Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура пластомных мутантов подсолнечника и горчицы в норме и после воздействия экстремальных факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура пластомных мутантов подсолнечника и горчицы в норме и после воздействия экстремальных факторов"

р Г Б од

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВА Людмила Борисовна

УЛЬТРАСТРУКТУРА ПЛАСТОМНЫХ МУТАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА И ГОРЧИЦЫ В НОРМЕ И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Краснодар - 1996

Работа выполнена в научно-исследовательском институте биологии, Ростовского государственного университета.

Научные руководители:

академик РА, доктор биологических наук, профессор Е.П. Гуськов зав. лабораторией эл. микроскопии, кандидат биологических наук Г.М. Федоренко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ст.науч.

Н.В. Воробьёв

кандидат технических наук, ст.науч. И.В. Шведов

Ведущая организация:

Кубанский государственный аграрн университет

Защита диссертации состоится 19 декабря 1996г. в 10 часов I заседании диссертационного совета К 063.40.03 при Кубанском государственном технологическом университете по адресу: 3500' ¿Краснодар, ул. Московская, 2, КубГТУ, корпус А, конференц-

зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КубГТУ Автореферат разослан "/Г' ШМкЯ^ 1996г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Г\ЫЛ] А-Д* Мннакова к.т.н., доцент

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ

Актуальность работы. В настоящее время проблема устойчи-юсти растений к действию экстремальных факторов среды приоб->етает особое значение в связи с возросшей необходимостью ие-юльзования засоленных почв и земель, лежащих в зоне недостаточного увлажнения. Для решения этой проблемы (ее теоретически аспектов) очень вешен поиск механизмов, объясняющих провесы, происходящие в клетках при действии внешних вредных ¡акторов.

Весьма перспективно в этом плане оказалось использование «етодов высокоразрешающей электронной микроскопии. К настояще-(у времени получены довольно обширные сведения по изменению гльтраструктуры различных форм растений при действии самых >азнообразных факторов среды (Куркова, 1975; Удовенко, 1977; 'довенко и др., 1980; Машанский и др. , 1987; Силаева, 1978; 1ибковская, 1979; Шэвякова и др., 1988).

На наи взгляд, целесообразно сопоставление структурных иа-¡енений растений с их некоторыми биохимическими показателям! [ля понимания метаболического значения выявленных ультраструк-'урных перестроек. Кроме того, не менее важно для решения гроблемы устойчивости, как в теоретическом, так и прикладном юпектах, выявление и получение форм, характеризующихся повы-юнной резистентностью к действию факторов внешней среды. Перфективно их использование в качестве удобных моделей в зкспе-шментах по сопоставлению ультраструктурни: перестроек, выяв-юнннх в исходных неустойчивых формах и их' мутантных линий, юзистентных к действию экстремальных факторов.

В нестоящей работе исследовались изменения ультраструктуры I содержания зеленых пигментов подсолнечника линии 3529 и гор-[ицы сорт Донская-5, а также мутантных соле-эасухоустойчивых ¡юрм, полученных на юс основе в нормальных условиях выращква-[ия и при действии хлоридного засоления, дефицита света и вла-■и. Предполагается существование определенной взаимосвязи 1у характером ультраструктурной организации органелл клСТок юследуемых растений и изменением их функционального состоя-мя, вызванного действием факторов внешней среда

Цель и задачи исследования. Конечной целью настоящей рабо-

ты является выявление особенностей и общх закономерностей изменения ультраструктуры клеточных органелл горчицы и подсолнечника при действии экстремальных факторов среды (при переходе на новый уровень функционирования) и значения (метаболического) этих изменений.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить ультраструктуру подсолнечника инбредной линии 3629 и мутанта еп: оЫоппа-5 при обезвоживании и дефиците света.

2. Исследовать ультраструктуру горчицы сорта Донская-5 и солерезистентных линий Б^и а также пестролистных мутантов.

3. Определить содержание зеленых пигментов в листьях подсолнечника инбредной линии 3629, горчицы сорта Донская-5 и резистентных мутантйв.

4. Изучить генетическую поироду соле-засухоустойчивых мутантов.

Научная новизна исследований. Впервые изучена' у. ьтраструк-тура и пигментный состав высших растений горчицы и подсолнечника и их мутантных форм в норме и при действии внешней среды: хлоридного засоления, дефицита влаги и дефицита света.

Выявлено, что адаптация исходных форм к действию этих факторов обусловлена изменением ультраструктуры пластидных компонентов.

Показано,. что у мутантных, резистентных линий действие экстремального фактора существенных изменений ультраструктуры не вызывает.

Показано влияние изменений генетической организации клеточных органелл масличных растений на оптимизацию их ультраструктурного патеррна в процессе адаптации • к вредным условиям среды. Показано, что в основе изменений ультраструктурной организации растительной клетки при переходе на новый уровень функциональной активности (под действием факторов внешней среды) леяаг два типа ультратрукгурных перестроек: изменение внутреннего строения клеточных органелл - первый тип и изменение их пространственного положения в клетке - второй тип.

Теоретическая и практическая значимость исследований. Про-

деланная работа вносит определенный вклад в понимание ультраструктурных механизмов устойчивости растений к факторам засоления и дефицита влаги, которое необходимо для создания теоретических основ выращивания растений в условиях засоленных почв и недостатка влаги, в 'иегсгронно-микроскопическое выявление пластидных мутантов резистентных к засухе и засолению. Использование этого метода, позволяет выделить перспективные мутант-ные формы как модели оптимальные для изучения механизмов устойчивости и практического использования. Выявленные изменения тонкого строения органедл могут быть использованы в качестве ультраструктурных показателей признаков устойчивости у исходных лнни!» ¡lpt1 создания целенаправленного, высоко эффективного селекционного процесса с целью получения ценных сельскохозяйственных культур, резистентных к действию экстремальных факторов.

Апробация работи. Основные положения работы были дололоэны на Всесоюзной конференции молодых ученых (Махарадзе-Анасеули, 1985), на б и 6 областной конференции "Механизмы адаптации растений и животных к экстремальным факторам среды" (Ростов-на-Дону, 1987, 1990), на 5 съезде ВОГиС (Москва, 1987), на 1 сьеэде ВОГиС (Саратов, 1994)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем работа Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, литературы и изложена на 121 странице ; содержит 28 рисунков, б табйиц, 1 схему; список литературы включает 157 наименований.

МАТЕРИАЛ!] И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований служили инбредная линия 3629 подсолнечника Helianthus annus L., а также плаотомный хлорофилльный мутант en: chlorina-5, полеченный на ее основе.

Другим объектом исследований служила горчица сарептская Brassica juncea© L., сорт Донская-б, а таю» пестролистные и солерезистентные линии, полученные на ее основе.

Индукция ШШ пласпдаъа нутацхй у гарчяг« Семянки сортовой популяции Донская-5, предварите.«,но замачивали в воде без

- б -

доступа воздуха при комнатной температуре в течение 10-12 чг i

сов. Набухшие семена раскладывали на увлажненной фильтровал: ной бумаге в чашках Петри и проращивали на водных раствор; НММ в течение 6 часов в термостате при 25°С. После окончаш шестичасовой экспозиции проростки тщательно отмывали от мутг гена 60 минут в проточной воде и в дальнейшем высевали в по. (Белецкий и др., 1990). Обработку проростков горчицы проводи: водными растьорами ШМ в концентрациях 0,01% и 0, Olí (РН-7,0). Растворы НММ готовили на 0,25 М фосфатно-цитратнс буфере (РЧ-7,0).

Получение солерезистентна форм горчицы сарепгской. Семе Ы t горчицы высевали в вегетационные сосуды с засолением NaCl концентрациях 0,8%, 1% и 1,2%. В каждый сосуд высевали по í семянок при шестикратной повторности. Почва - приазовский че] нозем. Влажность почвы поддерзкивали на уровне 60% от полис влагоемкости при помощи ежедневного полива сосудов ио весз Засоление почвы проводили дробно по 0,2% от веса сухой почвы несколько приемов (Сгрогонов и др., 1962). Условно обозначе! ные нами солерезистентные линии SRtH SR¿выделены из генераш М горчицы, прошедшей обработку мутагеном в концентрация 0,01/ , SR на провокационном фоне NaCl в 0,8%, SR на провокационнс фене NaCl в 1%.

Эл8!щюш10-ишсроскотчес!01й метод исследования. Электро! но-микроскопическое исследование структуры пластид проводи; по стандартной методике (Уикли, 1975). Применяли глутаро-осм евую фиксацию тканей листьев с последующим обезвоживанием заключением в эпоново-аравдлтовые блоки. Ультратонкие срег получали на ультрамикротоме BS-590 А и исследовали в электро! ном микроскопе ПЭМ-100.

Постановка зкеперкьклега го воздействии водного дефкщг lía ультраструктуру пластид подесшгачлигса. Растения мутам en: chlorina-5 и инбредной линии 3629 вырашгаали в сосудах массой почвы 9,6 кг. В каждом сосуде выращивали по одному рас тйнию. Почва - приазовский чернозем. Почвенную засуху создавг ли путем прекращения полива и доведения влажности почвы до ЗС ел- полной влагоемкости (60%) в условную фазу развития 5-6 па{ ' диетсев. Заданный режим влашости поддергивали в дальнейшем i псоюлпном уровне путем полива сосудов по весу.

Постановка эксперимента по воздействию св<?та на ультрас т-гктуру пластид подсолнечника. Растения инбредной линии под->лнечника 3629 и полученного из нее мутанта en:chlorina-5 вы-ццивали в сосудах в условиях вегетационного опыта. Вес почвы сосудах - 9,6 кг. Часть растений выращивали в обычных светок условиях при освещенности 18 ООО - 20 ООО люкс, другую ють - в условиях затемнения при освещенности 4 ООО лк.

Определе)0{е содержания зеленых пигментов .Содержание хло-)филлов определяли в первой , 3-5 паре настоящих листьев кон-юлыюй линии 3629 и исследуемых мутантов спектрометрически в j'X-hom ацетоне по методике (Гавриленко и др. , 197-5). Степень зглощения СЕета пигментами регистрировали на спектрофотометре ipecol-10" (Германия).

Статистическая обработка результатов опытов. Все предс-1вленные в работе опыты проводили в необходимой повторности. гатистическую обработку проводили.с использованием специально азработанной в нашей лаборатории автоматизированной системы зализа ультраструктуры клеток на базе ГОВМ типа IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ морфологических различий ультраструктуры пластид эдсолнечника исходной литот 3629 и пластомкого мутанта re chlorina-5. Электронно-микроскопическое исследование пластид эдсолнечника линии 3629 показало, что хлоропласты в норме леот ультраструктуру характерную для хлоропластов многих высях растений. Они овальной формы, их оболочка представляет со-эй двойную мембрану. Внутри органеллы видны хорошо развитая илакоидная система и большое количество рибосом. Встречаются акхе осмиофильные глобула

Обработка НММ вызывает различные изменения ультраструкту-ы хлоропластов. Прежде всего, под действием мутагена сущест-енно нарушается образование тилакоидной системы. Тилакоиды громы и гран не заполняют всего внутреннего пространства ор-анеллы. На некоторых срезах тилакоиды вообще не обнаруживают-я. тилакоидная система в органелле не имеет определенной ори-нтации. НММ вызывает изменение формы органелл. Наблюдается акже вакуолизация пластид.

Таким образом, НШ индуцирует в первой паре листьев растений подсолнечника М4в высокой степени (100%) различные изменения формы и внутренней структуры хлоропластоз.

Влияние водного дефицита на ультраструнтуру пластид плас-томного мутанта подсолнечника типа chlorina и накоторьж показатели иизнедеятельности. Необходимо отметить явление гетерогенности мутантного пластома (Michaelis, 1957) Нам удалось наблюдать два типа клеток с различными по ультраструктуре пластидами. Около 80% клеток ( подсчет сделан на основе анализа более 100 клеток) содержат пластиды с менее развитой, чем в норме, тилакоидной системой. В мутантных органеллах этого типа присутствуют тилакоиды стромы и гран. Однако последние у мутанта состоят из 3-5 ламеллярных дисков при 11 дисках у гран из хлоропластов зеленой линии. Гораздо меньшие размеры имеют и крахмальные зерна.

Остальная часть клеток мутанта имеет пластиды с более просветвленной стромой и внутренними мембранами, .представленными в основном лишь гилакоидами стромы. Крахмальных зерен в таких пластидах обнаружено не было. Оба типа пласФИм размерами не различаются.

Негативное влияние водного дефицита у линии 3629 начинает проявляться уже спустя неделю после начала действия стрессового фактора. Уплотняется строма хлоропластов, наблюдается разбухание тилакоидов, дезорганизация всей внутренней системы мембран, что является первой заметной реакцией хлоропластов на засуху (Генерозова, 1978). Появляется большое количество осми-офильных глобул. Через две недели влияние стрессового фактора усиливается. Те структурные изменения органелл, о которых говорилось выше, еще более углубляются. Процесс гранообразования сильно блокируется.

Реакция мутантных пластид на водный дефицит не является однозначной. Спустя неделю после начала действия стрессового фактора довольно часто встречаются клетки с органеллами, совершенно не отличимыми по ультраструктуре от пластид, не подвергавшихся отрицательным воздействиям. Воздействие негативного фактора проявляется лишь в незначительном уплотнении стромы некоторых пластид и небольшом увеличении количества и размеров осмиофильных глобул. Анализ электроннограмм мутантных пластид

двухнедельной засухи показал при значительном числе осмиофиль-ных глобул наличие хорошо развитых гран во всех пластидах, чего при нормальных условиях не отмечалось. На основании этого можно предположить, что водный дефицит вызывает усиление процессов гранообразования в тех пластидах, у которых в норме образуются лишь тилакоидн стромы.

Нами проведено исследование мутантных пластид и пластид линии 3629 в условиях водного дефицита не только на растениях, выросших в вегетационных сосудах, но и на полевом материале. Наблюдаются сходные изменения ультраструкгуры пластид в условиях засухи как мутанта, так и у линии 3629.

Результаты исследований некоторых показателей нормальных и мутантных растений, выращенных при различных условиях (засуха и норма) представлены в таблице 1.

Влияние засуги прежде всего сказывается на росте растений (Генкель, 1982; Сатарова, 1978). В нашем случае под действием засухи наблюдается снижение высоты растений как мутанта, так и исходной линии. Независимо от генетической природы растения выявлена однозначная реакция, поскольку высота растений б обоих вариантах в неблагоприятные годы достоверно (р 0,999) снижалась примерно на 10%.

Засуха приводит к изменению содержания зеленых пигментов. Как следует из таблицы 1 количество пигментов в обычные годы в обоих вариантах в фазу бутонизации возрастает. Особенно это заметно для мутанта, где повышение является более чем двукратным (с 2,50-2,57 мг/г до 5,56-5',99 мг/г). Иное положение складывается в засушливые годы. У линии 3629 в фазу бутонизации происходит снижение содержания зеленых пигментов. Так, в 1983 году оно уменьшилось с 8. 69 мг/г в фазе 3-5 пары листьев до 5,5 мг/г. У мутанта же в засушливых условиях количество хлорофилла в процессе развития растения или продолжает возрастать (1981 г.), или существенно не меняется (1983 г.). Тем не менее, общее содержание хлорофилла у-мутанта в фазу бутонизации, определявшееся в экстремальных условиях, все же ниже, чем у линии 3629. Кроме того, при сравнении данных контрастных лет видно, что в засуху количество зеленых пигментов у мутанта все-таки снижается. Степень этого снижения по сравнению с исходной линией была меньшей только в 19В1 году. В гаеуху 1983

года различия в этом плаце между мутантом,и зеленой линией не проявились. Возможно, это определяется тем, что поражающее действие засухи в 1983 году было более глубоким, чем в 1981.

Об этом же свидетельствуют и данные по урожайности мутантов в условиях засухи разных лет..

В 1983 году мутант примерно на четверть снизил свою продуктивность, в то время как в 1981 году масса семянок с одного растения почти не отличалась от такого же показателя в обычные годы. Между тем, урожайность инбредной линии 3629 в засушливые годы сяизилас:, на 40-47% . Несмотря на это, по абсолютному показателю продуктивность мутанта в засуху в лучшем случае лишь приближается к продуктивности инбредной линии.

Ультраструктура пластид пластомного мутанта подсолнечника, вырадешюго в разных световых условиях. Мы провели электронно-микроскопическое изучение мутангных пластид в различных условиях освещенности. Результаты морфометрического анализа,

Некоторые показатели нормальных и мутантных растений, выращенных при различных условиях (засуха и норма)

Таблица 1

|Год | Линия |опыта|

Высота |Содержание зеленых пигментов|Масса растений | мг/г абс. сух. веса семянок | семянок

см.

I- ¡на одно

| 5аза 3-5 пары | 4аза |растени I листьев |бутонизации | г.

11980 3629 138,2+1,4 I еп: сЫ. -5 103,7+1,0

8,35 2,50

9,46 41,9+1, 5,56 22,8+1,

11981 3629 123,2+1,2 |(зас. )еп: сЫ. -5 • 91,7+1,3

7,89 2,81

5,68 24,6+1, . 4,59 21,4+2,

11082 3629 132,3+1,4

I еп:сЬ1.-5 105,6+1,1

6,51 2,57

9,02 42,6+1, 5,99 23,7+1,

¡1983 3629 120,7+1,3

¡(нас. )сп: сЫ. -5 93,2+1,2

8,69 3,43

5.50 22,7+1, 3,86 18,4+1,

который дал возможность глубже оценить влияние мутационного изменения пластидного генетического материала на ультраструктуру органелл, проведены в таблице 2.

Таблица 2.

Некоторые показатели нормальных и муталтных пластид в зависимости от интенсивности освещения

1 1 | Линия i Вариант | Площадь, 1 см | Число тилакоидов в гране 1 I Отношение | тилакоиды/| пластиды| 1 1

1 1 |среза | |пластид ) > 1 1 мембран| пластид| |

13629 нормальное освещение затемнение 47,7 63,9 2,26 2,9 9,1 15,6 0,037 . 0,044 |

|en: chlo |rina-5 нормальное освещение затемнение 32,8 32,5 0,83 1,34 5,8 14,0 0,022 | 0,038 | 1

Изменение светового режима приводит к увеличению размера хлоропластов у дикой линии на 30%, увеличению абсолютной плошали системы внутренних мембран более чем на 20% увеличивается и относительная площадь мембранной системы органеллы.

Реакция пластидного мутанта на изменения интенсивности освещения несколько иная. Прежде всего в отличие от дикой линии у мутанта не увеличиваются размеры пластид. Интенсивнее, чем у зеленых пластид, происходит увеличение абсолютной площади внутренних мембран более чем на 50%. Соответственно возрастает и относительная площадь мембранной системы.. Почти в три раза увеличивается число тилакоидов на грану.

Следовательно, снижение интенсивности освещения модифицирует проявление пластидной хлорофилльной мутации подсолнечника, приводя к увеличению числа тилакоидов в гране и относительной площади мембранной системы, но не затрагивая площадь органеллы.

Генетический анализ пестролистных форм, иидуцкроваииьк Н- нитрозо- Н-штилмочевннсй у горчицы. При помощи НММ мы полу-

чили мутантные формы у горчицы сарептской. В основном они были представлены пестролистными растениями.

Фенотипически пестролистные растения характеризуются наличием на листьях белых, желтых или желто-зеленых участков различных размеров с четко выраженной границей медцу зеленой и мутантной тканью. Для определения генетической природы полученных мутантов проведен подсчет расщепления в потомстве пестролистных растений. Были проведены также реципрокные скрещивания пестролистных растений с зелеными растениями исходной сортовой популяции горчицы.

Таким образом, на основе двух критериев - неменделевского расщепления в потомстве и различий между реципрокными гибридами - установлено внеядерное наследование пестролистности у горчицы.

Индуцированные НШ внеядерные пестролистные мутации горчицы характеризовались сниженным содержанием хлорофиллов и ка-ротиноидов в мутантных тканях листьев. Степень этого снижения находилась в зависимости от фенотипического выражения признака пестролистности. Визуально по фенотипическому призн ку пестролистные линии горчицы можно разбить на три группы: зеленые растения с белыми участками, зеленые растения с желтыми участками и зеленые растения с зелено-желтыми участками. Результаты определения содержания хлорофиллов а+в и каротиноидов в лмстях пестролистной горчицы в фазу начала бутонизации представлены в таблице 3.

' Видно, что мутантная ткань пестролистных растений характеризуется пониженным по сравнению с контролем содержанием зеленых и желтых пигментов. Так, белые участки листа содержат фактически следы хлорофиллов а+в и каротиноидов, чуть больше -гжлтые участки, а зелено-желтые участки содержат хлорофилло! половинное количество, а каротиноидов - приблизительно 1/3 о-; содержания их у зеленых растений сортовой популяции. Зелены« участки пестролистных растений по содержанию хлорофиллов приближаются к контрольному показателю или даже несколько превосходят его.

Ультраптруктурный анализ пестролистных форм горчицы са релтской, индуцированных НММ. С целью выяснения структурно организации пластид в мутантных тканях пестролистных растений

Таблица 3.

Содержание хлорофиллов а+в и каротиноидов в листьях пестролистной горчицы в фазу начала бутонизации (полевой опыт).

1 | линия 1 1 содержание, мг/г сырой массы |

фенотип | 1 хлорофиллов | а+в | 1 каротиноидов |

| М+м

¡контроль зеленый 13,760 + 0,30 1,260 + 0,20 !

|пестролистная- 8 белый 0,298 + 0,05 0,020 + 0,0011

зеленый 14,770 + 0,30 0,450 + 0,03 1

|пестролистная- 1 желтый 0,354 + 0,05 0,150 + 0,05 |

зеленый 9,820 + 0,16 0,240 •ь 0,05 |

пестролистная - 15 зелено- 6,500 + 0,16 0,350 + 0,07 |

желтый

зеленый 12,710 + 0,11 0,940 + 0,05 |

горчицы нами было проведено электронно-микроскопическое исследование.

Внутреннее строение хлоропластов зеленых растений горчицы сорта Донская-5 сходно с внутренним строением хлоропластов других высших растений. Хлоропласты овальной формы, органеллы , имеют хорошо развитую мембранную систему, представленную тила-коидами стромы и тилакэидами гран. Тилакоидная система занимает все внутреннее пространство хлоропласта, что свидетельствует о высокой функциональной активности органеллы. Отмечено • большое количество органелльных рибосом. Встречаются довольно крупные крахмальные зерна, а также осмиофильные пластоглобулы.

Ультраструктура пластид зелено-желтых участков листа пестролистных растений отличается от таковой у зеленых растений. Даже без специальной морфометрической обработки хорошо видно, что количество ламелл в многочисленных гранах значительно

меньше, чем в норме, зато увеличилось число тилакоидов стромы. длина которых также выросла. Отмечено набухание межтилакоидно-го пространства тилакоидной системы, особенно четко оно выражено у тилакоидов стромы. Крахмальные зерна более многочисленные, но несколько меньше по размерам. Пластоглобулы также несколько меньших размеров и содержат просветвленный матрикс. Митохондрии более крупные, чем у контрольных растений, и плотнс прилегают к пластидам.

Анализ электроннограмм пластид из желтых участков листг показал, что только немногие из них содержат мембранный комплекс, представленный редкими тилакоидами гран и стромы, межги-лакоидное пространство последних значительно набухло. Пластоглобулы локализованы в виде отдельных скоплений их многочисленных мелких электронноплотных частиц, содержащих более десят] единиц. Крахмальные зерна практически не встречаются. Митохондрии крупные, с набухшими кристами.

В белых участках ткаги пластиды тилакоидной системы н< содержат, их матрикс представлен мелкодисперстным содержимым < рассеянными в нем электронносветлыми вакуолями. ' Шастоглобул] наблюдаются в виде значительных скоп^ний мелких электрон но-плотных частиц. Митохондрии крайне малочисленны, кристы : них слабо выражена

Таким образом, тонкое строение клеточных органелл мутант ных растений отличается от контрольных, особенно существенн различия в пластидах. Это прежде всего уменьшение размеро гран и увеличение их числа, набухание мзжт илакоидного прост ранства в зеленых участках ткани, частичное и полное отсустви тилакоидной системы в желтых и белых участках соответственно а также изменение размеров и числа пластоглобул, их электрон ной плотности и пространственной организации.

Исследование пигментного состава и ультраструктуры плас •гид ссшэрезистентных линий горчицы, индуцированных НММ, п; различных режимах хлоридного засоления. В результате вырашивг ния нескольких инцухт линий хлорофлльных мутантов горчицы * засоленном фоне были выделены 2 лииии горчицы, условно обознз ченные нами Эй^и , фенотипически зеленые, которые мы взя.; для исследования. Ультрасгруктурное изучение хлоропластов Л1 кии БК'а.и ¡проводилось в сравнении с контрольным сортом Доне

кая-5. Ультраструктура контрольных растений сорта Донская-5 (проросших на пресном фоне) описана нами выше.

1% засоление хлористым натрием существенно меняет организацию тилакоидной системы сорта Донская-5. Она представлена в основном гранами состоящими из 3-5 ламелл. Граны имеющие большое число ламелл немногочисленны. Крахмальные зерна практически отсуствуют, электро:лноплотные пластоглобулы обладают незначительными размерами (0,05 мкм.). Клеточная мембрана со стороны вакуоли образует значительные впячивания и инвагинации.

Для ультраструктуры мутантных линий 5!?,, и выращенных на пресном фоне, характерно наличие крупных крахмальных зерен, занимающих до 80% площади среза пластиды. Многочисленные граны с меньшим числом ламелл по сравнению с исходной линией (4,6 ед. и 9,2 ед. соответственно) равномерно расположены по площади среза пластида. Тилакоды стромы редки. Пластоглобулы крупные и электронноплотные, митохондрии ненабухшие с уплощенными кристами.

Анализ солеустойчивой линии при 1% засолении показал наличие в пластидах этих растений больших крахмальных зерен, занимающих большую площадь среза Тилакоидная система образована в основном, гранами с числом ламелл 15 ед. Межгилакодное пространство расширено, особенно значительной величины набухание достигает в тилакоидах стромы. Пластоглобулы довольно крупные до 0,3 мкм. и имеют неоднородную электронную плотность. Ультраструктурная организация тилакоидной системы соле-резистентной линии Б^при 1%'засолении МаС1 сходна с таковой линии 3!?}.

При ^засолении 1,2% НаС1•набухание межтилакоидного пространства снижается, уменьшается также размер крахмальных зерен, хотя во многих пластидах они по-прежнему достигают значительной величина Выросла общая электронная плотность за счет включения в строму пластид и цитоплазмы значительного числа мелкодисперотных частиц.. Анализ ультраструктуры линии ЗЯ,и ЗГ<3 при 1,2% засолении МаС1 показал, что хотя часть пластид и содержит крупные крахмальные зерна возрастает доля пластид их не содержащих, особенно это характерно для линии Отаечеко

также наличие незначительного набухания ыежгллаксидного пространства, вакуолизация цитоплазмы и отсусгвие элиегрошюплс-тно-

го слоя на клеточной стенке.

Результаты сравнительного морфологического анализа срезов ■хдоропластов солерезистентных линий и контрольного растения в зависимости от условий выращивания псказали различие ультраструктуры сорта Донская-5, выращенного в условиях засоления. Прелде всего засоление у Донской-5 приводит к уменьшению числа ламелл в гране с 9,2 до 6,56 ламелл, к отсуствию крахмальных зерен, занимающих в норме до 50% площади всей сгромы пластиды, уменьшению размеров пластоглобул с 0,17 до 0,025 смги их количества на рез пластиды с 0,095 до 0,047 в условных единицах.

Направленность изменения ультраструктуры у исследуемых линий в зависимости от условий выращивания другая. Засоление приводит к уменьшению плошади крахмальных зерен у БЯди до уровня Донская-5 на пресном фоне. На пресном фоне площадь крахмала З^и равна 32 и 22 см* а при засолении уменьшается до 7 см.8, Пластоглобулы крупные и их размеры от условий выращивания у линий особо не меняются, где-то 0,2 см.1" По результатам таблицы видно,,что засоление оказывает влияние на изменение ультраструктуры пластид БИ^и 5Н3, но в меньшей степени по сравнению с Донской-5. Следовательно, линии БК^и БЕ солерезистенгные в сравнении с Донской-5.

СШСУВДШШ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для выявления обидах закономерностей изменения тонкогс строения внутриклеточных органелл нами были изучены две масличные культуры горчица сарептская сорт Донская-5 и инбреднш линия подсолнечника 3629. Сравнительный анализ ультраструктур! клеток показал, что ультраструктура пластид горчицы сарептско! сорта Донская-5 сходна с ультраструктурой пластид подсолнечника инбредной линии 3629 и типична для высших растений (Курко-ва, 1976; Удовенко, 1977; Силаева, 1978).

Анализ морфологических различий ультраструктуры пласти, подсолнечника и горчицы, их пластомных мутантов показал, чп ьта эффективно воздействует на пластом подсолнечника и горчи ии, что совпадает с данными генетического анализа. Сравнива полученные данные. с результатами, приведенными в литератур Г.*п гнойтх растений, у которых удалось получить мутации

шастоме (томаты, табак, львиный зев, узумбарская фиалка), на-1более чувствительными органеллами к данному агенту оказались ]ластиды подсолнечника (Walters et al. , 1990).

Высокая избирательность НММ в отношении хлоропластов под-¡олнечника и горчицы определяется как физико-химическими сеой-:твами мутагена (способность к комплексообразованию, склон-юсть к связыванию с липидами), так и некоторыми особенностями объектов. Такими особенностями могут быть число единиц Пластова, состояние обмена клетки и определяемые этим обменом свойства мембран органелл. Показано, что липиды, их количество и качество играют валяную роль в способности ДНК реагировать с штрозосоединениями, что они представляют собой компоненту, осиливающие или ослабляющие специфичность мутагена.

Прежде всего, под действием мутагена существенно наруша-зтся формирование тилакоидной системы. Тилакоидная система мутантов представлена, в основном, многочисленными небольшими гранами, относительно равномерно распределенными в строме чластид. Торможение образования тилакоидной системы приводит к гому, что тилакоиды не заполняют всего внутреннего пространства органеллы. Иногда гранообразование усиливается, но в этом злучае тилакоидная система в органелле не имеет определенной ориентации. Отмечено в значительной степени набухание межгила-•гаидного пространства. В некоторых пластидах обнаружена вакуолизация тилакоидной системы. Мутаген вызывает также изменения |юрмы органелл. Крахмальные зерна имеют гораздо меньшие размеры по сравнению с контролем у подсолнечника. А у солерезистен-гшх мутантов горчицы SRaH SR5 крахмалообраэование сохраняется на достаточно высоком уровне. Митохондрии набухшие, с элект-ронносветлым матриксом и редкими расширенными кристами. Степень выраженности этих изменений в разных пластидах различная, что и определяет гетерогенность в тонком строении мутантных пластид.

Анализ данных по содержанию зеленых пигментов показал, что уменьшение площади тилакоидной системы у мутантных растений сопровождается сниженным количеством зеленых пигментов и наоборот. Результаты определения пигментного состава пестролистных мутантов горчицы показали, что они характеризуются сниженным содержанием хлорофиллов а+в и каротиноидов. Причем,

степень этого снижения зависит от фенотипического признака пестролистности. Например, в белых участках содержатся буквально следы хлорофиллов а+в и каротиноидов (0,298 мг/г сырой массы в белых участках при 13,760 мг/г у контроля а+в и 0,02 мг/г каротиноидов в белых участках при 1,26 мг/г у контроля). Таблица 3. Б зеленых участках пестролистных растений количество пигментов приближается к контрольному показателю или даже несколько превосходит его. Последнему факту мы находим следую* щее объяснение. Поскольку белая мутантная ткань пестролистного растения, не способная к фотосинтезу, существует ва счет зеленой части, снабжающей ее продуктами фотосинтеза, функциональная активность этой последней может повышаться.

Для изучения действия экстремальных факторов нами были отобраны на засоленном фоне резистентные мутанты подсолнечника еп: сЫог!па-5 и горчицы БИз, которые имеют похожую ультраструктурную организацию. Солерезистентные линии горчицы Б1?е. и взятые нами для исследования, фенотипически зеленые, но имеют ультраструктурную организацию тилакоидной системы отличную от таковой контрольных растений горчицы сорта Донская-5. Эти формы могут оказаться в дальнейшем перспективными в селекции, так как они сохраняют с одной стороны практически нормальное содержание хлорофилла, с другой стороны имеют измененную природу хлоропластов, обеспечивающую повышенную устойчивость к экстремальным факторам среды.

Действие фактора обезвоживания на подсолнечник и хлорид-його засоления на горчицу вызывало закономерные и достоверные изменения ультраструктуры исходной линии 3629 и сорта Донская-5, причем характер этих изменений сходен. В обоих случаях отмечено негативное влияние засухи и засоления на контрольные растения подсолнечника и горчицы сорта Донская-5, которое проявляется в набухании межгилакоидного пространства, уменьшении числа ламелл в гранах, уменьшении размеров пластоглобул, уменьшении крахмальных зерен при обезвоживании у подсолнечника и полном их отсуствии у горчицы при хлоридном засолении. Содержание зеленых пигментов также снижается как в условиях обезвоживания у подсолнечника, так и у горчицы при хлоридном засолении.

Из полученных результатов следует, что засоление и обез-

воживание вызывают ухудшение количественных и качественных характеристик ультраструктуры • пластид подсолнечника и горчицы. Смысл выявленной пространственной реорганизации гилакоидной системы, которая выражалась в уменьшении числа и размеров гран, в их более равномерном распределении по всей строме пластиды, очевидно, заклочается в ее более оптимальной организации для функционирования в условиях обезвоживания и засоления. В литературе так»й отмечены факты пространственной перестройки клеток с целью оптимизации их функций (Андреева, 1971; Куркова, 1975; Силаева, 1978).

Действие обезвоживания и засоления на мутантные растения подсолнечника и горчицы не оказывало существенного влияния на их улм ригп'руктуру и пигментный состав.

Так при действии засухи в мутантных пластидах подсолнечника, у которых наблюдалась вакуолизация, вакуоли исчезали, тилакоидная система приобретала упорядоченный характер, что проявлялось в их продольной ориентации. Из результатов таблицы 2 следует, что засуха приводит к снижению содержания зеленых пигментов и урожайности растений линии 3629, тогда как у мутантных растений в засушливых условиях содержание пигментов в процессе развития растения и масса семянок с одного растения существенно не менялось.

Таким образом,' экстремальные воздействия (засуха и засоление) вызывают у контрольных, неустойчивых растений, изученных масличных культур подсолнечника и горчицы, глубокие уль--траструктурные органелльные перестройки, проявляющиеся в изменении внутреннего строения клеточных органелл (набухании меж-тилакоидного пространства, уменьшении размеров пластоблобул и крахмальных зерен) и их пространственной реорганизации, которая выражается в,уменьшении числа и размеров гран, в и;: более равномерном распределении по всей строме пластиды.

Внутреннее строение и пространственная организация тила-коидной системы мутангнкх линий» в основном, похожа на ультраструктуру контрольных растений при действия описанных Факторов.

Действие факторов засоления и обзРБокивалпл существенно не изменяет ультраструктуру иссдэдуемых рейиетентн!«* мутантон горчицы и подсолнечника, что свидетельствует об их оптимальной

организации для функционирования в условиях действия изученных факторов.

Таким образом, характер изменения ультраструктурной организации пластид у подсолнечника при обезвоживании и у горчицы при засолении одинаков.

Иной характер изменений ульграструктуры пластид исходных и мутантных растений подсолнечника был отмечен в экспериментах по во?действию света различной интенсивности. Так у контрольных растений линии 3629 снижение светового режима приводит к увеличению размера хлоропластов на 30%, увеличению абсолютной площади системы внутренних мембран более чем на 25%, увеличению числа тилакоидов в гране (15,6 ед. в условиях затенения при 9,1 ед. в нормальных условиях освещения) Таблица 2.

Реакция мутанта на недостаток освещения несколько иная. В отличие от дикой линии у мутанта, не увеличиваются размеры пластид. Интенсивнее, чем у контрольных растений, происходит увеличение абсолютной площади внутренних мембран более чем на 50%. Соответственно возрастает и относительная площадь мембранной системы с 0,022 до 0, 038 усл. ед. Почти в три раза увеличивается число тилакоидов на грану (14,0 в условиях затенения при 5,8 в норме).

Сопоставляя данные по действию дефицита света с данным» по действию обезвоживания и засоления видно, что изменения однотипны, однако, имеют свою специфику, которая проявляется I уменьшении числа тилакоидов в гранах при водно-солевом стресс« и увеличении количества тилакоидов в гранах при недостаточно» освещэний. Эта специфика, видимо, определяется иной природо! действующего фактора.

В исследованиях Климова, касающихся изучения влияния хо-лодового закаливания на структуру и функцию хлоропластов озимой пшеницы были теоретические разработки возможного структурного механизма адаптации растений к экстремальным условия] среды (Климов и др. , 1990). Нам удалось экспериментально докапать. что именно такое строение тонкой структуры хлоропласто: пи в экстремальных условиях. Очевидно, это связано I

.меньшими энергетическими затратами в неблагоприятных условия Функци.'ииропания.

ВЫВОДЫ

1. НММ индуцирует в первой паре листьев растений подсол-[ечника Ы| различные изменения формы и внутренней структуры :лоропластов.

2. Показано, что ультраструктура пластид горчицы сарептс-;ой сорта Донская-5 в общих чертах сходна с ульграструктурой [ластид подсолнечника инбредной линии 3629 и типична для высота растений.

3. Для ультраструктуры мутантных (резистентных) форм гор-шцы и подсолнечника характерна высокая степень гетерогенности IX пластид. Тилакоидная система представлена, в основном, мно-•очисленными относительно небольшими гранами, равномерно расп->еделенными по всей строме пластиды. Характерно наличие значи-■ельного числа крупных пластоглобул, имеющих неравномерную ¡лектроннуга плотность и больших по размерам крахмальных зерен.

4. Хдоридное засоление и обезвоживание вызывают значитель-ше изменения ультраструктуры хлоропластов горчицы сорт Донс-сая-5, которые проявляются в набухании межгилакоидного прост->анства, уменьшении числа и размеров гран, в более равномерном »определении мейбранно-тилакоидной системы в строме, снижении электронной плотности пластоглобул, уменьшении их числа, а :акже числа и размеров крахмальных зерен.

5. Действие обезвоживания и засоления не вызывает сущест-¡енного изменения ультраструктуры исследуемых мутантных расте-шй, однако, отмечено некоторое увеличение значений ее морфо-¿етрических показателей.

6. Сопоставление данных о содержании зеленых пигментов в 1ластидах обоих типов (мутантные и нормальные) с их морфомет-эическими показателями степени развитости мембран тилакоидной ¡истемы позволяет предполагать о ее высокой функциональной активности.

7. На основании сравнительного анализа, полученных данных ю организации тонкого строения хлоропластов масличных культур тодсолнечника и горчицы, и их мутантных резистентных форм, выращенных в нормальных условиях и в условиях водно-солевого :тресса, недостатка освещения, а также цитохимических данных

можно заключить, что выявленные нами изменения ультраструктуры, связанные с изменением их функционального состояния при стрессе, обусловлены двумя типами структурных перестроек : первый тип - связан с изменением внутреннего строения орга-нелл, второй тип - с их пространственным перераспределением е клетке, причем направленность изменений одинакова, но имеет свою специфику связанную с природой действующего фактора

8. Разработан электронно-микроскопический экспресс-метод для ранней диагностики пластомных мутантов подсолнечника и горчицы, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, который позволяет проводить предварительный отбор перспетаивных форм на ранних этапах онтогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белецкий ЯГ Д. , Федоренко Г. М. , Раэорителева Е. К.. Степанова Л. Б. Реверсия у пластомного мутанта подсолнечника типа СЫ.ог1па// Цитология и генетика Т. 15, N 1. С. 34-38.

2. Белецкий Ю. Д. , Степанова Л Б. , СЕедоренко Г.;Влияние М-нитрозо-М- метилмочевины на ультраструктуру пластид подсолнечника в М // Цитология и генетика 1981. Т. 15, N 4. С. 3-6.

3. Белецкий Ю. Д., Щербакова Л. Б. Индуцированная М-нитро-зо-Н-метилмочевиной изменчивость хлоропластов в Ы //4-ый сьезд ЮГиС им. Е И. Вавилова: Тез. работ. М., 1982. С. 48.

4. Щербакова Л. Б., Белецкий Ю. Д., Раэорителева Е. К , Федоренко Г. М.//Рукопись деп. ВИНИТИ. 1985. N 2836-85.

5. Щербакова Л. Б., Белецкий КХ Д. , Федоренко Г. 11 Ультраструктура пластид жизнеспособных мутантов подсолнечника типа сМоПпа //там же, N 2837-85.

6. Щербакова Л. Б. Ультраструктура нормальных и мутантных хлоропластов подсолнечника в условиях засухи.// Всесоюзная конф. молодых ученых: Тез. докл. М., 1985. С. 197.

7. Щербакова Л. Б. и др. Ультраструктурная основа адаптации мутанта подсолнечника к обезвоживанию. // 5-ый сьезд ВОГиС им. Е И. Вавилова Тез. работ Ы. , 1987. С. 53 .

8. Белецкий К1 Д. , Щербакова Л. Б., Раэорителева Е. К., Федоренко Г. М. Ядерная супрессия выражения пластидной мутации у подсолнечника. //ДАН СССР. 1987. Т. 239, N 3. С. 714-716.

9. Щербакова JL Б. , Федоренко Г. М. Изменение ультраструктуры внутриклеточных органоидов при действии на организм некоторых экстремальных факторов среды.// 5-ая обл. научно-практическая школа- семинар: Тез. докл. 1987. С. 239-240. Рос-тсв/Дон.

10. Щербакова Л. Б.. Разорителева Е. К. Резистентный к засухе пластидньй хлорофилльный мутант подсолнечника. // тг ч же 1987. 0. 240-241.

11. Щербакова Л. Б. и др. Влияние водного дефицита m /ль-траструктуру пластид пдастомногго мутанта подсолнечника типа chloriпа. //Цитология и генетика. 1988. Т. 22. N 3. С. 53-54.

12. Щербакова Л. Б. и др. Ультраструктура пластид пластом-ного мутанта подсолнечника, выращенного в разньх световых условиях. // Цитология и генетика. 1989! Т. 23, N 5. С. 59-60.

13. Щербакова Л. Б. Модифицирующее влияние интенсивности освещения на ультраструктуру мутагтных пластид подсолнечника.// 6-ая областная научно-практ. школа-семинар: Тез. докл. 1990. С 180

14.(1ФеДоренко Г. М.. Щербакова Л. Б. . Разорителева Е. К Исследование генетической природы и механизмов солеустойчивости у горчицы.// Генетика 1994. Приложение. Т.30. С. 163-164. Тез. докл. • ,

' 15. Федоренко Г. М.. Щербакова Л. Б., Разорителева Е. К. . Карнаухова T. R . Сизова Л. И. Генетический и ультраструктурный анализ пестролистных форм, индуцированных Н-нитрозо-N- метил-мочевиной у горчицы. //Генетика. 1995. Т. 31, N 4. С. 504-509.

Подписано к печати 05.11.96. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага типографская. Обьем 1,44 п. л. Тираж 100 экз. Тип. ЦНТИ. Зек. 95"