Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистохимические и морфофункциональные исследования микроциркуляторного русла животных в норме и под влиянием молибдена

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Гистохимические и морфофункциональные исследования микроциркуляторного русла животных в норме и под влиянием молибдена"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. акад. Л. А. ОРБЕЛИ

\

На правах рукописи

МАРКАРЯН НАИРА ВАСИЛЬЕВНА

ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА животных В НОРМЕ И ПОД ВЛИЯНИЕМ МОЛИБДЕНА

С О О . 5

(<^.00.09 — Физиология человек;) и животных)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН —1 996

Работа выполнена в лаборатории гистохимии и нейроморфологии Института физиологии им. акад. J1. А. Орбели HAH Республики Армения и на кафедре физиологии, патофизиологии и радиобиологии АСХА.

Научные руководители: Доктор биологических наук,

профессор А. М. ЧИЛИНГАРЯН

Заслуженный деятель науки, доктор ветеринарных наук, академик АСХН РА, профессор М. С. ГРИГОРЯН

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор С. А. СИСАКЯН

Доктор биологических наук, профессор Р. А. АРУТЮНЯН

Ведущая организация: Ереванский государственный университет

Защита диссертации состоится « J » /,_<996 г. в « »

часов на заседании Специализированного совета 023 при Институте физиологии им. акад. Л. А. Орбели HAH РА (375028, Ереван, ул. бр. Орбели, 22, тел. 27-04-41, факс 7 (8852) 27-22-17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. акад. Л. А. Орбели HAH РА.

'—V

Автореферат разослан «

30

» ¡///f 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

Э. Г. КОСТАНЯН

¿USUUSUlih ¿ULPU4)bSnhí»5Ub ЯГ'БПГ^ЗПГЧ/ЬЬРГ' US4U5hL иШПЫ/МА ¿МПШСЧПи L. u. OPPtLflh 1АЪ4. ФГ>амиП<*ПЦЗЬ hbUShSnhS

тлподрзиъ гиьри. 4W.liмг»

wbau/bKubpi* орчл^ив^ич^рпвър^пнзар

дзпмн1ши.4>мл*или.ъ ъч ©О^П&ПКЪ^ЗиПЪШ. ¿bsugnsni^ermviibPC РШШЪПЪПМГ пи irni.Wi№bb Ц.ДП.ЬвПМЭ'ЗиЛ, ЪЬРАП

Ч-. 00. 09 — и'ифгути и. l|hQt|matiGhp}i ф^д^трч^ш

МЬПи"шрш0ш1(1иС qfimnipjni-GGbpfi рЬЦСшЬпф c^mu^iuG uiuinfi6ujG[i ñujjgJuiG uiuibGuJ¡unutuj3¡uiG

utaira«^ п

tPMUL — 1996

U2|uuimuiGj3p 1|Шшшр14Ь[ t iul)iur}bilj"iljnu L- U- ОррЬри luGiJuiG $tiq|ininqjiujj!i (1Сшл|илтлгф ñfiumnp|iil|iiuj|i U СЬ]рт1прф|цг^|1Шф [шрпршшпр^ш^и! U ¿Ч-SU ф^гцг^иц^, iu[uinujpmGiu4ujG ф^^псфшф U пш^п^ЬйишршОп^шС uulp(in-Gnul

qjwiiuljuiG цЬЦшфирСЬр'' 4bGuiupiuGuil)iuG qtimnLpiniGGbpli rçnljinnp,

ЧрпфЬипр L U- ЭММЛиРбиЪ

Ç|iinm,p]UJG 1{шитш1|шф1р q.npdfi¿, uiQiuuGuipiuchtJljuiG qfiinni.pjm.GGbpíi rjnljmnp, Z.4SU uiljuirçbilfiljnu, щрпфЬипр Ц. U. ЧПМПРвиЪ

'Hu^mnGiuliiuG QGiyituIiulunuGbp' Ptf£ljUil|ujG q(iu-irup[iuGGbp|n г>п1цппр,

щрпфЬипр U. U. Ur4IU43UL

4bGuuipuiQiul)UiG qtiinnL|»jriLGGbp|i r^nljuinp

шрпфЬипр а. и. ¿иппгчазпм,биъ

иаш2.шшищ 4uiqiívu4hpu|ru.p¡ni.Gv tpUuiGf\ щЬтшЦшй «íuuIiuiuiupuiG

*Tliu2i')i4UiGm,pini.G[i ЦицшСи^т. t4 « » 1996 р.

à. LL 4-Uli-|i ш1|шп.Ьй|1^пи L. U. Oppbi.nL uiGij- hG*Jtrií1Lrlril-ulh

(375028, fcpUuiG, ОррЬф trip. фгщ. 22), 023 duiuGiuq|iimu^uiG (unpfiprj-h ЭД-шифГ,

UinbGiu|ununi.piujG[! ЦшрЬф t iruiGnpiuGuJi LL ^UU-fi ш^шг^ЬСфЦпи L. U,. Op-pb^nL uiG4- ФЬЧ11П1ПЧ11Ш1|'1 bGuwJivnntinJi qpuiquipuiGruii

Ubr]iIiuqfipQ шпшр^шй t « » 1996 p.

lfiuuGuiq|imuJl{uiG (unplpttfi q|imtul{UiG ршртпщшр, l|bGuiupuiGiul)iuG q(iinnipjm.GGbpf) f»bl(GiuímL / t- Ч-. 4flUSUl.3UL

О Г) III Л и X Л Р Л KT [• I > И CT 1! К Л Р Л БОГ IЛ

Актуальность проблемы. Среди современных медико-био-

логпчсскпх паук макроцнркуляцня по праву занимает одно из ведущих мест. Актуальность этой проблемы определяется ее научной и практической значимостью, ибо микроциркулятор-',юе русло (АЩР) является тем отделом сердечно-сосудистой системы, где реализуется ее транспортная функция и обеспечивается транскагптллярный обмен. Микроциркуляция охватывает множество взаимосвязанных процессов, среди которых наиболее важные — это закономерности циркуляции крови и лимфы, состояния клеток крови, свертывания крови, транска-шллярио! о обмена и особенности миирососудо« i: Фи.чиологи-ч'снич условиях и при различав патологиях. О г успешной ;»а.фа'>отки vioi; фуида мент ал ыгои проблемы в зиачителыгой лете даписит решение ряда ьоиросоя ир.штическон мелки шш.

i'i an с гоншео время мнкроциркуля' при а'-; систем;; нитон .»пшо н.<\ чао гея различными методами, каждый нч которых • ;меС'Т слои преимущества, недопагкн и ограничении.

Наряду с общепрш'итммн .'иомнкрм'коиичее/кчк (Clark. :938; Zweifach, 193-1, ¡973; Jllip;, Ifijl; Селезнеи и со.шт., 1966—1976; Чернух и соавт., 1972, 1984; Козлов и соавт., 1982; Таточопко •гоптгг, 1986: Мчедлншпили, 1989. 1994; Голубь. .991. 1993 к др.) и н!!ы.\;н!к»!п!ы\!;! (Сг;ш.:н\ 1938; Pov.eiV, i053; Беков, 1965; Джавахашшиш и еиаит., 1082; Minaniika-wa, 1987) методами исследования, для изучения внутриорган-ного МЦР важное значение имеют гистоангнологические методы, основанные, на выявлении МЦР за счет окраски струк-■"У[)|'ых олемепгов сосудист« сгсчкч. К ним относится методы •требрнкой импрегнации Клосонсиою {1951), которыми изучаются сосуды мозга без дифференциации различии* звеньев "v'UlP п Куприянова (1965), позволяющие идеитифшшрочать различные виды сосудов на прозрачных оболочках и поверхностных участках органов.

Для исследования органного МЦР несомненный интерес

представляют методы определения активности специфических фосфатаз (Gomori, 1939; Wolf, 1943; Bell и Scarrowt, 1984), в том числе, гистохимическое выявление АТФ-ой активности, при помощи которых окрашиваются элементы гладкомышеч-ных клеток артериальных сосудов и обеспечивается диффе-ренцировка различных типов сосудов (Tarach, 1978), однако недостаток его в том, что происходит почернение фона даже на срезах толщиной 15—20 мкм.

В лаборатории гистохимии и нейроморфологии Института физиологии им. Л. А. Орбели HAH РА А. М. Чилингаря-ном (1968, 1977, 1986) были разработаны новые методы на основе осаждения клеточного и неорганического фосфора. При этом на толстых срезах (до 500 мкм) фиксированного материала весьма четко и контрастно выявляется архитектоника МДР мозга и других органов в трехмерном своем расположении с дифференциацией всех сосудов. Они избирательно окрашиваются за счет гидролиза нуклеозидфосфатов под действием бивалентных металлов (Ca). Благодаря установленному автором механизму и закономерностям преципитации фосфора и стандартизации различных стадий обработки ткани и срезов удалось разработать методические подходы, которые были названы гистоангиологическими, так как выявление МЦР происходит за счет непосредственной окраски эндотелия сосудов и гладкомышечных клеток артериального звена. Разработка новых гистоангиологических безынъекционных методов создала реальную базу для изучения вопросов, которые практически неразрешимы при исследовании нормального и патологического материала ни биомикроскопически, ни инъ-екционно. С помощью этих методов получены новые данные о морфофункциональных особенностях МЦР разных органов у человека, кошек и крыс (Чилингарян, 1968—1995; Сисакян, 1967—1985; Мелконян, 1986—1995). Сравнительные филогенетические исследования позволили установить значительные различия физико-химических свойств сосудов различных органов у разных видов животных. Однако при изучении МЦР кроликов и морских свинок не удалось получить равномерную сосудисто-капиллярную сеть с помощью этих АТФ-ых методов. Это побудило нас предпринять новые исследования для выяснения генеза неудовлетворительных результатов в отношении органного МЦР этих животных. По-видимому в зависимости от вида животного необходимо вводить определенные изменения в методические подходы, которые в конечном итоге обеспечивали бы четкое выявление МЦР. 4

Известно, что на состояние органного МЦР оказывают влияние многие факторы, в том числе реактивность и резистентность организма. По данным Петровой, Маркосян.-j (1969), Лукашнпа (1982) одним из объективных показателе-,' реактивности, резистентности и состояния микроциркуляцин может служить состояние гепаринообразователыюй системы, которой в последнее -время придают большое значение п механизма* защптно-приспособительних реакций. Основное фи ■шологнческое значение гепарина состоит в регулирующее влиянии на трофическую функцию капилляро-соединительно-тканных структур и процессы транскапиллярного обмена (Казпачсгв, i960, 1965; Дзизнаский, 1970, Петрова, 197S ь др.). Гепарин образует комплексы с белками, аминами, ферментами, гормонами и, тем самым, выполняет существенную роль в сохранении гомеостаза (Engelberg, 1963, 1969; Lingal, 1966; Исабаев и соавт., 1973; Черная, 1973; Карташов, 1980, Григорян и соавт., 1986, 1987, 1994; Лукашин, 1994).

В свете изложенного в настоящей работе нами были избраны два аспекта исследований: первый — состоял в гистохимическом выявлении органного МЦР у лабораторных жк-яотньг. бсмынъекционным Ca- ДТФ-ым методом Чнлннгар;-

h;i i: норме и при патологии; второй.....-в изучении некоторь-'--

физики-химических показателен крови, одновременно характс рн.чующ;-ч реактивное!.>, резистентность организма п состой нпо сосудисто-капиллярной сети в эксперименте у лабораторных животных под влиянием различных количеств молибдена и его сочетания с медью, а также у овец молибденовой и мед-но-молибденовой бпогеохимических провинции Армении (ПГХП). С -mix позиций проведение гистохимических и мор-фофизиологических исследований у лабораторных и сельскохозяйственных животных весьма актуально, так как позволит расширить представления о механизмах микроциркуляции в норме и патологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в контрастном и четком выявлении органного МЦР кроликов и морских свинок безынъекционным гистохимическим Са-АТФ-ым методом Чилингаряна, изучении мнкрососудистой сети, морфометрическом исследовании капилляров, некоторых показателей реактивности в норме и под влиянием молибдена.

В соответствии с поставленной целью нами сформулированы следующие основные задачи:

1. Апробировать новый безынъекционный гистрхимичес-кий Са-АТФ-ый метод Чилингаряна (1986) для выявления

органного МЦР кроликов и морских свинок. Провести поисковые исследования для получения истинной картины сосудисто-капиллярной сети.

2. Разработать новый вариант Са-АТФ-ого метода для выявления органного МЦР и получения постоянно воспроизводимых результатов на толстых срезах фиксированного материала кроликов и морских свинок.

3. Изучить состояние микрососудистого русла в норме и при молибденовой интоксикации у крыс и провести количественную оценку диаметра капилляров морфометрией.

4. Выяснить роль гепарина и тучных клеток в состоянии микроциркуляции, реактивности и резистентности организма в норме и под влиянием молибдена.

5. Изучить некоторые морфофункциональные и патолого-анатомические изменения у лабораторных животных, получавших избыточные количества молибдена и сочетания его с медью, а также у овец, обитающих в молибденовой и медно-молибденовой БГХП.

Научная новизна. Нами видоизменен гистохимический безынъекционный Са-АТФ-ый метод Чилингаряна, который впервые позволил выявить МЦР органов и тканей кроликов и морских свинок. Нами установлены оптимальные условия действия нового варианта инкубационной смеси, дающие возможность контрастно и одновременно выявить все звенья МЦР на толстых срезах изучаемых органов этих животных. При помощи указанного метода улавливаются малейшие сдвиги диаметра капилляров при различных функциональных состояниях организма. Выявлены в сравнительном аспекте отличия в реакции преципитации стенок сосудов разных органов у всех изучаемых животных.

Впервые исследовано состояние МЦР при молибденовой интоксикации животных. Показано, что при избыточном поступлении молибдена в организм животных происходит перестройка факторов реактивности и резистентности, оказывающая существенное влияние на реактивность сосудисто-капиллярной сети и, как следствие этого, развивается синдром ка-пилляротрофической недостаточности, играющий важную роль в генезе молибденового токсикоза.

Научно-практическое значение работы. Полученные новые гистохимические и морфофизиологические данные состояния органного МЦР в норме и при патологии у лабораторных и сельскохозяйственных животных позволят обогатить учение о микроциркуляции и могут быть включены в программу пре-

б

подавашгл курсов гистологии, матанатомнн, физиологии, патофизиологии и др.

Видоизмененный нами гнсточимнчоский бсзынъекпнонный Са-ДТФ-ый метод для иыявлетш органного МЦР лабораторных животных рекомендуем использовать в научных ц клинических исследованиях для выяснения морфофункцнональ-•юго состояния сосудисто-капиллярной сети в норме и патологии.

Па основании полученных результатов считаем .¡о.чмож-ным рекомендовать определение уровня гепарина крови и состояния тучных клеток в качестве показателей микродир-лулиша: а резистентности.

Гепарин можно использовать для коррекция нарушении микроциркуляции и транскапнллярного обмена.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на — Межвузовских студенческих научных конференциях (Ереван, 1984, 1985; Каунас, 1984, 1986); —IV и V съездах Армянского физиологического общества (Ереван, 1987, 1994); — X Всесоюзной конференции но проблеме микроэлементов и их применении в сельском хозяйстве и медицине ■'Чебоксары, 1986); — III Республиканской конференции ас-жирантов Арм. ССР (Ереван, 1989); — Ученом совете ипстн-.ута физиологии им. Л. Л. Орбели (Ереван, 1989, 1990); —11 всероссийской конференции «Молекулярные и клеточные ос-поьы кислотно-щелочного и гемпературного гомеиегила* (Сыктывкар, ¡994); — заседании лаборатории гистохимии и чеГпюморфологни Института физиологии им. Л. А. Орбели (Ереван, 19S9, 1996).

Публикации. ГТо теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, об-юрн литературы, материала и методов исследовании, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и рекомендаций. Работа содержит 2 схемы исследований, иллюстрирована .6 таблицами, 72 рисунками, микрофотографиями, диаграммами. Библиография включает 314 источников.

Во «Введении» обоснованы актуальность, цель, .-;адг'г% •üüiinaa. иаучио-пракпптсское значение результатов псслсдо-

"ПТИТП.

1. Обзор литературы представлен 4 подтипами, в которых с привлечением большого количества литературных источников изложены современные методы изучения микроцпр-куляции, проведен анализ литературных данных о роли гепа-.

рина и некоторых физико-химических показателей крови в реактивности и микроциркуляции, представлены сведения о влиянии молибдена на животный организм.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объектом исследований служили кролики (24), морские свинки (22), крысы (50) и овцы (240), подобранные по принципу аналогов.

Исследования проводились в условиях острых и хронических экспериментов. Материалом служили следующие органы и ткани: большие полушария мозга, твердая мозговая оболочка, миокард, почки, печень, селезенка, скелетная мышечная ткань и кровь. -

В работе использованы гистохимические, морфологические, морфометрические, физиологические и патолого-анатоми-ческие методы исследования.

Гистохимические методы. Выявление МЦР больших полушарий мозга, твердой мозговой оболочки, миокарда и скелетной мышечной ткани кроликов, морских свинок и крыс проводили безынъекционным гистохимическим Са-АТФ-ым методом Чилингаряна (1986) и видоизмененным нами Са-АТФ-ым методом.

После декапнтации животных быстро извлекали исследуемые органы, разрезали на кусочки толщиной 1 —1,5 см и фиксировали в 5% нейтральном формалине при 4°С в течение 3, 24, 48 часов. Оболочки извлекали по возможности целиком и фиксировали тотально. Из кусочков готовили замороженные срезы следующей толщины: большие полушария — 150 мкм, миокард — 60 мкм, мышцы—120 мкм. Все срезы собирали в физиологический раствор.

Первый метод. Са-АТФ-ый метод Чилингаряна (1986).

1. Срезы и оболочки помещали в инкубационную смесь следующего состава: 2 мл 6 Н аммиака-}-4 мл дистилл. воды-f-1 мл 0,1 М хлористого кальция+1 мл раствора АТФ (5 мг/мл). Объем смеси доводили дистилл. водой до 10 мл. Использовалась аденозин—5—-трифосфорная к-та (динатрневая соль) фирмы Reanal. Инкубация длилась 1—2 часа.

2. Промывка в двух сменах дистилл. воды 2—5 мин.

3. Перенос срезов в замещающую свинцовую смесь на 30 мин, приготовленную следующим образом: к 86 мл дистилл. воды+5 мл 1 Н ацетатного буфера (рН 6,2) + 10 мл 1 Н раствора уксуснокислого аммония4-2 г химически чистого уксус-

нокислого свинца. Раствор можно использовать многократно п долговременно.

■1. Промывка в двух сменах днегилл. поды 10 мин.

5. Обработка 20% раствором уксуснокислого аммония от нескольких секунд до 1 часа в зависимости от сроков инкубации, толщины срезов и органов.

0. Промывка в двух сменах дистилл. воды 5—10 мин.

7. Погружение в ап/о раствор сернистого натрия на 5 мин и более.

8. Промывка в дистилл. воде.

.Члк.чмчение в глицерин-желатин.

Второй метод. Видоизмененный нами Са-АТФ-ый метод.

Видоизменения состояли в апробировании одиннадцати вариантов инкубационных смесей, в которых мы изменяли количество растворов АТФ и хлористого кальция, концентрацию растворов аммиака. Нами также изменялись сроки обработки срезов инкубационной смесыо, свинцовой смесью и уксуснокислым аммонием. В диссертации описаны все одиннадцать вариантов инкубационных смесей. Приводим состав наи-г-о.'нч- »'Ч'тнмального и:« чих:

мл 411 аммиака+4 мл НаО+2 мл АТФ г2 мл 0.1 Д\ СаС1,.

Сш-тоянне органного АЩР крыс в норме и при молнбде-питчжсикацин изучали первым метолом. Животных разделили на группы: 1 -- задавали водные растворы молибде-: Iя натрия в больших количествах • 50«) мг/кг /к.ч расчета »••а чистый молибден) рег о» при иоу.оиш желудочного зонда ¡. гечеиие 2 -4 дней; 11 100 мг/кг в течение 15 дней.

Вскрытие проводили по общепринятым правилам (Жиров и соавт., 1982). Органы извлекали и помещали в 12% •Лормалчп . Iл я фпкеатппт.

Морфологическую картину овалов и акаиен научали методом приготовления парафиновых срезов (Меркулов, 1909). Препараты окрашивали гематоксилин-эозином.

Для выявления тучных клеток парафиновые срезы окра-•л и ¡»л ли кислым раствором толуидинового синего (Ромейс,

'Аорфометрмчсскис исследопакия мпкрссосудов проводили ■•«мереинем диаметра капилляров микрометром винтовым окуляром (Ок. х 15, Об. х 40). Для получения достоверных данных исследовали 150 полей зрения.

Физиологические исследования. В природных условиях наблюдения проведены на овцах Анкаванской молибденовой и Каджаранской медно-молибденовой БГХГ1, в среде которых

соотношение молибдена к меди соответственно равны Мо : Си =5: 1 и Мо:Си=1 :2,5 по картограммам биогеохимической лаборатории института им. Вернадского (Ковальский и соавт., 1976, 1978, 1985).

Состояние реактивности и резистентности под влиянием молибдена изучали в эксперименте у кроликов, морских свинок и крыс, получавших различные количества молибдена, а также сочетания молибдена и меди, соответствующие содержанию этих элементов в укосах трав произрастающих в указанных БГХП.

Изучали статус контрольных и подопытных животных, показатели гуморальной защиты, некоторые физико-химические показатели крови. Вязкость крови определяли вискозиметром, время свертывания крови по Милони, гематокритный показатель с помощью гематокрита (Предтеченский, 1960).

Определение содержания эндогенного гепарина (свободного) в плазме крови проводили по методу Сирмаи (1957) с применением тромбина и толуидиновой сини, учитывая время свертывания плазмы крови в секундах (Кост, 1975).

Содержание общего белка в сыворотке крови определяли рефрактометром РЛУ и использовали таблицу Рейса (Предтеченский, 1960).

Цифровой материал статистически обработан методом Ойвина, используя критерии Стыодента. Различия средних значений принимались статистически достоверными при Р^С 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Гистохимическое выявление МЦР орган«« кроликов и морских свинок безынъекционным Са-АТФ-ым методом Чк-лингаряна. В результате использования Са-АТФ-ого метода Чилингаряна на органах кроликов и морских свинок нам не удалось выявить четкой, контрастной и равномерной сосудисто-капиллярной сети на прозрачном фоне, как это было получено на тех же органах человека, кошек и крыс (Чилиига-рян, 1986, 1987, 1991).

Поэтому ставилась задача по изысканию новых вариантов инкубационных смесей, изменения сроков обработки срезов и других факторов для получения постоянно воспроизводимых результатов на толстых срезах фиксированного материала у кроликов и морских свинок. 10

3.2. Видоизмененный вариант инкубационной смеси Са-

ЛТФ-оп) метода для выявления МЦР органов кроликов и морских свинок.

Для избирательного выявления и повышения элективно-сти окраски сосудисто-капиллярной сети больших полушарий мозга, твердой мозговой оболочки, миокарда и скелетной мышечной ткани у кроликов и морских свинок но ходу эксперт! ментов нам удалось установить оптимальные условия нреци цитации. Нами было поставлено большое количество экспе-лутгм изменения условий постановки Са-АТФ-ого метода па разных его этапах. 'Гак, в частности, увеличивал:: пли уменьшали количество ингредиентов н концентрацию растворов, входящих в состав инкубационной смеси, изменяли сроки инкубации, обработки срезов свинцовой смесыо и уксуснокислым аммонием.

При выявлении МЦР больших полушарий мозга кролика мы установили, что непрерывная сосудисто-капиллярная сеть выявляется при инкубации срезов 2,5—4 ч, обработке свинцовой смесью 45—ВО мин и уксуснокислым аммонием 0,5—5 ч. При »том на срезах четко выступаю! зсе звенья МЦР «а прозрачном фоне. У крольчат картину МЦР мола новым методом ¡-.'.г,шляется также, как. и у половозрелых, однако об-лар^жткптся ноные капилляры на разные стадиях развг-тпа. Па с ре..: ах четко видно, как па стсз.ке фупкпионирую'.него ка.шл.юфз образуется утолщен.не п вид'' конуса (стадия «П''чкь.'>;. иногда и;> одном капилляре видно двустороннее но'-'лова.чне. Аналогичную картину МЦР наблюдали па среза-: АЮога морских свинок, однако осаждение продукта реакция на стенках сосудов происходит быстрее, чем у кроликов: инку" ация длится 0,5 -I ч, обработка срглог, сг.птщово«* смесью

И': - (.¡О N',11(1 И УКСУСНОКИСЛЫМ ЗКМОШ1СУ. ДО 1 >».

При выявлении МЦР твердой моагоиой оболочки у кроликов все звенья сосудисто-капиллярной сети четко выявляются на прозрачном фоне при инкубации срезов 2—4 ч, обработке ; шиповой смссьто 1 -1,5 т тг V кеу с ц о ч иг л ы м аммонием

бо,->ее о ми:;. Местами видно об|>.т:о:юигк: дпух капилляру:; • ; резулыате дихотомического разделения; исходного капилляра Венудярман часть имеет сложное троение -• несколько кос; каппллярных пенул вливаются широкие венозные бассейнгд или лакуны. Такая же картина наблюдалась на твердой мозговой оболочке морских свинок при инкубации 0,5—2 ч, обработке свинцовой смесыо 0,5—1 ч и уксуснокислым аммонием 5—50 мин.

При выявлении МЦР миокарда у кроликов избирательная преципитация продукта реакции на стенках сосудов и капилляров происходит при инкубации срезов в течение 6—8 ч, обработке свинцовой смесью — 6 ч и уксуснокислым аммонием 0,5—3 ч. Наиболее быстро преципитация наблюдается в глад-комышечных клетках артериальных сосудов. Венозные сосуды окрашены в светлокоричневый цвет за счет мелкозернистого осадка. Артериолы разветвляясь образуют плотную и четкую капиллярную сеть, которая выделяется гомогенночерной или коричневой окраской. На срезах миокарда морских свинок реакция преципитации ускорена, — инкубация 1,5—3 ч, обработка свинцовой смесью 2—3 ч, уксусно-кислым аммонием 5—30 мин.

При выявлении МЦР скелетной мышцы кролика нами установлены сроки инкубации срезов 8—12 ч, обработки свинцовой смесью б—10 ч и уксуснокислым аммонием до 20 мин. При этом отчетливо видно, что от артериолы, проходящей поперек мышечных волокон, отходят длинные капилляры, которые нередко анастамозируют между собой в виде коротких мостиков и образуют классическую сеть. МЦР скелетной мышцы морской свинки характеризуется стандартным строением и выявляется при инкубации 2—4 ч, обработке свинцо-еой смесью 2—Зч и уксуснокислым аммонием 0,5—1 ч.

Подводя итоги исследований, можно заключить, что видоизмененный нами вариант инкубационной смеси Са-АТФ-ого метода впервые позволил одновременно четко и контрастно выявить все звенья органного МЦР на прозрачном фоне у кроликов и морских свинок. На препаратах исследуемых органов легко прослеживается ход и расположение сосудов за счет отложения черного осадка сернистого свинца на стенке эндотелия сосудов и капилляров. В артериальных сосудах окрашиваются и гладкомышечные клетки, благодаря чему они дифференцируются от венозных.

Таким образом, предложенный нами видоизмененный вариант Са-АТФ-ого метода отвечает требованиям гистоангио-логии, прост и надежен в получении четкой сосудисто-капиллярной сети.

3.3. Состояние капилляров в различных тканях в нррме и при молибденовой интоксикации. Известно, что величина просвета капилляров является существенным фактором в регуляции локального кровотока и сравнительно постоянной величиной в норме. Избирательное пропускание различных ве-хцеств и форменных элементов крови зависит от структурных 12

особенностей капилляров органов, а также от степени их реактивности и чувствительности к различным агентам. Поэтому значительный интерес представляет изучение состояния диаметра капилляров при молибденовой интоксикации, имея ввиду, что в литературе нет данных о влиянии молибдена на МЦР, на реактивность и чувствительность микрососудов.

Результаты исследований по состоянию капиллярной сети лока.залп, что реакция сосудов и общая картина органного МЦР у крыс в норме аналогична таковой у кроликов и морских свинок, полученных нами видоизмененным Са-АТФ-ным методом. При морфометрическим игочрдоряппи сосудистой -ети средний диаметр капилляров мозга равен 6,2±0,09 (мкм),. твердой мозговой оболочки 7,36±0,34, миокарда 6,36+0,08, скелетной мышцы 5,8±0,16.

Наблюдения, проведенные на I и II группах крыс, получавших 500 и 100 мг/кг молибдена, показали, что в течение 2—4 дней у животных развивается молибденовый токсикоз разной степени.

Результаты гистохимических исследований сосудисто-ка-мндляркой сети больших полушарий мочга показали, что в артериальных сосудах сохраняется реакция гладкомышечных "лото к, но при этом видны также ядра а дней пищальных клеток. Количество окрашенных aw. »них .-ссудой ш .чичс.чыю меньше, чем на срезах у контрольны.» ж.ч г.отных.

Степень окраски капиллярной сети равная, пг слабой до интенсивной, наблюдается достоверная коиг;рикция капилляров у i группы на 55%, у II -на .40% по сранксни'О с контролем. На срезах также видна усиленная реакция нейроглпн. особенно олигодендроцитов.

На твердой мозговой оболочке при молибденовой интоксикации выявились все звенья MIÍ.P, однако [)еакч,пя неравномерная. Просвет сосудов но ходу варьирует, встречаются микроаневризмы, закручивания капилляров и заметное сужение их просвета — у I группы на 52,7%, у II — на 35,5%.

В миокарде крыс особых изменений з реакции МЦР нет, •инако местами из,меняются стоики с осуди», повреждаются ••идотелиальные клегки, некоторое капилляры разрыпаютсл. суживаются у Í группы на 52%. у II — на 34%.

На срезах мышц видно равномернее окрашивание всего МЦР, наблюдается извилистый ход, капилляров, диаметр их сужен на 48% у I группы и на 29% у второй.

4. Патолого-анатомические и морфологические исследования у лабораторных животных под влиянием молибдена. В

;работе приведено описание патолого-анатомической картины .у крыс и кроликов при молибденовой интоксикации и поставлен патолого-анатомический диагноз молибденозиса, молибденового токсикоза на основе застойной гиперемии мозговых оболочек, застойной гиперемии и отека легких, застойной гиперемии и расширения сердца, застойной гиперемии печени, геморрагического нефрита, катарально-геморрагичес-кого гастроэнтерита.

Результаты гистологических исследований показали, что в головном мозгу у крыс и кроликов отмечается полнокровие сосудов мягкой мозговой оболочки, дистрофические изменения. В миокарде очаги альтерации тина некробиоза, нерезкий межуточный отек, сосуды стромы полнокровны, вокруг них •лимфогнстиоцитарные скопления. В печени вакуольная дистрофия гепатоцитов, в синусоидах стаз и зернистая дистрофия, массивный гемосидероз звездчатых эндотелиоцнтов и т. п. В •селезенке нерезкая гиперплазия фолликулов, полнокровие, стаз. В почках кровенаполнение клубочков и стромы, где имеются массивные круглоклеточные инфильтраты, выраженная зернистая дистрофия. У группы кроликов, получавших в 2,5 раза больше меди, чем молибдена, изменения в морфологической картине почек и печени выражены значительно сла-■бее, что свидетельствует о физиологическом антагонизме меж-.ду молибденом и медыо.

Таким образом, подводя итоги результатов гистохимических, иатолого-анатомических и морфологических исследований можно утверждать, что под влиянием молибдена происходят нарушения микроциркуляцнн в различных органах.

5. Динамика гепарина, тучных клеток и некоторых показателей реактивности и резистентности у животных при избыточном поступлении в организм молибдена. Известно, что гепарин,,выделяемый тучными клетками, обладает широким спектром биологического действия. Исходя из задач настоящего исследования нами изучены динамика гепарина, состояние тучных клеток, время свертывания крови, динамика общего белка, вязкости, гематокритного показателя — показателей, характеризующих как реактивность организма, так и ■состояние МЦР, транскапиллярный обмен и тканевой гоме-остаз. Исследования проведены по нижеприведенной схеме з модельных опытах на крысах, кроликах и морских свинках и в природных условиях на овцах, в норме и при избыточном поступлении молибдена в организм.

Эксперимент I

Кролики и крысы, получавшие 500, 300 н 100 мг/кг молибдена в течение 2 — 1, 10 ц

15 дней

Эксперимент И

Кролики и морские свинки, получавшие сочетания молибдена и меди о : 1 я I : 2,5 п течение 20 диен.

Эксперимент Ш

Овцы, обитающие п эталонной зоне, молибденовой н медпо-чоешбденовой биоге-химнческих провинц.

исследований поктчл«*, что иод влиянием из-оы.очпо!о поступления молибден* у животных развивается равная степень молибденового токсикоза, протекающая по типу ст ресс - ре а кци н.

Результаты первого эксперимента »оказали, что кролики и крысы, получавшие 500 мг/кг молибдена, погибают на 2—i дни в условиях острой молибденовой интоксикации. Это состояние соответствует стадии мобилизации (тревоги) при стресс-реакции, быстро завершающееся истощением, на что гка~ьir-иот установленные нами изменения показателей крови:

■чн-пигелыюс повышение вязкости крот, на 45.....60% и пока-

чч для гома го крита на M .5.....25%, снижение содержаипч об

щ-.то белка но 8,6%, укорочение времени свертывания кроач па 20-2,3%. Значительно снижается уровень ^пдогениол) го-п;»;»'ШГ. • - на 28,9—35,4%, что вполне коррелирует с состой-н/еч [учных клеток миокарда и нечечш, которые качелян"» ¡¡а ;\гчл>;и стадии согревания и деграпуляцин. Это приводи г ••. снижению образова1:ня гепарина н выделению его в кровь, необходимых для поддержания резистентности и комсостава в первые дни »молибденового токсикоза.

У крыс и кроликов, получавших 100 и 300 мг/кг молнбде-н в ьгрвие дни интоксикации наблюдается аналогичная острому токсикозу динамика всех изученных показателей крови. Далее в стадию резистентности, на 10—-15 дни молибденовой подкормки, животные адаптируются благодаря мобилизации .u-'Mithhx факторов и целою ряда фтттолоттческттх спеем, приводящих к повышению сопротивляемости организма. Эт' наглядно проявляется в увеличении содержания гепарина кр.-ви и а 63,3% и гиперплазии тучных клеток в тпетьей степени дегрануляцни. Значительно удлинилось и время свертывания крови — на 61,5%, вязкость и гематокрнтный показатель увеличились в 1,5—2 раза, содержание общего белка снизилось на 8,5%. Общее состояние животных было удовлетворительным.

Результаты второго эксперимента, проведенные на двух группах кроликов и морских свинок, позволяют заключить, что животные I группы, которые получали в течение длительного времени сочетания молибдена и меди в соотношении 5:1,. наблюдаются признаки молибденового токсикоза. Отмечаются уменьшение частоты дыхания и пульса, потеря массы, трофические изменения шерстного покрова, повышение гепарина крови, удлинение времени свертывания крови, повышение вязкости и показателя гематокрита, незначительное снижение общего белка по сравнению с исходными данными. Эти сдвиги подтверждают результаты эксперимента 1 и установленные нами изменения в морфологической картине органов и тканей при сочетании Мо:Си=5: 1, вместе с тем они свидетельствуют об активации парасимпатического отдела ВНС и установлении нового уровня функционирования организма. У кроликов и морских свинок II группы, которые получали Мо : Си= 1 : 2,5, явления молибденового токсикоза не наблюдаются благодаря физиологическому антагонизму между этими микроэлементами. Отмечается некоторый привес и незначительное повышение показателей крови по сравнению с исходными данными.

Таким образом, результаты модельных опытов на разных лабораторных животных показали, что избыточное поступление в организм молибдена и его сочетаний с медью вызывает специфические однотипные морфофункциональные изменения, патогномоничиые для молибденового токсикоза. Показано, что уровень эндогенного гепарина является весьма чувствительным показателем, быстро реагирующим на избыточное поступление в организм молибдена и рассматривается нами как защитно-приспособительная реакция, направленная на повышение резистентности, на сохранение транскапиллярного обмена.

Исследования Григорян (1980, 1991), Татевосян (1991, 1994) на примере молибденовой и медно-молибденовой БГХП показали, что в геоэкстремальной среде болеют или погибают лишь те животные, которые имеют низкую степень естественной резистентности и неудовлетворительную степень адаптации. Животные с удовлетворительными защитными механизмами приспосабливаются к этим условиям обитания благодаря установлению нового уровня регуляции функций, поддерживающих гомеостаз.

В доступной литературе мы не нашли данных о содержании гепарина в крови сельхозжнвотных, поэтому нами

многократными исследованиями была установлена «норма» гепарина крови у хозяйственно зрелых овец эталонной зоны (ннтактные) равная 5,0—5,2±0,15 сек. В период беременности у овцематок уровень гепарина повышен до 9,0±0,57, после окота снижается до -1,00,3, у ягнят от рождения до 3 месяцев.....низкий 3,0 4,5-l0,2, а к 12 -20 месяцам стабилизируется 5,1 ±0,19. Полученные данные свидетельствуют, что уроне нь гепарина зависит от возраста овец и изменяется при различных физиологических состояниях. У обследованных овег, Анкаванской молибденовой БГХП уровень гепарина значительно зысокий и колеблется в течение года в пределах lO./ñiO/s • 22,5^:2, !, что н 2—4 раза превышает уровень ею в крови овец эталонной зоны. У овец Каджаранской медно-молибденовой БГХП показатели гепарина незначительно выше уровня у таковых эталонной зоны с сезонными колебаниями 5,G—7,2±0,32. Гипергепаринемия при молибденовой интоксикации является, на наш взгляд, надежным адаптоген-ным фактором, имеющим защитно-компенсаторное значение. У овец молибденовой БГХП нами установлены также низкие показатели общего белка, значительное удлинение времени vrepi ынання крови, повышенные показатели гематокрнта по срунненню с овцами медно-молкбдеповой БГХП н, в особен ьс.сги, с овнами эталонной зоны.

Резюмируя результаты натурных исследований на овцах, обитающих в среде с избыточным содержанием молибдена, можно считать установленным, что у части животных этой провинции формируется новый гомеостатическнй уровень метаболизма и резистентности, несомненно оказывающий влияние па состояние МЦР органов. Мы рассматриваем сдвиги в системе крови и гепаринообразовательной системе как защитно-приспособительную реакцию организма, направленную на поддержание гомеостаза в экстремальных условиях обитания животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Новый гистохимический метод разработанный нами является видоизменением Са-АТФ-ого метода, при помощи которого впервые выявлены чегко и контрастно на прозрачном фоне толстых срезов одновременно все звенья МЦР органов кроликов и морских свинок.

Гистохимический Са-АТФ-ый метод Чилингаряна, впер-

вые использованный нами на кроликах и морских свинках для выявления органного МЦР не дал четкой картины сосудисто-капиллярной сети на прозрачном фоне толстых срезов. Это побудило нас видоизменить этот метод путем варьирования состава инкубационной смеси, сроков обработок срезов и определить оптимальные условия действия нового варианта инкубационной смеси для выявления МЦР органов этих животных. В сравнительном аспекте обнаружены различия в реакции преципитации стенок сосудов разных органов у всех изучаемых нами животных.

Предложенный нами видоизмененный вариант Са-АТФ-ого метода отвечает основным гистоангиологическим требованиям, а именно: выявляется ангиоархитектоника МЦР органов в своем трехмерном расположении с дифференциацией всех звеньев благодаря окрашиванию гладкомышечных клеток артериальных сосудов.

.Метод отличается легкостью в постановке реакции, высокой чувствительностью и избирательностью при выявлении различных состояний МЦР в норме и патологии. Морфомот-рические измерения диаметра капилляров выявили их выраженную констрикцию под влиянием больших количеств молибдена. Вазоконстрикция ведет к повышению кровяного давления в органах, к кровенаполнению и гемостазу, установленному нами во многих органах и тканях. При этом снижается скорость кровотока, повышается вязкость крови, эритроциты наслаиваются, происходит их агрегация и адгезия, что по-видимому приводит к разрыву капилляров и кровоизлияниям. Это подтверждается нашими данными по повышению показателя гематокрита и вязкости, снижению содержания общего белка и уровня гепарина в крови, укорочению времени свертывания крови.

Вместе с тем сужение капилляров под влиянием молибдена приводит также к нарушению транскапиллярного обмена и тканевого гомеостаза, нарушается доставка кислорода, пластическое и энергетическое обеспечение тканей со всеми вытекающими из этого последствиями. Возникает неспецифический снмптомокомплекс, названный Казначеевым (1968, 1989) синдром «капилляротрофической недостаточности», при котором нарушается структура и функция органов. На основании морфофункциональных исследований установлено, что у животных с низкими показателями реактивности и резистентности гемодинамические нарушения в МЦР более выражены, что'приводит к развитию капилляротрофической недо-

статичности под влиянием молибдена. Мы считаем, что в те» пезе молибденового токсикоза синдром капилляротрофической' недостаточности играет существенную роль. В условиях избыточного поступления в организм молибдена наблюдаются также гемодинамическис нарушения, связанные со степенью проницаемости сосудов, перестройкой элементов сосудистой стенки, явлениями микроапеврпзмы и петлеобразного закручивания капилляров, выявленных гистохимическими методами, выраженностью застойных явлений и развит;',ем кровоизлиянии. Все установленные обменпо-трофнческпе изменения неизбежно приводят к дистрофическим изменениям в органах и тканях, к нарушениям состоянии органного МЦР.

Таким образом, видоизмененный нами Са-ЛТФ-ый метод, для изучения органного МЦР животных и избранные нами морфофункннональные показатели крови — уровень гепарина, общего белка, вязкости, гематокритного показателя, времени свертывания крови, морфометрия капилляров и морфология органов, являются надежными и весьма чувствительными тестами для определения функционального состояния МЦР и. транскаииллярного обмена.

ВЫВОДЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Видоизмененный нами вариант инкубационной смеси безынъекционного Са-АТФ-ного метода Чнлпнгаряна позволил выявить у кроликов и морских свинок одновременно все звенья органного микроциркуляторного русла.

2. С помощью видоизмененного Са-АТФ-ного метода возможно дифференцировать артериальное звено МЦР от венозного за счет окрашивания гладкомышечных клеток.

3. Видоизмененный Са-АТФ-ный метод отвечает всем требованиям гпстоангнологии, прост и надежен в получении четкой сосудисто-капиллярной сети, позволяет определять состояние капиллярной сети в норме и патологии.

4. Молибденовый токсикоз протекает по типу стресс-реакции. В стадии тревоги наблюдается выраженная констрик-дпя капилляров больших полушарий, 1 вердои мозговой оболочки, миокарда, скелетных мышц соответственно на 55; 52,7; 52 и 43%; наблюдаются явления мнкроапевризтлы, закручивания капилляров и другие гемодинамическис нарушения. В стадию резистентности эти изменения менее выражены, по протекают в аналогичной динамике.

5. Видоизмененный нами Са-АТФ-ный метод может быть •рекомендован для исследовании в области микроциркуляции.

6. Микроциркуляторные нарушения при молибденовой интоксикации у животных в стадии тревоги неизменно сопровождаются значительным снижением уровня гепарина, укорочением времени свертывания крови, повышением вязкости и гематокритного показателя, гипопротеинемией. В стадию резистентности уровень гепарина повышается, коррелирует с дегрануляцней тучных клеток.

7. Под влиянием молибдена в органах и тканях развивается синдром капилляротрофической недостаточности, играющий существенную роль в генезе молибденового токсикоза.

8. Морфологические исследования указывают на дистрофические изменения в паренхиматозных органах, массивный гемосидероз, лимфо-гистиоцитарную инфильтрацию в печени, почках и др.

9. На основании полученных результатов считаем возможным рекомендовать определение уровня гепарина крови как показатель состояния МЦР, резистентности и др. Гепарин можно использовать при нарушениях микроциркуляции и трансканиллярного обмена в условиях интоксикации в качестве средства для коррекции.

СПИСОК РАБОТ.

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Динамика гепарина в крови овец в различных условиях обитания. Микроэлементы в биологин и их применение в медицине и сельском хозяйстве. Чебоксары, 1986, т. 3, с. 175 (в еоавт. Григорян М. С.).

2. Динамика гепарина в крови овец в онтогенезе. Биол. журн Армении, Ереван, 1986, т. 39, № 8, с. 723 (в соавт. Григорян М. С., Татевосян Л. Г.).

3. Гепарин — как показатель адаптации и резистентного и. IV съезд Армянского физиологического общества, Ереван, 1987, с. 48 (в соавт. Григорян М. С.).

4. Гнстоангиологнческие исследования микрососудистого русла миокарда и скелетных мышц кролика. III Республиканская конференция аспирантов Арм. ССР, Ереван, 1989, ч. I, с. 71.

5. К вопросу о механизмах поддержания гомеостаза в условиям молибденовой if медио - мол ибденовой биогеохимичес-кпх провинций. Молекулярные и клеточные основы кис лотно-основного и температурного гомеосгада. Материалы 1! Всероссийской конференции, Сыктывкар, 1994, с. Hi1 (в соавт. Татевосян Л. Г., Григорян М. С.).

6. Гпег оа иапологические исследования микрососудистого рус -„та. миокарда у лабораторных жниогных. V съезд Армянскою физиологического общества, Ереван, 1994, с. 48.

7. Дммначио-АТФ-ын метод выявления .микрососудистого русла миокарда у лабораторных животных. Депонированные научные работы, Ереван, 1995, № 3, с. И (в соавт. Чплингнрян А. М.) .

8. Влияние экологических факторов па реактивность организма. I Российский Конгресс по патофизиологии с Меж дународным участием, Москва, 1996 (в соавт. Григорян М. С.. Татевосян Л. Г.) (в печати).

и-и.рч.ш'бил, ъш'Ри. «июнь

««ьчла-ъКоирь ОРЧ.Ц.Ш9КЬ m>tipn3i<piinM.eap ¿пкъъ ¿,enhlHlWm-JíNrt>UWu 1ГПРЛ>Па.ПМЛ13ИП,1и ¿líSUanSnW¡>-3№VubPC РШШЪП\.ПМГ № ичп.ър'ил!» идъъапдозш'ь vbp-en

û'uiqiupGhp}i U {>m{iu]u))qml|ßti|i}i opqiuGiujJiG iî]il|pngfipljmi-uup fïmGp (U*S¿,) it]iCs uijrM fiui¡uiGmpt¡|H(uifi IT. Q|i-

ijiGqmpjmG}i >Gbpiuplp[m) Ca-Ut?3>-}i irhpmpn{ (1986): Tbq sfiut-onrpjtjg uijtj lit.aipuüpGhp}) tfnui (^[шй тП,|гжг|т( ]auufiiuGg}il) флСр t|pm Gu-ijuiGuipt.ph] ITöA-Ji рщпр оциД|Г;Ьрц: Пшт'\, itüp lpnr\xî|ig 51иифп]иг[Ьд Ca-Ubä>-]i гПзрпщ), íiwuuuuim[l.g ]iGl|mputgpnG ];mmiimprj}i Gnp тшррЬрш1ц), puigtufmijuu}hg Gpui С}п|нупцт)г>]ш(1 oup.n]uîuq upupíiuGGhpp U pun¡iw[új]\l| tynfifi t(|iui íiiuuui l)mpi¡m&p-Glïpniiî итидфй inGqunî fiiujwGuiplqn{l.g fiuuyuipGbpJi U ími[iufun-qml|Gbp}i opq.iuGGbp]i U'84,-]r piipip oqiul|Gbpp: ÜUunjin|ui[uiö Ca-U.t;3j-]\ tfbpnrpu[ ГШгиршфчр 1; GuiU upupq ru giujmmG гпшр-pujauljhi USA-p quipl|bpiul(Ujj]iG hpuil|iuj|iGfig4 fîuipp iîl|ui-

GuijfiG p^l^l'PÍ1 GbplpîiuG 2fînpfi}u(: йЬрпгф oqGmpjiuiîp iaujuiGiupbpi|miî !; imuppbp xntuiailj'p l{LGtp.uG(\GLpji U unuppbp opqiuGGbpfi uiGiipfiu|i}i iquiinji ujpbgïiu|]iuuug}iuij}i iiïiiuljo}iuii]i íauin¿iÍiumiul|iuG umu!(iо С lulïu<inl¡ni p jniGGbp p к GpuiGg iîiuqiuuri}&-Gtïpji xnpuuUmuupji G4iuqiuqnijG фпфгфиирциССЬрр opqiuG|iq\S|i uuiipphp фт01| gpnGuq ¡jfiflui 1| fibpmu :

U.niuvjiQ utGquuí munnJGwiu]ipilbg un|jipv|!:iGm| lujmmiiíuupijutá l|teGi>iuGjiCihp|i lT5¿,-p: Uupugmgi|bg, np \1т]тр1рЪСр fnupmgnuî t ui un p luihuqui Gnprni ib fi gutßgp f¡htínr¡|iGuuíjil|iuj|i ]uiuGq.iupmtfGhp, ilb:ó l]))uujqGrjlíp]i, iiuil<r[]i Ipup&p puirpxiGpfi, upuuuiîljiuCji II lplui]upuij)iß i5l¡uiGQl.p]i tfuiqiuGnpGbpJi \nyuuiiui¿uu}i}i 30—55 uiri-Ipmm[ G^quignuí, iIuujiuGnpGbpji {ufiumií, ií]il¡pmuGUp)iqtí, jiG¿ii|hu Guili xapjiuG lîufônigjilpupjwG m fililíiuumljpliunuj]iG grngxuGfig'1 puipÖpuignuS, íiji upnu¡pтпТфGhiî|\ui, uipjiuG víudpuprp-íuiG óuuíui-Guil^i l|UtpGiU(jmiî, í¡biqiup}iG|i puiGuil|]i qq-iutfi Gi|utqmiï U г^ш-ргирш pgjigGbjiJi fiuun|il|iuqpljnuî:

Put gui fiui ¡in фш 5 ui]uttiuipuiGuil|uiß фт^итррпПиЦк. fihuib-

vjuiGp hG ¡aniínuijiiiuíuiíi duníuiGiul; opqwü[iqiT¡i

r^tfut)^pm¡tul(uiGrii|8piií.; Ii ntn.u.l¡ui]ulnip$ui(; ^hrjiiiiiG m lîuiqwCtr • piujjid uGmgifwiG iuGf!uuji«iU(jpHipjtii'<: 'i.umLG^Iufuimrui opqiu^-Cibpni;' puigtufiuijunjlt; LG 'iuih mjíiiq¡iu|i iínp.'biipiq}iuil|Mif; фг< • ijmjumpyjiiiülibp, ))Gjii||Mj}ip- i.G' ^¡и.кпрнф^ш, libilnu}tr)lipnq, jf}G4>}i|tnpuigjiiu, 1|шЦц.1(и;'Л< bpb»ijp;if.p, lupjtuliimbcinuí li чф • jiuGuKtbiymiahji:

Ниткцллй i|tuiuml«jij' {tyriuiU í[r. 'i цшшуифЦ^пи! L. uipjiuü üUg tihiquipjiGh piuGiulií'i a ujiupiupm И^^р]! líiip^npnqfuuyiU npn2bl RniGji ijí¡ílu)¡¡f l< op£4-iuG]u|up пЬ^ВД1'"

i¡Ultp'.Mirtip]!Ha|li

U'Lp ljnt|u[ig <Ilauijn¡|ui.iuiii Са-Ubíb-fi иЬрнгщ U utmugi.)ш/г ßnp Gjniш|шбршp¡1 il)iи»l|U(fi rn iiiip.]>nty}iq]inpsq.filuljwG фшшлЬрг; шпш2шр1|фпи1 I; l|]ipumlii q]iuiuil|iuü к ijijiüjiljiuljuií.i fibimuqrumn.-¡i.rHÍiGlipínii' lfS¿,-}\ npnphp'.i. Gupuvmilpuj: