Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тест-система на основе мутантных форм цитохрома c для количественного определения супероксидного анион-радикала

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Тест-система на основе мутантных форм цитохрома c для количественного определения супероксидного анион-радикала"

ОУ46У1702

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

На правах рукописи УДК 577.152

ПЕПЕЛИНА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ЦИТОХРОМА С ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3АПР2В1й

Москва-2010

004601702

Работа выполнепа в Лаборатории инженерии белка Отдела биоинженерии Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии ям. академиков М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук

Р.В. Черткова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук доктор физико-математических наук

А.А. Константинов Г.В. Семисотпов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоияженерия" РАН

Защита состоится «'/Л » ьЦ-О-З— 2010 г. в 10-00 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякипа и ЮЛ. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор физико-математических наук

ВЛ. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитохром с млекопитающих - низкомолекулярпый гем-содержащий белок, обладающий целым рядом биологических активностей. Основной функцией цитохрома с является перенос электрона от убихшшл: цитохром с - редуктазы (комплекс III) на цитохром с - иксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи митохондрий. В условиях высокой ионной силы цитохром с служит переносчиком электронов от цитохрома b¡ наружпой мембраны к комплексу IV внутренней мембрапы митохондрий (Bemardi, Arzone, 1981). При этом происходит перенос электронов по дыхательной цепи в обход ее начальных участков (участков генерации активных форм кислорода (АФК)). Значительная часть цитохрома с находится в митохондриях в довольно прочной связи с кардиолипином, входящим в состав внутренней митохопдриалыюй мембраны, и осуществляет пероксидазную функцию, которая может играть важную роль в инициировании выхода цитохрома с из митохондрий (Kagan et. al., 2005). После выхода в цитозоль цитохром с взаимодействует с фактором Apaf-1, что является ключевым этапом для образования апоптосом и запуска цитохром с - зависимого апоптоза (Zou et. al., 1999, Ни et. al., 1999). И, наконец, цитохром с обладает специфической антиоксидантной активностью, заключающейся в эффективном ингибировании продукции супероксидных радикалов (Ог~) (Korshunov et. ai., 1997, Skulachcv, 1998).

Супероксидные радикалы - нормальные метаболиты всех живых организмов, утилизирующих кислород в процессах обмена, но в избыточных концентрациях они токсичны, в первую очередь, как источник гидроксильных радикалов (ОН ). Гидроксильные радикалы обладают очень высокой реакционной способностью, вызывают окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других компонентов клетки. Общепринято, что продукция супероксида является неотъемлемым свойством дыхательной цепи митохондрий эукариотичеекпх клеток. Образование активных форм кислорода, таких как супероксид, в митохондриях является главной причиной окислительного стресса, ведущего к различным патологическим состояниям: нейродегеперативным заболеваниям, атеросклерозу и старению (Balaban, 2005).

Цитохром с широко используется для измерения скоростей геперации супероксидного анион-радикала. Однако, восстановление цитохрома с неспецифично для супероксида. Аскорбиновая кислота, глутатион и клеточные редуктазы могут восстанавливать цитохром с, который может бьггь рсокислен цитохром с - оксидазой и пероксидазой. Эти неспецифичные реакции восстановления и окисления цитохрома с искажают истинные значения скоростей образования супероксида.

Чтобы увеличить специфичность измерения супероксида, цитохром с частично ацеггилируют (~60% лизиновых остатков ацетилировано) (Агй е*. а1., 1975). Метилирование лизиновых остатков цитохрома с снижает скорости его восстановления митохондриальной и микросомальной редуктазами и скорости его окисления цитохром с - оксидазой, при этом способность цитохрома с к восстановлению супероксидом сохраняется. При ацетилировании цитохрома с уксусным ангидридом образуется достаточно гетерогенная смесь молекул цитохрома с с различным числом модифицированных лизиновых остатков. При этом реакционная способность цитохрома с по отношению к природному восстановителю и окислителю (убихинол: цитохром с - редуктазе я цитохром с - оксидазе) зависит от степени ацетилирования. При ацетилировании снижается общий положительный заряд цитохрома с, что ведет к снижению сродства к супероксиду. Неспецифическое взаимодействие ацетилированного цитохрома с (АсС) с компонентами дыхательной цепи уменьшают добавлением фосфата калия в сравнительно высоких концентрациях (до 100 мМ). С другой стороны, высокие концентрации фосфата калия вызывают частичное разобщение дыхательной цепи, что искажает картину генерации супероксида.

Все вышесказанное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования рекомбинантных мутантных цитохромов с, несущих замены, направленные на снижение реакционной способности по отношению к компонентам дыхательной цепи, и разработки на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в мигохондриальных препаратах, представляющей прикладной биохимический интерес.

Цель исследования.

Целью настоящей диссертационной работы являлось: конструирование, получение и исследование ряда вариантов цитохрома с, содержащих замены лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, направленные на снижение электрон-транспортной активности цитохрома с по отношению к белкам-партнерам дыхательной цепи, с последующей разработкой на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью.

Основные задачи исследования.

1. Путем введения одиночных и двойных замен в ген цитохрома с лошади исследовать роль индивидуальных лизиновых остатков в формировании реакционноспособных комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. На основе полученных данных о роли индивидуальных лизиновых остатков осуществить конструирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих сниженной

электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

3. Получить в препаративных количествах мутантные варианты цитохрома с, обладающие сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Провести детальное исследование мутантных вариантов цитохрома с лошади.

5. На основе отобранных на предыдущих этапах работы мутантпых вариантов цитохрома с, обладающих наиболее сниженной злектрон-трапспортной активностью, разработать тест-систему для количественного определения супероксидного апиоп-радикала в митохопдриальном препарате (прочносопряженных инвертированных субмитохондриальных частицах (СМЧ) сердца быка). Сравнить скорости генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренные с помощью полученных мутантных вариантов цитохрома с, и скорости генерации перекиси водорода, измеренные с помощью Amplex Red.

Научная новшна и практическая значимость работы.

Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. Путем специфического сайт-направленного мутагенеза получены мутаптные варианты цитохрома с лошади с единичными и двойными заменами лизииовых остатков в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с митохондриальными убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой, на глутаминовую кислоту и незаряженные остатки.

2. С помощью методов гешюй инженерии показано, что преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с - редуктазой дыхательной цепи вносят остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72, 86, 87, а в формирование комплекса с цитохром с - оксидазой - остатки Lys в положениях 13, 79, 86,87.

3. Получены мутантные варианты цитохрома с лошади, несущие разные комбинации замен К/Е (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) в окружении гемовой впадины и Е/К (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающие сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу Ш и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Показано, что мутантные варианты цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К.8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами, обладают сниженной

электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи по сравнению с АсС.

5. Разработана новая эффективная тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ сердца быка), основанная на восстановлении мутантньк вариантов цитохрома с лошади, обладающих сниженной по сравнению с АсС электрон-транспортной активностью по отношению к компонентам дыхательной цепи. Специфичность разработанной тест-системы к супероксиду в 2-4 раза превышает специфичность АсС (в реакциях обратного переноса электронов).

6. При сравнении скоростей генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренных с помощью разработанной тест-системы, и скоростей генерации перекиси водорода, измеренных с помощью Amplex Red, показано что только -50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

Разработанная в ходе данной работы тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади, может быть использована для измерения скорости генерации супероксида в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью, как инструмент для дальнейшего изучения окислительных процессов в митохондриях. Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работа докладывались и обсуждались па следующих российских и международных конференциях: XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); П студенческом симпозиуме по биоинженерии (Москва, 2007); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 200S); 12-й Путинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); 34л FEBS Congress (Prague, Czech Republic, 2009); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 8 таблиц, 6 схем и 23 рисунка. Список литературы содержит 187 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исследование роли кндипцдуальнмх лизнповых остатков цшохрома с лошади в формировании реакционноспособных комплексов с компонентами дыхатсльиой цепи

Для исследования роли индивидуальных Lys остатков цитохрома с в формировании реакционноспособных комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи на первом этапе работы получены мутантные варианты цитохрома с лошади, содержащие единичные и двойные замены ключевых для взаимодействия положительно заряженных остатков Lys 8, 13, 27, 72, 79, 86, 87 на отрицательно заряженные остатки Glu или нейтральные остатки.

Введение мутаций К8Е, ЮЗЕ, К27Е, Е69К/К72Е, К79Е, К86Е/К87Е, K86W/K87C в ген цитохрома с лошади в составе плазмидного вектора pBP(CYCS), осуществляли методом сайт-направленного мутагенеза с помощью QuikChange™ Mutagenesis Kit (Stratagene, США). Для введения в ген цитохрома с мутаций К8Е, К13Е, К27Е, Е69К/К72Е, К79Е, К.86Е/К87Е, K.86W/K87C были синтезированы комплементарные олигонуклеотидные праймеры, содержащие соответствующие мутации. После каждого этапа мутагенеза проводили секвенирование и переклонировапне мутантных генов цитохрома с в высокоэкспрессионную плазмиду pBP(CYCS).

Препаративную экспрессию полученных мутантных генов проводили в клетках E.coli штамма JM-109 в течение 22-24 ч. В использованной нами системе продукты экспрессии генов цитохрома с были локализованы в цитоплазме клеток-продуцентов. По окончании экспрессии клетки-продуценты отделяли от культуралыюй жидкости центрифугированием, ресуспендировали в буфере А для MonoS и гомогенизировали с помощью установки "French Press" (Spectronic Instruments, Inc., США). Из общей клеточной фракции растворимых белков выделяли рекомбипантный цитохром с согласно схеме, состоящей из двух этапов жидкостной хроматографии: на катионообменной колонке MonoS и адсорбционной колонке с гидроксиапатитом. Фракции, обогащенные цнгохромом с, имеющие соотношение AmzJAisa

равное 4.5-5.0 (соотношение для коммерческого препарата цитохрома с с чистотой >95% (Sigma, США)), объединяли, окисляли феррицианидом калия, трижды диализовали против аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизовали.

Способность мутантных вариантов цитохрома с взаимодействовать с убихияол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой изучали в системе митопластов печени крысы, лишенных эндогенного цитохрома с.

Сукцинат: цитохром с - редуктазную активность измеряли спектрофотометрически (при 550 нм) по восстановлению окисленного экзогенного цитохрома с. В этой реакции донором электронов служил сукцинат калия, передающий электроны в дыхательную цепь на сукцинатдегидрогеназу (комплекс II) и далее на убихинон, комплекс Ш и экзогенный цитохром с. Для того, чтобы исключить передачу электронов от цитохрома с на комплекс IV, последний ингабировали азидом натрия. Активность выражали в мкмоль восстановленного цитохрома с/мин на мг белка митопластов.

Цитохром с - оксидазную активность измеряли полярографическим методом. Реакцию инициировали добавлением в реакционную среду аскорбиновой кислоты, которая служила донором электронов для тетраметил-я-фенилендиамина, в свою очередь передающего электроны окисленному цитохрому с. Затем восстановленный цитохром с передавал электроны на комплекс IV, восстанавливающий кислород до воды. За активностью цитохром с - оксидазы наблюдали по убыли кислорода в реакционной смеси. Активность выражали в мкг-атом поглощенного кислорода/мин на мг белка митопластов.

Наименьшее изменение сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов наблюдалось в присутствии мутантного варианта ЮЗЕ: она составляла 84% от активности, измеренной в присутствии цитохрома с дикого типа. Влияние остальных мутаций на характеристики сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции оказалось более значительным: в присутствии варианта К79Е активность снизилась в 2 раза; в присутствии вариантов К8Е, К27Е - в 3 раза и в присутствии вариантов К86Е/К87Е, Е69К/К72Е, K86W/K87C - в 4, в 4.5 и в 6.5 раз, соответственно, по сравнению с активностью в присутствии цитохрома с дикого типа (рис. I, табл. 1).

Цитохром с - оксидазная активность, измеренная в присутствии мутантного варианта Е69К/К72Е, составляла 73% от активности, наблюдаемой в присутствии цитохрома с дикого типа, а в присутствии мутантного варианта К27Е - 61%. Более значительное снижение цитохром с - оксидазной активности в 2,2.5,4 и 6 раз наблюдалось в присутствии мутантных вариантов К8Е, К86Е/К87Е, К79Е, К13Е, соответственно. В случае мутантного варианта K86W/K87C активность цитохром с-оксидазы не отличалась от ее активности в присутствии цитохрома с дикого типа (рис. 2, табл. 1).

Рис. 1. Зависимость сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концешрацни добавленных цитохрома с сердца лошади (^Г) и его мутантных вариантов.

Таблица 1. Сравнение кинетических параметров сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с-оксидазной реакции в митопластах, лашеняых цитохрома с, в присутствии добавленных вариантов цитохрома с.

Параметры сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции

Вариант WT К8Е ЮЗЕ К27Е E69SC/K72E К79Е К86Е/К87Е K86W/K87C

цитохрома с

К„(мкМ) 17 1U 8 11,2 15,4 20,8 19,6 0,5

Ашщ (мкмоль цитохрома с /мин на мг белка) 0,086 0,028 0,072 0,026 0,019 0,039 0,023 0,013

Параметры цитохром с - оксидазной реакции

Вариант WT К8Е ЮЗЕ К27Е Е69К/К72Е К79Е К86Е/К87Н K86W/K87C

цитохрома с

КпДмкМ) 4,8 7,2 5,8 7 6 12,6 50 4,8

Аю„ (мы- атом кислорода /мин па мг белка) 0,92 0,5 0,15 0,56 0,67 0,25 0,36 0,92

Таким образом, скорости сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции митопластов в присутствии полученных нами мутантных вариантов цитохрома с лошади и, следовательно, их способность восстанавливаться дыхательной цепью уменьшались в ряду: \\Т > К13Е > К79Е > К8Е > К27Е > К86Е/К87Е > Е69К/К72Е > K86W/K87C. Аналогично, уменьшение скорости цитохром с-оксидазной реакции в присутствии мутантных вариантов и их

способность окисляться дыхательной цепью наблюдались в ряду WT = K.86W/K.87C > Е69К/К72Е > К27Е > К8Е > К86Е/К87Е > К79Е > К13Е.

1.0

WT

5 0,0

К79Е К13Е

О « 20 30 40 SO 60 70 80 90 100 Цитохром е^ (мкМ)

Рис. 2. Зависимость цитохром с - оксидазной активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концентрации добавленных цитохрома с сердца лошади (WT) и его мутантных вариантов.

Необходимо отметить, что введение одиночных и двойных замен положительно заряженных остатков на отрицательно заряженные приводило к снижению скоростей как сукцинат: цитохром с -редуктазной, так и цитохром с - оксидазной реакций, в то время как Кш для мутантных вариантов и для цитохрома с дикого типа имели близкие значения. Исключением являлось повышение на порядок Кт дм мутантного варианта К86Е/К87Е в цитохром с - оксидазной реакции.

Замена положительно заряженных остатков на нейтральные (K86W/K87C) приводила к снижению скорости только сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции, причем К„ в этом случае снизилась на порядок по сравнению с диким типом. Такое снижение Кш может свидетельствовать о том, что цитохром с с более гидрофобным в результате замен K86W/K87С сайтом взаимодействия способен образовывать больше продуктивных комплексов с убихияол: цитохром с - редуктазой, что может указывать на большую значимость для формирования такого комплекса именно гидрофобных взаимодействий. Замена положительно заряженного остатка на отрицательный в положении 13 приводила к снижению скорости только цитохром с - оксидазной реакции, что может свидетельствовать о том, что К13 преимущественно вовлечен в образование комплекса с цитохром с - оксидазой.

Полученные на первом этапе работы экспериментальные данные позволяют разделить остатки Lys цитохрома с из сайта взаимодействия с редокс-партнерами на две группы по значимости для формирования реакционноспособных комплексов. Консервативные остатки

Lys 86 и 87 важны для формирования обоих комплексов примерно в одинаковой степени и, по-видимому, являются "основой" универсального сайта взаимодействия цитохрома с с белковыми редокс-партнерами. Остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с - редуктазой, а остатки Lys в положениях 13, 79 - с цитохром с-оксидазой дыхательной цепи (рис. 3).

Рис. 3. Локализация на поверхности молекулы лошадиного цитохрома с остатков Lys (показаны положения е-аминогрупп соответствующих остатков Lys), преимущественно вовлеченных во взаимодействие с комплексом III (А) и с комплексом IV (Б) дыхательной | цепи. Молекула цитохрома с (pdb код 1HRC) показана со стороны гемовой впадины; изображение получено с помощью программы PyMOL.

2. Конструирование и получение вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации, направленные на сниженной электрон-транспортной активности по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи

Скорость образования супероксид-радикала оценивают по скорости восстановления окисленного цитохрома с, поэтому при условии измерения начальных скоростей реакций главным источником возможных артефактов следует считать «естественные» цитохром с -редуктазные, а не цитохром с - оксидазные активности. В наших экспериментах показано, что лизиновые остатки в положениях 8, 27, 72, 86, 87 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособных комплексов цитохрома с с комплексом III дыхательной цепи. В связи с этим с целью устранения электростатических взаимодействий между цитохромом с и белками-партнерами на следующем этапе работы был сконструирован ряд мутантаых генов цитохрома с с различными комбинациями замен положительно заряженных остатков Lys в положениях 8, 27, 72, 86, 87 (рис. 4, А) на отрицательно заряженные остатки Glu.

В ходе конструирования мутантных вариантов цитохрома с учитывали необходимость сохранения суммарного заряда молекулы, поскольку снижение суммарного положительного

заряда может снижать скорость реакции белка с отрицательно заряженным анионом супероксид-радикала. Кроме того, как показал опыт, при введении только двух замен К/Е (т.е. при уменьшении суммарного заряда с +12 до +8) возникают технические сложности при очистке рекомбинантных белков, вследствие более слабого связывания с катионообменным сорбентом. Для компенсации избыточных отрицательных зарядов в последовательности мутантных вариантов цитохрома с были введены замены Е/К в положениях 62, 69 и 90 (рис. 4, Б).

Рис. 4. Электростатическая поверхность потенциалов цитохрома с лошади. А - цитохром с дикого типа со стороны гемовой щели, Б - он же, при повороте на 180°, В -мутантный вариант цитохрома с К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К со стороны гемовой щели, Г - он же, при повороте на 180°. Боковые цепи положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков окрашены в синий и красный цвета, соответственно. Показаны положения е-аминогрупп остатков Lys и е-карбоксильных групп остатков Glu, которые заменяли путем сайт-направленного мутагенеза. Изображения получены с помощью программы PyMol.

Положения для введения заряд-компенсирующих мутаций были выбраны на противоположной гемовой впадине стороне молекулы цитохрома с, где преимущественно локализуются отрицательно заряженные остатки. При конструировании вариантов цитохрома с за основу был выбран вариант, содержащий мутации К86Е/К87Е, в присутствии которого наблюдалось существенное снижение как сукцинат: цитохром с - редуктазной, так

и шггохром с-оксидазной активности митопластов. В ген цитохрома с, содержащий мутации К86Е/К87Е, поэтапно вводили мутации, «ремясь получить конструкции с минимальным количеством мутаций. В результате нами были получены два варианта, содержащих по четыре аминокислотные замены (К27Е/К86Е/К87Е/Е90К, Е69К/К72Е/К86Е/К87Е), затем два варианта, содержащих по шесть аминокислотных замен (К27Е/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и один вариант, содержащий восемь аминокислотных замен (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К.86Е/К.87Е/Е90К) (рис. 4, В и Г).

Нетрудно заметить, что в результате введспия мутаций К/Е в положениях 8,27,72, 86, 87 и противоположных мутаций Е/К в положениях 62, 69, 90 произошли изменения электростатической поверхности цитохрома с лошади. Так, гемовая впадина в варианте цитохрома с с восемью заменами окружена преимущественно отрицательно заряженными остатками, тогда как положительные заряды «перемещены» на сторону молекулы, противоположную гемовой впадине. Предполагалось, что такое измените локализации зарядов приведет к полному или частичному «перемещению» сайта связывания цитохрома с с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи. В таком случае, мутантный шггохром с либо вовсе не будет способен к формированию реакционноснособных комплексов с белками-партнерами, либо будет находиться в невыгодной для транспорта электронов ориентации.

Таким образом, нами были сконструированы мутантные варианты лошадиного цитохрома с, содержащие четыре (К27Е/К86Е/К.87Е/Е90К, Е69К/К72Е/К86Е/К87Е), шесть (К27Е/Е69К/К72Ш86Ш87Е/Е90К, К8Е/Е62КУЕ69К/К72Е/К.86Е/К87Е) и восемь (К8Е/К27Е/Е62К/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е'Е90К) замен.

Введение мутаций К27Е/К86Е/К87Е/Е90К, Е69К/К72Е/К86Е/К87Е, К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62КУЕ69К/К.72Е/К86Е/К87Е,

К.8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К в ген цитохрома с лошади, экспрессию полученных мутантных генов цитохрома с, выделение и очистку мутантных белков проводили аналогично введению мутаций, экспрессии, выделению и очистке мутантных вариантов с единичными и двойными аминокислотными заменами.

3. Исследование вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации 3.1. Спектральные свойства

Для проверки спектральпых характеристик получепных мутантных вариантов цитохрома с К27Е/К86Е/К.87Е/Е90К, Е69К/К72Е/К.86Е/К87Е,

К27Е/Е69КЖ72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К.86Е/К87Е,

К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К снимали спектр поглощения в соответствующей среде. Окисление цитохрома с проводили феррицианидом калия, восстановление - дитионитом натрия.

Рис. 5. Спектр поглощения цитохрома с дикого типа (А) и мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К (Б).

I - окисленная, 2 - восстановленная формы цитохрома с.

Характер спектров свидетельствует о том, что введенные замены не привели к изменению спектра поглощения мутантного цитохрома с. Изменение молярного поглощения при восстановлении цитохрома с лошади дикого типа или мутантного цитохрома с с заменами К.8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К в максимуме при 550 нм составляет £550 = 20000 М"'см"' (рис. 5). Спектральные характеристики мутантных вариантов цитохрома с К27Е/К86Е/К87Е/Е90К, Е69К/К.72Е/К.86Е/К87Е, К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е были идентичны спектральным характеристикам цитохрома с лошади дикого типа и мутантного цитохрома с К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К. 3.2. Окислительно-восстановительный потенциал

Результаты получены совместно с В.В. Птушенко (лаборатория электрогенных фотопроцессов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского). Для измерения окислительно-восстановительного потенциала использовали платиновый и хлор-серебряный электроды, изменения поглощения регистрировали на спектрофотометре при непрерывном перемешивании и деаэрации раствора аргоном. Соотношение окисленной и восстановленной форм цитохрома с определяли по спектру поглощения. Окисление цитохрома с проводили феррицианидом калия, восстановление - аскорбиновой кислотой (рис. 6).

Измеренное значение окислительно-восстановительного потенциала для цитохрома с дикого типа составило +286 тУ, чего согласуется с литературными данными для растворимого цитохрома с (Шйоп а!., 1970).

150 200 250 300 350 400 450 500

{/(mV)

Рис. 6. Кривые титрования цитохрома с дикого типа (1) и мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К (2) аскорбиновой кислотой и феррицианидом калия.

Для мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е/Е90К измеренный окислительно-восстановительный потенциал имел значение +259 mV, что на 27 mV ниже значения для дикого типа. Таким образом, введете пяти отрицательно заряженных мутаций и трех положительно заряженных мутаций и изменение общего заряда белка с +12 до +8 привело к небольшому сдвигу окислительно-восстановительных свойств цитохрома с в восстановительную сторону.

3.3. Сукцинат: цитохром с - рсдуктазиая и цитохром с - оксндазная активность митопластов

В ходе экспериментов изучали и сопоставляли сукцинат: цитохром с - редуктазную (рис. 7, А) и цитохром с - оксидазную (рис. 7, Б) активность митопластов печени крысы, лишенных эндогенного цитохрома с, в присутствии цитохрома с сердца лошади, АсС, а также мутантных вариантов цитохрома с.

Двойная замена в молекуле цитохрома с К86Е/К87Е привела к 5-кратному снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и к 3-кратному снижению цитохром с-оксидазной активности митопластов. Введение третьей замены К27Е (в случае мутантного варианта К27Е/К86Е/К87Е/Е90К) или К72Е (в случае мутантного варианта Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е) привело к дальнейшему снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с-оксидазной активности митопластов, однако активности, измеренные в присутствии мутантных вариантов с четырьмя заменами, были выше активностей, измеренных в присутствии АсС. Введение четвертой замены К/Е (в случае мутантного варианта К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87ЕУЕ90К и К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) привело к тому, что сукцинат: цитохром с - редуктазная активность митопластов в присутствии мутантных

13

вариантов с шестью заменами была ниже, чем активности в присутствии АсС, а цитохром с -оксидазная активность в их присутствии вообще не была выявлена. Введение пятой замены К/Е (в случае мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е/Е90К) не привело к дальнейшему снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с-оксидазной активности (рис. 7). Мутантные варианты К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62КУЕ69К/К72Е/К86Е/К87Е, К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е/Е90К,

обнаружившие наибольшее снижение электрон-транспортной активности, по сравнению с АсС, были выбраны в качестве основы для создания тест-системы количественного определения генерации супероксида в СМЧ сердца быка.

4. Тестирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих наиболее сниженной электрон-транспортной активностью, в качестве детектора суиероксидного аниои-радикала в СМЧ сердца быка

«

Результаты получены совместно с В.Г. Гривенниковой (кафедра биохимии, МГУ им. М.В. Ломоносова). Основным местом генерации супероксида в митохондриях считают комплекс I дыхательной цепи (Brand et. al., 2004, Andreyev et. al., 2005, Hirst et al., 2008). Супероксид может образовываться как при окислении NADH (прямой перенос электронов), так и при обратном переносе электронов, который протекает при аэробном окислении сукцината, когда убихинон восстановлен, а на мембране митохондрий есть потенциал. Измерение генерации супероксида на внутренней митохондриалыюй мембране проводили в системе прочиосопряженных инвертированных субмитохоидрнальных частиц сердца быка (Lee, Ernster, 1967, Kotlyar, Vinogradov, 1990). Лишенные ферментов матрикса СМЧ являются оптимальной экспериментальной системой для изучения генерации супероксида митохондриальной дыхательной цепью. Образующийся супероксид в такой системе окислялся экзогенным цитохромом с, восстановление которого детектировали спектрофотометрически. По регистрируемой скорости восстановления цитохрома с оценивали скорость образования супероксидного анион-радикала. Необходимым условием измерения являлось использование супероксиддисмутазы (СОД), в присутствии которой подавляется восстановление цитохрома с супсроксидом, при этом восстановление от компонентов дыхательной цепи сохраняется.

В ходе разработки тест-системы на основе мутантпых вариантов цитохрома с измеряли общие сукцинат: цитохром с - редуктазные активности СМЧ в отсутствие и в присутствии СОД. СОД-чувствительные активности (скорости генерации супероксида) получали вычитанием СОД-нечувствительных активностей из общих активностей.

О 20 40 60

Цитохром сокисл (мкМ)

0 20 40 60 80 Цитохром свосст(мкМ)

Рис. 7. Зависимость сукцинат: цитохром с - редуктазной (А) цитохром с - оксидазной (Б) активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концентрации добавленных цитохромов с: цитохрома с сердца лошади (о), АсС (•), мутантного варианта К86Е/К87Е (•), К27Е/К86Е/К87Е/Е90К (а), Е69КУК72Е/К86Е/К87Е (а), К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К (а), К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е (а), К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е/Е90К (.)•

4.1. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ в реакции обратного переноса электронов

В реакции обратного переноса электронов субстратом окисления служит сукцинат калия. Сукцинат окисляется сукцинатдегидрогеназой (комплексом II), освобождающиеся при этом электроны передаются через убихинон на комплекс I (и идут на образование супероксида) и на комплекс III, эндогенный цитохром с и комплекс IV. Важным условием обратного переноса электронов от комплекса II на комплекс I является наличие трансмембранной разности электрохимических потенциалов, возникающей только на замкнутых мембранах, не проницаемых для ионов водорода. При добавлении экзогенного цитохрома с, он взаимодействует только с супероксидом и, вследствие этого, восстанавливается.

В препарате СМЧ всегда присутствуют незамкнутые фрагменты мембран. В таких фрагментах не возможен обратный перенос электронов, однако перенос электронов в цепи сукцинат —► комплекс ГГ —> комплекс III —> цитохром с —> комплекс IV сохраняется. С такими фрагментами может взаимодействовать экзогенный цитохром с, при этом происходит его восстановление от компонентов дыхательной цепи (комплекса III или эндогенного цитохрома с). Именно эта реакция мешает точному количественному определению генерации супероксида.

На рис. 8 приведены зависимости наблюдаемых скоростей сукцинат: цитохром с-редуктазной реакции от концентрации АсС и мутантных вариантов, содержащих шесть и

АсС (мкМ) АсС (нкМ)

К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К (мкМ) К27Е/Е69К/К72ЕЖ86Е/К87Е;Е90К (мкМ)

К8Е/Е62КУЕ69К/К72Е/К86Е/К87Е (мкМ) К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е (мкМ)

К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К8БЕ/К87Е/Е90К (мкМ) К8ЕУК27ЕУЕ62К/Е69ЮК72Е/К86Е/К87ВЕ90К (нкМ)

Рис. 8. Зависимость скорости восстановления АсС и мутантных вариантов цитохрома с от их

концентрации.

А, В, Д, Ж - Общая сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ при окислении сукцината катия в отсутствие (1 и 3) и в присутствии фосфата калия (2 и 4). СОД-нечувствительные составляющие этих реакций - 3 и 4, соответственно. Б, Г, Е, 3 - СОД-чувствительная сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ (скорость генерации супероксида) в отсутствие (1) и в присутствии фосфата калия (2).

восемь замен. Реакция восстановления цитохрома с анионом супероксвд-радикала -бимолекулярная реакция, скорость которой в одинаковой мере зависит от концентрации обоих реагентов. В связи с этим, регистрируемая скорость восстановления цитохрома с количественно соответствует скорости генерации супероксида только при его «насыщающих» концентрациях. Нетрудно заметить (рис. 8, Б, Г, Е, 3), что для АсС и мутантных вариантов насыщающей является концентрация 20 мкМ.

На рис. 9 показана регистрация образования супероксида в СМЧ сердца быка при сопряженном окислении сукцината калия с помощью 20 мкМ АсС. Суммарная скорость образования продукта (супсроксидного анион-радикала) при этом определяется, главным образом, комплексом I за счет энергозависимой, ротенон-чувствительной убихияол: кислород оксидоредуктазной реакции (обратный перенос электронов) (Lcc, Ernster, 1967, Виноградов, Гривенникова, 2005) и, в существенно меньшей степени, комплексом III (Ksenzenko et. al., 1983, Sun, Trempower, 2003, Chen et al., 2003).

Рис. 9. Регистрация образования супероксид-радикала в СМЧ сердца быка при окислении сукцината калия с помощью 20 мкМ АсС в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 100 мМ фосфата калия; с помощью 20 мкМ мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К в отсутствие (В) и в присутствии (Г) 100мМ фосфата калия.

В отсутствие фосфата калия около 80% наблюдаемой скорости восстановления 20 мкМ АсС не обусловлено генерацией супероксида, т.е реакция подавляется СОД на 20%, При высокой ионной силе реакция подавляется СОД на 40%. Следует отметить, что дифференцировать нечувствительную к СОД составляющую реакции на комплекс III-зависимое восстановление цитохрома с и его прямое взаимодействие с каким-либо компонентом комплекса I в качестве искусственного акцептора электронов не представляется возможным (табл. 2).

Присутствие фосфата калия в среде измерения снижает регистрируемую скорость генерации супероксида практически в 2 раза. СОД-чувствигельная активность (скорость генерации супероксида) в среде без фосфата в присутствии 20 мкМ мутантного варианта

цитохрома с К27Е/Е69КЖ72Е/К86Е/К87Е/Е90К составляет 65% от общей регистрируемой сукцииат: цитохром с - редуктазной активности СМЧ, в среде с фосфатом - 80%. СОД-чувствительная активность (скорость генерации супероксида) в присутствии 20 мкМ мутантного варианта цитохрома с К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е в среде без фосфата составляет 70% от общей регистрируемой сукципат: цитохром с - редуктазной активности СМЧ, в среде с фосфатом - 85% (табл. 2).

Таблица 2. Измерение генерации супероксид-радикала и перекиси водорода в СМЧ сердца быка. В скобках указан вклад СОД-чувствительной составляющей (генерации супероксида) в общую сукцинат: цитохром с - редуктазную активность.

Цитохром с, 20 мкМ Генерация супероксида (нмоль/мин на мг белка СМЧ)

5 мМ сукцинат (обратный перенос электронов) 50 мкМ ЫАОН, 5 мкМ ротенон (прямой перенос электронов)

-К-Р1 + 100 мМ К-Р1 -К-Р1 + 100 мМ К-Р1

АсС 1,5 (20%) 0,9 (40%) 2,0 (55%) 1,8 (65%)

К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К 1,4(65%) 0,8 (80%) 2,0 (45%) 1,9 (70%)

К8Е/Е62К/Е69КУК72Е/К86Е/К87Е 1,4(70%) 0,8 (85%) 2,3 (40%) 2,0(55%)

К8Е/К27Е/Е62К/Е69КУК72Е/К86Е/К87Е/Е90К 1,4(85%) 0,9 (90%) 2,0 (50%) 1,8(75%)

Генерация перекиси водорода (нмоль/мин на мг белка СМЧ)

Атр1ех Яес1,1 ОмкМ - 1,1 - 1,8

В отсутствие фосфата около 15% наблюдаемой скорости восстановления мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е901С не обусловлено генерацией супероксида, тогда как при высокой ионной силе реакция почти полностью подавляется СОД. СОД-чувствительпая активность (скорость генерации супероксида) в присутствии 20 мкМ мутантного варианта цитохрома с К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е/Е90К в среде без фосфата составляет 85% от общей регистрируемой сукцинат: цитохром с -редуктазной активпости СМЧ, в среде с фосфатом - 90% (табл. 2).

4.2. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ в реакции прямого переноса электронов

Комплекс I способен генерировать супероксид в реакции прямого переноса электронов только в присутствии ингибитора ротенона. В реакции прямого переноса электронов субстратом окисления служит КЛОН. Генерация супероксида комплексом I,

чувствительная к СОД, происходит как в замкнутых СМЧ, так и в незамкнутах фрагментах. Перенос электронов в дыхательной цепи блокирован ротеноном, однако экзогенный цитохром с может принимать электроны не только от супероксида, но и непосредственно от комплекса I и/или ЫАОН (Виноградов, Гривенникова, 2005).

Скорости генерации супероксида с КАОН в качестве субстрата окисления при его низких концентрациях (50 мкМ) существенно (примерно в полтора раза) выше, чем при окислении сукцината (табл. 2). Эта разница, скорее всего, обусловлена разной степенью восстановленности ГШ! при прямом (НА ОН в присутствии ротенона) и обратном (энергозависимое восстановление убихинолом) переносе электронов. Существенно меньшее влияние фосфата калия на ЫАОН-зависимую реакцию по сравнению с сукцинат-зависимой реакцией согласуется с предположением о разобщающем действии фосфатов калия. Для генерации супероксида в реакции обратного переноса электронов необходимо наличие разности потенциалов на мембране, поэтому присутствие фосфатов приводит к снижению скоростей генерации супероксида.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что мутантные варианты цитохрома с лошади, содержащие шесть аминокислотных замен (К27Е/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К.86Е/К87Е) являются более специфичными детекторами супероксида, генерируемого комплексом I в реакции обратного переноса электронов, по сравнению с АсС, поскольку СОД-чувствительная сукцинат: цитохром с-редуктазная активность СМЧ в присутствии этих мутантных вариантов составляет от 65% в среде без фосфата до 85% в среде с фосфатом, в то время как в присутствии АсС: только 20% в среде без фосфата и 40% в среде с фосфатом. Наиболее специфичным детектором супероксида является мутантный вариант цитохрома с, содержащий восемь замен (К8Е/Ю7Е/Е62К/Е69КЛС72Е/К86Е/К87Е/Е90К): СОД-чувствительная сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ в присутствии этого мутантного варианта составляет 85% в среде без фосфата и 90% в среде с фосфатом. При использовании как мутантных вариантов цитохрома с, так и АсС специфичность к супероксиду при измерении скорости генерации супероксида в реакции прямого переноса электронов примерно одинакова: СОД-чувствительные активности лежат в пределах 55-75%. По-видимому, это связано с тем, что в реакции прямого переноса электронов имеется большее число доноров электронов для экзогенного цитохрома с: КАОН, редокс компоненты комплекса I как в замкнутых СМЧ, так и во фрагментах СМЧ.

Таким образом, нами разработана тест-система количественного определения генерации супероксида в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ), основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади

(К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К.86Е/К87Е,

К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К). Специфичность разработанной тест-системы к супероксиду (при измерении скорости генерации супероксида в реакции обратного переноса электронов) в среде с фосфатом в 2 раза, а в среде без фосфата в 4 раза превышает специфичность АсС.

5. Измерение скорости образования перекиси водорода в СМЧ сердца быка

Результаты получены совместно с В.Г. Гривенниковой (кафедра биохимии, МГУ им. М.В. Ломоносова). Поскольку супероксидный анион-радикал является короткоживущей молекулой и быстро дисмутирует в перекись, одной из задач работы было сравнение скоростей образования супероксида и перекиси водорода комплексом I дыхательной цепи митохондрий.

Скорость образования перекиси водорода определяли по окислению Amplex Red с образованием резоруфина. Реакцию начинали добавлением сукцината калия (обратный перенос электронов) или NADH (прямой перепое электронов). Супероксид, генерируемый комплексом I, превращался в перекись с помощью СОД. В присутствии пероксидазы перекись затем окисляла молекулу Amplex Red до резоруфина. Реакция полностью подавлялась в присутствии каталазы.

Видно, что существует количественное несоответствие данных о генерации супероксид-радикала и перекиси водорода (табл. 2). Если образование измеряемой с Amplex Red перекиси водорода вторично и происходит только в результате супероксиддисмутазной реакции, следует ожидать совпадения величин, измеренных как по восстановлению цитохрома, так и по образованию резоруфина. Другими словами, из двух молей супероксида под действием СОД образуется один моль перекиси.

2О2" + 2ft —► 02 + Н202 (реакция, катализируемая СОД)

Результаты, приведенные в табл. 2 показывают, что как в реакции прямого (запускаемого NADH), так и в реакции обратного переноса электронов (запускаемого сукцинатом калия) перекиси образуется в 2 раза больше, чем в супероксиддисмугазпой реакции. Простое объяснение, согласно которому при использовании цитохрома с в качестве индикатора часть супероксида спонтанно дисмутирует (цитохром с не полностью измеряет генерацию супероксида) противоречит результатам, приведенным на рис. 8: увеличение концентрации цитохрома с не увеличивает скорости его восстановления.

Существует, по крайней мере, два возможных объяснения количественного несоответствия. Если генерация супероксида (окисление FMNH- кислородом) происходит в полости, недоступной для растворителя и, следовательно, для его свободной диффузии,

спонтанная днсмутация в этой полости приведет к одновременному появлению и перекиси водорода и супероксид-радикала, который реагирует с цитохромом с. Другая возможность состоит в том, что первичный аддукт FMNH -кислород распадается двумя путями, образуя и перекись водорода, и супероксид-радикал (Massey et al., 1973). Не исключено также, что комплекс I имеет два центра, прямо реагирующих с кислородом. В недавней работе других авторов было показано, что соотношение скорости образования перекиси и супероксида изолированным комплексом I сердца быка и Е. coli существенно различаются (Esteihazy et.al., 2008). С другой стороны, наши данные (табл. 2), полученные для «нативного» связанного с мембраной комплекса I, существенно отличаются от тех, что были измерены для изолированного комплекса I из того же объекта (Esteihazy étal., 2008). Не исключено, что соотношение скоростей генерации Н2О2 и О2 ~ комплексом I является параметром, чувствительным даже к незначительным изменениям структуры белка, происходящим при его солюбилизации.

Таким образом, сравнение скоростей генерации перекиси водорода и супероксид-радикала свидетельствует о том, что в комплексе I дыхательной цепи только ~50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

ВЫВОДЫ

1. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади, содержащих единичные и двойные замены положительно заряженных остатков лизана в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. Показано, что консервативные остатки Lys 86 и 87 примерно в одинаковой степени важны для формирования комплексов цитохрома с с убихинол: цитохром с - редукгазой и цитохром с - оксидазой дыхательной цепи. Остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с комплексом 1П, а остатки Lys в положениях 13,79 - с комплексом IV дыхательной цепи.

3. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади, несущих разные комбинации замен К/Е (в положениях 8,27,72,86,87) в окружении гемовой впадины и Е/К (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающих сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Показано, что мутантные варианты цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами обладают сниженной по

сравнению с АсС электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

5. Впервые разработана тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, основанная на восстановлении мугантпых вариантов цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К.87Е/Е90К, К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) и восемью

(К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами. Показано, что:

а) специфичность разработанной тест-системы к супероксиду в 2-4 раза превышает специфичность АсС (в реакциях обратного переноса электронов).

б) при сравнении скоростей генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренных с помощью разработанной тсст-системы, и скоростей геиерации перекиси водорода, измеренных с помощью Amplex Red, только ~50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Пепелила Т.Ю.. Черткова Р.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Роль индивидуальных лизиновых остатков цитохрома с лошади в формировании реакциоиноспособных комплексов с компонентами дыхательной цепи. Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. № 1. С. 98-104.

2. Пепелина Т.Ю.. Черткова Р.В., Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гривенником В.Г., Виноградов АД. Направленный мутагенез цитохрома с: реакции с компонентами дыхательной цепи и супероксид-радикалом. Биохимия. 2009. Т. 74. № 6. С. 768-778.

3. Черткова Р.В., Пепелина Т.Ю.. Долгих Д.А., Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г., Кирпичников М.П: Способ определения скорости генерации супероксида. Заявка на патент РФ. Регистрационный номер 2008128523, 15.07.2008. Решение о выдаче патента на изобретение от 10.08.2009.

4. Черткова Р.В., Пепелина Т.Ю.. Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г., Кирпичников М.П. Способ получения рекомбинантного мутантного цитохрома с. Заявка на патент РФ. Регистрационный номер 2008128521, 15.07.2008. Решение о выдаче патента на изобретение от 08.12.2009.

5. Пепелина Т.Ю.. Черткова Р.В., Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Разработка тест-системы количественного определения супероксида в митохондриальцых препаратах на основе мутантных вариантов цитохрома с. Тезисы докладов международной научной конференции по биооргаиической химии, биотехнологии и бионаиотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009. Том 2. Конкурс молодых ученых, с. 183-186.

6. Chertkova R., Pepelina Т.. Ostrovcrkhova Т., Grivennikova V., Vinogradov A., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Protein engineering of the horse cytochrome c: mutant proteins as an effective detector for quantitative measurement of superoxide radical generation. 34th FEBS Congress. Prague, Czech Republic, July 4-9,2009. In FEBS J. 2009. Vol. 276. Supl.l. p. 143.

7. Пепелина Т.Ю.. Черткова Р.В., Долгих Д.А., Кирпичников МЛ. Исследование роли отдельных аминокислотных остатков цитохрома с лошади во взаимодействии с белками-партнерами дыхательной цепи. Тезисы докладов XXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 9-11 февраля 2009, с. 40.

8. Пепелина Т.Ю.. Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих Д А., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Количественное определение генерации супероксида, основанное на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади. Тезисы докладов 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 10-14 ноября 2008 года, с. 100.

9. Пепелина Т.Ю.. Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Использование мутантных вариантов цитохрома с лошади для количественного измерения генерации супероксида субмитохондриальными частицами сердца быка. Тезисы докладов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008, с. 326.

10. Островерхова Т.В., Пепелина Т.Ю.. Черткова Р.В. Получение вариантов цитохрома с с мутациями, направленными на уменьшение сродства к комплексам III и IV дыхательной цепи. Тезисы докладов II студенческого симпозиума по биоинженерии. Москва, 21 октября 2007, с. 17-18.

11. Островерхова Т.В., Пепелина Т.Ю.. Черткова Р.В. Изучение взаимодействия мутантных вариантов цитохрома с с окислительно-восстановительными партнёрами. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 11-14 апреля 2007, с. 9-10.

12. Пепелина Т.Ю.. Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих ДА., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Взаимодействие мутантных форм цитохрома с лошади с окислительно-восстановительными партнёрами дыхательной цепи. Тезисы докладов XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-9 февраля 2007, с.32.

Подписано в печать: 05.04.2010

Заказ № 3515 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 . (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пепелина, Татьяна Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Цитохром с как переносчик электронов и антиоксидант.

1.1. Дыхательная цепь митохондрий.

1.1.1. Организация дыхательной цепи митохондрий.

1.1.2. Мультисубъединичные дыхательные комплексы.

1.1.2.1. Комплекс I (ЫАОН: убихинон - оксидоредуктаза).

1.1.2.2. Комплекс III (убихинол: цитохром с - оксидоредуктаза).

1.1.2.3. Комплекс IV (цитохром с - оксидаза).

1.2. Цитохром

1.2.1. Структура и функции цитохрома

1.2.1.1. Структура цитохрома

1.2.1.2. Функции цитохрома

1.2.2. Взаимодействие цитохрома с с белками-партнерами.

1.2.2.1. Взаимодействие цитохрома с с убихинол: цитохром с-оксидоредуктазой.

1.2.2.2. Взаимодействие цитохрома с с цитохром с - оксидазой.

1.2.2.3. Взаимодействие цитохрома с с цитохромом 65.

1.2.2.4. Взаимодействие цитохрома с с фактором Ара1>1.

1.2.2.5. Взаимодействие цитохрома с с цитохром с - пероксидазой.

1.3. Супероксидный анион-радикал.

1.3.1. Образование супероксидного анион-радикала.

1.3.2. Методы регистрации супероксидного анион-радикала.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и наборы реактивов.

2.1.2. Ферментные препараты.

2.1.3. Штаммы Escherichia coli.

2.1.4. Плазмидный вектор.

2.1.5. Олигонуклеотидные праймеры.

2.1.6. Буферные растворы.

2.1.7. Питательные среды.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Трансформация клеток Escherichia coli.

2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.2.1.2. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

2.2.1.3. Наработка клеточной биомассы для выделения плазмидной ДНК.

2.2.1.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.2. Сайт-направленный мутагенез.

2.2.3. Субклонирование мутантных генов.

2.2.4. Рестрикционный анализ.

2.2.5. Секвенирование ДНК.

2.2.6. Биосинтез и выделение белка.

2.2.6.1. Экспрессия генов рекомбинантных белков.

2.2.6.2. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.2.6.3. Окисление и восстановление мутантных вариантов цитохрома

2.2.7. Функциональные исследования.

2.2.7.1. Измерение окислительно-восстановительного потенциала.

2.2.7.2. Выделение митохондрий печени крысы.

2.2.13. Получение препарата митопластов, лишенных цитохрома с, из митохондрий печени крысы.

2.2.7.4. Получение препарата митохондрий из сердца быка.

2.2.7.5. Получение препарата СМЧ из митохондрий сердца быка.

2.2.7.6. Сопряжение и активация СМЧ.

2.2.7.7. Определение сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов спектрофотометрическим методом.

2.2.1 Я. Определение цитохром с - оксидазной активности митопластов полярографическим методом.

2.2.7.9. Расчет кинетических параметров реакций.

2.2.7.10. Измерение генерации супероксида в СМЧ сердца быка в реакции прямого и обратного переноса электронов.

2.2.7.11. Измерение скорости образования перекиси водорода в СМЧ сердца быка в реакции прямого и обратного переноса электронов.

2.2.8. Аналитические методы.

2.2.8.1. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

2.2.8.2. Количественное определение препаратов ДНК.

2.2.8.3. Электрофоретический анализ белков в БОБ-НАЛГ.

2.2.8.4. Количественный анализ белковых препаратов.

2.2.8.5. Определение концентрации белка биуретовым реактивом.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование роли индивидуальных лизиновых остатков цитохрома с лошади в формировании реакционноспособных комплексов с компонентами дыхательной цепи.

3.1.1. Получение мутантных вариантов цитохрома с, содержащих единичные и двойные замены.

3.1.2. Исследование мутантных вариантов цитохрома с, содержащих единичные и двойные замены.

3.1.2.1. Сукцинат: цитохром с - редуктазная активность митопластов.

3.1.2.2. Цитохром с - оксидазная активность митопластов.

3.2. Конструирование, получение и исследование вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации, направленные на снижение электрон-транспортной активности по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

3.2.1. Получение вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации.

3.2.2. Исследование вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации.

3.2.2.1. Спектральные свойства.

3.2.2.2. Окислительно-восстановительный потенциал.

3.2.2.3. Сукцинат: цитохром с - редуктазная и цитохром с - оксидазная активность митопластов.

3.3. Тестирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих наиболее сниженной электрон-транспортной активностью, в качестве детектора супероксидного анион-радикала в СМЧ сердца быка.

3.3.1. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ с помощью ацетилированного цитохрома с в реакции обратного переноса электронов.

3.3.2. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ с помощью мутантного варианта цитохрома с К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К или К8Е/Е62КУЕ69КУК72Е/К86Е/К87Е в реакции обратного переноса электронов.

3.3.3. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ с помощью мутантного варианта цитохрома с К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К в реакции обратного переноса электоронов.

3.3.4. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ в реакции прямого переноса электронов.

3.3.5. Измерение скорости образования перекиси водорода в СМЧ в реакции прямого и обратного переноса электронов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тест-система на основе мутантных форм цитохрома c для количественного определения супероксидного анион-радикала"

Актуальность темы. Цитохром с млекопитающих - низкомолекулярный гем-содержащий белок, обладающий целым рядом биологических активностей. Основной функцией цитохрома с является перенос электрона от убихинол: цитохром с - редуктазы (комплекс III) на цитохром с - оксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи митохондрий. В условиях высокой ионной силы цитохром с служит переносчиком электронов от цитохрома Ъ5 наружной мембраны к комплексу IV внутренней мембраны митохондрий [1]. При этом происходит перенос электронов по дыхательной цепи в обход ее начальных участков (участков генерации активных форм кислорода (АФК)). Значительная часть цитохрома с находится в митохондриях в довольно прочной связи с кардиолипином, входящим в состав внутренней митохондриальной мембраны и осуществляет пероксидазную функцию, которая может играть важную роль в инициировании выхода цитохрома с из митохондрий [2, 3]. После выхода в цитозоль цитохром с взаимодействует с фактором Apaf-1, что является ключевым этапом для образования апоптосом и запуска цитохром с - зависимого апоптоза [4, 5]. И, наконец, цитохром с обладает специфической антиоксидантной активностью, заключающейся в эффективном ингибировании продукции супероксидных радикалов (Ог' ) [6, 7].

Супероксидные радикалы - нормальные метаболиты всех живых организмов, утилизирующих кислород в процессах обмена, но в избыточных концентрациях они токсичны, в первую очередь, как источник гидроксильных радикалов (ОН'). Гидроксильные радикалы обладают очень высокой реакционной способностью, вызывают окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других компонентов клетки. Общепринято, что продукция супероксида является неотъемлемым свойством дыхательной цепи митохондрий эукариотических клеток. Образование активных форм кислорода, таких как супероксид, в митохондриях является главной причиной окислительного стресса, ведущего к различным патологическим состояниям: нейродегенеративным заболеваниям, атеросклерозу и старению [8].

Цитохром с широко используется для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала. Однако, восстановление цитохрома с неспецифично для супероксида. Аскорбиновая кислота, глутатион и клеточные редуктазы могут восстанавливать цитохром с, который может быть реокислен цитохром с - оксидазой и пероксидазой. Эти неспецифичные реакции восстановления и окисления цитохрома с искажают истинные значения скоростей образования супероксида.

Чтобы увеличить специфичность измерения супероксида, цитохром с частично ацетилируют (~60% лизиновых остатков ацетилировано) [9]. Ацетилирование лизиновых остатков цитохрома с снижает скорости его восстановления митохондриальной и микросомальной редуктазами и скорости его окисления цитохром с - оксидазой, при этом способность цитохрома с к восстановлению супероксидом сохраняется. При ацетилировании цитохрома с уксусным ангидридом образуется достаточно гетерогенная смесь молекул цитохрома с с различным числом модифицированных лизиновых остатков. Реакционная способность цитохрома с по отношению к природному восстановителю и окислителю (убихинол: цитохром с - редуктазе и цитохром с - оксидазе) зависит от степени ацетилирования. При ацетилировании снижается общий положительный заряд цитохрома с, что ведет к снижению сродства к супероксиду. Неспецифическое взаимодействие частично ацетилированного цитохрома с (АсС) с компонентами дыхательной цепи уменьшают добавлением фосфата калия в сравнительно высоких концентрациях (до 100 мМ). С другой стороны, высокие концентрации фосфата калия вызывают частичное разобщение дыхательной цепи, что искажает картину генерации супероксида.

Все вышесказанное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования рекомбинантных мутантных цитохромов с, несущих замены, направленные на снижение реакционной способности по отношению к компонентам дыхательной цепи, и разработки на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, представляющей прикладной биохимический интерес.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось: конструирование, получение и исследование ряда вариантов цитохрома с, содержащих замены лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, направленные на снижение электрон-транспортной активности цитохрома с по отношению к белкам-партнерам дыхательной цепи, с последующей разработкой на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью.

Основные задачи исследования.

1. Путем введения одиночных и двойных замен в ген цитохрома с лошади исследовать роль индивидуальных лизиновых остатков в формировании реакционноспособных комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. На основе полученных данных о роли индивидуальных лизиновых остатков осуществить конструирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

3. Получить в препаративных количествах мутантные варианты цитохрома с, обладающие сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Провести детальное исследование мутантных вариантов цитохрома с лошади.

5. На основе отобранных на предыдущих этапах работы мутантных вариантов цитохрома с, обладающих наиболее сниженной электрон-транспортной активностью, разработать тест-систему для количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальном препарате (прочносопряженных инвертированных субмитохондриальных частицах (СМЧ) сердца быка). Сравнить скорости генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренные с помощью полученных мутантных вариантов цитохрома с, и скорости генерации перекиси водорода, измеренные с помощью Amplex Red.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. Путем специфического сайт-направленного мутагенеза получены мутантные варианты цитохрома с лошади с единичными и двойными заменами лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с митохондриальными убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с -оксидазой, на глутаминовую кислоту и незаряженные остатки.

2. С помощью методов генной инженерии показано, что преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с -редуктазой дыхательной цепи вносят остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72, 86, 87, а в формирование комплекса с цитохром с - оксидазой - остатки Lys в положениях 13, 79, 86, 87.

3. Получены мутантные варианты цитохрома с лошади, несущие разные комбинации замен К/Е (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) в окружении гемовой впадины и Е/К (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающие сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Показано, что мутантные варианты цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69КУК72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами, обладают сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи по сравнению с АсС.

5. Разработана новая эффективная тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ сердца быка), основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади, обладающих сниженной по сравнению с АсС электрон-транспортной активностью по отношению к компонентам дыхательной цепи. Специфичность разработанной тест-системы к супероксиду в 2-4 раза превышает специфичность АсС (в реакциях обратного переноса электронов).

6. При сравнении скоростей генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренных с помощью разработанной тест-системы, и скоростей генерации перекиси водорода, измеренных с помощью Amplex Red, показано что только -50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида. Разработанная в ходе данной работы тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади, может быть использована для измерения скорости генерации супероксида в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью, как инструмент для дальнейшего изучения окислительных процессов в митохондриях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохром с как переносчик электронов и антиоксидант

В настоящее время вопросы окислительного стресса, апоптоза и старения являются, пожалуй, одними из наиболее актуальных. Постоянно открываются и исследуются новые антиоксиданты и прооксиданты. Однако, существует известный уже с 1920х годов низкомолекулярный белок - цитохром с - который обладает очень важными для жизни клетки свойствами, в том числе и антиоксидантыми, которые можно использовать для профилактики и лечения различных заболеваний, а также для количественной детекции супероксидного анион-радикала. Настоящий обзор посвящен роли цитохрома с в функционировании дыхательной цепи митохондрий и окислительных процессах. Рассмотрены структурно-функциональные особенности дыхательных комплексов митохондрий, а также особенности взаимодействия цитохрома с с белками-партнерами: комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи, цитохромом Ь5 наружной митохондриальной мембраны и мембраны ЭПР, цитохром с - пероксидазой дрожжей и апаптотическим фактором Apaf-1, находящимся в цитозоле. Также рассмотрены методы определения супероксида в биологических системах, основанные на использовании редокс-реагентов (в том числе цитохрома с и АсС), быстро взаимодействующих с супероксид-радикалом и превращающихся в продукты, детектируемые спектрофотометрически или с помощью ЭПР-спектроскопии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пепелина, Татьяна Юрьевна

выводы

1. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади, содержащих единичные и двойные замены положительно заряженных остатков лизина в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. Показано, что консервативные остатки Lys 86 и 87 примерно в одинаковой степени важны для формирования комплексов цитохрома с с убихинол: цитохром с -редуктазой и цитохром с - оксидазой дыхательной цепи. Остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с комплексом III, а остатки Lys в положениях 13, 79 - с комплексом IV дыхательной цепи.

3. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади, несущих разные комбинации замен КУЕ (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) в окружении гемовой впадины и Е/К (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающих сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Показано, что мутантные варианты цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69КУК72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами обладают сниженной по сравнению с АсС электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

5. Впервые разработана тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами. Показано, что: а) специфичность разработанной тест-системы к супероксиду в 2-4 раза превышает специфичность АсС (в реакциях обратного переноса электронов). б) при сравнении скоростей генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренных с помощью разработанной тест-системы, и скоростей генерации перекиси водорода, измеренных с помощью Amplex Red, только -50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе получены мутантные варианты цитохрома с лошади, несущие единичные, двойные и множественные замены положительно заряженных остатков лизина в окружении гемовой впадины, обеспечивающих его взаимодействие с митохондриальными убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой. Преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с - редуктазой дыхательной цепи вносят остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72, 86, 87, а в формирование комплекса с цитохром с - оксидазой - остатки Lys в положениях 13, 79, 86, 87. Разработанная в результате диссертационной работы тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала на основе мутантных вариантов цитохрома с, обладающих сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи, дает возможность измерять скорость генерации супероксида в мембранных препаратах (в частности, СМЧ). Специфичность тест-системы к супероксиду до четырех раз превышает специфичность АсС. Тест-система может быть использована в фундаментальной биохимии для измерения скорости генерации супероксида в мембранных препаратах митохондрий и микросом, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью, а также в медицинской биохимии для исследования роли супероксида в патогенезе нейродегенеративных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пепелина, Татьяна Юрьевна, Москва

1. Bernardi P., Azzone G.F. (1981) Cytochrome с as an electron shuttle between the outer and inner mitochondrial membranes // J. Biol.Chem. Vol. 256, pp. 7187-7192.

2. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. (1999) An APAF-1 cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9 // J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 1154911556.

3. Hu Y., Benedict M.A., Ding L., Nünez G. (1999) Role of cytochrome с and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-1 -mediated caspase-9 activation and apoptosis // EMBO J. Vol. 18, pp. 3586-3595.

4. Skulachev V.P. (1998) Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Lett. Vol. 423, pp. 275-280.

5. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria // FEBS Lett. Vol. 416, pp. 15-18.

6. Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. (2005) Mitochondria, oxidants, and aging // Cell. Vol. 120, pp. 483-495.

7. Azzi A., Montecucco C., Richter C. (1975) The use of acetylated ferricytochrome c for the detection of superoxide radicals produced in biological membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 22, pp. 597-603.

8. Saraste M. (1999) Oxidative phosphorylation at the fin de siècle // Science. Vol. 283, pp. 1488-1493.

9. Schultz B.E., Chan S.I. (2001) Structures and proton-pumping strategies of mitochondrial respiratory enzymes // Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. Vol. 30, pp. 23-65.

10. Grigorieff N. (1998) Three-dimensional structure of bovine NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) at 22 Â in ice // J. Mol. Biol. Vol. 277, pp. 1033-1046.

11. Walker J.E. (1992) The NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains // Q. Rev. Biophys. Vol. 25, pp. 253-324.

12. Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., Shannon R.J., Hirst J., Walker J.E. (2006) Bovine complex I is a complex of 45 different subunits // J. Biol. Chem. Vol. 281, pp. 32724-32727.

13. Galante Y.M., Hatefi Y. (1978) Resolution of complex I and isolation of NADH dehydrogenase and an iron-sulfur protein // Meth. Enzymol. Vol. 53, pp. 15-21.

14. Fearnley I.M, Runswick M.J, Walker J.E. (1989) A homologue of the nuclear coded 49 kd subunit of bovine mitochondrial NADH-ubiquinone reductase is coded in chloroplast DNA // EMBO J. Vol. 8, pp. 665-672.

15. Sazanov L.A., Peak-Chew S.Y., Fearnley I.M., Walker J.E. (2000) Resolution of the membrane domain of bovine complex I into subcomplexes: implications for the structural organization of the enzyme // Biochemistry. Vol 39, pp. 7229-7235.

16. Carroll J., Fearnley I.M., Shannon R.J., Hirst J., Walker J.E. (2003) Analysis of the subunit composition of complex I from bovine heart mitochondria // Mol. Cell. Proteomics. Vol. 2, pp. 117-126.

17. Brandt U. (1997) Proton-translocation by membrane-bound NADH:ubiquinone-oxidoreductase (complex I) through redox-gated ligand conduction // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1318, pp. 79-91.

18. Dutton P.L., Moser C.C., Sled V.D., Daldal F., Ohnishi T. (1998) A reductant-induced oxidation mechanism for complex I // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1364, pp. 245-257.

19. Belogrudov G., Hatefi Y. (1994) Catalytic sector of complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase): subunit stoichiometry and substrate-induced conformation changes // Biochemistry. Vol. 33, pp. 4571-4576.

20. Yagi Т., Yano Т., Di Bernardo S., Matsuno-Yagi A. (1998) Procaryotic complex I (NADH-1), an overview // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1364, pp. 125-133.

21. Hirst J., Carroll J., Fearnley I.M., Shannon R.J., Walker J.E. (2003) The nuclear encoded subunits of complex I from bovine heart mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1604, pp. 135-150.

22. Виноградов А.Д. (2001) Комплекс I дыхательной цепи: структура, редокс компоненты и возможные механизмы трансформации энергии // Биохимия. Т.66, вып. 10, с. 13461360.

23. Brody S., Mikolajczyk S. (1988) Neurospora mitochondria contain an acyl-carrier protein // Eur. J. Biochem. Vol. 173, pp. 353-359.

24. Papa S. (2002) The NDUFS4 nuclear gene of complex I of mitochondria and the cAMP cascade // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1555, pp. 147-153.

25. Carroll J., Shannon R.J., Fearnley I.M., Walker J.E., Hirst J. (2002) Definition of the nuclear encoded protein composition of bovine heart mitochondrial complex I. Identification of two new subunits // J. Biol. Chem. Vol. 277, pp. 50311-50317.

26. Krishnamoorthy G., Hinkle P.C. (1988) Studies on the electron transfer pathway, topography of iron-sulfur centers, and site of coupling in NADH-Q oxidoreductase // J. Biol. Chem. Vol. 263, pp. 17566-17575.

27. Suzuki H., King T.E. (1983) Evidence of an ubisemiquinone radical from the NADH-.ubiquinone reductase of the mitochondrial respiratory chain // J. Biol. Chem. Vol. 258, pp.352-358.

28. Mitchell P., Moyle J. (1967) Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria.// Biochem J. Vol. 105, pp. 1147-1162.

29. Lawford H.G., Garland P.B. (1972) Proton translocation coupled to quinone reduction by reduced nicotinamide-adenine dinucleotide in rat liver and ox heart mitochondria // Biochem J. Vol. 130, pp. 1029-1044.

30. Brown G.C., Brand M.D. (1988) Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio // Biochem J. Vol. 252, pp. 473479.

31. Galkin A.S., Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. (1999) ^H+/2e stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles // FEBS Lett. Vol. 451, pp. 157-161

32. Xia D., Yu C.-A., Kim H., Xia J.-Z., Anatily M., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer J. (1997) Crystal structure of the cytochrome 6c/ complex from bovine heart mitochondria // Science. Vol. 287, pp. 60-66.

33. Zhang Z„ Huang L.-S., Shulmeister V.M., Chi Y.-I., Kim K.K., Hung L.-W., Crofts A.R., Berry E.A., Kim S.-H. (1998) Electron transfer by domain movement in cytochrome bcj II Nature. Vol. 392, pp. 677-684.

34. Iwata S., Lee J.W., Okada K., Lee J.K., Iwata M., Rasmussen B., Link Th.A., Ramaswamy S., Jap B.K. (1998) Complete structure of the 11-subunit bovine mitochondrial cytochrome bci complex // Science. Vol. 291, pp. 64-71.

35. Gong X., Yu L., Xia D., Yu C-A. (2004) Evidence for electron equilibrium between the two hemes in the dimeric cytochrome bcj complex // J. Biol. Chem. Vol. 280, pp. 9251-9257.

36. Izrailev S., Crofts A.R., Berry E.A., Schulten K. (1999) Steered molecular dynamics of the rieske subunit motion in the cytochrom bcj complex // Biophys. J. Vol. 77, pp. 1753-1768.

37. Mitchell P. (1975) Protonmotive redox mechanism of the cytochrome bci complex in the respiratory chain: protonmotive ubiquinone cycle // FEBS Lett. Vol. 56, pp. 1-6.

38. Trumpower B.L. (1990) The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome be/ complex // J. Biol. Chem. Vol. 265, pp. 11409-11412.

39. Rolling D.R., Samoilova R.I., Holland J.T., Berry E.A., Dikanov S.A., Crofts A.R. (2003) Exploration of ligands to the Q; site semiquinone in the bcj complex using high-resolution EPR // J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 39747-39754.

40. Yu C.A., Nagaoka S., Yu L., King T.E. (1978) Evidence for the existence of a ubiquinone protein and its radical in the cytochromes b and cj region in the mitochondrial electron transport chain // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 82, pp. 1070-1078.

41. Ohnishi T., Trumpower B.L. (1980) Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate/cytochrome c reductase complex // J. Biol. Chem. Vol. 255, pp. 3278-3284.

42. Esser L., Quinn B., Li Y.F., Zhang M., Elberry M., Yu L„ Yu C.A., Xia D. (2004) Crystallographic studies of quinol oxidation site inhibitors: a modified classification of inhibitors for the cytochrome bcj complex // J. Mol. Biol. Vol. 341, pp. 281-302.

43. Crofts A.R. (2004) The cytochrome bej complex: function in the context of structure // Annu Rev. Physiol. Vol. 66, pp. 689-733.

44. Hong S., Ugulava N., Guergova-Kuras M., Crofts A.R. (1999) The energy landscape for ubihydroquinone oxidation at the Q0 site of the bcj complex in Rhodobacter sphaeroides II J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 33931 33944.

45. Yu C-A., Wen X., Xiao K., Xia D., Yu L. (2002) Inter- and intra-molecular electron transfer in the cytochrome bci complex // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1555, pp. 65-70.

46. Junemann S., Heathcote P., Rich P.R. (1998) On the mechanism of quinol oxidation in the bei complex // J. Biol. Chem. Vol. 273, pp. 21603-21607.

47. Ramirez E., Malmstrom B.G., Winkler J.R., Gray H.B. (1995) The currents of life: the terminal electron-transfer complex of respiration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 11949-11951.

48. Iwata S., Ostermeier C., Ludwig B., Michel H. (1995) Structure at 2.8 Â resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans II Nature. Vol. 376, pp. 660-669.

49. Svensson-Ek M., Abramson J., Larsson G., Tôrnroth S., Brzezinski P., Iwata S. (2002) The X-ray crystal structures of wild-type and EQ(I-286) mutant cytochrome c oxidases from Rhodobacter sphaeroides II J. Mol. Biol. Vol. 321, pp. 329-339.

50. Soulimane T., Buse G., Bourenkov G.B., Bartunik H.D., Huber R., Than M.E. (2000) Structure and mechanism of the aberrant ba.3 cytochrome c oxidase from Thermus thermophilics IIEMBO J. Vol. 19, pp. 1766-1776.

51. Taanman J.W., Capaldi R.A. (1992) Purification of yeast cytochrome c oxidase with a subunit composition resembling the mammalian enzyme // J. Biol. Chem. Vol. 267, pp. 22481-22485.

52. Tsukihara T., Aoyama H., Yamashita E., Tomizaki T., Yamaguchi H., Shinzawa-Itoh K., Nakashima R., Yaono R., Yoshikawa S. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 Â // Science. Vol. 272, pp. 1136-1144.

53. Tsukihara T., Shimokata K., Katayama Y., Shimada H., Muramoto K., Aoyama H., Mochizuki M., Shinzawa-Itoh K., Yamashita E., Yao M., Ishimura Y., Yoshikawa S. (2003)

54. The low-spin heme of cytochrome c oxidase as the driving element of the proton-pumping process // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 100, pp. 15304-15309.

55. Ostermeier C., Harrenga A., Ermler U., Michel H. (1997) Structure at 2.7 Â resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome c oxidase complexed with an antibody FV fragment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 94, pp. 10547-10553.

56. Gennis R.B. (1998) Multiple proton-conducting pathways in cytochrome oxidase and a proposed role for the active-site tyrosine // Biochim. Biophiys. Acta. Vol. 1356, pp. 241-248.

57. Michel H. (1998) The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95, pp. 12819-12824.

58. Banci L., Bertini I., Huber J.G., Spyroulias G.A., Turano P. (1999) Solution structure of reduced horse heart cytochrome c II J. Biol. Inorg. Chem. Vol. 4, pp. 21-31.

59. Bushnell G.W., Louie G.V., Brayer G.D. (1990) High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c II J. Mol. Biol. Vol. 214, pp. 585-595.

60. Stuart R.A., Neupert K. (1990) Apocytochrome c: an axceptional mitochondrial precursor protein using an exceptional import pathway // Biochemie. Vol.72, pp.115-121.

61. Heinning B., Neupert K. (1983) Receptor sites involved in posttranslational transport of apocytochrome c into mitochondria: specificity, affinity, and number of sites // Proc. Natl. Sci. USA. Vol.80, pp. 4963-4967.

62. Takano T., Dickerson R.E. (1980) Redox conformation changes in refined tuna cytochrome c II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 77, pp. 6371-6375

63. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson J. Wang X. (1996) Induction of apoptotic programm in cell free extract: requirement for ATP and cytochrome c // Cell. Vol. 86, pp. 147-157.

64. Kluck R.M., Martin S.J., Hoffman B.M., Zhou J.S., Green D.R., Newmayer D.D. (1997) Cytochrome c activation of CPP32-like proteolysis plays a critical role in a Xenopus cell-free apoptosis system // The EMBO J., Vol.16, pp. 4639-4649.

65. Hengartner M.O. (1998) Death cycle and Swiss army Knives // Nature. Vol. 391, pp. 441442.

66. Reed J.C. (1997) Cytochrome c: can't live with it- can't live without it // Cell. Vol. 91, pp. 559-562.

67. Zhivotovsky B., Orrenius S., Brustugun O.T., Doskeland S.O. (1998) Injected cytochrome c induces apoptosis // Nature. Vol. 391, pp. 449-450.

68. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. (1997) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade // Cell. Vol. 91, pp. 479-489.

69. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., and Wang X. (1997) Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. // Cell. Vol. 90, pp. 405-413.

70. Smith T.F., Gaitatzes C., Saxena K., Neer E.J. (1999) The WD repeat: a common architecture for diverse functions // Trends Biochem. Sci. Vol. 24, pp. 181-185.

71. Adrain C., Slee E.A., Harte M.T., Martin S.J. (1999) Regulation of apoptotic protease activating factor-1 oligomerization and apoptosis by the WD-40 repeat region // J. Biol. Chem. Vol. 274, pp. 20855-20860.

72. Yu X., Acehan D., Menetret J.F., Booth C.R., Ludtke S J., Riedl S.J., Shi Y., Wang X., Akey C.W. (2005) A structure of the human apoptosome at 12.8 A resolution provides insights into this cell death platform // Structure. Vol. 13, pp. 1725-1735.

73. Kidd V.J. (1998) Proteolitic activities mediate apoptosis // Annu. Rev. Physiol. Vol. 60, pp. 533-573.

74. Adams J.M., Cory S. (1998) The Bgl-2 protein family: arbiters of cell survival // Science. Vol. 281, pp. 1322-1326.

75. Rytomaa M., Kinnunen P.K.J. (1995) Reversibility of the binding of cytochrome c to liposomes // J. Biol. Chem. Vol. 270, pp. 3197 3202.

76. Tuominen E.K.J., Wallace C.J.A., Kinnunen P.K.J. (2002) Phospholipid-cytochrome c interaction. Evidence for the extended lipid anchorage // J. Biol. Chem. Vol. 277, pp. 88228826.

77. Prasad S., Maiti N.C., Mazumdar S., Mitra S. (2002) Reaction of hydrogen peroxide and peroxidase activity in carboxymethylated cytochrome c: spectroscopic and kinetic studies // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1596, pp. 63-75.

78. Cassina A.M., Hodara R., Souza J.M., Thomson L., Castro L., Ischiropoulos H., Freeman B.A., Radi R. (2000) Cytochrome c nitration by peroxynitrite // J. Biol. Chem. Vol. 275, pp. 21409-21415.

79. Chen Y.R., Deterding L.J., Sturgeon B.E., Tomer K.B., Mason R.P. (2002) Protein oxidation of cytochrome c by reactive halogen species enhances its peroxidase activity // J. Biol. Chem. Vol. 277, pp. 29781-29791.

80. Korshunov S.S., Krasnikov B.F., Pereverzev M.O., Skulachev V.P. (1999) The antioxidant functions of cytochrome c//FEBS Lett. Vol. 462, pp. 192-198.

81. Smith H.T., Staudenmayer N., Millett F. (1977) Use of specific lysine modifications to locate the reaction site of cytochrome c with cytochrome oxidase // Biochemistry. Vol. 16, pp. 4971-4974.

82. Ahmed A.J., Smith H.T., Smith M.B., Millett F.S. (1978) Effect of specific lysine modification on the reduction of cytochrome c by succinate cytochrome c reductase // Biochemistry. Vol. 17, pp. 2479-2483.

83. Ng S, Smith M.B., Smith H.T., Millett F. (1977) Effect of modification of individual cytochrome c lysines on the reaction with cytochrome ¿5 // Biochemistry. Vol. 16, pp. 49754978.

84. Rieder R., Bosshard H.R. (1978) Cytochrome bci and cytochrome oxidase can bind to the same surface domain of the cytochrome c molecule // FEBS Lett. Vol. 92, pp. 223-226.

85. Bosshard H.R., Zurrer M., Schagger H., von Jagow G. (1979) Binding of cytochrome c to the cytochrome be; complex (complex III) and its subunits cytochrome cj and bi II Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 89, pp. 250-258.

86. Pettigrew G. (1978) Mapping an electron transfer site on cytochrome c // FEBS Lett. Vol. 86, pp. 14-16.

87. Rieder R., Bosshard H.R. (1980) Comparison of the binding sites on cytochrome c for cytochrome c oxidase, cytochrome bcj, and cytochrome cy // J. Biol. Chem. Vol.255, pp. 4732-4739.

88. Kim C.H., King T.E. (1983) A mitochondrial protein essential for the formation of the cytochrome cj-c complex. Isolation, purification, and properties // J. Biol. Chem. Vol. 25, pp. 13543-51

89. Lange K., Hunte C. (2002) Crystal structure of the yeast cytochrome bcj complex with its bound substrate cytochrome c // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 99, pp. 2800-2805.

90. Solmaz S.R., Hunte C. (2008) Structure of complex III with bound cytochrome c in reduced state and definition of a minimal core interface for electron transfer // J. Biol. Chem. Vol. 283, pp. 17542-17549.

91. Selzer T., Schreiber G. (2001) New insights into the mechanism of protein-protein association // Proteins. Vol. 45, pp.190-198

92. Pelletier H., Kraut J. (1992) Crystal structure of a complex between electron transfer partners, cytochrome c peroxidase and cytochrome c II Science. Vol. 258, pp. 1748-1755.

93. Axelrod H.L., Abresch E.C., Okamura M.Y., Yeh A.P., Rees D.C., Feher G. (2002) X-ray structure determination of the cytochrome cf. reaction center electron transfer complex from Rhodobacter sphaeroides II J. Mol. Biol. Vol. 319, pp. 501-515

94. Gray H.B., Winkler J.R. (1996) Electron transfer in proteins // Annu Rev. Biochem. Vol. 65, pp.537-561

95. Stonehuerner J., O'Brien P., Geren L., Millett F., Steidl J., Yu L., Yu C.A.(1985) Identification of the binding site on cytochrome c/ for cytochrome c II J. Biol. Chem. Vol. 260, pp. 5392-5398.

96. Broger C., Salardi S., Azzi A. (1983) Interaction between isolated cytochrome cj and cytochrome c II Eur. J. Biochem. Vol. 131, pp. 349-352.

97. Wang K., Zhen Y., Sadoski R., Grinnell S., Geren L., Ferguson-Miller S. and Millett F. (1999). Definition of the interaction domain for cytochrome c on cytochrome c oxidase // J. Biol. Chem. Vol. 74, pp.38042-38050.

98. Roberts V.A., and Pique M.E. (1999) Definition of the interaction doman for cytochrome c on cytochrome c oxidase 11 J. Biol. Chem. Vol. 274, pp.38051-38060.

99. Sampson V, Alleyne T. (2001) Cytochrome c/cytochrome с oxidase interaction. Direct structural evidence for conformational changes during enzyme turnover // Eur. J. Biochem. Vol. 268, pp.6534-6544.

100. Кржечковская B.B. Мембраносвязанный цитохром bs. Роль цитохрома bs в регуляции активности изоформ цитохрома Р-450 (2005) // Мембраны. Серия Критические технологии. №2 (26), стр. 10-22.

101. Davydov D.R. (2001) Microsomal monooxygenase in apoptosis: another target for cytochrome с signaling? // Trends Biochem. Sci. Vol. 26, pp. 155-160

102. Swanson R., Trus B.L., Mandel N., Mandel G., Kallai O.B., Dickerson R.E. (1977) Tuna cytochrome с at 2.0 Â resolution. I. Ferricytochrome structure analysis // J. Biol. Chem. Vol. 252, pp. 759-775.

103. Argos P., Mathews F.S. (1975) The structure of ferrocytochrome b5 at 2.8 Â resolution // J. Biol. Chem. Vol. 250, pp. 747-751.

104. Salemme F.R. (1976) An hypothetical structure for an intermolecular electron transfer complex of cytochromes с and bs II J. Mol. Biol. Vol. 102, pp. 563-568

105. Deep S., Im S.C., Zuiderweg E.R., Waskell L. (2005) Characterization and calculation of a cytochrome c-cytochrome b5 complex using NMR data // Biochemistry. Vol. 44, pp. 1065410668.

106. Yu Т., Wang X., Purring-Koch С., Wei Y., McLendon G.L. (2001) A mutational epitope for cytochrome с binding to the apoptosis protease activation factor-1 // J. Biol. Chem. Vol. 276, pp. 13034- 13038.

107. Miller M.A., Han G.W., Kraut J. (1994) A cation binding motif stabilizes the compound I radical of cytochrome с peroxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 91, pp. 11118-11122.

108. Worrall J.A., Kolczak U., Canters G.W., Ubbink M. (2001) Interaction of yeast iso-1-cytochrome с with cytochrome с peroxidase investigated by 15N, 1H. heteronuclear NMR spectroscopy // Biochemistry. Vol. 40, pp. 7069-7076.

109. Меньшикова Е.Б., Зенков H.K. (1993) Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологии. Т. 113, вып. 4, с. 422-455.

110. Fridovich I. (1974) Superoxide Dismutases // Adv. Enzymol. Vol. 41, pp. 35-98.

111. Halliwell B. Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, London. 1985.

112. Boveris A. (1984) Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria // Methods Ensymol. Vol. 105, pp. 429-435.

113. Asada K. (1984) Chloroplasts: formation of active oxygen and its scavenging // Methods Ensymol. Vol. 105, pp. 422-429.

114. Mehdy M.C. (1994) Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. Vol. 105, pp. 467-472.

115. Kuthan H., Ullrich V. (1982) Oxidase and oxygenase function of the microsomal cytochrome P450 // Eur. J. Biochem. Vol. 126. pp. 583-588.

116. Del Rio L.A., Sandalio L.M., Corpas F.J., Palma J.M., Barroso J.B. (2006) Reactive oxygen species and reactive nitrogen species in peroxisomes. Production, scavenging and role in cell signaling // Plant Physiol. Vol. 141, pp. 330-335.

117. Patton S.E., Rosen G.M., Rauckman E.J. (1980) Superoxide production in purified hamster nuclei // Mol. Pharmacol. Vol. 18, pp. 588-593.

118. Andreyev A.Yu., Kushnareva Y.E., Starkov A.A. (2005) Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species // Biochemistry (Moscow). Vol. 70(2), pp. 200-214.

119. Raha S., McEachern G.E., Myint A.T., Robinson B.H. (2000) Superoxides from mitochondrial complex III: the role of manganese superoxide dismutase // Free Radic. Biol. Med. Vol. 29, pp. 170-180.

120. Sun J., Trumpower B.L. (2003) Superoxide anion generation by the cytochrome bcj complex //Arch. Biochem. Biophys. Vol. 419, pp. 198-206.

121. Kramer D.M., Roberts A.G., Muller F., Cape J., Bowman M.K. (2004) Q-cycle bypass reactions at the Q0 site of the cytochrome bci (and related) complexes // Methods Enzymol. Vol. 382, pp. 21-45.

122. Muller F., Crofts A.R., Kramer D.M. (2002) Multiple Q-cycle bypass reactions at the Q0 site of the cytochrome bcj complex // Biochemistry. Vol. 41, pp. 7866-7874.

123. Galkin A., Brandt U. (2005) Superoxide radical formation by pure complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica 11 J. Biol. Chem. Vol. 280, pp. 30129-30135.

124. Kussmaul L., Hirst J. (2006) The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 103, pp. 7607-7612.

125. Tarpey M.M., Fridovich I. (2001) Methods of detection of vascular reactive species: nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite // Circ. Res. Vol. 89. pp. 224-236.

126. Tarpey M.M., White C.R., Suarez E., Ricardson G., Radi R., Freeman B.A. (1999) Chemiluminescent detection of oxidants in vascular tissue: lucigenin but not coelenterazin enhances superoxide formation // Circ. Res. Vol. 84, pp. 1203-1211.

127. Benov L., Sztejnberg L., Fridovich I. (1998) Critical evaluation of use of hydroethidine as a measure of superoxide anion radical // Free Radic Biol Med. Vol. 25, pp. 826-831.

128. Budd S.L., Castilho R.F., Nicholls D.G. (1997) Mitochondrial membrane potential and hydroethidine-monitored superoxide generation in cultured cerebellar granule cells // FEBS Lett. Vol. 415, pp. 21-24.

129. Misra H.P., Fridovich I. (1972) The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase // J. Biol. Chem. Vol. 247, pp. 3170 -3175.

130. Wakeyama H., Takeshige K., Takayanagi R., Minakami S. (1982) Superoxide-forming NADPH oxidase preparation of pig polymorphonuclear leucocyte // Biochem J. Vol. 205, pp. 593-601.

131. Quintanilha A.T., Packer L. (1977) Surface localization of sites of reduction of nitroxide spin-labeled molecules in mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 74, pp. 570-574.

132. Rosen G.M., Finkelstein E.J., Rauckman J. (1982) A method for the detection of superoxide in biological systems // Arch. Biochem. Biophys. Vol. 215, pp. 367-378.

133. Roubaud V., Sankarapandi S., Kuppusamy P., Tordo P., Zweier J.L. (1997) Quantitative measurement of superoxide generation using the spin trap 5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide// Anal. Biochem. Vol. 247. pp. 404-411.

134. Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. (2006) Generation of superoxide by mitochondrial Complex I // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1757, pp.553-561.

135. Lee C.P., Ernster L. (1967) Energy-coupling in nonphoshorylating submitochondrial particles // Methods Enzymol. Vol. 10. pp. 543-548.

136. Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. (1990) Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase // Biochim. Biophys. Acta Vol. 1019, pp. 151-158.

137. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. Vol. 33, pp. 103-19.

138. Bullock W.O., Fernandez J. M., Short J. M. (1987) XLl-Blue: a high-efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection // BioTechniques. Vol. 5, pp. 376-378.

139. Долгих Д.А., Латыпов Р.Ф., Абдуллаев 3.X., Колон В., Родер X., Кирпичников М.П. (1998) Экспрессия мутантных генов цитохрома с лошади в Escherichia coli II Биоорганическая химия. Т.24, №10, С. 756-759.

140. Гловер Д.М. Клонирование ДНК. М.: Мир,1988.

141. QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США).

142. Johnson, D., Lardy, H. (1967) Isolation of liver or kidney mitochondria // Meth. Enzymol. Vol. 10, pp. 94-96.

143. Jacobs E.E., Sanadi D.R. (1960) The reversible removal of cytochrome с from mitochondria // J. Biol. Chem. Vol. 235, pp. 531-534.

144. Crane F.L., Glenn J.L., Green D. (1956) Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particle // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 22, pp. 475-487.

145. Burbaev D.Sh., Moroz I.A., Kotlyar A.B., Sled V.D., Vinogradov A.D. (1989) Ubisemiquinone in the NADH-ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain // FEBS Lett. Vol. 254, pp. 47-51.

146. Виноградов А.Д., Лейкин Ю.Н., Липская Т.Ю. Биохимия митохондрий. Биоэнергетика. Руководство к практическим занятиям по биохимии животных. М.: Изд-во Моск. унта, 1977, с. 19-22.

147. Ferguson-Miller S., Brautigan D.L., Margoliash Е. (1976) Correlation of the kinetics of electron transfer activity of various eukaryotic cytochromes с with binding to mitochondrial cytochrome с oxidase // J. Biol. Chem. Vol. 251, pp. 1104-1115.

148. Schagger H., Jagow G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. Vol. 166, pp. 368-379.

149. Babul J., Stellwagen E. (1972) Participation of the protein ligands in the folding of cytochrome с II Biochemistry. Vol. 11, pp.1195-1200.

150. Gornal A.G., Bardawill C.J., David M.M. (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction // J. Biol. Chem. Vol. 177, pp. 751-766.

151. Dutton P.L., Wilson D.F., Lee C-P. (1970) Oxidation-reduction potentials of cytochromes in mitochondria // Biochemistry. Vol. 9, pp. 5077-5082.

152. Brand M.D., Affourtit C., Esteves T.C., Green K., Lambert A.J., Miwa S., Pakay J.L., Parker N. (2004) Mitochondrial superoxide: production, biolodical effects, and activation of uncoupling proteins // Free Radical Biol. Med. Vol. 37, pp. 755-767.

153. Hirst J., King M.S., Pryde K.R. (2008) The production of reactive oxygen species by complex I // Biochem. Soc. Trans. Vol. 36, pp. 976-980.

154. Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г. (2005) Генерация супероксид-радикала NADH: убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца // Биохимия. Т. 70, с. 150-159.

155. Sun J., Trumpower В. (2003) Superoxide anion generation by the cytochrome bci complex // Arch. Biochem. Biophys. Vol. 419, pp. 198-206.

156. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L., Lesnefsky E.J. (2003) Production of reactive oxygen species by mitochondria: central role of complex III // J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 36027-36031.

157. Massey, V., Palmer, G., and Ballou, D. (1973) in Oxidases and Related Redox Systems (King, Т.Е., Mason, H.S., and Morrison, M., eds.) University Park Press, Baltimore, London, Tokyo, pp. 25-49.

158. Esterhazy D., King M.S., Yakovlev G., Hirst, J. (2008) Production of reactive oxygen species by complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Escherichia coli and comparison to the enzyme from mitochondria // Biochemistry. Vol. 47, pp. 3964-3971.