Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионогенных групп белков в структурно-функциональной организации тилакоидных мембран хлоропластов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ионогенных групп белков в структурно-функциональной организации тилакоидных мембран хлоропластов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах ружооиси

УДК: 577.3, 577.355

ОПАНАСЕНКО ВЕРА КОНСТАНТИНОВНА

РОЛЬ ИОНОГЕННЫХ ГРУПП БЕЛКОВ В СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН ХЛОРОПЛАСТОВ.

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

ПУЩИНО - 1996

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики фотосинтеза Института почвоведения н фотосинтеза РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.К. Акименко доктор биологических наук Ю.Е. Ерохин доктор физико-математических наук, профессор А.Н. Тихонов Ведущая организация:

Кафедра биофизики, биологический факультет МГУ.

Защита состоится июня 1996 г. в и часов на

заседании Специализированного Совета Д 200. 29. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (142 292, Пущино, Институт почвоведения и фотосинтеза РАН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Диссертация в форме научного доклада разослана " 2_3_" мая 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биоэнергетики вляется выяснение механизмов протонного сопряжения реакций переноса лекгронов и синтеза АТФ в энергопреобразующих мембранах клеточных ор-шелл - хлоропластов и митохондрий. Трансмембранный перенос ионов водо-ода (протонов) впервые был показан на хлоропластах [Jagendorf and Hind, 963] через 2 года после публикации Митчеллом хемиосмотической гипотезы опряжения [Mitchell, 1961], где постулировалась роль электрохимического по-енциала протонов как главного интермедиата между переносом электронов и интезом АТФ. Альтернативная гипотеза Вильямса появилась в это же время; ней тоже предполагалось, что ионы водорода играют ключевую роль, но со-ряженное с синтезом АТФ движение протонов происходит внутри мембраны Williams, 1961]. Эти две концепции стимулировали проведение большого ко-ичества исследований и быстрый прогресс в области биоэнергетики, однако опросы о путях и механизмах движения протонов до сих пор остаются дис-уссионными [Скулачев, 1970, 1989; Блюменфельд и др., 1977, 1987; Тихонов и р., 1974, 1978, 1986, 1995; Опанасенко и др., 1985, 1987, 1993; Чернавская и [ернавский, 1977; Ягужинский и др., 1984; Dilley et al., 1978, 1987, 1994; De Louchkovsky et al., 1981, 1987; Ferguson, 1985; Haraux, 1985; Kell, 1979; Laasch et L, 1987, 1992, 1994; Pick, 1988; Rottenbeig, 1985, 1990; WesterhoiT et al., 1984].

На фотосинтетических мембранах хлоропластов электрохимический по-гнциал протонов формируется, в основном, в виде концентрационной со-гавляющей - трансмембранного градиента pH, и необходимым условием ре-гения проблем энергетического сопряжения является выяснение характера роцессов взаимодействия протонов с ионогенными группами мембранных елков.

В условиях энергизации хлоропластов активность ионов водорода в одной фазе внутритилакоидного пространства увеличивается в сотни раз Bottenberg et al., 1972], что не может не влиять на степень ионизации и кон-юрмационное состояние белков, контактирующих с люменом. Более того, [ногие ионогенные группы полиферментных комплексов находятся в примем-ранных слоях, где уровень активности протонов постоянно колеблется вслед-твии внешних (освещенность) и внутренних причин: асинхронной работы [+-генераторов ЭТЦ и систем вторичного транспорта ионов. Поэтому именно оногенные группы белков должны принимать непосредственное участие в роцессах, обеспечивающих стабильность и эффективность структурно-функ-иональной организации тилакоидов в условиях энергетического сопряжения, определенных функциональных состояниях возможно существование специ-1ических систем ионогенных групп, образующих пути удаления Н+ как про-укта реакций из зон разложения воды и окисления пластогидрохинона и пе-еноса к АТФ-синтазным комплексам, использующим протоны для синтеза ТФ. Такие системы регистрируются как "мембранные пулы" или "протон-шасающие домены", которые были описаны в работах 1978-1987 групп Дил-и, Хомана, Юнге и Тихонова.

Характеристикой, непосредственно отражающей взаимодействие белков ялакоида с ионами водорода, является зависимость буферной емкости хлоро-ластов от pH реакционной среды. Связь между буферной емкостью хлоропла-гов и процессами энергетического сопряжения была выявлена в работах не-

скольких групп [ Walz et al., 1974; Junge et al., 1979; Опанасенко и др., 1978 1980, 1982, 1993; Тихонов и др., 1985, 1986; Хомутов и др., 1989]. Однако уче электростатических взаимодействий, возможных между ионогенными группа ми отдельных мембранных белков, в белковых комплексах, между белками J липидами мембраны представлялся слишком сложным для адекватного анали за данных, и вопросы об участии ионогенных групп мембраны в процесса трансформации энергии оставались невыяснеными.

В последнее время появились работы лабораторий Болдвина, Шольца ) Мои, в которых были определены энергии образования водородных связе1 между ионогенными группами аминокислотных радикалов специально синте зированных полипептидов [Huyghues-Despointes et al., 1995; Scholtz et al., 1993 Butcher et al., 1995]. Это позволяет сделать важный шаг в анализе данных тит рования биологических объектов - теоретически оценить сдвиг рКЭф ионоген ных групп при образовании водородных связей, стабилизирующих третичнук структуру белка. Выявление групп, участвующих в таких связях, принципиаль но возможно при анализе pH-зависимости буферной емкости белков в раство ре и в составе биологических мембран. Если это действительно так, мы полу чаем уникальный способ экспериментальной оценки количества и коопера тивности Н-связей ионогенных групп в третичной/четвертичной структур* нативных белков и полиферментных комплексов. Проверка этой гипотезы т базе экспериментального материала была одной из задач настоящей работы.

В связи с вышесказанным было выбрано следующее направление исследования тилакоидных мембран: анализ взаимодействия ионов водорода ( растворимыми белками, слабо ассоциированными с мембраной; изучение невезикулярных фрагментов мембран, содержащих комплексы белков ФС 2 i светособирающие комплексы антенны (ССК 2); сравнительное исследование тилакоидов хлоропластов в функциональных состояниях, характеризующихся разными режимами энергетического сопряжения; выяснение действия некоторых факторов, изменяющих состояние ионогенных групп, на структуру ь функции хлоропластов.

Цели настоящей работы состояли в выяснении характера процессот взаимодействия ионов водорода с ионогенными группами белков тилакоидной мембраны в связи с процессами энергетического сопряжения.

Конкретные задачи, определяемые целями исследования.

1. Разработка и применение метода буферной емкости для регистрации и анализа медленных конформационных переходов в белках и биологических мембранах при изменении pH реакционной среды.

2. Исследование процессов взаимодействия ионов водорода с отдельными белками и невезикулярными фрагментами фотосинтетических мембран.

3. Определение и анализ свойств ионогенных групп белков тилакоида в различных функциональных состояниях.

4. Оценка роли внутритилакоидных буферных систем в процессах энергетического сопряжения.

5. Исследование действия агентов, изменяющих состояние карбоксильных групп (ДЦКД и слабых липофильных оснований) на структуру и функции тилакоидных мембран.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было проведено ;равнительное исследование процессов взаимодействия ионов водорода с белами и ферментными комплексами тилакоидной мембраны.

Выявлены общие свойства выделенных белкбв (У-ЗЗ из ФС 2, АТФ-□а), фрагментов мембран и тилакоидов:

• большая часть карбоксильных групп аминокислотных радикалов Асп и

Глу объединена в системы кооперативных водородных связей;

• в области 5-8 рН происходят медленные конформационные переходы,

индуцируемые изменением активности ионов водорода;

• существуют кинетические барьеры для взаимодействия ионогенных

групп с ионами водорода реакционной среды.

Показано, что Н-связи в белках могут быть нарушены различными де-1атурирующими воздействиями: закислением реакционной среды, удалением труктурирующих ионов (в частности, марганца, из комплекса разложения во-ы ФС 2) высокими концентрациями одновалентных катионов, модификацией арбоксильных групп ДЦКД или катионами липофильных аминов. Нарушение 1-связей сопровождается различными изменениями структуры и функций ¡ембран.

Обнаружены новые функциональные эффекты: обратимое снижение уферной емкости с выделением ионов водорода при разделении зарядов в ФС на гранальной фракции мембран и активация системы транспорта калия и ммонийных катионов при ДЦКД-обработке хлоропластов.

Найдены два вида изменений ультраструктуры хлоропластов, отличные г осмотического набухания. Сделан вывод о том, что оба новых вида измене-ий ультраструктуры - высокоамплитудное гетерогенное набухание тилакоидов присутствии 9-аминоакридина или нейтрального красного и образование ежтилакоидных анастомозов в присутствии локальных анестетиков дибукаи-а и тетракаина - обусловлены нарушением латеральных и межмембранных яектростатических взаимодействий ионогенных групп, расположенных на яутренней поверхности тилакоидных мембран.

Предложена модель латерального и трансмембранного режимов сопря-ения, базирующаяся на том, что буферная система, обладающая гистерезис-ыми свойствами, может участвовать в векторном переносе протонов и совер-ать полезную работу в процессе синтеза АТФ.

Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что ротонная регуляция процессов энергетического сопряжения осуществляется, основном, на уровне Н-связей с участием карбоксильных групп белков внут-шней стороны тилакоидной мембраны.

Практическое значение работы. Полученные в работе результаты вно-гг вклад в понимание механизмов структурной и функциональной организа-ш отдельных ферментов и клеточных органелл.

В тилакоидных мембранах хлоропластов выявлен новый уровень регу-щии процессов энергетического сопряжения, существование которого ранее ; учитывалось при исследовании и моделировании механизмов трансформа-ш энергии.

Метод буферной емкости, разработанный для комплексного исследова-1Я полиамфолитов, применяется в нескольких лабораториях ИПФС (в четы-

рех лабораториях созданы автоматизированные установки). Предложенный I работе способ оценки количества и кооперативности Н-связей с участием ио-ногенных групп, основанный на определении и анализе рН-зависимости буферной емкости белков и биологических мембран, может найти широкое применение в белковой химии и биоэнергетике, поскольку он является пока единственным методом, обеспечивающим получение такой информации для сложных биологических объектов.

Новые виды изменений ультраструктуры хлоропластов, обнаруженные в настоящей работе, показывают удивительную отзывчивость биомембран на воздействия, нарушающие водородные связи и электростатические взаимодействия между ионогенными группами. Это новое явление, значимость которого для биохимии, биофизики и физиологии органелл пока трудно оценить.

Сходство структурно-функциональной организации энергопреобразу! щих мембран хлоропластов, митохондрий и бактериальных клеток позволя предполагать, что закономерности, обнаруженные при исследовании тилако: дов, отражают общие принципы регуляции процессов энергетического сопряж ния.

Апробапия работы. Основные результаты работы были доложены на всесоюзных и международных симпозиумах, семинарах и съездах, в том числе: на Объединенном симпозиуме биохимических обществ ГДР и СССР (Веймар, 1979), на Симпозиуме "Фотосинтетическая конверсия и запасание солнечной энергии"(Варшава, 1980), на Симпозиуме специалистов стран - членов .СЭВ (Пущино, 1981), на 9-ом Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряжнеия и регуляции" (Пущино, 1981), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986), на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), на Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино, 1989), на Советско-Индийском симпозиуме по регуляции фотосинтеза (Пущино, 1990), на Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология", на Рабочем совещании по фотосинтезу, СССР-США (Пущино, 1992), на 7-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Хельсинки, 1992), на Конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей" (Пущино, 1993), на Рабочем совещании биоэнергетических групп биохимических обществ России и Великобритании (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 50 работ в отечественных и зарубежных изданиях

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Титрование. Для удаления С02 реакционную среду непосредственно перед титрованием продували аргоном при pH 4,0. Затем значение pH раствора доводили до 6 и добавляли концентрированный раствор белка или суспензии мембран, предварительно освобожденный от буфера. После добавления объекта и 5-минутной инкубации доводили pH раствора до верхней границы интервала титрования и начинали титрование кислотой. После достижения нижней границы заданного диапазона pH и автоматической обработки данных включали титрование щелочью.

Расчет теоретической кривой титрования по уравнению Хендерсона-Хассельбаха осуществляли с помощью программы DNASTAR на основе известных аминокислотных последовательностей субъединиц белка или данных аминокислотного анализа, полученных для исследуемых мембран. При расчете использовались следующие величины рК аминокислот: Асп, Глу - 4,4; Цис -8,5; Тир - 10,1; Гис - 6,3; Лиз - 10,0; Apr -12,4; терминальные а-карбоксильная группа и а-аминогруппа - 3,1 и 8,0 соответственно.

В работе использовались ингибиторы, нуклеотиды и детергенты фирм "Sigma" и "Reanal", ионообменные смолы фирмы "Serva" и реактивы отечественного производства марки "хч".

Белок с молекулярной массой 33 кД выделяли из фотохимически активных препаратов ФС 2 шпината по методу Бертольда [Bertold et al., 1981].

CFj получали из листьев шпината по методу Биндера и др., 1978 г. Чистоту изолированного фермента тестировали электрофорезом в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле. Полученный белок дополнительных примесей не содержал. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (1976). Концентрация белка в ячейке объемом 3,5 мл составляла 0,5 мкМ, температура 20 °С, скорость подачи титранта варьировали от 0,12 до 1,5 мкмоль/мин.

Препараты гранальной фракции тилакоидных мембран - субхлоропла-стные препараты Т-20 - выделяли по методу Бертольда в модификации Шути-ловой [¿Путилова и др., 1987).

Хлоропласты гороха выделяли по методам Арнона [Arnon et al., 1954] или Аврона [Avron, 1960]. После 5 мин осмотического шока в дистиллированной воде образцы отмывали и ресуспендировали в среде, содержавшей 0,1 М KCl и 2 мМ MgCl2 (Б-1). Хлоропласты хранили при 0 °С в концентрированном виде и использовали в течение 6-8 часов после выделения. Титрование образцов проводили в такой же реакционной среде при температуре 12 °С и концентрации 0,2 мг СЫ в мл. В этих условиях эксперимента хлоропласты имели скорость фотофосфорилирования с ФМС около 100 мкмоль/мг Chi в час и уровень светоиндуцированного поглощения Н+ 0,6-0,7 мкэкв Н+/мг Chi в отсутствии субстратов фотофосфорилирования при pH 6,5. Кривые титрования и рН£зависимость буферной емкости тилакоидов рассчитывали по стандартной методике, описанной ранее. Б-2 хлоропласты выделяли по методу Аврона, но не подвергали осмотическому шоку. После выделения хлоропласты

ресуспендировали и переосаждали в реакционной среде, содержавшей 0,2 М сахарозу, 10 мМ №С1 и 5 мМ 1^С12-

Суспензию хлоропластов освещали белым светом интенсивностью 250 Вт/м2 при температуре 20 °С в реакционной среде следующего состава: 0,1 М сахароза; 0,2 мМ Тпсте; 0,2 мМ НЕРЕБ; 10 мМ ИаС1; 5 мМ MgCl2; 50 мкМ метилвиологен или феназинметосульфат; при концентрации хлорофилла 15-50 мкг/мл и рН 7,95. Электронный транспорт измеряли полярографически, по поглощению или выделению кислорода. Скорость синтеза АТФ - потенпио-метрически или с помощью люциферин-люциферазного биолюминесцентного метода. Светоиндуцированное поглощение протонов или катионов измеряли потенциометрически, используя соответствующие ион-селективные электроды.

Отбор проб для электронной микроскопии и их фиксацию в 2,5% растворе глутарового альдегида в фосфатном буфере проводили в темноте или на свету, в зависимости от условий эксперимента. Образцы дополнительно фиксировали 1% раствором 0в04 в том же буфере. Дальнейшую подготовку препаратов для просмотра в электронном микроскопе осуществляли по стандартным методикам [Семенова, 1989].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Метод буферной емкости для исследования процессов взаимодействия ионов водорода с ионогеннымн группами белков

Метод кислотно-шелочного титрования дает прямую информацию о состоянии ионогенных групп полиамфолита в данных условиях эксперимента: рН, ионный состав среды, температура - но он практически не применяется для описания физико-химических свойств белков и биомембран, т.к. адекватный анализ данных титрования возможен только для относительно простых биополимеров, содержащих небольшое количество ионогенных групп. Одной из целей нашей работы была разработка метода буферной емкости, расширяющего область применения потенциометрического титрования и обеспечивающего пролучение и интерпретацию данных о взаимодействии ионогенных групп боковых аминокислотных остатков (Я-групп) белка с ионами реакционной среды.

1.1. Методика регистрации и первичной обработки данных

Методика включает следующие элементы, реализованные в специальной автоматизированной установке, созданной на базе микроЭВМ |24|: а) Титрант добавляется в реакционную среду равными порциями через одинаковые интервалы времени. Значение рН среды регистрируется перед добавлением каждой дозы. 5) Зависимость рН среды от количества добавленного титранта (В) преобразуется в зависимость В(рН). В таком же виде представляется кривая титрования среды в отсутствии реагента В„ (рН).

в) В(рН) является суммой двух кривых: протонирования реагента (Ь) и титро-

вания среды - поэтому рН-зависимость протонирования реагента в этих координатах рассчитывается как разность экспериментальных кривых, полученных в двух независимых экспериментах: Ь(рН)=В(рН)- Во(рН).

г) Дифференцирование расчитанной кривой по рН дает зависимость от рН буферной емкости реагента - Р(рН). Эта кривая менее монотонна, чем кривая Ь(рН), что делает возможным анализ данных титрования.

1.2. Анализ и интерпретация данных

Зависимость Р(рН) биополимера может быть представлена в виде "буферного спектра" на шкале рН [4-7, 13], т.е. разложена на пики, соответст-аующие разным типам протонирования/депротонирования ионогенных групп:

р(рН)=1р!(рН)=0,575у|С1[5с111,157,(рН-рК1)]2, где С[ и рК, -концентрация (количество) и рКЭф групп ¡-го типа, у, - параметр кооперативное™ процесса протонирования/дспротонирования 1рупи ¡-го типа.

Значения -/¡>1 указывают на положительную кооперативность процесса - наличие рН-индуцированного конформационного перехода в узком диапазоне рН. Полуширина пика обратно пропорциональна величине у. Узкие пики ^информационных переходов легко идентифицируются на кривых ДНК и ис-кмтнепных полипептидов: поли-Ь-глутаминовой кислоты, поли-1--лизина.

Строгое разложение р(рН) в "буферный спектр" возможно для ДНК и простых реагентов [2, 3. 8, 12, 19, 25]. В нативных белках картина внутримоле-к\лярны\ взаимодействий усложняется и разложение кривой буферной емко-гти теряет однозначность из-за неопределенности числа пиков с близкими

значениями параметров рК[ и -/¡, соответствующих различным взаимодействиям Я-фупп между собой и с главной цепью.

В последнее время все большее внимание уделяется выяснению роли водородных связей между полярными и ионогенными Я-группами в формировании и стабилизации структуры белка. Сделано много работ на специально синтезированных полипептидах, где определены физико-химические характеристики различных Н-связей с участием ионогенных групп. Рассмотрим некоторые литературные данные, которые могут быть основой для полуколичественного описания и интерпретации кривых протонирования и буферной емкости белков. Недавно было показано [Ниу^ие5-Ое$рош1е5 е1 а1., 1995], что на синтезированных полипептидах, составленных из 16-22 аминокислот, полярная Л-группа глугамина образует Н-связь с карбоксильной группой Глу или Асп, если эти аминокислоты находятся в позициях (¡, ¡+4). Такие связи стабилизируют а-еннраль и имеют энергию около -1 ккал/моль карбоксильных групп. Электростатический вклад в энергию этих связей составляет -0.6 ккал, что соответствует смещению рК на 0,3-0,4 ед. рН. Анализ данных этой работы показал, что карбоксильные группы, образующие связи с полярными групиа-ми, имеют значения рК 4,0-4,1, а группы, не участвующие в образовании Н-связей - 4,4-4,5. Оценка величины у - кооперативное™ протонирования даст значения, близкие 1.

Образование Н-связей между ионогенными группами приводит к большему смещению рК взаимодействующих групп. Энергия Н-связей между ка-боксильными группами Асп и Глу составляет 1-2 ккал/моль. Этой же величине близка и энергия связи между К-фуппами глутамата и лизина [БсНоК/ е! а1., 1993|. Поэтому процессы стабилизации (присоединение одного "обобщенного" протона) и лабилизации (присоединение второго прогона) пар ионогенных групп должны изменять рК взаимодействующих групп на 0,7-1,4 сд. Такие смещения рК Гис и Лиз, образующих Н-связь, были зарегистрированы в работе лаборатории Мои [Ви1сИсг с! а!., 1995].

Можно предполагать, что карбоксильные Я-группы мо1уг образовывать ионные пары с имидазольной группой Гис. Если энергия такой связи составляет 1-2 ккал/моль ионогенных групп, то значения рК этих групп тоже будуг смещены примерно на 1.

Данные Табл. 1 показывают, что в диапазоне 3-8 рН два вида ионогенных групп могут дать серию пиков буферной емкости, параметры у которых могут отличаться от 1, если связи кооперативпы, т.е. их образование и диссипация сопряжены с изменением третичной структуры молекулы.

Табл. 1

Влияние образования Н-связей на рК^р ионогенных групп аминокислот белка. (рКо - значение рК в отсутствие взаимодействий)

аминокислоты рК0 рКэф.

Асп 4,4-4,6 3,4-3,6

Глу 5,4-5,6

а-спираль полиглутамата 5,2-5,4 5,5-6,0

Гис 6,3-6,8 7,3-7,8

Зная аминокислотный состав исследуемого белка, всегда можно сопоставить кривые титрования реальной молекулы и гипотетического клубка, в котором отсутствуют все виды взаимодействий, т.е. все рКЭф = рКо, а у = 1. По характеру различий эспериментальной и гипотетической кривой можно судить о наличии в белке Н-связей между ионогенными группами, оценить количество и кооперативность этих связей. Несмотря на полуколичественный характер, такая информация представляет большой интерес с точки зрения задач исследования структры и механизмов функционирования ферментов.

1.3. Кинетические эффекты при титровании белков

Согласно современным представлениям [Р^куп, 1991] формирование третичной структуры нативного белка включает 3 стадии:

I. Образование вторичной структуры, обусловленное взаимодействием каждого аминокислотного остатка с его ближайшими соседями по цепи. Формирование а- и р-регионов происходит в пределах 0,01 сек.

II. Сворачивание белка в промежуточную компактную структуру - флуктуирующую глобулу, сопровождающееся образованием гидрофобного ядра. Этот процесс требует около 1 секунды.

III. Трансформация флуктуирующей глобулы в плотно упакованную структуру нативного белка. Эта стадия самая медленная, она может занимать несколько минут или несколько часов. Функциональная активность ферментов появляется только при завершении этой стадии.

В процессе титрования белка нативная структура может быть нарушена, классическим примером этого служит кислотная денатурация гемоглобина, продемонстрированная Танфордом в 1953 году. Процессы денатурации/ренату-рации обычно достаточно длительны, чтобы вызвать эффект гистерезиса кислотно-щелочного титрования.

Причиной гистерезиса, не обусловленного денатурацией, будут медленные и обратимые изменения конформационного состояния белка, связанные с изменением рКЭф. Эти переходы особенно интересны, т.к. ммуг приводить к изменению функционального состояния фермента. Такой вид гистерезиса был обнаружен при титровании бактериальной гидрогеназы [31).

Другой причиной кинетических эффектов является существование в молекуле белка гидрофильных доменов, содержащих ионогенные группы. Диффузия ионов титранта к этим группам может быть настолько затруднена, 1То существование кинетического барьера вызывает искажение формы кривой титрования при повышении скорости подачи титрантов в реакционную среду.

Таким образом, выявление гистерезиса протонирования/депротониро-вания белка и исследование кинетических эффектов может дать уникальную информацию о рН-зависимых изменениях структуры, связанных с функцией фермента, и о существовании гидрофильных доменов, отделенных от реакционной среды кинетическими барьерами.

В качестве выводов по этому разделу можно сформулировать схему шализа данных титрования, которой мы пользовались в настоящей работе при 1Сследовании белков в растворе и в составе тилакоидной мембраны. Схема включает:

I. Проведение титрования белка в условиях, близких к равновесным, когда кривая протонирования ионогенных групп не зависит от скорости изменения рН в реакционной среде. !. Проверка обратимости титрования, определение областей денатурации.

р 16 12 8

4 -

3. Анализ кривой Р(рН), сопоставление с данными аминокислотного анализа. Разложение кривой в буферный спектр на шкале рН. Оценка количества групп, участвующих в Н-связях. Оценка кооперативности Н-связей разного вида.

4. Выявление и исследование кинетических эффектов протонирова-ния/депротонирования.

2. Сопоставление полученных данных с функциональным состоянием исследуемого объекта. Взаимодействие ионов водорода с белками, слабо ассциированными с тилакоидной мембраной

2.1. Y-33 - водорастворимый белок из ФС 2

Согласно литературным данным, этот белок расположен в непосредственной близости от марганцевого кластера, катализирующего реакцию фотоокисления воды, одним из продуктов которой являются ионы водорода [Seibert

et al., 1985]. Несмотря на то, что необходимость этого белка для сохранения структуры системы разложения воды считается доказанной, его конкретная функция остается неизвестной [Miyao and Murata, 1989; Hang et al., 1990].

По данным аминокислотного анализа [Oh-oka et al., 1986], белок содержит следующие ионизируемые аминокислоты: 14 Асп, 21 Глу, 8 Тир, 25 Лиз и 4 Apr. Наши эксперименты показали, что зависимость буферной емкости белка от рН реакционной среды, рассчитанная по данным титрования кислотой и щелочью от начального рН 7,0 (Рис. 1), представляет собой сумму трех пиков [39].

Как видно из данных Табл. 2, концентрационные параметры пиков А и Б не совпадают с количеством Асп и Глу, но их сумма близка общему содержанию дикарбоновых аминокислот. Следовательно, в каждом из процессов, соответствующих пикам А и Б, происходит связывание Н* с радикалами обеих аминокислот. Пик А имеет положительную кооперативное^ - значит процесс титрования сопровождается изменением конформации белка: эти карбоксильные группы участвуют в стабилизации третичной структуры.

Рис. 1 Буферная емкость бе.ша Y-

33 из ФС2 шпината, (магь/мшь белка/рН). Титрование киаотой и щелочью от рН 7,5

Табл. 2 Раножение кривой при рН < 7 дает параметры двух процессов, соответствующих титрованию карбоксигьных групп.

пик

А Б

рКэф 4,0-4,1 5,6-5,7

У 1,4 0,8-0,85

С, моль/моль белка 18 15

Вероятно, часть карбоксильных групп (пик Б, рКэф 5,6-5,7) участвует в образовании водородных связей вида COO' ..Н+.."ООС, но по данным Рис. 1 мы не можем выявить этот процесс, т.к. он, по-видимому, не кооперативе]! и происходит в области титрования кластеров карбоксильных групп аминокислот, близких по позициям в главной цепи. Однако, проверка обратимости титрования белка показывает наличие кислотно-щелочного гистерезиса именно в этом диапазоне рН. Гистерезис проявляется в наиболее полном виде, если перед началом титрования белок инкубировали не менее 5 мин при рН 7,5. (Рис. 2А).

Инкубация белка при рН < 4 приводит к изменению кривых титрования и исчезновению гистерезиса (Рис. 2В).

Эти данные демонстрируют существование трех конформационных состояний белка, каждое из которых характеризуется собственной схемой водородных связей с участием карбоксильных групп радикалов аминокислот. Переходы между состояниями полностью обратимы и не связаны с разрывом единственной S-S связи в молекуле Рис. 2 На рисунке показаны кри-белка, что было показано по спектру флуо- вые буферной емкости (отн.ед.), ресценции триптофана 241 |39]. расчиташые по данным циклов

Инкубация белка в щелочной среде кислотно-щелочного титрования стабилизирует состояние S(0), в котором белка, преинкубированного 7мин часть карбоксильных групп белка сближена при рН 7,5 (А) или 3,8 (В). так, что при закислении среды эти группы

образуют Н-связи между собой: кривая кислотного титрования на Рис. 2А имеет пик с рКЭф 5,6-5,7. Теперь мы можем сделать этот вывод, т.к. гистерезис не может быть обусловлен первично" постсдовательностью невзаимодействующих групп. При рН ниже 5 белок преходит в состояние S(H), зафиксированное дополнительными взаимодействиями, вероятно, полярных или гидрофобных радикалов. В состоянии S(H) депротонирование части карбоксильных групп затруднено необходимостью нарушения дополнительных взаимодействий (кривая шелочного титрования Рис. 2А). Переходы S(0) <-> S(H) занимают несколько секунд, поэтому кинетику переходов нам исследовать не удалось.

Третье конформационное состояние полипептида, S(A), формируется при инкубации более 5 мин при рН 3,8 (Рис. 2В). В этом состоянии карбоксильные группы не образуют Н-связей между собой: пик с рКЭф 5,7 отсутствует на кривых кислотного и щелочного титрования. Расчет вторичной структуры белка по методу Птицина и Финкельштейна показал, что из четырех а-спира-льных участков, возможных в белке при нейтральных значениях рН, три должны быть нарушены закислением среды до рН < 3 (44].

Переходы S(H) -» S(A) и S(A) -> S(0) требуют продолжительной инкубации при кислых и щелочных рН соответственно. Можно предполагать, что

переходы S(0) <-» S(H) имеют отношение к функционированию нативного белка: в люмене, с которым контактирует этот белок, значение pH при освещении хлоропластов колеблется в диапазоне 4,5-6,5 pH.

С другой стороны, расположение белка Y-33 в полиферментном комплексе ФС 2 таково, что он может связывать Н+, выделяющиеся при окислении воды. Если pH в люмене ниже 5, белок перейдет в конформационное состояние S(H), в котором, как было показано выше, депротонирование карбоксильных групп затруднено. Это приведет к возникновению кинетического барьера для выхода в люмен протонов, образующихся при окислении воды, и, таким образом, к торможению работы всего полиферментного комплекса.

Данные настоящей работы позволяют предполагать, что белок Y-33 является не только структурообразующим элементом КВК ФС 2. Он может быть и проводником для выхода протонов из зоны реакций КВК, и блокатором выхода Н+ при избыточном закислении люмена.

2.2. Взаимодействие Н+ с А ТФ-азой тилакоидов

В хлоропластах, митохондриях и бактериях синтез и гидролиз АТР, сопряженный с трансмембранным переносом протонов, осуществляется АТР-синтазой - связанным с мембраной комплексом белков. Он состоит из гидрофобной части, функционирующей как протонный канал, и гидрофильной части, сопрягающего фактора, содержащего нуклеотид-связывающие центры и выполняющего каталитические функции. Сопрягающий фактор тилакоидных мембран хлоропластов (Н+-АТР-аза, CFi) является водорастворимым ферментом и может быть переведен с мембраны в раствор обработкой ЭДТА.

В основу современных представлений о механизме трансформации энергии АТР-синтазой положена способность CFi изолировать каталитический центр фермента от реакционной среды посредством конформационных изменений [Boyer, 1993]. Изолированный CFi, в отличие от других АТРаз, проявляет лишь латентную активность, которую можно индуцировать нагреванием, обработкой тиоловыми соединениями, трипсином или детергентами. Процессы активации фермента и связывания с ним субстратов и продуктов реакции сопровождаются конформационными перестройками, регистрируемыми по изменению коэффициента седиментации CFj [Paradies, 1979], количества связанного трития [Ryrie and Jagendorf, 1972] или флуоресцентной метки [Harting et al., 1979].

В настоящей работе структура CFi впервые рассматривается с точки зрения состояния его ионогенных групп.

В соответствии с известными первичными последовательностями для субъединиц CFi и с учетом их стехиометрии 3a3ßy5s, на один олигомерный комплекс приходится 442 радикала Асп и Глу, 9 пар терминальных групп, 26 радикалов Гис и 11 Цис. Из этого следует, что кривая титрования сопрягающего фактора в диапазоне pH 3,0-7,0 должна отражать связывание Н4 в основном с карбоксильными группами Асп и Глу.

На Рис. 3 приведены экспериментальная и теоретическая кривые буферной емкости

3 4 5 6 7 8

рн

Рис. 3 Сравнение теоретической и экспериментальной кривых буферной емкости СГ/.

150

100

CF|. Сравнение этих кривых показывает, что пик, соответствующий титрованию карбоксильных групп, смещен в кислую сторону, и около 180 групп в молекуле нативного белка недоступны титранту. Логично предположить, что протонирование этих групп затруднено вследствие их участия в формировании Н-связей в структуре нативного белка и погружения внутрь молекулы.

Известно, что растворимый фермент стабилен в интервале рН 5,5-9,0, а инкубация при рН < 5,0 сопровождается потерей АТР-азной активности. По этой причине более детальное исследование взаимодействия Н+ с CFj было проведено в интервале рН 5,0-9Д После одного цикла титрования кислотой и щелочью в этом интервале рН фермент сохранял не менее 60% Mg-зависимой АТР-азной активности, стимулированной сульфитом.

Титрование нативного фермента в интервале рН 5,0-9,0 выявляет около 150 групп с высокими значениями рКЭф 5,6. Кривые титрования этих групп кислотой и щелочью не совпадают. Наиболее наглядно гистерезис титрования проявляется на кривых буферной емкости (Рис. 4).

Можно идентифицировать пики буферной емкости, отражающие протонирование и депротонирование групп с рКэф 5,6 и 6,0 соответственно. Наблюдаемый гистерезис не связан с денатурацией фермента и не обусловлен чисто кинетическими эффектами, так как он сохраняется при снижении скорости подачи титрантов в 10 раз. Причиной гистерезиса являются рН-зависимые обратимые конформационные изменения структуры фермента: образование и диссипация водородных связей между парами карбоксильных групп. Этой же причиной обусловлены и необычно высокие значения рКЭф около 150 карбоксильных групп фермента.

Результаты исследования действия нуклеотидов на характер титрования CFi

представлены на Рис. 5. Связывание АТФ, субстрата и регуляторного активатора АТФ-азной реакции лишь незначительно влияет на количество титрующихся групп, но изменяет характер кривой титрования (Рис. 5, кривая 3).

50 -

5 6 7 8 9 pH

Рис. 4 Киаютно-щ&ючной гистерезис титрования CF/. Кривые буферной емкости (моль/моль CFi) рассчитаны по данным титрования кислотой (сплошная линия) и щелочью (пунктирная линия). Скорость подачи тит-ранта - 1,5 мкм оль НС! (КОН)/мин.

Ь 200 150 100 50

5 6

7

РН

8 9

Рис. 5 Влияние нуюгеотидов на титрование CF). Кривая титрования кисютой без добавок (1), в присутствии 50 мкМ ЛОР (2) и 50мкМАТР (3). Скорость подачи титранта -1.5 мкмоль НС1/мин.

Наблюдаемые в присутствии АТФ изменения кривой титрования сходны с изменениями, регистрируемыми при щелочном титровании фермента, инкубировавшегося при кислых pH (Рис. 4).

Напротив, связывание АДФ, регуляторного ингибитора АТФ-азной реакции [Malyan and Vitseva, 1990], приводит к кислому сдвигу рКЭф ~100 ио-ногенных групп (Рис. 5, кривая 2), т.е. приводит к появлению конформйции, при которой основная доля карбоксильных групп погружена внутрь белковой молекулы. Судя по количеству вовлеченных во взаимодействие групп с аномально высоким рКэф (100 из 150), изменения конформации фермента при связывании АДФ охватывают большую часть олигомерного комплекса CFi-

Таким образом, можно сделать следующие выводы:

1) практически все карбоксильные группы белков CFi участвуют в образовании Н-связей, фиксирующих структуру комплекса;

2) около 150 групп участвует в медленном конформационном переходе с образованием/диссипацией связей между парами карбоксильными групп; эти ipynnu имеют рКЭф 5,6-6,0;

3) добавление АДФ приводит к измененению схемы кооперативных Н-связей: большая часть карбоксильных пар заменяется на связи между карбоксилами и положительно заряженными группами радикалов Лиз, Apr.

2.3. Субхлоропластные препараты ФС 2

Исследовали-взаимодействие Н+ с невезикулярными фрагментами гра-нальных мембран тилакоида - субхлоропластными препаратами Т-20, выделенными по методу Бергольда в модификации Шутиловой. Эти препараты содержат 1 реакционный центр ФС 2 на 230 молекул хлорофилла и состоят, в основном, из белков ФС 2 и светсобирающего комплекса 2 (ССК-2).

Пигмент-белковый комплекс ФС 2 включает в себя фотохимический реакционный центр, преобразующий энергию возбуждения хлорофилла Р680 в энергию разделенных зарядов, и кислородвыделяющий центр (КВЦ), в котором осуществляется реакция окисления воды с выделением молекулярного кислорода и ионов водорода. Установлено, что фотохимические реакции происходят в гидрофобной зоне ФС 2, на белках Di и D2, а КВЦ находится на границе гидрофобной и гидрофильной областей внутренней стороны тилако-идной мембраны.

В работах лабораторий Дилли, Юнге и Хомана [Laskho et al.,1984; Theg and Junge, 1983; Homann et al, 1985] было показано, что H+, освобождающиеся при окислении воды, не попадают непосредственно в водную фазу внугритила-коидного пространства. Они связываются в специальном белковом домене и начинают поступать в водную фазу только после достижения определенной степени протонирования этого домена. Предполагается, что в состав домена входят аминогруппы радикалов лизина с аномально низкими рК 7,2-7,5, расположенные на водорастворимых белках ФС 2 (Y-17, Y-24, Y-33) и полипептидах ССК-2. На свету домен заполняется даже в присутствии разобщителей, что предотвращает ингибирование ЭТЦ уксусным ангидридом, который взаимодействует только с непотгонированными аминогруппами белков [Dilley et al., 1980, 1982]. Остается неизвестным, могут ли Н+ реакционной среды связываться с функционально-активными группами мембранного домена и фотохимического реакционного центра, погруженными в тилакоидную мембрану.

Ь 600

400

200

3 4

5

рН

6 7

Рис. 6 Кривые титрования препаратов в присутствии (1) и отсутствии (2, 3) 0,4 М сахарозы. 1,2- контрольные образцы (Т-20), 3 - образцы поае Трис-обработки (Т-20-Т).

Целью настоящей работы было выяснение этой возможности с помощью прямого метода буферной емкости.

Титрование препаратов в присутствии 0,4 М сахарозы показало, что количество ионогенных групп Асп, Глу и Гис, про-тонируемых в диапазоне 4-7 рН, составляет менее 30% от их числа, определенного по аминокислотному составу: 580 Асп + Глу и 100 Гис в расчете на 230 молекул хлорофилла (Рис. 6, кривая 1). Инкубация препаратов при рН 4 вызывала полную и необратимую инактивацию образцов [35].

При исключении сахарозы из реакционной среды количество групп, доступных титранту, резко увеличивалось (Рис. 6, кривая 2) и было близким данным аминокислотного анализа и результатам расчета в предположении, что на 1 РЦ приходится 12 ССК-2. Следовательно, препараты способны гидратироваться с нарушением плотной

упаковки. Это изменение конформации не приводит к потере функциональной активности.

При удалении Трис-обработкой марганца и У-полипептидов (препараты Т-20-Т) возрастает количество карбоксильных групп с рКЭф 4,4-4,6 (Рис. О, кривая 3), несмотря на то, что при этой обработке удаляются и водорастворимые белки КВЦ У-17, У-24, У-ЗЗ, что снижает суммарное количество дикарбо-новых кислот в препаратах. Этот эффект обусловлен смешением рК при нарушении функционально-значимых Н-связей с участием карбоксильных групп.

Удаление только водорастворимых белков обработкой препаратов 1 М СаСЬ не визы вал о подобного эффекта, что показывает определяющую роль ионов марганца в организации структуры не только КВЦ, но и всего полиферментного комплекса ФС 2. Это заключение подтверждается тем, что добавление экзогенного Мп (3-5 мкМ) к препаратам Т-20-Т переводит их в состояние, близкое Т-20 как по виду буферного спектра, так и по реактивации функции фото-индуцированного переноса электронов, регистрируемого по восстановлению ДХФИФ. Ионы магния и калия не вызывали такой реактивации в концентрациях 20-40 мкМ [42].

Гидратированное состояние мембран должно быть характерным для полиферментных комплексов ФС 2 граналь-ных участков в составе тилакоида, где внутренняя поверхность мембраны контактирует с водной фазой внутритилакоидного пространства, недоступного для сахарозы.

р 300

200 -

100

5

рН

Рис. 7 Буферная емкость препаратов Т-20 в отсутствие сахарозы.

Табл. 3 Параметры пиков кривой буферной емкости гидратированных препаратов Т-20

Пик рКЭф 1 С

А 3,8 1,6 310

Б 5,1-5,2 1 240

С 6,1-6,2 1 160

Поэтому именно это состояние препаратов Т-20 было исследовано наиболее подробно.

На кривой буферной емкости гидратированных препаратов (Рис. 7) выявляются 3 пика, параметры которых приведены в Табл. 3.

Из данных Табл. 3 следует, что в гидратированных препаратах Т-20 значения рКЭф большинства карбоксильных групп смещены от стандартных значений вследствие участия этих групп в образовании Н-связей. В области денатурации (пик А) протонирование групп происходит кооперативно, что указывает на сопряженность системы водородных связей с участием радикалов Асп и Глу. Вероятно, стабилизация структуры препаратов осуществляется, в основном, за счет этих связей.

Пик Б, вероятно, соответствует титрованию карбоксильных групп в составе кластеров и ионных пар: рК3ф этих групп близко к рК полиглутаминовой кислоты. Пик В, очевидно, включает титрование имидазольных групп Гис: он отсутствует на кривых белка У-ЗЗ, не содержащего Гис (Рис. 1) и увеличен у препаратов Т-20-Т, не содержащих У-белков, с малым количеством гистидина.

В диапазоне 4-8 рН препараты устойчивы: циклы неравновесного кислотно-щелочного титрования можно повторять 2-3 раза; кривые титрования при этом хорошо воспроизводятся. При повышении скорости титрования на гидратированных препаратах появляется гистерезис протонирования-депротонирования в области 4,5-7,5 рН (Рис. 8).

Гистерезис сохраняется при высокой концентрации соли (0,5 М ЫаС1), в присутствии Тритона-ХЮО, после Трис- и СаС12-обработки (Табл. 4). Он

обусловлен наличием кинетического барьера для диффузии Н+ при титровании радикалов гистидина, расположенных в мембране и примембранном слое. Характерное время для этого процесса составляет около 2 мин.

Освещение гидратированных препаратов Т-20 в отсутсвии экзогенного акцептора электронов вызывает разделение зарядов в РЦ ФС 2, которое' сопровождается изменением состояния ионогенных групп [27, 36]. При включении света происходит обратимое в темноте снижение буферной емкости в области 4,0-4,5 рН (Рис. 9) и закисление реакционной среды (Рис. 10).

Оба эффекта соответствуют смещению рКэф 30-40 карбоксильных групп в кислую сторону вследствие светоиндуциро-

300

200 -

100 -

РН

Рис. 8 Кислотно-щелочной гистерезис в препаратах Т-20. ] -титрование кислотой; 2 - щелочью.

ванного образования дополнительных Н-связей между карбоксильными группами и другими аминокислотными радикалами. Вероятно, на свету образуются связи с ими-дазольными группами гистидина, на что указывает небольшое, но достоверное увеличение буферой емкости при рН > 6,5.

Препараты Т-20-Т имеют слабую и необратимую в темноте реакцию на свет. Освещение этих препаратов в отсутствии экзогенного марганца приводит к фотоингибированию ФС 2. Добавление Мп до освещения переводит препараты в состояние, близкое исходному: они реагируют на свет так же, как препараты Т-20.

Ранее на препаратах ФС 2 такая реакция на свет не отмечалась, но на тилакоидных мембранах, лишенных сопрягающего фактора СБ] при обработке хлоропластов бромистым натрием, наблюдали обратимое в темноте выделение протонов, которое объяснили изменением конформации мембранных белков. Данные нашей работы показывают, что в ФС 2 разделение зарядов приводит к изменению структурно-функционального состояния белков, и это изменение происходит только в том случае, если полиферментный комплекс сохранил систему Н-связей, необходимыми участниками которой являются ионы марганца.

Таблица 4. Количество ионогенных групп, титруемых в диапазоне рН 4-7, препаратов ФС 2 с разной степенью деструкции. 1 - суммарное количество, 2 - группы, участвующие в гистерезисе (моль/моль РЦ)

Образец 1 2

Т-20 + 0,4 М сахароза 280 0

Т-20 370 100

СаС^-обработка 360 100

Т-20-Т 550 140

Т-20-Т + 6 атомов Мп на 1РЦ 390 100

Суммируя данные этого раздела, можно сделать следующие выводы:

Рис. 9 Буферная емкость (отн. ед.) препаратов Т-20 в темноте (1) и на свету (2). Титрование кислотой.

Рис. 10 Светоиндуцированное закисление реакционной среды, обратимое при вы-ключенгии света.

1) В гидратированных препаратах ФС 2 ионогеные группы, включая и группы гидрофобной зоны полипептидов РЦ и ССК, практически доступны для ионов водорода реакционной среды. При титровании около 100 групп наблюдается кислотно-щелочной гистерезис, обусловленный кинетическим барьером.

2) Белковые комплексы ФС 2 структурированы системами слабых водородных связей с участием карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот. Удаление марганца из КВЦ приводит к разрушению этих систем связей, что указывает на структурную роль марганца не только в организации полипептидов КВЦ, но и всего полиферментного комплекса ФС 2.

3) Обнаружен новый фотохимический эффект - светоиндуцированное снижение буферной емкости гидратированных препаратов Т-20, сопровождающееся обратимым закислением реакционной среды. Эффект объяснен образованием на свету дополнительных водородных связей с участием радикалов дикарбоновых кислот и гистидина.

Таким образом, можно полагать, что в препаратах гранальной фракции тилакоидных мембран существует возможность латерального переноса Н+ в пределах примембранного слоя, которая обеспечивается системой кооперативных связей с участием карбоксильных групп аминокислот и наличием кинетического барьера между частью ионогенных групп и водной фазой. Наши данные подтверждают выводы лабораторий Дилли, Юнге и Хоманна о наличии в белках ФС 2 протон-связываюших доменов, медленно уравновешивающихся с водной фазой внутритилакоидного пространства, и дают биохимическую основу функционирования таких доменов.

3. Взаимодействие ионов водорода с тилакоидными мембранами

3.1. Роль ионогенных групп белков тилакоида в процессах энергетического сопряжения

Большинство классических работ, посвященных протонной регуляции энергетического сопряжения, было выполнено на хлоропластах, выделение которых проводилось с использованием осмотического шока и высоких концентраций солей. В этих работах было показано, что при стационарном освещении суспензии хлоропластов скорость синтеза АТФ пропорциональна величине трансмембранного градиента протонов, измеряемого обычно по распределению проникающих аминов, в частности, 9-аминоакршшна. Скорость переноса электронов от воды к акцепторам ФС 1 тоже зависит от величины градиента рН, т.к. реакция окисления пластогидрохинона тормозится закислением водной фазы внутритилакоидного пространства [McCarty et al., 1971; Tik-honov et al., 1981; Davenport et al., 1986).

Авторы, работающие на свежеприготовленных хлоропластах, полученных с использованием более мягких способов выделения в средах, содержащих сахарозу или сорбитол, часто получают результаты, трудно объяснимые в рамках хемиосмотической теории сопряжения. Этот факт получил экспериментальное подтверждение в работах лаборатории Дилли, где было проведено сравнительное исследование влияния проникающих аминов на кинетику индукции синтеза АТФ при импульсном освещении в хлоропластах, промытых и ресуспендированных в средах, содержавших 2 мМ MgCl2, 10 мМ КС1 и 0,2 М

V

200

100

0

1 10

0,01 0,1 Валиномицин, нМ

Рве. 11 Действие валиноми-цина на синтез АТФ с MB (1) и циклическое фотофосфори-лирование (2).

сахарозу или 0,1 М KCl (Dilley et al., 1985, 1987, 1994). В условиях стационарного освещения синтез АТФ может стимулироваться ионообменниками или проникающими аминами при снижении трансмембранного градиента Дц(Н+) [Giersch and Meyer, 1984; Pick and Weiss, 1989; Sigalat et al., 1988] или инги-бироваться ионофорами (грамицидин, валиномицин) без снижения Дц(Н+) [22, 26, 28, Pick et al., 1987; Rottenberg, 1990].

В серии наших работ был проведен ингибиторный анализ двух процессов фото-фосфорилирования: линейного, при переносе электронов от воды к акцепторам ФС 1, и циклического, в присутствии ФМС и диуро-на. Обнаружено, что действие грамицидина, валиномицина и нигерицина на эти процессы принципиально различно (Рис. 11, 12), в то время как действие С1ССР - одинаково.

Валиномицин, электрогенный переносчик К+, Na+, но не Н+, в низких концентрациях ингибировал синтез АТФ с MB, но не влиял на скорость электронного транспорта и на циклическое фотофосфорилирование. Такое же действие оказывали низкие концентрации грамицидина (0,1-1 нМ), когда кана-лоформер переносит ионы калия, натрия и аммония, но не Н+.

Нигерицин, индуцирующий электронейтральный обмен Н+ на одновалентные катионы, напротив, стимулировал синтез АТФ с MB, но игибировал циклическое фотофосфорилирование. Такое же действие оказывали 0,2 мМ хлористый аммоний и низкие концентрации метиламина, триэти-ламина, имидазола.

Эти данные показывают, что на одних и тех же хлоропластах два вида фотофосфо-

рилирования: линейное и циклическое - различаются по способу сопряжения переноса электронов и протонов с синтезом АТФ. Один из них реализуется при работе ФС 1 - в присутствии ФМС и диурона - и, вероятно, соответствует модели хемиосмотического спряжения. Второй наблюдается при переносе электронов через обе фотосистемы (от воды к MB). В отличие от первого, он, :удя по данным ингибиторного анализа, непосредственно не связан с величиной трансмембранного градиента pH и трансмембранным переносом Н+: эти параметры контролируют скорость транспорта электронов, но не степень его :опряженности с синтезом АТФ.

Можно предполагать, что существует латеральный поток протонов от ФС 2 к АТФ-синтазам, в то время как поток Н+, возникающий при переносе электронов между фотосистемами, направляется в водную фазу внутритилако-

100

Нигерицин, нМ

Рис. 12. Действие нигерицина

на синтез АТФ с MB (1) и циклическое фотофосфорилирование (2).

идного пространства. Используя эту модель, можно объяснить стимуляцию и ингибирование синтеза АТФ, сопряженного с линейным переносом электронов от воды к ФС 1. Стимуляция связана с увеличением скорости транспорта электронов в результате снижения градиента рН, а ингибирование - с переключением латерального потока Н+ на водную фазу. Если латеральный поток от ФС 2 переключается на водную фазу люмена, низкие концентрации ионо-форов не влияют на синтез АТФ или тормозят его, снижая скорость сопряженного переноса электронов [Keister and Minton, 1970; Karlish and Avron, 1971].

Механизм переключения латерального потока не известен: "переключателями" могут быть низкие концентрации электрогенных ионофо-ров и, вероятно, ненасыщенные жирные кислоты. В работе лаборатории Рот-тенберга, подтвердившей наши данные, было показано, что низкие концентрации пальмитиновсй кислоты ингабируют синтез АТФ с MB, но не влияют на величину Дц(Н+) и циклическое фотофосфорилирование [Pick et al., 1987].

Ионогенные группы белков тилакоидной мембраны могут быть эффективным Н+-буфером внутритилакоидного пространства, где в условиях энерги-зации активность ионов водорода постоянно колеблется вследствие внешних и внутренних причин: интенсивности света, асинхронной работы генераторов ЭТЦ и систем вторичного транспорта протонов.

Буферные системы ионогенных групп можно рассматривать и как стабилизаторы рН примембранного слоя, необходимые для ускорения обмена Н+ между водным обьемом люмена и мембраной. Такая возможность была убедительно продемонстрирована в серии работ Ю.Н. Антоненко и JI.C. Ягужинско-го, выполненых на бислойных фосфолипидных мембранах в 1985-1993 годах.

С другой стороны, карбоксильные группы белков мембраны образуют системы кооперативных связей, как это было показано выше для отдельных белков и мембранных фрагментов. Такие системы могут быть основой для недиффузионного латерального переноса Н+ по примембранному слою, если часть групп отделена кинетическим барьером от водной фазы внутритилакоидного пространства. В этом случае функциональные эффекты локального сопряжения должны наблюдаться в условиях, когда возникает кислотно-щелочной гистерезис при титровании органелл.

3.2. Действие изменения активности ионов водорода на белки тилакоидной мембраны

Для выяснения механизмов образования и использования электрохимического градиента протонов на мембранах тилакоидов необходима информация о влиянии изменения активности ионов водорода на состояние мембранных белков. Одним из прямых методов исследования процессов взаимодействия Н+ с биомембранами является потснциометрическое титрование, результаты которого можно анализировать в виде зависимости от рН буферной емкости органелл.

Буферная емкость хлоропластов, выделенных и исследованных в отсутствии сахарозы, определялась и анализировалась в лабораториях Аврона, Блю-менфельда, Юнге и в нашей лаборатории [4-7, 13, 16].

В рамках настоящей работы мы рассмотрим ранее полученные результаты с точки зрения новых возможностей анализа количества и кооперативно-сти водородных связей с участием радикалов дикарбоновых аминокислот. Актуальность такого рассмотрения определяется тем, что по характеру энергети-

ческого сопряжения хлоропласта, выделенные в солевых средах с использованием осмотического шока (Б-1), отличаются от хлоропластов Б-2, полученных при более мягких способах выделения в присутствии осмотиков, не проникающих сквозь тилакоидную мембрану (сахарозы, сорбитола). У последних, как было отмечено выше, нет прямой связи между скоростью фотофосфорили-рования и величиной трансмембранного электрохимического градиента Н+, что позволяет предполагать существование путей переноса Н+ от генераторов ЭТЦ к АТФ-синтазным комплексам в пределах примембранного слоя, отделенного кинетическим барьером от водной фазы внугритилакоидного пространства. Для удобства и компактности изложения в рамках настоящей работы было целесообразно ввести обозначения Б-1 и Б-2 для двух типов хлоропластов, поскольку оба типа относятся к классу С (лишены внешней оболочки), но имеют функциональные различия.

3.2.1. Зависимость буферного спектра тилакоилов от условий титрования и состава реакционной среды

У Б-1 хлоропластов количество карбоксильных групп, иротонируемых при титровании кислотой в диапазоне 3-7 рН, было меньше, чем определенное по аминокислотному анализу содержание Асп + Глу = 2,8 мкмоль/мг СЫ (Рис. 13).

Добавление в реакционную среду разобщителей (грамицидина, нигерицина в комбинации с валиномицином) не влияло на вид кривой в области титрования карбоксильных групп.

Пики буферной емкости соответствуют титрованию карбоксильных групп с рКЭф в области 3,3-3,6 (пик А) и 4,7-4,9 (пик Б). Параметры пика А показывают, что более 50% карбоксильных групп белков тилакоидной мембраны участвуют в образовании системы кооперативных водородных связей.

Пик Б тоже имеет положительную кооперативность. При увеличении скорости титрования он обычно расщепляется на 2-3 пика, сумма концентрационных коэффициентов которых всегда одинакова. В этой области происходят быстрые и обратимые конформа-ционные переходы в разных белках мембраны, не сопровождающиеся денатурацией.

Содержание гистидина, определенное по аминокислотному анализу образцов (0,45 мкмоль/мг СЫ), было слишком мало для надежной идентификации пика буферной

емкости, соответствующего титрованию Гис, но мы знаем, что он должен иметь рКэф в области 6,2-6,3 рН, как у препаратов ФС 2 (Рис. 7).

Буферная емкость тилакоидов в области 5,5-6,5 рН непостоянна. Здесь находится пик с рКЭф 5,6-5,8, который увеличивается при продолжительном хранении хлоропластов или в результате кислотной денатурации, как это показано на Рис. 13. В этой области находится пик растворимой АТФ-азы, титрова-

2 -

1

Рис. 13. Зависимость буферной емкости (мкэкв/мг СИ1/р[{) от рН для контрольных хлоропластов (1), хлоропластов, инактивированных инкубацией при рН 3 (2) и кривая, расчитанная по данным аминокислотного анализа

(3).

2 -

рн

ние которой сильно зависит от состояния фенмента. В частности, при добавлении АДФ количество доступных групп С?1 резко снижается (Рис. 8). Подобный эффект в этой области рН есть и на хлоропластах [1, 6, 13]. Если из суммарной кривой вычесть кривую титрования АДФ или АМФ, можно получить отрицательные значения р хлоропластов. Емкость в этой области рН может быть частично обусловлена и мембранными компонентами небелковой природы (аденозинфосфаты, свободные жирные кислоты), которые обнаруживаются в супернатанте при центрифугировании образцов после продолжительного хранения или закисления среды ниже рН 4.

Кислотно-щелочной гистерезис, не связанный с денатурацией, при титровании

Рис. 14 Зависимость буферной емкости С-1 хлоропластов от состава реакционной среды. Условия: 1 -100 мМ КС! + 2мМ „ , „

MgCl2; 2, 3 - 10мМКС1 + 5мМ образцов в области 5-8 рН был слабо выра-

MgCl2; 3 - + 0,2 М сахароза, 12 жен ™не обнаруживался.

„с При снижении концентрации КС1 до

10 мМ пик Б смещался в область 5,2-5,4, а общее количество групп, титруемых в диапазоне 4,0-4,5 рН, уменьшалось, что можно интерпретировать как увеличение количества Н-связей с участием карбоксильных групп (Рис. 14).

Добавление 0,2-0,4 М сахарозы незначительно усиливало этот эффект. Такое отличие в действии сахарозы на характер титрования тилакоидов и невезикулярных фрагментов мембран (Рис. 6, 14) можно объяснить тем, что группы с рКэф 5,2-5,4 находятся, в основном, внутри люмена, а степень гидратации

люменальной поверхности

рН 7,5

7 -

6,5 -

6 -

5,5 -

10

мин

15

20

Рис. 15. Дискретное титрование Б-2 хюро-пластов. Условия - в тексте.

мембраны замкнутой везикулы не зависит от присутствия в реакционной среде осмотика, не проникающего сквозь мембрану.

3.2.2. Кислотно-щелочной гистерезис при титровании Б-2 хлоропластов

Общий вид буферного спектра Б-2 хлоропластов, расчитанного по данным непрерывного титрования, был аналогичен кривым 2, 3 Рис. 14. Кроме того, количество групп с рКЭф 5,3-5,4 у хлоропластов Б-2 было больше на 30-50%, чем у Б-1 [29, 40]. Существенным отличием этих двух видов хлоропластов было то, что на Б-2 хлоропластах

гистерезис кривых протонирования-депротонирования в области 5-8 рН наблюдался во всех экспериментах.

Наиболее ярко гистерезис был выражен в условиях титрования при температуре 20 °С у образцов, не подвергавшихся отмывке в реакционной среде. В этом случае удавалось исследовать буферную систему тилакоида с максимальным уровнем кооперативности процессов протонирования-деиротонирования ионогенных групп.

На Рис. 15 приведена запись изменения рН при дискретном добавлении стандартных доз кислоты или щелочи.

В области рН 6,0-7,0 добавки титрантов вызывали близкие по величине быстрые смещения рН, свидетельствующие о быстрых и обратимых процессах связывания протонов. Кроме того, при рН ниже 5,9 добавление кислоты индуцировало медленное поглощение протонов, скорость которого зависела от рН реакционной среды. Эти протоны не выделялись в среду при защелачивании суспензии до исходного уровня рН. Добавление порций кислоты и щелочи после завершения медленного процесса вновь вызывало лишь быстрые и одинаковые смешения рН (Рис. 15, кривая 1).

При титрованиии щелочью от значения рН, установившегося в суспензии хлоропластов до начала эксперимента, наблюдались только быстрые смешения рН (Рис. 15, кривая 2). Если хлоропласты были преинкубированы в подкисленной среде, при защелачивании выше 6,3 рН появлялся медленный выход протонов, скорость которого зависела от рН реакционной среды.

Добавление в реакционную среду 0,5 мкМ грамицидина Б не оказывало заметного влияния на кинетику изменения рН, следовательно, медленные процессы не были обусловлены низкой трансмембранной проводимостью ти-лакоидов для ионов водорода.

Данные показывают, что в процессах медленного протопиовация и де-протонирования участвует одинаковое количество фупп, а величины быстрых смешений рН практически не зависят от медленных процессов. Следовательно, на хлоропластах существ>тот две системы буферов, имеющие разный характер взаимодействия с протонами. Одна из систем быстро уравновешивается с протонами реакционной среды, связывая около 1,0 мкэкв Н+ на 1 мг СЫ с рКэф 5,2-5,4. Взаимодействие Н" со второй системой сопряжено с медленными и обратимыми изменениями структуры. Измерения показали, что эта буферная система на образцах разного выделения способна связывать от 0,5 до 1,0 мкэкв Н* на 1 мг хлорофилла. В условиях дискретного титрования рКЭф кислой и щелочной ветвей гистерезиса составляли 5,8 и 6,6.

Кривые буферной емкости, рассчитанные по данным непрерывного титрования кислотой и щелочью при разной скорости дозирования титрантов показаны на Рис. 16.

Максимумы узких пиков буферной емкости при скорости 20 мкМ/мин соответствуют значеням рК> = 5,7 и рКг = 6,6 ки-

РН

Рис. 16. Киаотно-щелочной гистерезис при варьировании скорости подачи титрантов в реакционную среду. Скорости подачи кисюты и щелочи со-став.ши: lui*- 20, 2 и 2*-40, 3 и 3*- S0мкМ/мин.

слой и щелочной ветвей гистерезиса соответственно (кривые 1 и 1*). Коэффициенты кооперативное™ узких пиков, оцененные по разложению кривых, для процессов протонирования и депротонирования близки 5 и 4.

Увеличение скорости подачи титрантов до 40 мкМ/мин приводило к смещению ветвей гистерезиса в направлении титрования, но не изменяло количества групп, титруемых в диапазоне рН 4,5-8,0. (Рис. 16, кривые 2 и 2*). Следовательно, в этом случае скорость титрования была гораздо выше скорости медленного конформационного перехода. Дальнейшее увеличение скорости мало влияло на вид кислой ветви, но вызывало смещение щелочной, и количество групп при титровании щелочью снижалось. В этом случае скорости титрования были выше скоростей конформационных переходов, и мы получили "портреты" двух структурных состояний второй буферной системы: депро-тонированного (S(0) с рКЭф 5,2-5,4) и протонированного (S(H) с рКЭф 7,5). Эти портреты похожи на аналогичные состояния белка Y-33 из ФС 2, описанные выше (Рис. 2).

Смещение рКЭф при переходе S(0)-S(H) на тилакоидах тоже нельзя объяснить только образованием Н-связей с участием карбоксильных групп: эффект должен быть обусловлен включением других взаимодействий и ограничением доступности групп для Н+ водной фазы, что подтверждается особенностями кинетики протонирования-депротонирования тилакоидов.

Вопрос о локализации буферной системы, имеющей гистерезис, удалось выяснить при исследовании светозависимости процессов протонирования-депротонирования С-2 хлоропластов (Рис. 17).

В условиях энергизации большая часть ионогенных групп системы оказывается про-тонированной при рН среды выше 6,0 в результате поглощения Н+ из внутритилакоидно-го пространства. С другой стороны, при заще-лачивании внешней среды депротонирование групп на свету и в темноте происходит в одном и том же диапазоне рН (Рис. 17, 16), хотя на свету рН внутри тилакоида остается ниже 6. Следовательно, буферная система, обладающая гистерезисными свойствами, взаимодействует и с внешней средой. В присутствии разобщителя гистерезис на свету был таким же как в темноте (Рис. 16).

Светозависимость буферной емкости тилакоидов Б-1 и Б-2 хлоропластов оказалась практически одинаковой. В обоих случаях разность р свет-темнота имела две составляющие: не зависимую и зависимую от протонного градиента. Первая составляющая имела сходство с эффектами освещения, обнаруженными нами на невезикулярных препаратах Т-20: на тилакоидах, лишенных CFi NaBr-обработкой, светоиндуцированное снижение буферной емкости при рН < 4,5 сопровождалось обратимым закис-лением реакционной среды. Подобное закисление было ранее зарегистрировано на хлоропластах [Nelson and Eytan, 1979] и интерпретировано [Yamasaki and Nishimura, 1988] как свидетельство светозависимых изменений конформации

О -1-'-1-

4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 РН

Рис. 17. Кислотно-щелочной гистерезис Б-2 хлоропластов в условиях энергизации (1, 2). Титрование кисолотой (1) и щелочью (2). Темновая кривая кислотного титрования (3) показана пунктиром.

8

РН

Рис. 18 Разность буферной емкости (свет-темнота) у контрольных хлоропластов (1) и у хлоропластов, обработанных тринитрометаном (2) или ДЦКД(З).

белков мембраны, что не противоречит нашему предположению о светоиндуцирован-ном образовании в белках мембраны дополнительных Н-связей с участием карбоксильных и имидазольных групп.

Энергозависимая составляющая буферной емкости обусловлена прсггонировани-ем ионогенных групп мембраны при формировании ДрН. Часть групп, имеющих в темноте значения рКЭф около 4,8 (Б-1) или 5,35,4 (Б-2), на свету титруется при среднем значении рКэф около 7,5.

То, что при энергизации происходит именно смещение рК карбоксильных групп, а не появление новых, с рКЭф 7,5, подтверждается данными Рис. 16. При освещении гистерезис на Б-2 хлоропластах практическт пропадает: кислотная ветвь переходит на позицию щелочной, т.к. 5(Н) состояние поддерживается закислением внутритилакоидного пространства.

Как уже отмечалось, различие между Б-2 и Б-1 хлоропластами заключается прежде всего в том, что в последнем случае гистерезисные эффекты на неэнергизованных тилакоидах практически не наблюдаются, хотя количества титруемых групп близки и светозависимость р одинакова. Можно предполагать, что при энергизации Б-1 хлоропластов образуется состояние, аналогичное 5(Н), но менее стабильное из-за отсутствия полного набора необходимых компонентов и кинетического барьера между белками и водной фазой люмена.

Эффект светоиндуцированного смещения рКЭф был получен в лаборатории Аврона (\VaIz е1 а1, 1974) и объяснен смещением области титрования групп, расположенных внугри тилакоида, на величину градиента рН. Если это объяснение верно, то изменения величины ДрН должно приводить к соответствующим изменениям рКЭф внугритилакоидной буферной системы: добавление разобщителей смещало бы рКЭф на величину ДрН < ДрНо, а добавление блокаторов Н+-канала АТФ-синтазы (ДЦКД, вентурицидина) увеличило бы сдвиг рК не более, чем на 0,3 ед. рН в соответствии с наблюдаемым увеличением градиента рН. Однако, экспериментальные данные не подтверждают этого: увеличение протонной проводимости мембран с использованием разных воздействий (снижение интенсивности света, добавление субстратов фотофос-форилирования или грамицидина, внутримолекулярное разобщение СР[ обра,-боткой тетранитрометаном [21] или ртутью) давало одинаковый результат. Любое снижение ДрН не приводило к заметному изменению сдвига рКЭф, но снижало количество групп, титруемых при рКЭф 7,5 (Рис. 18).

Добавление ДЦКД, напротив, увеличивало сдвиг рКЭф более, чем на 1, так, что светоиндуцированное протонирование внутритилакоидных групп происходило при рН выше 9.

Можно полагать, что смещение области титрования внугритилакоидной буферной системы определяется значениями рКЭф клапанов каналов систем транспорта протонов. Клапаны каналов находятся на внешней поверхности мембраны и имеют рКЭф 7,3-7,5 и 8,5-9,0. Клапаны с рК 7,3-7,5 принадлежат

АТР-синтазному комплексу, клапаны с более щелочными значениями рК -неизвестной пока системе, обеспечивающей транспорт протонов при блокированных каналах АТР-синтазы в присутствии ДЦКД или вентурицидина.

Это предположение находит подтверждение в опытах по светошщуци-рованному включению трития в CFj (Рис. 19).

Зависимость включения трития от рН реакционной среды указывает на то, что процесс имеет кооперативный характер: он индуцируется в узком диапазоне рН 7,0-7,4 и дальнейшее повышение рН лишь слабо увеличивает включение трития в CF] [20, 23]. Скорости электронного и протонного транспорта при этом резко увеличиваются, а величина светоиндуцированного поглощения Н" снижается. В присутствии ДЦКД светоиндуцированное поглощение протонов возрастает, а включение трития в фермент полностью инги-бируется. Отсюда следует, что тритий включается в пептидные связи белков CF), если существует проток Н+ (и 3Н+) через молекулу фермента, т.е. когда открыт клапан канала АТФ-синтазы на внешней поверхности мембраны.

Очевидно, собственно клапанам каналов принадлежит лишь малая часть общего количества титруемых групп, которую невозможно выявить по кривым буферной емкости. На более простых объектах для определения рК применяют метод ЯМР. Недавно были определены рК пяти карбоксильных групп С-субъединипы АТФ-сшгтазного комплекса Е. coli : показано, что Асп 61, важный для протонной проводимости канала, имеет рК 6,9-7,1, а остальные карбоксилы Асп и Глу - 5,4-5,6 [Assadi-Porter and Fillingame, 1995]. Иггогда рК групп можно определить по рН-зависимости функциональной активности фермента. В лаборатории Л.А. Блюменфельда было показано, что при кислотно/щелочном переходе синтез АТФ возможен на изолированном комплексе АТФ-синтазы и даже просто на CFi, причем обе реакции зависят от степени протонирования кислотных групп с рКЭф 6,2 или 7,3 (Блюменфельл и др., 1987].

3.3. Возможность участия кооперативной системы ионогепных групп в трансформации энергии на тилакоидной мембране ¡40)

При протонировании системы на свету или в темноте возникает состояние S(H), характеризующееся высоким значением рК,ф 7,5 и большим количеством кооперативных связей с участием ионогепных групп радикалов Асп, Глу и Гис. При защелачивании среды состояние S(H) сохраняет устойчивость до рН 6,3, затем происходит депротонирование системы: она переходит в состояние S(0), характеризующееся более низкими значениями рКЭф ионогенных групп и более слабыми взаимодействиями между ними. Это состояние является устойчивым в щелочном диапазоне рН и сохраняется при закислении среды до рН 5,9, ниже которого вновь индуцируется переход в S(H), так что кривые цикла титрования представляют собой петлю гистерезиса. Значения рН 5,9 и 6,3 являются бифуркационными точками, так как в промежутке между ними система сохраняет состояние S(0) или S(H) в течение времени, срав-

Д3Н 100

50 -

6

7 8 РН

Рщс. 19 Светоиндуцированное включение трития в CFj при энергизации хлороплас-тов.

нимого со временем инактивации хлоропластов. Оценка рК ветвей гистерезиса по буферному спектру дает значения pKi 5,7 и рКз 6,6 с точностью до 0,1 ед. РН.

Системы, имеющие гистерезисные свойства, могут выполнять функции преобразователей энергии и совершать полезную работу. Используя найденные значения рК ветвей, оценим работу, которую может совершать буферная система тилакоидов в циклах протонирования-депротонирования:

AW = 2,3RTApKn(H+),

где

ДрК = рК2 - pKi = 0,8 ± 0,1 - минимальная оценка;

ДрК = рКЭф(2) - рК(2) = 2 ± 0,2 - максимальная оценка;

п(Н+) - количество групп, участвующих в кооперативных процессах,

равное 0,5-1,0 мкмоль/ мг Chi или 0,5-1,0 моль/ моль Chi.

Работа, вычисленная по приведенной выше формуле, составит от 1 до 2,5 ккал/моль ионогенных групп, участвующих в кооперативных процессах.

В темноте кооперативное протонирование-депротонирование системы в зависимости от рН среды занимает от 2 до 30 мин., однако из этого ire следует, что такова собственная длительность конформационных переходов. В любой момент титрования процесс протонирования можно остановить, сместив рН среды добавлением щелочи, и количество протонов, медленно диссоциирующих при рН выше рК2, будет близким количеству Н+, связанных хлоропласта-ми во время закисления. Это свидетельствует о доменной структуре буферной системы. Переходы S(0)-S(H) в доменах совершаются быстро, но для единичного домена вероятность перехода мала и требуется значительное время, чтобы переходы совершились во всех доменах.

Рассмотрим модель функционирования системы в условиях энергиза-ции. При рН среды выше рКг разные значения рН внутри и снаружи тилакои-да индуцируют появление разных состояний: компоненты, контактирующие с внутренней фазой, будут стремиться перевести домен в S(H), а взаимодействующие с внешней средой - в состояние S(0). Следовательно, при стационарном освещении система должна осциллировать между состояниями S(0) и S(H). Так как генерация S(H) обеспечивается поступлением протонов от переносчиков ЭТЦ, а переход в S(0) - диссоциацией Н+ на внешней поверхности мембраны, то осцилляции будут сопровождаться трансмембранным переносом протонов, скорость которого определяется лимитирующей стадией гистерезис-ного цикла. Кроме того, как отмечалось выше, в циклах протонирования-депротонирования доменов системы происходит трансформация энергии (1 -2,5 ккал на 1 г-экв транспортируемых протонов), т.е. может совершаться полезная работа.

При рН среды ниже pKi осцилляции прекращаются, так как становится невозможным денротонирование доменов. Домены остаются в протонирован-ном состоянии S(H) и не участвуют в переносе протонов через мембрану, но вносят большой вклад в величину спетоиндуцированного поглощения Н+ хло-ропластами.

Таким образом, модель, предлагаемая в данной работе, базируется на участии системы, обладающей гистерезисными свойствами, не в регуляции, а в осуществлении векторного переноса протонов. Она хорошо согласуется с экспериментальными данными и, в отличие от модели, предложенной Нойманом

[Naumann, 1988], не требует больших флуктуаций pH внутритилакоидного пространства в условиях стационарного освещения.

На основании полученных данных можно сделать следующее заключение:

1. Основой энергозависимости буферной емкости хлоропластов является про-тонирование ионогенных групп, связанное с закислением внутритилакоидного пространства.

2. АТФ-синтазный комплекс управляет протонированием внутритилакоидных групп посредством клапанов Н-канала, расположенных на внешней и на внутренней сторонах мембраны.

3. Б-2 хлоропласты отличаются от Б-1 тем, что, по крайней мере, часть ионогенных групп внутритилакоидного пространства, в том числе и группы клапанов АТФ-синтазы, объединена в кооперативную систему, отделенную кинетическим барьером от водной фазы люмена. Физической основой такого объединения могут быть сопряженные Н-связи с участием ионогенных групп аминокислотных радикалов мембранных белков.

4. На свету протонирование и депротонирование кооперативной системы происходит гораздо быстрее, чем в темноте, т.е. в условиях энершзации существует связь между системой и Н+-генераторами ЭТЦ. Вероятно, именно такой связью обусловлены функциональные эффекты, свидетельствующие о существовании двух режимов сопряжения процессов трансформации энергии: локального и делокализованного.

5. Можно предполагать, что и в условиях импульсного освещения именно система кооперативных Н-связей с участием ионогенных групп обеспечивает эффективное сопряжение процессов трансформации энергии в хлоро-пластах. В такой системе возможен перенос Н+ от ЭТЦ к АТФ-синтазам не за счет свободной диффузии по водной фазе, а по эстафете Н-связей между ионогенными группами примембранного слоя.

4. Действие агентов, изменяющих состояние карбоксильных групп, на взаимосвязь структуры и функции хлоропластов

В предыдущих разделах работы было показано, что большая часть ионогенных групп белков тилакоидной мембраны участвует в образовании кооперативных Н-связей, фиксирующих третичную структуру белков и полиферментных комплексов. Сформулирована гипотеза, согласно которой системы таких связей играют важную роль в процессах трансформации энергии на мембранах, определяя взаимосвязь структуры и функции органелл. Для проверки этой гипотезы было проведено исследование действия факторов, влияющих на состояние карбоксильных групп, расположенных в гидрофобных зонах (ДЦКД) и в примембранном слое люмена (катионы липофильных аминов).

4.1. Модификация карбоксильных групп белков мембраны N-N'-дициклогексилкарбодиимидом [32-34, 37, 38]

При исследовании процессов трансформации энергии в биомембранах часто используют ДЦКД, модифицирующий протонированные карбоксильные группы белков, имеющие гидрофобное окружение. Известно, что ДЦКД специфически взаимодействует с единственным радикалом глутаминовой кислсты гидрофобной зоны протеолипида с молекулярной массой 8,5 кД - субъединицы

III CFo. Эта субъединица в состве АТФ-синтазного комплекса содержит 6-12 копий протеолипида, и модификация одной карбоксильной группы приводит к ингибирова-нию синтеза АТФ, торможению сопряженного переноса электронов и увеличению светоиндуцированного поглощения протонов.

ДЦКД модифицирует ионогенные группы многих белков тилакоидной мембраны, что сопровождается ингибированием разобщенного переноса электронов (Sane ct al., 1979] и снижает величину трансмембранного градиента протонов, измеряемую по распределению рН-индикатора нейтрального красного (НК) |Jahneset al., 1988].

В нашей работе было обнаружен новый эффект ДЦКД - индукция трансмембранной проводимости для ионов калия и катионов различных проникающих аминов, в том числе 9АА, НК и локальных анестетиков. Этот эффект проявляется в стимуляции базалыгого переноса электронов при добавлении ДЦКД в присутствии проникающих аминов или ионообмен-ника нигсрицина (Рис. 20) и в снижении величины светоиндуцированного поглощения катионов К', аммония или НК.

Максимальное проявление эффекта наблюдалось при соотношении ДЦКД/хлорофилл 1-1,5. При больших концентрациях ДЦКД трансменбранная проводимость катионов ингибировалась, что можно было видеть по увеличению светоиндуцированного поглощения протонов и торможению скорости переноса электронов и темновой дисснации АН. Это подтверждает предположение о том, что эффект ДЦКД обусловлен модификацией карбоксильных групп эндогенной системы транспорта катионов, существование которой в тилакоидной мембране было доказано в работах Молотковского и Яковлевой 1982-1985 годов. Растворимый карбодиимид не вызывал подобных эффектов.

Таким образом, можно стелать вывод о том, что ДЦКД-модификация карбоксильных групп, расположенных в гидрофобной зоне тилакоидной мембраны приводит к изменению функционального состояния тилакоида:

• блокированию переноса протонов через АТФ-синтазный комплекс (ДЦКД/Chl < 1);

• активации системы трансмембранного переноса одновалеггтных катионов (ДЦКД/СЫ < 2);

• ингибированию систем электронного транспорта и переноса катионов (ДЦКД/СЫ > 2).

Идентификация количества модифицированных групп по буферггому спектру неэнергизованных тилакоидов затруднена тем, что их доля в сумме титруемых групп незначительна. Светозависимость буферной емкости в присутствии ДЦКД изменялась кардинально: область титрования карбоксильных групп внутритилакоидного пространства смещалась в щелочной диапазон рН

РССй, мкМ

Рнс. 20. Действие ДЦКД на базальный перенос электронов от воды к МВ в контроле (1) и в присутствии 0,2мМ аммония (2) или 10 нМ нигерицина (3). Хлоропласты - 20 мкг СИ1/мл.

более чем на 1 по сравнению с немодифицированными мембранами (Рис. 18) вследствие ингибирования утечки протонов через АТФ-синтазный комплекс.

4.2. Конкурентное связывание катионов липофильных аминов на внутренней поверхности мембраны тилакоида [45]

Липофильные амины, в частности, третичные, известные в медицине как локальные анестетики, имеют широкий спектр биологического действия. Так, например, тетракаин и дибукаин изменяют липидную композицию мембран растительных клеток [Jackson and John, 1984.] и ингибируют фотосинтез [Brown, 1985]. Эти амины вытесняют двухвалентные катионы с центров связывания на тилакоидной мембране [Gunther and Laasch, 1991] и вызывают "селективное" разобщение синтеза АТФ [Laasch et al., 1988, 1989]. Феноменологически это разобщение отличается от классического типа тем, что ингиби-рование фотофосфорилирования не сопровождается ускорением переноса электронов, несмотря на снижение градиента pH, измеренного по распределе-

14

нию [ С]-метиламина или тушению флуоресценции 9-аминоакридина (9-АА).

При энергизации хлоропластов в присутствии проникающего амина на тилакоидной мембране возникает не только протонный градиент, но и равный ему по величине градиент концентрации протонированной формы амина, что лежит в основе большинства методов определения pH водной фазы внутрити-лакоидного пространства [Rottenbeig et al., 1972]. Для этой цели часто используются флуоресцентный зонд 9-АА и индикатор pH нейтральный красный (НК), которые являются липофильными аминами и могут связываться как липосомами, так и тилакоидной мембраной, что приводит к завышению расчетных значений градиента pH, особенно в условиях стационарного освещения хлоропластов [Pick and Avron, 1976; Junge et al., 1979; Кузнецова, Кукушкин, 1981; Hope, 1985]

Для того, чтобы корректно исследовать влияние липофильных аминов на величину ДрН, измеренную с помощью других аминов, необходимо прежде всего оценить возможность конкуренции катионов этих аминов за центры связывания на внутренней стороне тилакоидной мембраны.

В работе Пика и Аврона был предложен способ расчета величины све-тоиггдуцированного поглощения протонированной формы проникающего амина, ANH, по стимуляции светоиндуцированного поглощения протонов, Д(ДН) при добавлении амина:

Д(ДН) = —-—ANH = (1 - a)äNH , (1)

К + Н0

где

К - константа диссоциации амина;

Но - активность свободных протонов в среде;

а - степень протонирования амина.

Математический анализ показал, что для расчета поглощения липо-фильного амина можно использовать формулу (2), аналогичную (1), где введен коэффициент Ь, характеризующий растворение амиьа в мембране, а величина ANH является суммой измеггений количеств связанных и свободных катионов внутри люмена:

А(АН) = ДЛИ(1--^-) (2)

1 +о

Мы исследовали светоиндуцирован-ное поглощение двух проникающих аминов, имеющих близкие значения рК (6,7 - НК и 6,9 - имидазол) и, следовательно, близкие значения а в уравнении (2). При рН 8,0 а « 1, поэтому Д(ДН) я ДЫН при любом значении параметра А

На Рис. 21 показана кинетика стимуляция ДН этими аминами. Данные рисунка показывают, что поглощение НК обусловлено, в основном, связыванием катионов НК внутри тилакоида. Такое связывание приводит к торможению диссипации ДН при выключении света, следовательно, НК не увеличивает, а снижает протонную проводимость мембраны.

На Рис. 22 приведены зависимости Д (ДН) от общей концентрации НК и 1т. Для имидазола кривые оказались линейными как' при минимальной, так и максимальной интенсивности света (кривые 1, 2). Добавление НК значительно сильнее стимулировало светоиндуцированное поглощение протонов как при низком, так и при высоком уровне освещения (кривые 3, 4).

Поскольку катионы 1т, в отличие от катионов НК, не связываются внутри тилакоида, имидазол можно использовать для оценки величины протонного градиента. Согласно оценке изменения Н;п по кривым 1 и 2 при переходе от сильного освещения к слабому концентрация протонов внутри тила-

Д(Д)Н+ 0.6

0.4

0.2

°'°0 ( 20 40 60 80 100 концентрация амина, мкМ

Рис. 22. Светоиндуцированное поглощение хло-ротастами катионов имидазола (1,2) и НК (3,4) в уаовиях сшбого (1,3) и сильного (2,4) освеще-

сек

Рис. 21. Стиму.гяция ДН проникающими аминами: 25 мкМ НК (2) и 100 мкМ имидазолом (3)

Д(Д) Н) мкэкв./мг СЫ

0.6

0.4

0.2

0.0'

О 10 20 30 40 50 концентрация N1?, мкМ

Рис. 23. Кривые стимуляции светоиндуцирован-ного поглощения протонов тилакоидами при добавлении НКв контроле (1) и на фоне липофиль-ных аминов: ТК (2) или 9АА (3).

ко ила снижается в 9,4 раза. В отличие от имидазола, такое же изменение протонного градиента не приводит к существенному изменению связывания катионов НК внутри тилакоида (Рис. 22, кривые 3, 4), которое насыщается уже при низкой освещенности.

Если катионы двух аминов способны конкурировать друг с другом за центры связывания на тилакоидной мембране, то при совместном добавлении этих аминов в суспензию хлоропластов должна наблюдаться неаддитивность стимуляции светоиндуцированного поглощения протонов, т.е. величина Д(ДН), измеренная для одного амина, будет снижаться в присутствии другого.

На Рис. 23 можно видеть, что 9-АА и тетракаин в значительной мере ингибируют индуцированную НК стимуляцию поглощения протонов. Поскольку снижение прогонного градиента почти в 10 раз не вызывало столь кардинальных изменений концентрационной кривой НК (Рис. 21), действие тетракаина и 9АА нельзя объяснить снижением протонного градиента в присутствии этих аминов. Общий вид кривых на Рис. 22 свидетельствует о том, что катионы 9-АА, тетракаина и НК связываются одними и теми же мембранными центрами. При увеличении концентрации НК происходит вытеснение катионов 9-АА и тетракаина катионами нейтрального красного, что и приводит к стимуляции поглощения протонов.

Этот вывод подтверждается данными Рис. 23.

Как видно на Рис. 24, увеличение концентрации 9-АА (кривая 2) или тетракаина (кривая 3) приводит к снижению поглощения НК до определенного уровня, который, вероятно, в условиях данного эксперимента соответствует величине концентрационного градиента катионов НК и протонов. В отличие от 9-АА и тетракаина, аммоний в этом диапазоне концентраций слабо влияет

ЛА5З5,%

100

80

60

40

3

20

0

0 10 20 30 40 50 концентрация амина, мкМ

Рис. 24. Влияние добавок 9-АА и тетракаина на светоиндуцированное поглощение НК, измеряемое оптическим методом при постоянной общей концентрации НК в реакционной среде.

на поглощение НК (Рис. 24, кривая 1), что может бьггь обусловлено слабым конкурентным связыванием аммония или его разобщающим действием.

Данные настоящей работы свидетельствуют о том, что катионы липо-фильных аминов конкурируют между собой за центры связывания, расположенные на внутренней поверхности тилакоидной мембраны. Поэтому, при измерении ДрН в присутствии аминов необходимо прежде всего оценить возможность конкурентного связывания исследуемого амина и амина, используемого для определения ДрН.

4.3. Изменения ультраструктуры тилакоидных мембран в присутствии липофильных аминов

При энергизации хлоропластов в присутствии амина концентрации катионов амина внутри и снаружи тилакоидов могут различаться в сотни раз. Такое повышение концентрации катионов липофилыюго амина в люмене приводит к их свяыванию на внутренней поверхности тилакоидной мембраны, следствием чего будет изменение баланса сил, стабилизирующих структуру белково-липилного матрикса мембраны, в том числе и Н-связей с участием карбоксильных групп. Электронно-микроскопическое исследование показало индукцию структурных изменений тилакоидной системы при освещении хлоропластов в присутствии липофильных проникающих аминов. Добавление в реакционную среду 2 цМ СССР ингибировало эти структурные перестройки.

4.3.1. Действие локальных анестетиков - либукаина (ДК) и тетракаина (ТК)

ш

Хлоропласты фиксировали на свету или в темноте в присутствии 25-50 мкМ ДК или ТК. В этих концентрациях локальные анестетики не снижали светоиндуцированнос поглощение протонов, на 15-20% ингибировали синтез АТФ в присутствии метилвиологена и на 20-40% циклическое фосфорилиро-вание с ФМС и диуроном. Момент фиксации образцов выбирали, исходя из кривой светоиндунированного поглощения прогонов в присутствии ТК.

Добавление к хлоропластам дибукаина или тетракаина в темноте не влияло на структуру хлороцластов . Освещение этих же препаратов приводило к значительным перестройкам структуры (Рис. 25)

Рис. 25 Действие .юкшьных анестетиков ДК и ТК на ультраструктуру энерги-

зованных х юроп. юстов.

На участках тилакоидов, контактирующих с внешней средой, - мсж-гранных и краевых гранальных - появляются межмембранные анастомозы и локальные выпячивания мембран в виде изломов или пиков. Можно предполагать, что эти выпячивания, сливаясь между собой, образуют анастомозы. Слияние мембран происходит таким образом, что внутритилакоидное пространство межгранных и краевых гранальных тилакоидов оказывается объединенным, при этом просвет его не увеличивается, составляя в анастомозах, как и в нативных тилакоидах, 5 нм.

Число межтилакоидных анастомозов, видимых на срезе хлоропласта, может варьировать от единиц до десятков. Иногда они столь многочислены, что на месте межгранных тилакоидов образуется сеть - пенообразная структура, заполняющая все пространство между гранами, не вовлеченными в процесс. Анастомозы имеют внутренний просвет такой же, как и сами тилакоиды. Поэтому даже максимальное развитие сети мембранных слияний не приводит к существенному возрастанию суммарного внутреннего объема. Этот вывод согласуется с данными работы Лааша, 1989, где было показано, что при освещении в присутствии ДК объем хлоропластов не увеличивается.

Было проведено временное сканирование процесса образования межмембранных контактов. В первые 2 сек освещения структурные изменения отсутствуют и хлоропласта не отличаются от исходных, темновых. После 4 сек освещения у 20% хлоропластов появляются первые контакты между тила-коидами. В это время можно видеть и картины выпячивания еще не слившихся мембран. После 6-8 сек освещения увеличивается как число слияний в одном хлоропласте, так и доля хлоропластов, охваченных процессами мембранных слияний: межмембранные анастомозы образуются уже у 50% хлоропластов. 10 сек освещения приводят к образованию анастомозов у 80% хлоропластов, что было предельным значением для всех просмотренных препаратов. Остальные 20% хлоропластов не содержали анастомозов, но имели значительные увеличения объема краевых и межгранных тилакоидов.

Таким образом, всего за 10 сек освещения происходит охват хлоропластов сетью межтилакоидных контактов. Максимальное развитие сети - насыщение анастомозами межграналыгого пространства хлоропласта - наблюдалось при 60 сек освещения.

Все эффекты обратимы при деэнергизации органелл. Уже через 10 сек после выключения света хлоропласта возвращаются к исходному состоянию и можно видеть лишь небольшие остаточные явления в виде пикообразных выростов на внешних мембранах некоторых тилакоидов.

4.3.2. Действие рН-индикаторов нейтрального красного и 9-аминоакрщщна

При исследовании энергизации хлоропластов наиболее популярными ДрН-индикаторами являются амфифильные проникающие амины нейтральный красный (НК) и 9-аминоакридин (9АА), которые применяются в условиях импульсного и непрерывного освещения соответственно.

Добавление в темноте 25 мкМ НК не приводило к каким-либо структурным изменениям тилакоидов, но освещение в присутствии 25 мкМ НК сильно влияло на ультраструктуру органелл (Рис. 26).

Основной эффект заключался в локальном набухании тилакоидов. Набухание тилакоидов было гетерогенным: в одном и том же хлоропласте содержались как тилакоиды с резко уреличенным объемом люменов, так и совершенно ненабухшие ламеллы. Набухали многие наружные тилакоиды гран,

часть внутригранальных тилакоидов и некоторые тилакоиды стромы. Кроме того, встречались тилакоиды, у которых область сильного набухания была локализована только на отдельных участках. При концентрации НК 25 мкМ эффекты локального набухания регистрировались у большинства хлоропластов, в то время как у 10-15% органелл они отсутствовали.

Все изменения структуры были обратимы в темноте: через 2 минуты после освещения остаточные эффекты локального набухания можно было обнаружить лишь у некоторых тилакоидов.

Рис. 26 Действие НК и 9АА на ультраструктуру энергизованных хлоропластов.

Ни добавление субстратов фотофосфорилирования, ни использование феназинметосульфата ± 5 мкМ диурона вместо метилвиологена не влияло на светоиндуцированные изменения структуры в присутствии НК.

Снижение концентрации НК в реакционной среде до 10 мкМ приводило к уменьшению количества хлоронластов с эффектами локального набухания, но не снижало амплитуды набухания тилакоидоп. Число тилакоидов с локальными выпячиваниями мембран заметно увеличивалось, и можно было предполагать, что такая деформация ламеллы является промежуточной стадией процесса набухания единичного тилакоида.

Действие 9АА на структуру органелл было во многом похоже на действие НК. В концентрации 10 мкМ 9АА не влиял на структуру хлоронластов в темноте, а на свету индуцировал эффекты локального набухания во многих хлоропласт;«. Однако после выключения света количество хлоронластов, содержащих остаточные деформации мембран, составляло 15-20%. В присутствии 25 мкМ 9АА эффекты, аналогичные локальному набуханию, можно было видеть на некоторых хлоропластах до включения света. На свету они регистрировались практически у всех хлоронластов - в остальном вид образцов был таким же, как на Рис. 25. В отличие от действия НК, действие 25 мкМ 9АА не было полностью обратимым в темноте: после выключения спета до 50% хлоронластов содержали тилакоиды с увеличенным объемом люменов, часто петлеобразные.

Добавление в реакционную среду 200 мкМ аммония не влияло па структуру хлоронластов на свету и в темноте.

Действие НК и 9АА на функциональное состояние хлоронластов в условиях, тождественных использованным при фиксации проб для электронной микроскопии, имело общие черты: 10-25 мкМ НК и 9АА ингибировали синтез АТР на 20-60%, но не снижали свегоиндуциропаннос поглощение Н' и не ускоряли базальный перенос электронов от воды к метнлвиологепу.

Структурные изменения в присутствии НК и 9АА, описанные в настоящей работе, можно охарактеризовать как высокоамилитудное локальное набухание тилакоидов. Зарегистрированы промежуточные формы локального набухания: петли и локальные выпячивания мембран в пределах одной ламеллы. Существование таких форм позволяет предполагать, что в стабилизации структуры тилакоидов участвует и система слабых кооперативных связей между мембранными компонентами, расположенными на противоположных сторонах внутренней поверхности люмена. Нарушение одной связи увеличивает вероятность разрыва соседней и для индукции конформационного перехода необходимо нарушение множества межмембранных связей. Такой переход должен происходить по принципу "все или ничего" и может быть обратимым. Для локального набухания это требование выполняется: снижение концентрации НК или 9АА в реакционной среде снижает количество, по не амплитуду эффектов. Электронно-микроскопическое исследование, не включающее обработку хлоронластов глутароным хтьдегидом, показывает, что внутри люменов имеются частицы |Nishi/awa and Mori, 19X9], способные, в принципе, обеспечивать контакты между мембранами люмена.

Как отмечалось ранее, связывание катионов НК, 9АА и ТК имеет конкурентный характер, и можно было ожидать, что все эти реагенты вызывают однотипные изменения ультраструктуры хлоронластов. Оказалось, что эффекты НК и 9АА резко отличаются от действия локальных анестетиков, которое характеризуется, прежде всего, образованием мсжтнлакоидных анастомозов. В

случае локального набухания мембраны соседних тилакоидов часто сближаются, но не сливаются, т.е. при индукция локального набухания или локальных слияний поверхностные свойства мембран должны быть различными.

Таким образом, в мембранах могут осуществляться два различных кон-формационных перехода: локальное набухание и образование анастомозов - и нам не удалось наблюдать одновременную индукцию этих переходов в пределах одного хлоропласта.

Необходимым условием локальных эффектов является энергизация мембран, следовательно, оба перехода индуцируются связыванием катионов аминов анионными группами внутри тилакоида. Формально это можно описать как существование на мембране двух видов центров связывания. Одни центры могут конкурентно взаимодействовать с катионами НК, 9АА, ДК и ПС; связывание катионов в этих центрах индуцирует структурные переходы. Центры второго вида взаимодействуют только с НК и 9АА: при заполнении этих центров внутренняя поверхность приобретает положительный заряд и возникают объемные эффекты локального набухания.

Поскольку ДК, ТК, НК и 9АА ингибировали синтез АТР, но не стимулировали базальный перенос электронов, можно сделать вывод о том, что локальное эффекты, в отличие от осмотического набухания, не сопровождаются увеличением протонной проводимости мембран. Можно предполагать, что сохраняется и высокий ионный градиент. Эти органеллы поглощают большое количество аминов не только за счет связывания катионов, но и в результате роста осмотического объема люменов. При столь значительной гетерогенности поглощения • тилакоидами использование липофильных аминов даже для качественной оценки величины трансмембранного градиента Н+ представляется весьма проблематичным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема взаимосвязи между структурой и функцией отдельных ферментов и клеточных органелл находится в центре внимания биохимии, биофизики и молекулярной биологии. Формирование и стабилизация нативной структуры белка, т.е. появление его функциональной активности, происходит в процессе медленных конформационных переходов, в которых участвуют ионогенные группы аминокислот, образующие водородные связи между собой и с главной цепью.

В настоящей работе впервые показано, что существует возможность экспериментального определения таких связей в структуре нативного белка: предложен метод оценки количества и кооперативности Н-связей с участием ионогенных групп по рН-зависимости буферной емкости белка в циклах кислотно/щелочного титрования.

Метод применим пля исследования процессов образования и диссипации Н-связей с участием карбоксильных групп, т.к. только для таких связей определены изменения свободной энергии на искусственных полипептидах. В данной работе мы оценивали количество и кооперативность связей двух видов, А и Б:

(А) [ЯгСОО- Н* ООС-М рК, = 3,4-3,8; рК2 = 5,4-5,8

(Б) [ЯгСОО- Н' N-^1 рК! = 3,4-3,8; рК2 > 7

где

ЯрСОО- - радикалы Асп и Глу;

N-1*2 - радикалы Гис и Лиз.

Метод был апробирован на растворимом белке У-ЗЗ из фотосистемы 2. Показано, что из 35 радикалов Асп и Глу этого белка по крайней мере 20 участвуют в образовании кооперативных Н-связей, стабилизирующих третичную структуру. Обнаружено 3 конформационных состояния, каждое из которых стабилизируется собственной системой связей. Переходы между состояниями индуцируются изменением рН, они обратимы и не обусловлены денатурацией или нарушением единственного мостика Переход между состояниями 5(0)/Б(Н) занимает меньше минуты и происходит в диапазоне 5-8 рН, характерном для тнлакоидного люмена. Этот переход имеет кислотно-щелочной гистерезис: 0-8 карбоксильных групп претерпевает изменения связей А о Б. Второй переход в состояние 5(А) требует более 5 мин инкубации при рН ниже 4. Можно предполагать, что только первый переход может быть связан с функционированием белка как регулятора переноса протонов от центра окисления волы ФС 2 в водную фазу люмена.

Титрование олигомерного белка СР) из АТФ-синтазного комплекса, имеющего 440 радикалов Асп и Глу, показало, что около 70% Асп и Глу участвует в образовании связей вида А и Б. Конформанионные изменения фермента, вызванные добавлением АДФ - ингибитора гидролиза - и субстрата синтеза АТФ приводит к замене около 100 связей типа А на связи типа Б, в результате чего плотность упаковки субъединиц фермента увеличивается.

В качестве модели биологической мембраны были исследованы невезикулярные фрагменты гранатьной зоны тилакоидов. Они имеют вид двойных

мембран, на внешней поверхности которых, контактирующей с реакционной средой, расположены белки донорной стороны ФС 2. В этих препаратах все радикалы Асп, Глу и Гис доступны для Н* реакционной среды и около 70% дикарбоновых аминокислот участвуют в образовании связей А и Б. Более половины этих связей нарушается при удалении из КВЦ эндогенного марганца и образуется вновь при добавлении 6 атомов Мп в расчете на РЦ. При титровании имидазольных групп Гис и части [руин, участвующих в связях тина А, возникает кислотно-щелочной гистерезис, свидетельствующий о наличии кинетического барьера для диффузии протонов между этими группами и объемом реакционной среды.

Показано, что на хлоропластах, выделенных без нарушения грапалыюй упаковки тилакоидов, большая часть ионогенных групп белков, контактирующих с водной фазой люмена, объединена в буферную систему, имеющую кислотно-щелочной гистерезис. Основой объединения служат кооперативные Н-связи типов А и Б и наличие кинетического барьера между буферной системой и водной фазой люмена. В условиях энергизации Н+ поступают в систему из водной фазы люмена и непосредственно от переносчиков ЭТЦ, а депротони-рование системы управляется протонными каналами АТФ-синтазных комплексов, часть которых входит в состав системы, как это показано на схеме.

Схема латерального и трансмембранного режимов сопряжения.

Кинетический барьер показан пунктирной линией.

Белок У-33 изображен как регулятор переноса Н+ от ФС 2.

В настоящей работе предложена модель функционирования гистсре-зисного цикла буферной системы, связанного с переносом протонов и совершением полезной работы. Система включает АТФ-синтазный комплекс, управляющий ее депротонированием, поэтому работа (до 2 ккал/экв Н+) может быть сопряжена с синтезом АТФ.

При исследовании функций хлоропластов, имеющих кислотно/щелочной гистерезис, было зарегистрировано существование двух режимов сопряжения переноса электронов с синтезом АТФ. Синтез АТФ при латеральном режиме сопряжения (в отличие от трансмембранного) ингибируется без снижения трансмембранного градиента протонов [22, 26, 28, Pick et al., 1987; Rottenberg, 1990]. На хлоропластах аналогичного типа было показано существование мембранных доменов, заполнение которых протонами необходимо для синтеза АТФ [Dilley et al., 1978-1989], для выхода протонов от ФС 2 в водную фазу люмена [Junge et al., 1979-1988] или для сохранения функциональной целостности ФС 2 [Homann et al., 1984, 1985]. Наши данные по титрованию отдельных белков, фрагментов мембран и тилакоидов дают химическую основу для организации структуры таких доменов - системы кооперативных связей с участием карбоксильных групп. Такие системы могут обеспечивать и латеральный, и трансмембранный перенос протонов, как это показано на схеме.

С другой стороны, наши результаты соответствуют и конформационно-релаксационной концепции ферментативного катализа, предложенной JI.A. Блюменфельдом. Согласно этой концепции, в процессах, сопровождающихся значительным изменением свободной энергии системы субстрат-продукт, элементарный акт химического превращения реализуется в ходе конформацион-ной релаксации фермент-субстратного комплекса, который в начале процесса находится в неравновесном состоянии. Буферная система, обладающая кислотно-щелочным гистерезисом, в условиях энергизации осциллирует между двумя равновесными конформациями, протонированной и депротонирован-ной, проходя через метастабильное состояние.

Как было показано в настоящей работе, изменение систем кооперативных водородных связей с участием ионогенных групп приводит к изменению функционального состояния белков, мембранных фрагментов и тилакоидов. В необходимости этих связей для обеспечения структурно-функциональной организации фотосинтетических мембран убеждают результаты исследования действия агентов, изменяющих состояние ионогенных групп белков.

ДЦКД-модификация карбоксильных групп, расположенных в гидрофобной зоне мембраны, приводит к активации системы электрогенного переноса калия и аммонийных катионов, в том числе и катионов липофильных аминов, использующихся для расчета трансмембранного градиента pH.

Связывание катионов липофильных аминов ионогенными группами люменалыюй поверхности мембраны приводит к нарушению латеральных и транстилакоидных связей и индукции обратимых изменений ультраструктуры хлоропластов

Совокупность представленных данных позволяет сделать вывод о том, что стабилизация структурно-функционального состояния фотосинтетических мембран хлоропласта происходит, в основном, на уровне водородных связей между ионогенными группами полиферментных комплексов белково-липидного матрикса. В частности, эффективность энергетического сопряжения определяется процессами образования и трансформации систем водородных связей с участием карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот.

выводы

1. Разработан автоматизированный метод для исследования процессов ионизации белков и биологических мембран при изменении концентрации ионов водорода в реакционной среде, позволяющий регистрировать изменения рКэф ионогенных групп в процессах медленных изменений третичной структуры белков. Метод обеспечивает получение уникальной информации о третичной структуре нативных белков: количестве и коо-перативности водородных связей между ионогенными группами аминокислотных радикалов.

2. Впервые проведено исследование процессов ионизации карбоксильных групп белков тилакоидной мембраны: полипептида Y-33 из ФС 2, Н-АТФазы и невезикулярных фрагментов граналыюй зоны мембран (препаратов Т-20). Показано, что в молекулах нативных белков до 70% радикалов Асп и Глу участвует в образовании системы водородных связей, фиксирующих структуру. Установлено, что при изменении активности ионов водорода в белках тилакоидной мембраны происходят медленные и обратимые изменения третичной структуры, обусловленные изменением схемы кооперативных Н-связей между ионогенными группами.

3. Показано, что удаление ионов Мп из КВЦ ФС 2 приводит к нарушению около 200 Н-связей в расчете на РЦ. Добавление экзогенного марганца в количестве 6 атомов на РЦ приводит к восстановлению этих связей.

4. На препаратах ФС 2 обнаружен новый фотохимический эффект - све-тоиндуцированное снижение буферной емкости в области 4-5 рН, сопряженное с закислением реакционной среды. Этот эффект индуцируется разделением зарядов в РЦ ФС 2, он обратим в темноте и для его проявления необходимо сохранение нативной структуры белков донор-ного участка ФС 2, обеспечиваемое ионами марганца.

5. Проведено исследование взаимодействия ионов водорода с карбоксильными группами тилакоидов хлоропластов, для которых показано отсутствие прямой связи между скоростью фотофосфорилирования и величиной трансмембранного градиента рН. В этих условиях не менее 50% карбоксильных групп белков мембраны участвует в образовании кооперативных Н-связей буферной системы, имеющей кислотно-щелочной гистерезис и отделенной кинетическим барьером от водной фазы внутритилакоидного пространства.

6. Предложена модель функционирования гистерезисного цикла прото-нирования/депротонирования буферной системы в процессах переноса

протнов и синтеза АТФ. Сделано заключение о том, что система кооперативных Н-связей с участием радикалов Асп, Глу и Гис может быть основой для латерального переноса Н+ от генераторов ЭТЦ к АТФ-сиптазным комплексам.

7. Установлено, что агенты, изменяющие состояние карбоксильных групп белков мембраны, индуцируют изменения структуры и функции тилакоидов. ДЦКД-модификация карбоксильных групп гидрофобной зоны мембраны увеличивает проводимость мембраны для калия и аммонийных катионов. Конкурентное связывание внутри тилакоида катионов липофильных аминов приводит к изменению ультраструктуры хлоропластов и ингибированию синтеза АТФ.

8. Обнаружено 2 новых вида энергозависимых изменений ультраструктуры хлоропласта. Локальные анестетики дибукаин и тетракаин индуцируют образование многочисленных анастомозов между тилакоидными мембранами, экспонированными в стромальное пространство. рН-индикаторы вызывают высокоамплитудное гетерогенное набухание тилакоидов хлоропласта. Оба вида изменений обусловлены нарушением систем кооперативных водородных связей внутри тилакоида при связывании катионов проникающих аминов.

9. На основании полученных данных сделан вывод о том, что ионогеи-ные группы белков тилакоидных мембран играют определяющую роль в структурно-функциональной организации полиферментных комплексов хлоропластов. В частности, регуляция процессов трансформации энергии происходит на уровне Н-связей с участием карбоксильных групп белков внутренней стороны тилакоидной мембраны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Макаров А.Д., Мальян А.Н., Опанасенко В.К. Взаимодействие аденозин-фосфатов с хлоропластами в реакции фотофосфорилирования. (1971) Биофизика, 16, 6, 1125-1128.

2. Опанасенко В.К., Мальян А.Н., Макаров А.Д. Определение констант диссоциации и комплексообразования АДФ и АТФ с ионами некоторых металлов. (1974) Итоги исследования механизма фотосинтеза (Материалы всесоюзного семинара, Пущино), 104-114.

3. Макаров А.Д., Опанасенко В.К., Лебедева А.И. Особенности структуры электрохимически восстановленных адениннуклеотидов. Их взаимодействие с неорганическим фосфатом. (1976) Биохимия, 41, 9, 1561-1566.

4. Опанасенко В.К., Герц С.М., Макаров А.Д. Буферная емкость полипротонных объектов. (1978) Биохимия, 43, 8, 1357-1368.

5. Opanasenko V.K, Makarov A.D. An estimation of free energy differences for the conformational transitions of photophosphorylating membranes. (1979) Тезисы докладов объединенного симпозиума биохимических обществ ГДР и СССР, Веймар, 51.

6. Опанасенко В.К. Определение и анализ зависимости буферной емкости хлоропластов от pH среды, Физиол.растений, 1980, 27, 195-202.

7. Опанасенко В.К., Макаров А.Д. Метод оценки величины изменения свободной энергии белков и биомембран при рН-индуцированных кон-формационных переходах. Сопрягающие мембраны хлоропластов. Биохимия, 1980, т.25, № 2, 210-216.

8. Рузиева Р.Х., Опанасенко В.К., Музафаров E.H. Протолитические свойства флавонолов из хлоропластов гороха. Химия природных соединений, 1980, №3, 337-340.

9. Opanasenko, V.K., Zolotareva, Е.К., Sarantcha, Yu.P., Makarov A.D. Кон-формационная рН-регуляция электронного переноса в тилакоидных мембранах хлоропластов гороха. Symposium on the Photosynthetic Solar Conversion and Storage. Abstracts, 1980, University of Warszawa, Poland, September, 17-23th, p. 39.

10. Опанасенко B.K., Ильченко В.Я., Грищенко B.M. Аминокислотный состав и протонная емкость тилакоидных мембран хлоропластов гороха. Биохимия, 1981, т. 46, №9, 1548-1551.

11. Опанасенко В.К., Золотарева Е.К., Захаров С.Д. Участие АТФ-синтетазы тилакоидных мембран в регуляции электронного транспорта. Симпозиум специалистов стран - членов СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии". Тезисы докладов, Пущино, 1981, стр. 23.

12. Опанасенко В.К.,Макаров А.Д. Оценка изменения свободной энергии макромолекул и биомембран при рН-индуцироваиных конформационных переходах. (1982) I Всесоюзный биофизический съезд. Москва. Тезисы стендовых сообщений, стр. 177.

13. Опанасенко В.К. Метод буферной емкости и его использование для изучения процессов взаимодействия протонов с биомембранами. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук, 1982, Пущино.

14. Опанасенко В.К., Золотарева Е.К., Макаров А.Д. Участие сопрягающего фактора тилакоидных мембран хлоропластов в регуляции переноса электронов. (1982) I Всесоюзный биофизический съезд. Москва. Тезисы стендовых сообщений, стр. 225.

15. Опанасенко В.К., Захаров С.Д., Золотарева Е.К. Зависимость протонной проводимости Н-канала АТФ-синтазного комплекса от степени протони-рования протеолинида. (1982) I Всесоюзный биофизический съезд. Москва. Тезисы стендовых сообщений, стр. 265.

16. Опанасенко В.К., Золотарева Е.К., Макаров А.Д. Буферная емкость тилакоидных мембран в связи с процессами энерготрансформации. Физи-ол. растений, 1983, т. 30, №1, 14-21.

17. Сухорукое Б.И., Опанасенко В.К., Монтрель М.М., Золотарева Е.К. Изучение взаимодействия ДНК с протонами среды методом буферной емкости. Молекулярная биология, 1983, т. 17, №5, 1009-1018.

18. Опанасенко В.К., Золотарева Е.К. Исследование протонной буферной емкости тилакоидных мембран хлоропластов - новый подход к изучению протон-транслоцирующих свойств АТФ-синтетазы. 16-я конференция FEBS, 1984, Тезисы докладов, стр. 341.

19. Sukhorukov B.I., Opanasenko V.K., Montrel М.М., Zolotareva Е.К. DNA structural transitions revealed from its buffer capacity pH-dcpendcncc. Studia biophysica, 1984, v. 101, 37-38.

20. Золотарева E.K., Захаров С.Д., Кузьмина В.П., Опанасенко В.К. Исследование энергозависимого включения трития в АТФ-синтетазу хлоропластов. Биологические мембраны, 1985, т. 2, №10, 1056-1057.

21. Malian A.N., Vitseva О.I., Opanasenko V.K. Properties of tetranitromethane-treated chloroplast ATP-synthctase and localization of tyrosyl residues involved in energy coupling during photophosphorylation. Photosynthetica, 1985, v. 19, №3, 373-381.

22. Opanasenko V.K., Redko T.P., Kuzmina V.P., Yaguzhinsky L.S. The efTect of gramicidin on ATP synthesis in pea clorophists: two modes of phosphorilation. FEBS Letters, 1985, v. 187, №2, 257-260.

23. Zolotareva E.K., Opanasenko V.K., Zakharov S.D., Kuzmina V.P. Correlation between energy-dependent tritium incorporation into CF, and light-induced protonation of thylakoid membranes. FEBS Letters, 1986, v. 197, №1, 2, 125128.

24. Опанасенко В.К., Золотарева Е.К., Казанцев А.П. Автоматизированная установка для определения буферной емкости. Методологические приемы получения и анализа кривых. Сб. "Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии". 1986, Пущино, 62-66.

25. Золотарева Е.К., Опанасенко В.К. Сравнительное исследование протони-рования полифенольных соединений с систематической вариацией структуры. Сб. "Свойства флавоноидов и их функции в метаболизме растительной клетки". 1986, Пущино , 22-38.

26. Опанасенко В.К., Редько Т.П., Ягужинский JI.C. О влиянии ионофоров на синтез АТФ и электронный транспорт в тилакоидных мембранах хлоропластов. ДАН СССР, 1988, т. 303, №3, 752-756.

27. Опанасенко В.К., Шутова Т.В., Ананьев Г.М., Климов В.В. Светоинду-нированные изменения буферной емкости субхлоропластных препаратов фотосистемы 2 шпината. Всесоюзная конференция "Преобразование све-

товой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях". 1989, Пу-щино, Тезисы докладов, 99.

28. Опанасенко В.К., Редько Т.П. Влияние АДФ на сопряжение электронного транспорта с переносом Н от системы окисления воды. "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях". 1989, Пущино, Тезисы докладов, 133-134.

29. Opanasenko V.K. Acid-base hysteresis of the chloroplast thylakoid membranes. Int. Symp. "Molecular organization of biological structures". Abstr. book 1, 1989, Moscow, 47.

30. Opanasenko V.K., Redko T.P., Two modes of photophosphorylation in thylakoid membranes of chloroplasts. Soviet-Indian Symposium on regulation of photosynthesis. Abstr., 1990, Pushchino, 32.

31. Опанасенко B.K., Зорин H.A. Взаимодействие гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina с ионами водорода при изменении рН реакционной среды. Биохимия, 1991, т. 56, №2, 326-331.

32. Опанасенко В.К., Редько Т.П., Губанова О.Н. ДЦКД индуцирует электрогенный перенос аммонийных катионов через тилакоидные мембраны хлороиластов. Межд. Конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", 1991, Пущино, Тезисы докладов, 70.

33. Опанасенко В.К., Редько Т.П., Губанова О.Н., Ягужинский JI.C. N,N-дициклогексилкарбодиимид индуцирует электрогенный перенос катионов аммония через тилакоидные мембраны хлоропластов. Биохимия, 1991, т. 56, №10, 1894-1899.

34. Редько Т.П., Опанасенко В.К., Ягужинский JI.C. К-зависимая регуляция электронного транспорта в хлоропластах гороха при совместном действии ADP и DCCD. Биохимия, 1991, т. 56, №9, 1710-1717.

35. Опанасенко В.К., Шутова Т.В., Климов В.В. Обратимое связывание протонов субхлоропластными препаратами фотосистемы 2 шпината при изменении рН реакционной среды. Биологические мембраны, 1991, т. 8, 595-600.

36. Шутова Т.В., Опанасенко В.К., Ананьев Г.М., Климов В.В. Светоинду-цированное изменение протонной емкости субхлоропластных препаратов фотосистемы 2 шпината. Биологические мембраны, 1991, т. 8, 601-505.

37. Gubanova O.N., Opanasenko V.K., Redko Т.Р., Yaguzhinsky L.S. Induction of elcctrogenic transfer of monovalent cations (K, NH) in thylakoid membranes by N,N -dicyclohexylcarbodiimide, 7th European Bioenergetics Conference, 1992, Helsinki, Finland, EBEC Reports, v. 7, 142.

38. Opanasenko V.K., Redko T.P., Gubanova O.N., Yaguzhinsky L.S. Induction of elcctrogenic transfer of monovalent cations (K, NH) in thylakoid membranes by N,N -dicyclohexilcarbodiimide. FEBS Letters, 1992, v. 307, 280-282.

39. Шутова T.B., Христин M.C., Опанасенко B.K., Ананьев Г.М., Климов В.В. Протон-акцепторные свойства водорастворимого белка 33 кД из фотосистемы 2 шпината. Биологические мембраны, 1992, т. 9, №8, 836-844.

40. Опанасенко В.К. Гистерезис протонирования-депротонирования хлоропластов при кислотно-щелочном титровании в диапазоне рН 5-8. Биохимия, 1993, т. 58, № 5, с. 761-723.

41. Губанова О.Н, Опанасенко В.К., Мальян А.Н. Изучение конформациои-ных изменений сопрягающего фактора хлоропластов методом кислотно-щелочного титрования. Биохимия, 1994, т. 59, №3, с. 410-418.

42. Т.В. Шутова, В.К. Опанасенко, В.В. Климов. Влияние ионов марганца на протон-акцепторные свойства субхлоропластных препаратов фотосистемы 2. Биохимия, 1994, т. 59, №7, с. 983-989.

43. Бородин В.Б., Опанасенко В.К. Зависимость восходящего участка световой кривой реакции Хилла от протонной проницаемости тилакоидных мембран: роль внутритилакошшого рН. ДАН, 1994, т. 339, №5, с. 694696.

44. Shutova T.V., Irrgang K.-R., Opanasenko V.K., Klimov V.V., Renger G. Secondary structure analysis of the 33 kDa protein from photosystem II and its dependence on pH. In "Photosynthesis: from Light to Biosphere", ed. P. Mathis, Kluwer Academic Publisher, 1995. v. И, p. 295-299

45. Опанасенко В.К, Губанова О Н., Агафонов А.В. Проблема измерения трансмембранного градиента рН в присутствии липофильных аминов. Биохимия, 1995, т. 60, №6, с. 917-924.

46. Опанасенко В.К., Семенова Г.А., Агафонов А.В., Губанова О.Н. Образование сетевидных мембранных структур при энершзапии хлоропластоп в присутствии локальных анестетиков. Биохимия, 1995, т. 60, №12, с. 2053-

47. Опанасенко В.К., Семенова Г.А., Агафонов A.B., Губанова О.Н. Действие ДрН-индикаторов нейтрального красного и 9-аминоакрилина на ультраструктуру хлоропластов. Биохимия. 1996, т. 60, №8, в печати.

2057.

СОКРАЩЕНИЯ

ФС РЦ КВЦ

ССК кДа

этц

MB

ФМС

ДЦКД

9АА

ДК

тк нк b

фотосистема реакционный центр кислоролвыделяюший центр светособираюший комплекс килодальтон

электронтранспортная цепь

метилвиологен

феназинметосульфат

Т^-№-дициклогскснлкарбодиимид, ССС13

9-аминоакрилин

либукаин

тетракаин'

нейтральный красный кривая титрования хлорофилл

гидрофильная часть А'ГФ-синтазного комплекса, растворимая АТФ-аза

гидрофобная часть АТФ-синтазного комплекса

белок с молекулярной массой 33 кДа из ФС 2

светоиндупированнос поглощение протонов

буферная емкость, модуль первой производной но рН от кривой

титрования

Chi CF,

CFo Y-33 ДН Р

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.................................................1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................5

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................7

1. Метод буферной емкости для исследования процессов взаимодействия ионов водорода с ноногеннымн группами белков..........7

1.1. Методика регистрации и первичной обработки данных........................7

1.2. Анализ и интерпретация данных............................................................7

1.3. Кинетические эффекты при титровании белков...................................9

2. Взаимодействие иопов водорода с белками, слабо ассциированными с тилакондной мембраной..........................................10

2.1. У-ЗЗ-водорастворимый белок из ФС 2.................................................10

2.2. Взаимодействие Н+ с ЛТФ-азой тилакоидов......................................12

2.3. Субхлоропластные препараты ФС 2....................................................14

3. Взаимодействие ионов водорода с

тилакоидпыми мембранами.......................................................................18

3.1. Роль ионогенных групп белков тилакоида в процессах энергетического сопряжения.......................................................................18

3.2. Действие изменения активности ионов водорода на белки тилакоидной мембраны...............................................................................20

3.2.1. Зависимость буферного спектра тилакоидов от условий

титрования и состава реакционной среды.........................................................21

3.2.2. Кислотно-щелочной гистерезис при титровании Б-2 хлоропластов.............22

3.3. Возможность участия кооперативной системы ионогенных

групп в трансформации энергии на тилакоидной мембране [40]................26

4. Действие агентов, изменяющих состояние карбоксильных

групп, па взаимосвязь структуры и функции хлоропластов...................28

4.1. Модификация карбоксильных групп белков мембраны ЛЧ/У-дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) активирует систему электрогенного транспорта одновалентных катионов [32-34, 37, 38]......28

4.2. Конкурентное связывание катионов липофильных алшнов на внутренней поверхности мембраны тилакоида [45]..................................30

4.3. Изменения ультраструктуры тилакоидных мембран в присутствии липофильных аминов.............................................................33

4.3.1. Действие локальных анестетиков - дибукаина (ДК)

и тетракаина (ТК) [46]....................................................................................34

4.3.2. Действие рН-индикаторов нейтрального красного и

9-аминоакридина...........................................................................................35

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................39

ВЫВОДЫ...................................................................................................42