Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений

Фоменко, Олег Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений"

На правах рукописи

Фоменко Олег Юрьевич

Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений

Специальность 03 00 04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2007

□031ТТ220

003177220

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Попов Василий Николаевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Борис Николаевич Иванов доктор биологических наук, профессор Тамара Андреевна Ковалева

Ведущая организация Сибирский институт физиологии и

биохимии растений (СИФИБР) СО РАН

Защита состоится 7 декабря 2007 г в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, Воронеж, Университетская пл, 1, аудитория 59

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан 6 ноября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М Ю

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных проблем современной биохимии растений является взаимодействие и регуляция путей свободного окисления дыхательных субстратов Электрон-транспортная цепь митохондрий является ключевым местом образования восстановительных эквивалентов, а также одним из основных источников генерации активных форм кислорода в растительной клетке

Наиболее распространенным восстановительным эквивалентом, синтезируемым в процессе функционирования центральных клеточных метаболических путей, является NADH, что делает его основным донором электронов в дыхательных цепях У прокариот NADH продуцируется в цитозоле, преимущественно гликолитическими ферментами (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназой и пируватдегидрогеназой) и тремя ферментами цикла трикарбоновых кислот изоцитрат-, а-кетоглутарат- и малатдегидрогеназами У эукариот соответствующие реакции цикла Кребса протекают в митохондриальном матриксе, приводя к образованию митохондриального NADH Восстановленные динуклеотиды окисляются NADH убихинон оксидоредуктазой (комплексом I) электрон-транспортной цепи Энергия при этом запасается исключительно в виде разности трансмембранного электрохимического потенциала

Кроме того, NADH, окисляясь в митохондриях, является потенциальным источником NAD+ - главного клеточного акцептора электронов Так как количество NAD+ мало по сравнению с количеством субстратов, которые необходимо окислить, образовавшийся в результате реакций окисления NADH необходимо быстро реокислять для поддержания постоянного уровня NAD+ и устранения возможного лимитирования процессов окисления недостатком NAD [32] Более того, отношение [NADH]/[NAD ] участвует в регуляции путей клеточного метаболизма, приводящих к синтезу АТР Потребности клетки в NAD+ ставят приоритет круговорота NADH даже выше синтеза АТР Благодаря тому, что свободное окисление одной молекулы NADH приводит к меньшему выходу АТР по сравнению с окислением той же молекулы, осуществляемому через комплекс I ЭТЦ, активность несопряженных NADH дегидрогеназ может быть жизненно необходимой в ситуациях, когда отношения [NADH]/[NAD+] и [ATP]/[ADP] являются очень высоким, именно благодаря тому, что они способны окислить больше NADH, произведя при этом меньше АТР, увеличивая таким образом поток субстратов окисления через дыхательную цепь

Подобная ситуация наиболее характерна для растений, находящихся на интенсивном свете, когда энергетические потребности клетки сполна покрываются за счет фотосинтетической электрон-транспортной цепи Обзор литературы показал противоречивость имеющихся о регуляции дыхания и свободного окисления светом Одним из возможных опосредованных механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция

несопряженного и разобщенного дыхания, является фитохромная система Известно, что фитохромная система участвует в регуляции активности некоторых ферментов дыхания растений Эффект фитохрома может проявляться через различные вторичные посредники, такие как ионы Са2+, G-белки, цАМФ, изменяя состояние клеточных мембран, в том числе и митохондриальной, или воздействуя на генетический аппарат клетки посредством различных сигнальных систем, регулируя таким образом интенсивность экспрессии генов

Практически все исследованные растения обнаруживают способность к цианид-нечувствительному дыханию Этот процесс обеспечивается присутствием во внутренней мембране митохондрий оксидазы, способной восстанавливать молекулярный кислород в воду, и не содержащей двухядерный гем-медный центр, присутствующий в других оксидазах [Mcintosh, 1994] Эта альтернативная оксидаза (АО), которая отличается от цитохромного пути является убихинон кислород оксидоредуктазой и функционирование ее, видимо, не сопряжено с образованием АТР Обнаруженная в растительных митохондриях, альтернативная оксидаза присутствует также в митохондриях дрожжей, некоторых грибов, протестах и трипаносомах [Wagner, Moore, 1997] К основным функциям альтернативной оксидазы относятся термогенез, предотвращение «переполнения» электрон-транспортной цепи и, что наиболее важно, предотвращение образования свободных радикалов за счет снижения мембранного потенциала при несопряженном дыхании

Неизученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при изменении светового режима, а также о кооперативной деятельности путей свободного окисления Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение распространения, каталитических характеристик и некоторых аспектов экспрессионной регуляции путей свободного окисления дыхательных субстратов в митохондриях высших растений

Для достижения цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить распространенность альтернативных ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ митохондрий высших растений

2 Выявить особенности процессов окисления NADH в семенах клещевины и роль реакций переаминирования в этом процессе

3 Исследовать разобщающий эффект лауриновой кислоты, опосредованный ADP/ATP-антипортером в митохондриях клубней картофеля

4 Изучить органоспецифическую экспрессии внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы S lycorersicum

5 Клонировать участки генов ndal и ndbl томата

6 Методом ПЦР в реальном времени изучить световую регуляцию экспрессии гена ndbl томата

7 Изучить коэкспрессию альтернативной оксидазы с NADH-дегидрогеназами II типа в митохондриях высших растений

8 Провести ПЦР-РВ анализ уровня экспрессии PUMP митохондрий томата

9 Провести количественный анализ уровня экспрессии гена ndbl томата в условиях различного светового режима

Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о функционировании и взаимодействии путей свободного окисления в митохондриях высших растений

Показана широкая распространенность механизмов разобщенного и несопряженного дыхания у растений, что свидетельствует об их важной роли в подержании нормального функционирования энергетического и конструктивного метаболизмов растительной клетки

В тканях томата с использованием ОТ-ПЦР анализа впервые идентифицированы гены внешней и внутренней ротенон-нечувствительных ЫАО(Р)Н-дегидрогсназ

Разработка эффективной ПЦР-РВ тест-системы позволила установить механизм регуляции экспрессии гена ndbl томата в условиях различного светового режима Показано, что в течение светового дня количество соответствующей информационной РНК возрастает, снижаясь с наступлением темноты Активация транскрипции гена ndbl объясняется, на наш взгляд, необходимостью эффективного и быстрого окисления восстановительных эквивалентов для предотвращения ситуации overflow на свету

На основе анализа действия света различного спектрального состава изучен механизм регуляции внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)H-дегидрогеназы активной формой фитохрома А Фотоактивный фитохром активирует транскрипцию гена ndbl в листьях томата, что приводит к увеличению концентрации соответствующей мРНК в клетке, что четко коррелирует с возрастанием емкости внешнего окисления NADH митохондриями листьев растений под действием красного света

Изучены механизмы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях клубней картофеля Показано, что активность ротенон-нечувствительных ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ в них низка, а основным механизмом свободного окисления дыхательных субстратов выступает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования, вызываемое свободными жирными кислотами, причем уровень разобщенности митохондрий возрастает при воздействии на растения пониженных температур С использованием ингибиторного анализа показано, что основным механизмом разобщения является функционирование ATP/ADP-антипортера Кроме того, установлено, что пониженная активность внешней ротенон-нечувствительной ЫАО(Р)Н-дегидрогеназы в тканях картофеля компенсируется повышенным содержанием в них белков, разобщающих дыхание и окислительное фосфорилирование

Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции путей свободного окисления дыхательных субстратов в митохондриях высших

растений в условиях изменения светового режима и воздействия пониженных температур Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции экспрессии и активности внешней ротенон-нечувствительной ЫАО(Р)Н-дегидрогеназы является одним из механизмов, координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений Полученные данные по экспрессии гена ndbl томата указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в зависимости от источника энергии и степени восстановленности электрон-транспортной цепи митохондрий

Практическая значимость. Знание механизмов взаимодействия энергетического и конструктивного метаболизма клетки открывает возможности регулирования их соотношения, что способствует повышению продуктивности и урожайности растений

Разработанная тест-система для анализа ПЦР-РВ паттернов экспрессии генов, кодирующих ферментативные системы свободного окисления митохондрий высших растений, может быть легко адаптирована для изучения функционального состояния электрон-транспортной цепи многих видов культурных растений

Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма как целостной системы Полученные данные по экспрессии генов путей свободного окисления при изменении светового режима создают условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности культурных растений, а также устойчивости растений к воздействию неблагоприятных факторов среды и патогенов

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях Они были представлены на 10 и 11 международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006, 2007), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на VI съезде общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), на ежегодных научных сессиях преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (Воронеж, 2005, 2007)

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях — 6 статьях и 6 тезисах

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (170 источников) Иллюстрационный материал включает 33 рисунка и 4 таблицы

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве основных объектов исследования в работе использовали 14-дневные проростки Solanum lycopersicum, выращенные в почве по стандартной методике при 12 часовом световом дне с интенсивностью света 25 Ватт/м2 Кроме того, в качестве объектов исследования служили проростки следующих культурных и диких растений кукурузы (Zea mays L ), сорт Воронежская 76, клещевины (Ricinus communis), картофеля (Solanum tuberosum) и аронника восточного (Arum orientale)

Постановка эксперимента по созданию светового режима Белый свет получали от ламп дневного света в установке «Флора-1» Красный (КС) и дальний красный свет (ДКС) получали с помощью светодиодов с областью испускания 640-680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710-750нм (ЗЛ127А-5, Россия) Опыты по изучению влияния фитохромной системы на растения проводили по следующей схеме Часть растений выдерживали при стандартных условиях выращивания растений (12-часовой фотопериод) Растения второй группы инкубировали 24 ч в темноте Третью группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 5 мин и затем инкубировали 3 ч в темноте И, наконец, четвертую группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 5 мин, затем ДКС с длиной волны 730 нм в течение 5 мин, после чего инкубировали 3 ч в темноте

Выделение растительных митохондрий. Митохондрии выделяли с использованием метода изоплотностного центрифугирования в градиенте перколла

Определение активности ферментов. Активности НАДН-ДГ и ПАЯК-ДГ ферментов определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности среды при длине волны 340 нм в течение 5 мин при 25°С За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин при 25°С

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry, 1951]

Выделение и очистка фермента. Для получения частично очищенного препарата ПАЯК-ДГ из эндосперма клещевины были разработана трех стадийная схема очистки, включающая получение гомогената, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и хроматографию на ионообменнике ДЭАЭ-целлюлозе

Выделение РНК и проведение ПЦР. Для выделения суммарной РНК применяли метод гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski et al, 1987] с использованием хлорида лития в качестве осаждающего агента Визуализацию результатов экстракции РНК производили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле Для идентификации генов альтернативных ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ использовали метод ПЦР со специфическими праймерами ПЦР проводилась на приборах«Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия)

Секвенирование ампликона. Очистку ампликона осуществляли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с помощью набора QIAEX® II Gel Extraction Kit (150), согласно рекомендациям производителя Очищенный ампликон секвенировали в «ВНТК генной активности» Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино)

Проведение ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ проводили на приборе Chromo 4(Biorad, США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I, референсного красителя ROX и генспецифических праймеров к генам ndbl, aoxla и pump томата В качестве гена-нормализатора использовался гена фактора элонгации томата ef-la В качестве отрицательного контроля при проведении ПЦР-РВ использовали суммарную клеточную РНК без этапа обратной транскрипции

Определение мембранного потенциала растительных митохондрий. ДТ определялся по изменению разностного спектра поглощения сафранина на спектрофотометре Aminco DW-2000 по разности поглощения при 523 и 555 нм [Akerman et al, 1976]

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3-х кратной биологической и аналитической повторности В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин, 1990]

РАСПОСТРАНЕННОСТЬ ВНЕШНИХ РОТЕНОН-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ NADH-ДЕГИДРОГЕНАЗ

Нами было проведено сравнение активности внешних ротенон-нечувствительных ЫАО(Р)Н-дсгидрогеназ в митохондриях различных видов растений и типов растительных тканей Полученные данные приведены в таблице 1 Исключительно высокая активность внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы наблюдается в початках термогенного растения A orientale Однако митохондрии из женского соцветия кукурузы (початка), морфологически близкого к початку A orientale, подобными свойствами не обладают - активность фермента у них ниже приблизительно в 7 раз Это позволяет предположить, что исключительно высокая активность внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)H-

дегидрогеназы митохондрий A orientale не связана с какими-либо морфологическими или видовыми особенностями, а присуща исключительно митохондриям, выделенным только из термогенных тканей растений Как видно из таблицы, наименьшей активность внешней ротенон-нечувствительной

Таблица 1

Активности внешних ротенон-нечувствительных ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ,

выделенных из разных тканей растений

Объект исследования Активность, Е/мг белка

клубник tuberosum 0,128±0,00б

зеленые листья S tuberosum 0,189±0,009

плоды S lycopersicum 0,022±0,001

зеленые листья S lycopersicum 0,430±0,022

початок A orientate 1,900±0,095

клубень А Orientale 0,021 ±0,001

зеленые листья Z mays 0,48б±0,024

початок Z mays 0,271 ±0,014

эндосперм R communis 0,125±0,006

НАБ(Р)Н-дегидрогеназы обладают митохондрии запасающих тканей, выделенных из клубней и плодов всех исследованных видов растений Такая картина может объясняться низким уровнем дыхательного метаболизма данных органов и низким уровнем фотосинтеза

ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛЕНИЯ МАИ-ЗАВИСИМЫХ СУБСТРАТОВ В

ЭНДОСПЕРМЕ КЛЕЩЕВИНЫ В ходе изучения функционирования ротенон-нечувствительных КАБ(Р)Н-дегидрогеназ высших растений нами было обнаружено, что активность внешней КАОН-дегидрогеназы в тканях эндосперма клещевины значительно ниже, чем в остальных изученных нами объектах Поэтому мы предположили, что в эндосперме клещевины должны функционировать иные обходные пути, позволяющие обойти лимитирующие участки цикла трикарбоновых кислот, связанные с продукцией МАОН, а именно от изоцитрата до сукцинил-КоА [МПШоиве е1 а1, 1986] Одним из такого рода механизмов может являться работа ГАМК-шунта и, в частности, его ключевого фермента -дегидрогеназы полуальдегида янтарной кислоты

Активность дегидрогеназы полуальдегида янтарной кислоты была обнаружена в жирозапасающих тканях всех изученных растений (щитках

кукурузы и пшеницы, эндосперме клещевины и семядолях подсолнечника и гороха) Активность ПАЯК-ДГ в щитках злаков составляла 0 21-0 26 Ед/г сырой массы, или 0 030-0 033 Ед/мг белка В семядолях подсолнечника и гороха активность ПАЯК-ДГ равнялась 0 22-0 23 Ед/г сырой массы Специфическая активность была равна 0 043 и 0 024 Ед/мг белка соответственно (табл 2)

Таблица 2

Активность дегидрогеназы полуадьдегида янтарной кислоты

жирозапасающих тканей различных растений

Орган Возраст Активность, Специфическая

проростков, Ед/г сырой активность, Ед/мг

дней массы белка

Щиток кукурузы 4 0,21±0,02 0,033±0,004

Щиток пшеницы 5 0,26±0,03 0,030±0,003

Эндосперм клещевины 5 0,49±0,05 0,068±0,008

Семядоли 3 0,22±0,02 0,043±0,003

подсолнечника

Семядоли гороха 7 0,23±0,02 0,024±0,003

В эндосперме клещевины специфическая активность дегидрогеназы полуальдегида янтарной кислоты была значительно выше (0 064 Ед/мг белка), чем в других изученных жирозапасающих растительных тканях

В ходе нашей работы мы обнаружили, что в эндосперме клещевины 80% активности ПАЯК-ДГ ассоциировано с цитозолем (табл 3)

Таблица 3

Субклеточная локализация ПАЯГ-ДГ в эндосперме клещевины

Фракция Суммарная активность, Ед Специфическая активность, Ед/мг белка

Цитозоль 24,1 0,106

Митохондрии 6,2 0,028

Глиоксисомы 1,9 0,008

Дегидрогеназа полуальдегида янтарной кислоты эндосперма клещевины была частично очищена нами, и были изучены некоторые ее каталитические

свойства Мы детектировали только один пик каталитической активности Максимальная эффективность элюции была достигнута при концентрации КС1 30-40 мМ В результате частичной очистки были получены препараты со специфической активностью 0 636 Ед/мг белка Степень очистки ПАЯК-ДГ составила 7,4 раза с выходом 36%

Очевидно, сопряжение реакций цикла трикарбоновых кислот с процессами переаминирования и ГАМК-шунтом в проростках клещевины является не только механизмом, обеспечивающим превращение больших количеств сукцината, продуцируемого глиоксилатным циклом, но при этом достигается перераспределение НАДН из митохондрий в цитоплазму, где его реокисление не связано с эффектом дыхательного контроля, а также обеспечивается поддержание рН-гомеостаза и происходит синтез аминокислот

ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ В МИТОХОНДРИЯХ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

При изучении механизмов разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования было показано, что инкубация клубней картофеля в течение 48-96 часов при температуре 4°С приводила к снижению митохондриального A*? Это было установлено на основе того факта, что начальный уровень ответа на сафранин (перед первой добавкой ресопрягающего агента) был ниже в митохондриях из растений, обработанных холодом В растениях, инкубировавшихся при 4°С, добавка БСА повышала мембранный потенциал сильнее, чем в митохондриях из контрольных растений (Рис 1) Эти данные могут объясняться тем, что холод вызывает увеличение уровня свободных жирных кислот, играющих роль медиаторов терморегуляторного разобщения Чувствительность ДЧ* к добавкам экзогенного лаурата была также сильнее для митохондрий из обработанных холодом клубней картофеля Добавка 60 цМ лаурата к этим митохондриям вызывала изменение оптической плотности по сафранину в 1,5 раза большее, чем в контрольных растениях

Нами был изучен эффект карбоксиатрактилата на митохондрии клубней картофеля Было показано, что он обладает более высоким ресопрягающим эффектом в митохондриях из обработанных холодом растений На фоне Катр нуклеотиды не вызывали дальнейшего ресопрягающего эффекта Таким образом, нами установлено, что в митохондриях картофеля адаптивная реакция на пониженную температуру заключается в накоплении свободных жирных кислот и снижении мембранного потенциала за счет разобщения жирными кислотами через ATP/ADP антипортер, причем уникальными характеристиками данного пути является высокая чувствительность к карбоксиатрактилату и чувствительность к GDP и UDP Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования может играть важную роль в регуляции скорости образования активных форм кислорода, так как для животных митохондрий было показано, что при снижении ДЧ* нелинейно понижалась и скорость образования АФК

0SA

BSA ONP

s I. у L,sH!

wo i

Lsu

CAtf I 1

AOP i ADP 5(лМ 1 (VM ! —<

DNP

? I 3 A

Рис. 1. Эффект инкубации in vivo при 4 С, разобщителей и некоторых ресопрягающих веществ in vitro на митохондрии из клубней картофеля.

Инкубационная смесь содержала 250 мМ сахарозы, 1- мМ MOPS, 0,5 мМ ЭГТА, 3 мМ КН2Р04 (pH 7.4), 100 мкМ TMDP, 5 мМ аскорбат, олигомицин (2 мкг/мг белка), 2 мкМ ротенон, 7 мкМ сафранин О, митохондрии (0,4 мг белка/мл). Добавки: Lau - 10 мкМ лаурат, CAtr - 1 мкМ карбоксиатрактилат, DNP - 100 мкМ динитрофенол, BS А - 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ POTEHOH-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ NADH-ДЕГИДРОГЕИАЗ ТОМАТА

Идентификация ротенон-нечувствительных NAD(P)H-flerHÄporeHa3 томата проводилась с использованием OT-ПЦР анализа. Праймеры для генов ndal и ndbl были разработаны при помощи программного обеспечения FastPCR. Проведение ПЦР с использованием матриц кДНК томата были получены ампликоны генов ndal и ndbl томата с длинами 382 п.о. и 574 п.о. соответственно (рис. 2).

Полученный ампликон предполагаемого гена ndal томата был секвенирован. Установлено, что имеет 98% гомологию с геном ndal, кодирующим внутреннюю ротенон-нечувствительную NADH-дегидрогеназу Solanum tuberosum.

МП п м

Рис. 2 Результаты ПЦР на матрице кДНК5. 1усореЫсит с использованием праймеров для гена «¿а/ (А) и п<1Ы (Б). П - ПЦР-продукт, М - маркеры.

ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ВНЕШНЕЙ РОТЕНОН-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЫАЭН-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ТОМАТА Изучение органоспецифической экспрессии гена пс1Ы томата проводилось с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ анализов. Проведение полимеразной цепной реакции с использованием матриц кДНК листье, стеблей и корней томата в оптимизированных условиях показало, что ген пс!Ы экспрессируется во всех изученных тканях томата (рис. 3).

К С Л М

Рис. 3. Органоспецифическая экспрессия гена п<1Ы томата. К - корень; С - стебель; Л - лист; М- маркеры.

Относительный уровень экспрессии гена ndbl в различных органах томата был изучен с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и референсного красителя ROX. Определение относительного уровня экспрессии производилось с использованием ДДСгметода. Наивысший уровень экспрессии гена ndbl обнаруживается в стеблях томата. Там он более чем в 4.5 раза превышает уровень экспрессии данного гена в корнях. Уровень экспрессии гена ndbl в листьях был несколько ниже, чем в стеблях, и превышал уровень его экспрессии в корнях лишь в 1,225 раза (рис. 4).

Рис. 4. Кинетика интенсивности флюоресценции во время ПЦР-РВ при изучении органоспецифической экспрессии ndbl томата (А) и относительный уровень экспрессии гена ndbl в различных органах томата. При проведении реакции использовалась кДНК, полученная с использованием 100 нг суммарной РНК.

Таким образом, полученные данные расширяют представления о физиологической роли внешних ротенон-нечувствительных NAD(P)H-дегидрогеназ и позволяют говорить о том, что ген ndbl конститутивно экспрессируется в тканях томата.

ВЛИЯНИЕ СВЕТА НА АКТИВНОСТЬ ВНЕШНЕЙ РОТЕНОН-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ NADH-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Было обнаружено, что после 24-часового облучения светом с интенсивностью 25 Дж/м2с растений, предварительно инкубированных 24 часа в темноте, активность внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы резко возрастала у всех изученных видов растений (рис. 5). Активность внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы митохондрий зелёных листьев кукурузы, томата и картофеля увеличивалась в 1,86, 1,99 и 1,44 раза соответственно. Наблюдаемое увеличение активности в связано, по-видимому, с тем, что роль альтернативного дыхательного пути резко увеличивается в условиях интенсивно протекающего фотосинтеза. В этих условиях главными функциями митохондрий являются продукция АТФ для синтеза сахарозы, поставка углеродных скелетов для процессов биосинтеза (особенно для ассимиляции азота) и фотодыхательное превращение глицина в серин. Таким образом, роль исследуемого фермента состоит в реокислении синтезируемого NADH и в предотвращении ситуации overflow, что позволяет функционировать циклу Кребса и ЭТЦ в условиях избытка восстановительных эквивалентов.

Рис. 5. Влияние смешанного белого света па активность внешних ротенон-нечувствительных NAD(P)H-

дегидрогеназ листьев различных растений.

СВЕТОВАЯ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПУТЕЙ СВОБОДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ТОМАТА

Нами были изучены изменения уровней экспрессии генов ndbl, aoxla и pump томата в течение светового дня. Опытные растения культивировались в фитотроне «Флора» при двенадцатичасовом световом дне. Нами исследовалось пять точек: момент переноса растений из темноты на свет (точка «О часов»), 1, 6 и 12 часов инкубации на свету с интенсивностью освещённости 25 Дж/м2с, и спустя 1 час с момента переноса растений со света в темноту. Из растений каждой группы выделялась РНК, а продукты, полученные в результате обратной транскрипции использовались для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Нами было установлено, что при переносе растений из темноты на свет (смена "ночи" и "дня") наблюдается быстрое накопление транскрипта ndbl в клетках, которое достигает своего максимума к 12 часу облучения. При этом количество транскрипта увеличивается более чем в 22 раза по сравнению с контрольной точкой - "О часов" - моментом переноса растений из темноты на свет. При переходе растений в темноту наблюдается быстрое падение концентрации транскрипта ndbl. В течение первого часа инкубации в темноте содержание соответствующей мРНК падает в 4,2 раза (рис. 6А).

Нами обнаружено, что изменение уровня экспрессии гена aoxla имеет сходный характер с динамикой экспрессии гена ndbl томата. С использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени было показано, что количество транскрипта увеличивается с момента переноса растений из темноты на свет и достигает своего максимума к 12 часу инкубации на свету с интенсивностью 25 Ватт/м2, увеличиваясь примерно в 20 раз по сравнению с контролем. При переносе растений в темноту количество транскрипта начинает закономерно уменьшаться. Через час инкубации растений в темноте количество транскрипта aoxla превышает его уровень в контроле уже только в 8,82 раза (рис. 6Б). В течение светового дня уровень экспрессии гена, кодирующего растительный разобщающий белок томата также меняется сходным образом.

1.2 га 1 - ■ листья кукурузы

с; ш S 0.8 £ ш л 0,6 ь □ листья томата

и ■ листья каргафзля

m 0,4 та 02 - i

1 1 1

темнота 24 ч свет 24 ч

условия опыта

Однако в течение первого часа инкубации растений на свету статистически достоверных изменений в обилии соответствующего транскрипта обнаружено не было. В дальнейшем количество транскрипта начинает возрастать, к шестому часу увеличиваясь в 2,25 раза по сравнению с контрольной. При этом

А Б

Рис. 6. Динамика экспрессии гена ndbl (А), aoxla (Б) и pump (В) зелёных листьев томата в течение светового дня. Определение уровня экспрессии проводилось методом ПЦР-РВ с применением флуоресцентного красителя SYBR Green I. При проведении реакции использовалась кДНК, полученная с использованием 100 нг суммарной РНК.

максимума оно достигало на 12 двенадцатый час инкубации растений томата на свету, и в 12,38 раза превышало уровень транскрипта в листьях контрольных растений. После переноса растений в темноту наблюдалось резко падение количества транскрита. После первого часа темновой инкубации оно составляло лишь 20% от своего максимального значения, и превышало количество транскрипта pump в листьях растений контрольной группы в 2,45 раза (рис. 6В).

Таким образом, нами показано, что в течение светового дня наблюдается коэкспрессия генов, кодирующих пути свободного окисления, причем паттерны

их экспрессии сходны и подчиняются, по-видимому, циркадным ритмам. Подобная регуляция позволяет растению более гибко регулировать потоки электронов и восстановительных эквивалентов в электрон-транспортных цепях митохондрий, адаптируя их в соответствии с текущими потребностями энергетического и конструктивного метаболизмов. Подобного рода регуляция экспрессии позволяет избежать ситуации overflow, поддерживает функционирование цикла Кребса на свету и благоприятствует нормальному протеканию фотосинтеза.

ВЛИЯНИЕ КРАСНОГО СВЕТА НА АКТИВНОСТЬ ВНЕШНЕЙ POTEHOH-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ NADH-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Установлено, что облучение растений красным светом (660 нм) вызывало увеличение активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы у всех исследованных видов растений (рис. 7) . Наиболее высокий прирост активности наблюдался у митохондрий томата. Спустя 3 часа после начала облучения активность фермента составила 236,1% от исходной. У растений кукурузы и картофеля активность исследуемого фермента выросла, соответственно, на 57,4 и 34,4% и составила 0,765 Е/мг белка и 0,254 Е/мг белка соответственно. При облучении растений дальним красным светом (730 нм) значительного увеличения активности не наблюдалось, а в случае зелёных листьев кукурузы и картофеля наблюдалось падение активности NDex на 20,2% и 24,4% соответственно. Последовательное облучение растения КС и ДКС оказывало аналогичный облучению ДКС эффект.

I « к Й ¡4 8 5

условия олыга

Рис. 7. Влияние света различных длин волн на активность внешних ротенон-нечувствительных NAD(P)H-дerидporeнaз зеленых листьев растений. Темнота -растения, инкубированные в темноте; свет - растения, выращенные на свету ; КС — растения, освещенные светом 660 нм; ДКС - растения, освещенные светом 730 нм; КС+ДКС -растения, последовательно освещенные светом 660 нм и 730 нм.

Таким образом, проведенные эксперименты показывают участие фитохромной системы в регуляции активности внешних ротенон-нечувствительных NAD(P)H-дeгидpoгeнaз митохондрий зелёных листьев растений, что подтверждается изменениями активности фермента при действии красного света, длина которого соответствует максимуму поглощения фитохрома и индуцирует его переход из неактивной формы Рббо в активную Р730. При облучении растений дальним красным светом наблюдается обратная фотоконверсия Р73о в неактивную Р660, которая не оказывает действие на интенсивность работы внешних ротенон-нечувствительных ЫАБ(Р)Н-дегидрогеназ.

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВНЕШНЕЙ РОТЕНОН-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЫАОН-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ СВЕТОМ РАЗЛИЧНЫХ ДЛИН ВОЛН

Нами было показано, что облучение растений в течение 5 мин светом интенсивностью 0,044 Дж/м2с с длиной волны 660 нм вызывает увеличение количества транскрипта пс1Ы в 1,6 раза. Облучение же светом той же интенсивности с длиной волны 730 нм такого эффекта не оказывало (рис. 8А). Напротив, наблюдалось дополнительное падение уровня транскрипта на 60% относительно контроля.

т "и

га •

660 нм 730 нм условия опыта

0,6

» 0,5 с

0.4

" 0,3 4

ш 0,2 1

1 0.1 —

660 нм 730 нм

условия опыта

Рис. 8. Влияние красного и дальнего красного света на экспрессию (А) и активность внешней ротенон-нечувствительной NADH-дeгидporeнaзы зелёных листьев томата.

Увеличение количества транскрипта коррелировало с изменением активности исследуемого фермента. Свет с длиной волны 660 нм вызывал увеличение активности в 2,4 раза по сравнению с контролем. Свет с длиной волны 730 нм данного эффекта не вызывал (рис 8Б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые нами была показана световая регуляция экспрессии внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата Установлено, что в течение светового дня количество транскрипта ndbl возрастает, достигая максимума к 12 часу инкубации растений на свету При переносе растений в темноты концентрация транскрипта падает Уже через час количество соответствующей мРНК уменьшается в 4,2 раза На основе анализа действия света различного спектрального состава нами выдвинута гипотеза о том, что в регуляции экспрессии гена ndbl томата принимает участие фитохромная система При этом изменения уровня транскрипта коррелировали с динамикой активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата

В нашей работе показано, что ферменты путей несопряженного дыхания необычайно широко распространены в растительном царстве Их экспрессия обнаруживается во всех изученных органах и тканях большого количества видов растений Это говорит об исключительной роли, принадлежащей им в процессе адаптации организма к меняющимся условиям окружающей среды и к воздействию абиотических стрессоров и паразитов Однако обнаруживаются некоторые виды растений, в тканях которых функциональная активность этих ферментов чрезвычайно низка Поэтому в ходе эволюции у них наибольшее развитие получили иные пути, позволяющие снимать явление дыхательного контроля

Нами было показано, что у растений с пониженной активностью ротеннон-нечувствительных NADH дегидрогеназ важную роль может играть разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования за счет рассеивания трансмембранного потенциала Митохондриальные разобщающие белки обнаружены у многих растений, грибов и простейших Их функционирование играет важную роль в процессе созревания плодов, адаптации к пониженным температурам и поддержании баланса ДцН в клетке Так, нами было показано, что в митохондриях картофеля адаптивная реакция на пониженную температуру заключается в накоплении свободных жирных кислот и снижении мембранного потенциала за счет разобщения жирными кислотами через ATP/ADP-антипортер, причем уникальными характеристиками данного пути является высокая чувствительность к карбоксиатрактилату и чувствительность к GDP и UDP Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования может играть важную роль в регуляции скорости образования активных форм кислорода, так как для животных митохондрий было показано, что при снижении ДцН нелинейно понижалась и скорость образования АФК

Ещё одним путем, позволяющим быстро окислять избыток восстановительных эквивалентов и снижать генерацию свободных форм кислорода является, по-видимому, ГАМК-шунт Нами показано, что в тканях с пониженной функциональной активностью ]МАВ(Р)Н-дегидрогеназ второго типа (например, в эндосперме клещевины) сопряжение реакций цикла трикарбоновых кислот с процессами переаминирования и ГАМК-шунтом в является не только механизмом, обеспечивающим превращение больших

количеств сукцината, продуцируемого глиоксилатным циклом, но при этом достигается также перераспределение НАДН из митохондрий в цитоплазму, где его реокисление не связано с эффектом дыхательного контроля, а также обеспечивается поддержание рН-гомеостаза и происходит синтез аминокислот.

Общая схема экспрессионной регуляции приведена на рис. 9. Такие факторы как условия освещённости, температурный режим, количество АФК, производимых дыхательной цепью, присутствие в среде ингибиторов комплекса I ЭТЦ позволяют осуществлять тонкую регуляцию дыхательного метаболизма растений, позволяя эффективно приспосабливаться к меняющимся условиям окружающей среды.

отосиктез

\iAD(P)H \

NDHex Комплекс I

мРНК

660 нм

Активация экспрессии

Репрессия экспрессии Синтез функционально активных ферментов

Мессен\джеры

АТР РБМ

4°С

Рис. 9. Гипотетическая схема регуляции экспрессии путей свободного окисления.

ААА - ATP/ADP-антипортер, AltOx — альтернативная оксидаза, NDHex — внешняя ротенон-нечувствительная ЫАО(Р)Н-дегидрогенза, NT - нормальная температура, PUMP -растительный разобщающий белок, Q - убихинон, РВМ - рецепторы вязкости мембран, цит с - цитохром с, ЦТК - цикл трикарбоновых кислот.

Таким образом, существование различных систем, обеспечивающих не сопряженное с запасанием энергии свободное окисление субстратов позволяет митохондриям эффективно регулировать энергетический заряд клетки и преодолевать ситуацию "переполнения" дыхательной цепи, особенно в условиях интенсивного фотосинтеза Эти механизмы защищают и сами митохондрии, снижая уровень кислорода (и вероятность образования активных форм кислорода) в непосредственной близости от митохондриальной ДНК, находящейся в митохондриальном матриксе, а также принимают участие в обеспечении нормального протекания многих физиологических процессов растительных организмов, что подтверждается их широкой распространенностью в растительном царстве Результаты проведенной нами работы позволяют судить о том, что физиологическая роль путей свободного окисления и механизмы их взаимодействия являются гораздо более сложными, чем представлялось ранее

ВЫВОДЫ

1 Активность ротененон-нечувствительных ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ обнаружена во всех изученных видах растений Максимальная емкость внешнего окисления NAD(P)H обнаруживается в термогенных тканях Arum orientale

2 Пониженная емкость окисления NADH митохондриями эндосперма клещевины коррелирует с высоким уровнем активности ПАЯГ-ДГ, позволяя говорить о том, что функционирование ГАМК-шунта позволяет эффективно окислять избыток NADH за счет функционирования цитоплазматических путей, что подтверждается высокой активностью ПАЯГ-ДГ в цитоплазме

3 Пониженная активность внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)H-дегидрогеназы в тканях картофеля компенсируется повышенным содержанием в них белков, разобщающих дыхание и окислительное фосфорилирование Установлено, что разобщение индуцируется жирными кислотами в концентрации 20-60 цМ, ресопрягающий эффект оказывается пуриновыми нуклеотидами и карбоксиатрактилатом

4 Отсутствие эффекта GDP после добавления карбоксиатрактилата и проявление ресопрягающего действия карбоксиатрактилалта в присутствии пуриновых нуклеотидов показывает, что основным механизмом разобщения является функционирование ATP/ADP-антипортера

5 Индуцированное жирными кислотами разобщение через ATP/ADP-антипортер увеличивается при инкубации клубней картофеля при пониженных температурах, причем это может быть в первую очередь связано с накоплением свободных жирных кислот

6 В тканях томата впервые идентифицирован фрагмент гена ndal Показана его гомология с генами ndal картофеля и арабидопсиса На основе

кластерного анализа построено филогенетическое дерево внутренних ротенон-нечувствительных NAD(P)H-flenwporeHa3 Показано, что наиболее близкородственными являются гены S tuberosum и S lycoperstcum

1 С помощью полимеразной цепной реакции впервые клонирован фрагмент гена ndbl томата с длиной 574 п о

8 Использование ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ анализа показало, что в различных органах томата содержание мРНК для генов NADH-дегидрогеназ второго типа коррелирует с активностью данных ферментов, и максимально в тканях стеблей томата

9 Установлено, что световой режим оказывает существенное влияние на активность альтернативных НАО(Р)Н-дегидрогеназ Так, при переносе растений томата из темноты на свет активность возрастала в 1,99 раза Увеличение активности коррелирует с синтезом новой мРНК, и это указывает на ведущую роль изменения уровня экспрессии гена в этом процессе

10 Свет с длиной волны 660 нм вызывает увеличение количества продукта транскрипции гена ndbl томата в 1,6 раза Показано, что дальний красный свет репрессирует транскирипцию данного гена При этом синтез соответствующей мРНК de novo коррелирует с изменением уровня активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы Одним из возможных механизмов световой регуляции экспрессии гена ndbl может являться функционирование фитохромной системы

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Регуляция биоэнергетики клетки пуриновыми нуклеотидами / О Ю Фоменко [и др ] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов - Воронеж, 2004 - стр 151-159

2 Фоменко О Ю Влияние красного и дальнего красного света на активность ротенон-нечувствительных NADH-дегидрогеназ в растительных митохондриях / О Ю Фоменко, М В Животягина, В Н Попов // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» - Вологда, 2005 -стр 173

3 Фоменко О Ю Идентификация генов ротенон-нечувствительных NADH-дегидрогеназ в митохондриях клубней картофеля (Solanum tuberosum L ) / О Ю Фоменко, М В Животягина, Е А Воронцова, В Н Попов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов - 2005 -с 184-190

4 Влияние пуриновых нуклеотидов на разобщающий эффект активных форм кислорода в митохондриях / О Ю Фоменко [и др ] //Вестник ВГУ, сер Химия Биология Фармация -2006 -№1 -стр 173-176

5 Фоменко О Ю Обнаружение внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы в митохондриях Lycopersicon esculentum / О Ю Фоменко, В H Попов, Е А Воронцова, А В Свиридов // Материалы 1(1Х) Международная конференция молодых ботаников - Санкт-Петербург, 2006,-стр 209-210

6 Фоменко О Ю Обнаружение внутренней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы в митохондриях листьев томата (L esculentum L ) / О Ю Фоменко, Е А Воронцова, M H Тутукина, В H Попов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов -Воронеж, 2006 - стр 221-226

7 Фоменко О Ю Регуляция альтернативных дыхательных путей растений активными формами кислорода / О Ю Фоменко, Е А Воронцова, А В Свиридов, MA Бондаренко // 10-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» Тез докл -Пущино, 2006 - стр 98

8 Роль процессов переаминирования в мобилизации дыхательных субстратов в прорастающих семенах клещевины / О Ю Фоменко [и др ] // Прикладная биохимия и микробиология - 2007 - т 43, № 3 - стр 376-381

9 Фоменко О Ю Динамика экспрессии гена ndbl зеленых листьев томата в течение светового дня / О Ю Фоменко, А С Шацких, В H Попов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов Воронеж, 2007 - стр 217-222

10 Фоменко О Ю Регуляция активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата красным светом / О Ю Фоменко, Е А Воронцова, В H Попов // VI съезд общества физиологов растений России Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» - Сыктывкар, 2007 -материалы докладов, часть 1 -стр 155

11 Фоменко О Ю Световая регуляция экспрессии внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата / О Ю Фоменко, H А Карпеченко, А С Шацких, В H Попов // VI съезд общества физиологов растений России Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» - Сыктывкар, 2007 -материалы докладов, часть 1 - стр 222

12 Фоменко О Ю Экспрессия гена ndbl томата регулируется фитохромной системой / О Ю Фоменко, В H Попов // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» Тез докл - Пущино, 2007 - стр 117

Статьи № 4 и 8 опубликованы в журналах, входящих в список ВАК

Подписано в печать 06 11 07 Формат 60 *84 '/16 Уел печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ 2313

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета 394000, Воронеж, ул Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фоменко, Олег Юрьевич

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Механизмы снижения внутриклеточной концентрации 14 кислорода

1.2. Феномен свободного окисления

1.3. Разобщённое дыхание как способ свободного окисления

1.3.1. Термогенин бурого жира млекопитающих

1.3.2. Растительный разобщающий митохондриальный белок

1.3.3. Разобщённое дыхание и ATP/ADP-антипортер

1.4. Молекулярные механизмы несопряжённого дыхания

1.4.1. NAD(P)H:xhhoh оксидоредуктазы типа II

1.4.1.1. Распространённость ротенон-нечувствительных 30 N AD(P)H-дегидроген аз

1.4.1.2. Классификация ротенон-нечувствительных 32 ЫАО(Р)Н-дегидрогеназ

1.4.1.3. Первичная структура ротенон-нечувствительных 34 КАЭ(Р)Н-дегидрогеназ

1.4.1.4. Взаимодействие хинонов с NAD(P)H- 38 дегидрогеназами типа II

1.4.1.5. Экспрессионная регуляция ротенон- 39 нечувствительных КАО(Р)Н-дегидрогеназ

1.4.1.6. Физиологическая роль МАО(Р)Н-дегидрогеназ типа II

1.4.1.7. Терапевтические аспекты ротенон- 42 нечувствительных ЫАБ(Р)Н-дегидрогеназ

1.4.2. Альтернативная оксидаза

1.4.2.1. Строение альтернативной оксидазы

1.4.2.2. Регуляция активности альтернативной оксидазы

1.4.2.3. Функции альтернативного пути

1.4.2.4. Роль Альтернативной оксидазы в патогенезе 53 2. Экспериментальная часть

2.1. Цели и задачи

2.2. Объекты и методы исследования

2.2.1. Объекты исследования

2.2.2. Постановка эксперимента по созданию светового 60 режима

2.2.3. Выделение растительных митохондрий

2.2.4. Определение количества белка

2.2.5. Определение активности ферментов

2.2.6. Очистка ПАЯК-дегидрогеназы

2.2.7. Выделение суммарной клеточной популяции РНК

2.2.8. Обратная транскрипция

2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.10. Количественный ПЦР-анализ

2.2.11. Определение уровня экспрессии генов

2.2.12. Секвенирование ПЦР-продукта

2.2.13. Компьютерные методы анализа 68 2.2.14 Определение мембранного потенциала растительных митохондрий

2.2.15. Статистическая обработка данных

2.3. Результаты и их обсуждение

2.3.1. Распространённость внешних ротенон- 70 нечувствительных NADH-дегидрогеназ

2.3.2. Особенности окисления NAD-зависимых субстратов в 72 эндосперме клещевины

2.3.3. Идентификация и клонирование гена внешней ротеноннечувствительных NADH-дегидрогеназы томата

2.3.4. Идентификация и клонирование гена внутренней 83 ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата

2.3.5. Тканевая локализация внешней ротенон- 87 нечувствительных NADH-дегидрогеназы томата

2.3.6. Органоспецифическая экспрессия гена внешней 90 ротенон-нечувствительных NADH-дегидрогеназы томата

2.3.7. Влияние света на активность внешней ротенон- 93 нечувствительных NADH-дегидрогеназы

2.3.8. Световая регуляция экспрессии генов путей свободного 95 окисления томата

2.3.9. Влияние красного света на активность внешней 105 ротенон-нечувствительных NADH-дегидрогеназы

2.3.10. Регуляция экспрессии внешней ротенон- 109 нечувствительных NADH-дегидрогеназы светом различных длин

2.3.11. Разобщающий эффект лауриновой кислоты 112 Заключение 125 Выводы 130 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений"

Одной из наиболее актуальных проблем современной биохимии растений является взаимодействие и регуляция путей свободного окисления дыхательных субстратов. Электрон-транспортная цепь митохондрий является ключевым местом окисления восстановительных эквивалентов, а также одним из основных источников генерации активных форм кислорода в растительной клетке.

Наиболее распространенным восстановительным эквивалентом, синтезируемым в процессе функционирования центральных клеточных метаболических путей, является NADH, что делает его основным донором электронов в дыхательных цепях. У прокариот NADH продуцируется в цитозоле, преимущественно гликолитическими ферментами (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназой и пируватдегидрогеназой) и тремя ферментами цикла трикарбоновых кислот: изоцитрат-, а-кетоглутарат- и малатдегидрогеназами. У эукариот соответствующие реакции цикла Кребса протекают в митохондриальном матриксе, приводя к образованию митохондриального NADH. Восстановленные динуклеотиды окисляются NADH:y6nxHHOH оксидоредуктазой (комплексом I) электрон-транспортной цепи. Энергия при этом запасается исключительно в виде разности трансмембранного электрохимического потенциала.

Кроме того, NADH, окисляясь в митохондриях, является потенциальным источником NAD+ - главного клеточного акцептора электронов. Так как количество NAD+ мало по сравнению с количеством субстратов, которые необходимо окислить, образовавшийся в результате реакций окисления NADH необходимо быстро реокислять для поддержания постоянного уровня NAD+ и устранения возможного лимитирования процессов окисления недостатком NAD+ [35]. Более того, отношение [NADH]/[NAD+] участвует в регуляции путей клеточного метаболизма, приводящих к синтезу АТР. Потребности клетки в NAD+ ставят приоритет круговорота NADH даже выше синтеза АТР. Благодаря тому, что свободное окисление одной молекулы NADH приводит к меньшему выходу АТР по сравнению с окислением той же молекулы, осуществляемому через комплекс I ЭТЦ, активность несопряженных NADH дегидрогеназ может быть жизненно необходимой в ситуациях, когда отношения [NADH]/[NAD+] и [ATP]/[ADP] являются очень высоким, именно благодаря тому, что они способны окислить больше NADH, произведя при этом меньше АТР, увеличивая таким образом поток субстратов окисления через дыхательную цепь.

Подобная ситуация наиболее характерна для растений, находящихся на интенсивном свету, когда энергетические потребности клетки сполна покрываются за счет фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Обзор литературы показал противоречивость имеющихся данных о регуляции дыхания и свободного окисления светом. Одним из возможных опосредованных механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция несопряжённого и разобщённого дыхания, является фитохромная система. Известно, что фитохромная система участвует в регуляции активности некоторых ферментов дыхания растений. Эффект фитохрома может проявляться через различные вторичные посредники, такие как ионы

Са , G-белки, цАМФ, изменяя состояние клеточных мембран, в том числе и митохондриальной, или воздействуя на генетический аппарат клетки посредством различных сигнальных систем, регулируя таким образом интенсивность экспрессии генов.

Практически все исследованные растения обнаруживают способность к цианид-нечувствительному дыханию. Этот процесс обеспечивается присутствием во внутренней мембране митохондрий оксидазы, способной восстанавливать молекулярный кислород в воду, и не содержащей двуядерный гем-медный центр, присутствующий в других оксидазах [81]. Эта альтернативная оксидаза (АО), которая отличается от цитохромного пути является убихинон:кислород оксидоредуктазой и функционирование ее, видимо, не сопряжено с образованием АТР. Обнаруженная в растительных митохондриях, альтернативная оксидаза присутствует также в митохондриях дрожжей, некоторых грибов, протестах и трипаносомах [162]. К основным функциям альтернативной оксидазы относятся термогенез, предотвращение «переполнения» электрон-транспортной цепи и, что наиболее важно, предотвращение образования свободных радикалов за счёт снижения мембранного потенциала при несопряжённом дыхании.

Неизученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при изменении светового режима, а также о кооперативной деятельности путей свободного окисления. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение распространения и некоторых аспектов экспрессионной регуляции путей свободного окисления дыхательных субстратов в митохондриях высших растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространённость альтернативных МАО(Р)Н-дегидрогеназ митохондрий высших растений.

2. Выявить особенности процессов окисления NADH в семенах клещевины и роль реакций переаминирования в этом процессе.

3. Исследовать разобщающий эффект лауриновой кислоты, опосредованный ADP/ATP-антипортером в митохондриях клубней картофеля.

4. Идентифицировать гены ndal и ndbl томата.

5. Изучить органоспецифическую экспрессию внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы S. lycopersicum.

6. Методом ПЦР в реальном времени изучить световую регуляцию экспрессии гена ndbl томата.

7. Изучить коэкспрессию альтернативной оксидазы с NADH-дегидрогеназами II типа в митохондриях высших растений.

8. Провести ПЦР-РВ анализ уровня экспрессии PUMP митохондрий томата.

9. Провести количественный анализ уровня экспрессии гена ndbl томата в условиях различного светового режима.

Показана широкая распространённость механизмов разобщённого и несопряжённого дыхания у растений, что свидетельствует об их важной роли в подержании нормального функционирования энергетического и конструктивного метаболизмов растительной клетки.

В тканях томата с использованием ОТ-ПЦР анализа впервые идентифицированы гены внешней и внутренней ротенон-нечувствительных КАО(Р)Н-дегидрогеназ.

Разработка эффективной ПЦР-РВ тест-системы позволила установить механизм регуляции экспрессии гена ndbl томата в условиях различного светового режима. Показано, что в течение светового дня количество соответствующей информационной РНК возрастает, снижаясь с наступлением темноты. Активация транскрипции гена ndbl объясняется, на наш взгляд, необходимостью эффективного и быстрого окисления восстановительных эквивалентов для предотвращения ситуации переполнения ЭТЦ на свету.

На основе анализа действия света различного спектрального состава изучен механизм регуляции внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)H-дегидрогеназы активной формой фитохрома А. Фотоактивный фитохром активирует транскрипцию гена ndbl в листьях томата, что приводит к увеличению концентрации соответствующей мРНК в клетке, что четко коррелирует с возрастанием ёмкости внешнего окисления NADH митохондриями листьев растений под действием красного света.

Изучены механизмы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях клубней картофеля. Показано, что активность ротенон-нечувствительных КАО(Р)Н-дегидрогеназ в них низка, а основным механизмом свободного окисления дыхательных субстратов выступает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования, вызываемое свободными жирными кислотами, причём уровень разобщённости митохондрий возрастает при воздействии на растения пониженных температур. С использованием ингибиторного анализа показано, что основным механизмом разобщения является функционирование ATP/ADP-антипортера. Кроме того, установлено, что пониженная активность внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)H-дегидрогеназы в тканях картофеля компенсируется повышенным содержанием в них белков, разобщающих дыхание и окислительное фосфорилирование.

Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции путей свободного окисления дыхательных субстратов в митохондриях высших растений в условиях изменения светового режима и воздействия пониженных температур. Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции экспрессии и активности внешней ротенон-нечувствительной МАО(Р)Н-дегидрогеназы является одним из механизмов, координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений. Полученные данные по экспрессии гена ndbl томата указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в зависимости от источника энергии и степени восстановленности электрон-транспортной цепи митохондрий.

Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма как целостной системы. Полученные данные по экспрессии генов путей свободного окисления при изменении светового режима создают условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности культурных растений, а также устойчивости растений к воздействию неблагоприятных факторов среды и патогенов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 10 и 11 международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006, 2007), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на VI съезде общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), на ежегодных научных сессиях преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (Воронеж, 2005,2007).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 6 статьях и 6 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (170 источников). Иллюстрационный материал включает 33 рисунка и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фоменко, Олег Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Активность ротенон-нечувствительных NADH-дегидрогеназ обнаружена во всех изученных видах растений. Максимальная ёмкость внешнего окисления NADH обнаруживается в термогенных тканях Arum orientale.

2. Пониженная ёмкость окисления NADH митохондриями эндосперма клещевины коррелирует с высоким уровнем активности ПАЯК-ДГ, позволяя говорить о том, что функционирование ГАМК-шунта позволяет эффективно окислять избыток NADH за счёт функционирования цитоплазматических путей, что подтверждается высокой активностью ПАЯК-ДГ в цитоплазме.

3. Пониженная активность внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы в тканях картофеля компенсируется повышенным содержанием в них белков, разобщающих дыхание и окислительное фосфорилирование. Установлено, что разобщение индуцируется жирными кислотами в концентрации 20-60 рМ, ресопрягающий эффект оказывается пуриновыми нуклеотидами и карбоксиатрактилатом.

4. Отсутствие эффекта GDP после добавления карбоксиатрактилата и проявление ресопрягающего действия карбоксиатрактилата в присутствии пуриновых нуклеотидов показывает, что основным механизмом разобщения является функционирование ATP/ADP-антипортера.

5. Индуцированное жирными кислотами разобщение через ATP/ADP-антипортер увеличивается при инкубации клубней картофеля при пониженных температурах, причём это может быть в первую очередь связано с накоплением свободных жирных кислот.

6. В тканях томата впервые идентифицирован фрагмент гена ndal. Показана его гомология с генами ndal картофеля и арабидопсиса. На основе кластерного анализа построено филогенетическое дерево внутренних ротенон-нечувствительных КАО(Р)Н-дегидрогеназ. Показано, что наиболее близкородственными являются гены S. tuberosum и S. lycopersicum.

7. С помощью полимеразной цепной реакции впервые клонирован фрагмент гена ndbl томата с длиной 574 п.о.

8. Использование ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ анализа показало, что в различных органах томата содержание мРНК для генов NADH-дегидрогеназ второго типа коррелирует с активностью данных ферментов, и максимально в тканях стеблей томата.

9. Установлено, что световой режим оказывает существенное влияние на активность альтернативных NADH-дегидрогеназ. Так, при переносе растений томата из темноты на свет активность возрастала в 1,99 раза. Увеличение активности коррелирует с синтезом новой мРНК, и это указывает на ведущую роль изменения уровня экспрессии гена в этом процессе.

Ю.Свет с длиной волны 660 нм вызывает увеличение количества продукта транскрипции гена ndbl томата в 1,6 раза. Показано, что дальний красный свет репрессирует транскрипцию данного гена. При этом синтез соответствующей мРНК de novo коррелирует с изменением уровня активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы. Одним из возможных механизмов световой регуляции экспрессии гена ndbl может являться функционирование фитохромной системы.

заключение

Так как количество NAD+ мало по сравнению с количеством субстратов, которые необходимо окислить растительной клетке в митохондриях, образовавшийся в результате реакций окисления NADH, необходимо быстро реокислять для восстановления уровня NAD+ с целью устранения лимитирования процессов окисления недостатком NAD+. Более того, отношение [NADH]/[NAD+] участвует в регуляции путей клеточного метаболизма, приводящих к синтезу АТР. Потребности клетки в NAD+ ставят приоритет круговорота NADH даже выше синтеза АТР. Для растений, как фотоавтотрофных организмов, чрезвычайно высока вероятность возникновения overflow и являющегося следствием этого угнетения электрон-транспортной цепи митохондрий. Благодаря тому, что окисление одной молекулы NADH при использовании путей свободного окисления приводит к меньшему выходу АТР по сравнению с окислением той же молекулы, осуществляемому через комплекс I ЭТЦ, их активность может быть жизненно необходимой в ситуациях, когда отношение [NADH]/[NAD+] является очень высоким, именно благодаря тому, что они способны окислить больше NADH, произведя при этом меньше АТР.

Наиболее эффективной системой преодоления описанной выше ситуации "переполнения" является функционирование альтернативных ^0(Р)Н-дегидрогеназ. Процесс окисления ими восстановительных эквивалентов не сопровождается генерацией трансмембранного градиента протонов, что позволяет резко увеличить поток дыхательных субстратов через электрон-транспортную цепь. Работа путей несопряжённого дыхания обеспечивает функционирование цикла Кребса на свету. Внутренняя ротенон-нечувствительная NADH-дегидрогеназа позволяет позволяющие обойти лимитирующие участки цикла трикарбоновых кислот, связанные с продукцией NADH, а именно от изоцитрата до сукцинил-КоА. Кроме того, функционирование внешней ротенон-нечувствительной NAD(P)Hдегидрогеназы позволяет с большой скоростью окислять NAD(P)H цитозоля без дополнительного угнетения функционирования цикла Кребса, что достигается отсутствием сопряжённого переноса протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Таким образом, основная функция внешних ротенон-нечувствительных КАБ(Р)Н-дегидрогеназ состоит, по-видимому, в обеспечении нормального функционирования ЭТЦ хлоропластов при протекании фотосинтеза. NAD(P)H, образующийся в процессе фотосинтеза, должен экспортироваться из хлоропластов и реокисляться, что связано с необходимостью поддержания соотношения NAD(P)H/ATP в строме.

Впервые нами была показана световая регуляция экспрессии внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата. Установлено, что в течение светового дня количество транскрипта ndbl возрастает, достигая максимума к 12 часу инкубации растений на свету. При переносе растений в темноту концентрация транскрипта падает. Уже через час количество соответствующей мРНК уменьшается в 4,2 раза. На основе анализа действия света различного спектрального состава нами выдвинута гипотеза о том, что в регуляции экспрессии гена ndbl томата принимает участие фитохромная система. При этом изменения уровня транскрипта коррелировали с динамикой активности внешней ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы томата.

Функционирование альтернативной оксидазы, передающий электроны непосредственно на кислород, позволят существенно снизить время жизни убисемихинона, предотвращая, таким образом, генерацию активных форм кислорода. Это значительным образом снижает риск повреждения митохондриальной ДНК, зажатой между кристами митохондриальной мембраны - главного места генерации АФК в клетке.

В нашей работе показано, что ферменты путей несопряжённого дыхания необычайно широко распространены в растительном царстве. Их экспрессия обнаруживается во всех изученных органах и тканях большого количества видов растений. Это говорит об исключительной роли, принадлежащей им в процессе адаптации организма к меняющимся условиям окружающей среды и к воздействию абиотических стрессоров и паразитов. Однако обнаруживаются некоторые виды растений, в тканях которых функциональная активность этих ферментов чрезвычайно низка. Поэтому в ходе эволюции у них наибольшее развитие получили иные пути, позволяющие снимать явление дыхательного контроля.

Нами было показано, что у растений с пониженной активностью ротенон-нечувствительных NADH дегидрогеназ важную роль может играть разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования за счёт рассеивания трансмембранного потенциала. Митохондриальные разобщающие белки обнаружены у многих растений, грибов и простейших. Их функционирование играет важную роль в процессе созревания плодов, адаптации к пониженным температурам и поддержании баланса ДцН в клетке. Так, нами было показано, что в митохондриях картофеля адаптивная реакция на пониженную температуру заключается в накоплении свободных жирных кислот и снижении мембранного потенциала за счет разобщения жирными кислотами через ATP/ADP-антипортер, причем уникальными характеристиками данного пути является высокая чувствительность к карбоксиатрактилату и чувствительность к GDP и UDP. Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования может играть важную роль в регуляции скорости образования активных форм кислорода, так как для животных митохондрий было показано, что при снижении ДцН нелинейно понижалась и скорость образования АФК.

Ещё одним путём, позволяющим быстро окислять избыток восстановительных эквивалентов и снижать генерацию свободных форм кислорода является, по-видимому, ГАМК-шунт. Нами показано, что в тканях с пониженной функциональной активностью NAD(P)H-flenwporeHa3 второго типа (например, в эндосперме клещевины) сопряжение реакций цикла трикарбоновых кислот с процессами переаминирования и ГАМК-шунтом является не только механизмом, обеспечивающим превращение больших количеств сукцината, продуцируемого глиоксилатным циклом, но при этом достигается также перераспределение НАДН из митохондрий в цитоплазму, где его реокисление не связано с эффектом дыхательного контроля, а также обеспечивается поддержание рН-гомеостаза и происходит синтез аминокислот.

Общая схема экспрессионной регуляции приведена на рис. 33. Такие факторы как условия освещённости, температурный режим, количество АФК, производимых дыхательной цепью, присутствие в среде ингибиторов комплекса I ЭТЦ позволяют осуществлять тонкую регуляцию дыхательного метаболизма растений, позволяя эффективно приспосабливаться к меняющимся условиям окружающей среды.

Таким образом, существование различных систем, обеспечивающих не сопряженное с запасанием энергии свободное окисление субстратов позволяет митохондриям эффективно регулировать энергетический заряд клетки и преодолевать ситуацию "переполнения" дыхательной цепи, особенно в условиях интенсивного фотосинтеза. Эти механизмы защищают и сами митохондрии, снижая уровень кислорода (и вероятность образования активных форм кислорода) в непосредственной близости от митохондриальной ДНК, находящейся в митохондриальном матриксе, а также принимают участие в обеспечении нормального протекания многих физиологических процессов растительных организмов, что подтверждается их широкой распространённостью в растительном царстве. Результаты проведённой нами работы позволяют судить о том, что физиологическая роль путей свободного окисления и механизмы их взаимодействия являются гораздо более сложными, чем представлялось ранее.

Фитохром А активный) А

Мессен1джеры

АТР РВМ

660 нм

Активация экспрессии t

4°С

Репрессия экспрессии

Синтез функционально активных ферментов

Рис. 33. Гипотетическая схема регуляции экспрессии путей свободного окисления. AAA - ATP/ADP-антипортер, AltOx - альтернативная оксидаза, NDHex- внешняя ротенон-нечувствительная ЫАО(Р)Н-дегидрогсназа, NT-нормальная температура, PUMP - растительный разобщающий белок, Q убихинон, РВМ - рецепторы вязкости мембран, цит с - цитохром с, ЦТК -цикл трикарбоновых кислот.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фоменко, Олег Юрьевич, Воронеж

1. Ершова А.Н. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и повышенному содержанию диоксида углерода / А.Н. Ершова. -Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 2007. 264 с.

2. Игамбердиев А.У. Окисление сукцината в глиоксисомах щитка кукурузы / А.У. Игамбердиев, Б.Ф. Иванов, М.И. Родионова // Физиология растений. 1990. - т.37, №.3.- стр. 505-510.

3. Игамбердиев А.У. Роль реакций переаминирования в метаболизме сукцината в эндосперме проростков клещевины / А.У. Игамбердиев, В.Н. Попов // Физиология растений. 1996. - т. 43. №4. - с. 548-553.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. Москва: Высш. шк., 1990. -351с.

5. Скулачев В.П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода /В.П. Скулачев // Молекулярная биология. 1995. - Т. 29, №6. - с. 1199-1209.

6. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации Ог как особая функция дыхательных систем клетки /В.П. Скулачев // Биохимия. -1994.-т. 59, №12.-с. 1910-1912.

7. A critique of the use of inhibitors to estimate partitioning of electrons between mitochondrial respiratoiy pathways in plant / A.H. Millar et al. // Physiologia Plantarum. 1995. - vol. 95. - pp. 523-532.

8. A plant cold-induced uncoupling protein / M. Laloi et al. // Nature. 1997.- vol. 389. pp. 135-136.

9. A single amino acid change in the plant alternative oxidase alters the specificity of organic acid activation /I. Djajanegara et al. // FEBS Letters.- 1999.-vol. 454.-pp. 220-224.

10. Acidianus ambivalens type-II NADH-dehydrogenase: genetic characterization and identification of the flavin moiety as FMN / T.M. Bandeiras et al. //FEBS Lett. 2002. - vol. 531. - pp. 273-277.

11. Akerman K.E.O. Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential / K.E.O. Akerman, M.K.F. Wikstrom // FEBS Lett. 1976. - vol. 68.-pp. 191-197.

12. Alternative oxidase in Durham wheat mitochondria. Activation by pyruvate, hydroxypyruvate and glyoxylate and physiological role / D. Pastore et al. // Plant and Cell Physiology. 2001. - vol. 42. - pp. 1373-1382.

13. Analysis of respiratory chain regulation in roots of soybean seedlings / A.H. Millar et al. // Plant Physiology. 1998. - vol. 117. - pp. 1083-1093.

14. Annonacin, a lipophilic inhibitor of mitochondrial complex I, induces nigral and striatal neurodegeneration in rats: possible relevance for atypical parkinsonism in Guadeloupe / P. Champy et al. // J Neurochem. 2004.-vol. 88,No. l.-pp. 63-69.

15. Arabidopsis genes encoding mitochondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light / A.M. Michalecka et al. // Plant Physiol. 2003. - vol. 133.-pp. 642-652.

16. AtPUMP: an Arabidopsis gene encoding a plant uncoupling mitochondrifa protein / I.G. Maia et al. // FEBS Lett. 1998. - vol. 429. - pp. 403-406.

17. Avila-Adame C. Disruption of the alternative oxidase gene in Magnaporthe grisea and its impact on host infection / C. Avila-Adame, W. Koller // Mol Plant Microbe Interact. 2002. - vol. 15, No. 5. - pp. 493-500.

18. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B.L. Jailkhani // J Biol Chem. -1979.-vol. 254.-pp. 12488-93.

19. Boveris A. The mitochondrial ggeneration and hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen /А. Boveris, B. Chance // Biochem. J. 1973. - vol. 134. - pp. 707-716.

20. Breitkreuz K.E. Subcellular compartmentation of the 4-aminobutyrate shunt in protoplasts from developing soybean cotyledons / K.E. Breitkreuz, B.J. Shelp//Plant Physiol. 1995.-vol. 108, No. l.-pp. 99-103.

21. Burge C. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA / C. Burge, S. Karlin // J. Mol. Biol. 1997. - vol. 268. - pp. 78-94.

22. Carneiro P. The main external NAD(P)H dehydrogenase of Neurospora crassa mitochondria /Р. Carneiro, M. Duarte, A. Videira // Biophys Acta. -2004.-vol. 1608.-pp. 45-52.

23. Characteristics of the aerobic respiratory chains of the microaerophiles Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori / M.A. Smith et al. // Arch. Microbiol. 2000. - vol. 174, No. 1-2. - pp. 1-10.

24. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in arabidopsis: intraorganelle location and expression / D. Elhafez et al. // Plant Cell Physiol. 2006. - vol. 47, No. 1. - pp. 43-54.

25. Characterization of Neurospora crassa mitochondria prepared with a grind-mill / H. Weiss et al. // Eur J Biochem. 1970. - vol. 14. - pp. 75-82.

26. Chaudhuri M. Trypanosome alternative oxidase is regulated post-transcriptionally at the level of RNA stability / M. Chaudhuri, R. Sharan, G.C. Hill // J Eukaryot Microbiol. 2002. - vol. 49, No. 4. - pp. 263-269.

27. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /Р. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - vol. 162. - pp. 156-159.

28. Cloning of an additional cDNA for the alternative oxidase in tobacco / J. Whelan et al. //Plant Physiology. 1995. - vol. 107. - pp.1469-1470.

29. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties andweight matrix choice / D. Higgins et al. // Nucleic Acids Res. 1994. - vol. 22. - pp. 4673-4680.

30. Cold stress decreases the capacity for respiratory NADH oxidation in potato leaves / A.S. Svensson et al. // FEBS Lett. 2002. - vol. 517. - pp. 79-82.

31. Cottingham I.M. Partial purification and properties of the external NADH dehydrogenase from cuckoo-pint {Arum maculatum) mitochondria /I.M. Cottingham, A.L. Moore //Biochem J. -1984. vol. 224. - pp. 171-179.

32. Cyanide-insensitive respiration in thermogenic flowers of Victoria and Nelumbo / H. Skubatz et al. // Journal of Experimental Botany. 1990. -vol. 41.-pp. 1335-1339.

33. Cytochrome and alternative respiratory pathways compete for electrons in the presence of pyruvate in soybean mitochondria /M.H.N. Hoefnagel et al. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1995. - vol. 318. - pp. 394400.

34. Dawson A.G. Oxidation of cytosolic NADH formed during aerobic metabolism in mammalian cells / A.G. Dawson // Trends Biochem Sci. -1979.-vol. 4.-pp. 171-176.

35. Differential expression of the multigene family encoding the Soybean mitochondrial alternative oxidase / P.M. Finnegan et al,. // Plant Physiology. 1997. - vol. 114. - pp. 455-466.

36. Effect of carboxyatractylate on transmembrane electrical potencial of plant mitochondria in different metabolic states /F. Macri et al. // Biochem Md Biol Int. 1994. - vol. 34. - pp. 217-224.

37. Electron partitioning between the cytochrome and alternative pathways in plant mitochondria / M. Ribas-Carbo et al. // Plant Physiology. 1995. -vol. 109. - pp. 829-837.

38. Enhanced expression and activation of the alternative oxidase during infection of Arabidopsis with Pseudomonas syringae pv tomato / B.H. Simons et al. // Plant Physiology. 1999. - vol. 120. - pp. 529-538.

39. Fait A. GAB A shunt deficiencies and accumulation of reactive oxygen intermediates: insight from Arabidopsis mutants / A. Fait, A. Yellin, H. Fromm //FEBS Lett. -2005. vol. 579, No. 2. - pp. 415-420.

40. Fang J. Alternative oxidase present in procyclic Trypanosoma bricei may act to lower the mitochondrial production of superoxide / J. Fang, D.S. Beattie // Arch Biochem Biophys. 2003. - vol. 414, No. 2. - pp. 294-302.

41. Fang J. External alternative NADH dehydrogenase of Saccharomyces cerevisie: a potential source of superoxide / J. Fang, D.S. Beattie // Free Radic Biol Med. 2003. - vol. 34. - pp. 478-488.

42. Fatty acids as acute regulation of the proton conductance of hamster brown fat mitochondria / R.M. Locke et al. // Eur J Biochem. -1982. vol. 129. -pp. 373-380.

43. Fatty acids cycling mechanism and mitochondrial uncoupling proteins / P. Jezek et al. // Biochm et Biophys Acta. 1998. - vol. 1365. - pp. 319-327.

44. Felsenstein J. PHYLIP Phylogeny Inference Package (Version 3.2) / J. Felsenstein // Cladistics. - 1989. - vol. 5. - pp. 164-166.

45. Finel M. Does NADH play a central role in energy metabolism in Helicobacter pyloril / M. Finel // Trends Biochem Sci. 1998. - vol. 23. -pp. 412-413.

46. First evidence and characterization of an uncoupling protein in fungi kingdom: CpUCP of Candida parapsilosis /W. Jarmuszkiewicz et al. // FEBS Letters. 2000. - vol. 467. - pp. 145-149.

47. Fisher N. A motif for quinine binding sites in respiratory and photosynthetic systems / N. Fisher, P.R. Rich // J Mol Biol. 2000. - vol. 296. - pp. 11531162.

48. Free fatty acids regulate the uncoupling and altermative oxidase activities in plant mitochondria / F.E. Sluse et al. // FEBS Lett. 1998. - vol. 433. - pp. 237- 240.

49. Functional reconstitution of Arabidopsis thaliana plant uncoupling mitochondrial protein (AtPUMPl) expressed in Escherichia coli /J. Borecky et al II FEBS Letters. 2001. - vol. 505. - pp. 240-244.

50. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search /S.F. Altschul et al. // Nucleic Acids Res. 1997. - vol. 25. - pp. 3389-3402.

51. Gomes C.M. A new type-II NADH dehydrogenase from the archaeon Acidianus ambivalens: characterization and in vitro reconstitution of respiratory chain / C.M. Gomes, T.M. Bandeiras, M. Teixeira // J Bioenerg Biomembr. 2001. - vol. 33. - pp. 1-8.

52. Growth inhibition of bloodstream forms of Trypanosoma brucei by the iron vhelator deferoxamine / T. Breidbach et al. // Int J Parasitol. 2002. - vol. 32,No. 4.-pp. 473-479.

53. Heat generation and dissipation in plants: can the alternative oxidative phosphorylation pathway serve a thermoregulatory role in plant tissues other than specialized organs? /R.W. Breidenbach et al. // Plant Physiology. -1997.-vol. 114.-pp. 1137-1140.

54. High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama et al. // Methods Enzymol. 1987. - vol. 154. - pp. 3-28.

55. Hollenberg C.P. The glutamate dehydrogenases of yeast: extra-mitochondrial enzymes / C.P. Hollenberg, W.F. Riks, P. Borst // Biochim Biophys Acta. 1970. - vol. 201. - pp. 13-9.

56. Homologues of yeast and bacterial rotenone-insensitive NADH dehydrogenases in higher eukaryotes: two enzymes are present in potato mitochondria /A.G. Rasmusson et al. // Plant J. 1999. - vol. 20. - pp. 7987.

57. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress / N. Nicot et al. // Journal of Experimental Botany. 2005. - vol. 56, No. 421. - pp. 2907-2914.

58. Huh W.K. Characterization of the gene family encoding alternative oxidase from Candida albicans / W.K. Huh, S.O. Kang // Biochem J. 2001. - vol. 356, No. 2.-pp. 595-604.

59. Hydrogen peroxide generation by higher plant mitochondria oxidizing complex I or complex II substrates /Е. Braidot et al. // FEBS Lett. -1999. -vol. 451.-pp. 347-350.

60. Identification of a mitochondrial external NADPH dehydrogenase by overexpression in transgenic Nicotiana sylvestris / A.M. Michalecka et al. // Plant J. 2004. - vol. 37. - pp. 415-425.

61. Identification of AtNDIl, an internal non-phosphorylating NAD(P)H dehydrogenase in arabidopsis mitochondria / C.S. Moore et al. // Plant Physiology. 2003. - vol. 133. - pp. 1968-1978.

62. In vivo complementation of complex I by the yeast Ndil enzyme. Possible application for treatment of Parkinson disease / B.B. Seo et al. // J Biol Chem.-2006.-vol. 281, No. 20.-pp. 14250-14255.

63. Jezek P. Evidence for Anion-translocating Plant Uncoupling Mitachondrial Protein in potato mitochondria /Р. Jezek, A.D.T. Costa, A.E. Vercesi // J Biol Chem. 1996. - vol. 271. - pp. 32743-32748.

64. Kita K. Parasite mitochondria as drug target: diversity and dynamic changes during the life cycle / K. Kita, C. Nihei, E. Tomitsuka // Curr Med Chem. -2003. vol. 10, No. 23. - pp. 2535-2548.

65. Kowaltowski A. J. Activation of the potato plant uncoupling mitochondrial protein inhibits reactive oxygen species gtntration by the respiratory chain / A.J. Kowaltowski, A.D.T. Costa, A.E. Vercesi // FEBS Lett. 1998. - vol. 425.-pp. 213-216.

66. Light regulation of the arabidopsis respiratory chain. Multiple discrete photoreceptors responses contribute to induction of type II NAD(P)H dehydrogenases genes / M.A. Escobar et al. // Plant Physiol. 2004. - vol. 136.-pp. 2710-2721.

67. Livak K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2"AACt method / K.J. Livak, T.D. Schmittgen // Methods. 2001. - vol. 25. - pp. 402-408.

68. Locke R.M. A re-evolution of the role of fatty acids in the physiological regulation of the proton conductance of hamster brown adipose tissue mitochondria / R.M. Locke, D.G. Nicholls // FEBS Lett. 1981. - vol. 135. -pp. 249-252.

69. Marsh P.B. Respiration and fermentation in the carrot, Daucus carota; I Respiration / P.B. Marsh, D.R. Goddard // American Journal of Botany. -1939. vol. 26. - pp. 724-728.

70. Mcintosh L. Molecular biology of the alternative oxidase / L. Mcintosh // Plant Physiology. 1994. - vol. 105, No. 3. - pp.781-786.

71. Meeuse B.J.D. Thermogenic respiration in aroids / B.J.D. Meeuse // Annual Reviews of Plant Physiology. 1975. - vol. 26. - pp. 117-126.

72. Melo A.M.P. New insights into type-II NAD(P)H:quinine oxidoreductases / A.M.P. Melo, T.M. Bandeiras, M. Teixeira // Microb and Mol Biol Rev. -2004. vol. 68, No. 4. - pp. 603-616.

73. Melo A.M.P. Primary structure and characterization of 64 kDa NADH dehydrogenase from the inner membrane of Neurospora crassa mitochondria / A.M.P. Melo, M. Duarte, A. Videira // Biochim Biophys Acta. 1999. - vol. 1412. - pp. 282-287.

74. Menz R.I. Identification and characterization of an inducible NAD(P)H dehydrogenase from red beetroot mitochondria / R.I. Menz, D.A. Day // Plant Physiol. 1996. - vol. 112. - pp. 607-613.

75. Menz R.I. Purification and characterization of a 43-kDa rotenone-insensitive NADH dehydrogenase from plant mitochondria / R.I. Menz, D.A. Day // J Biol Chemb. 1996. - vol. 271. - pp. 23117-23120.

76. Millar A.N. Regulation of Alternative Oxidase Activity by Pyruvate in Soybean Mitochondria / A.N. Millar, FJ. Bergersen, D.A. Day // Plant Physiol. Biochem. 1994. - vol. 32. - pp. 847-852.

77. Millhouse J. Control of the citric acid cycle in mitochondria from germinating castor bean endosperm / J. Millhouse, J.T. Wiskich // Plant Science. 1986. - vol. 46, No. 1. - pp. 15-19.

78. Mitochondrial disease: a historical, biochemical, and London perspective / J.M. Land et al. //Neurochem Res. 2004. - vol. 29. - pp. 483-491.

79. Mitochondrial succinic-semialdehyde dehydrogenase of the gamma-aminobutyrate shunt is required to restrict levels of reactive oxygen intermediates in plants / N. Bouche et al. // Proc Natl Acad Sci USA. -2003. vol. 100, No. 11. - pp. 6843-6848.

80. Molecular aspects of structure-function relationships in mitochondrial adenine nucleotide carrier / P.V. Vignais et al. // Structure and properties of cell membranes. 1985. - vol. 11. - pp. 139-179.

81. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease / D.J. Moore et al. // Annu Rev Neurosci. 2005. - vol. 28. - pp. 57-87.

82. Moller I.M. A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases / I.M. Moller // Trends Plant Sci. 2002. - vol. 7. - pp. 235-237.

83. Moller I.M. Binding and screening by cations and the effect on exogenous NAD(P)H oxidation in Neurospora crassa mitochondria / I.M. Moller, J.-P. Schwitzguebel, J.M. Palmer // Eur J Biochem. 1982. - vol. 123. - pp. 8188.

84. Moller I.M. NAD(P)H-ubiquinone oxidoreductases in plant mitochondria / I.M. Moller, A.G. Rasmusson, K.M. Fredlund // J Bioenerg Biomembr. -1993.-vol. 25. pp. 377-384.

85. Moller I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species / I.M. Moller // Annual Reviews of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001. -vol. 52.-pp. 561-591.

86. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. -vol.155, - pp. 335-350.

87. NADH dehydrogenases: from basic science to biomedicine / T. Yagi et al. //J Bioenerg Biomembr. 2001. - vol. 33, No. 3. - pp. 233-242.

88. New insight into the regulation of plant succinate dehydrogenase / C. Affourtit et al. //J. Biol. Chem.- 2001. vol. 276. - pp 32567-32574.

89. Nicholls D. G. Thermogenic techanisms in brown fat / D.G. Nicholls, R.M. Locke // Physiol Revues. 1984. - vol. 64. - pp. 1-64.

90. Nihei C. Trypanosome alternative oxidase as a target of chemotherapy / C. Nihei, Y. Fukai, K. Kita // Biochem Biophys Acta. 2002. - vol. 1587, No. 2-3. - pp. 234-239.

91. Organic acid activation of the alternative oxidase of plant minochondria / A.H. Millar et al. //FEBS Letters. 1993. - vol. 329. - pp. 259-262.

92. Palmieri F. Mitochondrial carrier proteins / F. Palmieri // FEBS Lett. 1995. - vol. 346. - pp. 48-54.

93. Popov V.N. Possible role of free oxidation processes in the regulation of reactive oxygen species production in plant mitochondria / V.N. Popov // Biochem. Soc. Trans. 2003.- vol. 31. - pp. 1316-1317.

94. Presymptomatic visualization of plant-virus interactions by thermography /L. Chaerle et al. //Nature Biotechnology. 1999. - vol. 17. - pp. 813-816.

95. Primary structure and import pathway of the rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae /S. De Vries et al. // Eur J Biochem. 1992. - vol. 203. - pp. 587-592.

96. Promper C. The role of the proton-pumping and alternative respiratory chain NADH:ubiquinone oxidoreductases in overflow catabolism of Aspergillus niger / C. Promper, R. Schneider, H. Weiss // Eur J Biochem, -1993. vol. 216.- pp. 223-30.

97. Protein measurement with the folin pihend reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - vol. 193. - pp. 265-275.

98. PUMPingplants /А.Е. Vercesi et al. //Nature. 1995. - vol. 375. - pp. 24.

99. Purvis A.C. Does the alternative pathway ameliorate chilling injury in sensitive plant tissues? / A.C. Purvis, R.L. Shewfelt // Physiologia Plantarum. 1993. - vol. 88. - pp. 712-718.

100. Purvis A.C. Reduction of superoxide production by mitochondria oxidizing NADH in the presence of organic acids / A.C. Purvis // Journal of Plant Physiology. 2001. - vol. 158. - pp. 159-165.

101. Regulation of the alternative oxidase activity in six wild monocotyledonous species; an in vivo study at the whole root level / F.F. Millenaar et al. // Plant Physiology. 2001. - vol. 126. - pp. 376-387.

102. Regulation of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria / D.M. Rhoads et al. // The Journal of Biological Chemistry. -1998. vol. 273. - pp. 30750-30756.

103. Respiratory chains from aerobic thermophilic / M.M. Pereira et al. // J Bioenerg Biomembr. 2004. - vol. 36. - pp. 93-105.

104. Roberts Т.Н. Direct evidence for the presence of two external NAD(P)H dehydrogenases coupled to the electron transport chain in plant mitochondria / T.H Roberts, K.M. Fredlund, I.M. Moller // FEBS Lett. -1995.-vol. 373.-pp. 307-309.

105. Role of alternative oxidase in pathogenesis of Cryptococcus neoformans / S. Akhter // Infect Immun. 2003. - vol. 71, No. 10. - pp. 5794-5802.

106. Rottenberg H. Fatty acid uncoupling of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondrial / H. Rottenberg, K. Hachimoto // Biochem. 1986. - vol. 25.-pp. 1747-1755.

107. Rozen S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, H. Skaletsky // Methods Mol. Biol. 2000. - vol. 132. - pp. 365-386.

108. Salicylic acid enhances the activity of the alternative pathway of respiration in tobacco leaves and induces thermogenicity / D. Van der Straeten et al. // Plant. 1995. - vol. 196. - pp. 412-419.

109. Satya Narayan V. The 4-aminobutyrate shunt in Solanum tuberosum / V. Satya Narayan, P.M. Nair // Phytochemistry. 1986. - vol. 25, No. 5. - pp. 997-1001.

110. Satya Narayan V., Nair PM (1990) Metabolism, enzymology and possible roles of 4-aminobutyrate in higher plants / V. Satya Narayan, P.M. Nair // Phytochemistry. 1990. - vol. 29, No. 2. - pp. 367-375.

111. Saviani E. E. Fatty acid-mediated uncoupling of potato tuber mitochondria / E.E. Saviani, I.S. Martins // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. - vol. 44. - pp. 833-839.

112. Scandalios J.G. Oxygen stress and superoxide dismutase / J.G. Scandalios // Plant Physiology. 1993. - vol. 101. - pp. 7-12.

113. Schonfeld P. Does the role of ADP/ATP- antiporter in the uncoupling effect of fatty acids depend on the mitochondria type? / P. Schonfeld // FEBS Lett.- 1992.- vol. 303.-pp. 190-192.

114. Skubatz H. Oscillatory, heat-production in male cones of cycads / H. Skubatz, W. Tang, B.J.D. Meeuse // Journal of Experimental Botany. -1 993.- vol. 44. pp. 489-492.

115. Skulachev V. P. Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling / V.P. Skulachev // J. Bioenerg. Biomembr. 1999. - vol. 31. -pp. 431-445.

116. Skulachev V. P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation / V.P. Skulachev // FEBS Lett. -1991.-vol. 294.-pp. 158-162.

117. Skulachev V. P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics / V.P. Skulachev // Biochim et Biophys Asta. 1998. - vol. 1363.-pp. 100-124.

118. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants /

119. V.P. Skulachev // Quarterly Reviews of Biophysics. 1996. - vol. 29. - pp. 169-202.

120. Specificity of the organic acid activation of alternative oxidase in plant mitochondria / A.H. Millar et al. // Plant Physiiology. 1996. - vol. 111.-pp. 613-618.

121. Stitt M. Pyrophosphate as an energy donor in the cytosol of plant cells: an enigmatic alternative to ATP / M. Stitt // Botanica Acta. 1998. - vol. 111.-pp. 167-175.

122. Stress-induced co-expression of alternative respiratory chain components in Arabidopsis thaliana / R. Clifton et al. // Plant Mol Biol. 2005. - vol. 58. -pp. 193-212.

123. Stryer L. Biochemistry / L. Stryer. N.Y.: Freeman. - 1995. - 1064 p.

124. Svensson A.S. Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves / A.S. Svensson, A.G. Rasmusson // Plant J.-2001.-vol. 28.-pp. 73-82.

125. The acute regulation of mitochondrial proton conductance in cell and mitochondria Prom the brown fat of cold-adapted and warm-adapted guinea-pigs /R.M. Locke et al. // Eur J Biochem. 1983. - vol. 129. - pp. 381-387.

126. The alternative oxidase in roots of Poa annua after transfer from high-light to low-light conditions /*F.F. Millenaar et al. // Plant Journal. 2000. - vol. 23. - pp. 623-632.

127. The ATP/ADP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria /A.Yu. Andreyev et al. // Eur. J. Biochem. 1989. - vol. 182. - pp. 585-592.

128. The cyanide-resistant oxidase: To inhibit or not to inhibit, that is the question / D.A. Day et al. // Plant Physiology. 1996. - vol. 110. - pp. 1-2.

129. The external calcium-dependent NADH dehydrogenase from Neurospora crassa mitochondria / A.N.P. Melo et al. // The Journal of Biological Chemistry. 2001. - vol. 276. - pp. 3947-3951.

130. The internal alternative NADH dehydrogenase of Neurospora crassa /М. Duarte et al. // Biochem J. 2003. - vol. 71. - pp. 1005-1011.

131. The internal rotenone-insensitive NADPH dehydrogenase contributes to malate oxidation by potato tuber and pea leaf mitochondria /S.C. Agius et al. //Physiologia Plantarum. 1998. - vol. 104. - pp 329-336.

132. The respiratory chain of the thermophilic archaeon Sulfolobus metallicus: studies on the type-II NADH dehydrogenase / T.M. Bandeiras et al. //Biochim Biophys Acta. 2003. - vol. 1557. - pp. 13-19.

133. The role of alternative oxidase in modulating carbon use efficiency and growth during macronutrient stress in tobacco cells / S.M. Sieger et al. // J Exp Bot. 2005. - vol. 56. - pp. 1499-1515.

134. The role of mild uncoupling and non-coupled respiration in the regulation of hydrogen peroxide generation by pland mitochondria /V. Casolo et al. // FEBS Lett. 2000. - vol. 274. - pp. 53-57.

135. The role of the alternative oxidase in stabilizing the in vivo reduction state of ubiquinone pool; and the activation state of the alternative oxidase / F.F. Millenaar et al. // Plant Physiology. 1998. - vol. 118. - pp. 599-607.

136. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 genes encode separate mitochondrial NADH dehydrogenases catalyzing the oxidation of cytosolic NADH / M.A.H. Luttik et al. // The Journal of Biological Chemistry. -1998. vol. 273. - pp. 24529-24534.

137. Umbach A.L. Covalent and noncovalent dimmers of the cyanide-resistant alternative oxidase protein in higher plant mitochondria and their relationship to enzyme activity / A.L. Umbach, J.N. d Siedow // Plant Physiology. 1993. - vol. 103. - pp. 845-854.

138. Umbach A.L. Regulation of alternative oxidase kinetics by pyruvate and intermolecular disulfide bond redox status in soybean seedling mitochondria / A.L. Umbach, J.T. Wiskich, J.N. Siedow // FEBS Letters. 1994. - vol. 348.-pp. 181-184.

139. Van Herk A.W.H. Die chemischen Vorgange im Sauromatum-Kolben / A.W.H. Van Herk // Receuil des Botaniqiues Neerlandais. 1937. - vol. 34. -pp. 69-156.

140. Vanlerberghe G.C. ALTERNATIVE OXIDASE: from gene to function / G.C. Vanlerberghe, L. Mcintosh // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. -1997.-vol. 48.-pp. 703-734.

141. Vanlerberghe G.C. Mitochondrial electron transport regulation of nuclear gene expression. Studies with the alternative oxidase gene of tobacco / G.C. Vanlerberghe, L. Mcintosh // Plant Physiology. 1994. - vol. 105. - pp. 867874.

142. Vanlerberghe G.C. Molecular localization of a redox-modulated process regulating plant mitochondrial electron transport / G.C. Vanlerberghe, L. Mcintosh, J.Y.H. Yip//The Plant Cell. 1998. - vol. 10. - pp. 1551-1560.

143. Wagner A.M. Alternative oxidase: its possible role / A.M. Wagner, A. Moore // Bioscience Reports. 1997. - vol. 17. - pp. 319-333.

144. Wagner A.M. Measurements of in vivo ubiquinone reduction levels in plant cells / A.M. Wagner, M.J. Wagner // Plant Physiology. 1995. - vol. 108. -pp. 277-283.

145. Wagner A.M. The alternative respiration pathway in plants: Role and regulation / A.M. Wagner, K. Krab // Physiologia Plantarum. 1995. - vol. 95.-pp. 318-325.

146. Whelan J. Sequencing of a soybean alternative oxidase cDNA clone / J. Whelan, L. Mcintosh, D.A. Day // Plant Physiology. 1993. - vol. 103. - pp. 1481.

147. Wierenga R.K. Preddiction of the occurrence of the ADP-binding beta alpha beta-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint / R.K. Wierenga, P. Terpstra, W.G. Hoi // J Mol Biol. 1986. - vol. 187. - pp. 101107.

148. Winkler E. Effect of fatty acids on H+transport activity of the reconstituted uncoupling protein / E. Winkler, M. Klingenberg // J Biol Chem. -1994. -vol. 269.-pp. 2508- 2515.

149. Yagi T. Bacterial NADH-quinone oxidoreductases / T. Yagi // J Bioenerg Bioomembr. 1991. - vol. 23. - pp. 211-225.

150. Zottini M. Oxidation of external NAD(P)H by mitochondria from taproots and tissue cultures of sugar beet {Beta vulgaris) / M. Zottini, G. Mandolino, D. Zannoni // Plant Physiol. 1993. - vol. 102. - pp. 579-585.1501. БЛАГОДАРНОСТИ

151. Автор хотел бы выразить благодарность тем людям, которые помогали ему, и без которых эта работа никогда бы не вышла в свет.

152. В первую очередь я выражаю слова признательности своим дорогим и любимым родителям. Огромное им спасибо за их бесконечное терпение, поддержку, любовь и заботу.

153. Я благодарю моего научного руководителя, Попова Василия Николаевича, за его ценные советы по планированию экспериментов, обработке полученных результатов и за его бесконечный оптимизм, вселяющий надежду на успех.

154. Я также признателен заведующему кафедрой физиологии и биохимии растений ВГУ Епринцеву Александру Трофимовичу за общее руководство моим проектом и помощь в обеспечении материальной базы исследования.

155. Хочется выразить признательность Елене Николаевне Моховой и Ольге Марковой, открывшим для меня удивительный мир растительной биоэнергетики.

156. Я благодарен Егору Борисовичу Прохорчуку за ценные консультации по стратегии планирования, проведения и интерпретации результатов количественного ПЦР-анализа.

157. Отдельное спасибо Константину Петровичу Пенскому за оказанную помощь в издании автореферата.

158. Также хочу сказать спасибо всем моим друзьям, которые всегда подставляли мне плечо и оказывали поддержку в минуты отчаянья.1. Олег Фоменко.

Информация о работе

Фоменко, Олег Юрьевич
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы