Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация мутагенного эффекта нитрозометилмочевины ингибиторами синтеза белка и РНК

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Модификация мутагенного эффекта нитрозометилмочевины ингибиторами синтеза белка и РНК"

РГ6 ол

2 ^ 14 рр На правах рукописи

МАШКИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

МОДИФИКАЦИЯ МУТАГЕННОГО ЭФФЕКТА НИТРОЗОИЕТИЛМОЧЕВИНЫ ИНГИБИТОРАМИ СИНТЕЗА БЕЛКА И РНК

03.00.15 - генетика

03,00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1997

Работа выполнена в НИИ Биологии Ростовского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Е.П.Гуськов

Научный консультант: кандидат биологических наук,

с.н.с. Р.М.Кесслер

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.А.Митрофанов (Институт биологии развития им.Кольцова, Москва) кандидат биологических наук, доцент В.С.Лысенко (Ростовский государственный педагогический университет)

Ведущая организация: ' - Воронежский

Государственный университет

Защита состоитсяj4-P. . декабря 1997г. на заседании специализированного совета Д 063.52.08 по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344006 г.Ростов-на-Дону, ул.Большая Садовая, 105, ауд 203 в Р.. часов).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГ: (344Q06, г.Ростов-на-Дону, уд. Пушкинская, 14В).

Автореферат разослан " // " ноября 1997 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук, профессор

Т.И. Бондаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблены. Процессы жизнедеятельности растительной клетки осуществляются в результате согласованного функционирования генома ядра и цитоплазматических факторов наследственности. Открытие хлоропластной ДНК более 30 лет назад привлекло особое внинание к изучению вопроса о роли пластома в регуляции процессов развития и жизнедеятельности целостного растительного организма. В геноме хло-ропластов на настоящий момент идентифицировано около 100 генов, кодирующих белки аппарата транскрипции-трансляции пластид, белки, принимающие участие в процессах фотосинтеза. Хлоропластный геном в значительной степени определяет устойчивость растений к различным сгрессорннм воздействиям. Внутривидовая цитоплазматическая изменчивость может существенно влиять на продуктивность растений, их устойчивость к возбудителям заболеваний, а также на частоту маркерных признаков в гибридных популяциях растений.

Пластидные нутации являются прекрасными моделями для изучения пластидно-ядерных взаимоотношений, например, принципов координации и регуляции экспрессии хлоропластных и ядерных генов б процессе биогенеза пластид. Открытие Ю.Д.Белецким (1969) способа направленного получения пластомных мутантов сделало возможным всестороннее изучение пластид как полуавтономных генетических систем растительной клетки. В то же время индукция лластидных мутаций позволяет раскрыть механизмы химического мутагенеза, решить проблемы некоторых разделов биохимии и физиологии растений.

В настоящее время в отделе генетики НИИ биологии РГУ создана коллекция пластомных мутантов подсолнечника и горчицы. Пластидная природа индуцированных мутаций была доказана результатами гибридологического анализа. Но ранее проведенный сравнительный анализ ряда пластомных мутантов подсолнечника не выявил существенных различий по некоторым биохимическим и молекулярным характеристикам по сравнению с исходной инбредной линией (Таран С., 1991; Усатов А.,1993). В качестве индуктора.пластидных мутаций был использован супермутаген Ы-нитрозо-И-метилмочевина (НММ). Несмотря на то, что первые пластомные мутанты подсолнечника были индуцированы 30 лет назад, механизм действия НИМ до сих пор не ясен. Возможным подходом к изучению пластидного мутагенеза является модифицирование условий для

индукции мутаций.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось изучение возможности модификации мутагенного эффекта НММ разобщителем дыхания и окислительного фос-форилирования 2,4-динитрофенолом и ингибитором хлоропластной РНК-полимеразы рифампицином, а также сравнительный цитогенетичес-кий, биохимический и молекулярный анализ ряда пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных НММ.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи : ,

- определить эффективность индукции НММ хлорофилльных мутантов подсолнечника в зависимости от времени действия 2,4-динитрофенола илк рифампицина;

- привести доказательства пластидной природы индуцированных НММ хлорофилльных мутантов подсолнечника,- провести сравнительный анализ устойчивости к НММ инбредной

зеленой линии 3 629 и ряда пластомных мутантов подсолнечника;

- исследовать активность антиоксидантных ферментов и содержание малонового диальдегида в тканях хлорофилльних мутантов подсолнечника ;

- провести сравнительный рестрикционный анализ хлоропластной ДНК исходной линии 3629 и ряда пластомных мутантов подсолнечника.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мутагенный эффект НММ может быть модифицирован ингибиторами метаболизма, в частности 2,4-динитрофенолом и рифампицином. Частота индуцированных мутантов подсолнечника и их природа зависят от времени действия вещества модификатора.

2. Пластомные мутанты подсолнечника более чувствительны к действию низких концентраций НММ на ранних сроках фиксации, однако характеризуются более стабильным клеточным циклом.

3. Природа индуцированных пластидных мутантов подсолнечника может быть обусловлена крупными делециями в молекулах хлоропластной ДНК.

4. Активность антиоксидантных ферментов и содержание малонового диальдегида в тканях пластомных мутантов подсолнечника достоверно отличаются от этих же показателей для исходной линии 3629.

Научная новизна результатов исследования. Впервые определены эффективные временные отрезки модификации мутагенного эффекта НММ

ингибиторами метаболизма. Показано, что в течение первых 6 часов роста проростки подсолнечника наиболее восприимчивы к действию внешнего стрессорного фактора. Природа индуцируемых мутаций в определенной степени зависит от времени действия вещества-модификатора.

Показано, что тшастомный мутант сЫогапа-5 и ядерно-цитоплаз-матический мутант сЬ1ог1па-12 более чувствительны к низким дозам нитрозометилмочевинн на ранних сроках фиксации по сравнению с линией 3629; однако данные линии характеризуются более стабильным клеточным циклом.

Впервые получены достоверные отличия активности антиоксидант-них ферментов и содержания малонового диальдегида в тканях ряда индуцированных пластомкых и ядерно-цитоплазматичесхих мутантов подсолнечника по сравнению с исходной линией 3629.

С помощью рестрикционного анализа показано, что природа индуцированных НММ пластидных мутаций подсолнечника может быть обусловлена крупными делениями в хлоропластной ДНК.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты экспериментов распирявт представления о механизмах образования пластидных мутаций. Показано, что эффективность индуцированного пластидного мутагенеза зависит от состояния белоксинтезирующей системы растительной клетки. Выявлены наиболее чувствительные временные интервалы онтогенеза подсолнечника для модификации мутагенного эффекта НММ, что может служить основой для получения пластидных мутаций у других видов высших растений. Маркированные на уровне фенотипа пласгомные мутанты могут служить материалом для исследования механизмов участия пластсма в детерминации межгеномных взаимодействий при формировании морфологических, биохимических признаков и свойств растений. Целесообразно их использование для решения проблем теории мутагенеза, генетики фотосинтеза и экологической генетики. Пластомные мутанты могут быть использованы как исходный матери- ал селекции для получения форм, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, возбудителям заболеваний.

Апробация работа. Материалы диссертации доложены на научной сессии биояого-почвенного факультета РГУ (1994, 1996), на 3 Европейском симпозиуме по биотехнологии подсолнечника (Германия, октябрь 1995), на VI Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, сентябрь 1997).

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 3 научных работы.

Сруктура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками. Работа состоит из зведения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения,.выводов, списка литературы, включающего 65 отечественных и 112 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использовали линии подсолнечника Helianthus ап-rmus из. коллекции отдела молекулярной^генетики НИИ биологии РГУ: исходная инбредная линия 362 9, пластидный хлорофилльный мутант Chlorina-5 и ядерно-цитоплазматический мутант Chlorina-12. Семена подсолнечника линии 3629 предварительно замачивали в анаэробных условиях в течение 18 часов. Прорастающие семена обрабатывали в чашках Петри раствором НММ в концентрации 0,015% в комбинации с разобщителем дыхания и окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофено-

лом (ДНФ) (5*10~SM) или ингибитором хлоропластной РНК-полимеразы _ р

рифампицином (Р) (10 М). Обработку НММ проводили в течение 3 часов с'12 до 15 часов после начала проращивания семян. ДНФ и Р применяли в следующие временные интервалы: 0-6, 6-12, 0-12, 12-18 и 15-21ч с начала проращивания семян. Обработанные и контрольные проростки подсолнечника промывали в проточной воде, после чего высевали в полевых условиях. Определяли частоту хлорофилльных мутантов подсолнечника в М2. Для выяснения генетической природы хлорофилльных мутантов проводили реципрокные скрещивания мутантов с исходной линией 3629.

Дитогенетический анализ проводили на керистематической зоне зародышевых корешков. Материал фиксировали в смеси спирта и уксусной кислоты (3:1) в различные сроки после обработки. Перестройки хромосом учитывали анафазным методом: на временных давленных препаратах, окрашенных молочноуксусным орсеином. В каждом варианте просматривали около 1000 анафаз, для определения митотического индекса - около 4000 клеток.

Для проведения биохимических исследований готовили гомогенаты-корешков и листьев. Материал растирали в фарфоровых ступках , центрифугировали и супернатант использовали в дальнейших исследованиях.

Определение активности каталазы проводили по метод/ Королюк И.А. и др.(1988). Метод основан на способности Н2О2 образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Определение суммарной пероксидаэной активности проводили по методу Бояркина А.Н. (1987). Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бенлидина под действием пероксида-зы. Метод определения малонового"диальдегида основан на способности вторичного продукта перекисного окисления липидов при высокой температуре в кислой среде реагировать с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного тринетинового комплекса. Хемилюнинесцент-ный анализ проводили на установке, собранной в НИИ биологии, хеми-люминометре-ЛМ1.

Выделение пластид и хлоропластной ДНК из листового материала проводили методом дифференциального центрифугирования. Рестрикцию хлоропластной ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя ("Fermentas", Литва). Для анализа хлоропластной ДНК использовали Bam HI, Bgl I, EcoRI, Hind III, Pst I, Pvu II эндонуклеазы рестрикции. Фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в горизонтальном 1% агарозном геле.

Статистическую обработку материала проводили по t-критерию Стьюдента (Владимирский, 1983). Резко отклоняющиеся наблюдения отбрасывали с использованием критерия Шовене (Кокунин, 1975). Различия считали достоверными при значениях р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из данных литературы известно, что мутагенный эффект алкилиру-ющих веществ может быть модифицирован соединениями, влияющими на различные стороны обмена веществ, в частности, на синтез макромолекул и энергетический статус клеток. В этой связи нами был поставлен эксперимент, оценивающий кластогенный эффект рифампицина и 2,4-ди-нитрофенола отдельно и в комбинации с НММ в концентрации 0,015%. Поскольку эффективное время индукции мутаций лежит в интервале 12-15 часов после начала прорастания зародыша, предобработка модифицирующими агентами была проведена в течение 6-12 часов от начала роста. Ни одно из этих соединений в используемых концентрациях не изменяет спонтанный уровень перестроек хромосом в клетках корневой меристемы проростков подсолнечника. Однако комбинированная обработ-

ка НММ с ДНФ или Р достоверно увеличивает уровень аберраций хромосом по сравнению с контролем и действием одного мутагена. Наибольшее число перестроек хромосом после обработки рифампицином с НММ зафиксировано через 12 часов после окончания воздействия мутагена. К 36 часам после действия мутагена уровень аберраций постепенно снижается, оставаясь достоверно выше контрольных значений. ДНФ с НММ индуцируют максимальное число йЗср только через 36 часов после окончания обработки.

Как Р так и ДНФ в используемых концентрациях не индуцируют генетических изменений у подсолнечника. Ни в одном из вариантов опыта не было зарегистрировано растений с измененным содержанием пигментов как в Мх так»и в М2. * В то же время НИМ индуцирует пестролист-ность уже в Мх с частотой 2,4% (1994 год) (табл.1) и 8% (1995 год) (табл.2). При этом выживаемость растений снижена по сравнению с контролем на 25-28%. Пестролистные формы отмечены практически во всех вариантах комбинированной обработки проростков подсолнечника НММ с веществом-модификатором.

Так как часть пестролистных растений Мх могла быть представлена морфозами, определяли частоту хлорофилльных мутантов в М2. Анализ растений М2 1995 года выявил некоторые различия в распределении типов хлорофилльных мутантов. В то время как Р в комбинации с мутагеном, подобно одной НММ, индуцирует все типы хлорофилльных мутаций, в вариантах обработки ДНФ-НММ жизнеспособные мутанты представлены только растениями типа с211огз.па (табл.1).

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что предобработка Р и ДНФ> усиливает эффект НММ, увеличивая количество хлорофилльных мутантов, часть которых может оказаться ядерными , а не пл'астидными.

Анализ растений М2 1996 года показал несколько иную картину (табл.2). В вариантах предобработки с ДНФ не обнаружено ни одного хлорофилльного мутанта в И^. Число мутантных форм в вариантах предобработки Р значительно ниже по сравнению с 1995 годом. В то же время отмечены хлорофилльные мутанты в вариантах действия ДНФ или Р одновременно с НММ и после обработки мутагеном.

'Различия по годам по частоте хлорофилльных мутантов могут быть связаны с влиянием условий вегетации на проявление мутаций. Любая мутация проходит стадию первичных потенциальных изменений, которые в зависимости от внутриклеточных и внешних условий могут либо реа-

Таблица 1.

Частота хлорофилльных мутаций подсолнечника, индуцированных нитро-эометилмочевиной в комбинации с 2,4-динитрофенолом и рифампицином 1994—1.995гг. , (в процентах, М±т)

1 ) вариант выжи пестрые выжи 1 всего му-| пестр. 1 ¡chlorina 1 летали |

| опыта ваек формы Mi ваек таций м2 I н2,% 1 м2,% м2,% |

1 1 мх,% % М2, Mim ( 1 1

1 ) Р0_б-НММ 58,7 2,3 60, 8 7 ,2±3,09*| 2,9 1 I 1,4 2,9 |

|Рб_12-НММ 53,3 2,5 54, 4 2 ,7±1,89 j 2,7 1 о 0 |

(Po-12-НММ 49,3 0 70 2 , 811,97 ( 0 1 1,4 1-4 j

|Р12-18-НММ 40 0 62 0 1 0 ! о 0 I

lp15-21-miM 77 ,3 1,7 65 0 1 0 1 о 0 |

|ДНФ0_б-НММ 32 4,2 62 4+1,96* | 0 ! 4,0 0 j

|днф6_12-нмм 62 , 7 8,5 59, 7 0 i 0 1 о 0 1

|днф0_12-нмм 69,3 3,8 45, 4 7 ,7+2,61** 0 1 6,7 0,9 |

¡ДНФ12_18-НММ 58,7 4,5 60 , 5 0 i 0 1 о 0 i

1ДНФ15-21-НММ 69, 3 3,8 63, 2 0 1 0 1 о 0 !

j нмм]_2—15 54,7 2,4 62 , 7 2 ,2±1,51 | 1,1 1 1,1 0 1

| контроль | 81,3 0 64 0 ! 1 0 1 ° 1 0 1 , 1

»-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05); **-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,01). лиэовываться в нутации, либо восстанавливаться до нормального состояния. Известно, что на реализацию потенциальных хлорофилльных мутаций у ячменя значительное влияние оказывает температура во время начального периода развития растений (Калам Ю., Орав Т., 1974).

При самоопылении полученных в М2 хлорофилльных мутантов подсолнечника мы наблюдали расщепление в потомстве. Пестролистные формы расщеплялись на три типа проростков- - зеленые, пестрые и летальные (желтые и белые). Последние погибали на стадии развития первой пары настоящих листьев. Никаких менделевских закономерностей при этом не наблюдали, что позволяет предположить Пластомную природу пестролистных форм.

Мутанты типа сЫогипа при самоопылении помимо хлорин выщепляли зеленые и летальные проростки. Доля сЬ1ог1па в потомстве составляет от 53 до 96%. Растения типа сЬ1ог1па, индуцированные НММ в комбина-

Таблица 2.

Частота хлорофиляьных мутаций подсолнечника, индуцированных нитро-зометилмочевиной в комбинации с 2,4-динитрофенолом и рифампицином 1995-1996 гг., (в процентах, М±т)

Г ■ ■ ■ ■ | вариант . . .. выжи пестрые выжи 1 всего му-| пестр. 1 |сЬ1ог1па 1 летали |

| опыта ваем формы М^ ваем таций М2 | 1

1 1 Мх,% М2,% М±т | М2,% 1 м2,% 1 м2,% 1

1 | Р0_6-НММ 68 8,8 78,5 1,5±0,73*| 1,5 1 1 0 0 1

1Рб-12"ним- 78 7,9 78,7 0,4±0,41 | 0 1 0 0,4 |

|Р0_12-НММ 64 0 81, 3 0' | 0 1 0 0 |

¡Р12-18-НММ 66 15,2 76,2 1,1Ю,55*| 0,3 1 0 0,8 |

|Р15_21-НММ 66 12,1 66, 9 16±2,3***| 1,2 1 13,5 1,2 |

¡ДНФо-6-НММ 52 14,8 75,5 0 | 0 1 0 о !

|ДНФ6_12-НММ 76 5, 3 76,9 0 1 0 1 0 0 I

|ДНФ0_12-НММ 78 7,9 70,7 0 1 0 1 0 0 I

|ДНФ12-18-НММ 56 10, 3 63,4 2, б±1,29*| 0 1 0 2,6 |

!ДНФ15_21-НКМ 64 12,1 79,2 1,. 0±0,58 ! 0,7 ! 0 0,3 !

|НММ12-15 52 8,0 60,4 2,9+1,44*| 1,5 1 0 1,5 |

|контроль 1 , . 80 0 .. 74,7 0 I 1 0 1 0 1 1

*-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05); »»■»-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,001). ции с Р(0-12), ДНФ(О-б) и ДНФ(0-12) б И4 дали только мутантное потомство. Отсутствие соматического расщепления в потомстве указывает на возможность ядерного происхождения данных мутаций.

Генетический анализ некоторых индуцированных мутантов доказал их различную генетическую природу. Реципрокные скрещивания пестролистных растений из варианта Р(6-12)-НИМ с исходной инбредной линией 3629 показали, что в том случае, когда пестролистную форму использовали в качестве материнского растения, гибридное потомство давало в Р1 расщепление, соответствующее расщеплению при самоопылении. При обратном направлении скрещивания все потомство было зеленым. Наличие соматического расщепления при самоопылении и материнское наследование признака при реципрокных скрещиваниях позволяет сделать вывод опластидной природе данной мутации.

При скрещивании мутантов с111ог2па из варианта обработки

ДНФ(0-бJ-HMM с зеленой исходной линией 3629 в Fl доминировала зеленая окраска независимо от направления скрещивания, что служит доказательством ядерной природы данной мутации.

Иную картину наблюдали при реципрокных скрещиваниях исходной линии с растениями chlorina, индуцированными НММ в комбинации с предобработкой ДНФ или Р в течение 12 часов. Когда в скрещиваниях с мутантами исходная линия 3 629 служила в качестве материнского растения, в Fl были обнаружены только зеленые растения. В F2 зеленые формы расщеплялись на зеленые, пестрые, летальные проростки и растения типа chlorina. При обратном направлении скрещиваний в Fl наблюдали расщепление на нутангные и зеленые растения. Доля мутантных форм составляла 24-23%. Полученные результаты указывают на то, что эти две мутации chlorina имеют сложную природу, обусловленную взаимодействием ядра и цитоплазмы.

Устойчивость организма к экстремальным воздействиям зависит от его генетических особенностей. При этом немаловажную роль играет внеядерная система наследственности. Пластомные мутанты с измененной кормой реакции организма могут иметь особое значение в процессе приспособления к различным неблагоприятным факторам.

Нами был проведен сравнительный цитогенетический анализ действия различных концентраций НММ на хлорофиллыше мутанты подсолнечника. В качестве объектов были выбраны исходная инбредная линия 3629, засухоустойчивый пластомный мутант chlorina-5, ядерно-цитоп-лазматический мутант chlorina-12 (обе линии получены в отделе генетики НИИ Биологии при РГУ Белецким Ю-Д. с сотрудниками) и два выделенных нами . ядерно-цитоплазматических мутанта из вариантов ДНФ(0-12)-НММ и Р(0-12)-НММ. Обработку мутагеном проводили в течение з часов с 12 до 15 часа после начала проращивания семян. НММ использовали в концентрации 0,015%, и 0,04%.

Как видно из таблиц 3 и 4, в клетках корневой меристемы проростков линии 3629 максимальное число аберраций хромосом (АХр), достоверно превышающее контрольные значения, зафиксировано через 24 часа после окончания обработки мутагеном в концентрации 0,04%. В то же время уровень пролиферативной активности клеток достоверно снижен по сравнению с контролем во всех вариантах обработки (табл.3,4). В клетках корневой меристемы мутантов chlorina-5 и chlorina-12 повышенный уровень АХр индуцируют обе концентрации мутагена. Однако в случае chlorina-5 индукция перестроек хромосом

приходится на первые 24 часа после обработки мутагеном, тогда как у проростков линии сЫог!па-12 достоверно повышенный уровень аберраций сохраняется в течение 48 часов (табл.3,4). Уровень перестроек

Таблица 3.

Сравнительная реакция линий подсолнечника на действие нитрозометил-кочевины в концентрации 0,015%.

1 ■ 1 ■ | линия |время всего анафазы с АХр 1 митот.индекс|

1 )п/д,ч 1 1 анафаз абс . М±т М1±т )

1 ....... 1 |3629 контроль I 857 5 0,6±0,26 9,6+0,47 |

| - - ■ ■ - г 6 898 10 1,1+0,35 5,7±0,37л ^ |

1 1 24 1126 13 1,2+0,32 6,4±0,39лл |

1 | 48 736 14 X,9+0,50 6,9±0,40лл |

¡сЬ1ог1па-5 контроль 934 3 0,3±0,18 11,2+0,49 |

I ! 6 856 14 1,6+0,43Л 8,1+0,43**лл|

1 1 24 619 20 3,2±0,71**лл 8,3±0,44** 1

! 1 48 641 13 2,0+0,55 9,0+0,45** |

¡сЬ1ог1па-12 контроль 1552 11 0,7±0,21 9,3+0,46 |

1 1 б 1109 14 1,3+0,34 5,3±0,35лл |

1 1 24 1259 40 3,2±0,49***л 6,1+0,38^ 1

1 1 48 1278 27 2,1—0,40а 8,1±0,43 |

|Р(о-12)-НММ контроль 872 3 0 , 3±0,19 10,7+0,49 |

1 1 б 651 15 2,3±0,59АЛ 3,б±0,23**лл|

1 1 24 1006 18 1,8±0,42лл 8,7+0,45**л |

1 1 48 616 8 1, 3±0,46 7,9±0,43ЛА |

|ДНФ(0-12)-НММ контроль 674 4 0,б±0,29 10,8±0,49 |

1 ' 1 6 465 6 1,3±0,53 3,3±0,28**лл|

1 1 24 848 28 3,3+0,61**АЛ 8,3±0,44**лл|

1 | 48 > 1 920 30 3,3±0,59**лл 8,9+0,45** | 1

♦♦-достоверные различия по сравнению с линией 3629 (р<0,001); л-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,01); ЛЛ-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,001). хромосом в клетках обоих мутантов достоверно отличается от исходной линии 3629 только в варианте обработки НММ в концентрации 0,015% (через 24 часа после действия мутагена). Появление высокого уровня АХр у сЬ1ог1па-5 на ранних сроках фиксации можно объяснить более

Таблица 4.

Сравнительная реакция линий подсолнечника на действие нитрозоме-тилмочевины в концентрации 0,04%.

1 1 | линия |время 1 |п/д,ч 1 1 всего анафаз анафазы с АХр абс. М±т 1 митот.индекс| МИт |

1 1 |3629 контроль I 857 5 0 ,6+0, 26 9, 6+0,47 |

1 1 6 500 4 0 ,8 + 0, 39 4, 1+0,ЗЗлл |

1 1 24 1000 25 2 ,5+0, 49 5, 9+0,37** |

1 | 48 791 13 1 ,6±0, 45 6, 7+0,ЗЭ^* |

| с1г1ог1па-5 контроль 934 3 0 ,3±0, 18 11 ,2±0,49 |

1 1 б 781 10 1 ,3 + 0, 41 6, 3+0,38**лл|

[ 1 ?-4 564 19 3 ,4+0, 7 6'" 8, 7+0,45** |

1 I 43 451 9 1 ,9±0, 64 9, 2±0,46** |

|сЬ1ог!па-12 контроль 1552 11 0 ,7+0, 21 9, 3+0,46 |

1 1 6 429 6 1 ,4±0, 57 4, 9+0,34лл [

1 1 24 920 23 2 ,5±0, 51ля б, 8±0,39лл |

1 [ 48 1168 / 2 ,3±0, 4 4 А 3 3+0,44* |

1р(0-12)-нмм контроль 872 3 0 ,3+0, 19 10 ,7±0,49 |

1 1 6 588 18 з ,1+0, з , 7+0,29лл |

1 1 24 771 30 3 ,9±0, 69аа 4, 1±0,31**ЛА|

1 1 48 387 6 1 ,6±0, 64 4 , 8±0,34**лл|

|ДНФ(о-12)_нмм контроль 674 4 0 ,6+0, 29 10 ,8+0,49 |

1 1 б 336 15 4 ,5+1, 13**лл з, 610,29^ |

1 1 24 261 6 2 ,3±0, 93 3, 9±0,30**лл|

1 1 48 1 1 304 9 2 ,9+0, 93 4, 4+0,32**лл| _1

* - достоверные различия по сравнению с линией 3629 (р<0,01);

**-достоверные различия по сравнению с линией 3629 (р<0,001); д-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,01); лл-достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,001). высоким уровнем пролитеративной активности меристематических клеток по сравнению с линией 3629. Обработка мутагеном снижает митотичес-кий индекс (МИ) в течение первых б часов после действия, однако и в этом случае уровень пролиферации остается достоверно выше по сравнению с исходной линией (табл.3,4). Пролиферативная активность клеток проростков линии сЫогз.па-12 восстанавливается до контрольных

значений только к 48 часу после обработки мутагеном, достоверно превышая при этом значения МИ для линии 3629. Таким образом, линии с111ог1па-5 и сЬ.1ог1па-12 оказались более чувствительны к низкой концентрации мутагена по сравнению с линией 3629. Однако обе линии характеризуются более высокой стабильностью МИ после мутагенных воздействий.

НММ индуцирует АХр в клетках корневой меристемы проростков линий Р(0-12)-НММ и ДНФ(0-12)-НММ (табл.3,4). Достоверные отличия по числу АХр по сравнению с линией 3629 отмечены через б часов после обработки НММ в концентрации 0,04%. Проростки линии ДНФ(0-12)-НММ помимо этого имеют значительно более вксокий уровень АХр через 24 часа после действия 0,015%-го раствора НММ. Реакция пролиферативной активности клеток более дифференцирована. Если через 6 часов после обработки мутагеном независимо от концентрации МИ практически не отличается от этого же показателя для линии 3629, то к 24 часам после действия НММ в концентрации 0,015% активность деления клеток корневой меристемы мутантов превышает таковую у инбредной линии. Однако после обработки наибольшей концентрацией мутагена МИ у данных мутантов достоверно ниже по сравнению с исходной линией.

По данным генетического анализа у всех четырех линий мутация в той или иной мере затрагивает ДНК хяоропластов. Это позволяет предположить, что даже в корневой меристеме фотосинтезирующие органел-лы, еще не прошедшие своего цикла онтогенеза, способны влиять на реализацию энергетического баланса пролиферирующих тканей. Данный вывод может служить исходным для углубленного анализа причин повышенной устойчивости хлорофилльных мутантов к экстремальным воздействиям .

Функциональная активность многих ядерных генов зависит от ци-топлазмагического окружения. Нами был проведен сравнительный анализ активности каталазы, пероксидазы и содержания МДА на разных стадиях развития растений линий 3629, сЬ1ог±па-5, сЬ1ог1па-12, ДНФ(0—12)-НММ и Р(0—12)-НММ.

Активность каталазы и пероксидазы в корнях проростков исходной линии 3629 и пластомного хлорофилльного мутанта сЫог1па-5 наибольшая по сравнению с другими стадиями, что, вероятно, является отражением интенсивно идущих процессов деления клеток, их роста и формирования тканей (рис.1,2). По мере развития организма активность каталазы в тканях листа постепенно падает, изменения суммарной пе-

роксидазной активности носят волнообразный характер. Наименьшие значения активности фермента отмечены в тканях семядольных листьев.

По мере роста происходит увеличение содержания МДА в тканях растений линий 3629 и chlorina-5(рис.3). Уровень вторичного продукта перекисного окисления липидов в листьях достоверно выше по сравнению с содержанием МДА в корнях. Однако если для линии chlorina-5 отмечено плавное нарастание концентрации МДА по мере развития организма , то наибольшие значения содержания продукта ПОЛ в тканях растений контрольной линии отмечены на стадии развития семядольного листа. Всплеск уроЕня МДА на данной стадии развития скорее всего отражает интенсификацию процессов ПОЛ из-за фотодинамического действия света, что приводит к образованию синглетного кислорода и супероксид радикала. На последующих стадиях развития устанавливается равновесие между интенсивностью процессов ПОЛ и активностью антиок-сидантных ферментов. Отсутствие подобного пика в содержании МДА у линии chlorina-5 может быть связано с более высокой активностью каталазы, а также с изменение« жирнокислотного состава свободных полярных липидов листьев в сторону повышения степени насыщенности по сравнению с исходной линией 3 6 29 (Лысенко В., 1993).

Корреляционный анализ показал, что существует обратная зависимость между суммарной пероксидазной активностью и содержанием МДА в тканях зеленых растений линии 3629 (г=~о,78). В то же время у растений линии chlorina-5 уровень МДА обратно пропорционально зависит от активности каталазы (г=-0,94).

Изменения активности ферментов в процессе развития растений линий chlorina-12 и ДНФ(0-12)-НММ носят антибатный волнообразный характер. Увеличение активности каталазы сопровождается снижением суммарной пероксидазной активности на этой же стадии развития и наоборот. Между активностью каталазы и содержанием МДА в тканях растений линии chlorina-12 существует прямая корреляционная зависимость (г=0,78). В то же время уровень вторичного продукта ПОЛ находится в обратной зависимости от суммарной пероксидазной активности (г=-0,71).

Содержание МДА в корнях растений из варианта ДНФ(0-12)-НММ наибольшее по сравнению с другими линиями (рис.3). В то же время уровень МДА в активно фотосинтезирующих листьях минимален.

Общая активность пероксидаз в условиях недостатка влаги, как правило, выше у засухоустойчивых сортов, что мы и наблюдали у плас-

□ корень |

□ сем.лкст } ¡Омол.лист | ¡□старлист^

сЬ|оппа-5 сШоппа-12 ДНФ-НММ

Рис.1 .Активность каталазы в тканях растений подсолнечника.

1600 1400 1200 1000 800 600 «О 200 О

¡□корень ¡□сем,лист ¡□мол лист ¡□стар лист

с(11оппа-5 сГ1|мта-12 ДНФ-НММ

Рис.2.Суммарная пероксидазная активность в тканях растений подсолнечника.

Рис.З.Содержание МДА в тканях растений подсолнечника.

томного мутанта chlorina-5 (рис.2). В варианте ДНФ(0-12)-НММ суммарная пероксидазная активность в молодых листьях невелика, однако содержание МДА на данной стадии минимально по сравнению" с другими линиями (рис.3). Возможно, что низкая активность пероксидаз в данном случае компенсируется повышенной активностью каталазы.

Одним из основных доказательств пластидной природы индуцированных мутантов является обнаружение физико-химических различий между молекулами хлоропластной ДНК нормальных и мутантных растений. Нами был проведен сравнительный рестрикционный анализ ДНК пластид исходной инбредной линии 3629 и двух хлорофилльных мутантов подсолнечника - chlorina-5 и chlorina-12. Мы сознательно использовали линии, полученный в лаборатории Ю.Д.Белецкого более 10 лет назад. За все время наблюдений не было обнаружено ни одного случая спонтанной реверсии среди растений типа chlorina, а проведенный генетический анализ показал пластидную и ядерно-цитоплазматическую природу линий chlorina-5 и chlorina-12 соответственно.

Фермент ВашHI расщепляет хлоропластную ДНК подсолнечника на 13 фрагментов с размером от 23 до 1т.п.н. Для эндонуклеазы EcoRl характерно наличие 19 фрагментов с размерами от 10,6 до 0,5т.п.н. Рестриктаза Bgll расщепляет хлоропластную ДНК подсолнечника на 8 фрагментов с размерами от 28,3 до 3,8т.п.н. Ни один из трех фрагментов рестрикции не выявил различий в структуре хлоропластной ДНК у исследуемых линий подсолнечника.

Рестриктаза Pstr расщепляет хлоропластную ДНК подсолнечника на 9 фрагментов с размерами от 28 до зт.п.н. 10 фрагментов образуется при обработке хлоропластной ДНК ресгриктазой PvuII. Их размеры находятся в пределах от 22,6 до 2,8т.п.н. Рестриктаза Hindlll расщепляет хлоропластную ДНК подсолнечника на 17 фрагментов с размерами от 15 до 2,4т.п.н. (рис.4). При этом обе мутантные линии не имеют самого крупного фрагмента хлоропластной ДНК размером 15т.п.н., что доказывает пластидную природу данных мутаций.

Несмотря на то, что первые пластокные мутанты, индуцированные НММ, были получены почти 30 лет назад, механизм действия НММ до конца не ясен. Ранее была высказана гипотеза о том, что эффект мутагена может быть связан с инактивацией долгоживущих матриц РНК (Усатов А. и др., 1995). Из данных литературы известно, что сухие семена растений содержат молекулы преформированной мРНК (Marcus А. et al., 1966), которые накапливаются на поздних стадиях формирова-

Рис.4. Распределение фрагментов хлоропластной ДНК при эяект] форезе в агарознон геле: 1,2-иаркеры, 3-Н1пй111 линия 3629, 4-Н. XII сЫог1па-5, 5-Нз.пс1 III с1Иогхпа-12, 6-Pvu IX линия 3629, 7-1 XX сЫ.ог1па-5, 8-Руи ii сП1ог1па-12, 9-РэЪ1 линия 3629, 10-Р: сМогд.па-5, И-РаМ стог1па-12.

ния семян в виде рибонуклеопротеидных комплексов - информосом (А; кпог1п et а1., 1976). Данные молекулы нРНК обеспечивают синтез б( ка в течение первых часов прорастания семени. Можно предположит что на ранних этапах развития растений существует переходная С1 дия, когда истощаются накопленные в цитоплазме сухих семян тра! крипты мРНК, а формирование аппарата транскрипции-трансляции йе г уо не завершено. Данная стадия развития должна быть наиболее вое риимчивой к воздействию самых различных факторов. Результаты при* денных выие экспериментов по модификации мутагенного эффекта I рифампицином или ДНФ,в значительной степени поддерживают данную г потезу.

Действие ДНФ как фактора, разобщающего дыхание и окислите! ное фосфорилированйа, в конечном итоге сводится к подавлению обр зования АТ<3>, энергия - которого необходима для нормальной жизнеде тельности растительной клетки. Совместное действие ДНФ с. НММ прив дит к общему подавлению всех клеточных процессов. В условиях деф

цита энергии, снижения уровня накопленных в сухих семенах мРНК, недостатка новосинтеэированных молекул РНК и белков нарушается работа Есех ферментативных систем, участвующих, в том числе, в репликации ядерной и хлоропластной ДНК, репарации первичных повреждений ДНК. В результате значительно повышается частота аберраций хромосом в клетках корневой меристемы проростков и хлорофилльных мутаций в М2 Еще одной возможной причиной повышенной эффективности мутагенеза может быть ингибируюцее влияние химических веществ на клеточное деление. По данным литературы известно, что обработка ДНФ увеличивает частоту цитологических аномалий, в том числе приводит к возникновению кариолеммо-подобных оболочек вокруг отдельных метафазных хромосом (Chakrabarti Д., Ghosh S.,'1994), блокирует анафазное движение хромосом (Helper P., Palevitz В. ,'1986). В условиях сниженной про-лиферативной активности меристематических клеток увеличивается эффективность индуцированного пластидного мутагенеза. Сложность индукции мутаций в хлоропластной ДНК заключается во множественности хлоропластов на клетку и их полиплоидности. Однако в цитоплазме клеток зародыша находится лишь несколько пропластид с минимальным количеством копий хлоропластной ДНК. Во время прорастания семян количество ДНК на хлоропласт резко увеличивается, что снижает вероятность закрепления и фенотипического проявления мутаций, возникших с отдельной молекуле хлоропластной ДНК. Блокирование клеточного деления, а следовательно и репликации как ядерной так и пластидной ДНК, создает ситуацию, в которой мутаген действует на сравнительно небольшое количество молекул нуклеиновых кислот, что повышает вероятность перехода мутаций в гомозиготное состояние.

Резкое падение эффективности НММ и отсутствие модифицирующего эффекта Р или ДНФ в случае их использования после 12 часов роста проростков может быть связано с тем, что проростки успели пройти "критическую" стадию в развитии. Сформированные и эффективно работающие системы транскрипции-трансляции позволяют снизить или даже полностью снять мутагенный эффект НММ.

Появление хлорофилльных мутантов в вариантах действия Р или ДНФ после НММ (1996 год) (табл.2) возможно связано с более глубокими нарушениями клеточного метаболизма, индуцированными факторами среды, прежде всего высокой температурой и недостатком влаги в начальный период роста. В условиях нашего эксперимента нарушения в синтезе белка, РНК и ДНК, индуцированные первоначально действием

ДНФ или Р с НИМ, не позволяют проросткам адекватно реагировать ] почвенную засуху. Возможно, что сравнительно небольшой процент ХЛ1 рофилльных мутантов М2 1996 года в случае предобработки Р или 1 отсутствие в вариантах обработки с ДНФ (табл.2) связаны с эмбрш нальной летальностью индуцированных мутантов в условиях засухи, то же время в вариантах постобработки веществом-модификатором фуги ционирование уже сформированного аппарата транскрипции-трансляц] позволяет организму, хотя и с некоторыми нарушениями, приспособит] ся и выжить в экстремальных условиях существования.

Анализ типов индуцированных мутаций и их генетической приро; позволяет предположить, что природа мутаций в определенной степе! зависит от времени действия вещества-модификатора, а точнее от сос тояния метаболизма клетки в момент обработки. Предобработка ДНФ течение первых 6-ти часов роста проростков создает условия для щ дукции ядерных мутаций. В то же время в случае обработки ДНФ в ре жиме 6-12 часов не зарегистрировано ни одного хлорофилльного мутаи та подсолнечника. 12-часовая предобработка разобщителем дыхания окислительного фосфорилирования и последующее действие НИМ индуця руют сложные ядерно-цитоплазматические мутации. Таким образом, моя-но заключить, что в течение первых 6 часов роста проростки подсол нечника наиболее, восприимчивы к действию метаболических ингибито ров. Нарушен^, метаболизма влечет за собой повышение частоты мута ций. В то же время при нормальных условиях роста первых шести часо развития, по-видимому, достаточно для формирования функционирующи ферментативных систем, что позволяет организму без видимых последс твий перенести стрессорное воздействие в более поздние сроки разви тия.

Шестичасовая предобработка Р в режиме 0-6 или 6-12 часов повы шает частоту индуцируемых НММ пестролистных форм. Расщепление в по томстве пестролистных форм указывает на их пластидную природу 12-часовая предобработка Р вызывает_более сложные ядерно-цитоплаз матические мутации с1г1ог!па.

Возникновение мутации как в ядерной, так и пластидной ДНК ока зывает влияние на весь клеточный метаболизм. Известно, что мутации в ток - числе и в хлоропластной ДНК, могут определять устойчивост растений к, различным стрессорным воздействиям.

Проведенный нами сравнительный анализ активности антиоксидант-ных ферментов показал, что растения линии сЫог1па-5 в целом имею1

несколько более высокий уровень активности данных ферментов по сравнению с линией 3629. В то же время уровень МДА в тканях мутанта не отличается от контроля, за исключением семядольного листа. Если для линии 3629 содержание МДА в тканях растений находится в обратной зависимости от суммарной пероксидазной активности (г—-0,78), то в тканях мутанта chlorina-5 основную роль в инактивации перекиси водорода играет каталаза (г=-0,94). Оба антиоксидант-ных фермента кодируются ядерным геномом, но если перохсидазы функционируют как в цитоплазме, так и в пластидах, то каталаза - это цитоплазматический фермент. Любая пластонная мутация, изменяя ультраструктуру пластид, влияет на функционирование собственных ферментативных систем. В то же время активность антиоксидантных ферментов может отражать состояние ядерного или пластомного геномов.

Сопряженная работа антиоксидантных ферментов наиболее четко выявлена у растений из варианта ДНФ(0-12)-НШ. Снижение активности каталазы совпадает с повышением суммарной пероксидазной активности и наоборот. Возможно именно благодаря этому содержание МДА в тканях активно фотосинтезирующих листьев данных растений минимально (рис.3), хотя в корнях проростков содержание вторичного продукта ПОЛ наибольшее по сравнению с другими линиями.

На уровень интенсивности реакций ПОЛ, а, следовательно, и устойчивости организма, может оказывать влияние и содержание пигментов в хлоропластах. Хлорофиллы и каротиноиды являются сильными тушителями 102 в хлоропластах. У пластидного мутанта chlorina-5 содержание хлорофиллов снижено на 35-40%, а каротиноидов на '25% -по сравнению с исходной линией 3629. В то же время в условиях засухи уровень пигментов у данного мутанта практически не изменяется, в то время как содержание хлорофиллов и каротиноидов у исходной линии значительно снижается (Белецкий К)., 1989). Возможно, что это одна из причин устойчивости chlorina-5 к недостатку влаги. По ряду критериев (сопряженная работа антиоксидантных ферментов, низкий уровень МДА в тканях активно, фотосинтезирующих листьев, повышенный уровень хлорофиллов и каротиноидов) можно предположить, что ядер-но-цитоплазматические мутанты из варианта ДНФ(0-12)-НММ окажутся более устойчивыми к стрессорным воздействиям по сравнению с исходной линией 3629 и chlorina-5.

Работы, где бы устойчивость растений к различным стрессорным воздействиям связывалось с молекулярными изменениями в пластидном

геноме, довольно редки. Например, известно, рестриктаза ВашН1 четко дифференцирует виды и сорта картофеля по структуре их хлоропластной ДНК в зависимости от устойчивости растений к вирусам (Палилова А., Пыко В., 1997)» Это указывает на возможность использования определенных фрагментов ДНК пластид в качестве маркеров устойчивости к различным стрессорныи воздействиям. Результаты рестрикционного анализа хлоропластной ДНК подсолнечника доказывают пластомную природу иутантных линий сЫогл.па-5 и с1ог!па-12.

ВЫВОДЫ

1.2,4-динитрофенол и рифампицин, не проявляя самостоятельной генетической активности, усиливают цитогенетический эффект НИМ. Комбинированная обработка проростков подсолнечника НММ с рифампици-ном или 2,4-динитрофенолом достоверно увеличивает уровень аберраций хромосом в клетках корневой меристемы проростков.

2.Генетический эффект комбинированной обработки НММ с 2,4-ди-нитрофенолом или рифампицином,зависит от времени действия вещества-модификатора и условий вегетации. Предобработка 2,4-динитрофено-.лом или рифампицином усиливает мутагенный эффект НММ, повышая частоту хдорофилльных мутантов в К2•

3.НММ в сочетании с шестичасовой предобработкой рифампицином индуцирует пластомные пестролистные мутации подсолнечника. Шестичасовая предобработка 2,4-динитрофенолом создает условия для индукции НММ ядерных мутаций подсолнечника типа сЫог^па. Обработка мутагеном в комбинация с 12—часовой предобработкой как рифампицином так и 2,4-динитроф.енолом индуцирует мутации сМогд.па ядерно-цитоплазмати-ческой природы.

4.Сравнительный цитогенетический анализ линий показал, что пластомный мутант сЬ1ог1па-5 и ядерно-цитоплазматический мутант ch.lori.na."-12 более чувствительны к низким дозам мутагена на ранних сроках фиксации по сравнению с линией 3 629. Однако данные линии характеризуются более стабильным клеточным циклом.

5.Активность антиоксидантных ферментов и содержание малонового диальдегида в тканях ряда индуцированных тхастомных и ядерно-цитоп-лазматических мутантов подсолнечника достоверно отличаются от этих же показателей для исходной линии 3629. Устойчивые к недостатку влаги пластомные мутанты подсолнечника характеризуются повышенной активностью антиоксидантных ферментов в тканях растений.

б.Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК показал отсутствие фрагмента размером 15т.п.н. в молекулах ДНК пластид линий chlori-па-5 и clorina-12.

СПИСОК РЛБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Modification of N-nitroso-N-methylurea mutagen effect (E.P.Guskov).- //Ill European symposium on Sunflower biotechnology. Germany. Bad Munster am Stein, 30.10-2.11.-1995.-P.51.

2. A comparative reaction of sunflower 3629 lire and chlori-na-5 to the N-nitroso-N-methylurea effects //26 EEMS Annual Meeting on Chromosome instability and cell cycle control. Rome. 3-7 September. 1996.-P.101.

3. Индукция цитоплазкатичсских мутантов подсолнечника //VI Международная научно-практическая конференция "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье", 8-14 сент. 1997. Алушта, Крым.

4.влияние 2,4-динитрофенола и рифампицина на генетическую активность нитрозонетилмочевины у подсолнечника (Е.П.Гуськов) //Генетика. -1998.-N.1.-с.