Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение мутантов кормовых дрожжей с высоким содержанием белка и их физиолого-биохимические особенности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение мутантов кормовых дрожжей с высоким содержанием белка и их физиолого-биохимические особенности"

АКАДШЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи

ДЕУМАБАЕВА Галия Абугатгевна

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ КОРМОВЫХ ДРОЖЖЕЙ О ВЫСОКИМ СОДОТАЖЕЫ БЕЛКА И ИХ (ШШОЛОГО-ШОХИШЧЕОКИВ ОСОБЕННОСТИ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соаокаше учепой ствпеяя кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекцаи микроорганизмов Института микробиологии и вирусология АН Паз ССР

Научный руководитель : член-норр; АН КазССР, д.б.к.

ШИГАЕВА М.Х;

Официальные оппоненты: д.б.н; .профессор Новожилова М.И.

к.б.н. Цуэыревская О.М.

Ведущее учреждение - Институт микробиологии АН Уз ССР, г» Ташкент

Защита состоится: " " М^рА 1991 г. в 1400часов на заседании Специализированного Совета К 008,01.01 по вощите кандидатских диссертаций при Институте микробиологии и вирусологии АН КазССР (Адрео: 480100, г.Алма-Ата, ул.Кирова, 103}

И МчВ

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке^АН КазССР (Алма-Ата, ул.Киро£а,юЗ )

Автореферат разослав £ т^ 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кавдвдат биологических наук

у.с.4уха\юднева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Проблема белкового дефицита в рационе животных уже давно решается микробиологическим способом - широкомасштабным выращиванием дрожжей и других микроорганизмов. Особое внимание при этом уделяется биотехнологическим 1роцессам, основанным на использовании постоянно возобновляемого растительного сырья. Дальнейшее развитие этого направ-пения требует, наряду с совершенствованием технологии, создания новых высокопродуктивных штаммов, способных к активному синтезу белка на средах из растительного сырья. В последние годы для получения новых штаммов стали все чаще применяться такие генетические направления как транспозонный му- , гагенез, слияние протопластов, генетическая инженерия и другие (Giantz, 1989; Groilman, 1989). Однако не утратили своей значимости и традиционные методы, например, химический мутагенез (Дурасова, 1987; Исакова, 1987). Тем более они не исчерпали себя в селекции кормовых дрожжей с повышенным содержанием белка. Имеются лишь разрозненные сведения о мутационной изменчивости кормовых дрожжей. Не отработаны критерии первичного отбора, недостаточно изучена реакция кормовых дрожжей на воздействие химических мутагенов, потенциальные возможности мутан^цхформ и перспективы их использования.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение индуцированной изменчивости кормовых дрожжей Candida, scottii , отбор перспективных штаммов по содержанию белка и накоплению биомассы; изучение физиолого-био-химических особенностей новых штаммов; взаимодействия их друг с другом и дрожжами-примесями.

В задачи исследования входило: - сравнительное изучение действия н- нитрозогуаиидина, я - нитрозо - К - метилбиурв-та, к— нитроэометилмочевикы, н- нитрозоотилмочзвины в влияния условий предварительного культивирования клеток дрожжей на мутагенез; - фнэиолого-биохиыическая характеристика мутантов, отобранных после действия мутагенов; - определение их чувствительности к токсическим веществам гедрояиэ-ных сред; - изучений вааимодейотвия мутантов C.sccbtii с

ДрООШШ родов Hansenula, Torulopsis, Trichosporon, Zygo-fabospora; - подбор мутантов дроккей C.scottii для совместного культивирования»

Научная новизна работы, ¿¡первые в селекции дробей Candida scottii в качестве мутагенного фактора использовали N-нитрозо- N-метилбиурет. Установлена реакция кормовых дрок-аей на воздействие химических мутагенов. Получено 7 штаммов с высоким содержанием белка в клетках. Впервые полутени нсевдо-тщетельшв клетка после обработки дроккей c.scottii шталма 1409 и-натрозоэиышочевиной. Впервые использованы двухкомло-нентнае кудътурц, состоящие аз мутантов кормовых дрожжей душ получения их большой биомассы с высоким содержанием белка.

Практическая ценность. Получены мутанты 3455, 3494, которые превосходили исходную культуру по содержанию белка (на 1,5%) и по количеству биомассы (на 0,100-0,112 г/100 мл). Биомасса одного из них (3455) содеркит повышенное количество лизина, лейцина.

Положения, выносимые на защиту.

- Возможность получения мутантов Candida scottii с повышенным содержанием белка и накоплением биомассы методом химического мутагенеза.

- Пригодность метода отбора мутантов по биомассе доя первичного скрининга.

- Перспективность использования смешанных культур дая получения биомассы кормовых дрожжей,"

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации доложены на 4 съезде ШГиС (Кишинев, 1982); 7 съезде ВМО (Алма-Ата, 1985); конференции молодых ученых "Молодекь и научно-технический прогресс" (Алма-Ата, 198S); Всесоюзных конференция*'-"Бисф1зика микробных популяций" (Красноярск, 1987) и "Биотехнология и биофизика микробных популяций" (Алма-Ата, 1991).

Публикации. Ло теме диссертации опубликовано П. работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка .литературы (160 источников). Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 5 таблиц и НО рисунков.

CQQEPKAHHE РАБОТЫ

Объекта и метода! исследования

Объекты исследования. Кермопые дрожи Candida acOttii штпммоа 1403 н 2508 (отобранные нами посла действия мророй на штамм Candida sccttii Тулунская-G)

- три тысячи семьсот мутшгеоа, полученных после дейст-[я химических мутагенов;

- дрожжи РОДОП НяпвепиЭа aaomali, Torulopsis pulcheri-а, Trichosporon cuteneu-;., Zygof aY ospora norxiana, »лученные иэ музея Института микробиологии и вирусологии

! КазССР.

Питательные среды. Среда Ридер, сусло-агар и гидролипат здсентсксго гидролизного завода.

Химические соединения. Мутагены: Я- нитрозогуанидинШГ) s !- нитрозо- В- метилмочевина (НММ), нитрозоэтилмочевииа ЮМ), N- нитрозо- М- метилбиурег (lit©). НГ использовали в шцентрации О,IS, Hi-Ш — 0,25?5,НММ и НЭМ - 0,05Й и испытыва-1 на клетки дрожжей в стационарной фазе роста (обычные гатки) и клетки выдержанные в течении 24 часов в физиологи-гском растворе (голодные клетки). Бреют деЧствил мутагенов i дрожжи - 15, 30, 60 и 90 минут.

Токсические соединения. Фурфурол добавляли в среда Ря-;р в количестве 0,1 о5.%, уксусную кислоту - 0," сб.Й, му-шьинуп. кислоту - С,1 сй.'/о.

Метода исследования. Мутагекннй о$фвят химических, сое-тений учитывали го выживаемости, морфологической издании« зсти и частоте появления активных: по накопления) биомассы и держанию белка форм. Выживаемость определяли путем подсче-1 выросших колоний в сравнении с контролен. Выход биомассы иссчитнвали весовым методой с пересчетом на сухой вес. Пер-тчный отбор мутантов дрожкэй проводили по накоплен)® биомас-1, учитываемой через 18-20 часов культивирования по оптича-:ой плотности, которую замеряли на ФЭК-56. Из каздой экспо-щии проверяли по 100 вариантов. Разная изменчивости всех гобранннх вариантов рассчитывали в процентах я контроля к

3

распределяли в вариационные ряды,которые сравнивали с контро. ным рядом.

Индекс взаимодействия видов в популяции определяли по о ношению (Дечуркш, 1981 >:

Xmt/ \о sx = --------------, где

V/ V

Xmt u ^тО " концентрация биомассы популяции анализируемого вида в смешанной культуре в момент врзмега t и t0 ;xpt и Хр0 - концентрация биомассы популяции того же вида в чис той культуре в момент времени t и t0 , которое было опред лено Н.С.Печуркиным для проточных культур, но мы использовал его в своей работе для подсчета индексов взаимодействия.

Скорость роста определяли по отношению:

2,3(ig х2 - lg Xj) jj » '

t2 - tj

где - начальные показания биомассы, ~ конечные показан биомассы в экспоненциальной фазе роста,tg-tj - промежуток времени.

Выход дрожжей определяли по отношению:

V т .количество выросшей биомассы (г. мг) . jqO%

• количество использованного сахара (г, мг)

Определение количества сахара проводили по методу Бертрана (Плешков, 1966). Содержание белка определяли по.методу Кьедьдшш (Пяеаков, 1968) и методом Лоури в модификации (Худяков, 1968). Определение аминокислотного состава белка кормовых дрокжей проводили на аминокислотном анализаторе AAA 33 производства Чехословакии по общепринятой методике (Закордо нец, 1982.

Определение суммарного количества нуклеиновых кислот пр водили по методу Свирина (1958).

Статистическую обработку данных проводили методами, опи санными Захаровым (1964) и Плохинским (1976).

РЕЗУЛЬТАТУ И (ШВДШЕ Селекция новых втвдмов

На первом этапе селекции для получения мутантов дрокхей

4

Candida scottii с высоким содержанием белха использовали камфору. Перспективные штаммы дрожжей Candida scottii 1409 (A.C. № 909988 СССР I960 ) и 250В, отобранные после действия камфорой служили материалом для дальнейшей селекции. Штамм 2508 подтвердил свои положительные качества: высокую белковость и больгаую продуктивность в условиях опытно-промышленного испытания на Астраханском гидролизно-дрожжевом заводе, о чем имеется соответствующий ант. Для своего роста он требует высокого содержания фосфора и чувствителен к повышению температуры вше 38-39°С. Это послужило основанием для использования этого штамма в дальнейшей селекции.

Изучение мутагенного действия И - нигрозогуанидина Я - нитрозогуанидин в концентрации 0,155 проявил сильный токсический эффект, возрастающий с изменением экспозиции. Жак при обработке в течение 15 минут погибло 9fc$ клеток, увеличение времени обработки до 30 минут привело к гибели 99% клеток, а при часовом воздействии выживали лишь единичные клетки (рис.1). Следует отметить, что клетки шташа 2508 более чувствительны к высоким дозаи мутагенам по сравнении со итам-NTOM 1409.

эис. I. Выживаемость дро*м;эй после действия НГ

5

Столь сильное аоедейетвие вызывало и иоменение морфологии колоний. В популяции обработанных клеток обнаруживались мелкие, точечные колонии, а также шероховатые с изменением пигментации (темно-кремовые, коричневые). Среди отмеченных морфологических типов преобладали мелкие и точечные колонии. Наибольшее число измененных колоний отмечено у штамма 1409.

Первичный отбор физиологических мутантов проводился по количеству образованной биомассы через 18-20 часов культивирования. Морфологически измененные формы, как правило, характеризовались низкой продуктивностью. Не зависимо от того по каким признакам отличались морфотипы, по размерам колоний или пигментацией, общим для них была замедленная скорость роста. Лучшими по накоплению биомассы оказались варианты, идентичные по морфологическим признакам исходному типу колоний дрожжей. Наибольший выход таких форы отмечается при экспозиции 60 минут, при которой отобраны культуры с активностьп 0,70 единиц оп.пл. (при активности 0,35 единиц on.пл. в контроле).

Действие W.-нитрозо- Я тМетилби.урета на штамм .дрожжей Candida scottii 1409 ' '

Из известных химических мутагенов и -нитрозо- Н -метил-биурет является наименее изученным на дрохжах. ШБ более слабый мутаген, поэтому его использовали в концентрации 0,25$, окспозиции 10-160 минут. Исследование летального действия НМБ на штамм дрожжей С.scottii 1409 показало, что изучаемая культура отличается довольно высокой устойчивостью к мутагену (рис.2). При 30 минутной и 60 минутной экспозициях процент живых клеток довольно высок (71,2$ и 52,7%), увеличение времени обработки до 90 минут снизило этот показатель до 35,6%. Обработка мутагеном в течение 120 и 160 минут привела к значительн-ному уменьшению числа живых клеток (9,4$ и г',1%).

Воздействие НМБ вызывало изменение морфологии колоний дрожжей. Кроме ыелких и точечных колоний отмечено появление секторных колоний дрогаей.

Изучение изменчивости по признаку накопления биомассы показало, что частота образования плюс-вариантов была наиболее высокой при окспозиции 60 и 90 минут ( отобраны культуры

6

Рис.2. Выживаемость дрожжей после действия НМБ

активностью 0,70-0,75 единиц оп.пл.).

Таким-образом, изучение мутагенного действия НМБ показа-о что мутаген обладает слабым губительным эффектом, индуци-|увт новые ыорфотипы (секторные колонии), способствует росту ариантов активных по накопленио биомассы.

Влияние условий культивирования на изменчивость дрожжей. индуцированных мутагенными факторами

Известна, что реакция клеток на воздействий мутагенных акторов зависит от условий, в которых они находились до об-аботки. Обычно исходным материалом для мутагенной обработки лужат суточные культуры, выращенные на полноценных питатель-ъас средах. Такие клетки наш обозначены как обычные. В проти-оположность им, клетки, выдержанные до обработки в течение 4 часов в физиологическом растворе, названы голодными.

Действие Я-нитрозометилмочевины

Выживаемость дрожжей С.асоъш штамма 1409 после дейст-ия НШ1 на голодные дрожжи существенно отличается от опытов обычными клетками. Воздействие мутагеном на обычные клетки ызывает снижение процент* живых клеа^к йо мере увеличения ремени обработки ( рис.3). В условиях голодания устойчивость леток к мутагену остается на высоком уровне (даже при 60 и О минутных экспозициях), когда выживаемость дрожжей соответственно равна 76,7% и 69,0$.

Морфологическая изменчивость проявилась в возникновении олоний дрожжей точечных, мелких и с измененной складчатое-ьп. Морфологическая изменчивость у голодных клеток был* вше,

7

4 (5 ¡0 -»5 Ш К 30 ман

Рис.3. Выживаемость дрожжей с.зсо«зЛ штамма 1409 после действия НШ

I - обычные клетки, П - голодные клетки

чем у обычных клеток при всех дозах мутагена.

Показатель выживаемости у штамма С.всо^а! 2508 также зависит от физиологического состояния клеток дрожжей в момент действия мутагеном. У обычных клеток дрояжей уровень кривой постепенно снижаясь до 60 минут, резко падает при 90 минутном воздействии, у клеток дрокжей после суточного голодания отмечается большая жизнеспособность при всех экспозициях (рис.4).

----—»—i-1-1-1— ' '

IS tO AS M 75 за мин

Рис.4. Выживаемость дрожжей C.scottii штамма 2508 , после действия ШМ .

*1 - обычные(клетки, П - голодные клетки .

Изучение изменчивости по признаку накопления биомассы ■ показало, что у штамма-1409 обнаруживалось большое ■ число вариантов активных по накоплению биомассы при действии на обычные клетки дрокяей. Особенно большая частота появления мутан-

>в по этому показателю ( с активностью 0,90-1,2 ед.оп.пл.) у гамма 1409 при экспозиции 60 минут, что соответствует наи -зньшему уровно морфологической изменчивости. Популяция годных клеток осталась более однородной и после обработки му-1геном. Наиболее высокие показатели оптической плотности на-эдятся в пределах 0,40-0,50 ед.оп.пл., в то время как у ис-эдной формы средние данные составляют 0,25-0,30 ед.оп.пл.

У штамма 2508 совсем иная картина: при действии на обычна клетки мутаген не индуцировал плюс-вариантов, при дейст-ии на голодные клетки дрожжей отмечался лишь незначительный цвиг вправо.

Таким образом установлено, что на проявление летального мутагенного действия ШМ оказывает влияние физиологическое остояние клетки. Так, голодные клетки дрожжей были более ус-ойчивы к действию мутагена, что, видимо, объясняется отсут-твием синтеза белка и увеличением количества трегалозы, уси-ивающее устойчивость клеток к физико-химическим факторам -ысутаиванию, голоданию и т.д. (Саубенова, 1979; Рапопорт, 986).

Мутагенное действие И-нитрозозтилмочевины

Своеобразно действие НЭД на обычные и голодные клетки .scottli штамма 1409. Предыдущие исследования выявили табильность штамма 2508, поэтому изучение мутагенного дейст-ия НЭМ проводилось только на штамме 1409. Кривые выживаемости у штамма 1409 однотипные независимо от условий культи-ирования. Жизнеспособность обычных клеток дрожжей несколько ыше, чем у голодных (рис.5). Кроме того НЭМ индуцировал по-вление псевдомицелиальных клеток дрожжей. В литературе нет ,анных о получении подобных псевдомицелиальных клеток дрожжей од действием НЭМ.

Результатом мутационной селекции дрожжей Candida scottii вляется отбор вариантов, способных накапливать биомассу вы-¡е, чем исходные культуры ( 8 среднем на 0| 100-0,150 r/I00wt).

Некоторые Фиэиолого-биохимическне свойства отобранных

.культур,

Основными промзводс'л венно-ценными показателями дрожжей

15 30 « 60 75 за мин

Рис.5. Выживаемость дрожжей после действия НЭМ

I- обычные клетки, II - голодные клетки

является накопление биомассы, содержание белка. Отбор по эти! признакам проводили по следующей схеме: обработка мутагеном, отбор после суточного культивирования по генеративной активности; проверка отобранных культур в динамике роста, отбор по содержанию белка и его аминокислотному составу.

Исследования по индуцированному мутагенезу позволили отобрать для дальнейшего изучения 36 вариантов, из них 8 получили от штамма 2508 и 28 - от штамма 1409 (таблица 1).Из 26 вариантов штамма 1409, 18 по накопление биомассы были равны или уступали исходному штамму и только 10 превосходили еп Наибольшую биомассу, превышающую контроль, накапливали варианты, полученные после обработки НММ. Все десять вариантов по конечной биомассе превосходили исходную культуру, но только у трех из них содержание белка было значительно йьгие, чем у исходной культуры (3455, 3474, 3494). Среди остальных вариантов, отобранных после действия НГ, НЫБ не было культур, превосходящих исходную культуру по количеству биомассы. Однако среди них были варианты с содержанием белка выше ШЦ> (1109, 4405, 4447, 4474, 4544). У мутантов, полученных после обработки НГ штамма 2508, высокий выход биомассы. Однако по синтезу белка они существенно уступают известным кордам.

При окончательной .характеристике были отобраны следуют» штаммы: 1109 после действия НГ на штамм 1409; 3455, 3474, 3494 после действия ШМ на штамм 1409; 4405- после действия ШБ на штамм 1409. В процессе проведенных исследований было обнаружено, что не всегда удается получить культуры, у кото-

10

Таблица I

Биомасса и содержание белка у вариантов,отобранных после действия НММ, НГ, НМБ на штаммы 1409 и 2508

Происхожде- АСБ, г/ЮОмл

мутантов ние Белок, %

I 2 3 4

ПОЭ шт.1409 0,127-0,163 56,3-61,0

117 НГ-0,1* 0,208-0,230 58,5-60,1

1122 0,108-0,130 59,3-60,0

1210 0,367-0,420 61,8-62,0

1223 0,275-0,320 58,9-60,0

1226 0,281-0,400 56,1-57,5

1300 0,250-0,372 55,6-57,8

1306 0,190-0,313 58,1-60,0

1309 0,290-0,301 50,2-53,1

1314 0,300-0,301 50,5-53,1

3453 шт.1409 0,511-0,788 42,5-48,0

3454 НММ-0,05£ 0,420-0,554 55,2-59,3

3455 0,418-0,687 60,0-60,1

3471 0,509-0,623 50,0-58,0

3474 0,603-0,842 56,0-60,0

3476 / 1 I ' 0,588-0,614 48,0-53,0

3485 0,645-0,665 39,0-44,6

3483 0,561-0,718 40,0-48,0

3494 0,564-0,591 59,0-62,0

3496 0,507-0,581 49,0-50,0

4404 ит.1409 0,350-0,420 53,0-57,2

4405 НМБ-0,25* 0,320-0,400 60,0-63,8

4447 0,273-0,350 60,3-61,0

4474 0,350-0,430 59,0-61,5

4500 0,346-0,420 54,0-58,7

4544 0,360-0,400 58,0-61,8

4547 0,331-0,410 57,0-59,0

4560 0,360-0,400 II 55,0-57-6

I 2 3 4

2068 шт.2508 0,599-0,658 33,1-33,8

2079 НГ-0Д5& 0,630-0,650 33,1-35,7

2083 0,573-0,074 32,5—33,8

2084 0,622-0,645 33,1-32,5

2089 0,572-0,594 32,5-33,1

2090 0,568-0,600 32,5-35,0

2103 0,624-0,628 21,2-24,0

2176 0,593-0,663 28,6-29,3

Контроль 1409 0,470-0,520 58,0-60,0

Контроль, 2508 0,410-0,530 58,0-60,0

рых бы совпадали повшешшэ показатели по накоплению биомаооы в сайта зу белка, но у некоторых такая корреляция существует, что является особенно ценным. К таким культурам, которые со- ! четают в себе повышенные показатели со накоплению биомассы и синтззу белка, относятся культура, полученные после обработки ЙШ: 3455,'3474 , 3494.

Характеристика биомассы мутантов дрожкей-Подученкне варианты могут отличаться не только по количеству биомассы и содержанию белка, но и по аминокислотному составу. Сосгаг биомасон одного и того же штамма дрожжей в значительной мере может аависеть от субстрата, на котором осуществляется рост (Христозова, 1986; Е1-5ашга<31 ,1988; Тюрина, 1990). Наш проведено изучение аминокислотного состава биомассы штаммов 1409, 2508 и мугантов 1109, 3455, 3474, 3494, 4405 дрэтей с.аео^и , Рост дрожжей наблвдалк на среде Ридвр о глюкозой шш коклозой^врабинозой, так как эти иоточнюш углерода содержатся в тех или иных соотношениях в гэдролизатах древесины шш сельскохозяйственных отходах, Ре-яультаты представлены в таблица 2, Дрожжи, выращенные на средах о глюкозой и ксилозой^арабинрвой, содержали все нознг-иегаашв аминокислоты; Дсмаашруодей аминокислотой биомасон

Характерно таска бжомассн вдтантов дрояаеЗ

Таблица 2

Х409 2508 1109 3455 3474 3494 4405

к«?® гл. к+а гл. к+а гл. к+А гл. к+а гл. к+а ГЛ. к+а

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

со

Аспараги-3,86 новая кислота Треонан Серии Ешгаиа-

3,41 3,43 3,15 3,31 3,00 3,47 3,20 3,97 3,20 ЗД2 3,26 3,64 3,13

,1ДЗ ОДЭ

1,45 1,45 2,33 1,44 1,19 1,52 1,30 1,18 1,33 1,29 1,25 1,18 1,33 1,01 1,37 1,СЭ 1,02 1,16

1,26 1,39 1,02 1,32 1,10 1,21 1,0 1,17

кислота 5,25 5,05 5,02 4,79 4,98 5,28 4,20 5,58 5,41 5,68 5,58 4,74 5,32 5,65

Пролзн. 0,77, 1,29 2,13 - 1,64 0,80 1,01 0,99 1,35 0,95 1,19 0,84 1,22 1,14 1,29

Ц2СТ2Н . следа следы следа следы следы следы следа следы следы следы следы следц следы следы

Глацан ' 0,93 1,21 1,29 1,15 1,17 1,00 1,27 1,10 0,95 1,10 1,04 1,13 0,98 1,07

Алания 1,35 1,77 1,93 1,67 1,71 1,44 1,81 1,59 1,42 1,61 1,53 1,68 1,42 1,61

Валан 1,18 1,21 1,86 1,70 1,46 1,41 1,59 1,55 1,25 1,60 1,36 1,63 1,32 1,60

Меетсшн. 0,18 0,21 0,62 0,25 0,21 0,15 0,17 0,17 0,19 0,15 0,25 0,18 0,23 0,21

ИзолеЁцан0,93 1,21 1,48 1,22 1.14 1,01 1,18 1,10 0,94 1,15 1,12 1,17 1,04 1,07

ЛеЯцан 2,39 3,31 3,55 3,11 4,30 2,68 4,46 2,67 2,96 2,89 3,04 3,04 3,71 2,82

Тирозин 0,72 0,83 1,30 0,82 0,73 0,69 0,92 0,71 0,74 0,77 0,73 0,81 0,87 0,72

Фешла-лашш 0,90 1,37 1,57 1,42 1,12 0,97 1,22 1,27 0,94 1,32 1,06 1,30 1,10 1,31

I

2 3 4 5 6 7 8 9 Ю II 12 13 14 15

Т&ствднн 1,88 0,95 2,61 1,14 1,13 0,72 ' Г,46 1,16 1,36 0,89 1,41 0,96 1,15 1,12

Левин 2,58 3,01 3,61 3,36 3,02 2,68 3,05 2,81 2,54 2,76 2,81 2,93 2,89 2,80

Арлшнн 1,21 1,24 2,33 1,68 1,33 1,16 1,42 1,12 1,01 1,15 1,26 0,88 1,22 1,18

Оумка : - .....

аиинсмс-лот.г/ЮОг

пробы 27,85 30,П 35,26 30,61 28,18 24.40 31,10 27,7? 26,83 27,94 27,51 27,54 28,05 28,06

Оуыма яук-

Пршмвчание: т. - гл - среда Ридер с 1$ глюкозы

ш -к + а - среда Ридер с I% ксялозн-врабанозн

дротаей с.зео^и является глютаминовая кислота. Содержание ее варьирует в пределах 4,65-5,68 г/100 г пробы В несколько меньших количествах по сравнению о глютаминовой кислотой в клетках присутствуют аспарагиновая кислота, оланин, лейцин, вашш, содержите которых составляет от 1,18 до 4,46 г/100г пробы. Следует отметить довольно высокое содержание у воех изученных штаммов лизина - одной из очень вампа незаменимых аминокислот (2,54-3,61 г/100г пробы). В белке почти всех дрожжевнх культур метионпн обнаруживается в очень незначительных количествах (0,15-0,62 г/100г пробы). Следовые количества цистина тшсшз определяются во всех пробах биомассы дротаей. Количество осталышх аминокислот п белковых пщро-лизатах не превышает 1-2 г/100г пробы.

Таким образе«, сравнение аминокислотного состава биомассы дробей C.sccttii штошов 1409, 2508 и мутантов 1109, 3455, 3474, 3494, 4405 показало, что дрожи синтезируют полноценный белок, в состав которого входят все незаменимые аминокислоты. Колпествешюе соотношение отдельных аминокислот в боже дробной, получешшх на средах о различными источниками углерода, различно. Но суммарному количеству аминокислот отличаются шташы 2508 и 3455.

Учитывая, что величину допустимой добавки микробной биомассы к рациону, принято определять по содержанию нуклеино-знх кислот, при катаболизме которых образуется мочевая кислота, нужно обращать внимание на пх содержание. Донные по общему количеству куклеяновкх кислот, определенному у штаммов 1409, 2508 и иуталтов 1109, 3455, 3474, 3494, 4405, показаны в таблице 2, Общее количество нуклеиновых кислот у мутантов и исходного иташа близки по значения и составляют в среднем около 6,0%, что соответствует дшошн других авторов (№пшо-вяч, 1977; Кр?шова,1903),

Сопоставление количества белка, определенного у итошов 1409 , 2508 и гигантов дройгей по методу Кьеладаля и методом Лоури (табл.2), показало, что количество сирого протеина варьирует от 56,5 до 61,4$, а количество истинного белка от 37,9 до 43,45?.

Влияние Фурфурола и органических кислот на рост

ДрОЖЕОЙ Candida scottii

Производственные субстраты - гвдролизаты древесини и сельскохозяйственных отходов содержат токсические соединения, являющиеся продуктами распада углеводов. К ним относятся фур~ фурол, муравьиная и уксусная кислоты. Известно, что фурфурол сюшает процессы дыхания, размножения, влияет на синтез белка, ДНК, ШК. Поэтому устойчивость культур к ингибиторам, содержащимся в производственных средах, является весьма важным показателем, характеризующим пригодность их для производства (Лазарова, 1990). Отсода необходимость проверки выделенных мутантов на устойчивость к токсическим примесям гидролизных сред - фурфуролу (концентрация 0,1 об.%), муравьиной кислоте>(концентрация 0,1 об.#), уксусной кислоте (концентрация 0,2 обJj). Оказалось, что мутанта отличались по степени устойчивости к токсичеоким компонентам гндролизата. Так, при культивировавши «а среде йздер с добавлением фурфурола наиболее устойчивыми оказались штаммы 1409 , 3455 , 3494, с добавлением муравьиной кислоты - штамм 3494, а наиболее уо-тойчивым к, уксусной кислоте оказался штамм 3455, у них более длительный, чем у исходного штамма период адаптации сменялся ускорением роста и повышенным накоплением биомассы.

Исследование взаимодействия дрожжей Candida scottii о другим родами дродей

Известно, что в производственных ферментерах на гадро-лизатах развивается доотаточно характерная микрофлора, представленная в основном пятью-шестью культурами аспорогенных

дрожкеЙ родовHansenula, Torulopsis ,Tric.hosporon, ftygof яЪозрогч,

из которых складываются определенные ассоциации основного вида и его примесей (Семушвда, 1987; Гусарова,1985; Исакова, 1987). В связи с этим нами проведены исследования роста кормовых дрожжей на гадролиэата в ассоциации с другими видами дрожжей, сопутствующими кормовым дрожжам в проиавацстввшшзс уоловиях т.е. изучалось взаимодействие этих дрожжей мгаццу СО'ЗоЦ. Основной культурой при ЯаСЙВб бнли ДрОЖШ с. scottii Ревультат'' пря.ног№тзчи в тяблще 3. Вое ттямии-примр^и при

Т6

выращивании в монокультуре накапливали биомассы меньше, чем основной шгаш дрожжей. Только в случае с дрожяами родаНяп-зепи1а наблвдается увеличите количества биомассы, пре-вышонцее ее значеже основного штамма в монокультуре.' В смешанной культуре с дрожжами с.всоии количество биомассы всех штаммов-примесей возрастает в среднем в 2 раза.

Таблица 3

Взаимодействие дрокжей с.всо^и сдрожжаки -примесями

Культуры Накопление биомаосн в % от контроля в конечные и начальные часы культивирования Индексы взаимодействия Характер взаимодействия

MOHO- в смеси с С.Scottii штаммов принес d: i ■Р о о -и W -и ■ 4J О

233,0/115,0 316,0/150,0 2,0 2,1 мутуализм

66,0/100,0 100,0/150,0 1,1 0,6 коммвноа-

лизм

71,0/71,4 152,0/107,0 1,4 1,4 мутуализм 66,6/58,8 313,0/100,0 2,6 3,1 мутуализм

Hansenula anómala

Torulopsis pulcherima

Trichosporon

cutaneum

Zygofahcapora marxiana

Стимуляция роста культур-примесей продуктами жизнедеятельности штаммов 1409 и 2508 объясняется потребностью большинства дрожяеподобннзс грибов в витаминах. Так, известно, что

Trichosporon нуждается В ТИЗМИНЭ,Zygofatospora И Hansenula

в биотине, тиамине, пантотеновой кислоте (Исакова,1966; Бо-сеяко,1977; Градова, 1984), а дрожжи c.eccttu являются прототрофннми. Подобное явление стимуляции дрогиами c.ecottil роста дрожжей-примесей описано в литературе (Семушина,-Э71; Гусарова, 1979; Сзппкова ,1988). Взаимодействия, склацнващив-ся между основными тешат дрохгей c.soottii ж штаммами дрояжей родов Hansenula,Torulopsis,Trichosporon,Zygofabospore язлязэтся положительными. Это положительные взшшоде&зтвия

17

■mua (дутуализгла и коммецоая«зша говорят об устойчивом сосуществования культур б ассоциации.

Взашодойствп^ мутантов, .при их совмосиюл

В настоящее врзыя очевидные прешущзствэ. ,которыми микробные ассоциации отличаются от монокультур, привел« к существенному расширению сфер прю.шношш сообществ микроорганизмов б промт.даеннок производстве. Без участия микробных сообществ невозможно получение кормового бежа на основе itcrow>~ зовашл углеводов,мотана, гидролизатах,Использование законов мерностей роста и развития культур в ассоциациях позволяют повысить продуктивность микробиологического синтеза. Б тех случаях, когда ассоциацик кукно составить из близких по сво-ш фушециональным нагрузкам микроорганизмов, на первый плшх вступает продуцирухадая способность партнеров и приходиться проводить больной отбор вариантов. Нами проведен отбор смешанных культур, СОЗГОЯВДС IIS мутантов дроккей Candida scottii для ex совместного культивирования (таблица 4). Отбор смешанных культур проводили по двум показатели,1 - скорости роста и выходу дрожяей. Как видно из данных таблицы величины скорости роста и внходь дроашй не всегда коррелируют. Tait штамм 1409 в сочетании со штаммом 3474 дает выход дрожжей -76,$ при скорости роста 0,17 ч""1, тогда как сочетание штаммов 1109 к 3474 дает выход дрошеой в 2 раза меньше дри скорости роста 0.19 ч-^. При вырп'цивании штаммов дрожжей 2508 и 3494 выход драаией составил - 70,0/J при скорости роста ОД? ч""*, а в сочетании штаммов 2503 и 1409 выход дрожжей не превышал 38,0% при более высокой скорости роста -0,19ч"1 т.е. следует отметить, что мутанты по-разному проявляют себя в различных сочетаниях. Из всех изученных сочетаний по выходу дрожжей наилучшими оказались ассоциации - 1409+3474, 25084-3494, Тул 6+3494.

Эти ассоциации состоят из исходных,-штаммов-и мутантов 3474, 3494, отобранных в процессе селекции, как, культуры,превышающие исходные по количеству биомассы ( на 0,227 г/ЮОмл-•3474) и количеству бежа (на 1,5^-3494). Эти. данные одноз-

IH ' • ■■

Таблица 4

Результаты совместного культивирования мутантов дроажей

Jr.'? культур у . ч-1 У

II09+3474 0,19 35,6

1409+4405 0,16 31,0

2508+3455 0,20 63,0

Тул 6+3494 0,22 70,0

1109+4405 0,21 30,0

1409+3474 0,17 76,0

2508+3494 0,17 70,0

Тул 6+3455 0,20 58,0

II09+3494 0,21 35,0

1409+3455 0,19 35,0

2508+1409 0,19 38,0

ТУл 6+4405 0,19 42,0

Тул -6 0,16 45,0

1109 0,20 34,0

1409 0,16 61,0

2508 0,18 46,0

3455 0,18 41,0

3474 0,18 58,0

3494 0,18 47,0

4405 0,18 33,0

начно свидетельствуют о том, что совместное культивирование специально подобранных микроорганизмов перспективно для создания интенсивного и экономического микробного синтеза-;

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные дозы щтагеяов для получения цутаятов кормовых дрожжей. Candida scottii о повышенным количеством белка. Для к- нятрозохуанвдияа - это концентрация мутагена 0,1% и экспозиция 60 минут, для N -нитрозо - я - мегалбиурвта-концентрация 0,25% я экспозиция 90 минут.

2, Изучение мутагенного действия в -нитрозометилмочеви-

19

ни и я- китрозоэтилмочевшш на обычные и голодные клеша дрожкей показало, что уровень выживаемости и морфологической изменчивости больше у голодных клеток, чем у обычных.

3. Все выделенные мутанты разделены на три группы: мутант 3474 превышает исходную культуру по количеству биомассы ( на 0,227 г/100 мл), но уступает ей по содержашно белка; вдтанты 1109, 4405 наоборот, накапливают меньше биомассы,но по содержанию белка превышают контроль ( 0,6-2,4$); мутанты 3455,3494 превышают контроль и по количеству биомассы (0,100-0,112 г/ЮОмл) и по количеству белка (1,5$).

4. Большинство мутантов по аминокислотному составу белка не отличались от исходной культуры. Лишь штамм 3455 накапливал большее количество лейцина, лизина.

5.¡ВДутанты 3455, 3494 оказались наиболее устойчивыми к действию токсически: веществ, содержащихся в гидролизных средах (фурфуролу в концентрации""0,1 ой.%, муравьиной кислоте

в концентрации 0,1 о6.%, уксусной кислоте в концентрации 0,2 об.$).

6. Показано преимущество совместного культивирования различных штаммов дрожкей с.зео^Н . Наилучшими оказались сочетания 1409+3474, 2508+3494, Тул 6+3494, у которых выход дрсшсой был выше, чем у других комбинаций и монокультур.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

Iе, Сембаева М.Г., Дкуиабаева Г, А. Селекция дрожжей после действия камфорой // В сб.: "Метаболизм а изменчивость микроорганизмов" Алма-Ата, 1982, С.193-200.

2, Сембаева М.Г., дкуиабаева Г,А, Индуцированная изменчивость кормовых дрожжей // Тезисы 4 съезда ВОГиС, Кишинев,

1982, 0,52.

3, Сембаева Ы.Г., Дкумабаева Г.А. Получение штаммов кормовых дрожжей о повышенной продуктивностью // Тезисы 7 съезда ВМО, Алма-Ата, 1985, С.68.

4. Двукабаева Г.А. Влияние л-нитрозоэтилмочевииы на дрожав // В сб.: "Молодежь к научно-технический прогресс",. Алма-Ата, 1986, С.184.

5. Сембаева М.Г., Шигаева М.Х., Дкуиабаева Г.А. Зависимость

мутагенного эффекта н -нитрозомотилиочевины от физиологического состояния клеток дротаей // Известия АН КязССР, сер. биол. 1986, № 4, С.44-50.

6. Сембаева Г.А., Джумабаева Т.А. Использовшше химических мутагенов в селекции кордовых дрожяей// Материалы респ. конф. ВОГОС, Алма-Ата, 1986, C.I53.

7. Сембаева ¡¡¡. Г., Дяумабаева Г.А, Гетерогенность популяции кормовых дрожжей, полученных о применением мутагенных факторов // Тезисы конф., Красноярск, 30/IX 1987, С,25.

8. Сембаева.М.Г., Дзумабаева Г.А. Мутагенное действие гг-нит-розометплбиурета на дрожки // В сб. "Естественная и индуцированная изменчивость микроорганизмов", Алма-Ата, I9B8, Г.ЗЗ, С.162-168,

9. Джумабаева Г.А., Сембаева М.Г. Рост кормовых дрокжей на гидролизных средах // В сб. "Использование новых микробных препаратов в народном хозяйстве" Алма-Ата,1989, С,48-53,

10.Ддумабаева Г.А., Сембаева М.Г., Шигаева М.Х. Характеристика биомассы кормовых дрожжей // Известия АН КазССР, оер. биол., 1991, Л 5, С,10-15.

11.Дяумабаева Г.А. Гетерогенность физиологической и биосинтетической активностей при подборе мутантов дрожжей Candida scottil, для совместного культивирования // Тезисы докладов всес.конф. "Биотехнология и биофизика микробных популяций". Алма-Ата, 1991, С.50.

Подписано к печати 26.08.91г. Зак. Н45Э Тир.100 экз Отпечатано на ротапринте КазинформГАПК. г.Алма-Ата,пр.Ленина,38