Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительные процессы и обмен фосфолипидов при молибденовом токсикозе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительные процессы и обмен фосфолипидов при молибденовом токсикозе"

яизииэиъь =ШЪР1111Ь8ПЬ0311и зьзги-газгиъъьрь иачизк» имиаьиьи з. рпьъьигазиъь иыиъ цьъииеьиьизь ьъизьэпьэ

аиеирзиъ зизиъь ^шчьиьрь

оеиьаизииъ тщпзьиъьпс Ь4 ьпиьть'пьаъьрь ФШииьи^ППЭЗПЬЪС иш-ьроьъизьъ впеиьцпаь сшииъим

0^.00.04 - мьъииеьим!

йшиОшцЬшш^шйр ЦЬОишршйшЦшО рЫ|йшйгиЬ

сфтииЦшО шиифбшСф Ьицдйшй шшЬОш|ипипф]шО

иьаиичьр

ЬрЬшО -1998

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

ЗАХАРЯН ГАЯНЕ ВЛАДИМИРОВНА

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И ОБМЕН ФОСФОЛИПИДОВ ПРИ МОЛИБДЕНОВОМ ТОКСИКОЗЕ

3.00.04 БИОХИМИЯ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1998

U2|iiminujGeQ tjaiimupilbi. t U.RbpujgnL шО^шй bp'HPR-li CGrihuiGrup U ^bGuuiopqiuGiuljujG phäNjh tui5phnGnu5 L RR qiiU l/n[hlinL|U]jhG UbGuuipuuGrupjuiG hGumtiununnuJ

q|iinuul|ujü r\bl|uji[ujp' ЦЬйи. сфт. г\пЦш., щрпф.

J.LT.LJbLßnGjmG

Tliu2innGailjiuQ QGrwhüiufunuübp' RR qiiU шЦшг^Ьй^^пи

U.U.^milpjmG; Pc^wljuiG q[nn. pbljümönL 4.3ni..LmqujG

ипш^шшшр IjuiqüiutjbpujnipjnLG' RR qiiU U. L. UGpnjiuüfi luGiIuiG Ъгирр opqiuGiuljiiiG pfitffiuijfi hGuinfiinruin

Tlu^inujuiGnLpjnLGQ IjujjiuGuJinL 1 1998 p. hruLfiuh « 22 » dmdp 1100 -fiG RR qUU R.PruG|iiupjiuG|i шОЦшй iHbüuLuphdhuijfi hüumfimnLmhG L|h9 042 üiuuGuiqhmiugiluJö funphpqnLü (375014, RR, bpLuiG, fl. UIiujI||i 5/1)

UmbGLufunuiupjiuÜQ 1)шрЬ[|1 ÖLuGnpiuüiui RR qilü R.PiuGfiiupjujGh iuGi(iuG

^bDumßfiühmjfi |iGum|iuinLuifi qpujr|ujpiuünu5: Ubn.ümqhPD шпшрЦшб t « 17 » hruG|iu|i, 1998p.

lfiuuGujq[iinLugiluj6 funphprjh qfirn. ешртпщшплу/>р r $ llhGuuipuiGujl|uiG q|iin. qnl^innp, щрпфЬипр U- UfiüriGjaiG

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии ЕрГМУ и Институте Молекулярной биологии HAH РА Научный руководитель: Доктор биологических наук, проф-

ессор М.М.Мелконян Официальные оппоненты: Академик HAH РА М.А.Давтян

Кандидат медицинских наук В.Ю.Коган

Ведущая организация: Институт тонкой органической химии им.

А.Л.Мнджояна HAH РА Защита состоится « 22 » июля 1998 в II00 часов на заседании Специализированного Совета 042 при Институте Биохимии им. Г.Х.Бунятяна HAH РА ( 375014, Ереван, ул. Паруйра Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института

Биохимии им. Г.Х.Бунятяна HAH РА. Автореферат диссертации разослан « 17 » июня 1998г.

Ученый секретарь Специализированного Совета^

Доктор биологических наук, профессор ш .^/А.А.Симонян

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время все больший интерес приобретает проблема всестороннего изучения микроэлементов (МЭ), которые обладают высокой биологической активностью и являются одним из объектов геохимической экологии.

Известно, что недостаточное или избыточное поступление МЭ в организм влечет за собой те или иные нарушения, нередко ведущие к возникновению эндемических заболеваний. Доклады экспертных комитетов ВОЗ и другие многочисленные публикации (Авцын А.П., 1991; Горбич В.Ф., 1993; Томпиев Е.К., 1992) позволяют сделать заключение, что в настоящее время есть все основания говорить о возрастающей агрессивности внешней среды. Одной из важных сторон этого, еще в недостаточной степени контролируемого, процесса являются загрязнения микроэлементной природы. Сравнительно недавно объектами изучения уровня микроэлементного загрязнения внешней среды стали промышленные города и окружающие их регионы.

В связи с перспективой дальнейшего научно-технического прогресса, развития энергетики и химической промышленности изучение механизмов повреждающего действия вредных факторов внешней среды на организм становится в настоящее время едва ли не самой насущной из медико-биологических проблем, тем более, что в этой проблеме имеются не изученные или слабо изученные аспекты. Все вышесказанное более чем актуально для нашего государства, т.к. в Армении имеются биогеохимические провинции с избытком молибдена (Анкаван, Каджаран).

Имеются сведения о профессиональных заболеваниях работников молибденовых и медно-молибденовых производств, находящихся и в Армении (Давидян С.Р., 1991; Степанян С.С., 1986). Как показали результаты гигиенических исследований на предприятиях Армении по добыче и переработке молибдена, рабочие основных профессий подвергаются одновременному эпикутанному и ингаляционному воздействию молибден-:одержащей пыли. Если загрязнение молибденсодержащей пылью кожных покровов представляет определенную опасность для развития аллергических дерматозов как клинических проявлений замедленного типа, то респираторное поступление в организм играет весьма существенную роль в развитии немедленных аллергических реакций.

МЭ участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, включены з различные виды обмена - белковый, жировой, углеводный. Они имеют эольшое значение в клеточном делении, кроветворении, костеобразовании, иммунологических реакциях и т. д (Thompson К.Н. et al., 1996; Van Gennip \.H. et al., 1994; Yurdakok M. et al., 1997). В частности, биологическая активность молибдена обуславливается его вхождением в состав ряда ферметов в качестве незаменимого компонента (Huber R. et al., 1996; Ichida К. et al., 1997: vloriwaki Y. et al., 1997; Sumi S. et al., 1996). В настоящее время известно 15 .юлибденсодержащих ферментов, но выяснение биологической роли лолибдена, как эссенциалыюго (жизненно необходимого) микроэлемента, :вязано с открытием трех из них, встречающихся в животном организме: ссантиноксидазы, альдегидоксидазы, сульфитоксидазы.

Известно, что в патогенезе молибденового токсикоза наблюдаются нарушения ряда ферментативных процессов. Сведения, касающиеся изменений фосфолипидов (ФЛ) при молибденозе, весьма незначительны. Изменения скорости течения обменных реакций липидов в организме, обусловленные нарушениями окислительных процессов, сопровождаются накоплением лизоформ ФЛ и ненасыщенных жирных кислот (ЖК). Исследование этих и связанных с ними процессов под действием молибдена представляет несомненный интерес.

Целью настоящего исследования явилось изучение специфики повреждающего действия молибдена на качественный и количественный состав ФЛ, на процессы свободнорадикального окисления липидов и гидроксилирования в микросомальной фракции печени и эритроцитарных мембранах (ЭМ), а также определение ферментативной активности ряда антиоксидантных ферметов, таких, как супероксиддисмутаза (СОД), глут-атионредуктаза (ГР) и глутатионпероксидаза (ГП) в печеночной ткани и ЭМ.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение закономерностей качественных и количественных сдвигов ФЛ в динамике развития молибденоза в печеночной ткани и мембранах эритроцитов.

2. Анализ процессов ПОЛ в печеночной ткани и мембранах эритроцитов под действием молибдена.

3. Изучение влияния молибдена на активность антиокислительных ферментов (СОД, ГП, ГР).

4. Исследование процессов гидроксилирования на примере окисления субстрата II типа анилина и сдвигами в содержании цитохромов Ь5 и Р-450 в микросомальной фракции.

5. Определение изменения качественного и количественного состава ЖК под влиянием молибдена.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изучение молекулярных механизмов токсического действия молибдена, как новое в патогенетическом механизме изученной патологии.

2. Интенсификация реакций СРО является обязательным атрибутом при молибденовом токсикозе и находится в прямой зависимости от дозы и длительности затравки.

3. Эффекты молибдена в изменениях качественного спектра и количественного содержания индивидуальных фракций ФЛ.

4. Изменения жирнокислотного состава ФЛ: увеличение содержания насыщенных ЖК с паралельным уменьшением их ненасыщенных представителей.

5. Влияние молибдена на уменьшение активности ферментов антиокислительной защиты клетки ( СОД, ГР, ГП).

6. Стимулирующая роль молибдена в подавлении процессов гидроксилирования, уменьшение содержания цитохромов Ь3 и Р-450.

Научная новизна. В работе впервые изучен качественный и количественный состав ФЛ и ЖК при молибденовом токсикозе. Установлено, что содержание ФЛ, в состав которых входят ацилненасьпценные жирные кислоты - фосфатидилхолинов (ФХ), фосфатидилэтаноламинов (ФЭ), фосф-

i-гидилсеринов (ФС), при повышенном поступлении в организм молибдена во зсе сроки наблюдений уменьшается. Одновременно наблюдается увеличение шзофосфатидилхолинов (ЛФХ), кардиолипинов (КЛ), монофосфоинозитидов [МФИ). Впервые доказано изменение жирнокислотного состава ФА; устано-злено увеличение содержания насыщенных представителей ЖК с параллельным уменьшением количества ненасыщенных представителей, а также обнаружено активирование процессов ПОЛ в микросомальной фракции как в аскорбат-, так и в НАДФН-зависимой системах окисления. Установлено понижение активностей СОД, ГП, ГР. Обнаружено нарушение реакций гидроксилирования анилина в микросомальной фракции печени, гопровождающееся одновременной убылью содержания цитохромов Ь3 и Р-450.

Теоретическая значимость и практическая ценность. Полученные данные значительно расширяют существующие представления и дополняют имеющиеся сведения о биологической роли молибдена. Полученные результ-пы позволяют по новому ■ интерпретировать роль липидов в обеспечении тканевых физиологических функций, продемонстрировать значение этих :оединений в стабилизации биологических мембран и поддержании постоян-:тва липидного окружения мембранных протеинов, что черезвычайно важно \ля активности ферментов, в том числе мембрансвязанных липидсодержащих ферментов. Совокупность полученных экспериментальных данных служит теоретической основой для усовершенствования концепции патогенеза молибденового токсикоза.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и эбсуждены на пятом съезде армянского физиологического общества (1994), та 70-й научной конференции ЕрГМУ (1997) и на конференции, посвященной 50-летию СНО ЕрГМУ (1998), на совместном заседании кафедры общей и эиоорганической химии и кафедры биохимии ЕрГМУ и членов Ученого Сов-;та института Молекулярной биологии (1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Стркуктура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований, заключения, выводов и :писка литературы. Работа представлена на 106 сраницах русского текста, годержит 12 таблиц и 7 диаграмм. Библиографический указатель включает 257 ссылок (117 русских и 140 иностранных источников).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований были белые беспородные крысы массой 150-ЮО г, получавшие per os водный раствор молибденовокислого натрия Na2Mo04) из расчета 50, 100, 300, 500 мг (в пересчете на элементарный лолибден) на килограмм живого веса ежедневно в течение 10, 20 и 30 дней.

1.Метол выделения субклеточных фракций.

Животных обезглавливали под легким эфирным наркозом, печеночную :кань измельчали и гомогенизировали в среде, содержащей 0,25М сахарозы и ),01М трис- НС1 буфер (рН 7,4). Субклеточные органеллы отделяли центри-

фугированием: ядра- при 850g в течение 15 мин; митохондрии - при 11000g в течение 20 мин (центрифуга К-24, ГДР); микросомы - при 105000g в течение бОмин (VAG -601, ГДР) (Shanaitman С. et al., 1967).

2. Мембраны эритроцитов выделяли осаждением с использованием буферов ( Limber G.R. et al., 1970).

3. Выделение, фракционирование и количественное определение ФЛ и их жирнокислотного спектра.

Экстракцию ФЛ проводили по методу Фолча ( Folch J. et al. 1957) в модификации Карагезяна ( Карагезян К.Г., 1969).

Фракционирование индивидуальных ФЛ проводили методом одномерной восходящей тонкослойной хроматогрфии с использованием системы растворителей хлороформ-метанол-аммиак (65:35:5). Пятна ФЛ идентифицировали с помощью соответствующих стандартных свидетелей (Sigma). Минерализацию липидного фосфора проводили в среде серной и азотной кислот с последующим пересчетом его содержания в мкг на 1 мг сухой ткани.

Метиловые эфиры ЖК ФЛ получали по методу Штоффеля (Соколова Г.П., 1982). Идентификацию полученных метиловых эфиров ЖК ФЛ проводили методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе марки "Хром-5" (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором. Идентификацию полученных метиловых эфиров ЖК проводили путем сравнения с хроматограммой смеси насыщенных и ненасыщенных метиловых эфиров ЖК с длиной углеродной цепи С,«,.Площади пиков отдельных компонентов ЖК на хроматограммах в % расчитывали как производные высоты пика на его ширину на уровне, соответствующем половине высоты.

4. Метод определения перекисей и гидроперекисей в ферментативной и неферментативной системах окисления.

В основе метода определения липидной пероксидации лежит реакция взаимодействия малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), протекающая при высокой температуре и кислом значении pH и завершающаяся образованием окрашенного триметилового комплекса, содержащего одну молекулу малонового диальдегида и две - ТБК (Владимиров Ю. и др., 1972). Интенсивность окраски измеряли спектрофотометрически при длине волны 535 нм.

Количество гидроперекисей определяли по интенсивности цветной реакции в присутствии тиоцината аммония, спектрофотометрирование производили при длине волны 480нм (Романова Л. и др., 1977).

5. Метол определения супероксилдисмутазы.

Активность СОД определяли по ингибированию супероксидных анион-радикалов, генерируемых в модельной системе, содержащей феназинмет-асульфат, НАДН, нитротетразолий синий (Nishikimi N. et al., 1972). Колори-метрирование проводили спустя 10 мин при длине волны 530 нм.

6. Метод определяя глутатионпероксидазы.

Метод основан на ' определении восстановлении глутатион-пероксидазной реакции глутатиона в модельной системе (Pinto R.E. et al., 1969).Колориметрирование проводили через 15 мин на СФ-46-ЛОМО при длине волны 412 нм. Активность фермента выражали в мкмоль GSH, окисленного за 1 мин/мг белка.

7. Метод определения глутатионредуктазы.

Принцип метода основан на определении скорости убыли НАДФН вследствие восстановления окисленного глутатиона в модельной системе, содержащей ГР (Путилина Ф.Е., 1982) .Активность ГР определяли по убыли НАДФН и выражали в мкмолях окисленного НАДФ/мин/мг белка с учетом коэффициента молярной экстинкции НАДФН - 2,07.

8. Метод определения п-гидроксилазной активности

Скорость п-гидроксилирования анилина определяли по количеству образовавшегося п-аминофенола. Реакция протекает на молекуле цитохрома Р-450 в присутствии НАДФН и кислорода. Интенсивность окраски измеряли :пектрофотометрически при длине волны 630 нм (Карузина И.И. и др., 1977).

9. Метод определения цитохрома Р-450.

Спектрофотометрическое определение содержание цитохрома Р-450 по \вухлучевой системе основано на измерении велечины поглощения комплекса восстановленого цитохрома Р-450 с окисью углерода при длине волны 450 нм (Ошига Т. е1 а!., 1964).

10. Метод определения цитохрома Ь^

Спектрофотометрическое определение количественного содержания дитохрома Ь5 осуществляли по измерению разницы в поглощении жисленной и восстановленной форм гемопротеида (Ошига Т. е1 а1„ 1964).

Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Ьотлту е1 а1.., 1951).

Обработку фактического цифрового материала производили с исполь-юванием критерия вариационной статистики в системе Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности фосфолипид-фосфолипидных соотношений под действием молибдена.

Качественный и количественный состав мембранных липидов норм-1льных тканей поддерживается в пределах относительно постоянных величин I заметно нарушается при различных внешних воздействиях. Мембранные 1>Л принимают активное участие в рецепции гормонов, токсинов, переносе :убстратов и других функций, в связи с чем, даже незначительные откло-тения в составе, содержании и обмене ФЛ мембран накладывают нежелат->льный отпечаток на функциональную активность клетки. В связи с вышеи-ложенным мы исследовали качественный и количественный состав ФЛ в юченочной ткани и в ЭМ под действием различных доз молибдена.

Как видно из таблиц 1 и 2, молибден оказывает разнонаправленное ¡лияние на содержание различных ФЛ печени и в ЭМ. Так, ФЛ, в состав юторых входят ацилненасыщенные жирные кислоты, такие, как ФХ, ФЭ, [)С, под влиянием молибдена во все сроки уменьшаются. Заслуживает вни-гания факт увеличения ЛФХ во все сроки наших наблюдений и особенно 1ри затравке высокими дозами молибдена (рис.1). Увеличение количества

ит>х,

Таблица 1

Содержание фосфолипидов ( % от общего кол-ва фосфолипидов ) в печени белых крыс, получавших

молибден ( п=10 )

Дни ис-следов. 10 дней 20 дней 30 дней

озы Конт 50 100 300 500 50 100 300 500 50 100 300 500

ЛФХ 10,5 ±0,8 17,1 ±1,1* 22,3 ±0,9* 5,8±1,3* 27,8±1,3* 17,7±1,1 22,9±1,5* 24,6±1,1* 28,7±1,1* 23,8±1,1* 25,9±1,1* 27,7 ±1,0* 8,6 ±0,8*

СФМ 10,5±0,8 10,1 ±0,8 10,1 ±0,8 10,5±1,0 10,8±0,1 11,8±1,4 10,1 ±0,8 11,0±0,8 10,2±0,7 10,1 ±0,7 10,0±0,9 11,0±0,6 1,04 ±0,7

МФИ 5,5±0,1 6,3±0,08* 6,1 ±0,15" 6,3±0,1* 6,4±1,1* 6,3±0,5* 6,2±1,0" 6,6±0,2* 7,2±0,3* 6,5±0,1* 6,9 ±0,1* 6,9±0,2* 6,8 ±0,2*

ФХ 25,9 ±1,4 20,1 ±1,1** 17,1±1,2* 5,3±1,4* 15,2±1,1* 18,8±0,8* 18,0±1,1* 16,0±0,8* 14,1±1,2* 17,4±1,1 15,6±1,3* 14,7±1,2* 4,7 ±1,2*

ФС 15,5±0,7 16,3 ±0,9 15,5±1,2 3,6±1,1* 13,3±0,8 14,4±0,9* 13,5±0,9 12,1±1,1" 1,1±1,1" 14,1±1,0 2,2 ±0,9" 11,2±0,6* 0,9±0,8*

ФЭ 17,2±1,1 13,4±1,1" 11,6±1,0" 11,4±1,0 9,1 ±0,9* 13,2±1,1 2,0±1,1" 11,6±1,1" 9,8±1,1* 10,7 ±0,9* 11,0 ±0,9* 10,1±1,1* 9,6 ±0,9*

кл 14,9±0,8 1б,8±0,8 17,1 ±0,95 17.1 ±1,1 17,5±1,2 17,7±1,2 17,4 ±0,9 18,2±1,0" 19,0±0,6* 7,4±0,8*" 8,5±1,2" 8,3 ±0,6" 8,4±0,7*

Примечание: Различия статистически достоверны относительно контроля * - р < 0,001 ; ** - р < 0,01 ; *** - р < 0,05

У

Таблица 2

Содержание фосфолипидов ( % от общего количества фосфолипидов ) в мембранах эритроцитов крыс,

получавших молибден ( п=10 )

Дни исследован. 10 дней 20 дней 30 дней

Дозы Контр 50 100 300 500 50 100 300 500 50 100 300 500

ЛФХ 10,0+0, 12,3 ±0,6 13,0±1, 15,2±1, 16,7±0, 15,8±0, 15,9±0,9 21,0±0, 22,3±1,2 18,8±1,2 21,8±1,1 •22,3±1, 24,2±1,0*

СФМ 20,8±1, 23,2±1, 24,2±0,9 24,1 ±1,1 24,8±1,1 23,2±1, 24,1 ±1,2 24,6±1, 25,2±1,0 22,8±0, 24,1 ±0,7' 28,9±1, 27,4 ± 1,1"

МФИ 8,6 ±0,6 12,6±0, 13,3±0, 15,8±0, 14,8±0, 12,9±0, 12,8±1,1' 9,2±1,2 7,3±0,9 10,3±0, 8,7±0,6 7,4±1, 6,3±1,1

ФХ 28,3±1, 19,2±1, 17,3±1, 1б,1±1, 15,8+0, 17,7±0, 16,5±1,0 16,1 ±0, 15,0±0,7 16,3±0,8 16,9±1, 15,3±0, 14,65'±0,8

ФС 14,3±0, 13,0±0, 12,2±0, 9,8±0,8" 8,6±1,1 П,4±1, 12,2±0,9 9,8±0,9" 10,1 ±0,9 12,8±1, 8,8±0,7 8,5±0,7 7,3±0,6*

ФЭ 8,5 ±0,7 8,4±0,7 7,1 ±0,9 6,4±0,9 6,0±0,5" 7,4±1,1 7,0±0,4 6,2±0,7* 6,0±0,6* 7,4±0,7 6,8±0,8 6,3±0, 6,2±0,9—

кл 9,5±0,7 11,6±0, 13,0±0,7 13,2±0,9 14,1 + 1,1 12,8±1,2 12,2±0,8" 13,1±0, 14,1 ±0,7 12,2±0,8* 13,8±0,7 14,0±0, 14,9±0,6"

Примечание: Различия статистически достоверны относительно контроля • - р < 0,001 ; *' - р < 0,01 ; "* - р < 0,05

по-видимому, связано с усилением процесса пероксидации липидов, с одной стороны, а с другой - повышением активности фосфолипазы А2. Доказано токсическое действие ЛФХ на эритроциты и другие клетки и ткани. Результаты наших исследований показали, что при молибденозе наблюдается увеличение содержания ЛФХ в мембранах эритроцитов. Накопление в мембранах ЛФХ - служит своеобразным индикатором активности фосфолипазы А2 и свидетельствует об активировании деградации липидов в условиях МГ. Установлено, что повышение уровня ЛФХ в эритроцитах приводит к усилению транспорта Na+ и CaJ+, а в микросомах печени ингибируется активность цитохрома Р-450 ( Новиков К.Н. и др., 1987; Hashimoto М. et al., 1987).

30

Рис 1. Содержание фосфолипидов (в % от общего количества фо-сфолипидов) в печени белых крыс ( доза ЗООмг/кг) при различных сроках исследований ( п=10 ).

По нашим данным, количество СФМ в печеночной ткани и в ЭМ не претерпевает каких-либо существенных изменений, что повидимому связано с их структурной организацией. Как известно, в молекуле СФМ присутствуют в основном остатки насыщенных жирных кислот, которые относительно устойчивы к окислению.

Большой интерес вызывает изменение содержания МФИ, относящихся к категории кислых ФЛ, принимающих деятельное участие в процессах передачи нервного импульса, которые участвуют в так называемом фосфоин-озитидном цикле (Асатрян Л.Ю., 1993).

Отмеченное нами увеличение содержания КЛ связано, по всей вероятности, с компенсаторно-приспособительными механизмами и очевидно направлено на поддержание работы дыхательной цепи митохондрий, которая страдает при повышенных поступлениях молибдена; в митохондриях печени молибденозных животных наблюдается снижение степени сопряжения дыхания и фосфорилирования, а также нарушение активности АТФ-азы (Машинян А.Х., 1981).

Результаты исследований жирнокислотного состава печеночной ткани свидетельствует о его значительных изменениях (рис.2). По нашим данным, повышенное поступление молибдена сопровождается уменьшением содержания ненасыщенных ЖК, таких, как олеиновая (С,8:1), линолевая (С18:2), арахидоновая (С^,), с параллельным увеличением содержания представителей насыщенных ЖК- пальмитиновой (С1б) и стеариновой (С33).

Рис.

2 Жирнокислотный состав фосфолипидов ( % от суммы ) печени белых крыс в норме и при воздействии молибдена (доза 300 мг/кг) (п=б). 1. Миристиновая С14.0 2. Пальмитолеиновая С,,., 3. Олеиновая С1в., 4. Линолевая С18.2 5. Пальмитиновая С1():0 6. Арахидоновая С2(м 7. Стеариновая С18.0 8. Сумма насыщенных ЖК 9. Сумма ненасыщенных ЖК.

Высвобождение ЖК из ФЛ клеточных мембран является не простой реакцией, а представляет собой сложный биологический механизм при котором в результате функционирования так называемого цикла де-ацилировагия-реацилирования осуществляется процесс отщепления ЖК, катализируемый фосфолипазой А2.

2. Влияние молибдена на процесс свободнорадикального окисления липидов и активность ферментов антирадикальной защиты.

Окислительные процессы липидов мембран в настоящее время привлекают большое внимание. Накоплен большой объем научной информации о вредоносном действии продуктов липидной пероксидации на морфо-функциональные свойства биологических мембран и главным образом на функцию трансмембранного переноса веществ. Нарушения физико-химических свойств клеточных мембран обусловлены преимущественно

срывами в устойчивости липид-белковых комплексов этих образований, чт вызывает инактивацию мембрансвязанных липидзависимых ферментов ] следовательно, изменение всего метаболитического статуса клетки.

Предпринятое нами изучение закономерностей динамики ПОЛ микросомальной фракции печени и в ЭМ подтверждает существование интактном организме определенного стационарного уровк свободнорадикальных реакций. Перекисное окисление липидов изучалос нами в ферментативной (НАДФН-зависимой) и неферментативной (аскорба-зависимой) системах окисления.

Как показали результаты иследований, содержание гидроперекисей перекисей (таб.3) в микросомальной фракции печеночной ткани белых кры претерпевает определенные изменения, степень которых находится в прямо зависимости как от количеств задаваемого молибдена, так и от продолжи-ельности его введения.

Таблица

Динамика содержания перекисей липидов ( в нмоль МДД на 1мг белка ) в микросомальной фракции печеночной ткани белых крыс при молибденовом токсикозе ( п = 6 )

Дни ис- Дозы АЗП нзп

след.

К о н т . 9,5+0,6 7,7±0,9

50 11,2±0,6 10,5±1,1"'

10 100 12,6±0,5" 11,4±0,7"

300 14,8±0,6' 13,7±0,5"

500 17,8±0,9' 17,5±0,3

50 16,2±0,1" 14,8±0,9'

20 100 17,5±1,0' 15,3±1,1'

300 21,6±0,6' 14,04 ±0,9"

500 24,1±1,4' 19,5±0,8

50 14,7±0,8' 14,8±0,5

30 100 18,4±0,8' 16,8 ±0,6"

300 25,5±1,1' 23,1±1,Г

500 26,4 ±0,9' 26,0±0,9'

Примечание: Различия статистически достоверны относительно контроля * -р < 0,001 " - р < 0,01 "* - р < 0,05

Так, наибольшее накопление перекисей липидов отмечается на 30-1 день при дозе молибдена 300 и 500 мг/кг веса в период развития молибден ового токсикоза (рис.3). Из приведенных данных следует, что молибденовьи токсикоз сопровождается активированием процесса образования перекисей микросомальной фракции как в аскорбат-, так и в НАДФН-зависимых си стемах окисления.

Предпринятое нами изучение процессов ПОЛ в ЭМ показало, что в ЭМ происходят аналогичные изменения, зависящие от дозы и длительности экспозиции.

Одним из пусковых механизмов перекисного окисления липидов являются супероксидные радикалы, которые образуются при аэробном окислении ксантиноксидазы, а также при действии альдегидоксидазы (Smith А.М. et al., 1982). Эти два фермента содержат в своей структуре молибден, и их активность повышается при молибденовом токсикозе. Нам представляется, что супероксидный анион-радикал, генерируемый ксантиноксидазой при аэробном окислении ксантина, может быть одним из факторов, иницирующих пероксидацию липидов микросомальных мембран. В настоящее время считают, что цитотоксичность супероксидного раликала обусловлена тем, что этот радикал является первичным и относительно стабильным продуктом восстановления кислорода и с его помощью образуются другие, более сильные окислители- гидроксильный радикал и синглентный кислород (Афанасьев И.Б., 1987).

"Гид.

Рис. 3 Динамика перекисного окисления липидов (АЗП, НЗП) (в нмоль МДА на 1мг белка), скорость реакций п - гидроксилирования анилина ) (в нмоль в 1мин. на 1мг белка), в микросомальной фракции печеночной ткани и активность супероксиддисмутазы (ед. активности на 1мг белка), в печени белых крыс (ЗООмг/кг).

Обезвреживание супероксидного аниона, обладающего токсическим действием, осуществляется ферментом супероксиддисмутазой (Гусев В.А., 1983). В этой связи нами была проведена серия исследований активности СОД на фоне введения различных доз молибдена. Как показали результаты исследований эффекты молибдена сопровождаются развитием заметного до-зозависимого уменьшения активности СОД в печеночной ткани (таб.4) и крови, особенно при даче его высоких концентраций (300 и 500 мг/кг) (рис.3).

При исследовании активности СОД эритроцитов нами обнаружено, что пр: низких дозировках и при 10-дневном поступлении молибдена активност СОД повышена, а при 20- и 30- дневном отравлении наблюдается понижени ее активности при всех дозировках. Концентрация Ог'" и эффективность кат ализа с участием СОД находятся в обратной пропорциональной зависимо сти.Следует отметить взаимосвязь концентраций молибдена и меди. И литературных данных известно, что избыточное поступление молибдена организм приводит к недостаточности меди (Ларский Э.Г., 1990, АгШтдк) Л.О. е1 а1., 1996а; АгШтдкт Л.Б. е1 а1., 1996Ь), вследствие антагонизма межд молибденом и медью. Мы полагаем, что дефицит меди в тканях пр: молибденовом токсикозе не может не привести к снижению либо биосит еза медьсодержащей СОД, либо ее акивности, в результате чего наблюдаете интенсификация реакций СРО.

Таблица ■

Активность супероксиддисмутазы в ед.активности на 1 мг белка в печени белых крыс при различных дозах молибдена ( п = 10 )

Дни ис- Дозы молибдена Активность

следова- в мг/кг супероксиддис-

нии мутазы

контроль 25,6±0,3 1

50 20,25 ±0,60'

10 100 18,98±0,33'

300 16,32±0,41'

500 16,00 ±0,26'

50 18,35 ±0,51'

20 100 17,26 ±0,43'

300 15,38 ±0,34'

500 14,17±0,93"

50 15,73 ±0,35'

30 100 14,32±0,28'

300 13,28 ±0,41'

500 12,77 ±0,11'

Примечание: Различия статистически достоверны относительно контроля * - р < 0,001 " - р < 0,01 "* - р < 0,05

Как было отмечено выше, скорость перекисных реакций зависит о активности внутриклеточных ферментных систем, участвующих разложении продуктов ПОЛ (Осипов А.И., 1990). Среди них особая роль при надлежит весьма эффективной глутатионпероксидазной системе. Скорость реакций и сродство к гидроперекисям настолько велики, что она може конкурировать за гидроперекиси НЖК, включенные в цепь радикальное процесса, ведущего к образованию МДА, и, благодаря этому, выступать : роли своеобразного антиоксиданта.

Продукты восстановления перекисей липидов - оксикислоты метаболизируют далее, а окисленный глутатион восстанавливается в СЭН редуктазной реакции. Как показали результаты нашего исследования, н. фоне действия малых доз молибдена наблюдается повышение активности ГГ

[ ГР, а более высоких- понижение. Активирование ГП малыми дозами юлибдена может рассматриваться как проявление компенсаторно-[риспособительной антирадикальной реакции организма, постепенно подавл-емой увеличением дозировки агента с одновременным снижением активно-ти ГП и ГР (рис.4).

Из литературных данных известно, что в крови и тканях животных, битающих в медно-молибденовых провинциях, содержание глутатиона и ровень сульфгидрильных групп уменьшены. В биосинтезе глутатиона немал-важное значение имеет тиолдисульфидный баланс белков, биосинтез оторых осуществляется с помощью таких серосодержащих аминокислот, как ;истеин (Кулинский В.И. и др., 1990, Кулинский В.И. и др., 1993). По-идимому, уменьшение количества сульфгидрильных групп, наблюдаемое при юлибденозе, не может не отразиться на метаболической роли глутатион-ероксидазы, следствием чего является уменьшение активности ГП и ГР при аче высоких доз молибдена.

не. 4. Активность глутатнонперокс11дазы(мкмоль вН глутатиона/мг белка) и глутатнонредуктазы (мкмоль НАДН/мг белка) в печеночной ткани белых крыс в динамике развития молибденового токсикоза.

Результаты проведенных комплексных исследований активности еакций ПОЛ и состояния физиологической антиоксидантной системы в усл-виях повышенного поступления молибдена дают возможность заключить, го интенсификация ПОЛ является обязательным атрибутом при молибден-вом токсикозе. Активация ПОЛ - это неспецифический ответ клетки на юбое экстремальное воздействие, компонент пускового механизма ерестройки метаболизма в неблагоприятной ситуации.

Причиной активации ПОЛ может быть усиление активности систем, энерирующих липоперекиси, повышение содержания инициаторов и су-стратов перекисного окисления, снижение уровня биоантиоксидантов, а акже активности антирадикальных ферментов, что влечет за собой развитие индрома пероксидации и перекисного повреждения клеточных мембран.

3. Влияние молибдена на процессы гидроксилирования и содержание цитохромов Ь, и Р-450 в микросомальной фракции печеночной ткуани.

В эндоплазматическом ретикулуме печени человека и животных локализована монооксигеназная система, которая выполняет защитную функцию, окисляя гидрофобные субстраты эндогенного происхождения и попавшие в организм чужеродные соединения- ксенобиотики. Известно, что процесс гидроксилирования протекает при участии НАДФН-специфического флавопротеида, цитохромов и Р-450.

В настоящей серии наших исследований в печени был изучен процесс гидроксилирования субстрата II типа- анилина при повышенных концентрациях молибдена. Как видно из результатов (табл.5), при молибденовом токсикозе изучаемый процесс протекает значительно медленнее, чем у интактных крыс, причем это замедление зависит как от дозы, так и от длительности экспозиции организма к повышенному уровню молибдена (рис. 4). Так, при 10-дневном отравлении при дозе 500 мг/кг гидроксилирование анилина, определяемое по образованию парааминофенола, составило 3,13 ± 0,28 нмоль, а при 30-дневном отравлении- уже 2,30 ±0,18 нмоль, т.е. в печени при молибденовом токсикозе обезвреживание анилина замедляется и часть токсического продукта поступает в кровь.

Мы уже упоминали о функциональном значении цитохрома Р-450, выполняющего роль фермента, связывающего субстрат и активирующего молекулу кислорода. Согласно полученным результатам (табл.5), молибденовый токсикоз характеризуется уменьшением в микросомальной фракции печеночной ткани содержания цитохрома Р-450.

Таблица 5

Определение скорости реакции п - гидроксилирования анилина ( в нмоль в 1 мин. на1 мг белка ) и содержание цитохромов Р-450 и Ь5 (нмоль/мг белка) в микросомальной фракции печени белых крыс при действии различных

дозах молибдена ( п = 10 )

Дни исследован Дозы молибдена в мг/кг Гид. анилина Р - 450 ь3

Контроль 5,92±0,33 0.98±0,06 0.56±0.02

50 4,53 ±0,25 0,73 ±0,05 0,52±0,04

10 100 4,28±0,40 0,62±0,04" 0,48±0,03

300 3,33±0,41" 0,55±0,05' 0,42±0,03"

500 3,13±0,28' 0,43±0,02' 0,38±0,04'

50 4,13±0,23" 0,68±0,04" 0,40±0,011'

20 100 3,52±0,18' 0,55±0,05" 0,36 ±0,023'

300 2,93 ±0,25"' 0,48 ±0,02' 0,32 ±0,028'

500 2,56±0,18" 0,43 ±0,06' 0,31 ±0,030'

50 3,52 ±0,30' 0,61 ±0,03' 0,40 ±0,02'

30 100 3,43±0,2Г 0,53 ±0,01' 0,38 ±0,018'

300 2,40±0,13' 0,45±0,02' 0,35±0,03'

500 2,30 ±0,18' 0,43 ±0,03' 0,32±0,04'

Примечание: Различия статистически достоверны относительно контроля * - р < 0,001 ** - р < 0,01 "* - р < 0,05

Дозозависимое уменьшение цитохрома Р-450 наблюдается во все изученные сроки. При увеличении дозы и длительности поступления молибдена в организм происходит прогрессивное снижение его содержания в печени. Так, в норме концентрация Р-450 составляет 0,98 ± 0,06 нмоль/мг белка, а при дозе 500 мг/кг и длительности затравки 30-дней содержание цитохрома равно 0,43 нмоль, т.е. происходит двукратное уменьшение.

Согласно результатам наших исследований, при молибденовом токсикозе имеет место убыль содержания цитохрома Ь5.. Это изменение зависит от дозы и длительности поступления в организм молибдена (рис.5).

Рис. 5 Содержание цитохромов Ь5 и Р - 450 в микросомальной фракции

печеночной ткани белых крыс в норме и при воздействии молибдена (доза ЗООмг/кг).

Из литературных данных известно, что существует взаимосвязь между изменением содержания цитохрома Р-450 и содержанием ФХ в микросомах печени (Бурлакова Е.Б., 1981) наблюдаются изменения количества и активности фермента, связанные с уменьшением содержания данного липида.

Наши исследования показали, что при молибденозе наблюдается уменьшение ФХ с параллельным повышением ЛФХ. По-видимому, уменьшение количества ФХ в микросомах печени может быть причиной уменьшения данного гемопротеида.

Стимулирование процессов ПОЛ при изученной патологии со значительным выходом продуктов СРО липидов оказывает свое повреждающее действие на мембраны эндоплазматического ретикулума и,

главным образом, на активность мембраносвязанных цитохромов Р-450 и Ь^. Изменения активности цитохрома Р-450 при СРО липидов могут иметь место как вследствие деструктивного нарушения, так и конверсии его в неактивную форму Р-420, обусловленную сдвигами в липидном окружении гема.

Мы надеемся, что предпринятое нами исследование в направлении изучения молекулярных механизмов развития интоксикаций различного происхождения послужит делу дальнейшего совершенствования поисков новых, более эффективных путей по предотвращению, нивелированию и нормализации последствий изученных токсикозов.

ВЫВОДЫ

1. Отравления молибденом сопровождаются интенсификицией реакций деацилирования мембрансвязанных ФЛ, с выходом высоких концентраций ЛФХ, как результат возрастания активности фосфолипазы А7

2. Патогенетические проявления токсического действия молибдена на уровне ЭМ характеризуются глубиной развивающихся в них нарушений филогенетически стабилизированного постоянства фосфолипид-фосфолипидных взаимоотношений.

3. Молибденовый токсикоз характеризуется увеличением содержания насыщенных ЖК с параллельным уменьшением их ненасыщенных представителей в общей сумме неэстерифицироанных ЖК в печени, что свидетельствует о чувствительности стимуляции фосфолипазы Л2.

4. Молибденовая интоксикация сопровождается активированием свободнорадикальных процессов в исследованных клеточных образованиях, как в ферментативной, так и в неферментативной системах окисления, глубина сдвигов которых зависит от дозы и длительности затравки молибденом.

5. С увеличением количества задаваемого молибдена и продолжительности его поступления в организм понижается активность супероксидди-смутазы, в результате истощения ее содержания при дефиците меди, необходимой для биосинтеза медьсодержащих СОД.

6. На фоне действия малых доз молибдена наблюдается повышение активностей ГП и ГР, а более высоких (300-500 мг/кг)- понижение.

7. Молекулярные механизмы токсических эффектов молибдена обусловлены его дозозависимым воздействием на процессы гидроксилирования, сопровождающимся снижением содержания цитохромов Ь5 и Р-450.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЗП - аскорбатзависимое перекисное окисление

ГП - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ЖК - жирная кислота

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

МДА - малоновый диальдегид

МТ - молибденовый токсикоз

МФИ - монофосфоинозитид

МЭ - микроэлемент

НЖК - насыщенные жирные кислоты

НЭП - НАДФН-зависимое перекисное окисление липидов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СФМ - сфингомиелин

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ЭМ - эритроцитарные мембраны

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захарян Г.В. Перекисное окисление липидов и генерация супероксид-аниона в крови при различных введениях молибдена. // Тезисы докладов V Всесоюз.съезда Армянского физиологического общества. Ереван. -1994. - С.40-41.

2. Григорян М.С., Захарян Г.В. Влияние молибдена на процессы перекисного окисления липидов и обмен фосфолипидов. // "Эксперемент-альная и клиническая медецина." Ереван. - 1994. - T.XXXIV, - №3. - С.71-78.

3. Мелконян М.М., Захарян Г.В., Меликян Т.Р., Авакян Э.А. Изучение процессов гидроксилирования в микросомальной фракции печени при введении молибдена. // Материалы 70-й научной конференции ЕрГМИ им.М.Гераци. Ереван. - 1997. - С.23.

4. Захарян Г.В., Мелконян М.М., Карагезян К.Г. Действие молибдена на процесс перекисного окисления липидов, активность антиокислительных ферментов и метаболизм фосфолипидов. // Биологический журнал Армении. Ереван. - 1997. - Т.50, - №3-4. - С. 161-165.

5. Захарян Г.В. Фосфолипидный состав митохондриальной и микросомальной фракции печени белых крыс при молибденовом токсикозе. // Материалы юбилейной конференци, посвященной 50-летию основания СНО ЕрГМУ. Ереван. - 1998. - С.33-34.

6. Захарян Г.В., Мелконян М.М., Э.А.Авакян Изучение микросомальной монооксидазной системы печени белых крыс при молибденовом токсикозе. // В сб.: Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медецины. -1998. - С.444-450.

7. Карагезян К.Г., Овсепян Л.М., Захарян Г.В., Карагезян М.К. Изучение активности антиокислительных ферментов при различных введениях молибдена. // Вопросы мед. химии, (в печати).

idmpmij gmp6mbdmb i|dqgdfiudlimgpi]4 gmidiugçmmnjm ijbuhi|nffum gi|ímgqlidi|1up lmgmnijtimij apijij gmf]mnqui gq Luümh Qdqglmftiui gmhmdmdmpdi^ ргтфбттп :dpmpbm]ig gmfdiufimgiudmhi ost' -d 4 SQ dqgpud3uuiiJ6 gq piujißhqlnu tfgudu 'piupligö ijlqmmfig i|üqggiuídiubmUm ijdqgmijöhmqu gmpßmlijnaodliijij piuimijßtimdt gi|fmpunudhi|p ijldmíl çmlidui q 6íiu6 fiuhmgijdo gmpßmijijnffo iJgiJUJgm .uimdmndiun ijbUmh tdudfidq :piupfigO gmrdiu]ii)ui(im bmiii|n3odqhigui]dmmiulb 4 bmuifiiuijqiigui|dmunu1b 'bmimupnLjlilJiJnffodqhnun ijdqgmgqjidqct gmfdiugmlnmZmhi

дфггЛтЬфтгштЬтц i|53d img } piu]iirimtn. :piudqbdmhmpmi) lmfn|mli-HdQVN I} nqhigfm '-uimdduhnm nqtn?gij 'piu6m]iijmhm i|dqgnq6udln gmp6miJi|n<îodqb i|dqgiii|lr>i¡1 i|tmi]6limil(fc gi|fmpunudh|t|p i^iidmü чтд э çmfidqdmginimt :dpmp6m?3 ijdqgiuddmhidmp çm6qbmq? 4 dpmp6mlq]im ijtimgm? ijdqgiuddmhidmp pmßqbmq 1 piu]i5tiqlnu дйи 'дшМшффиф i|pbmh| gi]imjiddmtïidmsi i|dqgtJi|tm|"!u4nu<t Iqfidin } 6fiu6 prnbgm giJSmun :piu6mlq]im ijdqggijhii|luijljdmh n ijdqggi|1un|lijlji|mm(tu(tubi|l gq piu]immlig timgmpmpmi|n :piudqginqhpmp dulud gmidiuinubminqq üpiunmtimhi iJUqggiufdiutimgmï i|dqggijpmlugmdilijlji)inm(tnu(t 'L|dqggiJdqnTiJlJiJuim<tnu<t .5 gím 'L|iJqQtiL|hiL|luttnuct Luhmgiudmfn üqgiuddmhidmp ijmßqbmq? 3 çm]ibdmib :dqggnifdiun|i^i^ ijpbmh gijfmliddmhidmp ßgmdg 1 gmfdiutimgiudmfti gmlimtimgma' i|dqgtnjlni("lu<tnuct Iqjirn gq 6iiu6 Odqgffgiuftidm Jdqggiufdiumubminqq çm]idmmmh| iumgmmhi дтрбтЗтит iJdqgpiuUmqmmnJm Imguijnqctudtn 4 ijdqQgnjfdiutigmîiilq ЬЦРЧ^аД Zudu lmgmnijligmq I Ijudmf] mil hrnj 'dpmfdiulimgiuümhi i|gqiidi|lup gq mmudmqdqb Qdqbdmp Zudu ijdu dmpmq gmfdiuuiqhimdgniq dqp 1 gmfimt|lidm gmhmjimd gip :ögmfdiudi|nmgpiurnu jmídiulimgmnji^ i]dqgljijfnijlu<tnu<t i i|dqgnq6udfri gmp6mlJi|nïo piudqggmpímhi jmpçiupdqg ijdqggiuidiuhmgmî dqddmm iJgqljdiJIup 3 çm]idi|]ig DîgminmnJZn

Л -ill Ф U Ф Л П

0Z