Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Несопряженная NADH

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Берцова, Юлия Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Краткое описание фиксации молекулярного азота и структуры нитрогеназного комплекса

2. Влияние кислорода на активность нитрогеназного комплекса

3. Регуляция экспрессии нитрогеназного комплекса

4. Защита нитрогеназного комплекса от повреждающего действия кислорода у различных азотфиксирующих микроорганизмов

5. Положение в систематике и некоторые общие характеристики Azotobacter vinelandii

6. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у A.vinelandii

7. Дыхательная цепь A.vinelandii

7.1 Терминальные оксидазы A.vinelandii

7.1.1. Цитохромоксидаза о-типа

7.1.2. Хинолоксидаза М-типа.

7.2. Роль хинолоксидазы bd-типа A.vinelandii в реализации механизма дыхательной защиты

7.3. Кислород-зависимая регуляция хинолоксидазы

W-типау A.vinelandii

7.4. Азот-зависимая регуляция хинолоксидазы М-типа

7.5. Предполагаемая роль первичных дегидрогеназ дыхательной цепи A.vinelandii в осуществлении дыхательной защиты

7.6. Бактериальные NADH:xhhoh оксидоредуказы

7.6.1. NADH:xhhoh оксидоредуктаза I (NDH Г)

7.6.1. NADH:xhhoh оксидоредуктаза II (NDH II)

7.6.3. Окисление NADH дыхательной цепью A.vinelandii

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культивирование бактерий.

1.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе.

1.2. Выращивание клеток A. vinelandii и Е. coli.

1.3. Хранение и проверка используемых штаммов.

2. Определение концентрации белка.

3. Получение клеточного лизата и суббактериальных частиц из клеток A.vinelandii и E.coli.

4. Определение цитохромного состава суббактериальных частиц, выделенных из клеток A.vinelandii.

5. Определение соотношения Н+/е" для ферментов дыхательной цепи A.vinelandii

6. Регистрация дыхания клеток или суббактериальных частиц A.vinelandii

7. Измерение генерации ДрН на суббактериальных частицах A. vinelandii с флуоресцентным индикатором акридиновым оранжевым.

8. Измерение генерации на суббактериальных частицах A.vinelandii с оксанолом VI.

9. Регистрация окисления NADH и dNADH клеточным лизатом или суббактериальными частицами A.vinelandii и E.coli.

10. Определение Кт для различных субстратов для NDH I и NDH II

11. Определение величины KLa (ммоль Ог х л"1 х ч'1), характеризующей поток кислорода.

12. Получение ndh~ штамма A.vinelandii методом направленного мутагенеза.

12.1. Амплификация фрагмента гена ndh

12.2. Клонирование ПЦР продукта в вектор pGEM-T

12.3 .Получение конструкции pGEM/ndh: :Тс

12.4. Получение компетентных клеток A.vinelandii

12.5. Трансформация компетентных клеток A.vinelandii.

12.6. Сегрегация мутации в гене ndh у A.vinelandii DN

12.7. Получение конструкций для определения нуклеотидной последовательности целого гена ndh.

12.7.1. "Высвобождение плазмиды"

12.7.2. ПЦР с "обратных" праймеров

12.8. Стандартные генетические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Исследование протонтранслоцирующей активности хинолоксидазы bd-imia А. vinelandii.

2. Исследование альтеративной терминальной ветви дыхательной цепи A.vinelandii.

3. Исследование окисления NADH дыхательной цепью A.vinelandii.

4. Исследование протонтранслоцирующей активности

NADU :убихинон оксидоредуктаз A.vinelandii.

5. Исследование экспрессии активности NDH I и NDH II у A.vinelandii при различных условиях выращивания.

6. Получение несодержащего NDH II штамма A.vinelandii

6.1. Клонирование фрагмента гена ndh из A.vinelandii'.

6.2. Внесение кассеты устойчивости к тетрациклину в клонированный фрагмент.

6.3. Внесение мутации в хромосомальную ДНК

A.vinelandii UW136.

7. Определение ферментного состава NADH дегидрогеназного участка дыхательной цепи мутантного штаммаDN165 A.vinelandii.

8. Роль несопряженной NADH:v6hxhhoh оксидоредуктазы в чувствительности к кислороду азотофиксирующей культуры A.vinelandii. 82 9. Определение первичной нуклеотидной последовательности гена ndh A.vinelandii.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Несопряженная NADH"

Большинство азотофиксирующих бактерий не способно ассимилировать N2 в условиях высокого содержания кислорода в окружающей среде, так как нитрогеназный комплекс, осуществляющий реакцию восстановления азота, необратимо инактивируется при взаимодействии с 02. Исключением из этого правила является строго аэробный микроорганизм Azotobacter vinelandii, который эффективно фиксирует молекулярный азот даже при очень высоких концентрациях 02 в среде роста. Однако, нитрогеназный комплекс этого микроорганизма также чувствителен к кислороду, как и у других бактерий. Таким образом, должен существовать какой-то специальный механизм, позволяющий A.vinelandii защищать нитрогеназу от инактивации 02. Была высказана гипотеза о том, что такая защита достигается в результате значительного понижения цитоплазматической концентрации кислорода за счет очень интенсивного дыхания. Этот механизм получил название "дыхательной защиты" и был подтвержден в результате большого количества исследований в различных лабораториях.

В том числе исследовалось, какие именно ферменты электрон-транспортной цепи A.vinelandii ответственны за осуществление механизма дыхательной защиты. Так было показано, что терминальная оксидаза bd-типа является необходимой для диазотрофного роста A.vinelandii при высоких концентрациях кислорода. То есть, эффективное снижение концентрации 02 в цитоплазме достигается, по-видимому, за счет быстрой работы именно этого фермента. Однако, для того, чтобы на терминальном участке дыхательной цепи A.vinelandii мог идти процесс быстрого восстановления кислорода за счет работы цитохрома bd, на ее начальном участке также должен существовать фермент, способный быстро передавать восстановительные эквиваленты на эту терминальную оксидазу.

В данной работе предполагалось исследовать особенности дыхательной цепи A.vinelandii, позволяющие этой бактерии осуществлять механизм дыхательной защиты. В частности, планировалось идентифицировать фермент начального участка электрон-транспортной цепи A.vinelandii, ответственный за реализацию высоких скоростей дыхания, и изучить его роль в защите нитрогеназного комплекса от повреждающего действия О2.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Берцова, Юлия Васильевна

выводы

1. Хинолоксидаза bd-тшш A.vinelandii способна к генерации протонного потенциала, и эффективность сопряжения для данного фермента составляет 1 Н+/е".

2. Перенос восстановительных эквивалентов с убихинола на терминальную оксидазу о-типау A.vinelandii осуществляется 6с[-комплексом.

3. Окисление NADH в дыхательной цепи A.vinelandii осуществляется двумя различными ферментами: сопряженной и несопряженной с генерацией протонного потенциала NADH-.убихинон оксидоредуктазами. (NDH I и NDH И, соответственно)

4. Удельная активность NDH I и NDH II в клетках A.vinelandii зависит от концентрации кислорода и связанного азота в среде выращивания. При повышении концентрации 02 активность несопряженной NADH дегидрогеназы увеличивается, в то время как активность сопряженного фермента уменьшается. При переходе культуры клеток A.vinelandii к диазотрофному росту активность NDH II увеличивается, а активность NDH I не изменяется.

5. Кислород-зависимая регуляция соотношения NADH:y6nxHHOH оксидоредуктаз у A.vinelandii осуществляется с участием Fnr-подобного белка CydR.

6. NADPH-оксидазная активность дыхательной цепи A.vinelandii осуществляется несопряженной NADH дегидрогеназой.

7. Штамм A.vinelandii с генетически инактивированной несопряженной NADH:xhhoh оксидоредуктазой не способен к росту в диазотрофных условиях при высокой концентрации кислорода.

8. Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что несопряженная NADH:xhhoh оксидоредуктаза необходима для осуществления дыхательной защиты нитрогеназного комплекса у A.vinelandii.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Берцова, Юлия Васильевна, Москва

1. Львов, Н.П. (1987) "Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов" 43 ежегодные Баховские чтения. М. "Наука", стр.7-14.

2. Маниатис, Т., Фрич, Э., и Сембрук, Дж. (1984) "Молекулярное клонирование", М. "Мир".

3. Мишустин, Е.Н., Шильникова, В.К. (1968) "Биологическая фиксация атмосферного азота", М. "Наука", стр. 249-257.

4. Хмель, И.А., Габинская, К.Н., Иерусалимский, Н.Д. (1965) "Рост и азотфиксация Azotobacter vinelandii в условиях различной аэрации", Микробиология, 34, стр. 689-694.

5. Хмель, И.А., Габинская, К.Н. (1965) "Влияние аэрации на рост Azotobacter vinelandii при использовании различных соединений углерода", Микробиология, 34, стр. 763-767.

6. Ackrell, В.А., and Jones, C.W. (1971a) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. I Properties of phosphorylating respiratory membranes. Eur. J. Biochem., 20, 22-28.

7. Ackrell, B.A., and Jones, C.W. (1971b) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. 2. Oxygen effects. Eur. J. Biochem., 20, 29-35.

8. Ackrell, B.A., Erickson, S.K., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain NADPH dehydrogenase of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 26, 387392.

9. Bauer, C.E., Elsen, S., and Bird, Т.Н. (1999) Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol, 53, 495-523.

10. Bergey's manual of systematic bacteriology. (1984) Krieg N.R.(editor), Williams and Wilkins, Baltimore/London, Vol. 1., 220-231.

11. Bjorklof, K„ Zickermann, V., and Finel, M. (2000) Purification of the 45 kDa, membrane bound NADH dehydrogenase of Escherichia coli (NDH-2) and analysis of its interaction with ubiquinone analogues. FEBS Lett., 467, 105-110.

12. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. (1996) H+/e stoichiometry for NADH dehydrogenase I and dimethyl sulfoxide reductase in anaerobically grown Escherichia coli cells. J. Bacteriol, 178, 6233-6237.

13. Borisov, V.B. (1996) Cytochrome bd: structure and properties. Biochemistry (Moscow), 61, 565-574.

14. Borisov, У., Arutyunyan, A.M., Osborne, J.P., Gennis, R.B., and Konstantinov, A.A. (1999) Magnetic circular dichroism used to examine the interaction of Escherichia coli cytochrome bd with ligands. Biochemistry, 38, 740-750.

15. Bourne, R.M., and Rich, P.R. (1992) Characterization of a sodium motive NADH:ubiquinone oxidoreductase. Biochern. Soc. Trans., 20, 577-582.

16. Brigle, K.E., Newton, W.E., and Dean, D.R. (1985) Complete nucleotide sequence of the Azotobacter vinelandii nitrogenase structural gene cluster. Gene, 37, 37-44.

17. Calhoun, M.W., and Gennis, R.B. (1993) Demonstration of separate genetic loci encoding distinct membrane-bound respiratory NADH dehydrogenases in Escherichia coli. J. Bacteriol., 175, 3013-3019.

18. Cotter, P.A., and Gunsalus, R.P. (1989) Oxygen, nitrate, and molybdenum regulation of dmsABC gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol., 171, 3817-3823.

19. Cotter, P.A., Chepuri, R.B., and Gunsalus, R.P. (1990) Cytochrome о (cyoABCD) and d (cyJAB) oxidase genes in Escherichia coli are regulated by oxygen, pH, and the for gene product. J. Bacteriol, 172, 6333-6338.

20. Dalton, H., and Postgate, J.R. (1968). Effect of oxygen on growth of Azotobacter chroococcum in continuous culture. J. Gen. Microbiol., 54, 463473.

21. Dalton, H., and Postgate, J.R. (1969). Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture. J. Gen. Microbiol, 56, 307-319.

22. D'Mello, R„ Purchase, D., Poole, R.K., and Hill, S. (1997) Expression and content of terminal oxidases in Azotobacter vinelandii grown with excess NH4+ are modulated by 02 supply. Microbiology, 143, 231-237.

23. Dolganov, N., and Grossman, A.R. (1993) Insertional inactivation of genes to isolate mutants of Synechococcus sp. strain PCC 7942: isolation of filamentous strains. J. Bacteriol, 175, 7644-7651.

24. Erickson, S.K., Ackrell, B.A., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain dehydrogenases of Azotobacter vinelandii. Biochem J., 127, 73-74.

25. Fay, P. (1992) Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev., 56, 340-373.

26. Fellay, R., Frey, J., and Krisch, H. (1987) Interposon mutagenesis of soil and water bacteria: a family of DNA fragments designed for in vitro insertional mutagenesis of gram-negative bacteria. Gene, 52, 147-154.

27. Finel, M., and Majander, A. (1994) Studies on the proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductases of mitochondria and Escherichia coll using the inhibitor 1,10-phenanthroline. FEBSLett., 339, 142-146.

28. Finel, M. (1996) Genetic inactivation of the. H"-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase of Paracoccus denitrificans is facilitated by insertion of the ndh gene from Escherichia coli. FEBS Lett., 393, 81-85.

29. Friedrich, T. (1998) The NADH-.ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 134-146.

30. Fu, H.-A., Iuchi,S., and Lin, E.C.C. (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions. Mol. Gen. Genet., 226, 209-213.

31. Galkin, A.S., Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (1999) H+/2e" stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles. FEBSLett., 451, 157-161.

32. Gil, A., Kroll, R.G., and Poole. R.K. (1992) The cytochrome composition of the meat spoilage bacterium Brochothrix thermosphacta: identification of cytochrome a3-and fl?-type terminal oxidases under various conditions. Arch. Microbiol., 158, 226-233.

33. Glick, B.R., Brooks, H.E., and Pasternak, J.J. (1985) Transformation of Azotobacter vinelandii With. plasmid'DNA. J. Bacteriol., 162, 276-279.

34. Green, G., Kranz, J., and Gennis, R.B. (1984) Cloning of the cyd gene locus coding for the cytochrome d complex of Escherichia coli. Gene, 32, 99-106.

35. Guenebaut, V., Vincentelli, R., Mills, D., Weiss, H., and Leonard, K.R. (1997) Three-dimensional structure of NADH-dehydrogenase from Neurospora crassa by electron microscopy and conical tilt reconstruction. J. Mol. Biol, 265, 409-418.

36. Gunsalus, R.P. (1992) Control of electron flow in Escherichia coli: coordinated transcription of respiratory pathway genes. J. Bacteriol., 174, 70697074.

37. Haddock, B.A., and Jones C.W. (1977) Bacterial respiration. Bacteriological Reviews, 41, 47-99.

38. Hill, J.J., Alben, J.O., and Gennis, R.B. (1993) Spectroscopic evidence for a heme-heme binuclear center in the cytochrome bd ubiquinol oxidase from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5863-5867.

39. Hill, S. (1988) How is nitrogenase regulated by oxygen? FEMSMicrobiol. Rev., 54, 111-130.

40. Hill, S., Austin, S., Eydmann, Т., Jones, Т., and Dixon, R. (1996) Azotobacter vinelandii NIFL is a flavoprotein that modulates trancriptionalactivation of nitrogen-fixation genes via a redox-sensitive switch. Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 2143-2148.

41. Hoffman, P.S., Morgan, T.V., and DerVartanian, D.V. (1979) Respiratory-chain characteristics of mutants of Azotobacter vinelandii negative to tetramethyl-p-phenylenediamine oxidase. Eur. J. Biochem., 100, 19-27.

42. Hoffman, P.S., Morgan, T.V., and DerVartanian, D.V. (1980) Respiratory properties of cytochrome c-dificient mutants of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 110, 349-354.

43. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23-28.

44. Jaworowski, A., Mayo, G., Shaw, D.C., Campbell, H.D., and Young, I.G. (1981) Characterization of the respiratory NADH dehydrogenase of Escherichia coli and reconstitution of NADH oxidase in ndh mutant membrane vesicles. Biochemistry, 20, 3621-3628.

45. Jones, C.W., and Redfearn, E.R. (1966) Electron transport in Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 113, 467-481.

46. Jones C.W., and Redfearn E.R. (1967) The cytochrome system of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 143, 340-353.

47. Jones, C.W., Ackrell, B.A., and Erickson, S.K. (1971) Respiratory control in Azotobacter vinelandii membranes. Biochim. Biophys. Acta, 245, 54-62.

48. Jones, C.W., Brice, J.M., Wright, V., and Ackrell, B.A. (1973) Respiratory protection of nitrogenase m Azotobacter vinelandii. FEBSLett., 29, 77-81.

49. Jones, H.M., and Gunsalus, R.P. (1987) Regulation of Escherichia coli fumarate reductase (frdABCD) operon expression by respiratory electron acceptors and the fnr gene product. J. Bacteriol., 169, 3340-3349.

50. Jordan, P.A., Thomson, A.J., Ralph, E.T., Guest, J.R., and Green, J. (1997) FNR is a direct oxygen sensor having a biphasic response curve. FEBS Lett., 416, 349-352.

51. Junemann, S. (1997) Cytochrome bd terminal oxidase (Review) Biochim. Biophys. Acta, 1321, 107-127.

52. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1994) Antimycin inhibition of the cytochrome bd complex from Azotobacter vinelandii indicates the presence of a branched electron transfer pathway for the oxidation of ubiquinol. FEBS Lett., 345, 198-202.

53. Junemann, S., Butterworth, P.J., and Wrigglesworth, J.M. (1995). A suggested mechanism for the catalytic cycle of cytochrome bd terminal oxidase based on kinetic analysis. Biochemistry, 34, 14861-14867.

54. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1996). Cytochrome bd oxidase from Azotobacter vinelandii. Purification and quantitation of the oxygen reduction site. J. Biol. Chem., 270, 16213-16220.

55. Jurtshuk, P.Jr., Mueller, T.J., and Wong, T.Y. (1981). Isolation and purification of the cytochrome oxidase of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 637, 374-382.

56. Khoroshilova, INC., Beinert, H., and Kiley, P. (1995) Association of a polynuclear iron-sulfur center with a mutant FNR protein enhances DNA binding. Biochemistry, 92, 2499-2503.

57. Kranz, R.G., and Gennis, R.B. (1985) Immunological investigation of the destribution of cytochromes related to the two terminal oxidases of of Escherichia coli in the other gram-negative bacteria. J. Bacteriol., 161, 709713.

58. Lambden, P.R., and Guest, J.R. (1976) Mutants of Escherichia coli K12 unable to use fumarate as an anaerobic electron acceptor. J. Gen. Microbiol, 97, 145-160.

59. Leif, H., Sled', V.D., Ohnishi, Т., Weiss, H., and Friedrich, T. (1995) Isolation and characterization of the proton-translocating NADH-ubiquinon oxidoreductase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 230, 538-548.

60. Leif, H., Weidner, U., Berger, A., Spehr, V., Braun, M., van Heek, P., Friedrich, Т., Ohnishi, Т., and Weiss, H. (1993) Escherichia coli NADH dehydrogenase I, a minimal form of the mitochondrial complex I. Biochem Soc Trans., 21, 998-1001.

61. Linkerhagner, K., and Oelze, J. (1996). Cellular ATP levels and Nitrogenase switchoff upon oxygen stress in chemostat cultures of Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol, 177, 5289-5293.

62. Matsushita, K., Ohnishi, Т., and Kaback, H.R. (1987) NADH-ubiquinon oxidoreductases of the Escherichia coli aerobic respiratory chain. Biochemistry, 26, 7732-7737.

63. Maynard, R.H., Premakumar, R., and Bishop, P.E. (1994). Mo-independent nitrogenase 3 is advantageous for diazotrophic growth of Azotobacter vinelandii on solid medium containing molybdenum. J. Bacteriol, 176, 5583-5586.

64. Moshiri, F., Chawla, A., and Maier, R.J. (1991a). Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the genes encoding the cytochrome d oxidase complex from Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol, 173, 6230-6241.

65. Nagpal, P.J.S., Retldy, M.A., and Das, H.K. (1989) Multiple chromosomes of Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol, 171, 3133-3138.

66. Oelze, J. (2000) Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter species: is a widely held hypothesis unequivocally supported by experimental evidence? FEMS Microbiol. Rev., 24, 321-333.

67. Osborne, J.P., and Gennis, R.B. (1999) Sequence analysis of cytochrome bd oxidase suggests a revised topology for subunit I. Biochim. Biophys. Acta, 1410, 32-50.

68. Page, W.J., and von Tigerstrom, M. (1978) Induction of transformation competence in Azotobacter vinelandii iron-limited cultures. Can. J. Microbiol., 24, 1590-1594.

69. Peters, J.W., Stowell, M.H.B., Soltis, S.M., Finnegan, M.G., Johnson, M.K.,and Rees, D.C. (1997) Redox-dependent structural changes in the nitrogenase P-cluster. Biochemistry, 36, 1181-1187.

70. Poole, R.K. (1994). Oxygen reactions with bacterial oxidases and globins: binding, reduction and regulation. Antonie van Leewenhoek, 65, 289-310.

71. Poole, R.K., and Hill, S. (1997) Respiratory protection of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii roles of the terminal oxidases. Biosci. Rep., 17, 303317.

72. Post, E., Kleiner, D., and Oelse, J. (1983a) Whole cell respiration and nitrogenase activities in Azotobacter vinelandii growing in oxygen controlled continuous culture. Arch. Microbiol, 134, 68-72.

73. Post, E., Vakalopoulou, E., and Oelse, J. (1983b) On the relationship of intracytoplasmic to cytoplasmic membranes in nitrogen-fixing Azotobacter vinelandii. Arch. Microbiol, 134, 265-269.

74. Puustinen, A., Finel, M., Haltia, Т., Gennis, R.B., and Wikstrom, M. (1991) Properties of two terminal oxidases of Escherichia coli. Biochemistry, 30. 39363942.

75. Rey, L., and Maier, R.J. (1997) Cytochrome с terminal oxidase pathway of Azotobacter vinelandii: analysis of cytochrome c4 and c5 mutants and upregulation of cytochrome c-dependent pathways with N2 fixation. J. Bacteriol, 179, 7191-7196.

76. Reynafarje, В., Costa, L.E., and Lehninger, A.L. (1985). 02 solubility in aqueous media determined by a kinetic method. Anal. Biochem., 145, 406-418.

77. Rich, P.R., Meunier, В., and Ward, F.B.(1995) Predicted structure and possible ionmotive mechanism of the sodium-linked NADH-ubiquinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 375, 5-10.

78. Rieske, J.S. (1976) Composition, structure, and function of complex III of the respiratory chain. Biochim. Biophys. Acta, 456, 195-247.

79. Robson, R.L., and Postgate, J.R. (1980) Oxygen and hydrogen in biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Microbiol., 34, 183-207.

80. Shen, J., Dean, D.R., and Newton, W.E. (1997) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Biochemistry, 36, 4884-4894.

81. Smith, A., Hill, S., and Antony, C. (1990) The purification, characterisation and role of the <i-type cytochrome oxidase of Klebsiella pneumoniae during nitrogen fixation .J. Gen. Microbiol., 136, 171-180.

82. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150, 76-85.

83. Spiro, S., and Guest, J.R. (1988) Inactivation of the Fnr protein of Escherichia coli by targeted mutagenesis in the N-terminal region. Mol. Microbiol., 2, 701707.

84. Spiro, S., Roberts, R.E., and Guest, J.R. (1989) FNR-dependent repression of the ndh gene of Escherichia coli and metal ion requirement for FNR-regulated gene expression. Mol. Microbiol., 3, 601-608.

85. Spiro, S., and Guest, J.R. (1991) Adaptive responses to oxygen limitation in

86. Escherichia coli. Trends Biochem. Sci, 16, 310-314.

87. Stewart, V. (1982) Requirement of Fnr and NarL functions for nitrate reductase expression in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 151, 1320-1325.

88. Thony-Meyer, L., Beck, C., Preisig, O., and Hennecke, H. (1994) The ccoNOQP gene cluster codes for a cb-type cytochrome oxidase that functions in aerobic respiration of Rhodobacter capsulatus. Mol. Microbiol, 14, 705716.

89. The Procaryotes. A handbook on habitats, isolation, and identification of bacteria. (1984) Edited by M.P. Starr at.set., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York. Yol.l, p.795.

90. Weiss, H., Friedrich, Т., Hofhaus, G., and Preis, D. (1991) The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur. J. Biochem., 197, 563-576.

91. Wikstrom, M. (1984) Two protons are pumped from the mitochondrial matrix per electron transferred between NADH and ubiquinone. FEBS Lett., 169, 300304.

92. Wikstrom, M., and Penttila, T. (1982) Critical evaluation of proton-translocating property of cytochrome oxidase in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 144, 183-189.

93. Wikstrom, M., Bogachev, A., Finel, M., Morgan, J.E., Puustinen, A., Raitio, M., Verkhovskaya, M., and Verkhovsky, M.I. (1994) Mechanism of proton translocation by the respiratory oxidases. The histidine cycle. Biochim. Biophys. Acta, 1187, 106-111

94. Williams, A.M., and Wilson P.W. (1954) Adaptation of Azotobacter cells to tricarboxylic acid substrates. J. Bacteriol. 67, 353-360;

95. Wong, T.Y., and Maier, R.J. (1985). Chlorpromazine inhibition of electron transport in Azotobacter vinelandii membranes. Biochim. Biophys. Acta, 807, 320-323.

96. Wu.,G., Hill, S., Kelly, M.J.S., Sawers, G., and Poole, R.K. (1997) The cydR gene product, required for cytochrome bd expression in obligate aerobe Azotobacter vinelandii, is an FNR-like protein. Microbiology, 143, 2197-207.

97. Yagi, T. (1990) Inhibition by capsaicin of NADH-quinone oxidoreductase is correlated with the presence of energy-coupling site 1 in various organisms. Arch. Biochem. Biophys281, 305-3 1 1.

98. Yagi, T. (1991) Bacterial NADH-quinone oxidoreductases. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 211-225.

99. Yates, M.G. (1988). The role of oxygen and hydrogen in nitrogen fixation. In The nitrogen and sulphur cycles. I.A. Cole and S.I. Ferguson (ed.), University Press. Cambridge, Vol. 42, p.386-416.

100. Young, I.G., Rogers, B.L., Campbell, H.D., Jaworowski, A. and Shaw, D.C. (1981) Nucleotide sequence coding for the respiratory NADH dehydrogenase of Escherichia coli. UUG initiation codon. Eur. J. Biochem., 116, 165-170.

101. Zheng, L., White, R.H., Cash, Y.L., Jack, R.F., and Dean, D.R. (1993) Cysteine desulfurase activity indicates a role for NIFS in metallocluster biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 2754-2758.

102. Так же, хотелось бы высказать особую благодарность Александру Валерьевичу Богачеву, совместно с которым были получены результаты представленные в данной работе.