Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли кальция функционирования фотосистемы 2 помощью локальных анестетиков прокаинового ряда

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли кальция функционирования фотосистемы 2 помощью локальных анестетиков прокаинового ряда"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 577.152.1

ИВАШНЕВА Марина Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ КАЛЬЦИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФОТОСИСТЕМЫ 2 ПОМОЩЬЮ ЛОКАЛЬНЫХ АНЕСТЕТИКОВ ПРОКАИНОВОГО РЯДА

/03.00.02 — биофизика/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1990

Работа выполнена " на- кафедре биофизики Биологического факультета МГУ

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор И.И.Иванов Научный консультант - кандидат биологических наук,

с.н.с. Б.К.Семин Официальные оппоненты -доктор биологических наук, зав. лаб. В.В.Климов -доктор физико-математических наук, н.с. А..Н.Тихонов Ведущее учреждение - Институт фотобиологии АН БССР, г.Минск

Защита состоится 1990г. в, /Г часов

на заседании Специализированного Совета К 053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственном университете им. 11.В. Ломоносова по адресу : 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан"^

" С^/СА-^М^ 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Б. А.. Гуляев

СНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность теш. Одной из ва^нейпих реакций фотосинтеза

1вляется окисление вода. Эту функцию осуществляет фотосистема 2

'ЗС 2/. Хлорофилл реакционного центра 2 /Р6Е0/, перейдя под

шйствием света в синглетно возбужденное состояние, передает свой

1лектрон по цепи переносчиков пластохинону и восполняет его поте-

вд, окисляя переносчик г , который акцептирует электрон от систе-

ы разложения воды. Появление методик получения фотохимически ак-

ивных препаратов ФС 2 предопределило большой успех в исследова-

ии её структурно-функциональной организации. Наиболее очищенный

омплекс ЗС 2, осуществляющий разделение зарядов меуду Р6С0 и пер-

ичным донором электронов феофитином, состоит из трех полипепти-

ов с молекулярными массами 32/01 /, 34/02/ и 9/цитохром в-559/кДа

Nanba>Satoh,1987/. Существуют методики выделения пигмент-белко-

зх комплексов ФС 2, способных восстанавливать ДШ'5 в присутст-

та ДФК, которые помимо перечисленных полипептидов включают один -

7 кДа /УашаиизМ вг.а1.,19Р8/ или два - 47 и 43 к£а / ег. а1.,

583/ белка. Ханотакисом с сотрудниками /0Ьапогак1з е1;.а1.,19Е7/

ш выделен наименьший по числу входящих в него полипептидов ком- 2+

[екс, сохраняющий в присутствии ЯЬ. , С1 и Сал функцию выделения галорода, состоящий из белков 47,43,32,30,9 и 33/периферическо->/ кДа. Препараты ФС 2, способные выделять кислород в условиях, «ближенных к физиологическим, помимо периферического полипепти-33 кДа содержат периферические полипептиды с молекулярными ссами 16 и 24 кДа /ЛипаЬау е1;.а1.,19е4/. Помимо белков, пигмен-в и пластохинонов в состав ФС 2 входят ионы С1~и

Несмотря на значительные успехи в исследовании ЗС 2, многие 1екты её структурно-функциональной организации остаются ещё не тененными. К началу исследований, представленных в данной рабо-, появились данные, предполагающие участие кальция в ^ункциони-

ровании ФС 2. Было установлено, что введение Са стимулирует процесс фотоактивации системы разложения воды хлоропластов, выделенных из растений, которые выращивались в темноте /Oku et al., 19КЗ/ или при прерывистом освещении /Оно,Inoue, 1983/. Барр с соавторами /вагг et а1.,1980/ наблюдали уменьшение скорости переноса электронов через SC 2 в'-хлоропластах, обработанных хелатором кальция ЭГТА. Этими же авторами /Вагг et а1.,1982/ позднее было показано подавление фотопереноса электронов в хлоропластах на уровне К 2 антагонистами кальыодулина трифторперазином и хлорпро-казином.

о.

В связи с возможностью участия Са в функционировании $С 2 представляет интерес исследование влияния на фотоиндуцировакный перенос электронов в хлоропластах различных соединений, воздействующих на опосредованные кальцием процессы в других биологических системах. В этой связи наше внимание привлекли локальные анестетики прокаинового ряда. Данные соединения, известные по своей способности блокировать проведение возбуждения по нервному волокну, влияют на многие процессы, протекающие в других мембранных системах. В целом ряде случаев их воздействие на биологические функции связывают с влиянием на опосредованные кальцием реакции или

о,

Са "'"-связывающие компоненты /Volpl et а1.,1979/. Особое значение

с позиции привлечения локальных анестетиков к изучению проблемы

роли кальция в функционировании $С 2 приобретает известное из ли- •

р.

тературных данных свойство указанных соединений вытеснять Са из модельных /Hauaer,Dewaon,1968 / и нативных /Low et al., 1979/мембран Кроме того, накопленный к настоящему времени значительный экспериментальный материал, касающийся взаимодействия местных анестетиков с искусственными и природными мембранами,может быть использован при изучении их воздействия на фотобиологические процессы.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение влияния локальных анестетиков прокаинового ряда на хлоропласта. При этом 5ыли поставлены конкретные задачи; исследовать воздействие данных зоединений на фотоперенос электронов в хлоропластах, рассмотреть влияние условий эксперимента на характер взаимодействия локальных анестетиков с тилакоидными мембранами; изучить действие этих соединений на характеристики £С 2 хлоропластов; исследовать влияние тональных анестетиков на содержащейся в хлоропластах кальций.

Научная новизна работы. В работе впервые исследовано действие юкальных анестетиков прокаинового ряда на хлоропласты. Сбнаруже-ю, что данные соединения подавляют выделение хлороплрстями кислорода, причем эффективность их ингибирующего действия, коррелирует анестезирующей активностью. Установлено, что локальные анесте-'ики прерывают фотоперенос электронов в первую очередь на донор-юм участке 1С 2. Обнаружено, что заряженные локальные анестетики ! концентрациях, значительно меньших ингибирующих, оказывают разоб-(ающее действие на электронный: транспорт. Показано, что степень [нгибирования заряженными локальными анестетика™ фотопереноса лектронов возрастает при повышении рН суспензии хлоропластов, :то обусловлено увеличениемсодержания анестетика в мембране пслед-твие его депротонирования и перехода в нейтральную фср^. Уста-овлено, что инактивация локальными анестетиками процесса, восста-овления хлоропластами 2,6-дихлорфенолиндо.фенола коррели-

ует с уменьшением выхода переменной флуоресценции хлоропластов. дновременно с ингибированием локальным анестетиком дикаином и нтагонистом кальмодулина хлорпромазином электронтранспортной ак-ивности хлоропластов наблюдается уменьшение амплитуды сигнала ПР 11а. Показано, что инактивация локальными анестетиками пере-оса электронов сопровождается выходом кальция из тилакоидных змбран.

-4В результате проведенных в работе исследований обнаружен новый класс ингибиторов донорного участка 2 - локальные анестетики прокаинового ряда, рассмотрены особенности взаимодействия данных соединений .с тилакоидными мембранами.

Практическая значимость работы. Обнаружен и исследован ношй класс ингибиторов фотоиндуцированного переноса электронов - локальные анестетики прокаинового ряда, прерывающие поток электронов на донорном участке £С 2. Эти соединения могут найти применение ? экспериментах, направленшх на изучение организации цепи йотопереноса электронов.

В виду показанного е настоящей работе соответствия эффективности ингабировакия локальными анестетиками йотопереноса электронов их анестезирующей активности, полученные нам данные, касающиеся влияния этих соединений на тиланоидные мембраны, представляют интерес для выяснения общих закономерностей взаимодействия локальных анестетиков с биологическими мембранами.

В связи с продемонстрированным в данной работе специфическим действием локальных анестетиков на хлоропласта, заключающемся в вытеснении кальция из мембран тилакоидов, уназанные соединения могут найти применение для воздействия на кальций-связывающие участки мембран хлоропластов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ, на I? научной конференции молодых ученых МГУ, Москва, 1966 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано В печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части /объекты и методы исследования, результаты и обсуждение/, выводов, списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАЖЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Во введении рассматривается актуальность теш, определяются задачи исследования.

Глава I. ОБЗОР ЖТЕРАТУШ

В этой главе содержатся сведения о структурно-функциональной организации ФС 2. Приведены данные, отражающие современное состояние знаний по проблеме роли кальция в функционировании SC 2. Рассмотрены представления о влиянии локальных анестетиков на мембранные системы.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным объектом исследования служили хлоропласта, выделенные из листьев 12-14-дневных проростков гороха.Содержание хлорофилла в пробах измеряли по методу Арнона / Arnon, 194-9/.

Скорость восстановления ДХФИФ определяли по изменению оптической плотности суспензии хлоропластов в .области 600 нм при освещении. Пробы освещали с использованием диапроектора Лектор-600 через тепловой фильтр при постоянном режиме перемешивания. Скорость выделения хлоропластами кислорода измеряли с помощью закрытого кислородного электрода Кларка с тефлоновой мембраной при 20° С и постоянном перемешивании.

.Температурные зависимости теплоемкости образцов регистрирога-ии на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-1М /произгод-;тво СКВ ЕП АН СССР, Пущино/.

Параметр* флуоресценции измеряли на установке, в которо" ис-юльзовали два источника света - измеряющий, источником которого телялась лампа фотовспышки ИФК-120, и действующи!"' /постоянный свет гампы КШ-150/. Измерение выхода постоянной /Ро/ и переменной /Fy/ флуоресценции проводили соответственно при открытых и закрытых реакционных центрах ФС 2. Блокирование реакционных центров®; 2

достигали восстановлением первичного хинонного акцептора при включении действующего света и введении в суспензию хлоропластов диу-рона.

Спектры ЭПР измеряли на радиоспектрометре трехсантиметрового диапазона отражательного типа РЭ-1307 /производство KF НП АН СССР, Черноголовка/.

Хлоропласте,для опытов с применением меченого кальция выделяли из 6-12-дневных проростков гороха, выраженных на кювете с еодо-проводной водой, содержащей ^Са2+/0,6-1,12 мкК/мл/. Суспензию контрольных или обработанных ингибитором хлоропластов /концентрация хлорофилла составляла 100 мкг/мл/ непосредственно после измерения скорости еосстановления ДХФЙФ в пробе центрифугировали при 3C00 g в течение 5 мин и отбирали 0,1 мл супернатанта для счета радиоактивной метки. Содержание радиоактивной метки в пробах определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра Rackbeta / LKB, Швеция/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОВОТДЕНИЕ

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЛОКАЛЬНЫХ АНЕСТЕТИКОВ НА

ФОТОИВДУЦИРОВАННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ В ХЛОРОПЛАСТАХ

В работе были использованы локальные анестетики прокаинового ряда, структурные формулы которых представлены на рис. I. Показано, что введение данных соединений в суспензию хлоропластов приводит к подавлению восстановления ДШФ /табл. I/. 50% уменьшение скорости восстановления ДШ® хлоропластами наблюдается при концентрациях этих веществ соответственно 13, 5,3, 4 и 1,5 мГ.'. Эффективность их ингибирующего действия возрастает в ряду тримекаин ^ди-каин лбензокаинлдибукаин. Следует отметить, что последовательность расположения данных соединений по эффективности ингибирования#Ло-

I

топереноса электронов в хлоропластах соответствует их анестезирующей активности /zingar,Jain,19SO}low et al.,1979/.

Для идентификации участка ингибирукяцего действия местных анес-

Гензокаин

м /с2%

чСоН,

%СГ^ГСН3

2 5

Тримекакн

/СН3 0=С-0-СН?-СН9-Ц

1 * * Ч^Нд

МН-СН2-СН2-СН2-С}^ Дикаин

о=с-мн-сн2-сн2-^ " И

С2%

0-СН2-СН2-СН2-СНз

Дибукаин

Рис. I. Структурные формулы локальных анестетиков

Таблица I

Влияние локальных анестетиков на ("отоперенос электронов в хлоропластах гороха

Соединение Концентрация ДУ/, рызывагоп'.ая 505^ ингибиро-пание

фотопереноса электронов

Е?0—тШй НоО—ФЦб Д'®й-Но—ГВв

Тримекаин Дикаин Бензокаин Дибукаин

13

5,3 4

1,5

13,2

5

4,4 1,7

34, 5 II,? более 10 а

Среда инкубации содержала 0,2 К сахарозу, 40 мМ трис-НС1 /рН 7,Г/, 2 Ш У$1г, Ю м!,' КС1. Концентрация хлорофилла 18 ют Дот. В среду инкубации для измерения активности хлогопластов были гведены: 30 1«кМ ДХ®/а/; 0,2? м!«' ®Ц /б/; 0,5 г.Г КБ, I ».*' зскорбат тетрил, 0,25 к'." ДХ®0, 5 миМ диурон /в/. Скорости восстановления ДХФИФ/а/, выделения кислорода /б/ и погло'.цения кислорода /в/ хлоропласташ в

среде без анестетика составляли соответственно 114, пЗ и 206

тетиков было исследовано их влияние на <£С I с использованием искусственного донора /восстановленного аскорбатом ДФИФ/ и акцептора /кетилвиологена/ электронов этой фотосистемы в условиях блокирования диуроном электронного транспорта rc: ;'.y Ж I и iC 2. Кз приведенных в таблице I данных видно, что уменьшение скорости переноса электронов от ДХЖФ-Н-р к метилвиологену наблюдается при концентрациях исследуемых соединений, намного превышающих концентрации, вызывающие подавление реакций HgO-«••ДМШ и Н^О-^-феррища-нид. В случае дибукаина, например, эти цифры различаются в 5,3 раза. Проведенный эксперимент показывает, что участком ингибирова-ния является ЗС 2.

С целью уточнения участка блокирования локальными 'анестетиками переноса электронов были поставлены опыты с применением искусственного донора электронов К 2 - 1,5-дифенилкарбазида /ДФК/. В суспензию хлоропластов, обработанных анестетиком, вводили ДФК /рис. 2/. Бри этом регистрировали восстановление их электронтран-спортной активности. Однако при введении ДЗ?К скорость восстановления хлоропластами ДХЗ® не достигала 100$, что, по-видимому, связано с уменьшением скорости донирования дифенилкарбазидом электронов iC 2 при щелочных pH среды инкубации /Vernon,Shaw,1969/. На рис. 2 для сравнения приведены аналогичные зависимости для триса, ингибирующего систему разложения воды хлоропластов, которые показывают, что при инактивации хлоропластов трисом введение ДФК также не приводит к увеличению скорости восстановления ДХЙ® до 10056. В другом эксперименте изучали влияние местных анестетиков на реакцию Д$К-*-ДХШФ хлоропластов с инактивироваяной системой разложения воды. Было показано, что участок цепи, обеспечивающий перенос электронов от ДФК к ДХШФ, продолжает функционировать при воздействии на хлоропласты тримекаина и дакаина в концентрациях, полностью блокирующих электронный транспорт НоО-^ДШ®. По-

8

2С0 Трис.Ш 10 Тримекаин.мМ

Рис. 2. Восстановление дифенилкарбазидом активности хлоропластов, обработанных трисом или тримекаином. I - хлоропласта инактивиро-ваны трисом, 2 - % ингибирования активности хлоропластов; 3 - хлоропласта! инактивированы триыекаином, \ - % ингибирования активности хлоропластов. Среда инкубации: 0,2 М сахароза, 40 Ш трис-Ш1 /рН 8,15/, 2 мМ MgCIg, 10 мМ KCI. Концентрация хлорофилла 17 мкг/мл, ДФК - 1,2 wM. Инкубация в темноте при перемешивании с трисом - 5 мин, с тримекаином - 40 с

лученные с применением ДЖ данные свидетельствуют о том, что участок ингибирования локальными анестетиками фотопереноса электронов расположен на донорной стороне ЗС 2.

Таким образом, установлено, что локальные анестетики подавляют фотоперенос электронов в хлоропласта* на уровне ШС 2 и их ингибирующая активность коррелирует с анестезирующей. В то же

время известно, что эти соединения могут влиять на мембранные

р. о.

функции через С а' -зависимые процессы, гатесняя Са /Low et al.,

1979/ или ингибируя калъмодулин /Volpl et.al.,1981/. В этоГ связи, принимая во внимание возможность участия б функционировании ФС 2, ингибироваше локальными анестетитгаги фотопереноса

электронов представляет интерес и было исследовано более подробно.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ, 1« СРВД1 ИНКУБАЦИИ И СВЕТА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНП!БИРОВАНИЯ ЛОЩЬдаИ АНЕСТЕТИКА),"И ПРОЦЕССА ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХЛОРОПЛАСТАШ ДХШ Локальные анестетики прокаинового ряда являются третичными аминами и в зависимости от рН среды заряжены положительно или не несут заряда, поэтому можно ожидать, что ионная сила и рН среды инкубации могут иметь существенное значение для их взаимодействия с хлородласташ. Опыты с варьированием ионной силы среды инкубации хлоропластов добавлением различных солей /табл. 2/ подтвердили данное предположение.

Таблица 2

Влияние ионной силы среды инкубации на степень ингибирования дибукаином процесса восстановления хлоропластами ДХФИФ

Среда инкубации хлоропластов Концентрация дибукаина,мК Ингибирование /%/ активности хлоропластов /н2б-*до®/

рН 7,3 0,2М сахароза,50 к!' фосфат натрия + 150 М NaCI + 300 ыМ NaCI 0,66 17 39 44

рН 7,75 0,2№ сахароза,50мМ фосфат натрия + 100 фосфата натрия + 150 Л фосфата натрия + 200 мМ фосфата натрия 0,33 , 28 67 75 100

рН 7,57 0,2 I,' сахароза, 40 мМ трис + 15 м[/ %С12 + 30 мЫ l/gCIg 0,33 13 20 31

рН 7,94 0,2 М сахароза, 40 мМ трис + ÍI5 мМ ЬЖ1г + 30 mí,' I"gCI2 0,33 45 67 100

Сыена фосфатного буфера на трис /данные не приведены/ практически не влияет на способность дибукаина ингибировать восстановление хлоропластами ДХФИФ, тогда как присутствие в среде инкубации сахарозы стабилизирует хлоропласты против действия анестетика. Из представленных в табл. 2 результатов видно, что эффективность воздействия дибукаина на электронтранспортную активность хлоропластов возрастает при более щелочных значениях рЛ среды инкубации. Степень ингибирования процесса восстановления хлоропластами ДХ®1Ф локальными анестетиками тримекаином и дикаином также возрастает при увеличении рН /рис. 3/.

100-

50 _

Рис. 3. рН-зависикость ингибирующего действия 4,12 ъМ тримекаина /I/, 3,3 кГ дикаина /2/ и 3,3 ыК бензокаина /3/ на процесс восстановления ДХ5КФ хлоропластами. Концентрация хлорофилла 13 мкг/мл. Состав среди инкубации приведен в подписи к рис. 2.

-1-1

7,5 8,0 £,5 pH

При изучении влияния локальных анестетиков на электронный транспорт в митохондриях было установлено, что они разобщают дыхание и фосфорилирование /Garlld,Uakaflhima,l983/.B то же время известно, что разобщители могут подавлять функционирование донорного участка $С 2 в области щелочных pH /Cohen et al.,1975 /. Учитывая эти факты, нельзя исключить возможность подобного механизма инактивации локальными анестетиками $С 2. Однако поскольку неизвестно, могут ли анестетики разобщать окислительно-восстановительные реак-

иии и синтез АТ§ е хлоропласта*, было исследовано влияние малых концентради:.' анестетика на скорость восстановления хлоропластами ДЖПФ. Представленные на рис. 4 данные показывают, что дикаин в концентрациях С,1 -.1 к!.' так ке, как известные разобщители карбо-нклгианид-м-хлор^енилгидразон /С1ССР/ и Nh'^CI, увеличивает скорость восстановления хлоропласта™ ДХ£К$, что пакет свидетельствовать о его разобщавшем влиянии на перенос электронов в хлоропластах. Однако подавление локальными анестетиками функционирования ЭЗ 2 не связано с их разобщающим действием, поскольку при увеличении концентрации анестетика кривые рН-зависимости ингибирования сдвигаются в направлении нейтральных рН /рис. 5/. Кроме того, бен-зокаин, не являющийся разобщителем, эффективно ингибирует реакции $С 2.

I 2 3 I С.мкМ

Рис. 4. Влияние разобщителей С1ССР/1/, НН4С1/3/ и ди-каина/2/ на скорость восстановления хлоропластами Д№®. рН среды инкубации /см. подпись к рис. 2/ 7,4.

Таким образом, зависимость степени ингибирования протонируе-мыми локальными анестетиками фотопереноса электронов от рН не связана с их разобщающим действием. Повышение эффективности воздействия анестетиков на электронный транспорт при более щелочных значениях рН может указывать на зависимость этого процесса от депрото-нирования либо анестетика, либо каких-то функциональных групп мем-

g

Рис. 5. рН-заЕИСимость инги-бирующего действия дикаина

тика: 0,28 /I/, 0,57 /2/, 1,73 /3/ и 3,54 /4/ iî". Концентрация хлорофилла в пробах 19 мкг/мл.

хлоропластш.ш ДХФИФ при различных концентрациях анесте-

на процесс восстановления

8,6 рН

бранных белков. В связи с последним предположением следует отметить, что было показано участие в функционировании донорного участка ЗС 2 аминокислотных групп с рК в области 7,6 /Leszlo et al., 1984/. Однако заряженность этих групп, по-видимому, не влияет на степень ингибирования анестетиками фотохимической активности хло-ропластов, поскольку рН, при котором наблюдается 50Я уменьшение скорости фотопереноса электронов через 2 существенно зависит от концентрации анестетика /рис. 5/. Следовательно,изменение активности заряженных анестетиков при повышении рН связано с их де-протонированием. Б пользу этого вывода свидетельствует и тот ¿акт, что эффективность ингибирования электронного транспорта нейтральным анестетиком бензокаином не зависит от рН среды инкубации хло-ропластов. Известно, что депротонирование анестетика приводит к резкому увеличению коэффициента его распределения ме.жду липидом и водой. Например,- для дикаина эта величина при рН 5,5 и 9,5 соответственно равна 22 и 630 /Boulanger et al.,1980 /. Возможно, что увеличение ингибирующей активности анестетика при депротонировании и обусловлено увеличением его концентрации в мембране. Влияние де-протонирования на содержание анестетика в мембране было рассмотрено на примере взаимодействия дикаина с липосомальными мембранами,

Рис. 6. Влюшие дикаина на температуру фазового перехода ДШХ. Концентрация дикаина : 1-0 мК, 2 - 0,5 Ш,3- 1,5 Ш.

Состав проб: 0,2 К сахароза, 40 1.А' трис-ГС1 /рН 8,31, 2 М 1'вС12> Ю Н31. Концентрация ДШ - 0,6 кг/мл.

На вставке: ^-зависимость влияния дикаина на температуру фазового перехода Д.'ФХ Ат/. I - без дикаина, 2 - +0,5 Ш дикаин.

делитель ^ |»_делитель 1:1 1:2,5

12,5 25 ,град.

сформированными из димиристоилфосфатидилхолина /ДЖ/, с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии. Как видно из рис. б , при увеличении концентрации дикаина в пробе температура фазового перехода ДЬЙХ понижается. Понижение температуры плавления ДМ0( наблюдается также при увеличении рН среды /концентрация дикаина в пробах постоянна, рис. 6, вставка/, что показывает повышение содержания анестетика в липидной фазе при его депротонирова-нии.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение ингибируидей активности локальных анестетиков при повышении рН среды инкубации хлоропластов скорее всего обусловлено увеличением содержания анестетика в мембранах тилакоидов. При этом следует

иметь в виду возможность различной химической активности заряженной и нейтральной форм анестетика, которая может вносить определенный вклад в формирование рН-зависимости ингибирующего действия локальных анестетиков на хлоропласта. Так, например, для триса -гидрофильного амина, было показано, что эффективность воздействия на систему разложения воды его нейтральной формы выше по сравнению с протонироваяной /Yamaehlta, Butler,1969/.

Известно, что скорость развития процесса инактивации хлороп-ластов некоторыми аминами, например, трисом.существенно возрастает на свету /Cbenlae,Martin,1978 /. Поскольку для локальных анестетиков также характерно наличие аминогруппы, было исследовано влияние света на эффективность их ингибирующего действия. Для сравнения скоростей развития процесса инактивации данными соединениями хлоропластов в темноте и на свету была использована различная величина ингибирущей активности нейтральной и заряженной форм анестетика. Скорость восстановления хЛоропластаыи ДХФИФ измеряли после доведения рН среды инкубации до значения, при котором анестетик /в данной концентрации/ не влияет на фотохимическую активность хлоропластов. Как видно из результатов опыта /табл.3 /,в темноте процесс инактивации развивается достаточно медленно - через 2 минуты инкубирования с .5,5 мМ тримекашоы сохраняется около 40% активности хлоропластов и лишь спустя 5 ищут достигается практически полное блокирование электронного транспорта. Тогда как освещение существенно ускоряет инактивацию хлоропластов анестетиками. Так, уже через 30 секунд освещения /в процессе измерения скорости восстановления ДХФИФ в пробе с тримекаином при рН среды 8,5/ достигается такая же степень ингибирования анестетиком электронного транспорта - 94%, как и при пятиминутной обработке в Темноте. Эти результаты свидетельствуют о фотосенсибилизации процесса инактивации локальными анестетиками переноса электронов в хло-

Таблица 3

Ингибирование тримекаином процесса восстановления хлоропластами ДХФИФ в зависимости от времени инкубации с анестетиком при

снижении рН среды

Время Активность хлоропластов /Н^ОДХ®^/,^ Образец инкубации рН е>5 рН е,5->7,2

Контроль 10 с 100 89

+5,5 мМ тримекаин б 109

Контроль 2 мин 100 100

+5,5 Ш. тримекаин 0 41

Контроль 5 мин 100 87-

+5,5 1.4' тримекаин 0 6

Состав среды инкубации: 0,2 М сахароза, 40 мМ'трис-НС1, 2 ьК МвС1£, Ю Ш КС1. Концентрация хлорофилла 23,5 мкг/мл. Хлороплас-ты, суспендированные в среде с рН 8,5 инкубировали в темноте с тримекаином или без анестетика в течение указанного в таблице времени, после чего определяли активность хлоропластов либо без изменения рН среды, либо после доведения рН до величины 7,2.

ропластах. Также следует отметить, что анестетики эффективнее действуют на электронтранспортнуи активность хлоропластов, подвергнутых предварительному, даже кратковременному - в течение 30 секунд, освещению, чем адаптированных к темноте.

Как было указано выше, степень инактивирования хлоропластов тримекаином повышается с увеличением времени инкубации. Не исключено, что это может быть связано с ингибированием помимо донорного участка £С 2 других участков цепи переноса электронов. С целью проверки такой возможности было исследовано восстановление дифе-нилкарбазидом активности хлоропластов в зависимости от длительности их обработки тримекаином. Результаты опыта показали, что при

введении в..суспензию хлоропластов искусственного донора 3С 2 - ДЕК наблюдается реактивация хлоропластов, причем скорость восстановления ДХФКФ в присутствии ДФК не зависит от длительности их инкубации с тримекаином и степени подавления переноса электронов ^0 ДХФИФ. Эти данные показывают, что анестетик и при увеличении вре-

мени инкубации не подавляет функционирование акцепторного участка 5С 2.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЛОКАЛЬНЫХ АНЕСТЕТИКОВ НА ШХОД ШСТРОИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И СИГНАЛ ЭПР Ils ХЛОРОПЛАСТОВ

Известно, что ингибирование §С 2 при выращивании клеток сине-зеленых водорослей Anaoystia nldulana в среде, не содержащей Са^+ /Brand et al., 1983 /»или их обработке хелатором двухвалентных катионов этилендиаминтетраацетатом /Piatorlus,Schmid,1984 / сопровождается подавлением переменной флуоресценции клеток. Уменьшение выхода переменной флуоресценции было зарегистрировано также при добавлении антагонистов кальмодулина в суспензию хлоропластов шпината и клеток хлореллы /ЧаморовскиЯ.ДОаторин, 1Г64/.

Как уже указывалось выше, в литературе рассматриваются два

возможных механизма влияния местных анестетиков на» мембранные про-

р,

цессы : модификация ими липидной фазы или воздействие на Са'-связывающие компоненты. В связи с этим для выяснения механизма инактивации локальными анестетиками ®С 2 было исследовано их влияние на выход быстрой /постоянной Fo и переменной Pv/ флуоресценции хлоропластов.

Представленные на рис. 7 зависимости показывают, что при увеличении концентрации анестетика в суспензии Fo меняется весьма незначительно, тогда как Fv быстро уменьшается до нулевого значения, причем наблюдается корреляция ингибироваиия процесса восстановления хлоропластами ДХ®$ и снижения выхода переменной флуоресценции. Концентрации дикаина, при которых наблюдается ГС-% уменьшение скорости восстановления ДЖ1Ф и амплитуды переменной флуоресценции, практически совпадают и равны I ьМ.

Поскольку эффективность подавления местными анестетиками электронтранспортной активности хлоропластов возрастает с увели-1ением рН,было исследовано влияние рН среды инкубации на выход

АЛ600'°/о i F' отн-ед-

Рис. 7. Зависимость выхода постоянной Ро /I/ и переменно:"' Ру /2/ флуоресценции и активности /Т^О^ДХЗКФ/ хлоропластов/3/ от концентрации дикаина. рН среды инкубации 6,45» концентрация хлорофилла 5 гкг/мл

60

40

I

2

3

с,

флуоресценции обработанных дикаином хлоропластов. Опыт показал, что в интервале рН, где отмечается ингибирующее влияние дикаина на процесс восстановления хлоропластами ДЙИ®, выход Fv уменьшается.

Таким образом, ингибирование локальными анестетиками электронного транспорта сопровождается уменьшением Fv. В этом отношении их действие аналогично влиянию на хлоропласты антагонистов кальмо-дулина /Чаморовский, Ыаторин, 1564/.

В процессе исследования взаимодействия данных соединений с хлоропластами было обнаружено, что при введении локального анестетика дикаина и антагониста калькодулина хлорпромазина в суспензию наблюдается уменьшение амплитуды сигнала ЗПР Ils хлоропластов. Этот сигнал индуцируется окисленной формой компонента D , дониру-ющего электрон непосредственно РСЕ0+ /Воиввас,Etienne,1982/, который, по-видимому, не участвует в линеГ;ном транспорте электронов от воды /Takahashl,styrlng, 1987 /. Исчезновение сигнала ЗПР На показывает, что дикаин и хлорпромазин вызывают дестабилизацию долго-гивучего радикала D* , которкГ при этом быстро восстанавливается.

Интересно, что при обработке хлоропластов дикаином и хлорпро-мазином одновременно с уменьшением амплитуда сигнала ЗПР Ils наблюдается ингибирование процесса восстановления хлоропластами ДХФИФ /рис. 6/. ПолученныГ: результат свидетельствует о том, что

"'о

Хлорп£оь£зин,»К Дикаин, Ш

Рис. £. Влияние хлоупрсмгзпна и дкпаглс. ка г.гплитуду сигнала ЭПР 11а/I/ к скорость восстановления хлороплсстагк /2/.

рН среды инкубации/состав ск. в пр-пгвчеики к табл. р/ г пробпх с хлорпроказкиок 7,0, с дикаином - £,4. Концентрация гсяороГшгас б образцах для регистрации сигнала 3IF Ils составляла 4,Г кг/т, в проба:: для определения скорости восстаноЕленкг хдоропласташ ДХЯЛФ - Х£ ккг/кл. Хлоропласта /1С0 ют/кл/ обрр.баташаяксь реагентом в течение I мин, затем суспензию делили на две пробы, концентрацию хлорофилла в которых доводили до необходимых значений:.

подавление данными соединениями линейного переноса электронов на донорном участке ЗС 2 сопровождается воздействием на альтернативный донор электронов Р6£0+-D.. Справедливо предположить, что прерывание дикаином и. хлорпромазином линейного переноса электронов от воды скорее всего происходит на уровне переносчика z, природа и окружение которого аналогичны D /Debua et al., 1988 /. Подавление дикаином и хлорпромазином переменной флуоресценции хлоропластов монет свидетельствовать в пользу такой созмссшости, поскольку подобного эффекта не наблюдается При действии триса - ингибитора кис-пород-выделяющей системы, что предполагает инактивацию этими соединениями различных участков цепи переноса электронов на окисляющей зтороне $С 2.

Полученные результаты в совокупности с возможным Сас -зпвнсиют механизмом действия локальных анестетиков и антагонистов кгльгоду-

лина на хлоропласты могут свидетельствовать в пользу участия кальция в обеспечении функционирования компонентов Z и D. Интересно в связи с этим отметить, что для выращенных в не содержащей кальция среде клеток Anacyatls nldulans характерно уменьшение амплитуды сигнала ЭПР Не , соответствующего переносчику Z/Brand, Becker 1984/.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЫЫХ АНЕСТЕТИКОВ НА СОДЕРЖАЩИЙСЯ В

ТИЛАКОИДШХ МЕМБРАНАХ КАЛЬЦИЙ В предыдущей главе было показано, что ингибирование локальными анестетиками фотопереноса электронов через ЗС 2, так же как инактивация ЗС 2 обработанных антагонистами кальмодулина хлоропластов шпината /Чаморовский.Маторин, 1984/ или выращенных в среде р.

с недостатком Ca сине-зеленых водорослей Anacyatls nldulans /Brand et al., 198?/ сопровождается подавлением переменной флуоресценции. Эти данные предполагают, что инактивация локальными анестетиками хлоропластов может быть опосредована их влиянием на Са^+-зависимые процессы ЗС 2.

Известно, что локальные анестетики вытесняют кальций из мембран эритроцитов /low et al., 1979/. Можно предположить, что взаимодействие этих соединений с фотосинтетическими мембранами также сопровождается вытеснением кальция. С целью проверки возможности такого механизма влияния анестетиков на тилакоидные мембраны было исследовано содержание кальция в среде инкубации контрольных хлоропластов и подвергнутых обработке локальными анестетиками.

Опыты проводили на хлоропластах, которые ввделяли из листьев проростков гороха, выращенных на среде, содержащей Суспен-

зию обработанных анестетиком или контрольных хлоропластов непосредственно после измерения скорости восстановления в пробе ДХЗ® осаждали и определяли содержание в супернатанте радиоактивной метки. Как видно из результатов опыта, представленных на рис. 8,

Рис. 8.Зависимость активности /HgO-^flX®®/ хлоропластов /I/ и содержания в среде/2/

инкубации от концентрации ди-каина. Концентрация хлорофилла ТОО vkt/мл. pH среды инкубации /состав см. в подписи к табл.3/ 8,5.

инактивация дикаином фотопереноса электровоз сопровождается увеличением концентрации меченого кальция в среде инкубации. Выход "Цза^ в среду инкубации, по-видимому, обусловлен его высвобождением из мембран тилакоидов, а не увеличением их проницаемости для этого катиона, поскольку при инактивации дикаином хлоропластов, подвергнутых осмотическому шоку, также наблюдается увеличение содержания 45Са2+ в среде.

При повышении рН среды инкубации ингибирущая активность анестетика возрастает, что соответствует увеличению эффективности вытеснения анестетиком кальция из мембран хлоропластов.

Для того, чтобы выяснить, насколько специфична способность локальных анестетиков вытеснять кальций из тилакоиднкх мембран, было исследовано влияние других ингибиторов 5С 2 на содержание радиоактивной метки в среде инкубации хлоропластов, выделенных из троростков гороха, которые были выращены на содержащей сре-

Было показано, что при инактивации хлоропластов трисом и гид-зоксилашном, подавляющими функционирование системы разложения во-щ, а таете линоленовой кислотой, прерывающей поток электронов на (онорном и акцепторном участках ЗС 2, увеличения содержания

Дикаин, Ш

в среде инкубации не наблюдается.

При инактивации ®С 2 на уровне системы разложения воды нагреванием суспензии хлоропластов до 50-55°С содержание 4%а2+в среде инкубации практически не меняется. При дальнейшем нагревании суспензии регистрируется увеличение концентрации радиоактивной метки в среде. Резкий подъем вверх кривая температурной зависимости выхода претерпевает в диапазоне температур £0-95°, где наблюдаются эндотермические структурные переходы Ш 2. Причем в основе формирования одного из них лежат процессу термоденатурации полипептида 01 реакционного центра ЗС 2 /Ананиева, 198В/. Резкое увеличение выхода кальция из мембран тилакоидов при нагревании суспензии до температур, при которых происходит денатурация компонентов 2С 2, в частности, полипептида находится в соответствии с возможной ролью кальция в функционировании переносчиков ъ и и , которые как известно, являются остатками тирозина полипептидов 1)1 и 1)2 реакционного центра $С 2 /йеЪив еЪ а1.,1988/.

Таким образом, проведенные исследования показали, что подавление локальными анестетиками переноса электронов на донорном участке 2 сопровождается вытеснением кальция из тилакоидных мембран

р.

хлоропластов, что является свидетельством в пользу Са -опосредованного механизма.ингибирующего действия анестетиков, а, следовательно, участия кальция в обеспечении функционирования донорного участка 2 вблизи реакционного центра.

ШВ0Д1

I. Исследовано влияние локальных анестетиков прокаинового ряда на хлоропласта. Установлено, что данные соединения ингибируют фотоиндуцированный перенос электронов на донорном участке 5С 2. Эффективность инактивации исследованными веществами хлоропластов возрастает в ряду тримекаин \дикаин \бензокаин лдибукаин, которй соответствует последовательности расположения этих соединений по

степени подавления проведения возбуждения по нервному волокну.

2. Эффективность ингибирования локальными анестетиками транспорта электронов возрастает при увеличении рН среды инкубации хлоропластов, что связано с депротонированием анестетика и его переходом в нейтральную форму.

Обнаружено, что локальные анестетики могут оказывать разобщающее действие на электронный транспорт.

3. Показано, что локальные анестетики уменьшают выход переменной флуоресценции хлоропластов. Причем, концентрационные и рН-зависимости действия этих соединений на уровень переменной флуоресценции коррелируют с соответствующими зависимостями их влияния на фотохимическую активность хлоропластов.

5. Установлено, что ингибирование локальным анестетиком дика-ином и антагонистом кальмодулина хлорпромазином процесса восстановления хлоропластами ДХЗ® сопровождается уменьшением амплитуды сигнала ЭПР На.

6. Показано, что подавление локальными анестетиками фотопере-юса электронов сопровождается выходом кальция из мембран тилако-одов.

Инактивация ЗС 2 такими ингибиторами как трис, гидроксиламин, шноленовая кислота или тепловой обработкой суспензии хлоропластов ге приводит к высвобождению кальция из тилакоидных мембран.

7. Совокупность полученных в работе данных свидетельствует в гользу участия кальция в обеспечении,фотопереноса электронов на до-горном участке Ш 2.

По теме диссертации опубликованы работы:

I. Семин Б.К., Чудиновских М.Н., Иванов И.И. Изучение влияния юкальных анестетиков на транспорт электронов в хлоропластах горо-:а. Биохимия, 15£б, т.51, вып. 4, с. 546-552.

-242. Чудиновских I-'.H. Изучение механизма ингибирования локальными анестетиками электронного транспорта в хлоропластах. В сб.: Проблемы современной биологии. Тр. 17 научн. конф. мол. ученых биол. фак. 1'ГУ. М., 1986, ч. 3, с. 2-5. Деп. в ВИНИТИ I5.09.C6, W 6662-В.

3. Семин Б.К., Чудиновских 1.1.Н., Иванов И.И. Изучение механизма ингибирования локальными анестетиками транспорта электронов на донорном участке КН. Биохимия, 19Б7, т.52, вып. Е, с. 1279 -1285.

4. Чудиновских ?".Н., Кауров Ю.Н., Семин Б.К., Иванов И.И. Исследование теркоустойчирости электронного транспорта в iCII мембран термофильных цианобактерий. Физиология растений, 1987, т. 34, вып. 6, с. 1073-1076.

5. Семин Б.К., Лядский В.В., Чудиновских М.Н., Венедиктов П.С., Иванов И.И. Влияние локальных анестетиков на выход быстрой /Ро/ и переменной /Ру/ флуоресценции хлоропластов. Биофизика, 1988, т. 33, вып. 3, с. -448-451.

6. Семин Б.К., Чудиновских М.Н., Тимофеев К.Н., Иванов И.И.

р.

Влияние соединений, взаимодействующих с Ca -связывающими участками на сигнал Не хлоропластов гороха. Биофизика, 1986, т. 33, вып. 5, с. 809-811.

7. Ивашнева М.Н., Семин Б.К., Иванов И.И. Роль Са2+ в структурно-функциональной организации донорного участка фотосистемы II.-Успехи современной биологии, 1989, т. I06i вып. 3, с. 340-346.

8. Semin В.К., Tehudinoveklch M.Ii., Ivanov I.I. Local aneet-

hetic-induced inhibition of chloroplast electron transport. Gen.

198S' "

Подписано в печать 2.02.90 г. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Зак. № 1582. Изд. № 9162

Формат 60X 90 '/,6.

ПМБ ЦИНТИхимнефтемаша