°С; II - 30°С; III - 37°С. Среда инкубации содержала 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-НС1, pH 7,6. Концентрация хлоропластов 1,5 мг хл./мл

- 9 -

происходит формирование гран тилакоидов.' Вытеснение зонда из мест стекинга, -где доступность для воды гораздо ниже, на боковую поверхность гран и в тилакоиды стромы, может приводить к увеличению наблюдаемых значений параметра полярности, при концентрации катионов, превышающей 2-3 мМ.

Двухстадийные изменения параметра полярности Р дополняют данные по изменению локальной концентрации зондов, находящихся в липидной фазе мембран. На рис.4 приведены данные, характеризующие зависимость локальной концентрации зондов 1 и 2 от концентрации Мп^+. Оценка локальной концентрации зондов дает представление о гетерогенности липидной фазы. Известно, что жирнокислотные1 спиновые зонды не встраиваются в зоны пограничных с белками липидов СЬепаг, 1977). Эти липиды, участвующие в белок-липидных взаимодействиях, ведут себя отлично от остальных и не проявляют свойств бислоя. Поэтому увеличение локальной концентрации зонда 1 при росте концентрации катионов связано с уменьшением доступной для них части бислоя и ростом зон липидов, иммобилизованных интегральными белками. При увеличении концентрации Мп^+ свыше 2 мМ происходит разрушение этих зон и увеличение доли липидов,'доступных для нит-роксильного зонда.

Природу участвующих в белок-липидных взаимодействиях липидов проясняют эксперименты с гекапептидом - грамицидином Б. Он взаимодействует с отрицательно заряженными липидами мембран, в тилакоидах - преимущественно с фосфолипидами. Кривая связывания для катионов Мп^+ в присутствии грамицидина Б практически не отличается от контрольной Срис.1). Грамицидин Б не конкурирует с катионами Мп^+ за центры связывания, не приводит- к вытеснению связанного Известно, что грамицидин 5 обладает способностью образовывать комплексы с фосфолипидами и нарушает белок-липидное взаимодействие за счет ослабления связи пограничных фосфолипидов с белками СОстровский и др. ,'1976).

Данные по действию грамицидина Б на величину ¿д /3, которая, как показано ранее, характеризует локальную концентрацию зондов в мембранах тилакоидов, приведены на рис.5. Первоначальное увеличение доступной для зондов доли липидов можно объяснить конкуренцией грамицидина Б за фосфолипиды, находя- 10 -

)

Рис. 4. Зависимость величины 1д /3 зондов 1 и 2 в мембранах тилакоидов от концентрации МпС^. Среда инкубации содержала 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-НС1, рН 7,6. Концентрация хлоропластов 1,5 мг хл./мл

Рис. 5. Зависимость величины параметра 1д /3 зондов 1 и 2 в

мембранах тилакоидов от концентрации грамицидина Среда инкубации содержала 0,2 М сахарозы, 2 мМ МпС^, ЮмМ трис-НС1, рН 7,6. Концентрация хлоропластов 1,2 мг хл./мл

- И -

щиеся в пограничных с интегральными белками мембраны областях. Для мембран тилакоидов, как показано в нашей лаборатории (Барышева и др., 19833, концентрация грамицидина 3 меньше 0,1 мкМ/мг хлорофилла действует аналогично ингибитору переноса энергии. При возрастании концентрации антибиотика более заметно выступает разобщающий эффект и эффект ингибирования нециклического транспорта электронов. Нами показано, что этот диапазон концентраций примерно соответствует области изменения параметра 1д /3, в которой грамицидин Б разрушает прибел-ковую зону фосфолипидов. Дальнейшее увеличение концентрации грамицидина Б может приводить, в силу наличия на нем гидрофобного кольца, к связыванию с ним дополнительных порций ли-пидов за счет гидрофобных взаимодействий. При этом могут возникать зоны, недоступные для зонда в сеязи с "замораживанием" этих липидов ССимакова и др., 19793. Эти представления подтверждаются экспериментами, демонстрирующими, что последовательность внесения в среду суспендирования грамицидина Б и катионов влияет на параметр порядка спиноеых зондов в мембранах тилакоидов хлоропластов.

Действительно,- предварительное внесение грамицидина Б в среду инкубации обессоленных хлоропластов порождает конкурентное взаимодействие этого полипептида с интегральными белками за заряженные липиды. Оно не позволяет им участвовать во взаимодействии с белками тилакоидов прм внесении катионов. Напротив, предварительное внесение катионов приводит к иммобилизации заряженных липидов белками тилакоидов и затрудняет их связывание грамицидином 8 в небольших концентрациях. Электронно-микроскопические исследования показали, что некоммутативность действия катионов и грамицидина Б проявляется не только на состоянии липидов мембран, но и на изменении структуры тилакоидов, образовании контактов между гранами.

3. Роль липидной фазы во взаимодействии пигмент-белковых комплексов хлоропластов

Проведенные эксперименты по быстрому внесению в

среду суспендирования тилакоидов выявили очень быструю динамику связывания Срис.63. Этот процесс происходит за время, меньшее 1-2 сек. После быстрого связывания Мп^х в течение длительного времени происходит нарастание катионной индук-

- 12 -

А, огн.ед.

• • • • сл мМ МпСЗ^

« « ......4

2 мм мпС12 «

• • • • » » ф я * т • • •

*

0.5 « « • ••• • . « « мМ 1ЛпС12

60 120 *,сек.

Рис. 6. Зависимость амплитуды сигнала ЭПР ионов Мп^+, не

связанных с тилакоидами, от времени. Концентрация хлоропластов 1,2 мг хл./мл

Рис. 7. Кинетика увеличения выхода флуоресценции С686 нм)

хлоропластов при добавлении в среду 2 мМ МпС^-Среда инкубации содержала 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-НС1, рН 7,6. Концентрация хлоропластов 12,5 мкг хл./мл

- 13 -

ции флуоресценции Срис.7). Это свидетельствует о перестройках, происходящих в мембранной фазе тилакоидов, которая, в силу ее еысокой вязкости, характеризуется малыми скоростями. Показано, что изменения выхода флуоресценции прежде всего определяются латеральным перераспределением пигмент-белкового комплекса (Braun and Malkin, 1991).

Приведенная на рис.8 зависимость амплитуды флуоресценции от концентрации MnClg хорошо сопоставима с предыдущими данными по связыванию катионов и изменениями, происходящими под их действием в липидной фазе. Заполнение центров сильного сродства катионами и возникновение вокруг интегральных белков, в том числе, вероятно, -и светособирающего комплекса, зон иммобилизованных липидов совпадают с ростом катионной индукции флуоресценции, формированием новых пропорций в распределении энергии между ФС I и ФС II Срис.9), что хорошо видно из низкотемпературных спектров флуоресценции.

F73C/F683 тога:

I.I

1.5

1.3

I——3-£

II

I

Конц. MnCI2lMM

I 3 5

Конц. МпС1р,мМ

Рис. 8. Действие различных концентраций МпС].^ на выход флуоресценции хлорофилла .

Действие различных Рис.9. Действие различных •раций МпС^ на вы- концентраций МпС^на отно-■оресценции хлоро- шение амплитуд низкотемпе-

ратурной флуоресценции тилакоидов С77°Ю на длинах волн 730 и 683 нм.

I - контроль; II - 4 мкМ грамицидина S Концентрация хлорофилла 30 мкг хл. /мл

Эти представления подтверждаются влиянием на эффект "катионной индукции" флуоресценции и сцектры низкотемпературной флуоресценции модификатора заряженных липидов грамицидина На рис.8 показано его влияние на катионную индукцию флуоресценции. Грамицидин Б в определенных концентрациях сам может незначительно повышать выход-флуоресценции. Однако, величина изменений несравненно меньше, чем при действии катионов. Внесенный ранее Мп грамицидин Б ингибирует изменения флуоресценции, вызванной катионами СЗаботин, Кулаков, 1978). Грамицидин Б приостанавливает их даже тогда, когда эти изменения уже происходят под влиянием внесенных в среду катионов. При этом, как видно из рис.9, разрушение грамицидином 5 зоны иммобилизованных белками липидов приводит к существенному изменению отношения 17зо/1в8з в спектрах низкотемпературной флуоресценции и возвращению этого параметра к уровню, существующему в обессоленных хлоропластах.

Грамицидин 8, разрушая зоны иммобилизованных интегральными белками липидов, способен существенно изменить распределение энергии между пигмент-белковыми комплексами фотосинте-зирующей мембраны, то есть регуляторный механизм распределения энергии между фотосистемами опосредован состоянием фосфо-липидов и их взаимодействием с белками.

4. Исследование взаимодействия гидрофобных лигандов с изолированным сопрягающим комплексом АТФ-синтетазы хлоропластов В настоящее время развиваются представления о том, что АТФ-синтетазный комплекс мембран хлоропластов чувст-

вителен к липидному окружению. Для определения характеристик связывания гидрофобных лигандов с СГ1 было изучено взаимодействие фермента с нитроксильными парамагнитными зондами различной природы. Структурные формулы этих зондов представлены на рис. 10 вместе с кривыми связывания этих зондов с СГ] в координатах Клоотца. Независимо от длины и насыщенности углеводородной цепи, наличия карбоксильных или гидроксильных групп, все использовавшиеся зонды подвергаются кооперативному связыванию Стабл.1). Увеличение концентрации зонда приводило к заполнению примерно б центров связывания, отличающихся невысоким сродством к парамагнитным аналогам активаторов и слабой

- 15 -

он

N-O- О

/—с=с—с=с—с=с—с=с—с=с

<3-с^с—С==С—С=С—CSI

\

-о' 4

N--0'

/—\

/

I/O связ.'Ю6, М-1 2 5

0.7

0.5

0.3

0.3

—I—

0.5

I/C своб.'Ю6, М-1

Рис. 10. Связывание зондов различной природы' С1-5) с латентным CFj.

Среда инкубации содержала 5 мМ трис-HCl, pH 8,0. Концентрация белка 0,5 мг/мл

зависимостью константы связывания от гидрофобности зондов.

Таблица 1

Параметры связывания различных зондов с CFt

N зонда I II III IV V

Количество мест

связывания зон-

дов с СГ 6-7 6 7 6 6-8

Константа связывания зондов с С?1 2,4"105 3,0'104 2,0'105 1,6'105 0,5"105

Кривые связывания соответствующих зондов отражены на рис,10. Среда инкубации содержала 5 мМ трис-HCl, pH 8,0. Концентрация белка 0,5 мг/мл.

В таблице 2 представлены результаты,характеризующие связывание изолированным сопрягающим комплексом зонда 1 в присутствии в среде нуклеотидов, являющихся субстратом и продуктом фермента - АТФ и АДФ. Связывание с этими нуклеотидами можно рассматривать, как имитацию определенных стадий ферментативного катализа. Если внесение АТФ в среду инкубации белка, находящегося в латентном состоянии, не вызывает существенных изменений характера связывания, то в присутствии АДФ константы связывания белка с парамагнитными аналогами гидрофобных активаторов значительно увеличиваются, хотя количество центров связывания остается неизменным Срис.ИЗ.

В таблице 2 представлены данные по связыванию латентного, термоактивированного и бутанолактивированного СГ1. Характер связывания с гидрофобными зондами СГ>, активированного 0,4 М раствором бутанола, который, как известно, восстанавливает Мд-АТФазную активность СБарышева, 1989), существенно отличается от связывания с латентной формой белка Срис. 123. Кривая связывания нелинейна в координатах Клоотца. Анализ

- 17 -

1/С связ.'Ю6, М"

1.0-

0.5

СР СР+АТФ СГ+ЛДФ

0.5 1/С своб.'Ю6, М

Рис. И. Влияние нуклеотидов на связывание зонда 1с СГ . Концентрация вносишх нуклеотидов 10 мМ АДФ и АТФ. Среда инкубации содержала 5 мМ трис-НС1, рН 8,0. Концентрация белка 0,3 мг/мл

Таблица 2

Действие нуклеотидов и активации на кинетику рекомбинации свободных радикалов, индуцированных'УФ облучением в , и параметры связывания СГ] с зондом 1

СР 1 С? +АТФ 1 СТ^ +АДФ СР +Т° 1 СР1+бут.

1оля медленно зекомбинирую-дох свободных эадикалов (%) 11,9 12,4 15,9 10,5 9,8

Соличество <ест связыва-шя СМ/Ю 5.4 6,3 6,0 6,2 6,4

Сонстанта связывания ,"105 М-1) 2,0 2.2 4,4 5,2 8,3

Среда инкубации содержала 5 мМ трис-НС1, рН 8,0. Концентрация белка 0,3 мг/мл. Концентрация вносимых нуклеотидов 10 яМ АДФ и АТФ. Температура отжига 1=-6°С.

1анных по отрицательной и положительной кооперативности при степени насыщения от 10 до 90%, проведённый согласно Диксон, Лэбб С1982), позволяет получить для связывания с бутанолакти-зированным СГ гидрофобного лиганда значение коэффициента {илла, равнее 2. Аналогичными свойствами обладает и термоак-гивированная форма С^. Значения коэффициента Хилла для этой рормы белка - 1,4. В латентной же форме кривая связывания характеризуется незначительной нелинейностью, чему соответствует коэффициент Хилла, близкий к 1. Данные свидетельствуют,» ето именно активация белка приводит к возникновению положительной кооперативности при связывании молекул гидрофобных тагандов.

Исследования связывания гидрофобных лигандов были допол-

- 19 -

I/C связ.'Ю6, М-1

0.5

---1-----

I/O своб.'Ю6, М-1

Рис. 12. Связывание латентного (I), активированного 5-минутным нагреванием CID и 0,4 М бутанола С IIID CFi хлоропластов с зондом 1. Среда инкубации содержала 5 мМ трис-HCl, pH 8,0. Концентрация белка 0,3 мг/мл

ены экспериментами, которые отражает изменения вторичной труктуры С!^ . Результаты представлены'в таблице 2. Внесение среду инкубации фермента АТФ не меняет ни констант связыва-ия, ни долю быстро рекомбинирующих свободных радикалов, ко-орые соответствуют, по мнению Львова С1967), величине а-спи-альности белка. Активация СГ[ бутанолом, а также термоакти-ация фермента не только значительно меняет характеристики вязьюания зонда 1, что обсуждалось выше, но и приводит к из-енению доли медленно рекомбинирующих- свободных радикалов,что бъясняется увеличением а-спиральности. Присутствие АДФ, на-ротив, приводит к уменьшению а-спиральности фермента. Приве-енные в таблице 2 данные можно рассматривать как свидетель-тво о наличии корреляции между изменением вторичной структу-ы белка и параметрами связывания нитроксильных гидрофобных игандов.

5. Обсуждение

Рядом исследователей развивается идея о так называемых генерализованных" структурных перестройках различных мемб-анных систем клетки как кооперативных систем СКонев, 19753. 'акты, приведенные Иванченко С19743, а также Гольдфельдом и ;р. С19803, которые широко используют спиновые зонды и метки, •оворят в пользу того, что мембраны тилакоидов в этом отноше-[ии не отличаются от других клеточных мембран. В связи с этим :уществует представление о различных состояниях мембран хло->опластов. Одно из них определяется отсутствием межмембранных ¡заимодействий, когда тилакоиды не состыкованы, частицы комп-гексов ССК, ФС I, ФС II, АТФ-синтетазы равномерно распределе-1Ы по мембране. Хлоропласты в этом случае характеризуются шзким выходом флуоресценции и транспортом электронов, а также шзкой активностью фотофосфорилирования. Такое состояние наб-подается экспериментально в бессолевой среде. В высокосолевой :реде тилакоиды упакованы в граны, частицы комплекса ССК и ФС [I образуют олигомеры. Выход флуоресценции и транспорт элект-зонов в этой ситуации высок, так же как и активность фотофосфорилирования. При этом происходит латеральное разделение гагмент-белковых комплексов тилакоидной мембраны.

Нами впервые с помощью гидрофобных парамагнитных зондов : использованием метода ЭПР показано, что переход из состоя- 21 -

нця 1 в состояние 2 сопровождается двухстадийными перестрой ками липидной фазы тилакоидов. Эксперименты, проведенные с специфически взаимодействующим с фосфолипидами грамицидино S, демонстрируют, что заполнение центров высокого сродств двухвалентными катионами при достижении ими концентрации 1мМ приводит к увеличению доли фосфолипидов, взаимодействующи с интегральными белками. Одновременно в этом диапазоне конце нтраций, как показывают данные электронной микроскопии, про исходит процесс гранообразования и стекинг тилакоидов в гра иы.

Сопоставление приведенных выше данных о влиянии анесте тиков и грамицидина S на ультраструктуру хлоропластов и липи дную фазу мембран в присутствии катионов позволяет считать что роль белок-липидных взаимодействий в организации и функ ционировании фотосинтезирующей мембраны существенна. В нерву очередь обработка анестетиками и грамицидином S вызывает раз рушение зон липидов, иммобилизованных белками мембран. Рас рушение этих зон сопровождается исчезновением ультраструктур хлоропластов, характерной для состояния 2. Исследования флус ресценции продемонстрировали, что образование и исчезновени иммобилизованных интегральными белками зон пограничных липе дов приводит к существенному изменению в характере передав энергии между ССК, ФС I и ФС II. Белок-липидные взаимодейст вия, по-видимому, в большой степени определяют характер ко* тактов между пигмент-белковыми комплексами мембран.

Наряду с исследованиями количественно преобладающего тилакоидной мембране светособирающего комплекса, который моа но рассматривать в контексте данной работы как некий маркер ный белок, демонстрирующий чувствительность к изменениям.прс исходящим под действием катионов в липидной фазе тилакоидо! были проведены исследования другого функционально важного 6t лка тилакоидов - СГ;.Поскольку для многих АТФаз, как уже упс миналось выше, характерна зависимость активности от липидно1 окружения, данные,полученные нами о его перестройках при сш цифическом связывании парамагнитных аналогов активаторо: представляются естественными. Эксперименты по связыванию CI гидрофобных парамагнитных зондов показывают, что характерис тики связывания чувствительны к различным состояниям белкг

- 22 -

как латентного, так и термо- и бутанолактивирсванного. Они зависят от наличия в среде суспендирования АТФ и АДФ. 3 то же время связывание с гидрофобными лигандами существенно отражается на конформации этого фермента, то есть способно, как нам кажется, менять его вторичную структуру. Эти данные демонстрируют принципиальную возможность прямого влияния перестроек в липидной фазе, наблюдавшихся в описанных выше экспериментах, на сопрягающий фактор СГ .

Энергизация мембран тилакоидов при освещении сопровождается увеличением концентрации двухвалентных катионов во вне-тилакоиднсм пространстве на 1-2 ыН, что примерно соответствует диапазону, в котором нами наблюдались структурные перестройки липидной фазы, и весьма вероятно, что СГ наряду с другими белками тилакоидной мембраны, в частности, как показано нами, светособирающим комплексом, является чувствительным к ним.

ВЫВОДЫ

1. Индуцированные катионами изменения структуры хлоропластов сопровождаются:

а) двухстадийной перестройкой структуры мембран тилакоидов;

6} монотонным увеличением упорядоченности липидной фазы мембран;

в) немонотонным изменением полярности в окружении встроенных в мембрану нитроксильных зондов и их локальной концентрации.

2. Модификация мембран циклическим полипептидом грамицидином 8, взаимодействующим с отрицательно заряженными липида-ми, приводит к прекращению структурных перестроек в мембране.

3. Характер структурных перестроек, индуцированных катионами и грамицидином Б, зависит от последовательности их внесения в суспензию мембран.

4. Наблюдаемые структурные перестройки сопровождаются изменением степени иммобилизации заряженных липидов интегральными белками, их латеральным перераспределением в мембране.

5. Регуляторный механизм распределения энергии между фо-

- 23 -

тосистемами опосредован состоянием фосфолипидов и их взаимо действием с белками.

6. Связывание гидрофобных аналогов активаторов с изоли рованкым каталитическим комплексом АТФ-синтетазы хлоропласто имеет специфический характер.

7. Параметры и количество мест связывания существенн отличаются у латентной и активированной форм белка и завися от присутствия в среде инкубации АДФ.

8. Связывание CF с гидрофобными лигандами вызывает из менения его вторичной структуры и является кооперативным про цессом.

9. Эффективность фотофосфорилирования определяется н только сохранением барьерных свойств тилакоидной мембраны, л также взаимодействием фермента АТФ-синтетазы с липидами мемс раны.

10. На основе собственных и литературных данных обсужда ется положение о регуляторной роли белок-липидных взаимоде? ствий в функционировании фотосинтезирующих мембран кг целого.

Список работ по теме диссертации

1. Малах Ю.Е. , Заботин А.И. , Кулаков A.A.,Новоселов Н.I Исследование спиновым зондом катион-индуцированных изменен! интактных мембран тилакоидов хлоропластов//В сб.:- Некотор1 характеристики мембран и водообмен клеток растений. - Казаш 1982. - С.192-200.

2. Заботин А. И. , Кулаков А.А., Галеева А.3., Новосел< Н. В. , Малах Ю. Е. Исследование белок-липидных взаимодействий связи с организацией и функционированием фотосистем хлор< пластов//1 Всес. биофиз. съезд. Тезисы докладов стендовых с< общений. -Москва, 1982. - Т.1. -С.345.

3. Кулаков A.A., Заботин А.И., Малах Ю.Е..Новоселов Н.] Взаимодействие катионов с липопротеиновыми комплексами фот-систем хлоропластов//Там же. - С.345.

4. Малах Ю. Е. Изучение взаимодействия парамагнитных ги, рофобных лигандов с АТФ-синтетазой//В сб.:Тезисы докладов V Респ. конф. мол. ученых-химиков. - Таллинн, 1987,- Ч. 1.- С.

5. Барышева Т.С., Малах Ю. Е. .Мухтарова Л. Ш. .Заботин А.

- 24 -

)собенности действия гидрофобных модификаторов на Н+-АТФазу слоропластов//Деп. в ВИНИТИ. - 1987. - N 3312 - В87. - 17 с.

6. Малах Ю. Е. Изучение белок-липидных взаимодействий при сатиониндуцированных перестройках тилакоидной мембраны//В сб.• Гезисы докладов III Всес.конф. мол. ученых по физиологии растительной клетки. - Петрозаводск, 1988. - С.64.

7. Заботин А. И. , Халабуда Л. Н. , Малах Ю.Е. Перераспреде-тение энергии между фотосистемами опосредовано белок-липидны-€1 взаимодействиями//В сб. тезисов докладов: Структурная ди-1амика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов. - Минск, 1988. - С. 53.

8. Малах Ю. Е. , Заботин А. И., Халабуда Л. Н. Характеристи-са состояния липидов и их взаимодействий с белками тилакоид-шх мембран при структурных перестройках//Там же. - С.83.

9. Малах Ю. Е. Перестройка липидной фазы мембран тилакоидов под действием катионов//Деп. в ВИНИТИ. - 1990. - N 2227 -390. - 15 с.

10. Малах Ю. Е. , Мухтарова Л. Ш. Исследование взаимодейст-' зия гидрофобных лигандов с изолированным сопрягающим комплексом АТФ-синтетазы хлоропластов//Деп. в ВИНИТИ.- 1991.- N 1524 -В91. - 17 с.

11. Малах Ю. Е. Роль заряженных липидов в структурных пе-эестройках мембран тилакоидов//Деп. в ВИНИТИ. - 1992. - N 99392. - 24 с.

Сдано в набор 22.12.93 г. Подписано в печать 24.12.93 г. Форм.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. I. Тираж 100. Заказ 536.

Лаборатория оперативной полиграфии КПУ 420008 Казань, Ленина, 4/Б