Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая и генетическая характеристика пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных N-нитрозо-N-метилмочевиной

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая и генетическая характеристика пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных N-нитрозо-N-метилмочевиной"

РГ6 од

1 М 1393

министерство науки, высшей школы и технической политики российской федерации

ростовский ордена трудового красного знамеш государственный университет Специализированный совет К 063.52.09

На правах рукописи

УСАТОВ Александр Вячеславович

биохимическая и генетическая характеристика пяастомных мутантов подсолнечника индуцированных к-н5строзо-н-мет№шочешной

03.00.04 - биологическая имя 03.00.15 - генаткка

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1993

Работа выполнена а отделе молекулярной гонотда НИИ Биологии Ростовского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета.

Научные руководителя:

кандидат биологических наук

Ю.Д. Белецкий

доктор биологических наук, профессор Е.П. Гуськов

Офицольвде оппопентн:

Ведущая организация:

доктор биологических наук М.С. Одинцова

доктор биологаческих наук О.Г. Даввдэнко

Институт экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича АН Беларуси

Защита диссертации состоится итая 1933 г. в асов на заседании специализированного совета К 063.52.09 по защите диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Ростовском государственном университете /344006, г.Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РТУ. Автореферат разослан Ж С^гс?^ 1993 Г,

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

В,К. Кирой

-I-

онцая характеристика проблемы

Актуальность проблемы, открытие ДНК в составе пластид около 30 лет назад, половило начало экспериментальным исследованиям пластид как относительно автономных генетических систем растительной клетки и поставило вопрос о месте и роли пластидного генома в процессах регуляции развития и жизнедеятельности растительных организмов. ДНК пластид, на дол» которой приходится до 102 всей клеточной ДНК, учзствует в реализации жизненно вааашх функция растительной клетки. Геном пластид кодирует около половины белков, участвующих в фотосинтезе, а также ряд компонентов пластидной белок-синтезкрувдбй системы. С ним связаны многие хозяйственно ценные признаки растений, такие как устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, некоторым антибиотикам, гербицидам, грибным патогенам.

Как правило, в естественных условиях, мутации в пластидной ДНК возникают с частотой не Солее 0,02-0,06$ (Назетапп, . 1979). Поэтому увеличение ассортимента мутаций в плзстоме с помощью индуцированного мутагенеза, существенно ускоряет решение многих проблем не только генетики пластид и теории химического мутагенеза, но и некоторых разделов биохимии, физиологии растений и селекции.

Однако направленное получение мутаций пластид у высших растений до сих пор сопряжено с отсутствием теоретической базы механизма их становления (Белецкий, 1989; ЯаПегэ ег а1., 1990). В связи с этим приобретает особую актуальность изучение механизмов индукции мутация в пластоме высших растений и, в частности* роли репликации пластидной ДНК в этих процессах.

В настоящее время в отдела генетики НИИ биологии РТУ создана значительная коллекция пластом!шх мутантов подсолнечника с использованием в качестве индуктора . мутаций М-нигрозо-Ы-метклмочевиш. С помощью гибридологического анализа и других методов была доказана пластидная природа индуцированных мутаций. Ранее проведенный сравнительный анализ рака пластомных мутантов подсолнечника не выявил существенных различий с исходной линией по некоторым биохямичесгам характеристикам (Таран, 1991). Логика исследований привела нас к необходимости сравнительного анализа данных мутантов непосредственно на уровне ДНК, так как решатоим доказательством пластидной природа индуцированных мутантов является выявление, изменений' в структуре собственно органелльиого

генома.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исслэдовашю роли репликации генетического материала пластид в индукции пластидннх мутаций, а тьюее сравнительный биохимический анализ хлДНК плестскных мутантов подсолнечника, • индуцированных №01.

Исходя из поставленной цели, Снли сформулированы следувдте задачи:

- определить »Кактивное время индукции НММ пластидннх мутаций на рашх этапах прорастания семян подсолнечника;

- привести доказательства пластидной природа индуцированных гам хлорофилльных мутантов;

- изучить кинетику вклотеши ^н-подиина в пластвдную и ядерную ДЖ клеток зародовей прорастаидах семян подсолнечника;

- исследовать хдДКК у пяастомшх гизнеспособкых нутантшх линий подсолнечника методом электронной микроскопии;

- провести сравнительный анализ результатов рестрикции хдЦНК исходной формы и ряда пластомных мутантов подсолнечника.

Научная новизна исследований. Впервые определен эффективный временной отрезок индукции шшстидных мутаций КШ который приходится на 12-15ч прорастания семян подсолнечника.

Впервые изучена динамика репликац;» пластидной ДНК на ранних стадиях прорастания семян подсолнечника. В частности, определен момент начала этого процесса, а такхэ степень синхронности репликации пластидной и ядерной ДЖ.

Показано, что максимальная эффективность индуцированного ШШ пластедного мутагенеза связана с пиком регизшацда пластома. приходящегося на 17-18ч прорастания семянок подсолнечника.

Рестрикционный анализ и электронно-микроскопическое исследование хпДНК исходной форма н пластомных мутантов подсолнечника индуцированных та, показала, что дачный агент не вызывает крупных перестроек, таких как протяженные делэции или дупликации, в структуре ДНК иутантных пластид.

Практическая значимость исследования. Результаты экспериментов позволяют выявить наиболее чувствительные временные точки онтогенеза подсолнечника для индукции пластидкых мутаций с помогаю ШМ, что штат служить основанием для получения пластомных мутантов у других видов высших растений. Данная работа расширяет представления о механизмах образования пластидннх мутаций. Нуте-

цки пластсмa яватся удобными кодэлямя для исследования структуры и функции пласгидиой ДНК, различных сторон пластидио-ядоргах взаимоотношений. Пластомшэ мутанты подсолнечника могут бить использованы и в практических целях, для получения форм устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среда, а тахзе как исходный материал для селекции.

Апробация работи. Материалы работа били представлены и об-судаенн на IV Всесоюзной кок^оренша 'Биология клетки* /Тбилиси, 1985/; V Съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров км. Н.И. Вашигава /Москва, IS37/; V Всесоюзной конференции "Биология клетки" /Тбилиси, 1987/; Всесоюзной конференции по ХИМИ-ЧвСКОНУ ВДТаГСНЭЗу /МОСКЕЭ, 1992/.

Публикация. По теки диссертации опубликовано 5 печатных

работ.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит пз ЕС9Дзга:я, обзора литература, описания обгектов п методов исследования, иэлогэкия полученных результатов и их обсугде-Ш!я, выводов, списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена из 124 страницах магпиопясного текста, содергэт 4 таблицы а 16 рисунков. Список датируемой литература включает 229 наименования, из которых 157 на имош-раяных языках.

МАТЕРИАЛЫ И ¡ÍST03J КССЕДОВАИИ

Объектом исследований слузяли кнсредная лязгая 3629 подсолнечника Hellanthua глпииз L., а тгкгю аластокныэ хлорофолльные мутанта. полученные на ее основе.

Индукипя НМЛ пластидннх мутаций у подсолнечника. Использовали семянки ннбредной линии подсолнечника 3629, которые предварительно замачивали в воде без доступа воздуха при комнатной температуре в течение 18ч. Набухгше. семена раскладывали на увлажненной фильтровальной бумаге в чалках Петри а проращивали 24ч в тер.юстате при 26°С. Через кахдае три часа отбирали одинаково развивааикеся проростки, помещали их в раствор мутагена и продолжали проращивать при тех г» условиях. После окончания трехчасовой экспозиции проростки таательно отмывали от мутагена 30 минут в проточной воде и в дальнейшем высевали в поле. Таким образом, мы получили 8 последовательных трехчасовых временных интервалов обработки иутагенсм прорзстасскх. семянгО-З; 3-fi: 6-

9; &-i2; 12-15; 15-18; 16-21; 21-244.

Обработку проростков подсолнечника проводили водами растворами НММ в двух концентрэшях 0,01 я 0,015$. Растворы Ш.! готовили на 0,25 Ы (¡осфатко-цитратаом буфере (рН=7,0).

Для выяснения генетической природа хлороСаллышх мутантов проводили решшрокша скревивачия этих мутантов с исходной линией 3629. Частоту мутаций определяли, как по отношению числа се-Ыйю Kg с наследственными изменениями к соцему числу семей Н2, так и по отношении числа мутантов М2 к сотому числу растения • для статистической оценю: результатов расцепления применяли метод Х~.

о

Определение уровня включения ^Н-тимидина а пластидную и ядерную ДНК зародцаей прорастакдгг семянок подсолнечника. Семена инОредноЯ линия 3629 проращивала по схеме, описанной в предыдущем разделе. Одновременно, через 2. 5. в, II. 14, 17, 20 и 23ч после начала прорашвашя предварительно замоченных секян в их зародааад определяла зштенсвдность агнтозз пластадной и ядерной ДНК. С этой целью выделешага зародшаи гшкуокровали 60 ¡.иг при 2б°С в воде содеркгаез 740 КБк/ш ^н-тикидет («Изотов"; удельная радиоактивность 780 ГВк/квдь). Посла инкубации проростки продавали в проточной воде и сразу выделяли клеточные органелла.

Выделение я очистку ядер проводили по описанному иетояу (Реаматов к др.. 1934) с -шбольЕими койфшащижи.

Пролластяда выделяли из еуперяатакга. полученного ери осаздекки ядер, Выделенные проплаеуяда трехкратно переосакдали в буфера для выделения центрифугированием при 4 тис. об/кин в течение 15 «ян. Лад удаления примесей яДНК суспензию органелл схЗрзбатвали ДНК-азоЯ (50 мхг/мл), (Signa, США)- Реакцию с ЛНК-азой останавливали, доОавляя ЭДГА до концентрации 0,2 Ц. Про-пластида оевздали центрифугвровэвиеы при 5 тис. oö/мкн в течение 15 ккн.

Чистоту фракций проверял!! с помощь» электронной микроскопии. Все процедура, начиная с гомогенизации ткани к кончая лизисом органелл, выполняли при 4°С.

Удельную рздаоактаыгость ядерной л пластинной ДНК олреде-ляли после ¡а выделения по катоду Ыитчелла и Нирсаякса (liltchell, Hlraalls, 1984) в гидролиза 55 НС104 в течете 30 ш при 100°с.

Радиоактивность гадроллзать ДКК измеряли в jsiokcs:icsoa

сцинтилляторе на жидкостно-сцмнтилляционном счегшке SL-3000 (Фракция).

Содержание ДНК в пробах определяли флуориметричаским методом в присутствии га-диэмкнобензойноЯ кислоты » 2НС1 (Vytaaer, 1932). Флуоресценцию образцов измерял! при 520 нм и длине волны зозбуэдапцегс света 406 им на спектрофлуоримегре "Hltach.1 650-6" (Япония). По полученным показателям флуордо.етрии и истинной радиоактивности гидролизата ДНК рассчитали удельную радиоактивность проо.

Определение содержания хлорофиллов. Содержание хлорофиллоЕ определял!! в первой паре настоящих листьев контрольной линии и желто-зеленых мутантов chlorlna спектрофотометрически в 85%-ном ацетоне по методике (Гавриленко и др.). Степень поглощения света пигментами регистрировали на спектрофотометре "Specol-IO" (Германия).

Методы выделения и очистки хлоропластов. Для выделения хлоропластов использовали первую пару настоящих листьев растения, выращенных в оранжерее. Листья разрували в нокевом гомогенизаторе при 10000 об/мин в течение 20с в буфера для выделения: 0.05М трис-ЬС1, pH 7,6; 0.35М манкит; 0.01И ЗДГА; 0,1% ЕСА; 25 -поливинилпирролидон; 0,15 2-меркаптоэтацол (соотношение веса ткани и оОемз буфера 1:5). Для удаления неразрупенннх клеток и их фрагментов гомогенат последовательно фильтровали, не откимая, через 4слоя älracloth (CalBlochen) и центрифугировали 10мин при IOO-g. Из надосадочноЯ микоста хлоропласта осаядали при IOOO-g в течение IOara и двавды промывали буфером для выделения. Очистку хлоропластов проводили в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы (falmer, ises).

Выделение ДНК из хлоропластов. Очищенные хлоропласта суспендировали в 50мл среда: 0.I5M NaCl, О.ХМ 3JTTA, pH 8,0 и ocaat-. дзля центрифугированием (IOOO-g, 10мин). Осадок хлоропластов ли-зировалн в буфере следующего состава: 0,05М трис-HCl, pH 8,0; 0,05М ЭДТА; 2,5%-ныЯ саркозил; протеиназа К (100мкг/мл), (Slgp3, США). Ддя удаления крахмала и остатков клеточнкх стенок лизат хлоропластов центрифугировали в течение 15мин при 2000-g.

Из лизироваюшх органелл ДНК выделяли в градиенте плотности CsCl/БЭ (Palmer, 1986).

РестрикшюнныЯ анализ хпДНК. Рестрикцию проводили согласно рекомендаций фирмы изготовителя ферментов (НПО "Фермент", вклъ-

шос). В качество маркеров использовали рестрикти ДНК фага X, "переваренной" несколькими ростриктизми: Xfco I, Bgl II, Ecoí^+BamHI.

Срагмента ДНК разделяла методом электрофореза в вертикальном 0,73 агароэном геле. Электрофорез проводили 2,-Ьч в пульси-рущем электрическом полз при напряжении 160 В, силе тока 20 иА (время прямого тока 60 мс, время обратного тока 25 мс). Поело проведения электрофореза гели окрапивали водными растворами бромистого зтидил (I ккг/мл) в течение 60 кинут. Затем гели фотографировали при ультрафиолетовом освещении, используя оранкевцй светофильтр.

Исследование ультрасгруктугы пластид методом электронной микроскопии. Электронно-микроскопическое исследование структуры пластид проводили по известной методике (Прихояенко и др., 1973). Применяли глутэро-осмиевую фиксацию тканей листьев с по-следундим обезвоживанием и заключением в эпоново-аралдатовке блоки. Ультратонкпэ срезы получали на ультрамикротоме УЫТП-4 и исследовали в электронном микроскоп* "Tesla-BS-242E".

Исследование хпДКК методом электронной микроскопии. Для электронно-микроскопического исследования хдЩЖ использовали метод белковой пленки (Klelnschmilt, Zahn, 1959). Осадок ДНК растворяли в 0.05М трио-HGl буфере, pH 7,9, до концентрации IHK 0,51,0 ккг/ил. Затем добавляли форлакид н цятохром "с" до коночной концентрации 30% и 0,Olí, соответственно. Смесь наслаивали на поверхность соды, содержал;» й 0,Б&-ш»Я форнамид. Образовавшуюся пленку снимали на медные сеточки, предварительно покрытые форм-варовой гц-лькой-подлоекол и укрепленные угл?м. Обрэзцы напыляли сплавом платина/лалладиЯ и исследовали в электронном микроскопе JBI-7A (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Частота индуцированных НММ плвстидшх мутаций в завистаюс-ти от времени прорастания семянок подсолнечника в момент обработки мутагеном. Результаты экспгримснтоЕ по индукции НИН плас-тсадш. мутаций в зависимости от того, в какой момент прорасташи семянок проводится обработка мутагеном в концентрациях 0,01% и 0,0155 приведены в табл. I и 2.

Видно, что при использовании-мутагена в-концентрации 0,01%

íacTOTa индуцированных 0,OIS HYM пластадкых мутация в зависимости от времени семянок подсол!ачшс<а в момент обработки мутагеном.

Таблица 1. прорастания

Вариант Время в Число Число семей с яластиднымй мутациями Число Число иластаяшх мутаций

опыта часах семей Мр абсолютное % рчстений М, абсолютное г

I 0-3 :ез 0 0 5112 0 0

2 3-6 147 0 0 4733 0 0

3 6-9 149 0 0 4602 0 0

4 9-12 151 23 15,2 i 2,9 5662 ai 1,4 ± 0,2

5 12-15 142 58 40,8 i 4,1 3768 142 3,8 i 0,3

6 15-18 141 9 6,4 i 2,1 3670 19 0,5 i 0,1

7 18-21 146 0 0 4566 0 0

8 21-24 143 0 0 4213 0 0

9 9-15 152 32 21,1 ♦ 3.3 5410 99 1,4 i 0,2

10 12-18 143 25 16,8 Í 3,1 5792 83 1.4 1 0.2

Частота ищуцяровандах 0,0155 И&1 пластал па мутаций в зависимости от времени

семянок подсолнечника в *кааопт обработал мутагеном.

ТжШша 2. прорастания

Вариант Время в Число Число семей с шшстпдннмя кутаниями Число Число пластидах мутаций

опыта часах семей ебсолвтроо Ог растений И? абсолютов S

I 0-3 101 0 0 2652 0 0

2 3-6 107 0 0 2830 0 0

3 6-9 94 0 0 2353 0 0

4 9-12 ,102 25 24,6 * 4,3 2764 72 2,6 i 0,3

5 12—ТЕ 99 44 44,4 I 6,0 2642 133 5,0 1 0,4

6 15-18 98 П 11,2 i 3.2 2703 39 1,4 * 0,2

7 ie-2I 102 0 0 2868 0 0

8 21-24 106 0 0 2921 0 о-

9 9-15 1СV 39- 36,4 t 4,7 2820 91 3,2 t 0.3

10 12-18 95 0 0 2526 0 0

(тобл.1) наивксяая частота киукцга пластздннх мутаций - 40,8 t 4,IS по числу семей М2 с шшстшиымв мутациями я 3,8 i 0,3$ шшстадиых мутангоз получена в Езркантэ US.язя при действии мутагена во врекеннсй отрезке 12-15ч с качала. проращивания семянок. В предыдущем варианте N4, когда дэЯствнэ НШ осуществлялось з S-I24, эФХектавнс-сть мутагена была ниже, в 2,7 раза, "как. по числу семей Н2 с плпствдапгй мутыдазм (15,2 ± 2,95), тек и пластиках Мутантов (1,4 » 0,2$). Еда более сильное снижение частоты пластидннх мутаций наблюдается в варианте N5 (15-18ч) -в 6,4 раза семей М2 с мутациями (6,4 i 2,1») и в 7,6 раза мутантов (0,5 t 0,15). Во всех остальных..исследованных трехчасовых интервалах нам не удалось индуцировать плзстядны«» мутации.

При использовании НШ в концентрации 0,015% получена практически идентичная с предыдущим оштои Ерзгакяая динамика индукции мутаций пластона (табл.г). Пкк пндукизш Tai-скэ приходятся на вариант I® (12-15ч) - 44,4 t 5,03 семей УдС тасгиднымя- мутациями и 5,0 1 0,45 пластаднахмутантов. В пр9!дндуиэм варианте N4 (9-12ч) ЕфСектаЕНость действия мутагена стшхаэтся в 1,8 раза по числу семей ы2 (24,5 i 4.3S) я в 1,9,раза по числу мутантов (2,6 г 0,35). Более сильное сндазшэ эффэгшшнЬста .дэйсгвш!. ШМ, как и э предыдущем опыта, пзблядаэтсл в варианте Кб <15-18ч)- в 4,0 раза, как по числу семей !JU (11,2 4 3,22), тек а га числу мутантов (1,4 t 0.2J.

. '. Для более подробного анализа результйтов.пояучзнкых в предыдущих опытах, были допоягитэльнр.псслэдовака два, шестичасовых временных отрезка обработки мутагеном прорастаиих сэмгкок - варианты Н9 (9-15ч) я N10 (12-18ч) (табл.2;3). Оба эта интервала вклэтают в себя трехчасовой интервал 12-154, в которой наблюдается максимальная частота индукиви мут&ций. - ' ■■ ..

Динамика включения ^Я-тимщшна в пластиднуи и ядеряух) ДНК зародыией на ранних этапах' прорастания семянок подсолнечника. Динамика включения ^ тамидша в пласишув и ядерную ДНК подсолнечника представлена на рис. I. Видно, что радаоактивная метка начинает включаться меаду 3 и 6 часами прорастания семян, причем одновременно как в ядернуя, так и в пластидну» ДНК, достигая первого максимума к 9-ти часам. После спада в 12-15часов новый пик активности наступает х 18 часам. То есть в клетках развпващяхся зародыш»й подсолнечника синтез ДНК протекает в виде повторявдихся синхронных циклов, характерных как для ядерно-

А/ Радиоактивность

зародышей при прорастании семян подсолнечника. А/ - пластидная ЛИК, Б/ - ядерная «ДНК

го, так я для плзстлдного компартментоз клеткп.

Согласно даяшм латературы (Гр::ф, ¡'ваксв, ÍS8Q) продолжительность гатотаческсго цикла у подго.к:эч1пка пря. тежературэ около 20°С составляет Пчасов. Подучэшаа результаты га на ' противоречат. Так как кн проращивали семена при более онсокоЯ температуре (26°С) а предварительно згдгзчпааля га з течение 1Э часов, то в .условиях нгкего зкспоркхэнта длительность кятотачёсшэ-го иква, по-Еэдимсау» составляет около 9 часоэ, и два пас» сен-теза ядерной ЛШ, пряяодлетвса на 9 я ,18 часоз, могут соответствовать S-фазам первых двух.иитотичесгах циклов.'

Сокращение продолжительности гатотаческого цякла также котят Снть объяснено тем» что в назем окспэрхгзнтэ вкл&юйнэ "^Н-такйдина в ядэряув ДКН клеток определялось на си,их " первчх этапах развитая зародаея, для которых характерен ссоСнЯ тяп'деления, названий археглюн (Богорова, .. Кдзткй ряших лэро-днзай этого типа могут делиться непрзрнЕко ва счет -сохрздзния Gj rt <¡2 фэз клеточного шклз. Скнтм': кэ'сбходакых продуктов протекает в коти ютоза и а поздно!* S фззэ. '.-•• ..

Кэкоторуп "развитость" газсса склэчотк! ^.ттддкпа в яд?р-нуэ ДИК, а тие» довольно Еассккэ заачэкнл'' рэдяогзяягпссто' пиками могно объяснить нэдостаточной скнхроетззшгэа т-леточрк циклов клетек эародкза при прорастать Надо ожзтпть, что ".ос-■ппь синхронности у растительных яеттох значительно слогнээ, чгм у кяяроорггнязтоэ п ототпмх, так кгк у рзстэнтй • ектегве» клеточное дэлэш'л происходят в трястемах. •• прэдотазиетх собеЗ очень уагай слоа. клэтоя. Эта иэристеих .прздвтзздяггг собсЯ -асинхронные популяции'хдэток с разлтпетя д.пягля мзтеитезого шила (Каликкн, 1983). а нсслэдсазззях па ¡сул'.турпх рготателыпз: клеток, было показано, что дает в. рэяг»- кяовдовееэд/тда.'-'&сэ таеткн является потсязшмн одной рэдоначалызай кдэткз, 'я ?,сэ ■ нэ-чалькыэ условия уравнена, найляааптся зскэяшэ фяуктущет про-долг.!тольноста клеточного Ц2кла (Еогсрова, 1989);" Кэ'" пгзкваэт сожешя, что в наган случае корректнее определять 'гнтвпеявяоеть енптева Д1Я гз в цело?.! зародыше, а в'отделках ого . органах, й ccsansium, па соя® начальных этапах развития садсолягшгха фэронцнровать органа зародила технически очэпь слогно.

Влияние н-китрозо-н-иэпшичевины на ,'ij. НИИ яцдушгруо? пзстролпстпость утя з tlj. У подсолнечника аномальная гэлто- бо-гая пятнистость яз'растевпях М» появляется, ватавая' с 3-5 mapa

Ееетоядах листьев. Ульграсгруктура плостад в зеленых участках мозаичного растения не отличается от нормы.

Электронно-микроскопическое исследование пластид, взятых из бесхлорофильных участков листьев растений Ы£, показало значительную гетерогенность их по ультраструктуре (рис. 2). Превде всего, под действием мутагена существенно нарушается образование тилаксадной системы. Тилакоиды строкы и гран не заполняьт всего "внутреннего пространства органелл. На некоторых срезах тилакоиды вообще не обнаруживаются. В?.', вызывает изменение формы органелл, наблвдается вакуолизация пластид. Однако, несмотря на разнообразные изменения ультраструктуры, могао отметить две характерна закономерности - все анализируемые щшстиду содержали значительное количество пластоглобул, представляпэдх собой неструктурированные агрегата белхово- лигидиа компонентов момбран (ФреЯ-Висслннг, 19вЗ); а такие во Есех пластидах присутствовали рибо-сомоподоб.чые частицы.

Доказательства пластидной пр!гроды инцущгрова1шых КИМ мутантов подсолнечника. В условиях ныгаго эксперимента спектр пластаддах мутаций оказался довольно узким - отмечем мшь хло-рофилышэ аномалии, прием абсолютно подаБЛЯщеэ число приалось на пестролистные фордь Только в варианте "12-15ч" появлялись мутации chlcrlna.

Сенотипшески пестролистные растения Kg w- отличались от таковых в Mj. Иногда пестролкстность была выражена уге у семядолей, но чаще у первых и последующа настоящих листьев, сохраняясь до их естественного опирают. Граница ыевду измененной и нормальной зеленой тканью листа была выражена четко.

Необходимо отметить, что шделенные нами пестролистные мутанты удовлетворяют обсепршотпвд критериям пластидной наследственности. Для них характерно: соматическое расщепление, одно-родительское «атеримское наследование ыутантного признака, изменение внутренней структуры пластид, наличие нэ грглшце между нормальной и мутантной тканями гетеропластидных клеток.

Изучая наследование пестролистности у подсолнечника мы обнаружили кэменделевское расщепление в потомстве самоопыляющихся пестролистных растений. Например, в потомстве 100 мутантных растений наблюдали расцепление: 3Q&5 зеленых: 1002 пестрых: G43 нелтах (белых) проростков; последние шгибалк на стадии семядолей.

Для доказательства однородительского материнского наследо-

• - • ••

г.-»-«» ■} ' --к"'

• »ли»!' .. »1

Рис,2. Ультраструкгура пластид на срезах клеток, взятых из бесхлорофилльншс участков листьев подсолнечника растощй! М|

V А' --'Л

15 ;'.5 ..v .а,^« «¿у -й '' п *\гд 5ы?, *

1 '-гг***

Рис.3. Ультраструктура гетерошшстидной клетки расположенной на границе неуду зеленой и желтой тканями з листе химерного растения подсолнечника

вания мутантного признака были проведены риципрокше скрещивания пестролистных растений с исходной инбредной линией. В том случае, когда пестролистные растения опылялись пыльцой зеленых растений, гибридное потомство давало расщепление в соответствув-шее расщеплению при самоопылении. Например, при -гибридизации в качестве материнской формы 100 пестролистных растений в било получено расщепление: 672 зеленых: 183 пестрых: 124 желтых (бе-.лых) проростков. При обратном направлении скрещивания, то есть когда в качестве материнского растения использовалось зеленое, а отцовским растением служила" пестролистная форма, все потомство "■было Зеленым.

Для пластид в мутантных тканях растений М, характерны значительные изменения ультрагтруктуры. Электронно-микросксшческий анализ пестролистных мутантов выявил различия белой и аелтой мутантшх форм. В пластидах желтой формы имеются лишь слабо развитые талакоида строки, граны полностью отсутствуют. Строма пластид мелкозернистая, но менее плотная для электронов, чем у исходной линии. Для пластид белой формы характерно еще большее изменение внутренней структуры. Тилакоддшх структур практически кет. В пластидах наблюдаются вакуоли и осмкофш-пые глобулы.

При электронно- шкроскогичессксм исследовании выделенных пестролистных мутантов на границе между нормальной н мутантной тканями были обнаружены гетеропласткаше-клетки (рис.3 К

Как было отмечено выше, еще одним классом плаотомных хло-рофглльшх мутантов подсолнечника, выделенных ¡три обработке 1Ш прорастающих семянок только во временном интервале 12-154, были еэлто- зеленые фор/ы, или сЫог1па по классификации Густафссона (Сизз1а1ззоп, 1940).

Выделенные нами мутанты сЬ1ог1па характеризовались сниженным по сравнению с исходной линией 3829 содержанием зеленых пигментов. Суммарное количество хлорофиллов а+Ь у мутантов колебалось от 3,12 до 5,64 мг на 1г абсолютного сухого веса, в то время как у контроля сно составляло в среднем 8,24 мг/г.

Кизнеспособность многих желто-зеленых мутантов чрезвычайно низка. Основная масса растений гибла до цветения. Этим объясняется тот факт, что из выделенных 6 мутантов после обработки ЮМ в концентрации 0,01$ и II мутантов - в концентрации 0,0X5% провести генетический анализ мы смогли только у 2 и 3 растений, соответственно.

Результаты реципрокннх скрещиваний указывают на внеядерный характер наследования выделенных нами мутаций. Когда мутанта chlorlna использовались в качестве материнского растения при скрещивании с исходной линией в Fj был представлен только мутан-тннй фенотип. При рецштрокном скрещивании в Tj все растения были зелеными.

Электронко-микроскопическое исследование хпДНК пластомных мутантов подсолнечника en-chlorlrta-5 и en- ctiIorlna-12. С помощью электронной микроскопии были изучены форм и размеры хпДНК исходной линии и двух аластсмных мутантов подсолнечника, индуцированных НММ.

Выделение ДНК из хлоропластов проводили с помощью анионного детергента саркозила. При этом было обнаруженно, что мембранные структуры полностью не лизируются. Около 20% молекул ДНК находятся в связанном о мембранами состоянии. На рис. 4 представлена электронная микрофотография хпДНК подсолнечника линии 362Э при лизисе пластид 2% сзркозилом. Видно большое число нитей ДНК примерно одинакового диаметра, отходящих от фрагмента хлоропласта во всех направлениях и образующих, многочисленные петли разной длит. При этом ДНК находится в сверхспиралнзованном и ре лакированном состояниях. Общая длина нитей ДНК, ассоциированных с фрагментом хлоропласта, состазляет около 150 ммк, что соответ-

о

ствует молекулярной массе около 3-10 дальтон или размеру молекулы около 450 т.п.н. Установить одно определенное место прикрепления нитей ДНК к фрагментам этих оргадалл не удается, также как в большинстве случаев трудно измерить общую длину нитей, часто переплетающихся друг с другом и скрытых под фрагментами хлоропластов. К сожалению, в подобных опытах трудно оценить, какому числу молекул ДНК оно соответствует. Наибольшая длина нитей ДНК, по данным литературы, составляет около 500 ммк (Одинцова, 1987), что соответствует размеру 1500 т.п.н. и согласуется с результатами определения содержания ДНК в пластидах биохимическими методами.

В условиях нашего эксперимента около ЗОЖ свободнолежаиих молекул ДНК хлоропластов подсолнечника исходной линии обнаруживаются в форме колец, длина контура которых составляла 49.2 ± 0,9 ммк (рис. 5). Молекулы хпДНК обнаружены также в форме ксва-лентно замкнутых двутяжевых колец сверхспиральной конфигурации. Длина линейных молекул, обнаруженных в препаратах ДНК хлороплас-

. . ■ Г; 0

■ ■- : ' ■ 'Ч---1'......-'•■•

Рпс.4. Электронная микрофэтографм хдДНК контрольной линии подсолнечника после лизиса пластид 2%-вым сар-козилом

- -'V .>;.-.,>•. .......,-...... -у ,

г-...'- : ■

Рис.5. Электронная микрофотография кольцевой молекулы хлДНК контрольной линии подсолнечника

тов подсолнечника легли 3629, варьировала от 5 до 50 шк. Так как кольцевые молекулы ЛК очень чувствительны к различным воздействиям (влияние пуклеаз, гидродинамические воздействия и т. д.) и длина летейных молекул не превышала 50 ммк, очевидно, что хпДНК подсолнечника находится In vivo в виде кольцевых молекул с длиной контура около 50 кмк, что соответствует размеру молекула около 150 т.п.н. и характерно для хпДНК большинства видов высших растений. Более того, наши данные подтверждает результаты, полученные на подсолнечнике с помощью других негодов (Hleaeberg et al., 1989).

При эдектротгамикроскопическом исследовании хпДНК мутант-ных линий еп-сЫог1ла-5 и en-cídorlna-12 были получены сходные результаты. Контурная длина кольцевых молекул хпДНК составляет 49,6 t 1,2 и 49,7 г 0,6 ммк, соответственно.

Таким образом, форма и размер xnW двух пластомных мутантов, индуцированных НМЫ, на уровне разрешения электронного микроскопа оказались идентичными как меяду-собой, так и по сравнение с контрольной линией.

Рестрикциоиннй анализ хпДНК пляс томных мутантов нодселнеч-_ ника en-chlorina-5 и en-chIorlna-12- При рестрикшоннон анализе хпДИК подсолнечника исходной'линии 362Э и двух ее пластомннх мутантов en-ctU.orlna-5 и en-chlorina-12 были использованы следующие рестриктазы ВааН I, Hlnd III, КсоН I, Egl I и ХЬо I. Число и размер фрагментов, образующихся при расцеплении хпДНК этими ферментами, представлены в табл. 3.

Суммируя размеру фрагментов хпДНК подсолнечника, полученные с помощью 5 ферментов рестрикции, можно сделать вывод, что общая длина молекулы хлДЖ составляет около. 152 т.п.н. Небольшие вариации результатов по отдельным ферментам, по-видимому, объясняются тем, что фрагменты с размером меньше, чем I т.п.н. при их разделении в 0,72 агарозном гэлэ практически невозможно определить. Полученные нами результата подтверждают денные других авторов (Keyraud et al., 1987; Rieseberg et al., 1983), а такзе они согласуются с результатами, полученными вами при измерения контурной дайны молекул хпДНК.

На рис. 6 показана электрофореграмма ВашН I, Hlnd III, EcoR I, Bgl I, Xho I-фрагментов хпДНК подсолнечника исходной m-нии 3629. Идентичные электрофореграммы были получены к для иу-тантных линий en-chlorlna-5, en-chlorlna-12. Следовательно, ея

Таблада 3.

•Число и размэр Фрагиентоа (т.п.п. ), обрвзупзп.ся при рас-кэпхэкки пластинной ДНК исходной лиши 3629 подсолнэчника эвдонухлэазами рестрикции: ВазК I, Hlnd III; EcoR I. Bgl I t> 3Qio I '

Bartíi I - Hüll III EcoR I Sgl I . Xho I йзркеры

К ■ тля N ТГШ К . ТПН M ТПН 'K ' , TIW тли

B1 25,5 Й1 15,5 El 16,3 Bgi - 34.5 XI 32,5 33,4

B2 19.4 H2 12,0 Е2 12,J 26.0 X2 18,0 22,0

B3(2) 9,4 H3(2) 10,5 Б3(3) 10,2 Bg3 18,0 X3 15,3 15,7 ,

B4 ! 7,9 H4 (4) 9,0 Е4<3> 9.5 Eg4(2)15,2 X4 10.5 15,0

B5 7.4 H5 , 8,2 £5 ■ 5,0 Bg5 11.5 X5(2) 9,6 13,3 !

в&,: 7,0 Нб(2 > 7,5 Е6 4,8 BgS ' 10.8 X6 9.0 9,7

BT(2) 5,6 H7(2) 6.6 ШЗ) 4,0 Bgr 6.8 xrm •8,6 9,1

B8(3> 3,7 Ш5 6,3 вз<з> 3,5 EsS 5,0 xs 7,8 5.5

U9<2) 3.0 Н9 3,9 Е9 2,7 Eg9 4*8 ХЭ 5.6 4.9

B10(4>2,8 Н10 2,8 ЕЮ(З) 2,S Bg10 4.0 XI0. ■ 4,0 4.6

811 2,5 H11(2) 2,4 El 1.(2) 2,3 XII 3,8 3.8

Bt2' . 2,2 B12(2) 2,3 El 2 2,1 X12(2) 3,2 3,2

B13 2,1 ШЗ 1,7 El 3(2) 2.0 X13. 2,7 г.8

B14 1.9 Hi 4 (4) 1,2 E14 1.9 XI4 0,8 2.6

B15(3) 1.7 Н15(2> 0,6 Et 5 1,7 2,4

Bt6 1 ¿5 El 6 (2) 1,6 1.9

£17(3)1.4 El 7 (2 ) 1,5 1,1

BIO 1.2 E18 1.1 0,6

B19 .1,0

Суша

(т.п.н.)

147,3 151,0 151, 6 I5Ï .0 152 ,8

123 4 5 6 7 8 9

Рис.6. Электрофорэграмма фрагментов хпДНК контрольной линии 3629 подсолнечника, образующихся при расщеплении ее следующими ферментами рестрикции: 2-BamH I; 3-EcoR I; 5-Bgl I; б-Xho I; 8-Hlnd III; 1,4,7,9 -маркеры

один из используемых ферментов рестрикции ке выявил различий в структуре хгДНК у исследуемых лкгсй подсолнечника.

.. Полученные дачные свидетельствуй, что мутационные изменения хяЦНН двух плзстомкы1 мутантов подсолнечника находятся за пределами сайтов узнавания использованных нами фир.митов реет- • рикцки, й такая об отсутстыш крупных перестроек, таких как про- " тяже иные делеции или дупликации, в структуре ДНК данных, мутантов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты настоящей работы подтверждает, что Н-нитрозо-М-кетнлмочевина (ИЫЯ) является эффективным индуктором илзстидных мутаций у высших рветений. Сравнивая полученные дашше с результатами, приведенными в литературе для выссих растений, у которых удалось получить мутации в пластоме (томаты, табак, львиный зев, узумбарская фиалка), наиболее чувствительными органеллама к данному агенту оказались пластиды подсолнечника (Saltera et al., 1990).

Анализ результатов электронной микроскопии растений, обработанных НИМ, свидетельствует о тем, что существует определенная динамика распределения измененных пластид в зависимости от сроков последействия и количества клеточных циклов, прошедаих после окончания обработки. Если у растений Mj в первой паре настоящих листьев наблюдали 100% изменения пластид (Еелецкий и др., 1981), то в клетках листьев 3-5 пары зарегистрировано появление пластид, ультраструктура которых соответствовала морфологии контрольной линии. поено прийти к выводу, что после действия НИ мы имеем пс меньшей мере три класса пластид - нормальные, модифицированные л мутактике,так как НЫМ в силу своих свойств действует иа всю многоступенчатую систему "ген-признак".

Вероятно, часть первичных поврездениЯ ДНК пластид может ре-парироваться ядернюти ила собственно органелльшши системами, часть - сохраняет высокий уровень метастаевльности и некоторая часть в процессе клеточных делений передает фиксированные мутационные изменения иластидной ДНК. В результате, форетровшше химерных тканей, которые фенотшшчески проявляются, начинай с 3-5 пары листьев растений Мр монет зависеть не просто от рассортировки ыутантных ы зеленых органелл в ходе последу пса мятотичес-ккх делений клеток, a от их соотношении в клетках, которые в дальнейшем образуют дифференцирупдувся ткань. Если основную ыес-

су составляют лэгно иояпфвдЕруемаэ плестада, то гёзначитвлъноэ преобладание нормальных или мутгнтшх органелл в клетке, даст начало зеленой или белой ткани. Безусловно на гффект "передоминирования" дояпи влиять кок гсгутрпг-лэточные, так в впеатэ факторы срэды. Вероятно, истинная рассортировка пластид возмогла только после мгйотического отбора в процвссе созрев&тая семяпочки. Именно поэтому гомопдастомнае мутштниэ растения, содержала измененные пластида во всех клетках, мокко получить только в М,.

Следует отметать, что Мутанты типа chlorlna, индуцированные различными химическими агентами, в основном имеют ядерную природу (ПриЯлин я др.. 1975; Jayabalan, Rao,- 1988). Однако, используя в качестве мутагена НММ б концентрациях 0,01 и 0,015%, нам удалось выделить, хотя и в незначительных количествах по сравнению с пестролистными формами, мутация chlorlna шзядерноя природы. Надо полагать, что изменение в плзстомз долита определять какое-либо селективное преимущество перед нормально!! формой, в . результате которого мутантшэ пластиды полностью вытесняют нормальные, начиная у?з с Вероятно, ге-энно поэтому среди растений коллекции плестошых мутантов chlorlna пэдсолнэ'шпкэ, созданной в нашей лаборатории, довольно часто удается выделять ли-пии с повышенной резистентностью к абиотическим факторам срэды (Бэдешка и др., 19Э0).

йаханнзм индукции ша пластадннх мутация по-прегнэму недостаточно ясен. Результаты, полученные при анализе кинетики включения радиоактивной метки в ядерную и аластадную ДНК, в сопоставлении с эффективным временем индукции пластидннх мутаций не позволяют сделать однозначных выводов о непосредственном участии процесса репликации ДНК в фиксации мутацяа, индуцированных K5Í. -Исследованиями механизма индукции ядерных мутаций у нивот-ных и растений елаиирующми агентами установлено, что наиболее чувствительными к мутагенному всздейстЕив являются предсинтета-ческая стадия и стадия синтеза ДНК (Дубинин, 1978; Митрофанов, Олкмпиеш:о, I98C). По аналогии мокно ожидать, что подобный механизм должен суцествовать д при индукции мутация в пластидной ДНК.

Исследовав временно!» промежуток от О до 24ч прорастания семянок, та определяли, что пра обработке H35J только в отрезке 918ч возникают мутации с четким пиком, пршгодяавмся ■ на 12-Т5ч. Следовательно, основной кик репликации шшстома додкзв прихо-

диться на этот отрезок времени или ь ближайшие последующие часы, в течете которых потенциальные изменения ДНК переходят в фжси-рованое состояние. На рис. I видно, что максимальное включение Н-гимидина в пластидную ДНК приходится на 1?-18ч прорастания. Это частично подтверждает предположение о сходстве механизмов мутагенеза ядерного генома и пластома.

Следуя этой логике, можно полагать, что гажу включения радиоактивной метки в ДНК пластид, приходящемуся на е-9ч прорастания должен соответствовать повышенный выход :шастомных мутантов. Однако, при обработке НЗДЛ до 9ч нам не удалось зарегистрировать ни одно хлорофалльное изменение как при концентрации мутагена 0,01$, так и при его концентрации 0,015%. Это свидетельствует о том , что уровнен репликации пластома нельзя полностью объяснить эффективность пласгкдного мутагенеза на самых начальных этапах развития растений и в этот процесс вовлечены иные существенные звенья метаболизма растительной клетки, в частности, по-видимому, процессы репарации. Не исключено, что интенсивность работ репарационных систем на разных стадиях развития прорастающих семян различна, вследстьле чего наблюдаются столь резкие изменения в эффективности мутагена в зависимости от момента его действия.

Репарация ДНК является фундаментальным процессом, обеспечивающим генетическую стабильность клетей. Наиболее полно восстановление разнообразных повреждения структуры ДНК изучено у бактерий (Тарасов, 1932). К сожалении, о репарации генетического материала пластид практически ничего не изьестно. Ранее С. Д. Белецким было показано, что индуцированные НУМ повреждения пластид подсолнечника очень быстро восстанавливаются (БелецкуЯ, 1939).

Эффективность пластадного мутагенеза также может быть связана с процессами транскрипции или трансляции, следствием которых ягляется восстанозление генетического материала органелл.

Существует большое число обзоров, посвященных ранним этапам индивидуального развития, в которых показано, что активность белкового синтеза в течение длительного Бремени определяется трансляцией, а не транскрипцией генов (Браше, 1961; Дэвидсон, 1972; Ней4ях, Тимофеева, 1977). У морских ежей и амфибий ядерный синтез макромолекул, необходимых для развития зародыша, начинается только после окончания дробления и формирования гаструлы.

До этого момента зародыш использует белок-синтезярувдий' аппарат, запасенный материнской цитоплазмой (Comb, 1965; Ne.ner, Infante,-1965). Для растительных обьектов подобных фактов приведено в литератур« крайне мало. Однако, по единичным публикациям можно судить о том, что растения на ранних этапах развития также исполь-зуст не вновь синтезированные транскрипты, а матрицы, накопленные цитоплазмой в процессе созревания женской гаметы. Существование генных продуктов, т.е. мИК с большой продолжительность!) жизни, было обнаружено в покоящихся семенах нута, хлопка и пшеницы. Через час после замачивания семян пшеницы интенсивность синтеза белка составляла 28% максимального, а через 3-5ч она достигала 65$ (Marcus, Feeley, 1964; 1965; Dure, Walters, 1966). Эксперименты с применением актиномицина показали, что усиление синтеза связано со сборкой полисом из компонентов, хранившихся в тканях семени, а не синтезированных de novo (Barker, Ribber, 1967; Chapman, Rieber,1967). Возможно, что у растений в процессе развития содержание рибосомальной РНК, такке как и общее количество РНК уменьшается до тех пор, пока не начинается синтез но-еой рибосомальной РНК, как это показано для беспозвоночных (Comb, 1965: Нешег, Infante, 1965).

Суммируя вышеприведенный факты, мохно прийти к выводу, что з раннем эмбриогенезе растений существует временная точка, являющаяся "слабым звеном" в процессе развития - время, когда истощаются транслированные резервы, запасенные материнской цитоплазмой, и ещо не запущен в полной мэре процесс трансляции белков de novo, как ядерного тек а пластидного компартментов клетки. Эта критическая точка должна быть наиболее чувствительной к воздействию различных факторов, в том числе и мутагенов.

Результаты эксперимента, приведенные в табл. I и 2, свидетельствуют, что для подсолнечника такой критической зоной является временной интервал 12-15ч обработки, во время которой обе концентрации мутагена индуцируют в М2 максимальный уровень плвс-тидных мутаций. Обработка мутагеном, которая заканчивается до 12ч и начинается после 15ч в несколько раз снижает выход мутант-ных растений.

Особую трудность для интерпретации представляют серпента перекрываидихся обработок НММ. Вариант 12-184 при концентрация 0,015% возмогло просто летален, либо за счет соматического отбора, либо за счет активации репарационных процессов, так как-

уменьшешю концентрации до 0,018 дает примерно столько же мутантов, сколько неперекрыващиеся варианта. В остальных случаях с перекрьзадаимися обработками частота индукции мутация имеет промежуточные значения между таковыми для трехчасовых вариантов.

Однако, при статистической оценке результатов видно, что увеличение экспозиции обработки мутах-еном на Зч с 12 до 15ч достоверно не изменяет ни число семей Mg с пластидными мутациями, ни количество пластомных мутантов как при концентрации НМЫ О,Olí, так и при 0,015$. А увеличение эффективности пластидного мутагенеза в 12-154 по сравнению с 9-15ч мокно объяснить тем, что часть мутагена за три часа с 9 до 12ч инактивируется внутри организма. Таким образом, при вступлении проростков в критический интервал 12-15ч, концентрация НМЫ уж? уменьшена по сравнению с исходной.

Пожалуй наибольший интерес представляет высоко достоверное уменьшение частоты индукции мутаций при увеличении экспозиции обработки ШЧ (0,01$) на три часа от 15 до 18ч при сравнении двух вариантов 12-15ч и 12-18ч. Это уменьшение также можно объяснить выходом развивавшихся проростков, в случае шестичасового варианта, из критической зоны после 15ч от начала прорастания. В это вре«я, как было указано выше, начинает ьключаться в метаболизм организма высокомолекулярные продукты собственного генома клеток, следствием чего является снигение уровня пластидаых мутаций. Поэтому, трехчасовая экспозиция проростков в мутагене после 15ч (вариант 15-184) приводит к многократному сикхенип индукции пластидных мутаций.

Б этом плане следует рассмотреть еце одну из возможных причин отсутствия пластинной индукции после 18ч обработки НММ -множественность элементов пластоыа.

Известно, что геном пластид полиплоидный: он существует в виде мнокестга идентичных копий (Dyer, 1984). В цитоплазме клеток зародила находится незначительное количество пропластид с минимальным числом копий собственной ДНК. При прорастании семян однодольных и двудольных растений на са«нх ранних стадиях развития содержание ДНК, как на пластиду, так и на клетку, резко возрастает. Эти события чрезвычайно затрудняет фенотипическое проявление мутационного события в отдельной молекуле пласткдноЯ ДНК. Очевидно, что чем меньше молекул пластидной ДНК на клетку имеется в момент обработки мутагеном, тем более вероятно, что

кзу.энение попадет в спорогенную ткань н перейдет к потомкам. Му-танкс'сие изменения, которые не достигнут генеративно?; ткани, пройдл через ряд китотичоских циклов, виявляются толхо в соматических клетках растения

Втамо, эта причина лежит в основе полученных нами результатов по индукции Н?.И пластидшл мутаций у кукурузы (данные не опубликов.'-." 2). Схема опыта Сила идентична описанной в данной работе за исключением того, что кы исследовали не первые сутки развития проростков, а третьи (48-72ч). В М^ наблюдался высохиЦ уровень пестролистное™, однако в мы не обнаружили га одного растения с хлорофилпьными- аномалиями.

Сравнительный анализ результатов электронной микроскопии П рестрикции пластидноЗ ДШС исходно!! лигам 3629 подсолнечника и пласто!.яих мутантов, полученных на сэ основе, свидетельствует оо отсутствии заметных изменений в структуре ДНК, которые нокно было бы напрямую связать с фзнотипичвским аффектом хлорофнлльннх иутантов» Кэ обнаругяно крупных деления или дупликаций. Тем не мэнеэ генетически!! анализ с полной убедительностью доказывет наследственную внэядернуп природу полученных изменений.

Наиболее реально!? причпгаЯ расцепления в потомстве расте-1г.:й, обработанных К£5, по наЬему ¡¿неют, является нарупэние сис-тэм, регулирующих нормальную работу пластома, в результате чего понижается его чувствительность к внутриклеточным н внесшим воздействиям. Обработка Н.?.! в заданных выие условиях, как утя было сказано, в основном не связана с непосредственным контентом мутагена с ДНК и нарушением ее целостности. Скорее всего КМ реагирует с рРНК или долгоживутаа матрицами мРНК, что приводит к нарушениям биогенеза ферментов, ответственных за основные процессы мэта0оп1зма пластсма - репликацию, транскрипцию, трансляция и репарацию. Такое опосредованное влияние на геном пластид' приводит к разнообразии действия измененных хдДНК, часть которых в процессе деления хлоропластов вытесняется нормальной ("дикоЭ") ЛНК, часть дает начало иутантнш клонам хлоропластов, часть сохраняет иетастабилыюэ состояшю, подчиняясь регулирующим "командам" извне.

Для сравнительного анализа индуцированных НИ пластошых мутантов непосредственно на уровне ДНК кы сознательно отобрали мутантные линии, полученные В.Д. Белецким более 10 лет назад. Сргз хг^зр, оггссязгеа к 33 пестролистным лишим» не обкару»

lio ira одного случал реворсии, хотя за время наблюдения било просмотрено более 15000 растения. Среда 7 мутантннх линий типа chlorlna лизь в одной из них за 12 лот воспроизводства однажды возникла спонташтя реверсия (Белецкий, 1989).

Сам факт, что после однократной обработки семени, мутантные хлоропласти сохраняй: свою индивидуальность, пройдя через тысяча делений в соматических клетках и цитоплчзмэтическиЯ мейотическкй отбор, воспроизводясь в последующа поколениях, свидетельствуй о возможности запасного адаптивного пути ш!Топлазматической вволюции, основанной на сохранении "гетерогенности регуляторной системы хлДНК.

выводы

1. Обработка семянок подсолнечника инбредаой линии 362S Н-нитрозо-И-метилмочеышой (НИЛ в концентрациях 0,01% и 0,0151 вызывает появление в Mj шзаичиых растений.

2. Измена ультраструктура пластид в зеленых и бесхлорофил-льных участках юззаичиых растения подсолнечника Uj. Показано, что пластиды в зеленых участках не отличается от норды, а в бес-хлорофклльшх - происходит нарушение структуры тилакоияшх мембран, а также отмечено поваленное содержание пластоглобул.

3. Методом гибридологического анализа установлена внеядер-пая природа индуцированных ШМ мутантов подсолнечника.

4. Подобраны оптимальные интервалы времени при прорастыпй семян подсолнечника для индукции ШМ пластидных мутаций. Установлено, что обработка прорастающих семян НХМ, как при концентрации 0,015, так и 0,015% во временном интервале 0-24ч индуцирует мутации только в отрезке 9-18ч с четким пиком, приходящимся на 12-15ч. В пограничных с кил трехчасовых временных интервалах происходит значительное снижение эффективности индукции, особенно в период от 15 до 18 часов.

5. Изучена кинетика включения 3Н-тимидкна в пластидаую и ядерную ДНК клеток зародышей прораставши семянок подсолнечника. Показано, что радиоактивная метка начинает включаться одновременно в плесгидную к ядерную ДНК между 3-им и 6-ым часами прорастания. Обнаружены два пика синтеза обеих ДНК, приходящиеся на 9 и 18 часов.

6. Максимальная эффективность индуцированного шм пластид-

ного мутагенеза'кореллирует с пиком репликации пластома, приходящегося на 17-18ч прорастания семянок подсолнечника.

7. Показано, что пластом клеток подсолнечника, подобно пластому ipyrax представителе!! покрытосеменных растений, представлен ч.лекулаки ДНК, имеющими форму колец, контурная длина которых составляет около 50 mkw, что соответствует 150 т.п.н. и нолекулярноЯ масса 100 МП.

8. Сравнительной анализ результатов электронной микроскопии и рестрикции пластинной ДНК исходной линии 3629 подсолнечника и пластомных мутантов chlorlna, индуцированных НИМ. свидетельствует об отсутствии крупных перестроек, таких как протяженные деле-ции или дупликации, в структуре ДНК пластомных мутантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Таран С.Ф., Усатов A.B. Выяснение первичного эффекта пластидной мутации у подсолнечника // IV Всесоюзн. конференция по биологии клетки - Тбилиси.-1985.-С.684-685.

2. Усатов A.B. Активность рибулозо-1,5-бифосфзт карбокси-лазы у пластидного мутанта подсолнечника и полученных на его основе гибридов // V съезд ВОГйС им. Н.й. Вавилова, тез. докл.-Москва-1987.-Т.3.-С.156.

3. Усатов A.B., Разорателева Е.К., Таран С.О. Изменение нормы реакции пластомного мутанта подсолнечника и гибрида, полученного на его основе, в зависимости от условий выращивания // V Всесою;:. конференция по биологии клетки - Тбилиси-1987.-С.1005-1006.

4. Усатов A.B., Таран С.Ф., Дмитриев В.В., Белецкий В.Д. Динамика включения 3Н-тимидина в пластидную и ядерную ДНК заро-дыаей на начальных этапах проращивания семянок подсолнечника // Цитология.-1990.-Т.32, N3.-С.293-300.

5. Белецкий Ю.Д., Усатов A.B., Разорителева Е.К. Частота индуцированной Н-нитрозо-Л-метилмочевиной внеядерной пестролист-ности у подсолнечника в зависимости от уровня репликации пластидной ДНК // ДАН СССР.-1990.-Т.313, N3.-C.7I6-7I8.