Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЭНЕРГОПРЕОБРАЗУЮЩИХ СИСТЕМ ХЛОРОПЛАСТОВ РАЗЛИЧНЫХ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЭНЕРГОПРЕОБРАЗУЮЩИХ СИСТЕМ ХЛОРОПЛАСТОВ РАЗЛИЧНЫХ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ-АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

БАССАРСКАЯ Елизавета Михайловна

УДК 581.132:577.3:633.11

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЭНЕРГОПРЕОБРАЗУЮЩИХ СИСТЕМ ХЛОРОПЛАСТОВ "РАЗЛИЧНЫХ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1986

Работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, доцент Гавриленко В. Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кумаков В. А.; кандидат биологических наук, ст. н. сотр. Моторина М. В.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства имени Н. И. Вавилова ВАСХНИЛ, Ленинград.

Защита состоится . . *4г . Я/?&£££>*% . . . 1987 г.

часов на заседании Специализированного совета Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева (Д. 120.35.07). по адресу: Москва, 127550, Тимирязевская ул., д. 49, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан . . '. . . 1986 г.

Ученый секретарь /W/

Специализированного совета™ ШуШ^

кандидат биологических наук " М. Н. Кондратьев

СПЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Продовольственная программа СССР (Продовольственная программа, 19 82) ставит задачей дальнейшее увеличение урожайности сельскохозяйственных культур. Важная роль в резении поставленной.задачи прга-)адлежит исследованиям физиологических закономерностей, определяющих высокую активность продукционного процесса.

Интенсивно разрабатываемая в последние годы теория фото-скнтетическсй продуктивности (Ничипорсвич; 1977, 1982) устанавливает решатацую роль фотосинтетической деятельности в формировании урожая. Ватным резервом повышения продуктивности является увеличение интенсивности фотосинтеза единицей зеленой.по-верхности растения (Быков и др., 1980; Зеленский» 1982; Мокро-носов, 19 82; Кумаков, 1985). На современном этапе интенсивного растениеводства необходимо создание высокопродуктивных форм растений путем генетического улучшения интенсивных характеристик фотосинтетического аппарата. Проведение таких направленных селекционных работ требует исследования роли отдельных стадий фотосинтеза в повышении продуктивности возделываемых культур.

В серии работ В.З.Гавриленко с сотрудниками (Гавриленко и др., 1974; 1980, 1981, 1984) исследован вопрос о значении уровня фотосинтетического энергообмена в продукционном процессе. Показано,, что растения высокопродуктивных сортов озимой и яровой пшеницы уже на ранних стадиях развития,отличаются более высоким уровнем фотофосфорилирования и ряда сопряженных с этим процессом фотоэнергетических реакций. В последние годы получены данные о том, что высокая-активность фотофосфорилирования характерна для высокопродуктивных сортов и на более поздних стадиях онтогенеза (Володарский.с сотр., 1979; Сахарова,,19 80), и, как было показано Т.Е.Кренделевой с сотр;, характерна также для вьсо-

И 'ТТЬЭД

Иау.-І л I

сель кот • ' • с • I. ад демш| пк. Ь. А. А-.лагяквц

М

копродуктивных сортов других видов растений (Якубова и др., . 1979; Алауддин и др., 1983; Кренделева и др., 1985). Таким образом, повышение энергетической эффективности фотосинтеза у высокопродуктивных форм является общей закономерностью и это определяет необходимость более глубокого исследования данной проблемы.

Дель и задачи исследования. Целью работы являлось более углубленное изучение структурно-функциональных особенностей систем фотофосфорилирования, определяющих высокую энергетичес- ' кую эффективность первичных процессов фотосинтеза высокопродуктивных сортов. Задачи исследования включали: I) сравнительный анализ активности циклического и нециклического фотофосфорили-рования опытных растений; 2) исследование активности работы электронтранспортной цепи (ЭТЩ фотосинтеза и 3) фотоиндуцируе» мого процесса поглощения протонов хлоропластами опытный сортов пшеницы, а также их буферной емкости; 4) анализ каталитических свойств сопрягающих факторов I (СР]) из хлоропластов, различающихся по продуктивности сортов яровой пшеницы; 5¥ изучение физико-химических свойств сопрягающего фактора I исследуемых сортов .

Научная новизна работы. В, работе впервые проведены углубленные сравнительные исследования каталитических и физико-химических свойств АТФсинтетаэного комплекса и, прежде всего, сопря-. тающего фактора I у различающихся по энергетической эффективности первичных процессов фотосинтеза и продуктивности сортов пше-«ицы. Установлено, что уровень фотофосфорилирования интактных « реконструированных систем в значительной мере определяется спецификой структурно-функциональных свойств сопрягающего фактора I.

Дан анализ Са -АТФачной активности высокоочищенных препа-

ратов СР] опытных сортов в разных условиях эксперимента (при варьировании концентрации субстрата, условий рН, времени термоактивации фермента и др . ) . Выявлены две гетерогенные формы СРт, различающиеся у опытных сортов по электрофоретической подвижности в ПААГ. При помощи электрофореза с додецилсульфатом натрия <ДДС-На) определен субъединичный состав отдельных форм СР] у Аактивно- и слабофосфорилирующего сортов. Методом флуорометри-ч-еского анализа проведено исследование состояния тирозиновкх остатков СР] пшеницы и сопоставлены отдельные показатели флуоресценции у двух различающихся по продуктивности сортов.

Практическая значимость работы. В работе установлена возможность изменения в процессе селекции интенсивных показателей работы фотосинтетического аппарата, имеющих значение для формирования свойств высокой продуктивности. Выявленные особенности организации и работы энергопреобразующих систем высокопродуктивных сортов могут быть использованы в селекционной практике при разработке программ по созданию высокопродуктивных сортов яровой пшеницы.

Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на УУ и ХУ1 (1984, 1985) конференциях молодых ученых Биологического факультета МГУ, на Всесоюзной научной конференции "Физиоло-го-генетические проблемы интенсификации селекционного процесса" (Саратов, 4-6 июля 1983 г.) , на конференциях "Фотосинтетический метаболизм и его регуляция" (Чернигов, 17-19 мая 1983 г.) и МГУ сельскому хозяйству"(Москва, 19 35) .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. —">,*" ' Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 2 0 рисунков. Состоит из введения, обзора литературн, методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов и'списка цитирование

литературы, включающего 259 наименований, из них £02 зарубеж-_ ных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили 9-31 дневные проростки яровой пшеницы ( Triticum eeativun L. ) трех сортов саратовской , селекции, которые являясь генетически близкими, различаются по этапам селекции и продуктивности: низкопродуктивный селекционно старый сорт Эритроспермум 8202, среднепродуктивный сорт более поздней селекции Саратовская 49 и новый высокопродуктивный сорт интенсивного типа Саратовская Ь2. Растения взращивались в термостатной камере лаборатории искусственного климата МУ имени М.В.Ломоносова при постоянных условиях освещения (10 000 люкс), температуры (25°С) и влажности (60$), на 1/2 нормы питательной смеси Прянишникова, рН 6,0.

Хлоропласты выделяли в среде 0.35М НаС1 и 0.025М трис-НС1 буфера, рН 8,0 двукратным центрифугированием (3 мин 800 об/мин, 10 мин 3000 об/мин), промывали средой выделения и переосаждали центрифугированием Ю мин при 3000 об/мин, затем хлоропласты суспендировали в среде выделения. Активность циклического (с фенаэинметосульфатом) и нециклического (с К Ре(Сн)е) фосфорили-рования определяли по убыли в реакционной смеси неорганического фосфата (Avron , 1963). Для определения Фн использовали метод Чена с сотр. ( Chen et al., 1956), хлорофилла в суспензии хло-ропластов - метод Арнона (Агпоп , 1949). Содержание зеленых пигментов в листьях опытных растений определяли спектрофотометри-чески, используя формулы Мак-Кинни ( Ыас-Kinney , 1941). Фотохимическую активность хлоропластов исследовали спектрофотометри-чески при длине волны 420 им по убыли количества К Ре(См )g в световой пробе. Активность реакции Хилла определяли полярогра-

фическкм методом с помощью стационарного электрода Кларка закрытого типа по скорости выделения кислорода хлоропластами. Определение активности светиндуцирусмых процессов поглощения протонов хлоропластами проводили потенциометрическим методом ( № -ahimuгa е! а1 ., 1962). Буферную емкость хлоропластов определяли потенциометричеоки и рассчитывали по формуле, приведенной Опанасенко с сотр. (1981). Выделение сопрягающего фактора из хлоропластов и реконструкцию фосфорилиругащих систем проводили по методу Оогаана и Шевита ( Shoshan , Shavit , 1977) с некоторыми модификациями. Количество снимаемого белка определяли методом Лоури ( Хошгу е! а1 ,, 1951), Для исследования Са -АТФаз-ной активности СРт и еро физико-химических свойств использовали метод выделения СРт, описанный Штротманом ( Stгotmann е! а 1., 1973), с некоторыми модификациями. Предварительную очистку и концентрирование С^' осуществляли сульфатом аммония (Степанова и др., 1978). Дальнейшую очистку С^' и изучение свойств белка проводили методом электрофореза в ПААГ по Дэвису в модификации Сафоновых (Сафонов и др., 1968). Са -АТФазную активность определяли в препаратах электроферетически чистого С^' по методу Степановой и др. (1978). Содержание сульфгидрильных групп,С^' определяли методом Эллмана (Е11тап , 1959). Слектрофлуорометри-ческое исследование электрофоретически чистых препаратов С^' проводилось на регистрирующем спектрофлуориметре с монохроматическим возбуждением (Бурштейн, 1975). Флуоресценция возбуждалась светом ртутной линии 280,4 нм и 296,7 нм от лампы СВД-120. В спектры вводилась поправка на спектральную чувствительность прибора. Доля тирозиновой компоненты в спектрах флуоресценции и анализ кривых спектрофо.тометрического титрования остакоп тирозина (для определения рК) осуществлялся при использовании алгоритма Марквардта (Елее^е! а1 ., 1972). Данные исследований

подвергали статической обработке (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕН И Е I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗВИТИЯ СПКТШХ РАСТЕНИЙ

Обший анализ развития опытных сортов яровой пшеницы показал, что уже у 10-дневных проростков проявлялись особенности морфологической структуры, характерные для данных генотипов. Проростки Саратовской 52,отличались большей шириной и суммарной площадью 1-го и 2-го листа и более развитой корневой системой. У растений высокопродуктивного сорта отмечены наибольшие значения сырого и сухого веса надземных органов и корней и выше доля корней в общей массе растения. По концентрации хлорофиллов а и б и их соотношению в листьях исследуемые три сорта практически .не различались, что может указывать на отсутствие значительных различий в организации пигментных систем данных сортов ЯШэницы.

2. АКТИВНОСТЬ ФОГОСИНТЕТИЧЕСКОГО ФОСФОРИЛШЖАНИЯ ХЛОРО-Ш1АСТ0В иклдаЕмых СОРТОВ

Сравнительный анализ энергетической эффективности работы фотохимических систем хлоропластов опытных сортов показал, что исследуемые сорта пшеницы четко различались по активности циклического и нециклического фотофосфорйлирования (таблица I).

Таблица 1.

Активность циклического и нециклического фотофосфорйлирования и фотовосстановления КРе(Сн )с.

N. Вари-N. ант Сорт N. Фотофосфорилирование мкмоль £>н»мг хл «час йотовосстанов-ление К3Ре(См )6 мкмоль КзРе(Сн )6. мг хл -час Р/2ё

циклическое с ОМС нециклическое с Кэре(Ск )6

Эритроспермум Саратовская 49 Саратовская 52 84,62 + 8,52 113,45+4,47 140,61+9)60 69,46+7,45 87,24+7,71 113,66+6,06 174,03+6,98 172,60+в,33 |175;31+6,39 0,80

Агтквность циклического и нециклического фосфорилирсванкя была существенно выше у высокопродуктивного сорта Саратовская 52 и составляла в среднем 13ОД от активности среднепродуктивно-го сорта Саратовская 49 и 169% от активности нкзкопродуктивно-го сорта Эритроспермум 82 02. Исследуемые сорта мало отличались по скорости нециклического потока электронов (таблица I) . Коэффициент Тг/Хе, характеризующий степень сопряжения, бкл значительно выше у высокопродуктивного сорта. Это позволяет говорить о том, что у хлоропластов Саратовской 52 нециклический поток электронов сопряжен с фосфорилированием более эффективно, чем у Саратовской 49 и особенно у Эритроспермум 8202.

Выбранные сорта, значительно различаясь по уровню фотофос-форилирозания, представляют удобные объекты для исследования особенностей систем сопряжения, определяющих высокую эффективность работы АТФсинтетазного комплекса. Исходя из современных представлений о двух основных стадиях фотофосфорилирования.было проведено сравнительное исследование активности работы ЭТЦ фотосинтеза, фотоиндуцируемого процесса поглощения протонов и терминальной стадии фотофосфоршшрования, связанной с каталитической активностью сопрягающих белков.

: 3.'. ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЭТЦ ХЛОРОПЛАСТОВ.

Определение скорости потока электронов по активности выделения кислорода при различных значениях рН реакционной смеси показало, что высокопродуктивный сорт Саратовская 52, не отли-.'чаясь по интенсивности базального потока электронов (рис, ІА) , несколько превышает менее продуктивный сорт Эритроспермум 82 02 по активности сопряженного (рис, ІВ) и разобщенного (рис. ІВ) -. транспортов влектронов, особенно при оптимальнее ЗНПЧРНИЯХ рН • этих потеков. (8,0,н 7,8, соответственно), Это позволяет ГОРО-рить о более высоком уровне потенциально 'воэмомого транспорта

- в -

электронов у хлоропласте? активноЛссчсрилиругеЛего высокопродуктивного сорта. '

Однако различия в активности транспорта электронов были менее выр&чены, ч«м в актчрности £сто*сслсрилирозгшия опьтних сортов. Согласно теории Митчелла (Mitchell , I9CG) основой пре-образованна энергии является сспряяссныЯ с транспортом электронов процесс генерации протонного градиента, в СВЯЗИ с этим было проведено сравнительное исследование аятизности £отоиндуцируемо-го процесса поглощения протонов (рис. 2).

Яэ данных рис. 2 молно видеть, что хлсроп.-асты высокопродуктивных ссртсв с высоки* урсрн*** *ото£сс1;срйЛ1!рсвания имели более высокую активность фотопоглощение протснсв. Максимальная активность этого процесса у опытных сортов достигалась при разных значениях рН. Системы с вксоким уровнем фотофсс*срилирова-ния имели более кислыЯ спткмум рН (0,4 - для Саратовской L2,

" ив ТА Ш%~ ел" рН

Ркс. I, Скорость выделения кислорода хлсропластами«пзеницы сортов Эритроспермум 8202 (I) и Саратовская 52 (2) в зависшее--ти от рН: А - в отсутствии АД*+5н, Б - в присутствии АД5+Фн, В - в присутствии н Ы]С1.

6,6 - для Саратовской 49 и 6,7 - для Эритроспермум 82 02) . Следовательно, состояние сопрягающих мембран, соответствующее их максимальной активности, у сортов с высоким уровнем фотофосфорили-рования достигается при более высоких концентрациях протонов в среде по сравнению со слабо фосфорилирупшими хлоропластами дру-

гих сортов. Это может указывать на различие электрохимических свойств мембранных белков исследуемых сортов пшеницы.

Е--1-1-1-!_I_I_1_1_

В« 6,1 6.Б 6,7 6,9 рН

Рис . 2 . Активность фотоиндуцированного поглощения протонов хлоропластеми пшеницы сортов Эритроспермум 8202 (I), Саратовская 49 (2) , Саратовская 52 (3) в зависимости от рН.

Характерные различия между сортами были обнаружены при определении буферной емкости хлоропластов. При всех исследуемых значениях рН (от 6,2 до 7,0) хлоропласты Саратовской 52 и Capi-товскоЯ 49 имели более высокую буферную емкость, чем хлоропласты Йритроспермум 8202. Таким образом, способность к взаимодействию с протонами у мембранных белков высокопродуктивных сортов выше, чем у низкопродуктивного, т.е. они имеют в нативном состоянии большее число протонсвяэывающих центров. В связи с современными представлениями о существовании локальных протонных пулов внутри тилакоидных мембран ( Dllley et al . ,1981) , обнаруженные в работе различия в буферной емкости и активности фотопоглощения протонов могут иметь определенное значение для процесса создания исследуемъми системами необходимой величины прогонного градиента., ,' :

Установленные различия у опытных систем в транспорте электронов, светзависимых реакциях поглощения протонов, значении рН оптимума этого процесса,.величине буферной емкости позволяют

считать, что мембранные системы высокопродуктивных активно фос-г форилирующих сортов имеют ряд особенностей, которые уже на первой стадии синтеза А1Ф определяют высокую активность первичных процессов преобразования энергии света в протонный потенциал.

4. КАШИ1ИЧЕЖАЯ АКПЗНОСТЬ С0ПРЯГАВД1Х БЕГЖСВ.

Наибольшее внимание в работе было уделено сравнительному

изучению функциональных и структурных свойств сопрягающих факторов I опытных сортов, поскольку именно они несут каталитические центры синтеза АТС. Функциональная активность СН' исследовалась в опытах по реконструкции фосфорилиругощих систем (определение сопрягающей активности) и путем прямого определения Са -АТФазной активности в изолированных, электрофоретически чистых препаратах СН'.

4.1, Сопрягающая активность СН в опытах по реконструкции ФосФорилирующих систем.

Опыты по реконструкции систем фотофосфорйлирования показа-» ли, что сопрягающие белки активно фосфорилирующего сорта Сара* товская 52 проявляли значительную сопрягающую активность и обеспечивали высокую фосфслйипфУюшуй активность реконструированных систем во всех, вариантах опыта (рис. 3). Сопрягающий фактор 1 низкопродуктйвного сорта Эритроспермум 8202 обладал существенно меньшей сопрягающей активностью при рекомбинации со своими мем<* Сранаин '{рис. ЗА) и был совсем неактивен с мебр&нами Саратовская 52 -Срйс. ЗБ). Таким образом, Можно заключить, что уровень фотофосформлирования опытных сортов в значительной мере опреде* эЪгётся спецификой функционирования СР].

Параллельно проведенный количественный анализ белка в реакционной смеси до и после реконструкции (рис. 3, зачерненные столбики) показал, что отсутствие сопрягающей активности СР] Эритроспермум 8202 при рекомбинации с меыбранами Саратовской 52

MOI-

- п

: №

&

| го « о

FHC. 3. Активность фотофосфорилирования исходных и рекой» струированных систем и количество белка, присоединившегося к мембранам при реконструкции (зачерненные столбики) ! А - Эритрс-спермум 8202, Б - Саратовская 52. Фосфорилирование; I *• исходное, 2 - после двукратной обработки хлоропластов 0,15 мМ ЭДГА, 3 - систем, реконструированных с CCj Эритроспермум 8202, 4 -систем, реконструированных с CFj Саратовской 52,

обусловлено неспособностью его взаимодействовать с мембранами высокопродуктивного сорта. Поскольку по данным электрофоретичес-

кого анализа CPj Эритроспермум 82 02 содержит все 5 типов субъе-г диниц, причиной отсутствия контакта могло быть конформационное или зарядовое несоответствие между белками мембран Саратовской _52 и сопрягающими белками Эритроспермум 82 02,

В опытах с модификацией CFj Эритроспермум 82 02 кзнформаци-онно-активными агентами (условия рН, Mg , .питиотрейтол) исследована возможность изменения характера взаимодействия этого белка с мембранами Саратовской 52 и повышения его сопрягающей активности. Опыты по варьирования рН среды реконструкции от 7,8 до 8,4 не дали существенных результатов. Увеличение концентрации MgClg в среде реконструкции до 2 0 мМ несколько повысило ео-прягаицую активность CFj Эритроспермум 82С2, Именно при этой концентрации CF» слабо фосферилируппего сорта оказался способ-

° концентрация /\Т%М

4. Активность фотофосфорилирования реконструированных

систем и активность фотоиндуцированного поглощения протонов исследуемыми системами (зачерненные столбики) в зависимости от концентрации ДГТ в среде реконструкции. Фосфорилирующая активность хлоропластов Саратовской 52; I - исходная-, 2 - после Двукратной обработки 0,15 мМ ЭДГА Фосфорилирование реконструированных систем: 3 - мембраны Саратовской 52 + С^' ЭритростгерЛум 8202, 4 - мембраны Саратовской 52 + СРт Саратовской 52.

ным контактировать с мембраной Саратовской 52-, Наибольший эффект на активность реконструкции был обнаружен при действии дитиотрей-тола (ДГТ) (рис. 4). В варианте с СР' Эригроспермум 8202 ДГТ оказывал резко положительное действие на эффективность реконструкции. Это проявлялось в значительном повышении способности СРт Эритроспермум 6202 контактировать с мембраной (о чем судили по увеличению фотопоглощения протонов - рис. 4, зачерненные столбики) и увеличении каталитической активности СРт низкопродуктивного сорта. В то же время в варианте с С^' Саратовской 52 присутствие ДГТ в среде реконструкции приводило к снижению активности фо-тофосфорилирования.

Известно, что ДГТ действует главным образом на конформацион-ное состояние СР' (АИёгео е! и1 ,, 1982); в основе изменения кон-формации за счет ДГТ лежит увеличение аН-групп в отдельных субъ-

единицах фермента (Arana , Vallejoa , 1982; Nalin , MeCarty f 1984). В связи с этим протквополотное действие ДТТ на реконструкцию опытных систем может быть связано с неодинаковым исходным редокс состоянием исследуемых белков. Определения покапали, что электрофоретичеоки чистые белки активно фосфорилирующего сорта Саратовская 52 содержали • среднем в 2,8 раза больше легко реагирующих С ДТНБ sH-rpynn, по сравнению с CFj слабо фосфори-лирукхцего Эритроспермум 8202, при одинаковом количестве общих SH-групп ь обоих белках (см. раздел 5.1.).

Таким образом, данные этой серии опытов показывают необходимость тонкой регуляции редокс состояния CPj для создания высоко активной конформационной структуры белка, определяющей возможность взаимодействия СРт с компонентами мембран и реализации его максимальной активности. Установленное в работе неоднозначное действие рН, концентрации ионов магния и ДТТ на активность реконструкции, при использовании CPj двух сортов пшеницы Эритро-спермум 8202 и Саратовская 52, свидетельствует о различии струк-турно-функциЛальных свойств исследуемых белков.

4.2. Са. -АТФазная активность электрофоретически чистых препаратов сопрягающего фактора I.

Важным показателем функциональной активности CPj является АТФазная активность, которая у изолированного фермента находится в латентном состоянии и может проявляться после его предварительной термоактивации (Farron , Наокег , 1970). В работе было ПрОВедено сравнительное изучение Са -АТФазной активности электрофоре-тичеоки чистых препаратов CPj, выделенных из хлоропластов Эритроспермум 8202 и Саратовская 52. При всех условиях эксперимента (различная концентрация субстрата, время термоактивации, условия рН и др.) CPj, изолированный из хлоропластов Саратовской 52, отличался значительно более РЫСОКОЙ удельной Са*- -АТФаэноЙ актив-

ностью и рядом кинетических характеристик (рис. 5; б), Ферменты исследуемых сортов различались по величине 7ШВХ, насыщение и ин-гибирование их активности достигалось при разных значениях концентрации субстрата. На основании данных рис. 5 были определены значения КЛ методом Лайнуивера-Бэрка, которые были близки у опытных сортоз и составили 3,37 мМ для Саратовской 52 и 3,21 мУ для Эритроспермум 82С2. Это может указывать на довольно Слизкое сродство каталитических центров С^ исследуемых сортов в субстрату. Более высокая АТ5аэная активность фермента активно фосфо-рилируюсцего сорта Саратовская 52 является, по-видимому, результатом генетически обусловленных особенностей организации и функционирования каталитического центра Ср высокопродуктивного сорта новой селекции,

Определения зависимости Са -АТ5азной активности СРт опытных сортов пшеницы от рН (рис. б) показали, что фермент Саратовской 52 проявлял более высокий, чем у сорта Эритроспермум 6202, уровень активности при всех исследуемых значениях рН (от 7-,2 до 8,5) и имел иной рН оптимум. У Саратовской 52 максимальная скорость гидролиза достигалась при рН 8,0-8,2, а у Эритроспермум 8202 - при 7,8. Различие в рН оптимумах полет указывать на неидентичное состояние функциональных групп реакционного центра ферментов, поскольку оптимальные значения рН определяются прежде всего величинами рК аминокислот реакционного центра и его окружения.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ ПОКАЗАЛ, что СЕ] высоко- и низкопродуктивного сортов существенно различается по уровни каталитической (сопрягающей к Са -АТЗазной) активности. В связи с этим представляло интерес провести исследования ряда физико-химических свойств белков опытных растений, которые могут определять неодинаковый уровень их функциональной

активности, ъ

Рис. 5. Са*"*-АТ1азная активность согрягагцего фактора I из хлсропластсв Эрятроспериум CZ.CZ (I) и Саратмская 52 (2) в зависимости от концентрации субстрата. ~ 30

30

3 " ~ V Т/гп 18 8.0 А.2 WfW Рис, 6. Влияние рН на Сал-АТСазну» активность CPj хлоре— пластов пвеницы сортов Эритросвермуи Б2С£ (X) к Саратовская ££СЭ<

7*рН&9

5%рНв.а

02« 0.235

0.208 0.8*0

я71(,па.о 0,162 8.175

0590 0>3в

0,55»

о;«э

- олоо

А 6 А а. л о

Рис. 7. Элвктрофоретичвскаж подвижность. в ПААГ Салков сырых 0£Е* екстрактов, выделенных из хлоропласте* Эритросперцуи в2С2 (X) и Саратовская £2 (Б) по методу Псшанж, Еевина, (1973). Окраска гелей на Са2*-А13азцув активность.

5. а;зжс-т'.мчгас1Е СССБЕЖССТИ КССЛЦДТЮ; СРХ.

5.1, Содержание 8 Н-ггупп в электрофоре-тически чистых препаратах СИ опытных сортоз.

Каталитическая активность СИ' во многом зависит от состояния сульфгидрильных групп фермента ( Уаііеіоа еі а 1. , 1983; На-ііп , МсСаіІу , 1984). Установлено, что єН-группьі непосредственно в акте катализа не участвуют, но определяют активную кон-формационнуга структуру белка (уаііеіоє , 19 81). 3 связи с этим было проведено определение содержания легко реагирующих с ДГИБ и 'общих єН-групп в электрофоретически чистых препаратах СИ' опытных растений (таблица 2).

Таблица 2 .

Содержание легко реагирующих и общих єІТ-групп в СИ опытных растений в зависимости от времени их хранения при 0-4°С (нмоль єН-мг белка )

Вариант Время хранения SH/ легко реагирующие зН, общие

Эритроспер-мум.8202 Саратовская 52 Эрктроспер-мум Е2 02 Саратовская 52

Свежевыд еленныЯ 2 недели 3 недели 5,21+0,65 13,08+1,36 22,18+0,80 14,66+0,59 26,98+0,84 30,17+0,95 36,54+0,59 37,01+0,61 37,28+1,35 37,70+0,89 38,96+0,91 38,28+1,35

Из данных таблицу видно, что СИ высокопродуктивного сорта Саратовская 52 независимо от времени хранения содержал значительно больше легко реагирующих єН-групп, чем СИ низкопродуктивного сорта Эритроспермум 8202, тогда как общее содержание

8Н-групп было практически одинаково. Полученные результаты позволяют думать, что высокая функциональная активность сопрягающих белков Саратовской 52 обусловлена спецификой их конфирмационной структуры.

5.2. Электрофсретическая характеристика сопрягающих белков.

Для исследования некоторых молекулярных свойств белков был

Проведш элекгролсреткчески."'. анализ CPj в ГААГ (рис. 7). При анализе ОТЛ экстрактов в стандартных условиях на ?£ гелях, рЯ 0,9 у обоих слитных сертев Сило олньружено 2 полосы,прояьляг-ие СлЛ-АТЛазную актизность. Сопрягающие белки обеих зен у ксследу-аллс сортов различались по электроферетической подвижностк (&0. Таким образом, дышке электрофогетпческого анализа позволяли выявить наличие 2-х гетерзгеяьых ферм CPj у каждого сорта и отличие ферм CPj у ьисоко- и ниэкспредуктканого сертсв. Лспопьзсва-ние ICS геля, разделяюще*-0 гл&Еним образом по молекулярной массе, позволило выявить лигь одну АТ2азну» зону с одинаковым значением Rf для обоих сортсв. При анализе ферментов на крупнопористом KS геле, рН 0,0, на котором разделение белков обусловлено в основном кх зарядом, разделение дзух зенлолее четким, чем на 7л геле» Совокупность этих данных позволяет предположить, что ферма CPj опытних сортов имели некоторые различил в величине заряда. Наибольшие различия между отдельными формами были обнаружены при рН 0,0 (5& гель) (рис. 7), условия, при которых сохраняется н&тивкая структура белка.. Следовательно, в наткзном состоянии CPj опытных сортов имели наибольшие различия в заряде и ксн-формации. ЭлектрофоретическиЯ анализ белков в присутствии £ДС-На показал, что Селки обоих сортсв I и 2-Я АТ5азной зон сохраняют все 5 типов субьединиц..Результаты проведенных в работе исследований и данные работ других авторов ( Adolfaen et al., 1975; Joahl et al ., 1979) показывают, что разные формы CPj отличаются неодинаковым уровнем каталитической активности. Возможно, соотношение определенных ферм, различающихся по Функциональной активности, может определять разный уровень общей активности фото-фосфоршшрования опытных сортов.

5.3. ФлуорометрическиП анализ и епеКТроАэтокетрическое

титровм.ие электрофоретическн чистых препаратов СРт.

В настоящее время установлено существенное значение для каталитической активности СРі одного-двух остатков тирозина, входящих в активный центр фермента (Уаііеіоє , 1981). Исследование состояния тирозиновых групп в электрофоретически чистых препаратах СБі опытных сортов, проведенное методом флуоресцентного анализа белков (Бурштейн, 1976, 1977), показало, что опытные белки различаются по величине квантового выхода флуоресценции. Квантовый выход излучения СРі Саратовской 52 при всех исследованных значениях рН был ниже выхода СРі Эритроспермум 8202 (рис. 8). Эти данные, наряду с данными о неодинаковом отношении интенсив-ностеЯ флуоресценции при 305 и 350 нм (3,09 - для Эритроспермум 8202 и 3,23 - для Саратовской 52, при рН 8,0), могут отражать неодинаковое состояние тирозиновых остатков в СРі двух сортов, обусловленное разным составом их микроокружения.

Рис . 8 . Зависимость от рН квантового выхода флуоресценции растворов СРз из пшеницы сортов Эритроспермум 8202 (I) и Саратовская 52 (2) . Возбуждение при 280 нм; 20'С. Кривая 3..- зависимость от рН интенсивности рассеянного раствором света ртутной линии при 365 нм ( Я рассеяния), отражащая изоэлектрическую ;агрегацию белка.

Опыты по спектрофотометрическому титровании позволили установить, что ионизация остатков тирозина происходит не одинаково у исследуемых CPj . Так, нормально титрующиеся остатки тирозина Эритроспер/ум 82 02 начинали титроваться позже (рК составляло 10,3) , чем у Саратовской 52 (рК - 10,1); количество этих остатков несколько больше ' CPj высокопродуктивного сорта.

Полученные в работе данные по спектрам флуоресценции и спектрофотсметрическому титрованию указываю? на различие в распределении и окружении тироэиновых остатков в CPj опытных сортов, Выявленные микроструктурные различия CFj из хлоропластов высоко- и ниэкопродуктиЕного сортов могут млеть значение в проявлении белками различной каталитическая активности.

Таким образом, на основании проведенного в работе сравнительного анализа можно заключить, что высокая фосфорилирующая активность высокопродуктивного сорта Саратовская 52 обусловлена структурно-функциональными особенностями отдельных компонентов энергопрербразующих систем. Ведущая роль в повышении уровня энергообмена принадлежит сопрягающим белкам. Проведенные исследования показали, что CFj , выделенные из хлоропластов высокопродуктивного сорта новой селекции с высокой фотофосфорилирующеЯ активностью, отличается более высокой каталитической (сопрягающей и АТФазной) активностью и рядом физико-химических свойств: содержанием sH-rpyrfn, электрофоретической подвижностью в ПААГ И состоянием тирозиновых остатков. Полученные данные позволяют предположить, что в процессе селекции высокопродуктивного сорта происходили изменения белков АТФазного комплекса, что послужило основой повышения его активности.

ВЫВОДЫ

I. Для высокопродуктивных сортов яровой пшеницы характерна

более высокая энергетическая эффективность первичных процессов фотосинтеза. Высокопродуктивные сорта Саратоьская 52 и Саратовская 49 отличаются от низкопродуктквного сорта Эритроспермум 8202 более высокой активностью циклического и нециклического фотофосфорилирования,

2. ЛКТИЕНЫЙ синтез АТ5 у продуктивных сортов обусловлен особенностями светзависимой и энзиматической стадий фотофосфори-лирования. Высокопродуктивный сорт Саратовская 52 характеризуется более высокой скоростью потенциально возможного электронного транспорта и активностью сопряженных с работой ЭТЦ систем фотопоглощения протонов. При этом активно фосфорилкрующие хлороз пласты Саратовской 52 отличаются более "кислым" положением рН А оптимума процесса поглощения протонов и высокой буферной емкостью, что, по-видимому, определяется спецификой злектро-химичес-ких свойств белков тилакоидных мембран данного сорта,

3. В повышении уровня фотосинтетического энергообмена у высокопродуктивных сортов пшеницы ведущая роль принадлежит бел-г-кам сопрягающего комплекса. Показано, что фосфорилиругощая активность интактных и реконструированных систем в значительной мере определяется спецификой каталитических и физико-химических свойств сопрягающего фактора I;

4. Специфика сопрягающего фактора I опытных сортов сохрач-няется при выделении его из хлоропластсв. Опыты по реконструкции систем фосфорилироэалия позволили выявить более высокую сопрягающую активность С^' высокопродуктивного сорта Саратовская , 52, которая может определяться каталитическими свойствами и. особенностями конформационного и зарядового состояния белка.:.-;'./..

5. Высокоочкщенные препараты изолированного С^' опытных,', сортов значительно различались по Са -АТФазной активности.Пре- / параты высокопродуктивного сорта проявляли более высокую ката-/;

литическу» активность при всех исследованных экспериментальных условиях (при изменении концентрации субстрата, времени термоактивации и условий рН) и отличались рядом кинетических характеристик.

6. Разный уровень каталитической активности СБі опытн/х растений может определяться генетически обусловленными особенностями их физико-химических св:Лств. Исследуемые белки различались по числу легко реагирующих 8 Н-групп и электрофоретичее-кой подвижности в ПААГ. Данные флуорометрического анализа и спектрофотометрического титрования показали, что СРі опытных сортов различаются по величине квантового выхода излучения, отношению ЛЗСЕ/Л350 И значению рКа ионизации остатков тирозина, что может указывать на некоторые различия в. состоянии и окружении тирозиновых остатков в этих белках. ч

7. Электрофоретический анализ позволил выявить ряд гетерогенных форм СБі у исследуемых сортов. У активно- и слабо фосфо-рилирующего сортов эти формы различались по подвижности в ПААГ и функциональной активности,

8. Результаты проведенной работы позволяют предположить, что в процессе селекции пшениц невысокую продуктивность происходили изменения белков сопрягающего комплекса, их физико-химических и функциональных свойств, что определило более высокую активность энягопгэмйраэуюцих систем у селекционно поздних, высокопродуктивных сортов яровой пшеницы.

Работы, опубликованные по материалам диссертации

I. Гавриленко В.З., Жигалова Т.В., Б&ссарская Е.М. Повышение энергетической эффективности фотосинтетического аппарата в процессе селекции высокопродуктивных форм пшеницы. - Вест.Моск. ун-та, 1983, серия 16, биология, Г- 3, с. 38-45.

2. Бассарская Е.М. Сравнительный анализ энерго-преобразую-щих систем хлорогыастов у сортов пшеницы различной продуктивности. - В кн.: Молодые ученые и основные направления развития современной биологии. Труды 15 конференции молодых ученых Биол. ф-та МГУ, рукопись деп. в В'ЛНИТИ Я 6014, 1984, ч.1, с. І59-І6І.

3. Бассчрсиая Е.М. Сравнительное исследование РГл-АТФаз активно- и слабо фосфорилирующих хлоропластов пшеницы. - В. кн. : Молодые ученые и основные направления развития современной биологии. Труды 16 конференции ученых Биол. ф-та МГУ, рукопись деп. в ВИНИТИ 5047-65, 1985, ч.1, с. 193-196.

4. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Бассарская Е.и. Актив-кость фотоэнергетических реакций и продуктивность растений. -Физиол. и биохим. культ, раст., 1985, т.17, ИЗ, с. 375-378.

5. Гавриленко В.$., Бассарская Е.М. АТФазная активность СР], изолированного из хлоропластов двух сортов пшеницы с различным уровнем фотофосфорилирования. - £изиол. раст., 1986, т.33, вып. 2, с. 296-304.

Л 61689 28/Х1—86 г.

Объем 1'/г п. л.

Заказ 3318. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44