Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые биохимические и ультраструктурные особенности пластид пластомных мутантов подсолнечника

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые биохимические и ультраструктурные особенности пластид пластомных мутантов подсолнечника"

государственный комитет рсфср по делам науки и высшей школы

ростовский ордена трудового красного знамени государственный университет

Специализированный совет К 063.52.09

На правах рукописи

ТАРАН Сергей Фомич

НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЛАСТИД ПЛАСТОМНЫХ МУТАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1991

Работа выполнена в отделе молекулярной генетики НИИ Биологии Ростовского ордена Трудового Красного Знамепи государственного университета.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

зав. отделом молекулярной генетики ¡Ю.Д.Белецкий] /Росгов-на-Дону/

Официальные оппоненты: член-корреспондевт АН БСССР, зав. лаб. биохимии и биотехнологии ин-та Экспериментальной ботаники АН БСССР В.Н.Решетншсов кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 'НПО "Дон"

А.К.Сулейманов

Ведущая организация: ордена Ленина Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.

Защита диссертации состоится "24" декабря 1991г. на заседании специализированного совета К 063.52.09 в Ростовском государственном университете /г.Ростов-на-Дону, • ул.Энгельса, 105, »уд. 304, в 14.00/. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГУ.

Автореферат разослан

1991г.

Ученый секретарь ,

специализированного совета, доктор биологичемких наук

В.Н.Кирой

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Управление процессом фотосинтеза представляет собой одну из центральных задач, стоящих перед биологической наукой, для решения которой в первую очередь необходимо всестороннее знание организации фотосинтетического аппарата. Наряду с исключительно важной ролью, которую играют хлоропласты в фотосинтезе, они осуществляют также синтез белка, аминокислот, биосинтез жирных кислот и фосфолипидов, конечные стадии ассимиляции азота и серы.

Хлоропласты имеют собственную генетическую систему и способны мутировать. Как следствие, пластидные мутации могут определять различные структурно-функциональные изменения аппарата пластид и в целом клетки. Поэтому пластидные.мутации являются прекрасными моделями для исследования структуры и функции генома хлоропластов, различных сторон пластидно-ядерных взаимоотношений /Hagemann, 1980; Белецкий, 1989/. Нельзя недооценивать роль пластидных мутаций в решении задач генетики фотосинтеза и устойчивости растений к абиотическим факторам внешней среды.

Долгое время четких и воспроизводимых способов искусственного получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении. Следует отметить, что у водорослей, например у Chlamydomonas, индукция пластидных мутаций не вызывает особых затруднений /A.D. Blowers et al., 1989/. Сложившаяся ситуация тормозила развитие теоретических исследований в области генетики высших растений и делала невозможным широкое использование в практике пластидных мутантов с повышенными фотрсиитетической активностью и устойчивостью к экстремальным воздействиям.

В течение ряда лет в отделе генетики Научно-исследовательского института биологии Ростовского университета под руководством Ю.Д. Белецкого проводились исследования'индуцированной изменчивости хлоропластов у подсолнечника. Впервые в мире была доказана возможность индукции мутаций пластид при помощи Ы-нитрозо-М-метилмочевины. Эти работы получили высокую оценку в мировой науке /Белецкий, 1989/. В дальнейшем способность НММ реагировать с наследственным материалом хлоропластов была подтверждена рядом исследователей /Pohlheim, 1974/. В нашей стране работы по индукции и биохимической

- ¿ - •'

характеристике пластидных мутаций ведутся в единичных лабораториях.

В настоящее время в отделе генетики имеется коллекция пластом-ных мутантов подсолнечника, с помощью которой изучаются механизмы образования пластомных мутаций. Индуцированные нластидные мутанты подсолнечника используются для решения многих теоретических проблем, в частности, такой важной, как проблемы пласгидно-ядерных взаимоотношений, и в практических целях, например, для повышения устойчивости растений к стрессовым факторам (засоление, засуха, химические соединения и т.д.).

К началу наших исследований для ряда мутантов подсолнечника, в i ом числе использованных нами, была доказана с помощью гибридологического анализа и других методов пласгомная природа мутаций. Было установлено, что пластиды оказывают влияние на функциональную активность ядерных генов. В то же время биохимические и ультраструк-тур1<ые исследования пластид оставались фрагментарными. Не был изучен лолипептидный состав тилакоидных мембран пластид подсолнечника, который, как нам казалось, мог дать объяснение обнаруженным резким ультраструктурным изменениям пластид у бесхлорофилльных пластомных мутантов подсолнечника.

Цчль и задачи исследования. Перед нами была поставлена задача -исследовать биохимические и ультраструктурные особенности пластид ряда жизнеспособных и летальных мутантов подсолнечника, попытаться выявить те изменения структуры и функций пластид, которые определяются непосредственно изменением в хпДНК. Подобная работа на коллекции пластомных мутантов подсолнечника была проведена впервые.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие экспериментальные задачи: "

- определить содержание хлорофиллов и параметры фотосинтетической активности у пластомных мутантов подсолнечника;- изучить ультраструктуру мутантных пластид пластомных мутантов

подсолнечника;

- определить коэффициент седиментации рибосом в гомогенатах листьев пластомных мутантов подсолнечника;

- исследовать высокомолекулярную рРНК из 70S и 80S рибосом пластомных пестролистных линий подсолнечника методом диск-электрофореза;

- определить удельную активность РБФКО у пластомных пестролист» их мутантов подсолнечника;

- исследовать полипептидный состав тилакоидных мембран пластид пластомных мутантов подсолнечника "методом диск-электрофореза в присутствии ДДС-Na.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено сравнительное биохимическое исследование ряда жизнеспособных и летальных пластомных мутантов подсолнечника. Показано, что жизнеспособные мутанты Chlortaa по ряду изученных биохимических показателей сходны. То же самое справедливо и для изученных пестролистных мутантов. Таким образом, биохимические данные подтверждают классификацию мутантов на типы Chlorina и пестролистные, основанную на фенотипических и генетических признаках.

Показано, что наряду с резким нарушением уровня накопления зеленых пигментов, у пластомных мутантов значительно нарушена, по сравнению с контролем, ультраструктура пластид. Тем не менее, пластиды содержат физиологически активные рибосомы, о чем можно судить по удельной активности РБФКО в мутантных пластидах листьев подсолнечника, поскольку известно, что большая субъединица РБФКО кодируется хцЦНК и синтезируется на 70S рибосомах.

Впервые изучен состав белков 70S рибосом подсолнечника. Показано, что пластомные мутации подсолнечника могут подавлять экспрессию рибосомных генов и вызывать изменения в структуре аппарата трансляции (рибосом).

Показано, что мутация в пластидном геноме, являющаяся причиной хлорофиллыюго дефекта, не вызывает изменений в составе, полипептидов органельного происхождения. Однако, вызванное мутацией нарушение структуры и функций хлоропласта, по-видимому, блокирует синтез пластидных факторов, участвующих в регуляции активности ядерных генов, кодирующих полипептиды светособирающего Хл а!в-белкового комплекса.

Сравнительное биохимическое исследование коллекции пластомных мутантов позволяет глубже понять сложные взаимосвязи, имеющие мес-' то в биогенезе и функционировании хлоропластов. Среди исследуемых и других мутантов коллекции подсолнечника, имеющейся в отделе генетики НИБИ РГУ, есть формы, обладающие хозяйственно-ценными признаками. Так, например, мутант'en-chlorina-5 является засухоустойчивым, а мутант en-chlorina-З и en-chlorina-1 - солеустойчивым. Сравнительный биохимический анализ мутантов позволяет дать характеристику состояния их пластидного аппарата, что является ценным при выяснении

в дальнейшем причин, по которым эти мутанты имеют хозяйственное значение.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены ца "IV Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров им. Н.И, Вавилова" /г.Кишинев, 1982/, на "IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки" /г. Тбилиси, 1985/, на Всесоюзной конференции "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций - новые направления в мутагенезе растений" /г. Вильнюс, 1986/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит - таблиц и /э рисунков. Список цитируемой литературы включает наименований, из которых иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектами исследования в данной работе служили пластиды пластомных хлорофилльных мутантов подсолнечника. Б работ» исследовали три мутанта типа СЫоппа и четыре пестролистные линии, индуцированные ранее с помощью китрозометилмочевины.

Электронная микроскопия пластид подсолнечника. Электронно-микроскопическое исследование структуры пластид проводили по /Прихо-женко и др., 1979/. Применяли глутарр-осмиевую фиксацию тканей листа с последующим обезвоживанием и заключением в эпйново-аралдито-вые блоки. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме УМТП-4 и исследовали в электронном микроскопе "Те51а - ВБ - 242Е".

Определение содержания хлорофиллов и фотосинтетической активности пластид/ Содержание хлорофиллов определяли спектрофото-метрически в 85-%-ном ацетоне по методике /Гавриленко и др., 1975/. Степень поглощения света пигментами регистрировали на спектрофотометре "5ресо1 - 10" /ГДР/. Измерения фотосинтетической активности проводили методами ЭПР и замедленной флуоресценции /Тимофеев и др., 1969; Маторин и др., 1978/.

Выделение пластид из листовой ткани. Выделение пластид из ли-гового материала проводили методом дифференциального центрифуги-ования. Навеску листьев гомогенизировали на холоде в среде следую--его состава: 0,4М сахароза; 0,02М-трис-НС1 рН 8,0; 0.006М 2-мер-аптоэтанол; 0.008М диэтилдитиокарбамат-Ка. Соотношение среды го-огенезации и веса листьев 3:1. Профильтрованный через гидробиоло-гаеский газ гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 500 q ля удаления ядерной фракции и обломков клеток. Хлоропласта и ждали центрифугированием при 2500 q 20 минут.

Методы исследования пластидных рибосом. Седиментацию 70S и OS рибосом исследовали в аналитической ультрацентрифуге Спинко Е, отор АнД при 42040 об/мин при температуре 20°С. Листья гомогени-«ровали в 0,01М К-фос.фатном буфере, рН 7,5 /вес:объем, 1:0,5/ и рофильтро ванный гомогенат подвергали аналитическому ультрацент-ифугированию.

Суммарный препарат высокомолекулярной рРНК выделяли из лис-ьев и пластид методом фенольной депротеинизации /Кулаева, 1970/. ,иск-электрофоретическое разделение высокомолекулярной рРНК про-эдили по Ленингу /Loening, 1967/.

Экстракцию рибосомных белков проводили из 70S рибосом с по-ощью 3 М LiCl в присутствии 6 М мочевины. Электрофорез белков в [ААГ в первом направлении был по Мартини и Гоулд /Martini and tould, 1971/, а во втором направлении по Лэммли /Laemmli, 1970/.

Методы исследования белков тплакоидных мембран. Для определе-ия удельной активности РБФКО растворимые белки (где РБФКО со-гавляет 50/% белка) выделяли гомогенизацией листьев 2-кратным объ-мом 0,1М-трис-НС1-буфера рН 8,0, содержащем 0,2М NaCl, 0,5 мМ ДТА, 0,01 М MgCl и 0,006 М 2-меркаптоэтанол. Гомогенат центрифу-1ровали при 20000 q в течение 30 минут при 4 °С. Супернатант ис-ользовалй в качестве препарата РБФКО без хранения. Определение дельной активности РБФКО проводили радиометрическим методом Романова и др., 1980/.

Для выделения полипептидов тилакоидных мембран хлоропласты азрушали осмотическим шоком в среде: 0,01М-трис-НС1, рН 8,0 1%-ый 2-меркаптоэтанол. Суспензию центрифугировали при 20000 q 30 инут. Осадок мембранной фракции один раз промывали средой и важды бидистиллированной водой.

Растворимые белки пластид, содержащиеся в надосадочной жидкости после осмотического шока пластид, осаждали 50%-ным ацетоцом. Далее проводили с шша те же операции, что и с мембранными белками.

Мембранную фракцию пластид солюбилизировали 0,0625М-трис-НС1 буфером рН 6,8, содержащим 0,5%-ный 2-меркаптоэтанол и 2-%-иый додецилсульфат-Ка. Мембранные полипептиды фракционировали при помощи диск-электрофореза по методу Лэммли /ЬаегатН, 1970/.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Содержание хлорофиллов и параметры фотосинтетической активности у пласгомных мутантов подсолнечннка

Исследуемые мутанты различаются между собой в фенотипе окра-скол листьев. Прежде всего это обусловлено сниженным содержанием зелечых пигментов. Результаты определения содержания хлорофиллов в листьях подсолнечника приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Содержание хлорофиллов в листьях подсолнечника и его пласгомных мутантов.

Объек-исследования Хл, м'г на 1 г абс. сухого веса Процент от контроля Хл, мг на 1 г абс. сухого веса Процент от контроля Хл,+Хл, мг на 1 г абс. сухого веса Хл,/Хл.

Линия 3629 5,35 100 2,17 100 - 7,52 2,46

еп-сЫ-1 4,96 92,7 2,13 98,2 7,09 2,32

еп-сЫ-6 3,58 •66,9 1,56 71,9 5,14 2,29

еп-сЫ-5 2,47 46,2 1,18 • 54,4 3,65 2,10

2-22 0,13 2,4 0,16 7,4 0,29 0,81

2-24 0,08 1,5 0,16 7,4 0,24 0,53

2-25 0,18 3,4 0,24 11,1 0,42 0,76

2-42 0,12 2,2 0,19 8,8 0,31 0,62

<и 5:

Б

Сэ

сГ

С: §

¿с

м

3

1мин

а 5 ■ г о

Рис. 1. Сигналы ЭПР хлоропластов (А) п индуцированные кривые замедленной флуоресценции листьев (Б) подсолнечника

Стрелками обозначены моменты включения (|) и выключения (|) света

- исхпдная .'пшнн 31:29; П — —мутанты г/<* сЫгтгю !, ел: сЫогЬпа-Ъ соответственно

Как видно из таблицы, содержание Хл, и Хл, и отношение Хл,/Хл, у мутанта еп-сЫог1па-1 близко к исходной линии 3629. У мутанта еп-сЫолпа-6 содержание Хл, и Хл, снижено на 30%, а у са-сЫопаа-З снижено на 50%. В то же время соотношение Хл,/Хл, в сравнении с исходной линией 3629 изменяется ва 7% у ея-сЫолла-6 и на 25% у еп-сЫоппа-5. Из таблицы видно, что уменьшение содержания хлорофиллов айву мутантов типа СЫоппа от их содержания в листьях нормальных растений происходит почти пропорционально.

Измерение сигналов ЭПР1 показали, что в хлоропластах исследуемых мутантов наблюдается нормальный фотоиндуцированный сигнал ЭПР1, ассоциируемый с фотоокисленной формой Р700 (рис. 1л). Параметры замедленной флуоресценции в листьях этих мутантов были подобны параметрам эамедлепной флуоресценции в листьях линии 3629 (рис. 1.6). Это свидетельствует о том, что у изученных мутантов не нарушено функционирование реакционных центров ФС I и II. Несколько пониженная фотосинтетическая активность наблюдалась у мутанта еп-сЫоп'па-5, что, вероятно, связано с более низким содержанием хлорофилла у этого мутанта.

В желтых участках листьев пестролистных мутантов, как видно и: таблицы 1, обнаруживаются лишь следы зеленых пегментов. У мутанто! 2-22, 2-24, 2-25 и 2-42 содержание Хл, ч Хл, не превышает 3-10% о-содержания у исходной линии 3629. Это не позволило измерить сигна лы ЭПР1 и замедленной флуоресценции у пластомных пестролистны; мутантов подсолнечника.

3.2. Ультраструктура мутантных пластид пластомных мутантов под солнечника

Электронно-микроскопическое исследование показало, что в клет ках настоящих листьев подсолнечника линии 3629 содержатся овальны или линзообразные хлоропласта, диаметр которых по длинной оси со ставляет 5,48 + 0,38 мкм. Тонкая структура этих пластид типична дл хлоропластов высших растений: они окружены хорошо выраженно двойной мембраной и имеют развитую 'ламеллярпую систему, предстаЕ ленную ламеллами гран и ламеллами стромы (рис. 2.а). В довольн плотном мелкозернистом матриксе хлоропластов имеются электроннс прозрачные участки, в которых видны рибосомоподобные частицы и кс роткие ДНК-содержащие фибриллы. На срезах хлоропластов подсолнс ника видны зерна крахмала, которые локализованы внутри электронш

Рис. 2. Ультраструктура хлоропластов на срезах клеток листьев подсолнечника

а - исходная линия 3629; б - мутанты еп: сМог1па-1, еп: сЫог1па-5, еп: сЫоНпа-б соответственно

прозрачных участках матрикса. Осмиофильные глобулы немногочислен-ны.В клетках листьев мутантов еа-сЫоппа-1 (рис. 2.6), еп-сЫог!па-5 (рис. 2.в) и еп-сЫоппа-б (рис. 2.г) содержатся овальные хлоропласта, диаметр которых по длинной оси составляет 5,9 + 0,33 мкм, 4,8 + 0,38 мкм и 4,3 + 0,16 мкм соответственно. Хлоропласт имеют развитую ла-меллярную систему, представленную ламеллами граи и ламеллами стро-мы. Общая структурная организация хлоропластов у этих мутантов имеет ряд различий по сравнению со структурой хлоропласшв линии 3629 (рис. 2.а). К таким различиям относятся обнаруживаемые у этих мутантов вакуолизация некоторых ламелл и общая дезорганизация в расположении ламеллярной системы (мембранная система имеет в основном эксцентрическое расположение).

Следует отметить, что аналогичные изменения ультраструктуры хлоропластов мутанта еп-сЫог1па-5 наблюдали другие авторы при выращивании растений в полевых условиях /Белецкий а др., 1981/.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что во внутренней структуре пластид пестролистных мутантов 2-25 и 2-42 имеются лишь слабо развитые 'тилакоиды стромы, граны отсутствуют (рис. З.а). Строма пластид мелкозернистая, но менее плотная для электронов, чем у исходной линии 3629. В матриксе видны прозрачные для электронов участки с ДН К-содержащими фибриллами. Зерна крахмала отсутствуют, но много осмиофильных глобул, которые отражают нарушения образования мембранной системы.

Для мутантов 2-22 и 2-24 характерны пластиды с еще большим изменением внутренней структуры (рис. З.б). Мелкозернистая строма пластид ещё менее плотная для электронов чем у мутаитоЬ 2-25 и 2-42. Тилаковдных структур практически нет. В пластидах наблюдаются вакуоли и осУтофильные глобулы. Тем не менее пластиды, что очень важно, содержат рибосомы.

Исследуемые нами пластомные мутанты СМогШа содержат пониженное содержание хлорофиллов, а пестролистные мутанты содержат лишь следы зеленых пигментов.-При этом наблюдаются глубокие изменения ультраструктуры пластид. Образование тилакоидной системы в хлоропластах и синтез хлорофилла тесно взаимосвязаны. Уоддингтон считает это хорошим примером обратной связи - наличие пигмента необходимо для образования специфической мембранной структуры, а эта структура необходима для непрерывного синтеза хлорофилла /Уоддингтон, 1964/.

Рис. 3. Ультраструктура пластид на срезах клеток листьев подсолнечника

А - мутанты 2-25 я 2-42; Б - мутанты 2-22 и 2-24

- и -

3.3. Аналитическое ультрацентрифугирование 70S и 80S рибосом из гомогенатов листьев пластомных мутантов подсолнечника

Как было установлено, мутэнтные пластиды содержат рибосомы. Нами по данным нескольких опытов было определено относительное содержание 70S рибосом. При аналитическом ультрацентрифугировании гомогенатов листьев подсолнечника линии 3629 и мутантов en-chiorina-1, en-chlorina-5, en-chlorina-6 было обнаружено, что они содержат два типа рибосом (80S и 70S). Относительное содержание 70S рибосом хло-

(70 S V

70S + 805 составлает У линии 3629 н мутантов

сшогша, сп-chlorina-l, еп-сп1ог1па-5 в en-chlorina-б 41,6; 41,2; 30,5 и 37,5% соответственно.

Таким образом, у мутанта en-chlorina-5 содержание 70S рибосом понижено в среднем на 25% по сравнению с линией 3629.

Аналитическое центрифугирование гомогенатов мутантных желтых лнстьев подсолнечника показало, что у мутантов 2-22, 2-24, 2-25 и 2-42 относительное содержание .70S рибосом составляет 39,9; 40,5; 31,8; 28,7 соответственно. При этом у мутантов 2-25 и 2-42 оно снижено по сравнению с линией 3629 на 25%. Интересно, что у мутантов 2-22 и 224 относительное содержание 70S рибосом близко к контрольному, хотя на электронно-микроскопических снимках видно, что строма пластид мутантов значительно менее плотная, чем пластид контрольной линии 3629. Тогда для мутантов 2-22 и 2-24 сохранение Соотношения

Í 705 \

705 + 805 1001 веР°ЯТН0 можно объяснять предположив, что у,мутантов пропорционально сниженному количеству 70S рибосом снижено количество 80S рибосом.

В литературе описан ряд внеядерных хлорофилльных мутантов высших растений и водорослей, характеризующихся пониженным содержанием или отсутствием 70S рибосом /Borner, 1985/. Так у желтых мутантов Chlamydomonas reinhardu У-27 и У-28 с материнским характером наследования содержание '70S рибосом снижено на 30-40% /Oyurjan et al., 1979/. Каким образом за счет мутацйи происходит уменьшение числа 70S рибосом неизвестно. По-видимому, при Зтом происходит подавление экспрессии каких-то хлоропластных генов (например, генов рРНК, рлбосомпых белков, мембранносвязанной РНК-полимеразы). Таким образом, у внеядерных мутантов подсолнечника наряду с пониженным содержанием хлорофилла наблюдается пониженное содержание рибосом. Эти факты побудили яяс к дальнейшим исследованиям.

3.4. Двумерный электрофорез в ГГДАГ белков 70S рибосом пластомных мутантов en-chlorina-1, en-cfalorina-5, en-chlorina-б подсолнечника

У пластомных мутантов en-chlorina-1, en-chIorina-5 и'en-chlorina-б подсолнечника изучали распределение белков 70S рибосом при двумерном электрофорезе в ПААГ. Это важно еще и потому, что рибосомы хлоропластов подсолнечника не изучены. Ничего не было известно о числе и свойстзах рибосомных белков.

В препаратах 70S рибосом подсолнечника было обнаружено 60 белков при двумерном электрофорезе в ПААГ (рис. 4). Ранее методом двумерного электрофореза было показано, что рибосомы других видов высших растений - шпината, табака, гороха - содержат 56-67 белков /Удалова и др., 1982, 1984/, тогда как у рибосом Escherichia coli насчитывается 52 белка. Следовательно, по Числу белков рибосомы хлоропластов, являясь частицами прокариотического типа, по числу белков несколько отличаются от бактериального типа рибосом.

По интенсивности окрашивания красителем пятна белков значительно отличаются друг от друга. Так, белки 2, 16, 35, 44, 46, 54, 59 наиболее интенсивно окрашиваются красителем Кумасси R-250. Белки 6, 9, 11-13, 25-27, 29, 39, 45, 47, 50, 57, 58 слабо окрашены. Интенсивность окрашивания и расположение белков в препаратах рибосом исходной линии подсолнечника и всех мутантов сохраняются постоянно от опыта к опыту. Относительная молекулярная масса рибосомных белков подсолнечника соответствует 11,5-57 кДа.

Следует отметить, что у Escherichia coli самый высокомолекулярный белок имеет молекулярную массу 61 кДа, а для рибосом хлоропластов, выделенных из разных видов высших растепий, значение молекулярных масс варьирует от 51 до 40 кДа. Несмотря на то, что самый высокомолекулярный белок рибосом хлоропластов высших растений имеет более низкое значение молекулярной массы, чем белок рибосом бактерий, доля высокомолекулярных белков (молекулярная масса > 45 кДа) выше у рибосом хлоропластов, чем у рибосом Escherichia coli: 7 и 1 белок соответственно.

Большая часть белков рибосом подсолнечника имеет молекулярную массу в интервале 12-42 к Да. Сходное распределение белков по молекулярной массе наблюдается для рибосом хлоропластов гороха - 1140 кДа и табака - 10-35 кДа /Удалова и др., 1984/. Средняя молекулярная масса рибосомных белков хлоропластов подсолнечника 26,9 кДа.

- м -

0

© ,-:--- 0

| Старт

I

©

Ни. шею/

тоо —--- г 1

шм —-- <р'

3 cS®e£ ° о".

V00B —- ты —- Щг

Рис. 4. Распределение белков 70S рибосом подсолнечника

при двумерном электрофорезе в ПААГ 1-е направление: 4%-ный по акрнламвду гель, рН 4,3 4ч; 15%-выйпоакриламиду гель, рН 8,3 9ч

Таким образом, по интенсивности окрашивания красителем, числу, молекулярной массе, характеру распределения белков на электрофореграм-ме белки рибосом хлоропластов подсолнечника сходны с рибосомами пластид других высших растений.

Сравнительное исследование белков рибосом хлоропластов внеядер-ных мутантов подсолнечника и рибосом хлоропластов исходной липии 3629 не позволило обнаружить различий между ними у мутантов еп-chlorina-1 и en-chlorina-б и лишь у мутанта en-chlorina-5 были обнаружены различия в составе белков аппарата трансляции. Так, белки 36 и 38 с молекулярными массами 20 и 19 кДа соответственно окрашены менее интенсивно и, по-видимому, присутствуют в рибосоме в более низкой концентрации, чем у исходной линии 3629. Эти .белки отмечены на рис. 4. Пониженное содержание двух рибосомных белков в рибосомах хлоропластов мутанта подсолнечника en-chlorina-5 и неменделеевский характер наследования мутации могут указывать на то, что эти белки кодируются хлоропластным геномом.

Поскольку мутант en-chlorina-5 характеризуется повышенной засухоустойчивостью и может использоваться для селекционной работы, детальное исследование аппарата трансляции и экспрессии генома хлоропластов этого мутанта представляет большой интерес.

У пластомных пестролистных линий 2-22, 2-24, 2-25 и 2-42 изу чить состав рибосомных белков не удалось в силу технических причин, и в первую очередь того, что необходимо было нарастить 2-3 кг молодых мугантных листьев. А это выполнить практически невозможно.

3.5. Диск-электрофоретическос исследование высокомолекулярной рРНК из 70S и 80S рибосом пластомных пестролистных линий 2-22, 2-24, 2-25 п 2-42 подсолнечника

У пестролистных линий изучали спектр высокомолекулярной рРНК 70S рибосом. Примененный йами метод позволяет отделять высокомолекулярную рРНК от низкомолекулярной. Недеград^рованная высокомолекулярная рРНК в использованных условиях делится на четыре зоны (рне. 5). Зопы" I п III соответствую^ 25S и 18S рРНК цитошшзматтгче-ских 80S рибосом. Зопы II и IV соответствуют 23S н 16S рРНК пла-стидных 70S рибосом /Loening et al., 1967/. Денситограммы суммарного препарата высокомолекулярной рРНК (рис. 5) были идентичны как для контрольной липии 3629, так и пестролистных линпй 2-22, 2-24, 2-25, 2-42.

Рис. 5. Деиситограммы высокомолекулярной рРНК их зеленых и чутантных тканей подсолнечника при электрофорезе в 2,5%-ном ПААГ

А - компоненты рРНК суммарного препарата рРНК листьев; Б - компоненты рРНК из препаратов изолированных хлоропластов 1-258,II-238,111-188, IV - 16Б

- Í7 -

Идентичность спектров рРНК наблюдалась и при электрофоретиче-ском разделении высокомолекулярной рРНК, выделенной из препаратов осмотически разрушенных хлоропластов как линии 3629, так и ее мутантов 2-22, 2-24, 2-25, 2-42. В спектре рРНК были обнаружены только зоны И и IV, которые соответствуют 23S и I6S рРНК пластндных 70S рибосом (рис. 5).

Таким образом, выделение и фракционирование высокомолекулярных рибонуклеиновых кислот пластомных мутантов 2-22, 2-24, 2-25, 2-42 подсолнечника не обнаружило существенных качественных отличий от исходной инбредной линии 3629.

3.6. Удельная активность РБФКО у пластомных мутантов 2-22, 224, 2-25, 2-42 подсолнечника

Наличие рРНК и рибосом в мутантных пластидах еще не свидетельствует о том, что в органальных рибосомах осуществляется биосинтез белка. Для решения этого вопроса в мутантных тканях определяли активность РБФ-карбоксилазы, большая субьединица которой кодируется пластомом. Результаты определения активности РБФ-карбоксилазы показали, что в тканях пластомных мутантов она колеблется, снижаясь в большей или меньшей степени у различных мутантов, несмотря на одинаковое' по фенотипу выражение хлорофилльной мутации. Наиболее значительно активность фермента уменьшена у мутантов 2-22 и 2-24:

ЛИНИЯ Активности мкмоль/мин на мг белка

3629 0,36 + 0,04

• 2-42 0,25 + 0,03 '

2-25 0,18 + 0,03

2-24 . 0,02 + 0,005

2-22 > 0.0Í +0,003

Известно, что фракция. белка, имеющая РБФ-карбоксвлазную активность, составляет в норме 50% всех растворимых белков растительного организма. РБФ-карбоксилаза характеризуется высокой молекулярной массой, превышающей 5.00 кДа. В соответствии с этим можно было полагать, что наиболее выраженная по мощности белковая зона на электрофореграмме должна представлять собой РБФКО. Радиометрический анализ белка, элюированного из кусочков геля, соответствующих этой зоне, показал наличие РБФ-карбоксилазной активности как у линии 3629, так и у мутантов 2-22, 2-24, 2-25, 2-42.

- if- -

Полученные результаты подтверждают, что исследуемые мутанты, хотя и в меньшей степени, чем зеленая линия, синтезируют РБФКО.' Поскольку большая субъединица этого фермента синтезируется на пла-стидных рибосомах, можно сделать вывод, что рибосомы 70S в мутант-ных пластидах функционируют. Более того, важно, что пластоген, определяющий структуру большой субьединицы этого фермента, функционально активен.

В последнее время для ряда видов растений (кукуруза, шпинат, табак, ослинник я т. д.) построены физические карты хлоропластной ДНК, на которых локализованы гены рРНК и большой субъединицы РБФК. Принципиальных отличий в организации наследственной информации в зависимости от объекта не обнаружено. Это дает основание имееющиеся по структуре и функции хлоропластной ДНК данные переносить и на подсолнечник.

Наличие у мутантов высокомолекулярной пластидной рРНК и РБФ-карбохсилазы свидетельствует о том, что гены рРНК и большой субьединицы фермента в мутантном пластидном геноме функционируют. Поэтому можно сделать вывод, что анализируемые нами мутации не представляют собой крупных делецнй в тех участках пластидного генома, где локализованы данные гены. С другой стороны изменения в хлоропластной ДНК могут быть различными точковыми мутациями, затрагивающими синтез большой субьединицы РБФК и рРНК. В этом случае должен образовываться менее активный фер мент или меньшее количество нормального фермента, что установлено нами для анализируемых мутантов. Часто обнаруживаемое нарушение структуры хлоропластов 'является вторичным и очень трудно разграничить причину и следствие /Уоддиштон,196^/. Возможно поэтому и другое объяснение - меньшее количество РБФК у мутантов обусловлено наличием сложных регуля-торных связей, имеющих место в^ процессе функционирования пластид.

3.7. Диск-злектрофорепгаеское исследование, в присутствии ДДС-Na, тилакоядиых мембран хлоропластов пластомных мутантов подсолнечника

. Пониженное содержание хлорофилла в н в, уменьшение активности РБФК и глубокое нарушение ультраструктуры пластид пластомных мутантов подсолнечника, побудило нас к исследованию тилакоидных мембран пластид.

Btaoa

чзопо

, пива

13700

Рис. 6. Распределение полипептидов гилакоидчых мембран при электрофорезе в ПААГ + ДДС-Na

Хл,Б1 - Хл,-белховый комплекс ФСI; ХлАБ1 - Хл,-апобелок ФСI; Хл,АБ2 - Хл,-айЬбелок ФС И; Хл,/р2 - светособирающий, Хл,/_- белковый комплекс; Хл,/ДБ2 - светособирающий Хл,л- апобелок; а—е- CF, - субьедигощы внешнего компонента сопрягающего фактора; СР0 - мембранный компонент Сопрягающего фактора. Слева - оаспределение белков-маркеров а - линия 3629; о-г - мутанты en-chlorina 1, en-chlorina 5, en-chlorina б

18000

чзаао

гюоо

13700

т*

»¿1 "

б . в С

О

ВС РВГК

МСРБФК I

© ;

Ряс. 7. Распределение полипептидов растворимой фракции хлоро пластов

при электрофорезе в ПААГ + ДДС - N8 а - линия 3629; б-г - мутанты еп-сЫоНпа 1, еп-сЫоНпа 5, еп-сЫоппа 6, ВС - большая субъединица РБФК, МС - малая субъединица РБФК

Полипептидный состав тилакоидов пластид высших растений достаточно хорошо изучен. Тилакоидные мембраны фотосинтезирующих организмов содержат пять крупных надмолекулярных комплексов: ФС1 и ФСИ, светособирающий комплекс, комплекс цптохромов и АТФ-сян-тетазный комплекс. С помощью диск-электрофореза в присутствии ДДС-Na н других методов, определены молекулярные массы полипептидов тилакоидных мембран. Такое состояние проблемы позволяет довольно уверенно локализовать полнпептиды того или иного комплекса тилакоидных мембран на электрофореграммах диск-электрофореза в присутствии ДДС-Na. Этой возможностью мы и воспользовались в своей работе.

Полипептидный состав тилакоидных мембран пластид исходной линии 3629 был типичен для хлоропластов высших растений. В использо-вапных нами условиях среди полипептидов тилакоидов пластид обнаруживалось 36-39 компонентов (рис. 6). Среди мембранных белков были найдены полнпептиды, соответствовавшие по молекулярно-весовым характеристикам хлоро филл-белковому комплексу, содержащему реакционный центр ФС1, сопрягающему фактору I, хлорофилл-белковому комплексу, содержащему реакционный центр ФСН, и светособираюхцему Хл-й/( белковому комплексу (рис. 6).

В электрофоргтических профилях распределения полипептндов тилакоидов пластид мутантов en-chlorlna-1, en-chIorlna-5, en-chlorlna-б и линии 3629 различий обнаружено не было. Профили распределеппя белков растворимой фракции хлоропластов изучепных мутантов и липии 3629 при электрофорезе в ПААГ 4 ДДС-Na также, были качествен-, по сходными. Во всех случаях обнаруживалось 50-57 компонентов, причем наиболее интенсивно были, окрашены полосы, соответствовавшие субъедшшцам РБФК, имевшие Молекулярную массу 55 и 13 кДа (рис. 7). Как известно, РБФ-карбоксилаза оксигеназа - основной водорастворимый белок хлоропластов, на.долю которого приходится до 50% растворимых белкой листьев, как можно заметить, у мутантов еп-chlorina-1, en-chlorina-5, en-chlorina-6 интенсивность полос, соответствующих субъединицам РБФК, не уменьшена по' сравнению с линией 3629 (рис. 7). Напротив, у мутантов 2-22, 2-24, 2-25 и 2-42, интенсивность полос, соответствующих субъединицам РБФК резко уменьшена (рис. 8), что хорошо согласуется с данными, полученными при исследовании удельной активности РБФК.

©

■ч • . : |

I

• г д,

Рис. 8. Распределение полипептидов растворимой фракции хлоропластов при электрофорезе в ПААГ + ДДС - N8

а - линия 3629; б-д - мутанты 2-22, 2-24, 2-25 и 2-42

БС - большая субьединица РБФК, МО - малая субъединшм РБФК

Ф"

-Хла Б1

-Хла ЛЕ1

- £ СР,

- Р

- Ч,

- 'ла М-_ V СР(

-Чч/в ы .Ч/в

-Хла/В Ы

- ХСРд

е ср;

©

а-б.

Рис. 9. Распределение полипептидов тилакоидных мембран при электрофорезе в ПААГ + ДДС - Ыа

а-б - линия 3629; в-е - мутанты 2-22,2-24, 2-25, 2-42 Стрелкой указаны белки с молекулярной массой 25 кДа и 23 кДа

Мутанты 2-22, 2-24, 2-25, 2-42 по профилю распределения полипептидов мембран пластид от контрольной линии 3629 отличаются изменениями в полипептидах светособирающего Хл,/;-белкового комплекса. В профиле распределения пептидов наблюдали отсутствие белка с молекулярной массой 23 кДа,. Полипептид с молекулярной массой 25 кДа у мутантов дробился на две менее интенсивные полосы, хотя на электрофоре^амме контрольной линии 3629 он представлен одной интенсивной полосой (рис. 9). Хлорофилльный мутант с подобными нарушениями полипептидов тилакоидных мембран пластид описан у кукурузы Гоп-кинсом с соавторами /Hopkins et al., 1980/. У этого мутаита отсутствуют полипептиды с молекулярной массой 23 и 25 кДа при резком нарушении внутренней структуры пластид.

Так как мутанты 2-22, 2-23, 2-25, и 2-42 являются по фенотипу беолорофилльными, то было логичным предположить о влиянии отсут-ствил хлорофиллов на полученные полипептидные изменения профиля тилаюидных мембран. В связи с этим исследовали спектр мембранных полипептидов пластид этиолированных проростков линии 3629. В данном случае наблюдалось лишь уменьшение интенсивности окрашенных белковых полос с молекулярной массой 21-29 кДа. Это значит, что отсутствие полипептида с молекулярной массой 23 кДа у мутантов не обусловлено внешними факторами, а является результатом мутационных изменений.

Полипептиды с молекулярной массой 23 и 25 кДа принадлежат светособирающему Хл^ -белковому комплексу и кодируются ядром, а нменно мультигенным семейством cab - генов /Polacco et al., 1987/.

Из полученных результатов следует два вывода. Во-первых исследование спектра мембранных белков мутантных пластид подсолнечника не позволило выявить изменений, определяемых дейстнием конститутивных пластид генов. Для решения проблемы генполипептид в данном.случае необходимо дальнейшее углубленное исследование мутантов. Во-вторых, очевидно, что пластидная мутация влияет на ССК ФСН путем изменения механизмов регуляции.

Природа регуляторных факторов, участвующих в транскрипции генов светособирающего Хл^ -белкового комплекса при освещении в настоящее время интенсивно изучается. Предполагается, например, что для оптимальной транскрипции данных генов необходим сигнал хлоропласт-ного происхождения /Burgess et al., 1988/. Фотоокислительное разрушение хлоропласта, обработанного норфлуразоном, сопровождается мру-

шением формирования данного сигнала с вытекающими отсюда последствиями в отношении генов, кодирующих полипептиды комплекса. При устранении внешней причины, вызвавшей фотоокисление хлоропласта, транскрипционная активность ядерных генов восстанавливается /Schuster et al., 1988/.

Очевидно, что у исследованных нами мутантов нарушен синтез пластидных факторов, регулирующих активность ядерных генов свето-собирающего Хл,/е-белкового комплекса.

Таким образом, мутация в пластидном геноме, являющаяся причиной хлорофилльного дефекта, не вызывает изменений полипептидов ор-ганельного происхождения, входящих в структурные белки пластид.

ВЫВОДЫ

1. Изучены некоторые биохимические характеристики пластид трех жизнеспособных и четырех пестролистных пластомных мутантов подсолнечника. Показано, что у жизнеспособных мутантов типа Chlorina понижено содержание хлорофиллов а н в. Функционирование реакционных центров ФС I и II не нарушено. Пластомные пестролистные, мутанты подсолнечника содержат Следовые количества зеленых пигментов.

2. Обнаружены, в зависимости от типа мутации, различные ультраструктурные изменения мутантных пластид по сравнению с контрольной линией подсолнечника. В хлорошшстах мутантов типа Chlorina наблюдается вакуолизация некоторых ламелл и общая дезорганизацня в расположении ламеллярной системы. У пестролистных линий мутантные пластиды сильно вакуолизированы и имеют слабо развитые тилакоиды стромы. Гранальные структуры отсутствуют.

3. Проведено сравнительное исследование, белков рибосом хлороп-ластов подсолнечника и его пластомных мутантов Chlorina. У мутанта en-chlorina-5 обнаружено пониженное содержание двух рибосомных белков. Эти данные позволяют предполагать, что- они кодируются геномом хлоропластов.

4. Показано, что полипептидный состав тилакоидных мембран мутантных пластид типичен для высших растений. В исползованных нами экспериментальных условиях в тилакоидах выявлено 36-39 компонентов, а в растворимой фракции мутантных пластид 50-57 компонентов.

5. Электр офоретические профили распределения полипептидов ти-лакоидов пластид мутантов типа СЫоппа и контрольной линии, подсолнечника одинаковы. Пестролистные мутанты по профилю распределения мембранных полипептидов отличаются от контрольной ливни изменениями в полипептидах светособирающего Хл ^-белкового комплекса ФС II. Таким образом, исследование спектра мембранных белков мутан-тных пластид подсолнечника не выявило изменений, определяемых действием конститутивных пластидных генов. По-видимому, пластидная мутация влияет на транскрипцию волипептидов кодируемого ядром светособирающего комплекса опосредованно, путем изменения регуляторных механизмов.

6. Данные, полученные в настоящей работе, позволяют предполагать, что нитрозометилмочевина, с помощью которой были индуцированы изученные мутации, не вызывает значительных изменений в структуре хлоропластного генома.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пластидная рРНК и ультраструктура пластид у пластомных мутантов подсолнечника /Э.Я.Прихоженко/, - // IV съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Тез. докл. -Кишинев,- 1982 - т.З, с.206.

2. рРНК, активность РБФ карбоксилазы и ультраструктура пластид у пластомных желтых мутантов подсолнечника /Э.Я.Прихоженко, Г.М.Мелконов, Ю.Д.Белецкий/. - // Физиология растений. - 1985 -т.32, N3, с.456-460.

3. Выяснение первичного эффекта пластидной мутации у. подсолнечника / А.В.Усатов /. - // Всесоюзная межуниверситетская конференция по биологии клетки. Тез. докл. - Тбилиси - 1985 - Труды конф., с.684-685.

4. Белки рибосом хлоропластов внеядерных мутантов подсолнечника / Г.В.Удалова, Н.П.Юрина, Ю.Д.Белецкий, М.С.Одинцова /. - // доклады АН СССР - 1986. * т.286, N1/ с.209-212.

5. Анализ природы летальных пластомных мутаций подсолнечника индуцированных К-нитрозо-М-метилмочевиной / Э.Я.Прихо-

-женко. Ю.Д.Белецкий /. - // Межвузовский сборник "Исследования по генетике" - Ленинград - 1986. - N10, с.126-130.

6. Биохимический анализ природы пластццных мутаций подсолнечника, индуцированных Ы-нитрозо-Ы-метилмочевиной /. - // Всес.конф. "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций - новые направления в мутагенезе растений (эукариотов)" -Тез. докл. - Вильнюс - 1986 - с,79.

7. Использование диэтилдитиокарбамата натрия для экстрагирования нативных белков и ферментов из тканей подсолнечника / Н.С.Ко-локолова, Е.Б.Иванова, Р.М.Кесслер /. - // Физиология и биохимия культурных растений. - 1987. - т.19, N3, с.289-293.

8. Структура и функции хлоропластов у жизнеспособных пластом-ных мутантов подсолнечника / М.С.Турищева, Ю.Д.Белецкий, Г.Г.Белкина, М.С.Одиицова /. - // Физиология растений. - 1987 - т.34, N6, с.1097-1102.

Подписано к печати 15Л С. VJ г. Осп ом Г,5 п.л, Тграж ПО зкз. Заказ 512. Офсетная печать РКП ПГ'О "(¿'.геология".