Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции разобщенного и несопряженного дыхания в проростках и культуре клеток томата: роль активных форм кислорода, света и пониженной температуры

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции разобщенного и несопряженного дыхания в проростках и культуре клеток томата: роль активных форм кислорода, света и пониженной температуры"

На правах рукописи

Мальцева Елена Витальевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РАЗОБЩЕННОГО И НЕСОПРЯЖЕННОГО ДЫХАНИЯ В ПРОРОСТКАХ И КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ТОМАТА: РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА, СВЕТА И ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ

Специальность 03.01.05. - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

2 3 ДЕК 2010

Воронеж 2010 г.

004618936

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Попов Василий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тимофеева Ольга Арнольдовна кандидат биологических наук Фоменко Олег Юрьевич

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «24» декабря 2010 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан •

Учёный секретарь диссертационного совета

ноября 2010 года.

Брехова Л. И.

ВВЕДЕНИЕ .

Актуальность проблемы. Растительные организмы обладают широким спектром защитно-приспособительных реакций, способствующих их устойчивости к разнообразным стрессовым факторам внешней среды. При этом физиологический стресс, индуцируя избыточную активацию метаболизма, может повышать общие адаптивные механизмы растительного организма и способствовать увеличению его устойчивости к возможным стрессовым воздействиям [Ishikawa М. et al., 1995].

Характерной особенностью организмов с аэробным типом метаболизма выступает наличие окислительного стресса в клетках. Поскольку растительные организмы не только потребляют кислород, но и образуют его в ходе фотосинтеза, процесс поддержания внутриклеточной концентрации кислорода на низком уровне является для них особенно важным [Скулачёв В. П., 1998].

Усиление генерации активных форм кислорода может быть одной из причин развития повреждений живых организмов при воздействии неблагоприятных факторов различной природы [Mittler R., 2002]. Реакция растений на стресс заключается в различных перестройках метаболических и физиологических процессов, имеющих своей целью адаптацию растительного организма к изменившимся условиям. При этом возрастают энергозатраты клетки и происходит усиление эффективности дыхания [Семихатова О. А., 1995].

Интересно отметить, что растения обладают сложной системой путей несопряженного транспорта электронов, обходящих генераторы протонов электрон-транспортной цепи. Так, для митохондрий высших растений было показано, что окисление НАДН осуществляется помимо комплекса I ЭТЦ системой несопряженных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, локализованных на внутренней и внешней стороне внутренней мембраны митохондрий, а цианид-резистентная альтернативная оксидаза (АО) характеризуется более низким сродством к кислороду, чем цитохромоксидаза и индуцируется в том случае, когда концентрация кислорода становится выше оптимальной для протекания энергозапасающих процессов [Millenaar F. F., 2003, Moller I. M., 2001]. Ранее было предположено, что альтернативная оксидаза должна коэкспрессироваться с ротенон-нечувствительными НАД(Ф)Н-дегидрогеназами, причем вторичными мессенджерами для обоих систем могут выступать активные формы кислорода [Берцова Ю. В. и др., 2004].

Wagner показала, что HiOi может индуцировать экспрессию генов АО в растительных тканях [Wagner А. М„ 1995]. Активация синтеза АО также наблюдалась у растений и дрожжей, выращиваемых в присутствии антимицина A [Minagawa N. et al., 1992], когда супероксид-радикал является вторичным мессенджером.

Повышение мембранного потенциала и увеличение времени жизни убисемихинона стимулирует образование АФК митохондриями [Korshunov S. S., 1997]. Обнаруженные в митохондриях стеблей гороха и гипокотелей подсолнечника АДФ/АТФ-антипортер, а также UCP-подобный белок картофеля PUMP участвуют в индуцированном жирными кислотами разобщении. Данный факт позволил сделать предположение, что разобщённое дыхание может быть адаптивным механизмом при воздействии пониженных температур как за счёт стимулирования термогенеза, так и за счёт снижения мембранного потенциала, а, следовательно, и скорости генерации активных форм кислорода.

В настоящее время одной из актуальных проблем при изучении ферментативных систем растений является также влияние света на дыхательный метаболизм и цикл трикарбоновых кислот. На сегодняшний день имеются данные об участии фитохромов в регуляции ферментов дыхания [Matthew А.Е. et al., 2004]. Одним из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, который имеет важное значение в обеспечении клеточного дыхания, является малатдегидрогеназа (МДГ). Она представляет собой полифункциоиальный ферментный комплекс, обеспечивающий протекание конструктивного и энергетического обменов в клетке.

Вопросы экспрессионной регуляции большинства генов, кодирующих белки дыхательного метаболизма высших растений в условиях окислительного стресса, до сих пор остаются открытыми.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение влияния избыточной генерации активных форм кислорода, пониженных температур и света на экспрессию генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания С3-растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Получить каллусную культуру ткани томата in vitro.

2. Изучить динамику активности ряда ферментов окислительного метаболизма и антиоксидантной защиты при прорастании семян Lycopersicum esculentum Mill.

3. Определить органоспецифический уровень экспрессии генов, кодирующих белки несопряжённого и разобщённого дыхания, в разных органах проростков томата.

4. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов, кодирующих белки альтернативных путей дыхания, в условиях смены светового режима методом ПЦР-РВ в листьях томата.

5. Изучить динамику активности ряда ферментов антиоксидантной защиты и окислительного метаболизма при воздействии низкой положительной температуры и в условиях смены светового режима.

6. Исследовать влияние пониженной температуры на экспрессионную регуляцию генов, кодирующих белки альтернативных путей дыхания, в листьях томата.

7. Идентифицировать развитие окислительного стресса в культуре клеток томата in vitro в присутствии пероксида водорода и антимицина А по изменению ферментативной активности ряда ферментов и накоплению продукта перекисного окисления липидов.

8. Изучить влияние пероксида водорода и антимицина А на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sod3-l в культуре ткани томата in vitro.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы позволяют расширить и углубить представления о функциональной значимости белков разобщённого и несопряжённого дыхания митохондрий Сз-растений в условиях стресса.

Полученная каллусная культура ткани томата in vitro, используемая как модель окислительного стресса в клетках, даёт возможность выяснить роль активных форм кислорода в регуляции экспрессии генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания.

Использование количественного ПЦР анализа позволило установить, что максимальный уровень экспрессии генов альтернативных путей дыхания, наблюдаемый в тканях листа, позволяет растению гибко и эффективно регулировать потоки электронов в ЭТЦ митохондрий, адаптируя их в соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного

метаболизма клетки в процессе интенсивно протекающего фотосинтеза на свету.

Изменение экспрессии генов ndal, nadp-red, sod3-l и ant в листьях томата в условиях смены светового режима свидетельствует об участии белков, кодируемых данными генами, в поддержании нормального функционирования ЭТЦ в условиях избытка восстановительных эквивалентов, образующихся на свету в ходе фотосинтетических реакций. На основе анализа действия света различного спектрального состава изучен механизм регуляции гена mt-mdh в листьях кукурузы активной формой фитохрома. Активная форма фитохрома блокирует транскрипцию гена mt-mdh в листьях кукурузы, что приводит к уменьшению количества мРНК в клетке. Данный факт коррелирует с угнетением активности НАД+-зависимой малатдегидрогеназы в листьях растений под действием красного света.

С помощью ПЦР анализа в реальном времени в культуре томата in vivo при воздействии температуры +4 С показана значительная активация генов aoxla, ant и pump и некоторое повышение концентрации мРНК для генов ndal и ndbl, что свидетельствует об активном использовании томатом адаптивных механизмов для приспособления к пониженным температурам за счёт футильного реокисления восстановительных эквивалентов клетки без повышения синтеза АТФ. Снижение ферментативной активности аконитазы и увеличение в культуре ткани томата in vitro количества продуктов перекисного окисления липидов в присутствии в среде культивирования пероксида водорода и антимицина А свидетельствует о накоплении в тканях активных форм кислорода и, как следствие, о развитии окислительного стресса. При этом с помощью ПЦР анализа в реальном времени установлена активация генов aoxla, ant и pump, схожая с тем, что наблюдалась в обработанном холодом зелёном растении. Кроме того, перекись водорода увеличивала уровень экспрессии гена ndal, кодирующего внутреннюю НАД(Ф)Н-дегидрогеназу, а активность гена ndbl не менялась, что свидетельствует об участии альтернативных дыхательных путей в предотвращении избыточной генерации активных форм кислорода и в процессах термогенеза.

Практическая значимость. Представленные в работе результаты можно рассматривать как пример реакции высших растений на неблагоприятные факторы внешней среды.

Известно, что при выработке стрессового ответа происходит изменение в транспорте метаболитов, снижение активности путей, вовлечённых в образование АФК во время стресса, и индукция различных защитных белков, снижающих образование АФК. Одним из таких механизмов снижения уровня АФК в митохондриях высших растений является активация путей свободного окисления дыхательных субстратов.

Изучение отдельных механизмов регуляции белковых молекул растений в норме и при патологиях на генном уровне даёт широкие возможности для эффективного управления устойчивостью и продуктивностью культурных растений уже на организменном уровне.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 13-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2009, 2010), международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), материалах II Всероссийского с международным участием конгресса «Симбиоз Россия» (Пермь, 2009), межрегиональных конференциях, посвящённых памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2008, 2009, 2010), а также в научной сессии отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010).

Публикации. Основные результаты данной диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 8 статьях и 3 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (187 источников). Иллюстративный материал включает 29 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Для исследования экспрессионной регуляции гена mt-mdh в условиях разного светового режима в качестве объекта исследования использовали зелёные листья проростков кукурузы (Zea mays L., сорт «Воронежская 76»), выращенных гидропонным способом при t = 25°С с интенсивностью света 25 Ватг/м3. Для исследования экспрессионной регуляции генов несопряжённого и разобщённого дыхания в условиях стресса использовали зелёные листья проростков томата (Lycopersicum esculentum Mill., сорта «Волгоградский 323»), выращенные в грунте при 12-ти часовом световом дне в фитотроне «Флора» при интенсивности освещенности 25 Ватг/м2 и 21 дневную культуру ткани томата in vitro, полученную с использованием стандартной среды Мурасиге и Скуга с добавлением гормонов НУК и БАП в концентрации 2 мг/л.

Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили при 25°С с помощью спектрофотометрических методов на СФ-46 («Ломо», Россия).

Активность аконитазы (АГ, КФ 4.2.1.3) определяли по увеличению оптической плотности реакционной среды при 240 нм за счёт образования цисаконитовой кислоты.

Активности каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,0) в присутствии 3% пероксида водорода по снижению оптической плотности при 230 нм [Землянухин А. А. и др., 1996].

Активность малатдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.1.37) измеряли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционной смеси, определяемой скоростью расходования НАДН [Епринцев А. Т. и др., 2007].

Активность внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы (НАД(Ф)Н-ДГ, КФ 1.6.5.3) определяли по скорости расходования НАДН при 340 нм в присутствии в среде 1 мМ СаСЬ [Фоменко О. Ю., 2007].

Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) осуществляли с использованием бензидинового реактива при 530 нм [Землянухина О.А., 2003].

Определение активности супероксидцисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) проводили при 540 нм по методике, описанной С. Чевари [Чевари С., 1981].

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА). Метод определения основан на образовании триметилового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм в результате взаимодействия МДА с ТБК (тиобарбитуровая кислота) при высокой температуре в кислой среде [Popov V.N., 2001].

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Lowry с соавт. [Lowry О.Н. et al., 1951].

Экстракция суммарной РНК. Суммарную РНК из исследуемых объектов выделяли с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода экстракции [Hillary Е. S., 2000].

Обратная транскрипция. Проводили с помощью обратной транскриптазы M-MulV ("Fermentas", Литва) в присутствии олиго-dT-праймера в качестве затравки [Okayama Н., 1987].

Подбор праймеров. Осуществляли на основе сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых генов в геномах организмов различных таксономических групп в базах данных GeneBank, Swissprot и pdb с использованием алгоритма BLAST (США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Определение границ генов и их экзон-интронной структуры производилось при помощи программы GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html). Выравнивание последовательностей с целью выявления наиболее консервативных участков проводили с помощью программы AliBee (http://www.genebee.msu.su/services/malign reduced.html'). Проверку праймеров на наличие образования димеров и вторичных структур осуществляли с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).

Полиммеразная цепная реакция. Проводили с использованием набора реактивов «Амплификация ДНК» («Силекс», Россия) и генспецифических праймеров. Реакция проводилась в термоциклере Biometra Personal Cycler (Biomrtra, Германия) и «Тецик» (ДНК-Технология, Россия) по следующей схеме: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин,

затем 30 циклов: 95°С - 30 с, определённая для каждого гена Тт - 30 с, ITC -30 с, 12'С - 5 мин.

Аналитический электрофорез в агарозном геле. Для визуализации и анализа качества выделенной РНК и продуктов ПЦР использовался электрофорез в 1% геле агарозы фирмы Helicon (Россия). Результаты фиксировались цифровой видеокамерой Samsung и обрабатывались с помощью пакета программ Gel Explorer 1.0.

Определение концентрации нуклеиновых кислот. Определение концентрации и чистоты препаратов нуклеиновых кислот проводилось спектрофотометрическим методом на СФ-46 ("Ломо", Россия) при длине волны 260 нм и 280 нм.

Проведение ПЦР в реальном времени. Количественный ПЦР-анализ проводили с применением флуоресцентного красителя SYBR Green I с использованием набора реактивов фирмы «Синтол» (Россия) на приборе Chromo 4 (Biorad, США) [Ребриков Д.В., 2009]. Разработка праймеров проводилась с использованием программного обеспечения Fast PCR (Финляндия) и Primer3 [Rozen S. et al., 2000]. В качестве нормализатора использовали ген ef-la: F 5'-ACAAGATTGGTGGTATTGGAAC-3\ R 5'-GGTGCATCTCAACAGACTTS-3' (Tm=60° С). Для гена nribl использовали следующую последовательность праймеров: F 5'-

CTGATGAATGGTTGCGAGTG-3', R 5'-TCATCCTTATCCGCAGCTTT-3' (Tm=60°C), для гена ndal: F 5'-TCGTGAAGTTCATCATGCTCAG-3',R 5'-ATAGGGAACGTTTGTGCCATCG-3' (Tm=56,9° С), для гена pump: F 5'-TATTCGCAAGTAGCGCCTTT-3', R 5'-ATCCCCTTCAACTGCCTTCT-3' (Tm=60° С), для гена aoxla: F 5'-TGTTTTAGGCCATGGGAGAC-3', R 5'-ACATCAGTGGGGAAACGAAG-3' (Tm=60° С), для гена ant. F 5'-CTAYTGGAAGTGGTTTGCTG-3', R 5-CATTGAACTGCCTYTCRCCT-3' (Tm=60° С), для гена nadp-red: F 5'-ACTGGTGATGATGCACCTG-3', R 5'-AYAATCKAAGCTTGTGAGGCTT-3' (Tm=60° С), для гена sod3-l: F 5'-MTCWGGMTGGGTGTGGCT-3', R 5'-CTYACRTTYTTGTACTGCARGT-3' (Tm=60° С). Для гена mt-mdh: F 5'-GAGTTTGTTCAGTTTCATCC-3', R 5'-CCACCCATATTATAATGCAC-3' (Tm=57° C).

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2"ма-метода [Livak К. J. et al., 2001] с

использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software (Biorad, США).

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3-х кратной биологической и 3-х кратной аналитической повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ТОМАТА И ЕЁ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

В связи с тем, что культура недиффиренцированных клеток in vitro оказывается наиболее чувствительной к активным формам кислорода, использование каллусной культуры томата как объекта исследования открывает широкие возможности для изучения вопроса окислительного стресса.

На оптимизированной среде МС была получена рыхлая, умеренно оводнённая с однородными недифференцированными клетками каллусная культура L. esculentum Mill, серого цвета (рис. 1). При этом эффективность каллусообразоания к концу 21-дневного культивирования составила 86-90%, индекс роста - 6,5, а удельная скорость роста 0,04 сут '.

Рис. 1. Культура ткани томата in vitro, (а) -

каллусообразование на эксплантах листовых пластинок томата; (б) - микроскопическое изображение недифференцированных клеток томата.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ РАЗОБЩЁННОГО И НЕСОПРЯЖЁННОГО ДЫХАНИЯ, В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ I УСОРЕКБЮиМ ЕБСШЕтиМ М11Х. Исследование динамики активности ряда ферментов окислительного метаболизма в процессе онтогенеза ЬусорегБюит с.чси1еп1ит МШ. показало увеличение активности АГ к 6-ому дню прорастания семян, а МДГ, НАДН-ДГ и СОД к 10-ому дню, что связано с переходом растения к

фотосинтетической деятельности. Проведенный ПЦР-анализ кДНК с генспецифическими праймерами для гена ndal и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле показал наличие одной полосы на гель-электрофорезе, что соответствует теоретически ожидаемому размеру продукта в 382 п.н. Для гена ndbl получен ПЦР-продукт, состоящий из 124 п.н. Для гена aoxla в результате ПЦР-реакции получен продукт из 128 п.н. Использование специфических праймеров для гена pump позволило получить ПЦР-продукт из 107 п.н., а для гена ant - из 149 п.н. Один продукт полимеразной цепной реакции с подобранными нами праймерами является результатом специфического связывания праймеров с матрицей, что подтверждает наличие мРНК исследуемых нами генов в суммарной вытяжке РНК. Единственная полоса на геле после ПЦР показывает, что взаимодействие между ними является результатом специфического связывания праймеров и кДНК (рис. 2).

к с л м К с л м к с л м К с Л М К С' л м

"t Ш

ш 1' |§ I Ml

—« mm ' Щк? мм Ш ш •'.:. ' Фф щф ,,,

(») (6) « (г) (д)

Рис. 2. Продукты амплификации генов в различных органах томата. К - корень; С -стебель; Л - лист; М - ДНК маркеры от 100 до 1000 п.н.; (а) - ПЦР-продукт к гену ndal, (б) - ПЦР-продукт к гену ndbl, (в) - ПЦР-продукт к гену aoxla, (г) - ПЦР-продукт к гену pump, (д) - ПЦР-продукт к гену ant.

Полученные с помощью ПЦР-РВ анализа данные по экспрессии генов НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, альтернативной оксидазы, АДФ/АТФ-антипортера, PUMP, НАДФ-редуктазы и супероксиддисмутазы во всех исследованных органах томата показали, что максимальная транскрипционная активность изучаемых генов наблюдается в листьях, что позволяет растению гибко и эффективно регулировать потоки электронов в ЭТЦ митохондрий, адаптируя их в соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного метаболизма (табл. 1).

Таблица 1. Уровень экспрессии генов, кодирующих альтернативные пути дыхания, в различных органах Ь. мсикпШт МШ. (отн.ед.), п=3, р<0,05.

Органы ndbl ndal aoxla pump ant nadp-red sod3-l

Корень 1,27±0,04 1,00+0,01 1,00±0,01 1,00±0,01 1,00+0,01 1,00+0,01 1,00+0,01

Стебель 1,00±0,01 1,01+0,01 3,71±0,11 1,66±0,05 5,03±0,16 4,38±0,12 1,11+0,01

Лист 9,65±0,29 2,55±0,08 38,05±1,52 42,81 + 1,71 5,74±0,18 38,85+1,55 15,35+0,61

ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ NDA1, ANT, NADF-RED И SOD3-1В ЗЕЛЁНЫХ ЛИСТЬЯХ ТОМАТА И ГЕНА MT-MDH В ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ ПРИ СМЕНЕ СВЕТОВОГО РЕЖИМА В ходе исследования световой регуляции экспрессии генов ndal и nadp-red и sod3-l в зелёных листьях томата выявлено, что в первый час инкубации растений на свету после темноты наблюдается увеличение относительного количества транскриптов по сравнению с контролем («О часов» - момент переноса растений из темноты на свет). К 12 часам экспозиции на свету наблюдается снижение уровня экспрессии генов по сравнению с первым часом инкубации растений на свету, а в течение первого часа инкубации томата в темноте содержание соответствующих мРНК падает практически до значения, соответствующего переносу растений из темноты на свет. Динамика экспрессии гена ant в течение светового дня имеет несколько иную картину: максимальный уровень мРНК изучаемого гена наблюдается к 6 часам экспозиции растений на свету (рис. 3).

Полученные данные позволяют предположить наличие механизмов экспрессионной регуляции альтернативных дыхательных путей, обеспечивающих корреляцию их активности с интенсивностью фотосинтетических реакций, что позволяет оптимизировать протекание НАД-зависимых процессов в цитоплазме, хлоропластах и митохондриях и обеспечить нормальное функционирование митохондриальной и цитоплазматической ЭТЦ в условиях избытка восстановительных эквивалентов.

(а)

(б)

А

свет

JH

Экспозиция.

(в)

ж

Экспозиция, час

I * I

J2L

Ж

I 1

I «

(г)

гЬ

П . F-П

i

свет

Экспозиция, час

4

Рис. 3. Динамика экспрессии генов в зелёных листьях томата при смене светового режима, (а)-ген лей/; (б)-ген ant, (в)-ген nadp-red; (г)-ген sod3-l.

С помощью ПЦР анализа в реальном времени установлено, что митохондриальная форма МДГ в зелёных листьях кукурузы является светорегулируемым ферментом, активность которого зависит от светового режима.

ю 0,8

I

р" 0,6

о

В \

0

1 0,2

НЕп

-ь

ri~|

S "

i 12

свет темнота ' «с

ДКС КС+ДКС Условия опыта

(б)

-Ь

ДКС кс»дкс

Условия опыта

Рис. 4. Влияние красного (КС) и дальнего красного (ДКС) света на активность НАД1 ■ зависимой МДГ (а) и экспрессионную регуляцию гена ml-mdh (б) в зелёных листьях кукурузы.

Интенсивность функционирования митохондриальной МДГ регулируется на уровне транскрипции гена, кодирующего данную форму фермента. В темноте для обеспечения интенсивно функционирующего цикла

Кребса происходит увеличение скорости транскрипции гена митохондриальной формы МДГ, что проявляется в накоплении мРНК гена. Высокие концентрации транскрипта гена mt-mdh чётко коррелируют с увеличением активности исследуемого фермента. В опытах по влиянию КС и ДКС на уровень экспрессии гена митохондриальной МДГ было показано, что красный свет индуцирует изменения в работе генетического аппарата растительной клетки, приводящие к уменьшению количества мРНК исследуемого гена. Противоположный эффект оказывает действие дальним красным светом. Его влияние на растения кукурузы приводит к более интенсивному накоплению мРНК гена mt-mdh (рис. 4).

ВЛИЯНИЕ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ NDA1, NDB1, АОХ1А, ANT, PUMP Vi NADP-RED Анализ профилей экспрессии генов ndal и ndbl, кодирующих внутреннюю и внешнюю ротенонон-нечувстельную НАД(Ф)Н-дегидрогеназу соответственно, в зелёных листьях томата in vivo показал, что через 24 часа экспонирования растений при +4°С количество генспецифических транскриптов данных генов в листьях составляет 1,8 отн. ед. и 3,3 отн. ед. соответственно. Значительное увеличение относительного уровня экспрессии гена aoxla, кодирующего в листьях альтернативную оксидазу, наблюдается уже в первый час экспозиции томата на холоде (5,54 отн. ед.) и достигает максимума к 24 часам экспозиции растений на холоде (17,16 отн. ед.). Исследование динамики экспрессии гена ant, отвечающего за синтез АДФ/АТФ-антипортера показало, что максимальное количество транскриптов этого гена накапливается к 6 часам инкубации растений при +4°С. Для гена pump, кодирующего разобщающий белок, показано существенное повышение относительного уровня генспецифических транскриптов экспрессии изучаемого гена: к 6 часам он составил 11 раз от контроля, а к 24 часам экспозиции при +4°С возрос в 114 раз. Экспрессия гена nadp-red, кодирующего НАДФ-редуктазу, к 24-ом часам инкубации томата при +4°С составляет 7,7 отн. ед. (рис. 5).

Экспозиция, час Экспозиция, час

Рис. 5. Динамика экспрессии генов в зелёных листьях /,. esculentum Mill, в условиях низкой температуры (+4 С), (а) - В - ген ndal- ген лсЫ, . Ген аох1а\ (б) - ® -ген ant, ген pump, ген nadf-red.

Генерация тепла в условиях пониженной температуры окружающей среды позволяет поддерживать температуру тканей растения на определенном уровне, что важно для обеспечения нормального функционирования ферментов, имеющих определенный температурный оптимум.

ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА И АНТИМИЦИНА А НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ПУТЕЙ ДЫХАНИЯ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ ТОМАТА IN VITRO

Присутствие в среде культивирования каллусов томата in vitro пероксида водорода и антимицина А способствует развитию окислительного стресса, о чём свидетельствует резкое падение активности аконитатгидратазы и накопление в клетках продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида. Анализ профиля экспрессии гена sod.3 1, кодирующего Mn-содержащую супероксиддисмутазу, также указывает на наличие в клетках окислительного стресса. Использование ПЦР анализа в реальном времени позволило установить роль активных форм кислорода в регуляции экспрессии генов, кодирующих альтернативные пути дыхания. Так, воздействие перекиси водорода в концентрации 0,1 мМ, 10 мМ на каллусную культуру ткани томата в течение 6 часов приводит к увеличению количества мРНК генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump (рис. 6).

При низких концентрациях перекиси индуцируется АДФ/АТФ-антипортер, а при более высоких концентрациях Н2О2 резко растет синтез

мРНК разобщающего белка. Оба эти переносчика способны к индуцированному жирными кислотами разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования [V¡апсI к) А. е1 а1. 1994]. но, по-видимому, сначала активируется конститутивно присутствующий антипортер, а разобщающий белок вовлекается в разобщение уже в ситуации значительного повреждения клетки.

Концентрация НЮ;, мМ

Концентрация антимицина А, мгМ

Рис. 6. Влияние пероксида водорода (а) и антимицииа А (б) на экспрессию генов, кодирующих белки несопряжёиного и разобщённого дыхания, в культуре ткани L.

esculenlum Mill, in vitro. П - ген ndal, 0 - ген ndbl, И - ген aoxla, ® - ген ant, § -ген pump. И- ген sod3-l.

Исследования регуляции экспрессии генов разобщённого и несопряжённого дыхания в культуре томата in vitro в присутствии антимицина А с помощью ПЦР анализа в реальном времени показали, что наличие 5 мкМ антимицина А в среде культивирования каллусов приводит к увеличению количества транскриптов гена sod3-l в четыре раза по сравнению с контролем. Содержание транскриптов гена aoxla росло в этих условиях более чем в три раза по сравнению с контролем. 5мкМ антимицин А не оказывает значительного эффекта на уровень экспрессии гена ndbl. Для гена же ndal показано снижение уровня мРНК относительно контроля при такой концентрации ингибитора. При 15 мкМ и 25 мкМ концентрации антимицина А наблюдается уменьшение количества транскриптов генов sod3-l, aoxla, ndal и ndbl. Обработка культуры томата in vitro ингибитором комплекса III ЭТЦ способствует увеличению уровня мРНК генов разобщённого дыхания. Так. уровень экспрессии гена ant при 5 мкМ концентрации АА увеличивается в 9 раз по сравнению с контролем. Однако

15 мкМ концентрация данного ингибитора практически не меняет уровень экспрессии гена, кодирующего белок АДФ/АТФ-антипортера. При этом для гена pump показано, что 5 и 15 мкМ концентрация АА способствует увеличению количества мРНК данного гена в 5 и 9 раз соответственно относительно контроля (рис. 6). Ингибирование комплекса III ЭТЦ способствует увеличению скорости переноса электронов через первый дыхательный комплекс и, как следствие, усилению образования АФК, а также изменению её редокс-состояния. Блокирование митохондриального окисления на I и III участках цепи переноса электронов способствует активации альтернативных путей переноса восстановительных эквивалентов на кислород [Рахманкулова 3. Ф., 2001]. Одним из способов такой активации может являться повышение уровня экспрессии соответствующих генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клеточные системы растений способны чётко реагировать на внешние воздействия. Координация данных процессов осуществляется регуляторными механизмами, одним из которых является регуляция метаболических процессов на уровне экспрессии и, как следствие этого - изменения активности ферментов основных метаболических путей.

Данные по изменению активности ряда ферментов окислительного метаболизма в процессе онтогенеза LycopersJcum esculentum Mill, свидетельствуют о функциональной роли изучаемых белков при переходе растения к фотосинтетической деятельности. Исследование динамики активности малатдегидрогеназы в щитках Zea mays L. показало её активирование уже на начальных этапах развития семян, что указывает на участие исследуемого фермента в обеспечении растущего организма необходимыми субстратами за счёт метаболизации запасных веществ и его необходимости для активации биосинтетических и энергетических процессов в первые периоды развития растения [Алёхина Н.Д., 2007, Monty К., 2002].

В ходе исследования экспрессии генов ndal, ndbl, aoxla, pump, ant, nadp-red и sod3-l в различных органах томата максимальный уровень их транскриптов наблюдается в листьях, позволяя растению гибко и эффективно регулировать потоки электронов в ЭТЦ митохондрий, адаптируя их в

соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного метаболизма.

Полученные данные по исследованию световой регуляции экспрессии генов ndal, ant, nadp-red и sod3-l свидетельствуют о том, что имеет место экспрессионная корреляция активности альтернативных дыхательных путей митохондрий с интенсивностью процессов фотосинтеза и активностью антиоксидантной системы клетки. Изучение световой регуляции гена mt-mdh в зелёных листьях Zea mays L. позволяет сделать вывод о том, что изменение активности ферментов при действии света различной длины волны находится под генетическим контролем, а изменения в работе генов связаны с возможным участием в его регуляции фитохромной системы. Подобные результаты были показаны ранее для гена ndal в растениях А. thaliana [Matthew А.Е. et al., 2004].

Значительная активация генов aoxla, ant и pump и некоторое повышение концентрации мРНК для генов ndal и ndbl при +4°С показывает, что томат активно использует адаптивные механизмы, приспосабливаясь к пониженной температуре, что может обеспечиваться футильным реокислением восстановительных эквивалентов клетки без повышения синтеза АТР и свидетельствует о том, что томат относится к холодоустойчивыми видам. Повышение экспрессии гена nadp-red может свидетельствовать об интенсификации работы электрон-транспортной цепи хлоропластов в условиях влияния пониженной температуры. Образующиеся при этом восстановительные эквиваленты могут быть использованы НАД(Ф)Н-дегидрогеназами митохондрий, которые за счет реокисления НАД(Ф)+ будут обеспечивать функционирование механизмов несопряженного и разобщенного дыхания, необходимых для термогенеза.

Использование культуры ткани томата in vitro позволило установить, что добавление перекиси водорода к каллусам вызывает повышение концентрации мРНК для генов aoxla, ant и pump, схожее с тем, что наблюдалось в обработанном холодом зеленом растении. Ранее было установлено, что холод вызывает существенное увеличение скорости генерации перекиси водорода в тканях растений [Szal В. et al., 2009] и, возможно, именно перекись водорода выступает вторичным мессенджером для индукции не только альтернативной оксидазы, но и разобщающих белков. Интересно отметить, что в культуре ткани томата при низких

концентрациях перекиси индуцируется АДФ/АТФ-антипортер, а при более высоких концентрациях Н2О2 резко растет синтез мРНК для разобщающего белка. Оба эти переносчика способны к индуцированному жирными кислотами разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования [Kowaltowski A.J. et al„ 1999, Popov V. N., 2003, Vianello A. et. al„ 1994]. При адаптации растений к холоду, по-видимому, сначала активируется конститутивно присутствующий антипортер, а разобщающий белок вовлекается в разобщение уже в ситуации значительного повреждения клетки (так, в этих условиях активность аконитазы снижалась на порядок). Добавление антимицина А к культуре клеток приводило к схожим последствиям. При 5 мкМ концентрации повышалась активность генов aoxla, ant, тогда как повышение концентрации ингибитора увеличивало содержание мРНК для гена pump, а активность остальных изучаемых генов снижалась, по-видимому, свидетельствуя о существенном токсическом эффекте и снижении общей активности митохондрий. Для НАД(Ф)Н-дегидрогеназ сделать однозначный вывод об участии АФК в регуляции активности кодирующих их генов не удалось. Перекись водорода, но не антимицин А, увеличивала уровень экспрессии гена ndal, кодирующего внутреннюю НАД(Ф)Н-дегидрогеназу, а активность гена ndbl не менялась.

Снижение ферментативной активности аконитазы и увеличение в культуре ткани томата количества продуктов перекисного окисления липидов в присутствии в среде культивирования пероксида водорода и антимицина А свидетельствует о накоплении в тканях АФК и, как следствие, о развитии окислительного стресса. Повышение концентрации активных форм кислорода в клетке может сигнализировать о том, что режим работы митохондриальной ЭТЦ не оптимален, и для предотвращения ее полного торможения и дальнейшей генерации АФК, необходимо активизировать альтернативные дыхательные пути. Одним из способов такой активации может являться повышение уровня экспрессии соответствующих генов. Обнаруженная нами корреляция экспрессии генов альтернативных дыхательных путей и антиоксидантной системы клетки показывает, что в условиях активно протекающих фотосинтетических процессов избыточная генерация АФК предотвращается за счет одновременного использования нескольких механизмов, одним из которых является свободное окисление дыхательных субстратов.

Проведённые нами исследования индукции экспрессии генов альтернативной оксидазы, НАД(Ф)Н-дегидрогеназ и путей разобщения дыхания жирными кислотами подтвердили участие данных ферментов в защите растений томата при воздействии низких температур. Кроме того, установлено, что не только альтернативная оксидаза, но и гены pump и ant могут активироваться при воздействии Н202 и АА. Эти факты могут быть объяснены тем, что как несопряженное окисление дыхательных субстратов, так и разобщение окисления и фосфорилирования приводят к индукции термогенеза, уменьшают время жизни семихинона и, следовательно, вероятность образования супероксида за счет передачи электрона от семихинона на кислород [Skulachev V. Р., 1996].

Рис. 7. Гипотетическая схема регуляции экспрессии генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания, активными формами кислорода в клетках растений. « + » - образование АФК в клетке; « - » - подавление образования АФК в клетке. АО - белок альтернативной оксидазы; in НАДН-ДГ - белок внутренней НАД(Ф)Н-дегидролгеназы; ПАМП - растительный разобщающий белок ПАМП; АНТ -растительный разобщающий белок АТФ/АДФ-антипортер.

ВЫВОДЫ

1. Использование стандартной среды Мурасиге и Скуга, содержащей гормоны БАП и НУК в концентрации 2мг/л, позволило получить культуру недифференцированных каллусных клеток томата in vitro с индексом роста 6,5, удельной скоростью роста 0,04 сут"' и эффективностью каллусообразования 86-90% к концу 21-дневного культивирования.

2. При изучении динамики активности ферментов окислительного метаболизма при прорастании семян Lycopersicum esculentum Mitt, максимальная активность аконитатгидратазы наблюдается на 5-6 день развития. Активирование НАДН-дегидрогеназы, малатдегидрогеназы и супероксиддисмутазы наблюдается к 10-му дню развития семян, что, возможно, связано с активированием фотосинтетических реакций.

3. Изучены органоспецифические паттерны экспрессии генов ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, альтернативной оксидазы, растительного разобщающего белка, АДФ/АТФ-антипортера, НАДФ-редуктазы и супероксиддисмутазы в различных органах растения. Показано, что исследуемые гены экспрессируются во всех изученных органах, а максимальный уровень их экспрессии обнаруживается в тканях листа.

4. Проанализирована динамика экспрессии генов mt-mdh, ndbl, aoxla, pump и ant в зеленых листьях растений при изменении светового режима. Показано, что количество генспецифических транскриптов данных генов достигает максимума в 1-6-ой час после переноса растений томата из темноты на свет и уменьшается в течение 1 часа после переноса растений в темноту.

5. Воздействие пониженной температуры, а также света в течение первого часа инкубации растений после темноты вызывало активацию ряда ферментов антиоксидантной защиты и инактивацию аконитазы, что может свидетельствовать о повышении внутриклеточной продукции активных форм кислорода.

6. Показано, что воздействие пониженной температуры повышает уровень экспрессии генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и nadp-red в листьях томата. Это связано с необходимостью активации путей альтернативного дыхания для обеспечения термогенеза, что может являться механизмом адаптации к пониженной температуре.

7. Добавление в среду культивирования перекиси водорода в концентрации 0,1 мМ приводило к снижению активности аконитатгидратазы, активации пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы и накоплению малонового диальдегида. Причем, добавление экзогенной перекиси в этой концентрации вызывало внутриклеточные изменения, сходные с

действием 25 мкМ антимицина А, являющегося внутриклеточным индуктором генерации супероксидрадикала.

8. В ходе исследования влияния пероксида водорода на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sod3-l в культуре ткани томата in vitro, показано, что пероксид водорода может вызывать совместную индукцию экспрессии гена, кодирующего белок альтернативной оксидазы, не только с геном внутренней ротенон-нечувствительной НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, но и генами, кодирующими белки разобщённого дыхания, выступая при этом в качестве вторичного мессенджера в передаче сигналов в клетке.

9. Использование культуры ткани томата in vitro позволило исследовать влияние антимицина А на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sod3-l. Показано, что даже незначительные его концентрации приводят к развитию окислительного стресса в тканях, а повышение уровня экспрессии большинства изученных генов альтернативных дыхательных путей свидетельствует об их участии в предотвращении избыточной генерации активных форм кислорода, в частности супероксиданионрадикала.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Влияние спектрального состава света на активность и уровень экспрессии NAD-зависимой малатдегидрогеназы / Е.В. Полуэктова (Мальцева) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2008. - Вып. 10. - С. 207-210.

2. Влияние красного и дальнего красного света на активность малатдегидрогеназы в листьях кукурузы / Е.В. Полуэктова (Мальцева). В.Н. Попов, Е.В. Баркалова // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений : тез. докл. междунар. конф., Екатеринбург, 6-10 октяб. 2008 г. - Е., 2008. - С. 338-339.

3. Использование сорбентов различной природы для разделения изоферментов малатдегидрогеназы и изоцитратлиазы / Е.В. Полуэктова (Мальцева) [и др.] // Материалы 3-ей Международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» : тез. докл., .Белгород, 2224 сент. 2008 г. - Б., 2008. - С. 242-245.

4. Электрофоретическое изучение НАДН-дегидрогеназ в митохондриях Triticum aestivum / Е.В. Полуэктова (Мальцева). В.Н. Попов // Симбиоз

Россия : Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. - Пермь, 2009. - С. 239-241.

5. Влияние пероксида водорода на окислительный метаболизм в каллусе Lycopersicum esculentum / E.B. Полуэктова (Мальцева) [и др.] // 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология наука XXI века» : тез. докл., 28 сентября-2 октября. - П., 2009. - С. 79.

6. Гормональная регуляция активности ферментов в культуре ткани различных сортов Petunia / E.B. Полуэктова (Мальцева). O.A. Землянухина,

B.Н. Попов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов.-Воронеж, 2009. - Вып. 11.-С. 168-172.

7. Изменение изоферментного состава малатдегидрогеназы в онтогенезе Zea mays L. / E.B. Полуэктова (Мальцева) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2009. - Вып. 11. - С. 40-46.

8. Кинетические характеристики тетрамерной формы малатдегидрогензазы, полученной с использованием ионообменной хроматографии из животных и бактерий / Е.В. Мальцева (Полуэктова) [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - Т. 10. - Вып. 2. -

C. 231-235.

9. Влияние антимицина на экспрессионную регуляцию генов aoxla и ndbl в каллусе Lycopersicum esculentum / E.B. Мальцева (Полуэктова), A.C. Шацких, В.Н. Попов // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология наука XXI века» : тез. докл., 19-23 апреля. - П., 2010.-Т. 2.-С. 157.

10. Экспрессионная регуляция генов, кодирующих белки разобщённого дыхания в культуре томата in vitro активными формами кислорода / Е.В. Мальцева (Полуэктова) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2010. - Вып. 12. - С. 142-145.

11. Участие перекиси водорода в регуляции коэкспрессии альтернативной оксидазы и ротенон-устойчивой НАДН-дегидрогензы в листьях и каллусах томата / А.Т. Епринцев, Е.В. Мальцева (Полуэктова) [и др.] // Известия РАН. Серия биологическая. - Москва, 2011. - № 1. -С. 1-7.

Работы №8 и №11 опубликованы в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подп.впеч. 19.11.2010. Формат 60x84'/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1468. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3 Тел. 204-133

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мальцева, Елена Витальевна

Введение В

Глава 1. Обзор литературы

1.1 .Фотосинтез и дыхание

1.1.1. Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания

1.1.2. Световая регуляция темнового дыхания

1.1.3. Участие фитохромов в регуляции генов 20 1.2. Активные формы кислорода в растительной клетке

1.2.1. Характеристика активных форм кислорода

1.2.2. Образование активных форм кислорода в условиях ^ стресса

1.2.3. Влияние активных форм кислорода на геном клеток

1.2.4. Образование активных форм кислорода в ^ митохондриях

1.2.5. Образование активных форм кислорода в пероксисомах

1.2.6. Образование активных форм кислорода в ^ хлоропластах

1.2.7. Образование активных форм кислорода в цитоплазме

1.2.8. Антиоксидантные механизмы защиты клеток 33 1.3. Особенности митохондриальных белков высших ^ растений

1.3.1. Особенности митохондрий высших растений

1.3.2. Ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н- ^ дегидрогеназы

1.3.3. Регуляторные особенности альтернативной ^ цианидрезистентной оксидазы

1.3.4. Функциональные особенности разобщающих белков растений

1.3.5. АДФ/АТФ-антипортер высших растений

1.3.6. Устойчивость растений к стрессовым воздействиям ^ с участием белков несопряжённого и разобщённого дыхания

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Цели и задачи

2.2. Объекты и методы исследования

2.2.1. Объекты исследования

2.2.2. Постановка эксперимента по созданию светового режима

2.2.3. Постановка эксперимента по изучению влияния пониженной температуры

2.2.4. Постановка эксперимента по изучению влияния пероксида водорода и антимицина А

2.2.5. Определение активности ферментов

2.2.6. Определения концентрации малонового ^ диальдегида

2.2.7. Определение количества белка

2.2.8. Выделение суммарной клеточной РНК

2.2.9. Обратная транскрипция

2.2.10. Разработка праймеров

2.2.11. Полимеразная цепная реакция

2.2.12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот ^ в агарозном геле

2.2.13. Определение концентрации нуклеиновых кислот

2.2.14. Количественный ПЦР-анализ

2.2.15. Определение уровня экспрессии генов

2.2.16. Компьютерные методы анализа

2.2.17. Статистическая обработка данных

2.3. Результаты и их обсуждение

2.3.1. Получение каллусной культуры томата и её физиологические характеристики

2.3.2. Изучение регуляции альтернативных путей дыхания в культуре томата in vitro и in vivo

2.3.2.1. Исследование активности ферментов окислительного метаболизма и антиоксидантной защиты в 69 онтогенезе томата и щитках кукурузы

2.3.2.2. Органоспецифическая экспрессия генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённоо дыхания

2.3.2.3. Уровень органоспецифической экспрессии генов ndal, ndbl, aoxla, pump, ant, nadp-red и sod3-l

2.3.2.4. Динамика активности ряда ферментов в зелёных листьях растений при смене светового режима

2.3.2.5. Динамика экспрессии генов ndal, ant, nadp-red, sod3-l и mt-mdh в зелёных листьях растений при смене 89 светового режима

2.3.2.6. Динамика активности ферментов в листьях томата при воздействии пониженной темперетуры

2.3.2.7. Влияние пониженной температуры на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant,pump и nadp-red

2.3.2.8. Влияние пероксида водорода на экспрессию генов альтернативных путей дыхания в культуре ткани томата in vitro

2.3.2.9. Влияние антимицина А на экспрессию генов альтернативных путей дыхания в культуре ткани томата in vitro

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции разобщенного и несопряженного дыхания в проростках и культуре клеток томата: роль активных форм кислорода, света и пониженной температуры"

Актуальность проблемы. Растительные организмы обладают широким спектром защитно-приспособительных реакций, способствующих их устойчивости к разнообразным стрессовым факторам внешней среды. При этом физиологический стресс, индуцируя избыточную активацию метаболизма, может повышать общие адаптивные механизмы растительного организма и способствовать увеличению его устойчивости к возможным стрессовым воздействиям [102].

Характерной особенностью организмов с аэробным типом метаболизма выступает наличие окислительного стресса в клетках. Поскольку растительные организмы не только потребляют кислород, но и образуют его в ходе фотосинтеза, процесс поддержания внутриклеточной концентрации кислорода на низком уровне является для них особенно важным [43]. У растений, наряду с реакциями фотосинтеза, важную роль в энергетике клетки играет окислительное фосфорилирование, осуществляемое за счет работы митохондриальной электрон-транспортной цепи. Конечным акцептором электронов при этом выступает кислород. При протекании паразитных реакций одноэлектронного восстановления кислорода в клетке постоянно образуются активные формы кислорода, способные вступать в реакции неспецифического окисления любой биомолекулы, включая и ДНК [44].

Усиление генерации активных форм кислорода может быть одной из причин развития повреждений живых организмов при воздействии неблагоприятных факторов различной природы [121]. Реакция растений на стресс заключается в различных перестройках метаболических и физиологических процессов, имеющих своей целью адаптацию растительного организма к изменившимся условиям. При этом возрастают энергозатраты клетки и происходит усиление эффективности дыхания [42].

Интересно отметить, что растения обладают сложной системой путей несопряженного транспорта электронов, обходящих генераторы протонов электрон-транспортной цепи. Так, для митохондрий высших растений, было показано, что окисление НАДН осуществляется помимо комплекса I ЭТЦ системой несопряженных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, локализованных на внутренней и внешней стороне внутренней мембраны митохондрий, а цианид-резистентная альтернативная оксидаза характеризуется более низким сродством к кислороду, чем цитохромоксидаза и индуцируется в том случае, когда концентрация кислорода становится выше оптимальной для протекания энергозапасающих процессов [118, 125]. Так, для митохондрий из листьев арабидопсиса [75], проростков огурца [68] и плодов цветной капусты [160] было показано, что инкубация растений при пониженных температурах активирует цианид-резистентное дыхание, реализуемое за счет индукции альтернативной оксидазы. Ранее было предположено, что альтернативная оксидаза должна коэкспрессироваться с ротенон-нечувствительными НАД(Ф)Н-дегидрогеназами, причем вторичными мессенджерами для обоих систем могут выступать активные формы кислорода [6]. Wagner показала, что Н2С>2 может индуцировать экспрессию генов АО в растительных тканях [184]. Активация синтеза АО также наблюдалась у растений и дрожжей, выращиваемых в присутствии антимицина А [134], когда супероксид-радикал является вторичным мессенджером.

Повышение мембранного потенциала и увеличение времени жизни убисемихинона стимулирует образование АФК митохондриями [105]. Обнаруженные в митохондриях стеблей гороха и гипокотелей подсолнечника АДФ/АТФ-антипортер, а также UCP-подобный белок картофеля PUMP участвуют в индуцированном жирными кислотами разобщении. Данный факт позволил сделать предположение, что разобщённое дыхание может быть адаптивным механизмом при воздействии пониженных температур, как за счёт стимулирования термогенеза, так и за счёт снижения мембранного потенциала, а, следовательно, и скорости генерации активных форм кислорода.

В настоящее время одной из актуальных проблем при изучении ферментативных систем растений является также влияние света на дыхательный метаболизм и цикл трикарбоновых кислот. На сегодняшний день имеются данные об участии фитохромов в регуляции дыхательных ферментов [110]. Одним из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, который имеет важное значение в обеспечении клеточного дыхания, является малатдегидрогеназа. Она представляет собой полифункциональный ферментный комплекс, обеспечивающий протекание конструктивного и энергетического обменов в клетке.

Вопросы экспрессионной регуляции большинства генов, кодирующих белки дыхательного метаболизма высших растений в условиях окислительного стресса, до сих пор остаются открытыми.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение влияния избыточной генерации активных форм кислорода, пониженных температур и света на экспрессию генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания Сз-растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить каллу сную культуру ткани томата in vitro.

2. Изучить динамику активности ряда ферментов окислительного метаболизма и антиоксидантной защиты при прорастании семян Lycopersicum esculentum Mill.

3. Определить органоспецифический уровень экспрессии генов, кодирующих белки несопряжённого и разобщённого дыхания, в разных органах проростков томата.

4. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов, кодирующих белки альтернативных путей дыхания, в условиях смены светового режима методом ПЦР-РВ в листьях томата.

5. Изучить динамику активности ряда ферментов антиоксидантной защиты и окислительного метаболизма при воздействии низкой положительной температуры и в условиях смены светового режима.

6. Исследовать влияние пониженной температуры на экспрессионную регуляцию генов, кодирующих белки альтернативных путей дыхания, в листьях томата.

7. Идентифицировать развитие окислительного стресса в культуре клеток томата in vitro в присутствии пероксида водорода и антимицина А по изменению метаболической активности ряда ферментов и накоплению продукта перекисного окисления липидов.

8. Изучить влияние пероксида водорода и антимицина А на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sodS-l в культуре ткани томата in vitro.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы позволяют расширить и углубить представления о функциональной значимости белков разобщённого и несопряжённого дыхания митохондрий С3-растений в условиях стресса.

Полученная каллусная культура ткани томата in vitro, используемая как модель окислительного стресса в клетках, даёт возможность выяснить роль активных форм кислорода в регуляции экспрессии генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания.

Использование количественного ПЦР анализа позволило установить, что максимальный уровень экспрессии генов альтернативных путей дыхания, наблюдаемый в тканях листа, позволяет растению гибко и эффективно регулировать потоки электронов в ЭТЦ митохондрий, адаптируя их в соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного метаболизма клетки в процессе интенсивно протекающего фотосинтеза на свету.

Изменение экспрессии генов ndal, nadp-red, sodS-1 и ant в листьях томата в условиях смены светового режима свидетельствует об участии белков, кодируемых данными генами, в поддержении нормального функционирования ЭТЦ в условиях избытка восстановительных эквивалентов, образующихся на свету в ходе фотосинтетических реакций. На основе анализа действия света различного спектрального состава изучен механизм регуляции гена mt-mdh в листьях кукурузы активной формой фитохрома. Активная форма фитохрома блокирует транскрипцию гена mt-mdh в листьях кукурузы, что приводит к уменьшению количества мРНК в клетке. Данный факт коррелирует с угнетением активности НАДт-зависимой малатдегидрогеназы в листьях растений под действием красного света.

С помощью ПЦР анализа в реальном времени в культуре томата in vivo при воздействии температуры +4°С показана значительная активация генов , aoxla, ant и pump и некоторое повышение концентрации мРНК для генов ndal и ndbl, что свидетельствует об активном использовании томатом адаптивных механизмов для приспособления к пониженным температурам за счёт футильного реокисления восстановительных эквивалентов клетки без повышения синтеза АТФ. Снижение ферментативной активности аконитазы и увеличение в культуре ткани томата in vitro количества продуктов перекисного окисления липидов в присутствии в среде культивирования пероксида водорода и антимицина А свидетельствует о накоплении в тканях активных форм кислорода и, как следствие, о развитии окислительного стресса. При этом с помощью ПЦР анализа в реальном времени установлена активация генов aoxla, ant и pump, схожая с тем, что наблюдалась в обработанном холодом зелёном растении. Кроме того, перекись водорода увеличивала уровень экспрессии гена ndal, кодирующего внутреннюю

НАД(Ф)Н-дегидрогеназу, а активность гена ndbl не менялась, что свидетельствует об участии альтернативных дыхательных путей в предотвращении избыточной генерации активных форм кислорода и в процессах термогенеза.

Практическая значимость. Представленные в работе результаты можно рассматривать как пример реакции высших растений на неблагоприятные факторы внешней среды.

Известно, что при выработке стрессового ответа происходит изменение в транспорте метаболитов, снижение активности путей, вовлечённых в образование АФК во время стресса, и индукция различных защитных белков, снижающих образование АФК. Одним из таких механизмов снижения уровня АФК в митохондриях высших растений является активация путей свободного окисления дыхательных субстратов.

Изучение отдельных механизмов регуляции белковых молекул растений в норме и при патологиях на генном уровне даёт широкие возможности для эффективного управления устойчивостью и продуктивностью культурных растений уже на организменном уровне.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 13-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2009, 2010), международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), материалах II Всероссийского с международным участием конгресса «Симбиоз Россия» (Пермь, 2009), межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A.

Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2008, 2009, 2010), а также в научной сессии отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010).

Публикации. Основные результаты данной диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 6 статьях и 5 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (187 источников). Иллюстративный материал включает 29 рисунков и 3 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мальцева, Елена Витальевна

120 ВЫВОДЫ

1. Использование стандартной среды Мурасиге и Скуга, содержащей гормоны БАП и НУК в концентрации 2мг/л, позволило получить культуру недифференцированных каллусных клеток томата in vitro с индексом роста 6,5, удельной скоростью роста 0,04 сут"1 и эффективностью каллусообразования 86-90% к концу 21-дневного культивирования.

2. При изучении динамики активности ферментов окислительного метаболизма при прорастании семян Lycopersicum esculentum Mitt, максимальная активность аконитатгидратазы наблюдается на 5-6 день развития. Активирование НАДН-дегидрогеназы, малатдегидрогеназы и супероксиддисмутазы наблюдается к 10-му дню развития семян, что, возможно, связано с активированием фотосинтетических реакций.

3. Изучены органоспецифические паттерны экспрессии генов ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, альтернативной оксидазы, растительного разобщающего белка, АДФ/АТФ-антипортера, НАДФ-редуктазы и супероксиддисмутазы в различных органах растения. Показано, что исследуемые гены экспрессируются во всех изученных органах, а максимальный уровень их экспрессии обнаруживается в тканях листа.

4. Проанализирована динамика экспрессии генов mt-mdh, ndal, nadf-red, sod3-l и ant в зелёных листьях растений при изменении светового режима. Показано, что количество генспецифических транскриптов данных генов достигает максимума в 1 -6-ой час после переноса растений томата из темноты на свет и уменьшается в течение 1 часа после переноса растений в темноту.

5. Воздействие пониженной температуры, а также света в течение первого часа инкубации растений после темноты вызывало активацию ряда ферментов антиоксидантной защиты и инактивацию аконитазы, что может свидетельствовать о повышении внутриклеточной продукции активных форм кислорода.

6. Показано, что воздействие пониженной температуры повышает уровень экспрессии генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и nadp-red в листьях томата. Это связано с необходимостью активации путей альтернативного дыхания для обеспечения термогенеза, что может являться механизмом адаптации к пониженной температуре.

7. Добавление в среду культвирования прекиси водорода в концентрации 0,1 мМ приводило к снижению активности аконитатгидратазы, активации пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы и накоплению малонового диальдегида. Причем, добавление экзогенной перекиси в этой концентрации вызывало внутриклеточные изменения, сходные с действием 25 мкМ антимицина А, являющегося внутриклеточным индуктором генерации супероксидрадикала.

8. В ходе исследования влияния пероксида водорода на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sod3-l в культуре ткани томата in vitro, показано, что пероксид водорода может вызывать совместную индукцию экспрессии гена, кодирующего белок альтернативной оксидазы, не только с геном внутренней ротенон-нечувствительной НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, но и генами, кодирующими белки разобщённого дыхания, выступая при этом в качестве вторичного мессенджера в передаче сигналов в клетке.

9. Использование культуры ткани томата in vitro позволило исследовать влияние антимицина А на экспрессию генов ndal, ndbl, aoxla, ant, pump и sod3-l. Показано, что даже незначительные его концентрации приводят к развитию окислительного стресса в тканях, а повышение уровня экспрессии большинства изученных генов альтернативных дыхательных путей свидетельствует об их участии в предотвращении избыточной генерации активных форм кислорода, в частности супероксиданионрадикала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клеточные системы растений способны чётко реагировать на внешние воздействия. Координация данных процессов осуществляется регуляторными механизмами, одним из которых является регуляция метаболических процессов на уровне экспрессии и, как следствие этого -изменения активности ферментов основных метаболических путей.

Данные по изменению активности ряда ферментов окислительного метаболизма в процессе онтогенеза Lycopersicum esculentum Mill, свидетельствуют о функциональной роли изучаемых белков при переходе растения к фотосинтетической деятельности. Исследование динамики активности малатдегидрогеназы в щитках Zea mays L. показало её активирование уже на начальных этапах развития семян, что указывает на участие исследуемого фермента в обеспечении растущего организма необходимыми субстратами за счёт метаболизации запасных веществ и его необходимости для активации биосинтетических и энергетических процессов в первые периоды развития растения [128,2].

В ходе исследования экспрессии генов ndal, ndbl, aoxla, pump, ant, nadp-red и sod3-l в различных органах томата максимальный уровень их транскриптов наблюдается в листьях, позволяя растению гибко и эффективно регулировать потоки электронов в ЭТЦ митохондрий, адаптируя их в соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного метаболизма.

Полученные данные по исследованию световой регуляции экспрессии генов ndal, ant, nadp-red и sod3-l свидетельствуют о том, что имеет место экспрессионная корреляция активности альтернативных дыхательных путей митохондрий с интенсивностью процессов фотосинтеза и активностью антиоксидантной системы клетки. Изучение световой регуляции гена mt-mdh в зелёных листьях Zea mays L. позволяет сделать вывод о том, что изменение активности ферментов при действии света различной длины волны находится под генетическим контролем, а изменения в работе генов связаны с возможным участием в его регуляции фитохромной системы. Подобные результаты были показаны ранее для гена ndal в растениях А. thaliana [110].

Значительная активация генов aoxla, ant и pump и некоторое повышение концентрации мРНК для генов ndal и ndbl при +4°С показывает, что томат активно использует адаптивные механизмы, приспосабливаясь к пониженной температуре, что может обеспечиваться футильным реокислением восстановительных эквивалентов клетки без повышения синтеза АТР и свидетельствует о том, что томат относится к холодоустойчивымй видам. Повышение экспрессии гена nadp-red может свидетельствовать об интенсификации работы электронтранспортной цепи хлоропластов в условиях влияния пониженной температуры. Образующиеся при этом восстановительные эквиваленты могут быть использованы НАД(Ф)Н-дегидрогеназами митохондрий, которые за счет реокисления НАД(Ф)+ будут обеспечивать функционирование механизмов несопряженного и разобщенного дыхания, необходимых для термогенеза.

Использование культуры ткани томата in vitro позволило установить, что добавление перекиси водорода к каллусам вызывает повышение концентрации мРНК для генов aoxla, ant и pump, схожее с тем, что наблюдалось в обработанном холодом зеленом растении. Ранее было установлено, что холод вызывает существенное увеличение скорости генерации перекиси водорода в тканях растений [67] и, возможно, именно перекись водорода выступает вторичным мессенджером для индукции не только альтернативной оксидазы, но и разобщающих белков. Интересно отметить, что в культуре ткани томата при низких концентрациях перекиси индуцируется АДФ/АТФ-антипортер, а при более высоких концентрациях Нг02 резко растет синтез мРНК для разобщающего белка. Оба эти переносчика способны к индуцированному жирными кислотами разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования [135, 182, 106]. При адаптации растений к холоду, по-видимому, сначала активируется конститутивно присутствующий антипортер, а разобщающий белок вовлекается в разобщение уже в ситуации значительного повреждения клетки (так, в этих условиях активность аконитазы снижалась на порядок). Добавление антимицина А к культуре клеток приводило к схожим последствиям. При 5 мкМ концентрации повышалась активность генов aoxla, ant, тогда как повышение концентрации ингибитора увеличивало содержание мРНК для гена pump, а активность остальных изучаемых генов снижалась, по-видимому, свидетельствуя о существенном токсическом эффекте и снижении общей активности митохондрий. Для НАД(Ф)Н-дегидрогеназ сделать однозначный вывод об участии АФК в регуляции активности кодирующих их генов не удалось. Перекись водорода, но не антимицин А, увеличивала уровень экспрессии гена ndal, кодирующего внутреннюю НАД(Ф)Н- дегидрогеназу, а активность гена ndbl не менялась.

Снижение ферментативной активности аконитазы и увеличение в культуре ткани томата количества продуктов перекисного окисления липидов в присутствии в среде культивирования пероксида водорода и антимицина А свидетельствует о накоплении в тканях АФК и, как следствие, о развитии окислительного стресса. Повышение концентрации активных форм кислорода в клетке может сигнализировать о том, что режим работы митохондриальной ЭТЦ не оптимален и для предотвращения её полного торможения и дальнейшей генерации АФК, необходимо активизировать альтернативные дыхательные пути. Одним из способов такой активации может являться повышение уровня экспрессии соответствующих генов. Обнаруженная нами корреляция экспрессии генов альтернативных дыхательных путей и антиоксидантной системы клетки показывает, что в условиях активно протекающих фотосинтетических процессов избыточная генерация АФК предотвращается за счет одновременного использования нескольких механизмов, одним из которых является свободное окисление дыхательных субстратов. Проведённые нами исследования индукции экспрессии генов альтернативной оксидазы, НАД(Ф)Н-дегидрогеназ и путей разобщения дыхания жирными кислотами подтвердили участие данных ферментов в защите растений томата при воздействии низких температур. Кроме того, установлено, что не только альтернативная оксидаза, но и гены pump и ant могут активироваться при воздействии Н2Ог и АА. Эти факты могут быть объяснены тем, что как несопряженное окисление дыхательных субстратов, так и разобщение окисления и фосфорилирования приводят к индукции термогенеза, уменьшают время жизни семихинона и, следовательно, вероятность образования супероксида за счет передачи электрона от семихинона на кислород [157].

ИЗМЕНЕНИЕ СВЕТОВОГО РЕЖИМА АНТИМИЦИН А | \ переполнение» overflow

Несопряжённое дыхание т.НАДН-ДГ

Разобщённое дыхание

ПАМП

Рис. 29. Гипотетическая схема регуляции экспрессии генов, кодирующих белки разобщённого и несопряжённого дыхания, активными формами кислорода в клетках растений. « + » - образование АФК в клетке; « - » - подавление образования АФК в клетке. АО - белок альтернативной оксидазы; т НАДН-ДГ - белок внутренней НАД(Ф)Н-дегидролгеназы; ПАМП - растительный разобщающий белок ПАМП; АНТ - растительный разобщающий белок АТФ/АДФ-антипортер. чО

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мальцева, Елена Витальевна, Воронеж

1. Авдонин П. В. Рецепторы и внутриклеточный кальций / П. В. Авдонин, В .А. Ткачук. М.: Наука, 1994. - 285с.

2. Алехина Н. Д. Физиология растений / Н. Д. Алёхина и др.. М.: Академия, 2007. - 640с.

3. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент / В. В. Ляхович и др. // Биохимия. 2006. - Т. 71. - № 9.-С. 1183-1197.

4. Активность и изоферментный спектр пероксидазы клонов карельской берёзы, размножаемых in vitro / О. А. Землянухина и др. // Межрегиональный сборник научных трудов №5. Воронеж: ВГУ, 2003.-С. 46-52.

5. Барабой В. А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и припатологии / В. А. Барабой, Д. А. Сутковой. Киев: Наук, думка, 1997. -420 с.

6. Берцова Ю. В. Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale / Ю. В. Берцова, В. Н. Попов, А. В. Богачёв // Биохимия. -2004. Т. 69. - № 5. - С. 712-718.

7. Власов Н. Ф. О сортовой специфичности изоферментов супероксиддисмутазы кормовых белков / Н. Ф. Власов, Г. П. Зятчина // Сельскохозяйственная биология. 2000.- №5. - С. 93-96.

8. Влияние света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы / Попов В. Н. и др. // Физиология и биохимия стресса. 2005. - Т. 1. - № 1.-С. 30-36.

9. Возможное участие активных видов кислорода в индукции цианидрезистентного пути на начальной стадии старения каллуса табака / Г. Чжоу и др. // Физиология растений. 2001. - Т. 48. - № 5. - С. 684691.

10. Головко Т. К. Дыхание растений / Т. К. Головко. СПб.: Наука, 1999. -204 с.

11. Гольдштейн Н. Активные формы кислорода как жизненно необходимые компоненты воздушной среды / Н. Гольдштейн // Биохимия. 2002. - Т. 67. - № 2. - С. 194-204.

12. Грабельных О. И. Энергетические функции митохондрий растений в стрессовых условиях / О. И. Грабельных // Физиология и биохимия стресса.-2005.-Вып. 1.-№ 1.-С. 37-54.

13. Гудвин Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудвин, Э. М. Мерсер. -М.: Мир, 1986.-Т. 1.- 393 с.

14. Дымова О. В. Адаптация к свету фотосинтетического аппарата теневыносливых растений (на примере А.ща reptans Ь.) / О. В. Дымова, Т. К. Головко // Физиология растений. 1998. - №4. - С. 521-528.

15. Епринцев А. Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко // М.: «Академкнига», 2007. 228 с.

16. Епринцев А. Т. Функционирование малатдегидрогеназной системы в мезофилле и обкладке листьев кукурузы в условиях солевого стресса / А. Т. Епринцев, О. С. Федорина // Физиология растений. 2007. - Т. 54. - № 6. - С. 820 - 827.

17. Епринцев А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла

18. А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. Воронеж: ЦентральноЧерноземное книжное издательство, 2005. - 224 с.

19. Ермков И. П. Физиология растений / И. П. Ермаков. М.: Академия, 2007.-635 с.

20. Ершова А. Н. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и повышенному содержанию диоксида углерода / А. Н. Ершова. -Воронеж: ВГУ, 2007. 264 с.

21. Заграбельных С. Н. Биотехнология. Культивирование продуцентов и очистка продуктов / С. Н. Заграбельных. Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 2000.- 108 с.

22. Землянухин А. А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений / А. А. Землянухин, JT. А. Землянухин. Воронеж: ВГУ, 1996.168 с.

23. Игамбердиев А. У. Уникальная генетическая система митохондрий / А. У. Игамбердиев // Соросовский образовательный журнал. Биология. -2000.-Т.6.-№1.-С. 32-36.

24. Кислюк И. М. Стимуляция дыхания листьев пшеницы и пролиферация митохондрий в их клетках под влиянием охлаждения / И. М. Кислюк, Е. А. Мирославов, Т. В. Палеева // Физиология растений. 1995. - Т. 42. -С. 603-606.

25. Климов С. В. Пути адаптации растений к низким температурам / С. В. Климов // Успехи современной биологии. 2001. - Т. 121. - № 1. - С. 322.

26. Колесниченко А. В. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений / А. В. Колесниченко, Т. П. Побежимова, В. К. Войников // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - № 4. - С. 624-630.

27. Колесниченко А. В. Белки низкотемператрного стресса растений / А. В. Колесниченко, В. К. Войников. Иркутск: Арт-Пресс, 2003. - 196 с.

28. Ладыженская Э. П. Биохимические механизмы передачи внешних сигналов через плазмалемму растительной клетки при регуляции покоя и устойчивости / Э. П. Ладыженская, М. А. Проценко // Биохимия. 2002. - Т. 67. - № 2. - С. 181-193.

29. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк., 1990. - 351с.

30. Лукаткин А. С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс / А. С. Лукаткин. Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2002. - 208 с.

31. Мурей И. А. Взаимосвязь между фотосинтезом и темновым модифицированным дыханием на свету у кукурузы / И. А. Мурей, 3. Ф. Рахманкулова // Физиология растений. 1990. - Т. 37. - №3. - С. 462-467.

32. Мамушина Н. С. Взаимодействие фотосинтеза и дыхания в одноклеточных морских водорослях и высших СЗ-растениях / Н. С. Мамушина, Е. К. Зубкова, О. В. Войцеховская // Физиология растений. -1997. Т. 44. - №3. - С. 449-461.

33. Мамушина Н. С. Функционирование основных этапов темнового дыханияна свету у С3 растений с разным сезонным ритмом / Н. С. Мамушина, Б.

34. К. Зубкова // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - № 1. - С. 30 - 37.

35. Мерзляк М. Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений / М. Н. Мерзляк // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 9.- С. 20-26.

36. Общие системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: факты и гипотезы / В. В. Кузнецов и др. // Физиология растений. 1990. - № 37. - С. 987-996.

37. Особенности функционирования митохондрий культурных и дикорастущих растений в стрессовых условиях / О. И. Грабельных и др. // Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск, 2007.- С.58-62.

38. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой и др.. СПб.: Наука,1992.- 148 с.

39. Пескин А. В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК / А. В. Пескин //Биохимия.- 1997.-Т. 62. № 12. - С. 1571-1578.

40. Пинейру де Карвалью М. А. А. Малатдегидрогеназа высших растений / М. А. А. Пинейру де Карвалью, А. А. Землянухин, А. Т. Епринцев. -Воронеж: ВГУ, 1991. 216 с.

41. ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков и др.. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 215 с.

42. Рахманкулова 3. Ф. Взаимосвязь дыхания и фотосинтеза в норме и при стрессе у разных видов растений / 3. Ф. Рахманкулова // Вестн. Башкирск. ун-та. 2001. - №2. - С. 68-70.

43. Романова Е. В. Ферменты в антиоксидантной системе растений: супероксиддисмутаза / Е. В. Романова // Arpo XXI. 2008. - №7. - С. 2730.

44. Семихатова О. А. Дыхание поддержания и адаптация растений / О. А. Семихатова// Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 312-319.

45. Скулачёв В. П. Альтернативные функции клеточного дыхания / В. П. Скулачёв // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 8. - С. 27.

46. Скулачёв В. П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки / В. П. Скулачёв // Биохимия. -1994.-№59.-С. 1910-1912.

47. Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений / И. А. .Тарчевский. М.: Наука, 2002. - 294 с.

48. Фоменко О. Ю. Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений : дис. . канд. биолог, наук / О. Ю. Фоменко. -Воронеж, 2007. 149 с.

49. Хохлова JI. П. Сезонные изменения митохондрий у закаленных и незакаленных к холоду растений озимой пшеницы / J1. П. Хохлова, Н. Н. Кучеренкова, И. Р. Абдрахимова // Физиология растений. 1993. - Т. 40. -С. 607-612.

50. Цыренов В. Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированныхклеток и тканей растений: учебно-методическое пособие / В. Ж. Цыренов. Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. - 58 с.

51. Чевари С. Спектрофотометрический метод определения супероксиддисмутазы / С. Чевари, И. Чаба, Й. Секей // Лабораторное дело. 1981.-№ 11.-С. 678-680.

52. Шакирова Ф. М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовымфакторам и её регуляция / Ф. М. Шакирова. Уфа: Гилем, 2001. - 160с.

53. Шестаков С. В. Молекулярная генетика фотосинтеза / С. В. Шестаков //

54. Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 9. - С. 22-27.

55. A novel cis-element that is responsive to oxidative stress regulates three antioxidant defense genes in rice / S. Tsukamoto et al. // Plant Physiol. -2005. Vol. 137. - P. 317—327.

56. A plant cold-induced uncoupling protein / M. Laloi et al. // Nature. 1997.1. Vol. 389.-P. 135-136.

57. Accumulation of small heat shock proteins, including mitochondrial HSP22, induced by oxidative stress and adaptive response in tomato cell / N. Banzet et al. // Plant J. 1998. - Vol. 13.-P. 519-527.

58. Alscher R. G. Role of superoxide dismutases (SOD) in controlling oxidativestress plants / R. G. Alscher, N. Erturk, L. S. Heath // J. Exp. Bot. 2002. -Vol. 53. -№372.-P. 1331-1341.

59. Alternative oxidase in Durham wheat mitochondria. Activation by pyruvate, hydroxypyruvate and glyoxylate and physiological role / D. Pastore et al. // Plant and Cell Physiology.-2001.-Vol. 42.-P. 1373-1382.

60. Antimycin A treatment decreases respiratory internal rotenone-insensitive NADH oxidation capacity in potato leaves / D. A. Geisler et al. // BMC Plant Biol. 2004. - Vol. 4. - P. 4-8.

61. Apel K. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction / K. Apel, H. Hirt // Annu Rev. Plant Biol. 2004. - Vol. 55. - P. 373-399.

62. Are diverse signalling pathways integrated in the regulation of Arabidopsis antioxidant defence gene expression in response to excess excitation energy? /

63. P. Mullineaux et al. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2000. - Vol. 355.-P. 1531-1540.

64. Arora A. Oxidative stress and antioxidative system in plants / A. Arora, R. K.

65. Sairam, G. C. Srivastava // Curr. Sci. 2002. - Vol. 82. - P. 1227-1238.

66. Arrigo A. P. Gene expression and the thiol redox state / A. P. Arrigo // Free Rad. Biol. Med. 1999. - Vol. 27. - P. 936-944.

67. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygensand dissipation of excess photons / K. Asada // Plant Mol. Biol. 1999. - Vol. 50.-P. 601-639.

68. AtPUMP: an Arabidopsis gene encoding a uncoupling mitochondrial protein /

69. G. Maia et al. // FEBS Lett. 1998. - Vol. 429. - P. 403-406.

70. Bakalova S. Isoenzyme profiles of peroxidase, catalase and superoxide dismutase as affected by dehydration stress and ABA / S. Bakalova, D. Nedeva, A. Nikolova // Bulg. J. Plant Physiol. 2003. - P. 3 86.

71. Blokhina O. Reactive oxygen species and nitric oxide in plant mitochondria:origin and redundant regulatory systems / O. Blokhina, K. V. Fagerstedt // Physiol Plant. -2010. Vol. 138. - № 4. - P. 447-462.

72. Catalase is encoded by multigene family in Arabidopsis thaliana L. / J. A. Frugoli et al. // Heynh. Plant Physiol. 1996. - Vol. 112. - P. 327-336.

73. Chilling stress and mitochondrial genome rearrangement in the MSC16 cucumber mutant affect the alternative oxidase and antioxidant defense system to a similar extent / B. Szal et al. // Physiologia Plantarum. 2009. -Vol. 137.-P. 435-445.

74. Cold stress decreases the capacity for respiratory NADH oxidation in potato leaves / A. S. Svensson et al. // FEBS Lett. 2002. - Vol. 517. - P. 79-82.

75. Controlled levels of salicylic acid are required for optimal photosynthesis andredox homeostasis / A. Mateo et al. // J. Exp. Bot. 2006. - Vol. 57. - P. 1795-1807.

76. Cooper T. G. Mitochondria and glyoxysomes from castor bean endosperm enzyme constitutents and catalytic capacity / T. G. Cooper, H. J. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 3507-3513.

77. Cyanide-resistant, ATP-synthesis-sustained, and uncoupling protein sustained respiration during postharvest ripening of tomato fruit / A. M. Almeida et al. // Plant Physiol. 1999. - Vol. 119. P. - 1323-1329.

78. Differential localization of antioxidants in maize leaves / A. G. Doulis // Plant

79. Physiol. 1997.-Vol. 114.-P. 1031-1037.

80. Dixon R. Plant eel culture. A practical approach / R. Dixon, R. Gonzaless. -USA: Oxford University Press, 1996. 190 p.

81. Dual action of the active oxygen species during plant stress re-sponses / J. Datet al. // Cell. Mol. Life Sci. 2000. - Vol. 57. - P. 779-795.

82. Dynsmic changes in the mitochondrial electron transport chain underpinning cold acclimation of leaf respiration / A. N. Armstrong et al. // Plant, Cell and environment. -2008.-Vol. 31.-P. 1156-1169.

83. Effects of cold exposure in vivo and uncouplers and recouplers in vitro on potato tuber mitochondria / V. N. Popov et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2002. Vol. 1553. - P. 232-237.

84. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and regulatory role for hydrogen peroxide / T. K. Prasad et al. // Plant Cell. -1994. Vol. 6. - P. 65-74.

85. Exploring the molecular nature of the alternative oxidase regulation and catalysis / C. Affourtit et al. //FEBS Lett. -2001. Vol. 510. - P. 121-126.

86. Fait A. GAB A shunt deficiencies and accumulation of reactive oxygen intermediates: insight from Arabidopsis mutants / A. Fait, A. Yellin, H. Fromm // FEBS Lett. 2005. - Vol. 579. - № 2. - P. 415-420.

87. Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial unconpling proteins / P. Jezeket al. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1365. - P. 319-327.

88. Finkel T. Oxidants, oxidative stress and the biology of aging / T. Finkel, N. J.

89. Holbrook // Nature. 2000. - Vol. 408. - P. 239-247.

90. Foyer C. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signaling / C. Foyer, G. Noctor //New Phytol. 2000. - Vol. 146. - P. 359-388.

91. Foyer C. Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria / C. Foyer, G. Noctor // Physiol. Plant. 2003. - Vol. 119. - P. 355-364.

92. Functional coexpression of the mitochondrial alternative oxidase and uncoupling protein underlies thermoregulation in the thermogenic florets of skunk cabbage / Y. Onda et al. // Plant Physiology. 2008. - Vol. 146. - P. 636-645.

93. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search / S. F. Altschul et al. // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 33893402.

94. Genomic evidence for COP1 as a repressor of light-regulated gene expressionand development in Arabidopsis / L. Ma et al. // Plant Cell. 2002. - Vol. 14.-P. 2383-2398.

95. Characterization of the gene family for alternative oxidase from Arabidopsis thaliana / D. Saisho et al. // Plant Mol. Biol. 1997. - Vol. 35. - P. 585-596.

96. Hillary E. S. A Quantum Leap in mRNA Quantitation / E. S. Hillary // The

97. Scientist. 2000. - Vol. 14. - P. 22.

98. Homologues of the uncoupling protein from brown adipose tissue (UCP1): UCP2, UCP3, BMCP1 and UCP4 / F. Bouillaud et al. // Biochim. Biophys. Acta.-2001.-Vol. 1504.-P. 107-119.

99. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress / N. Nicot et al. // Journal of Experimental Botany. 2005. - Vol. 56, № 421. - P. 2907-2914.

100. Hung S.-H. Hydrogen peroxide functions as a stress signal in plants / S.-H. Hung, C.-W. Yu, C. H. Lin // Bot. Bull. Acad. Sin. 2005. - Vol. 46. - P. 110.

101. Identification of a mitochondrial NADPH dehydrogenase by overexpression intransgenic Nicotiana sylvestris / A. M. Michalecka et al. // Plant J. 2004. -Vol. 37.-P. 415-425.

102. Igamberdiev A. U. Plant mitochondrial function during anaerobiosis / A. U. Igamberdiev, R. D. Hill // Ann Bot. 2009. - Vol. 103. - P. 259-268.

103. Inactivation and degradation of CuZn-SOD by active oxygen species in wheatchloroplasts exposed to photooxidative stress / L. M. Casano et al. // Plant Cell Physiol. 1997. - Vol. 38. - P. 433—440.

104. Inactivation of aconitase and oxoglutarate dehydrogenase in skeletal muscle invitro by superoxide anions and/or nitric oxide / U. Andersson et al. // Biochem. Biophys. Res. 1998. - Vol. 249. - P. 512—516.

105. Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress signaling / S. Morita et al. // Plant Cell Physiol. 1999. - Vol. 40. - P. 417122.

106. Influence of chloroplastic photo-oxidative stress on mitochondria alternative oxidase capacity and respiratory properties: a case study with Arabidopsis yellow variegated / K. Yoshida et al. // Plant Cell Physiol. 2008. - Vol. 49. -P. 592-603.

107. Influence of CSP 310 and CSP 310-like proteins from cereals on mitochondrial energetic activity and lipid peroxidation in vitro and in vivo / A. Kolesnichenko et al. // BMC Plant Biology. 2001. Vol. 1. - P. 1-6.

108. Inhibition of the alternative oxidase stimulates H202 production in plantmitochondria / V. N. Popov et al. // FEBS Lett. 1997. - Vol. 415. - P 8790.

109. Jezek P. Mammalian mitochondrial uncoupling proteins / P. Jezek, K. D. Garlid // J. Biochem. Cell Biology. 1998. - Vol. 30. - P. 1163-1168.

110. Kardish N. The tomato gene for the chloroplastic Cu,Zn-superoxide dismutase: regulation of expression imposed in transgenic tobacco plants by a short promoter / N. Kardish et al. // Plant Mol. Biol. 1994. - Vol. 25. - P. 887-897.

111. Korshunov S. S. High protonic potencial actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria / S. S. Korshunov, V. P. Skulachev, A. A. Starkov // FEBS Lett. 1997. - Vol.416. - P.15-18.

112. Kowaltowski A. J. Activation of the Potato Plant Uncoupling Mitochondrial Protein Inhibits Reactive Oxygen Species Generation by the Respiratory Chain / A. J. Kowaltowski, A. D. T. Costa, A. E. Vercesi // FEBS Lett. -1999.-Vol. 425.-P. 213-216.

113. Laloi, M. Plant mitochondrial carriers: an overview / M. Laloi // Cell. Mol. Life Sci. 1999.-Vol. 56.-P. 918-944.

114. Li J. Hydrogen peroxide contents and activities of antioxidative enzymes among C3, C4 and CAM plants / J. Li, X. Zhao, S. Matsui // J. Japan Soc Hort Sci. 2001. - Vol. 70. - P. 747-752.

115. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways / Ma Ligeng et al. // Plant Cell. -2001. Vol. 13. - P. 2589-2607.

116. Light regulation of the Arabidopsis respiratory chain. Multiple discrete photoreceptor responses contribute to induction of type II NAD(P)H dehydrogenase genes / A. E. Matthew et al. // Plant Physiol. 2004. - Vol. 136. - P. 2710-2721.

117. Lin C. Plant blue-light receptors / C. Lin // Trends Plant Sci. 2000. - Vol. 5. -P. 337-342.

118. Livak K. J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2~AACT method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. 2001. - Vol. 25. - P. 402-408.

119. Lowry O. Protein measurement with the Folinphenol reagent / O. Lowry, N. Rosenbrough // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 194. - P. 265-275.

120. Luethy M. H. Partial purification and characterization of three NAD(P)H dehydrogenases from Beta vulgaris mitochondria / M. H. Luethy, M. K. Hayes, T. E. Elthon // Plant Physiol. 1991. - Vol. 97. - № 4. - P. 13171322.

121. Maxwell D. P. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells / D. P. Maxwell, Y. Wang, L. Mcintosh // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - Vol. 96. - P. 8271-8276.

122. Mechanisms of thermoregulation in plants / J. R. Watling et al. // Plant Signaling & Behavior. 2008. - Vol. 3. - P. 595-597.

123. Metzler M. C. Maize NADP-malate dehydrogenase: cDNA cloning, sequence, and mRNA characterization / M. C. Metzler, B. A. Rothermel, T. Nelson // Plant Mol. Biol. 1989. - Vol. 12. - P. 713-722.

124. Millenaar F. F. The alternative oxidase: in vivo regulation and function / F. F. Millenaar, H. Lambers // Plant biol. 2003. - Vol. 5. - P. 2-15.

125. Mitochondrial reactive oxygen species. Contribution to oxidative stress and interorganellar signaling / D. M. Rhoads et al. // Plant Physiol. 2006. -Vol. 141.-P. 357-366.

126. Mitochondrial uncoupling protein is required for efficient photosynthesis / L. J. Sweetlove et al. // PNAS. 2006. - Vol. 103. - № 51. - P. 19587-19592.

127. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance / R. Mittler // Trends Plant Sci. 2002. - Vol. 7. - № 9. - P. 405-410.

128. Mittler R. Reactive oxygen gene network of plants / R. Mittler // Trends Plant Sci. 2004. - Vol. 9. - P. 490-498.

129. Modelling photosynthesis of cotton grown in elevated C02 / P. Harley et al. // Plant Cell Environ. 1992. - Vol. 15. - P. 271-282.

130. Molecular distinction between alternative oxidase from monocots and dicots / M. J. Considini et al. // Plant Physiol. 2002. - Vol. 129. - P. 949-953.

131. Moller I. M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species /1. M. Moller // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. - Vol. 52. - P. 561-591.

132. Moller I. M. The oxidation of cytosolic NAD(P)H by external NAD(P)H dehydrogenases in the respiratory chain of plant mitochondria /1. M. Moller // Physiol. Plantarum. 1997. - Vol. 100. - P. 85-90.

133. Moller I. M. The role of NADP in themitochondrial matrix / I. M. Moller, A. G. Rasmusson // Trends Plant Sci. 1998. - Vol. 3. - P. 21-27.

134. Monty K. Molecular Cell Biology / K. Monty, M. Scott. WH Freeman and Company, 2002. — 476 p.

135. Moore A. L. The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria / A. L. Moore, J. N. Siedow // Biochim. Biophys. Acta.-1991.-Vol. 1059.-P. 121-140.

136. Neill S. Hydrogen peroxide signaling / S. Neill, R. Desikan, J. Hancock // Curr Opin Plant Biol. 2002. - Vol. 5. - P. 388-395.

137. Neff M. M. Light: Anindicator of time and place / M. M. Neff, C. Fankhauser, J. Chory // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P. 257-271.

138. Negative regulation of plant photomorphogenesis / O. G. Smirnova et al. // System computational biology: analysis and modelling of gene networks and metabolic pathways. 2002. - P. 104-107.

139. Noguchi K. Interaction between photosynthesis and respiration in illuminated leaves / K. Noguchi, K. Yoshida // Mitochondrion. 2008. - Vol. 8. - № 1. -P. 87-99.

140. Possible involvement of superoxide anion in the induction of cyanide-resistant respiration in Hansenula anomala / N. Minagawa et al. // FEBS Lett. 1992. - Vol. 302. - P. 217-219.

141. Popov V. N. Possible role of free oxidation processes in regulation of reactive oxygen species production in plant mitochondria (review) / V. N. Popov // Biochem. Soc. Transactions. 2003. - Vol. 31. - №. 6. - P. 1316-1317.

142. Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells / H. B. Shao et al. // Int. J. Biol. Sci. 2008. - Vol. 4. - P. 8-14.

143. Primary structure and import pathway of the rotenone-insensitive NADHubiquinone oxidoreductase of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae / S. R. De Vries et al. // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 203. - P. 587-592.

144. PUMP ing plants / A.E. Vercesi et al. // Nature. 1995. - Vol. 375. - P. 24.

145. Purvis A. C. Role of the alternative oxidase in limiting superoxide production by plant mitochondria / A. C. Purvis // Physiol. Plant. 1997. - Vol. 100. - P. 165-170.

146. Purvis A. C. Superoxide production by mitochondria isolated from green bell pepper fruit / A. C. Purvis, R. L. Shewfelt, J. W. Georgenie // Physiol. Plant. -1995.-Vol. 94.-P. 743-749.

147. Raghavendra A. S. Beneficial interactions of mitochondrial metabolism with photosynthetic carbon assimilation / A. S. Raghavendra, K. Padmasree // Trends Plant Sci. 2003. - Vol. 8. - P. 546-553.

148. Raghavendra, A. S. Links high mitochondrial activity but incomplete engagement of the cyanide-resistant alternative pathway in guard cell protoplasts of pea / A. S. Raghavendra, T. Vani // Plant Physiol. 1994. -Vol. 105.-№4.-P. 1263-1268.

149. Rasmusson A. G. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria / A. G. Rasmusson, K. L. Soole, T. E. Elthon // Annu Rev Plant Biol. 2004. - Vol. 55. - P. 23-39.

150. Regulation of alternative oxidase activity in six wild monocotyledonous species. An in vivo study at the whole root level / F. F. Millenaar et al. // Plant Physiol. 2003. - Vol. 126. - P. 376-387.

151. Rhoads D. M. Isolation and characterization of a cDNA clone incoding an alternative oxidase protein of Sauromatum guttatum (Schott) / D. M. Rhoads, L. Mcintosh / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 88. - P. 2122-2126.

152. Role of ferrous iron In cyanide-resistant respiration in Hansenula anomala / N. Minagawa et al. // FEBS Lett. 1990. - Vol. 267. - P. 114-116.

153. Ros B. A. Hydrogen peroxide production is a general property of the lignifying xylem from vascular plants / B. A. Ros // Ann Bot. 1998. - Vol. 82.-P. 97-103.

154. Rozen S. Primer 3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, H. Skaletsky // Methods Mol. Biol. 2000. - Vol. 132.-P. 365-386.

155. Sairam R. K. Changes in activity of activity of antioxidant enzymes in sunflower leaves of different ages / R. K. Sairam, D. V. Singh, G. C. Srivastava // Biol. Plant. 2003. - Vol. 47. - P. 61—66.

156. Scandalios J. G. Oxygen stress and superoxide dismutase / J. G. Scandalios // Plant Physiology. 1993.-Vol. 101.-P. 7-12.

157. Scandalios J. G. The rise of ROS / J. G. Scandalios // Trends Biochem. Sci. -2002.-Vol. 27.-P. 483-486.

158. Schuster W. An adenine nucleotide tranclocator gene from Arabidopsis thaliana / W. Schuster, S. Kloska, A. Brennicke // Biochim. Biophys. Acta. -1993.-Vol. 1172.-P. 205-208.

159. Seymour R. S. Switching off the heater: influence of ambient temperature on thermoregulation by eastern skunk cabbage Symplocarpus foetidus / R. S. Seymour, A. J. Blaylock // J. Exp. Botany. 1999. - Vol. 50. - P. 1525-1532.

160. Skulachev V. P. Lowering of the Intracellular 02 Concentration as a Special Function of Respiratory Systems of the Cells / V. P. Skulachev // Biochemistry. 1994. - Vol. 59. - P. 1910-1912.

161. Sukalovic V. Plasma membrane-bound phenolic peroxidase of maise roots: in vitro regulation of activity with NADH and ascorbate / V. Sukalovic, M. Vuletic, Z. Vucinic // II Plant Sci. 2003. - Vol. 165. - P. 1429-1435.

162. Skulachev V. P. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-producing mitochondria and cell / V. P. Skulachev // FEBS Letters. 1996.-Vol. 397.-P. 7-10.

163. Small W. C. Identification of a cytosolically directed NADH dehydrogenase in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae / W. C. Small, L. M. Henn // Bacteriology. 1998. - Vol. 180. - № 16. - P. 4051-4055.

164. Stimulation of potato tuber respiration by cold stress is associated with an increased capacity of both plant uncoupling mitochondrial protein (PUMP)and alternative oxidase / F. F. Calegario et al. // J. Bioenerg. Biomembr. -2003.-Vol. 35.-P. 211-220.

165. Stress-induced changes in ubiquinone concentration and alternative oxidase in plant mitochondria / V. N. Popov et al. // Biosci Rep. 2001. - Vol. 21. - P. 369-379.

166. Superoxide stimulates a proton leak in potato mitochondria that is related to the activity of uncoupling protein / M. J. Considine et al. // J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278. - P. 22298-22302.

167. Suzuki N., Mittler R. Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance between signaling and destruction / N. Suzuki, R. Mittler // Physiol. Plant. 2006. - Vol. 126. - P. 45-51.

168. Svensson A. S. Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves / A. S. Svensson, A. G. Rasmusson // Plant J.-2001.-Vol. 28. -P.73-82.

169. Taylor B. L. PAS domains: internal sensors of oxygen, redox potential, and light / B. L.Taylor, I. B. Zhulin // Microbiological Molecular Biological Review. 1999. - Vol. 63. - P. 479-506.

170. The distribution of electron transport between the main cytochrome and alternative pathways in plant mitochondria during short-term cold stress and cold hardening / O. I. Grabelnych et al. // J. Thermal Biol. 2004. - Vol. 29. -P. 165-175.

171. The effect of growth and measurement temperature on the activity of the alternative respiratory pathway / M. A. Gonzalez-Meier et al. // Plant Physiol. 1999. - Vol. 120. - P.765-772.

172. The impact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria / L. J. Sweetlovel et al. // Plant J. 2002. - Vol. 32. - P. 891-904.

173. The internal rotenone-insensitive NADPH dehydrogenase contributes to malate oxidation by potato tuber and pea leaf mitochondria / S. C. Agius et al. // Physiologia Plantarum. 1998. - Vol. 104. - P. 329-336.

174. The maize alternative oxidase la (Aoxla) gene is regulated by signals related to oxidative stress / A. N. Polidoros et al. // Redox. Rep. 2005. - Vol. 10. -P. 71-78.

175. The promoter of the Arabidopsis thaliana plastocyanin gene contains a far upstream enhancer-like element involved in chloroplast-dependent expression / O. Vorst et al. // Plant J. 1993. - Vol. 4. - P. 933-945.

176. The role of different plant seedling shoots mitochondrial uncoupling systems in thermogenesis during low-temperature stress / O. I. Grabelnych et al. // J. Therm. Biol. 2003.- Vol. 28. - P. 571-580.

177. The role of hydrogen peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signalling in response to environmental stresses / I. Slesakl et al. // Akta Biochimica Polonika. 2007. - Vol. 54. - № 1. - P. 39-50.

178. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 genes encode separate mitochondrial NADH dehydrogenases catalyzing the oxidation of cytosolic NADH / M. A. H. Luttik et al. // The Journal of Biological Chemistry. -1998. Vol. 273. - P. 24529-24534.

179. Tobin E. M. Phytochrome regulated gene expression / E. M. Tobin, D. M. Kehoe // Semin. Cell Biology. 1994. - Vol. 5. - P. 335-346.

180. Tyagi A. K. Light-regulated expression of photosynthesisrelated genes / A. K. Tyagi, A. Dhingra, S. Raghuvanshi // Taylor and Francis Publishers Ltd: London. 2000. - P. 324-341.

181. Vanlerberghe G. C. Mitochondrial alternative oxidase is not a critical component of plant viral resistance but may play a role in the hypersensitive response / G. C. Vanlerberghe, S. H. Ordog // Plant Physiol. 2002. - Vol. 129. -№4.-P. 1858-1865.

182. Vanlerberghe G. C. Molecular localization of a redox-modulated process regulating plant mitochondrial electron transport / G. C. Vanlerberghe, L. Mcintosh, J. Y. H. Yip//The Plant Cell. 1998. - Vol. 10.-P. 1551-1560.

183. Vanlerberghe G. C. Alternative oxidase: from gene to function / G. C. Vanlerberghe, L. Mcintosh // Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1997,-Vol. 48. P. 703-734.

184. Vianello A. ATP/ADP antiporter is involved in uncoupling of plant mitochondria induced by low concentrations of palmitate / A. Vianello, E. Petrussa, F. Macri // FEBS Lett. - 1994. - Vol. 349. - P. 407-410.

185. Villar R. Dark leaf respiration in the light and darkness of an evergreen and a deciduous plant species / R. Villar, A. Held, J. Merino // Plant Physiol. 1995. -Vol. 107. - P. 421-427.

186. Wagner A. M. A role for active oxygen species as second messengers in the induction of alternative oxidase gene expression in Petunia hybrida cells / A. M. Wagner // FEBS Lett. 1995. - Vol. 368. - P. 339-342.

187. Xu Y.-C. The influence of hardening to stress by H202 on the drought resistance of wheat plantlets / Y.-C. Xu, J. Wang, L. Shan // Acta Bot. Boreali-Occident. Sin. 2000. - Vol. 20. - № 3. - P. 382-386.

188. Yu N. A genome approach to mitochondrial-nuclear communication in Arabidopsis / N. Yu, R. Nickels, L. Mcintosh // Plant Physiol. Biochem. -2001.-Vol. 39.-P. 345-353.

189. Zhu D. Differentia accumulation of manganese-superoxide dismutase transcripts in maze in response to abscisic acid and high osmoticum / D. Zhu, J. G. Scandalios // Plant Physiol. 1994. - Vol. 106. - P. 173—178.