Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСФОРМАЦИИ CI-СОЕДИНЕНИЙ У METHILOCOCCUS THEBMOPHILTJS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСФОРМАЦИИ CI-СОЕДИНЕНИЙ У METHILOCOCCUS THEBMOPHILTJS"



ОРДЕНА ЛЕНИН! И ОРДЕНА ЩШ НАРОДОВ АКАДШИ НАУК УССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЫЖРОЕИОЛОГШ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукописи ПИНЧ/К ГРИГОРИЙ ЭФРОЮЮШЯ

УДК 579.041.4,222

ИЗУЧЕНИЕ ИЕХАНШЙ ТРАНСФОРДЩИИ СгСОВДИНШЙ У иетнплсосслэ тнеемомилз

(03.00.07 - шскробно логия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ШВ - 1990

Работа выполнена в йгституте микробиологии и вирусологии им. акад. Д. К.Заболотного АН УССР

Научный руководитель - доктор биологических наук

В. А.РОМАНОВСКАЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор

И. Я. ЗАХАРОВА

доктор бколопгческнх наух

профессор

А.А.СИБИРНДО

Ведущее учраидение - хафеуара микробиологии Московского государственного университета

Защита состоится "4? * fL.^bgfyf 1990 г. в 9 - 30 час, на заседании специализированного совета Д 016,06.01 по защите докторских диссертаций при інституте юисробиологш я вирусологии тени Д.К.Заболотного АН У0СР по адресу: • 252143, Ккев-143, ул.Заболотного,154

С диссертацией иакно ознакомиться * библиотеке Йктнтута микробиология и вирусологии тени Д.К. Заболотного АН УССР

Автореферат разослан * 4{> * Kfl^fCfy 1990 г.

Ученый секретарь

спецтлиэироввигргг! совета . '

кандидат биол^.' ^«ук От-С'Ч- — Э.А.КОВМЕЖО

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

Актуальность, Ыетаноиисляощие бактерии в течение последних

телей в СССР и за рубежом. Это объясняется их биотехнологичес-кии потенциалом, а также рядом теоретических проблем их биологии; облигатной зависимостью от метана как источника углерода и энергии, подавлением роста экзогенными органическими веществами, которые являются нормальными метаболитами клетки, способностью расти на смеси неростовых субстратов, широкой субстратной специфичностью ключевых ферментов окисления метана и т.д. В последние годы установлена большая роль метанокислящик бактерий в круговороте углерода биосферы, поскольку значительная часть органического вещества, синтезируемого фототрофными организмами, разлагается в анаэробных эконишах с образованием метана, Поэтому метанокисляющие бактерии, наряду с автотрофами, замыкав? цикл превращений углерода биосферы.

Метанокисляющие бактерии привлекают внимание также в связи с возможность» их применения для синтеза белка, экзополиса-харидов и биологически активных веществ из метана природного газа, использования их клеток в качестве каталитических систем для окисления целого ряда сложных органических соединений в химической промышленности.

Использование в прикладных целях любого микроорганизма тем эффективнее, чем глубже мы знаем его биологи», пути метаболизма и их регуляцию. За последние 10-15 лет в изучении конструктивного метаболизма метанокисляющих бактерий достигнуты существенные успехи. В то же время процессы окисления интермедиатов окисления метана, а также механизмы генерации энергии, реализуемые

20-30 лет являются предметом изучения широкого круга исследова-

Моок. сальскехо». акядмм*

ЦРНТРА/ЫМЙ-

НАУЧНАЯ 6И6ЛИОТВ4А

этими микроорганизмами, исследованы недостаточно полно*

Цель и задачи исследования. Цель» настоящей работы (Sumo выяснение локализации процессов охмеления метана, метанола н формальдегида относительно ЦГЫ метанокислявщих бактерий Ыо. tbermophlXus и изучение механизмов генерации внергим, сопряженных с окислением восстановленных Сj-соединений.

В задачу исследований входило;

- изучить механизмы генерации электрохимического градиента протонов, сопряженные с процессами окисления метанола к формальдегида;

- изучить механизм поглощения клетками метана н интерме-диатов его окисления;

- выяснить роль "W0 и ЦЦГ в окисления Метанола и формальдегида;

Список сокрадениц.

АР - альдегидредуктаза; ОПР - оксипируватредуктаэа; *(ДГ -метанодаегцдрогенаэа; МОК - метанодоксидаэный комплекс; ШО -метанмоноокенгеназа; ФДГ - формиатдегидрогевааа; ФдДГ - формаль-дегиддегидрогенаэа; АТ - активный транспорт; ТО - терминальная оксидаэа.

ФА - формамнд; ФJC - феназинметосудьфат; TW4" -тетрафенкл-фосфоний; СССР - карбонмлцианнп-м-хлорфвнклгцаразон; JCCP -кар-<5 онил цианид-п-трн$торметоксифенилгкдраэон.

КС - клеточная стенка; №Í - наружная мембрана; ЦПМ - цито-плазматическал мембрана.

Научная новизна. Впервые показано» что метанокисляицие бактерии поглощает метан к формальдегид путей энергозависи-Ного транспорта.

Установлено» что окисление экзогенного метанола в клетках этих бактерий катализируют два фермента - йЫО и ЦДГ, при этом ¡(ДГ локализована в периплазме. Этот фермент не катализирует в клетке окисление формальдегида при росте на метане, как считалось ранее, однако участвует в детоксикации высоких концентраций этого соединения. Установлено также, что окисление одного моля формальдегида в клетках Uc.theraophi.lus сопровождается восстановлением двух молей НАД*.

В клетках ив. ъЬвморЫ1ив обнаружен неизвестный ранее для метанокисляицих бактерий фермент - альдегидредухтаза, исследованы условия, в которых происходит экспрессия активности этого фермента. Показано, что клетки, обладающие активностью АР, способны генерировать протондвижущуи силу на ЦГЫ за счет окисления НАДИ без участия НАДН-дегидрогеназы и протонных насосов.

Практическая ценность. Наличие энергозависимого транспорта метана к формальдегида в клетки метанокислявщих бактерий следует учитывать при построении моделей круговорота метана в биосфере, в экологических исследованиях, в расчетах эффективности процессов биосинтеза на метане, в дальнейшем изучении регуляции окисления метана. Полученные закономерности окисления метанола и формальдегида являются основой для разработки способа синтеза формальдегида.

Установленная нами чувствительность к осмотическому шоку реакции монооксигенирования метана и активного транспорта формальдегида в клетки может быть причиной нестабильности процесса

получения белка на природном газе, так как при крупномасштабной культивировании метанокислдацих бактерий в ферментер регулярно подается большой объем концентрированного раствора питательных солей. Вследствие этого, некоторая часть клеток продуцента периодически подвергается осмотическому шоку.

Апробация работы.дДатериалы диссертационной работы доложены на конференциях Молодых учены* Института микробиологии и вирусологии АН УССР (Киев,1986,1987,1988,Канев,1986),17-й научной конференций м0лодш ученых, (1966), 19-Я конференции молоды* ученых ШМ (Пущино, 1968),6-м международном симпозиуме "пробный рост на ^-соединениях* (ФРГ,Геттинген,1989),7-м съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы,1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит нэ введения, списка сокращений, одной главы обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы {209 источников). Работа изложена на 46$ страницах Машинописи, включая 26 рисунков и 7 таблиц.

Объект и методы исследования. Объектом исследования служила термофильная культура облигатных метанокиелявщих бактерий Ме£Ьу1ососси« ъьегторМ1и» штамм Шй /Малатенко с соавт. ,1976/. Культивирование бактерий осуществляли на минеральных среда* в периодическом и непрерывном процессах,как описано ранее /Малатенко с соавт.,1978;Линчук с соавт.,1987/.При изучении процесса окисления метанола или формальдегида бактериями,растущими на «етане,использовали культуру в режиме хемостата с лимитированием роста азотом аммония.В ферментер вносили Метанол или формальдегид до конеч-

них концентраций 0,3 % и 0,03 % соответственно, либо метанол одновременно в ферментер и в среду на подаче до конечных концентраций 0,1 % и I % соответственной Клетки для определения удельной активности АР отбирали через 30 часов после внесения метанола.

Концентрации СН4, СН3ОН, СдНдОН, СдВ^Н, С^О, СдИ^О в жидкости и в газовой фазе определяли на газовом хроматографе "ЛХМ-8МД" /Ыалашенко с соавт.,1978/. Концентрацию СИОН определяли по реакции с ацетилацетоном / яааЬ ,1953/; аммония - при помощи реактива Несслера /Ваславская, Трубецкая, 1964/, форми-ата - при помощи формиатдегидрогенаэы /Соколов, 1988/, белка -методом Бредфорда /Вгеатогй, 1976/.

Скорость окисления субстратов определяли в 50 ыМ Оа -фосфатном буфере рН 6,9 на полярографе ППТ-І при помощи платинсклор-серебрЯного электрода закрытого типа /Малашенко с соавт.,1978/ при температуре 50 °С. Водорастворимые субстраты и ингибиторы вносили в вцде водных или буферных растворов; Тй+, СССР и РССР - в виде раствора в диметилфодоамцде, В отдельном эксперименте исследовали влияние чистого растворителя на окисление субстрата "клетками;

Обработку клеток трипсином (5 мг/мл) осуществляли в 50 мМ трис-неї буфере рН 7,9 при темпераіуре 37 °С после предварительной инкубации £25 °С) для нарушения целостности ИМ в одном из следующих растворов:

1. 50 мЫ фосфатный буфер рН 8,0, содержащий 1,5 мг/мл

ЭДО;

2. 50 ы*1 трис- НС1 буфер рН 8,0;

3. 50 мМ трис- НС1 буфер 8,0, содержащий 1,5 мг/мл ЭДГА.

- б -

Сферопласты из клеток lie. thermophiius получали путем ■ инкубации бактерий при 37 °С в течение. I часа в 50 ыН фосфатном буфере рН 7,9, содержащем 2 ыМ ЭД1А, 0,2 М сахарозы и 2 иг/мл лиэоцима. Б некоторых экспериментах сферопласты подвергали осмотическому шоку. Для этого юс суспендировали в дистиллированной воде, I ыМ и 10 uil трис-нс! буфере рН 7,0. Бел» осмотическому току подвергали нативные клетки, То их суспендировали в дистиллированной воде (25 °С или около О °С) после инкубации в 100 мМ трис-aca буфере рН 7,0, в тон же буфере с 7 % сахарозы либо в 50 мМ трис-HCl буфере рН 7,0 с 20 % сахарозы.

Регистрацию транслокации протонов проводили по описанному ранее методу /Holleher et al., 1982/ с использованием прибора "Ионометр ЭВ-74" и самописцу КСП-4 (I мВ).

Активность ферментов определяли in situ, в грубом бесклеточном экстракте, в мембранной фракции и во фракции растворимых белков. Клетки разрушали " путем обработки ультразвуком с использованием дезинтегратора УЗДН-I в режиме тока 0,4 А при резонансе (22 кГц, 4 °С, 3 х 20 сек с перерывами для охлаждения) либо при помощи экструз ионного дезинтегратора ДКМ-3 (конструкция Института химической физики АН СССР). Дезинтеграт центрифугировали (4 °С, 20 ОООе, 25-30 мин), суперн&тант использовали в

1

качестве грубого экстракта. Фракции мембран и растворимых белков получали путем ценприфупфования грубого экстракта при 100 OOOg в течение I часа.

Частичную очистку АР осуществляли путем гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-IOO.

Активность 1ЩГ in vitro определяли по скорости потреб л е-

ния кислорода полярографически при 50 °С. В I мл реакционной смеси содержалось ( в мкмоль): трис-вс1 рН 9,0 - 50, ИН4С1 -10, Ф1С - 0,5, белок - 0,2-0,3 мг. Реакцию начинали введением в ячейку метанола до конечной концентрации 5 мМ. Определение активности ВДГ1а з^и проводили таким же образом, но вместо бесклеточного экстракта использовали клетки.

Активность АР определяли по скорости потребления НАДН спектрофотометрически при 340 нм, а таюке по изменении концентраций субстрата и продукта реакции. Реакционная смесь содержала в I мл(в мкмоль):фосфатный буфер рН 7,0 - 50, НАДН или НАДОН - 0,5, белок - 0,06-0,1 мг. Реакцию начинали добавлением 2 мкмоль -субстрата после термостатирования при 45 °С в течение I шн. В качестве субстратов использовали формальдегид, ацетальдегид, пропяоновый альдегид, оксигшруват, ацетат, метанол, этанол, про-панол, ацетон, Изучение оптимума рН проводили в диапазоне 5,0 -8,0 в фосфатном буфере, 8,5-9,5 - в трие-нс1 буфере (каждый 50 мМ).

Активность 0ПР определяли спектрофотометрнческн при 340 нм по зависимому от оксипирувата окислению НАДН. Реакционная смесь содержала в I ил (в мкмоль); фосфатный буфер рН 7,4- 50, НАДН-0,5, белок. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль океипирувата натрия после инкубации при 45 °С в течение I мин.

Активность НАДН-оксицазы определяли по скорости окисления НАДН при разных; значениях рН буфера спектрофотшетрически при 340 »1. При определении активности НАД/Ф/+ - пли НАД/Ф/Н-эави-сииых ферментов их активность корректировалась с учетом активности НАДН-оксидаэы.

Активность НАД/ФУ+-ЗЯИЧРИЦ^Й ФдДР определяли в Грубых

бесклеточных экстрактах или во фракциях растворимых белков(приготовленных из клеток, выращенных в разных условиях) по восстановлению НАД/3/зависимому от формальдегида» ацетальдегида или пропионового альдегида, в присутствии или отсутствии восс- . тановленного глутатиона (2 мЮ. I мл реакционной смеси содержал (в мкмоль): фосфатный буфер - рН 6,0-8,0 - 50, НАД+ или Н/ЩЬ+ -0,5 или 1,0, белок - 0,1-1,0 мг/мл. После инкубации реакционной смеси в течение I мин при температуре 30 °С, 40 °С, 45 °С или 50 °С реакцию начинали добавлением субстрата до конечной концентрации 5 мМ. v

РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Локализация метанолдегидрогеназы относительно цитоплазма-тической мембраны. Было изучено влияние трипсина на активность МДГ, ОПР и АР в клетках Цс. thermophilics, подвергнутых различной обработке с целью нарушения целостности Щ. Установлено,что инкубация с трипсином не снижает активность ВДГ la situ, если клетки предварительно инкубировали в трис- RC1 буфере без ЭДПА или в фосфатном буфере с ЭДТА. Внесение трипсина в суспензию клеток, инкубированных в течение 3 ч в трис-HCl буфере с ЭДГА приводит к падению активности этого фермента на 80 % в течение 5 мин. Степень подавления активности 1ЩГ трипсином прямо зависит от времени предварительной инкубации клеток с трис-ионами я ЭДГА. Анализ клеток после инкубации с трипсином свидетельствует о том, что такая обработка не приводит к их лизису.

Изучение воздействия трипсина на удельную активность АР и ОПР в клетках lio.theimophilus с нарушенной целостностью НИ показало, что активность этих ферментов остается неизменной.

Следовательно, молекулы АР и ОПР, в отличие от молекул МДГ, недоступны, для трипсина. Полученные результаты позволяют заключить, что ВДГ расположена в периплазме бактерий Мс.ъЬегторЬИиа, в то время как АР и ОПР локализованы в цитоплазме. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что только инкубация клеток с трис-ионами и ЭДТА делает их КС проницаемой для молекул неболь-яих белков, таких как трипсин. В этом плане бактерии Ыс.гьегшо-рЫХие не отличается от других грам-отрицательных бактерий.

Для изучения прочности связи молекул ВДГ с наружной стороной ЩШ мы изучили распределение активности фермента между сферо пластами и раствором, в котором происходит их образование. Активность ВДГ обнаружена только в сферопластах. Таким образом, удаление КС бактерий не приводит к выходу ВДГ из клеток. Для отделения ВДГ от ЦПМ сферопласты были подвергнуты осмотическому шоку различной силы. Установлено, что осмотический шок приводит к лизису оферопяастов. В связи с этим было изучено влияние осмотического шока на метанолоксидаэ ную активность нативнък клеток. (В том случае, если ЦЦГ слабо соединена с ЦПМ, отделение «того фермента в результате осмотического шока от цепи переносчиков электронов, расположенных в мембране, приведет к падению скорости окисления спиртов клетками бактерий). Получены следующие результаты. I) После осмотического шока скорость окисления клетками метанола снижается в два раза, 2) ЭДТА (ингибитор МОК) уменьшает на 60 % скорость окисления метанола нативными клетками и на 100 % - клетками после осмотического шока. 3) Осмотический шок не влияет на скорость окисления клетками этанола (субстрат ЦЦГ), но полностью подавляет окисление метана. Поскольку метанол, в отличие от этанола, является, наряду с метаном, суб-

стратом ШЮ у iic.thermophi.ius, & ЭДГА не влияет на активность этого фермента в клетках (см. следующий раздел), можно заключить, что осмотический шок подавляет активность ЫКО, ио не влияет на активность МОК и, следовательно, не приводит к нарушению контакта МДГ с мембранными переносчиками электронов. Таким образом, МОГ прочно ассоциирована с периплазматической стороной ЦПМ метанокисляющих бактерий Мс.-ЬЬегпюрЬИиз, где,оче- . видно, находится также цитохрой осо, так как ранее было показано, что он является непосредственным акцептором электронов от ВДГ этих бактерий /Соколов о соавт., 1981/.

Механизм окисления метанола и формальдегида бактериями Ыс. №е ипорМГиз. Метан окисляется в клетках метанокисляющих бактерий до СО^ через метанол, формальдегид и формиат, при этом часть формальдегида отвлекается для синтеза биомассы. Первый этап - ыонооксигенирование метана - катализирует ММО, второй -окисление метанола - ИСК. Обе ферментные системы неспецифичны в отношении используемых субстратов: в частности, ШО способна катализировать монооксигенирование метанола. Таким образен», в ' клетках метанокисляющих бактерий есть два фермента, способных катализировать окисление этого вещества, поэтому одной из задач нашей работы было выяснение их роли в окислении метанола 1а. ■луо. Для решения поставленной задачи мы исследовали влияние ацетилена (ингибитора ШЗ) и ЭДГА (ингибитора МОК) на процесс окисления первичных спиртов клетками 11с. -ЬЬепюрЬИив.

Установлено, что ЭД1А лишь частично сникает скорость окисления метанола клетками, в то время как окисление »танола я пропанола полностью подавляется этим ингибитором. Если после ЭДГА добавить ацетилен, клетки прекращают окислять метанол.

Совместное действие ЭДТА и ацетилена не зависит от порядка их внесения. .

Далее было исследовано действие'ЭДГА на окисление метана, а также на соокисление СО (который является субстратом ММО) с НСООМа в качестве источника НАДН для ММО. Установлено, что ЭДТА подавляет окисление клетками метана, но не затрагивает соокисление CO+HCOOSa. Более того, добавление формиата полное ты) восстанавливает процесс окисления метана, хотя при этом меняется стехиометрия данного процесса (уменьшается в два раза расход кислорода). Следовательно, ЭДТА ингибирует окисление метана на уровне МОК и не оказывает влияния на активность ММО в клетках бактерий. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что окисление этанола и пропанола катализирует только МОК, в то время как часть экзогенного метанола окисляется в клетках Btc.the-rmophilue при участии НТО.

Vb пользование ацетилена и ЭДТА позволило нам предварительно оценить сродство МЭК и ШО в составе целых клеток к метанолу.

Оказалось, что сродство целых клеток к метанолу (Км = 2,5*Ю~ЭМ)

£

значительно ниже, чем сродство к метану (Км - 6,6'10 М /Иала-гаенко с соавт., 1987/), в то время как значение Kit для МОК <I5,2'I0~® И) говорит о высоком сродстве этой ферментной системы к метанолу. Таким образом, представленные вше результаты позволяют заключить, что часть экзогенного метанола окисляется в «летках М с. t hemophilus при участии ШО, однако окисление метанола, образующегося в процессе окисления метана, катализирует главным образом МЭК.

В цепи окисления метана до С&> третьим интермедиатом является формальдегид. На уровне этого соединения происходит разде-

ление потока углеродна на нужды .конструктивного и энергетического метаболизма. В связи с этим возникает вопрос: какой (ие) фермент (ы) катализирует(ют) окисление формальдегида в клетках Ко. -ЫдогаорЬИие? В бесклеточных экстрактах эту реакцгео с высокой скоростью катализирует МЩ% однако роль этого фермента в окислении формальдегида клетками неясна. Для решения данной задачи мы исследовали влияние ингибитора ШК (ЭДГА). и ингибитора ЦЩ1 (формамида) не процесс окисления формальдегида интактньаш клетками мс.ШегиюрьПиа. Установлено, что эти ингибиторы не подавляют ни окисление формальдегида, ни соохисление формальдегида с 00, если его концентрация не превшает 0,2-0,25 мМ. При увеличении концентрации формальдегида указанные ингибитор« снижают скорость его окисления.

Следует отметить, что при росте бактерий на метане не наблюдается появление свободного формальдегида, поэтому ясно, что ВДГ не участвует в окислении этого соединения при росте на метане. В то же время способность этого фермента катализировать окисление формальдегида при увеличении его концентрации свидетельствует об участии МГ в защите периплазма от экзогенного формальдегида.

Каков же механизм окисления формальдегида, генерируемого в процессе роста на метане ? Наиболее вероятным кандидатом на роль фермента, ответственного эа его окисление, является Независимая ФдДГ, обнаруженная в бесклеточных экстрактах ряда ме-танокисляюцих бактерий. Однако мы не обнаружили в акстрактах Ыс, Шепаормдив фермента, катализирующего окисление формальдегида сопряженно с восстановлением НАД* или НАД8+. В то же время мы установили, что скорость соокисления клетками формаль-

дернут с 00, являющегося субстратом ММО, в два раза вше, чш скорость соокисления формата с СО (таблица). Отсцда следует, что при окислении формальдегида генерируется в два раза больше восстановительных: эквивалентов, чем при окислении формиата.

Таблица

, Скорость потребления кислорода при соокислении формальдегида- и формиата С СО клетками Мс, -ЬЬеторЬИив

Субстрат Концентрация, Скорость потребления кис»

мМ лорода.нмоль- (иин.мг АСЕ)-1'

сн4 295

СО ' ■ 0,07 0

свои 0,25

+ 264

со 0,07

НСОШГа ю.о

+ 112

со 0,07

Здесь необходимо отметить, что МШ способна использовать в качестве восстановительных эквивалентов только электроны, поступающие от ВДГ или от НАД(9)Н. Поскольку виие было показано,что . ВДГ не участвует в окислении формальдегида при его концентрации до 0,25 ыМ, можно заключить, что в процессе его окисления до формиата в клетках Нс.ЪЪетаорЬИив происходит генерация НАДЙУЙ.

У метанокисляющих бактерий одним из механизмов передачи электронов на кислород при окислении С^-соединений является реакция монооксигениров&ния метана. № предположили, что л клетках Нс.'ЫмторЬИив ММО способна выполнять роль терминальной окси-

д&эы и в присутствии субстрата. Для проверки »того предположения было изучено влияние ацетилена на окисление пропанола и фо-рыиата интактными клетками бактерий. Установлено, что.ацетилен частично (на 40 %) подавляет окисление этих субстратов. Поскольку пропанол и формиат не являются субстратами ММО, можно предположить, что этот фермент способен катализировать реакцию восстановления кислорода за счет электронов, поступающих от ВДГ иНАДН.

Косвенным подтверждением оксидазной функции ММО является тот факт, что окисление пропанола в одинаковой степени подавляется цианидом калия (рис. Ііїзд* 6-8 мкЫ). & »том трафике имеется еще два участка сникший скорости окисления пропанола, что указывает на участие трех терминальных оксидаэ в его окислении.

В процессе изучения метабояиэш. формальдегида ш ббнаружм-

N

5 400

Рис. I. Кинетика подавления цианидом калия скорости окисления метана (I) и пропанола (2) клетшми но. їЬегшорЬІІив.

Концентрации: метан - 0,1мК пропанол - I мй, биомасса-0,12 мг АСВ/мл

0 1 г 3 Ч 5

ЫЩ&мкМ-

ли в бесклеточном экстракте Мс. -ЬЬегторМІив активность неизвестного ранее для нетанокисляющюс бактерий фермента, катализирующего восстановление формальдегида до метанола за счет окисления НАДН. Фермент был частично очшцен и изучен. Установлено, что кроме формальдегида этот фермент катализирует восстановление ацетальдегида. и пропионового альдегида до соответствующих спиртов, не использует в качестве восстановителя НАДИІ. Обратную реакции фермент не катализирует. Таким образом, по правилам Международной комиссии по ферментам его следует называть НАДН: альдегид оксццоредуювэа, однако для удобства мы будет использовать тривиальное название - альдегидредуктаза.

Исследование различных фракций бесклеточкого экстракта показало, что активность АР обнаруживается во фракции растворимых белков и, как было показано вше, локализована в цитоплазме. Удельная активность фермента в зависимости от условий выращивания бактерий изменяется в широких пределах. Установлено, что высокая удельная активность АР наблюдается в присутствии экзогенного метанола, а также при лимитировании роста азотным источником питания.

& предположили, что одной из фикций АР кокет быть дето-ксшсация формальдегида, & также других экзогенных альдегидов в цитоплазме бактерий. Действительно, эксперименты показали,что клетки, обладающие активностью АР, в анаэробных условиях стехи-ометрически восстанавливают альдегиды до соответствующих спиртов. Эти результаты позволили предполагать, что іфи восстановлении альдегнпа в присутствии кислорода образовавшийся спирт, будет окисляться с участием периплазматической ЦЦГ. В случае справедливости данного предположения трансформация альдегида в

Птппюи*

М)

адг|

вР'

ЦИПШПМШЛ

6 Л*1 (М)Н Щ**_

\ />гн* Эшенкьк

м N шдат

У л »г

Эндшнкьк сакгамш

Рис. 2. Схема механизма формирования электрохимического градиент протонов у 11с. ЗДехшорМіиз. ТО -терминальная оксидаза

клетке приведет к генерации электрохимического градиента протонов на ЦШІ. Эксперименты, проведенные с иктакткыми клетками, показали, что при трансформации прошонового альдегида генерируется протонный градиент с эффективность» При этом следует отметить, что пропионовый альдегид не является субстратом ЦЦГ к не ассимилируется.

Полученные результаты позволяют заключить» что у метанокис-лящкх бактерий Мс. ъЬехторЫХив может действовать механизм генерации протондввкущей силы при функционировании системі сопряженных реакций, катализируемых МДГ, АР, а также ФДГ или ферме* нтами, осуществляющими восстановление НАД* за счет энергии эндогенных субстратов (рис. 2). Особенность» этой системы является то, что электроны и протоны НАДН используются для генерации іфо~ тонного градиента без участия протонных насосов.

Меяанизш транспорта одноуглероднах соединений в клетки Не. ^епаорЩца. По современный представлениям НПО расположена на внутренней стороне ЦПЫ. Если это так, то метан перед тем, как подвергнуться монооксигенированн», должен попасть в цитоплазму.

Одна из задач нашего исследования состояла в изучении механизма втого процесса. Проведенные эксперименты показали, что протоно-форы ГССР и СССР, рассеивающие протондвщущую силу на ЦПМ,через несколько секунд после внесения подавляют окисление метана бактериями мс.-ЬЬеипорЬііив. Формкат не восстанавливает процесс окисления метана, так же как и увеличение его концентрации (рис. 3).

1 . (Ь

8 «

«о

эГ

и

«

10

го и бо

6Р6МЙ, МИН

Рис. 3. Влияние РССР на потребление метана клетками Мс. "ЬЬегторЬИив. Начальная концентрация ■ НСООНа —10 мМ

Ингибирущее действие протонофоров макет быть вызвано одюй из следующих причин: подавлением ферментной системы, осуществляв щей монооксигекирование метана, или нарушением поступления метана в клетки, что предполагает наличие у бактерий энергозависимого транспорта этого вещества. Для того, чтобы проверить, сохраняется ли активность ММО в присутствии протонофоров, мы исследовали их влияние на процесс ыоноокскгенирования клетками метанола, который, как было показано вше, является субстратом »того фермента. ИСК при втом был подавлен с помощью ЭДТА.

Установлено, что бактерии lic.tbermopbilus способны в присутствии FCCP монооксигенировать метанол. Полное подавление реакции ацетиленом подтверждает, что окисление метанола в данных условиях катализирует только этот фермент. Отсюда следует, что протонофоры не являются ингибиторами LK0 и причиной подавления ими процесса окисления метана является наличие у бактерий Mc.ther-mophllus системы его активного транспорта, зависимой от протон-дввкущей силы. Вероятно, данная система транспорта неспецифична в отношении метана, так как протонофоры ингибируют также соокис-ление формиата с 00, который является субстратом Ш). ffa окисление самого формиата протонофоры не влияют.

Кроме этого, мы установили, что проникающий катион 1ФФ+ полностью подавляет окисление клетками метана, но не влияет на процесс монооксигенирования метанола. Отсюда следует, что транспорт метана зависит только от одного компонента протондвикущей силы-мембранного потенциала.

Eteaie было показано, что у бактерий Uc.themophilue ВДГ ассоциирована с внешней стороной ЦПМ, поэтому образование формальдегида из метанола происходит в перишсазматнческом пространстве. Отсюда возникает вопрос: каков механизм поступления формальдегида в цнтоплазцу - диффузия или активный транспорт ? Для выяснения »того мы изучили действие ÎCCP и 4А (ингибитора ВДГ) на потребление клетками формальдегида. Установлено, что только смесь этих ингибиторов подавляет процесс. Далее мы изучили влияние РССРна процесс окисления клетками метанола. В отсутствие протонофора окисление метанола сопровождается потреблением образующегося формальдегида, и не подавляет этот процесс (ряс. 4). Картина меняется, если перед внесением метанола клетки про*

л

0 5

время, мин

0 5 <0 время, мин

Рис. 4. Динамика изменения концентрации формальдегида (* - без формамида, 3-е формамидом) при окислении метанола (I) клетками Мс.Шесторьииз в присутствие (б) и в отсутствие (а) КСТ. I - внесение формамида

инкубировать с гссР: в этом случае происходит стехиометрическое превращение метанола в формальдегид, потребление которого начинается лишь после полного исчерпания метанола и приобретает чувствительность к ФА (рис. 4). Следовательно, в присутствии прото-нофора, диссипирунцего протондвикущую силу, формадьдегци окисляется только при участии ВДР, т.е. я периплазме, что указывает на существование у Мс.иЬеппорЬИиз системы активного транспорта »того соединения, подавляемой протонофоромТ

Далее мы установили, что прекращение окисления формальдегида наступает через 8-10 минут после добавления протонофора к клеткам. Аналогичные результаты были получены в анаэробных условиях с ацетальдегидои и пропионовым альдегидом добавление про-

Е гс

ш

тонофора приводило к полному прекращения их восстановления клетками только через 10 ■ минут (рис, 5.).Мнный эксперимент может служить доказательством энергозависимого поглощения альдегидов,так как АР расположена а цитоплазме, a FCCP не влияет на активность этого фермента la vitro.Данный эксперимент позволяет таюке предположить, что система транспорта формальдегида неспецн&ична в отношении этого вещества.

Эксперименты с проникавшим катионом ТМ+ позволили установить ^ что процесс транспорта альдегидов зависит от обоих компонентов протондвюкущей силы, Ifa исследовали тате влияние осмотического шока на процесс окисление формальдегида. Оказалось, что его действие аналогично действию протонофоров. Это свидетельствует об участки в процессе транспорта пернплаэматического альде-гцдсвяэывающего белка.

Заключение. На основании полученных нами результатов мы предлагаем следующую схему организации процессов окисления мета-

. го

время, МИН

Рис. 5. Восстановление ацеталь-дегида (1,3) в этанол (2,4) клетками U о, themophilus (2 мг АСБ/нл) в анаэробных условиях в присутствии УССР (1,2) и без РССР" (3,4)

■ на а клетках Мс. -ььег-

| биомасса | „ , ..

'—-у-—1 ^¿.Щ ворЬІІца (рве. 6).

Метан, путем активного транспорта, зависимого от мембранного потенциала, поглощается клетками и моноок-сигенируется.Продукт этой реакции - метанол - выходит в периплазму, где подвергается реакции дегидрирования * при участии МДГ. Электроны метанола через цнтохром ссо переносятся к ШЮ или терминальной оксидазе, а протоны и формальдегид остаются в периплазме. Формальдегид проникает через ЦЇЇМ в цитоплазму при помощи механизма активного транспорта с участием пе-риллаэматического альдегидевяэывающего белка. Дальнейшие превращения формальдегида связаны либо с фиксацией для нужд конструктивного метаболизма, либо с окислением до Сй>, причем процесс окисления одного моля формальдегида сопровождается восстановлением двух молей над+ до НЩ. кроме втого часть формальдегида может быть восстановлена до метанола за счет электронов и протонов НАДН при участии АР. Эта реакция является частью механизма циклического формирования электрохимического градиента протонов . на ЩШ. ■ ' .

Рис. 6. Схема организации процесса трансформации метана в клетке Мо. ЫгегнюрЫХив

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Метая поглощается клетками lie. tberraophilue при учас-

, тии »нергозависимой системы транспорта. Система активного транспорта метана использует энергию разности электрического потенциала на цитоплазматической мембране.

2. Окисление экзогенного метанола в клетках lio. tbexaophi-lua катализирует два фермента - метанмонооксигенаэа и нетанол-дегидрогеназа. Метанол, образующийся из метана, окисляется главным образом с участием метанолдегидрогенаэы,

3. Метанолдегидрогеназа в клетках Uc.thermophilue прочно ассоциирована с наружной стороной цитоплазматической мембраны.

4. Восстановление кислорода за счет электронов, освобождающихся в метаноддегцдрогеназной реакции, осуществляется при участии трех терминальных оксидаэ, одной из которых может служить ЫШ. Не исключено, что этот фермент способен также выполнять роль терминальной окендазы при окислении НАДК в отсутствие углеводородного субстрата.

5. Формальдегид, образующийся из метанола в периплазме бактерий Мс»tberaophilue проникает в цитоплазм путем активного транспорта. В состав системы транспорта формальдегида входит пе-рк плазматический альдегиде вяз ывающий белок.

6. Фортьдегид окисляется в цитоплазме бактерий КсДЬвш-рМХив сопряженно с восстановлением НАД(Ф)+. Реакция окисления НАДН является лимитирующим этапом окисления экзогенного формальдегида.

7. Метанолдегидрогеназа не катализирует в клетке окисление форюльдегида в процессе роста на метане, однако при повьюении концентрации этого соединения вше определенного уровня часть

его может окисляться при ее участии. ЧЦГ» очевидно, осуществляет контроль содержания свободного формальдегида в периплазме бактерий ис.ШегаорьИи&Подавление транспорта формальдегида через цитошгазматическую мембрану путем осмотического шока или диссипации протондвижущей силы приводит к тому, что ЦДГ приобретает способность катализировать окисление формальдегида независимо от его концентрации. Не исключено поэтому, что на уровне системы транспорта этого соединения осуществляется регуляция скоростей поступления формальдегида в цитоплазму и окисления в периплазме.

6. Обнаруженный нами в клетках Мс.гЬегшорЬИив неизвестный ранее для ыетанокислящш бактерий фермент - альдегидредук-таза - локализован в цитоплазме и катализирует восстановление формальдегида, ацетальдегида и пропионового альдегида в соответствующие спирты сопряженно с окислением НАДН. Альдегидредуктаза мсжет участвовать а системе реакций, приводящих к генерации протондвккущей силы на цнтотазматической мембране за счет энергии НАДН без участия НАДН-дегцдрогенаэы и протонных насосов, а также контролирует содержание формальдегида в цитоплазме клеток.

СШЮСК РАВОТ,ОПУБЛШОБШШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Соколов И.Г., Пянчух Г.Э. Циклический механизм формирования протонного градиента у метанокисляющкх бактерий м«*£цг1оео-- сша гь«1еюрЫ1и*У Проблемы современной биолог** : Тр. 17-й науч. конф. молодых ученых биол.ф-та МГУ (¿¿осква, 22-25 апр. 1986 р.)- Ч. I. - С. 116-121. - Дел. ъ ВИЩСМ 12.09.86 » 6642-В.

2. Пинчук Г.Э., Малашенко Ю.Р. Активный транспорт метана в клетки метанокнсляшцих бактерий Hethylococcua themophl-lus // УП съезд Укр. минробиол. об-ва : Тез. докл. (Черновцы, сентябрь, 1969 г.). - Ч. I. - 1989. - С. 78-79.

3. Пинчук Г.Э,, Романовская В.А. Локализация процессов окисления ыетанола и формальдегида в клетках метанокисляицкх бактерий // УП съезд Укр. ыикробиол. об-ва : Тез докл. (Черновцы, сентябрь, 1989 г.). - Ч. I. - 1989. - С. 79.

4. Соколов И.Г., Столяр С.М., Криттаб Т.П., Пинчук Г.Э. Роль метанмонооксигеназы при ассимиляции ыетанола метанокисляоци-мн бактериями // Ыикробиол. журн. - 1989. - Т. 51, » 2. -

С. 38-46.

5. Piacbulc G.E. Parti cipatioa of fo гаaldehyde active transport la its assimilation by Uethylococcus theaeopMlus cells // 6tb International eyepoeium on microbial growth on C^ compounds. - Gottingen (PBS), 1989. - P.

6. Pinohuk G.B., Sokolov I.e., IfalashenJco Т.Й. Membrane potential-dependent methane uptake by the Uethylococcus ther-mophllua cells // 6th International eympoalna cm microbial growth on Cj. compounds. - aSttingen (РШ), I9S9. -P.440.

Подп, кгеч .¿.03-?C Бф ¿7tOt Форматер» J^f By мага tyie. Пет. офс. Усл. леч. л. Уч.-вэд. л. / Тираж too.

. Бесплатно.

Киевская кивгккзя типография научной книги. Киев, Репина, 4.