Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой"

Р Г 5 Ом

о

- и /;::д ¡Г"";

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи Заславский Дмитрий Леонидович

УДК 577.35

Механизм генерации мембранного потенциала цктохром с оксидазой.

(03.0.04 — биологическая химия)

.. АВТОРЕФЕРАТ.

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в отделе биоэнергетики Института .физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.А.Константинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В .Д. Самуилов

кандидат биологических наук В.Ю.Арцатбанов

Засчита состоится

часов на заседании Специализированного Совета (Д.053.05.032) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. • ■

Автореверат разослан " " 1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Ю.Н. Лейкин

Актуальность проблемы. Митохондриальяая цитохромоксидаза катализ )фует завершающий этап з процессе переноса электронов от МАВН к кислороду окисление цмтохромг С моле-куляр-пл': :п:слсрсдсм. Восстансззние молг^ули етслорода до воды требует присоединения четырех электронов и четырех протонов.

Восстаят-пепле .кислорода протекает поэтапно. Описаны два относителъъо устойчивых, спектрально различимых, кислородных ннтермедн.ута: перекксный (Р) и оксиферрильяый (Р) комплексы, которые соответствуют двух и трех электронному восстановлению кислорода.

Восстановление молекулярного кислорода до воды, катализируемое цитохромоксидазой, сопровождается перекосок элекгричестап зарядов через внутретога мембрану митохопдрии за счет того, что щгтозгром С, служащий донором электронов, находится в периплазме, а протоны, требуемые для восстановления кислорода до воды, захватываются кз матрикса. Кроме того, восстановление молекулярного кислорода до »оды цитохромоксидазой сопряжено с переносом через мембрану ионов Н"1", что повышает КПД третьего пункта сопряжения. В настоящее время принято считать, что, восстанавливая молекулу кислорода до «оды в процессе дыхания, цитохромоксидага переносит через внутреннюю мембрану митохондрии, изнутри — наружу, четыре протока. Метзду тем, о механизме переноса протонов через мембрану известно крайне мало. ■ . .... ...

Изучая энергозависимое обращение каталитического цикла цитохромоксидазы, Викстрем (\Vikstrom, 1985) пришел к выводу, что каждый из одноэлектронных переходов Р —>р к р —>Ох сопряжен с тралсмембраявой тразслокацией двух протонов на каждый переносимый электрон, тогда как предшествующее этим этапам двухэлектронное восстановление кислорода до перекиси водорода не сопряжено с ■ транслокацией протонов.

Тем не менее, вопрос о количестве протонов переносимых на различных этапах восстановления кислорода остается открытым. Тем более, неизвестны отдельные стадии переходов Р—и И—>Ох. Именно методы быстрой кинетики, использовавшиеся в данной работе, позволяют эффективно получать информацию о протекании этих реакция.

Целью работы было изучение кинетики генерации; Д'}' при одноэлестронном зоссгановлешга цитохромоксидазы, а также выявление и

V

характеристика отдельных стадии переноса зарядов дитохромоксидазой.

Научная но?и?нз. ¿ушзая работа является первым исследованием

генерация при функционировании отдельных стадий каталитического цикла цйтасромоксидазы. Эти измерения стали возможным:! благодаря разработаззому Т.Нильсоном методу фотохдапгческсго одкоэлахтронного восстав оелйлия цитохрс2.!Оксидазы при помощи трис(бпп'тр15Д11Л)рутс:;!>я (51иБру), юисрий и лег в основу данной работы.

С другой стороны, разработанный Л.А.Драче;зы:; н сотрудниками, в нашей лаборатории прямой электрометрический метод слежения за генерацией ДЧ' сделал возможным ^сследойояпе быстр..!:: электрогешхых реакций цитохромоксидазы.

Сочетание зтях двух методой позволило исследовать элехтрогеняые реакции, протекающие при госста.ювлешп: цитохромоксидазы с субмикросекундным разрешением. Этот подход позволяет также оценить число переносимых зарядов при одноэлектропном восстановлении этиа. интермеднатов.

Бсервые прямо показана электрогеяность ряда отделмых стадий реакций восстановления перекисного и охсиферрильного комплексов. Показано, что восстанозлепие перекисиого и оксиферрилъного комплекса сопровождается переносом равного числа зарядов через сопрягающую мембрану. Показано, что протекание реакций внутримолекулярного переноса электронов и протонов не зависит от природы донора электронов.

Показано, что транслокация протонов через мембрану протекает по механизму прямого сопряжения протонирования—депротонирования переносчика протонов со степенью окисления меди СиЗ. ,

Практическое значение работы. Полученные данные существенно дополняют современные знания о механизме генерации мембранного потенциала цитохромоксидазой и могут найти применение при исследованиях других терминальных оксидаз. Кроме того, результаты работы требуют пересмотра гипотезы Викстрема рЛ'ьЧ^гот, 1985) о том, что восстановление перекисного и оксиферрильного комплексов сопряжено с переносом двух протонов через сопрягающую мембрану.

Адробзпия работа. Основные результаты работы дважды представлялись на Гордонских конференциях (1993,1994), а так же на семинаре со биоэнергетике НИИ физико—химической биологии им. А.Н. Белозерсхого и на Российско —Германском минисимпозиуме по биоэнергетике в Орбеке (1994).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3 печатных работах.

Структура .работы. Диссертация состоит из введения, обзора литератур; J, описания методов исследования, Езлоя;сгшя результатов С!:су?-кдо;:::я результатов, списка цитируемой литературы. Диссертация яллюстрквсгвьа 20 рисунками и 5 схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 работе нс.юльзовалн реактивы отечественного ч зарубежного производства.- Дрожжевой цнтохром с, .чодифицвреоакпий по остатку cys—102 трис(бяп!)ридил)рутениеаыч комплексом был предоставлен Ф.Мкллстся.

иитохромохедам из сердца быка, выделенная .во методике Фаулера (Fowler, JSS2), била предоставлена Т.В.Выгоднной.

Оч::ст?су пнтсхролоксндазц от солей прсводзгля то методу фраз (Fry, 1970), используя сефздекс С — 25 (ccarse), повторяя процседуру 2 — 3 раза.

Встраивание цитохро.чоксидазы в лязосоэвд прозодилн1 диалнзтм методом IRakker, ¡S72!. Лкпосоми встраивали ка коллодиепую пленку, n.vcnvmwTy.a рэствором фосфэтидилхолнпз ;Г-Р — ЮОмг.'мл) и crsaptu£!i:i!ia (1мг/мл) з декане, в присутствия ЗЭмМ M0SO4 стечение трех часов. Пссде встраивания среду заменяли на ЮмМ гаилин в 5мМ ■ПиЗ-адетатпоя буфера клн в буфере TRIS-CHES-MOPS (2мМ, 2мМ и 1мМ, соотзстстьенно!. В опытах, требующих изменения рН в среду измерения добавлялки 1иМ дизтаноламив. Подробно, условия каждого конкретного опыта описаны в подписях к рисункам.

Оптические и электрометрические измерения проводили как описано 2 работе (Zaslavsfcy el.al., 1993).

Восстанодлепке тпохрочоусиАззи и питохрома с ггрн почеши RnBpy.

Потенциал полуБосстановления RuBpy составляет около. +1В, поэтому в темноте он " не способен подавать электроны на ИЕтохромокс.чддзу. Поглощение кванта света (схема 1) переводит ею в относительно долго живущее ¡~100нс) возбужденное состояние, с потенциалом полувосстановления около — 1Б. Если RuBpy ховалентно связан с цитохремом с или находится в прочном комплексе с цитохромокекдазой, то он способен за это время отдать один электрон акцептору, перейдя при этом в степень окисления +3. Наличие необратимого донора электронов (ЮмМ анилин) предотвращает реокислеяие акцептора за счет ревоссгановлеиия частицы КлВруЗ+.

СХЕМА 1

А

А __ .

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Оптические изменения вызываемые однозлектро:тым Фотохимическим восстановлением цитохромоксидазы. ч При низкой данной силе и рН 8, трис(бшгирндил)рутениевый комплекс (Р.иВру) прочно связывается с цитохромоксидазой в точке связывания цятохрома с. В присутствии ЮмМ анилииа, вспышка света приводит к быстрому фосстановлению меди СиА цитохромоксидазы.

Вслед за неразрешаемым фотохимическим восстановлением меди СиА оксиферрильвого комплекса цитохромоксидазы наблюдается быстрый (т~50мкс) перенос электрона на тем .а - (рис.1), вызывающий увеличение оптической плотности при 445нм. Далее следует более медленное двухфазное уменьшение оптической плотности (Т2~1мс и тз~4мс). Конечное значение оптической плотности меньше исходного, что связано с Босстгвовлеиием сксиферрнльного комплекса цитохромоксидазы до ферриформы фермента. Вклады фаз составляют примерно 80 и 20%, соответственно. Миллисехундные компоненты оптического ответа, связаные с реокнелением тема а и восстановлением оксиферрильного комплекса, подавляются добавлением цианида ¡рис.2), блокирующим перенос электрона между темам а и биядерным центром.

! кч га

:.пг

'и» г;

¡¡Я Л

I; г, ь .

ил

с. си.

III И

п

' Г.! •.•■(*•<< Г

Е.С52

I '

л <

-5 -9.К2

>М

;'*„, Г*,-» Сд

5*

4 Й

ПЙ

|Г','с.! Оптические ;:з>1еие!;ич, Бизиг-ае?:ые одкоэлектроштм восстановлением | I огснферряльного яо-яилкса дитояром с охсчдазы. I

¡Кзгзетга ЮхЮин содчржв/л 10мкМ цитохромоксидазы в 5мМ ТШБ—адетатион | |бу&ере (рН В.1), 0.1% октил - р — О—глюгошфанозид, 10мМ а ими, 4мМ НоОоЛ (БО.мкМ КиВру. Кряпу> т.'олу;е;;а усреднением по 65 отлетам. Энергия есшгшхя — ! )50мДА.

-|Рас.2 Действие цканиьв на »шллисекундные фазы оптического отпета. ¡Кювегга 3x3мм, хъаез средх: тот же, что и в водзп'сп к 1 4 ?0СмхМ РсСу. ¡Кгивеитрация этяе'теомокоиазы ~ 50мкМ. После регистрации стзета {ссифсррильяого кс.-тялвксз г ккгатгу добавили 1иМ КСМ. |

Грпс

ит

Тр'

: 'г;ч ^г'.о"Т;!

В кр^сутст-ни ИнВру, пспишка сгета ЕШаг.ает генерацию потенциала дктохрс.»1схсчдаз0й встроенной в лшюсомп, прмхлеепные на коллодинвую пленку (рис 3-(. Знак фотоэлектрического ответа соответствует переносу помячнтелытого заряда изнутри лкпосомы наружу.

Гелеракял Л'? кмеег три фазы, времена которых хорошо совпадают с гремечамн фаз оптического ответа (т^—»0 — 50-гкс, Т2~0.6 — 1.2нс, Т3-З —.С.>.;с). Аяплитуда первой фазы фотоэлектрического ответа не заы.сит от хо^цеятредии згрекиси водорода и яе чувствительна х добавлению цкаи«,а (рис.4). Нечувствительность амплитуды первой фазы к состоянию билдерпого кислородоредуктазного цектра подтверждает ее

■ Суммарная амплитуда миллисекундвьк компонент фотоэлгзпркчеехегс отаета растет с увеличением концентрации Н202 и насыщается при ннзкж (К~ЛмкМ) концентрациях перекиси водорода {р!'.с.5), когда образуется смесь перекисного и окенферрильного комплекса и ие меняете* при увеличении концептргцнн Н2С2,- когда пся

цитохромохеидгза герехо.шт в форму оксиферримлого комплекса. Это С. с::'?:''с геренесом электрода с У- Си Л на

|И |

Рис.3 Фотоэлектрический ответ охсиферрильнсго комплекса. Циггохромохсидазвые протеолипосомы встраивали на коллодиевую пленку и заменяли среду встраивания на среду измерения: 5м М TRIS—адетатний буфер, ЮмМ анилин. 4мМ Н2О2 и 80мкМ RuBpy добавляли в оба отсека измерительной ячейки.

«•Л RuCK.j;"

показывает, что число зарядов переносимых через мембрану при восстановлении перекисного и оксиферрильного комплекса одинаково, что согласуется с данными Р. Митчела и соавторов (М11сЬе11,Я. е! а!, 1Р92), о том, что восстановление обоих интермедиатов сопровождается захватом одного протова, но не подтверждает предположение Викстрема (УЛкзиога, 1939) о . том, что при р,Н>.6 восстановление перекисного -комплекса сопровождается захватом двух протонов, а восстановление оксиферрильного комплекса не сопровождается захватом протонов.

Рис.4 Действие цианида на фотоэлектрический ответ цитохромоксадазы. Среда измерения та же, что и в подписи к 3. После регистрации ответа оксиферрильвого комплекса в ячейку добавили 1мМ КСГч' и 200.48311 ГсСу. Сигнал регистрировали после 20 минутой инкубации.

0.5-

-0.5

¡№8.1

fiOiiM MBipyJj'

flash * , «I

VJH<

2C0 uS

cosjpouütl F

+KCH

40 bS

0

Рис.5 Зависимость формы фотоэлектрического ответа цитохромоксидазы от концентрации перекиси водорода. Состав среды измерения тот же, что и в подписи к рис.З. В пробу последовательно добавляли перекись водорода в различных концентрациях. А— фотоэлектрические ответы цнтохромоксидазы при концентрациях Н2О2 5мкМ (1), 100мкМ (2) и 1мМ |3). Б— за=зсимость амплитуды II фазы (квадраты) III фазы (пятиуольники) и суммарной амплитуды двух фаз (тругольнкки)от концентрации перекиси водорода.

Однако, при переходе от микромолярных концентраций перекиси водорода к миллим олярпым наблюдается некоторое замедление генерации А'¥ , вызываемой восстановлением фермента. Кинетический анализ показывает, что зто связано с некоторым увеличением вклада третьей фазы с одновременным уменьшением вклада второй фазы. Перераспределением вкладов второй и третьей фаз генералам А'¥ (рис.5), происходит при тех же концентрациях перекиси водоролд (К-1б0мкМ), что и полный переход фермента в форму оксиферрилытсго комплекса. Это не означает, что вторая фаза связана с восстановленпгм перекиского комплекса, а третья с восстановлением оксиферрильного, сосполъку да;ле

комплекса. Среда измерения та же, что и в подписи к 3. После регистрации ответа; оксиферрилъного комплекса в ячейку добавили хаталазу и инкубировали 20 минут.

в случае полного перехода цитохромоксидазы в оксиферрильный комплекс вторая фаза присутствует, что особенно хорошо видно при рассмотрении оптического ответа оксиферрилъного комплекса (рис.2|. ч

Вклад первой фазы в генерацию ДЧ* составляет около 20% (19 — 23), вклад второй фазы составляет так же около 20« (17—21), а вклад третьей фазы около 60% (55—62). Таким образом, соотношение вкладов третьей и второй фаз фотоэлектрического ответа оксиферрилъного комплекса составляет около 3. При низких концентрациях перекиси водорода это соотношение существенно ниже и составляет лишь около полутора. Это свидетельствует об обратимости реакции порождающей вторую фазу фотоэлектрического ответа (по крайней мере в случае оксиферрилъного комплекса).

В хорошем согласии с данными оптических измерений, миллисехундные компоненты фотоэлектрического ответа полностью подавляются цианидом и существенно подавляются каталазой (рис.6). Каталаза не полностью подавляет медленные фазы электрического ответа, поскольку когда цитохромоксидаза встроена в лмтюсомы, то, даже в

присутствии каталазы, часть фермента находится в форме перекисного и оксиферрильного комплексов, образующихся за счет медленного аэробного окисления липидов.

Влияние оН на кинетику генерации АЧ* питохромоксидазой,.

Восстановление- оксиферрильного комплекса до ферриформы тема аз протекает с захватом протона из матрикса митохондрии и, кроме того, оно дополнительно сопряжено с переносом одного или двух (\\Як5тип, 1935) протонов через сопрягающую мембрану, поэтому особый интерес представляет зависимость скоростей отдельных стадий реакции восстановления оксиферрильного комплекса от рН.

Нами была исследована рН зависимость фотоэлектрического ответа в диапазоне рН от 5.8 до 9.5. Оказалось, что в этой области вклады фаз фотоэлектрического ответа остаются неизменными; кроме того, скорости первых двух фаз также не зависят от рН. Следовательно, реакции, порождающие первые две фазы фотоэлектрического ответа .не связаны с захватом протона из внутренней водной фазы.

а

я

X <4

2.8-1

2.5-

2.4-

2.2-

7.5

8

—i— 8.5

—i 9.5

Рис.7 Зависимость наблюдаемой константы скорости третьей фазы . фотоэлектрического ответа от рН. Среда измерения представляла буферную смес TRIS —CHES —MOPS (см. материалы и методы) и содержала 1мМ ацетат диэтаноламония 4мМ перекись водорода, 40мкМ RuBpy. рН изменяли добавляя КОН или НС1 контролируя его значение при помощи микроэлектрода.

СХЕМА 2 Стадии переноса зарядов цитохромоксидазой.

Стадии переноса электрона обозначены непрерывными стрелками. Толстые стрелки обозначают преимущественное | направление протекания реакции. Стадии переноса протона

обозначаются пунктирными стрелками. Группа сопряженная с медью . СиВ обозначена как А—. Доноры протонов для группы А— и феррилыюго кислорода обозвачспи соответственно как 01 и 02.

Скорость третьей фазы имеет слабовыраженную рН— зависимость и увеличивается от 2мс при рН 7 до примерно 8мс при рН 9 (рис.7) Основные изменения скорости третьей фазы происходят при рН>3. Это похазывает, что скорость восстановления оксиферрилыюго комплекса лимитнрутся скоростью внутримолекулярного переноса • протона, требуемого для протснирования кислорода оксиферрильного комплекса при образовании гидроксил— иона. рК внутрнбелкового донора протона можно приближенно оценить, как 8.0. Таким образом, при тясокгс: рН происходят расцепление третьей фазы на две субфазы.

Предлагаемая последовательности стадий переноса зарядов

Сопоставление дз.вных оптических и электрометрических измерений позволяет построить модель работы протонной помпы датохромоксидазы [схема 2) и оценить число протонов переносимых через v сопрягающую ' мембрану при восстановлении перекисного и охеиереррильного комплексов.

Перенос электрона с меди СаА на гем о соответствует переносу единичного заряда ча половину гидрофобного барьера (HinkJe.P and Mitchell,P., 1970j, что позволяет оценил, сверху число зарядов, переносимых на I электрон. Поскольку вклад первой фазы фотозлектр'гческого ответа составляет около 20%, то эта оценка составляет 2.5. Однако, поскольку перенос электрона с меди СчА на ге.м а обратим, то эта оценка является завышенной. Считая, что число зарядов переносимых яа каждый -электрон должно быть целым (q=2) мы оцениваем глубину протекания реакции переноса электрона с меди СиА на гем а, как 0.8 ¡соответствует константе равновесия К = 4).

Вслед за восстановлением тема а происходит его реокисление, которому соответствует вторая фаза наблюдаемых- оптических и электрических ответов. В ходе этой фазы происходит большая часть уменьшения оптической плотности при 445нм (по сравнению с третьей фазой), однако вклад ее в генерацию потенциала значительно ниже. Таким образом, вторая фаза, по—видимому, представляет собой перенос электрона с тема а на медь СиВ.

Вклад второй фазы в генерацию A'F в случае оксиферрильного комплекса примерно равен вкладу первой фазы, а в случае перекисного хомплекса даже превышает его. Поскольку гем а и ииядерный кислородоредуктазный центр расположены на одинаковой глубине в мембране, то перенос электрона с гема а на медь СиВ, скорее всего,

малоэлектрогенев. Следовательон, относительно большей вклад второй фазы в генерацию ДЧ-1 связан с переносом прогона при протоиированки группы сопряженной с медью СиВ. Поскольку скорость и амплитуда второй фазы не зависят от pH, то проголирование этой группы происходит во внутримолекулярном режиме, а рК внутрибелкового донора протона имеет достаточно высокое значение (рК>3.5).

Величина амплитуды второй фазы электрического отпета говорит о том, что донорная группа находится вблизи внутренней водной фазы (менее 20% от поверхности), что делает процесс ее репротенировзнкя малоэлектрогекным.

Третья фаза электрических к оптическнх ответов представляет собой реокисление меди СиВ и восстановление окскферрнльпого комплекса, сопровождающееся протонированием кислорода оксиферрнльного комплекса и депротонированием грузны сопряженной с медью СиВ во внешнюю водную фезу. Протежирование оксифсррильного комплекса протекает во внутримолекулярном режиме, а рК внутреннего донора протоноЕ составляет около 8.5. Это объясняет наличие слабой pH — зависимости скорости третьей фазы.

Генр.радия Д*У нитохоочоксилазой при окислении аитохром?, с.

Для того, чтобы убедиться, что при восстановлении щгтохроггоксидазы с исеользоъеншсм RuDpy протекает те же реакции, что к ври окислении, цитохрома с, мы сравнили кинетику генерации АЧ' в присутствии RuBpy и цитоохрома с , модифицированного трис(бияиридил)ругениевым комплексом по аминокислотному остатку сув-102 (Ru-cyt —с).

Электрические ответ цитохромоксидазы в присутствии Ru-cyt—с отличаете."; от наблюдаемого в присутствии RuBpy (рис.7|. Дело в том, что ка свету происходит восстановление не только прочно связанного с ц:похромоксидазой цитохрома с, но и избытка цитохрома с г. растворе, • что приводит к погвланкю дополнительной медленной компоненты фотоэлектрического отгета.

Эта компонента селективно подавляется феррнцканидом, который быстро окисляет восстановленный цктохром с в растворе, но не . связанный с цитохромоксидазой (рнс.8). В присутствии феррнциаиида можно сравнить фотоэлектрические отбсты вызываемые фотохимическим востаиовлеаием меди СиА цитохромоксидазы и восстановлением прочно связанного с

¡Рпс. 7 Генерация неубранного потенциала цитохромоксэдазой при отаслении фотсхидатески восстал оЕлепного цитохрома с. Среда измерения та же, что и в подписи кЗ. Вместо Р.иВру в ячейгсу добавляли 5мхМ Яи — — с. Измерения проводили в отсутствие перекиси водорода."

ферментом Ru — cyt — с (рис.12). Видно, что в случае Ru — cyt—с наблюдается отчетливое замедление генерации мембранного потенциала. Кинетический анализ показывает, что скорость перво1"з фазы замедляется до 70—80мхс, а ее вклад задает примерно до .15%. Это легко объясняется ч включением в систему уравновешивающихся редокс—центров дополнительного одноэлектронного переносчика (гем с), который быстро (Ahmed ei. aJ., 1992) обменивается электроном с медью СиА. Это приводит (схема 3) к уменьшению как доли электронов переносимых с пары (с.СиА) на гем а, так и наблюдаемой скорости процесса (по сравнению с RuBpy).

Рис. 8 Действие ферряцяанида на фотоэлектрический отеет цитохромоксидазы 8 присутствии цитахрома с. Условия те же, что и в подписи к 7. После регистрации исходного

фотоэлектрического 4 ответа в пробу добавили 100мкМ ИеСу.

> 0.8 £

; ^ 9

•Н ■ 0.4-С

о 0-2-1 +)

0 О ft.

-0,2

Щ M2-cijt-c

«

ч

! I

'-»ет^п'''

*10ЕцН FeCy

>

£

I, *

(5 ■И

! Й О

1 «> О й,

3-

,2-

4Я ИД

1- Мру.

2- Ки-сц1-с

200

20 й

Рис. 9 Генерация мембранного потенциала при переходе Б —>Ох в грисугствии ИиВру и Яи —су1 — с. Среда измерения к ах в подписи г. рнс.З. Перед измерениями Б ячейку добавляли 4мМ перекиси водорода и либо 40мкМ КиВру либо 5мкМ Яи —су*1—с и 200мкМ Иесу.

СХЕМА 3

С и .

где К — константа равновесия реакции переноса

электрона с меди Сид на гем а, а к — константа скорости прямой реакции востановлевм гема с. Тогда эффективная константа скорости прямой реакции восстановления гема а становится равной: ¡4

где .; = -

К 1+К'

Константа скорости обратной реакции окисления гема а (к_ Достается неизменной (по сравнению с ИиВру). Таким образом амплитуда первой фазы пропорциональна величине:

а

-, а скорость первой фазы определяется выражением:

к - + Формальный переход от Яи —су} —с к КиВру можно осуществить, взяв параметр £= 1.

Уменьикл? степени восстановленное!:! ггма а приводит к некоторому замедленно второй фазы. Однако вклад ее возрастает, пссколысу происходит перераспределение вкладов первой и второй фаз аналогичное перераспределению складов второй и третьей фаз, происходящему при узол»;чении концентраций перекиси водорода. Таким образом, наблюдаемое замедление ДТ при переходе от КиВру к Ки —су1 — с объясняется наличием дополнительного однозлектронного переносчика и не требует нредпологать чллячяе какого—либо влияния цитохрома с на протекание реакций переноса электрона и протонов цитохромоксидазой.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые заргшстрирозана генерация ЛЧ7 - , вызываемая одиоэлеетроннш: ¡¡осстгнсплснием цитохромоксидазы с использованием ДцВру и Ни —су1 —с, и исслздована ее кинетика.

2. Сравнительный анализ данных оптических и электрометрических измерений показывает, что кинетически не разрешаемое нами восстановление меди СнЛ первичного акцептора злектр07юп, практически, не дает вклада з генерацию Л41 и вызывает протеканние процессов переноса электрона и протонов, порождающих, по меньшей мере, три фазы оптических и злектричесхих ответов, описываемых последовательной схемой реакций:

а), следующий за восстановление?] .меди СиА, злектрогенный быстрый (т~5С —50мкс) и обратимый перенос электрона на гем а, не чувствительный к состоянию ¡шслородоредуктазного центра;

б), дальнейший (если цитохромоксидаза находится в форме перекисного или ог.сиферрильного комплекса) перенос электрона с тема а на медь СиВ, сопряженный с внутримолекулярным электрогенным протонированием некой группы, переносчика протона, лимитирующим скорость восстановления меди СиВ (х-0.6 —1.2мс);

в), реокисление меди СиВ, которое лимитируется внутримолекулярным протонированием (т~2 —Змс) перекисного или сксиферрильного комплекса и сопровождается депротонированием сопряженной с медью СиВ группы во внешнюю годную фазу;

Г), репротонирование двух внутрибелковых доноров протонов из внутренней водной фазы.

3. Протекание этих процессов не зависит от природы донора электрона и приводит к переносу 2 зарядов через сопрягающую мембрану

т.е. к по.чпированию единственного протона) при восст&нсолении ка-'

перекисного, так и охснферрильного комплексов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. .

!'. Zaslavsky D., Kaulen A.D., Smiraova I.A.', Vygodina T.V., Konstantinov A-A. Flash—ind used membrane potential generation by cytochrome с oxidase. -FEBS Lett., 1993, v.336, N3, p.339-393

2. Zaslavsky D., Smimova I.A., Siletsky S., Kaulcn A.D., Millett F., Konstantinov A.A. —FEBS Lett, (accepted) Rapid kinetics of membrane potential generation by cytochrome с oxidase with photoactive Ru(II) —tris—bipyridyl derivative of cytochrome с as electron donoi.

3. Konstantinov A.A., Zaslavsky D.L., Sniimova I.A., and Kaulen A. D. in proc. of a Liposome Birthday Conference at Babraham Hal!, Cambridge (m press) Cytochrome с oxidase in liposomes: fist rapid tmetics measureiT^nls of membrane potential generation by the enzyme.

Список сокращении RuBpy — трис(бипиридил)рутений(Н) (хлорид),

Ru —cyt —с — cys— 102 модифицированный трис(бшдгоидил)рутениевим

комплексом дрожжевой цктсхром с.

TR1S — трис{гиАроксиметил)амино.четан,

CHHS — 2 —(N—циклогексиламино)зтан сульфокислота,

MOPS — 3 —(N—Морфолино)пропан сульфокислота,

FeCy — феррицианид калия

Р — псрекисный комплекс,

F — оксиферрильный комплекс.

Ох — окисленная цитохромоксидаза.

Подписало к печати/ _ 11 199 ^г. . Отпечатано ва ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 Производственном комбинате Объем Литературного .фонла Зак. ^ ^г^Гир. 100