Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода

Попов, Василий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода"

Попов Василий Николаевич

Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж -2003

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственого университета и в отделе биоэнергетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Константинов Александр Александрович доктор биологических наук Любимов Валерий Юрьевич

доктор биологических наук, профессор Пашков Александр Николаевич

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии

Зашита состоится 10 октября 2003 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете (394006, Воронеж, Университетская пл., 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан 5 сентября 2003 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

2_оо5~А

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Существование множественных метаболических путей, обеспечивающих сходные процессы, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма, как целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных с повышением устойчивосга живых организмов к неблагоприятным факторам. И в этой связи одним из важнейших направлений является изучение клеточного дыхания, которое может обеспечивать клетку энергией, а может быть не сопряженно с запасанием энергии, и его координация с метаболизмом различных классов органических соединений. Это относится и к окислительному метаболизму митохондрий и пероксисом в период интенсивного функционирования глиоксилатного цикла, так как организация метаболизма жирных кислот представляет особый интерес. Нейтральные липиды являются основной запасной формой органического вещества и от возможности их быстрой утилизации зависит скорость адаптации организма. Р-окисление жирных кислот может протекать как в митохондриях, обеспечивая энергетические потребности клетки, так и в пероксисомах (Lazarow, 1978). Органеллы эти интересны тем, что протекающие здесь окислительные процессы не связаны с запасанием АТР. Образующиеся в пероксисомах NADH и FADH2 окисляются там же кислородом с образованием супероксидрадикала и перекиси водорода (Luster, Donaldson, 1987; Lopez-Huertas et al., 1999). Пероксисомы изолированы мембраной от цитоплазмы и образующиеся та?.! активные формы кислорода немедленно детоксицируются присутствующими в избытке супероксиддисмутазой, каталазой, пероксидазой. Основными субстратами, окисляемыми в пероксисомах, являются жирные кислоты, особенно в период интенсивного использования запасных липидов для глюконеогенеза. Процесс мобилизации запасных жиров для синтеза углеводов, по-видимому, протекает во всех живых организмах. Однако для тканей высших животных биохимический механизм данного процесса остается невыясненным (Лебкова, 2000). Считается, что окисление липидов может приводить к образованию кетоновых тел и их последующему вовлечению в энергетический обмен. Наличие ферментов |3-окисления жирных кислот в животных пероксисомах (Lazarow, 1978) и феномена ресинтеза гликогена в печ

голодании (Лебкова, 1984) позволяет предположить

ферментов глиоксилатного цикла, позволяющих конденсировать две молекулы ацетил-КоА, образующегося при ($ -окислении, в сукцинат, как это происходит в растительной и бактериальной клетках.

Принято считать, что сукцинат, интенсивно образующийся в глиоксилатном цикле, при прорастании жирозапасающих семян далее окисляется в отрезке цикла Кребса до оксалоацетата и последний вступает в глюконеогенез. Однако нет данных о том, сбалансирована ли скорость глиоксисомальных и митохондриальных процессов, особенно в период максимальной активности глиоксилатного цикла. Кроме того, известно, что для функционирования глюконеогенетического пути необходимо высокое содержание в клетке восстановленных пиридиннуклеотидов и АТФ, замедляющее работу электронтранспортной цепи митохондрий, в частности, сукцинатдегидрогеназного комплекса (Affourtit et al., 2001). Таким образом, есть основание предполагать наличие альтернативных путей окисления сукцината в период прорастания масличных семян.

Кроме того, функционирование митохондрий в условиях высокого соотношения НАДН/НАД+ и АТФ/АДФ и высокого мембранного потенциала, а также при повышенных концентрациях кислорода, при пониженных температурах, засухе, поранениях может приводить к генерации активных форм кислорода (супероксид-радикала, перекиси водорода, гидроксил-радикала), способных повреждать митохоцдриальную ДНК (Skulachev, 1996). Ранее было показано, что клеточное дыхание ш vivo в норме происходит не только сопряженно с запасанием энергии, но и без такого сопряжения. Второй тип дыхания был назван свободным. Было высказано предположение, что свободное окисление участвует в терморегуляторном термогенезе, в образовании или разрушении метаболитов, детоксикации ксенобиотиков и даже (косвенно) в запасании энергии (Скулачев, 1989), и было предположено, что понижение внутриклеточной концентрации Ог, приводящее к ограничению образования АФК, также является специфичной функцией дыхательной системы клетки (Скулачев, 1994). Этот процесс и наличие защитных механизмов активно изучались для животных тканей и микроорганизмов, но остаются относительно малоисследованными для растительных митохондрий. Так, в частности, было показано участие так называемого «мягкого» разобщения у животных и дыхательной защиты у Azotobacter vinelandi в регуляции скорости образования активных форм кислорода. Растительные митохондрии обладают широким спектром путей

свободного окисления, роль которых возрастает при адаптации к повышенным или пониженным температурам, изменению состава атмосферы и светового режима. Наличие в растительных митохондриях альтернативной оксидазы, работа которой не связана с образованием АТФ и генерацией протонного потенциала, определяет возможность либо сопряженного окисления убихинола через цитохромный путь, либо быстрое несопряженное окисление через альтернативную оксидазу, вызывающее термогенез (Wagner, Moore, 1997). В этой связи ключевым является вопрос об участии путей несопряженного и разобщенного окисления в регуляции образования активных форм кислорода.

1Тель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение роли процессов свободного окисления в мобилизации запасных липидов и защите организма от избыточной генерации активных форм кислорода.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние факторов, индуцирующих липолиз и ß-окисление жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на функционирование глиоксилатного цикла и окислительных процессов в пероксисомах.

2. Определить возможность функционирования глиоксилатного цикла в тканях млекопитающих в условиях, вызывающих мобилизацию запасных жиров, выявить субклеточную локализацию данного процесса.

3. Выделить отдельные ферменты, обеспечивающие функционирование глиоксилатного цикла, изучить их физико-химические, каталитические характеристики и регуляцию.

4. Исследовать возможность функционирования альтернативных путей окисления сукцината в условиях его интенсивного образования из запасных липидов в глиоксилатном цикле.

5.' Выявить механизмы генерации активных форм кислорода в растительных митохондриях и роль процессов свободного окисления в регуляции этого процесса.

6. Изучить возможность индукции путей несопряженного транспорта электронов (на примере альтернативной оксидазы) факторами, вызывающими интенсивное образование активных форм кислорода.

7. Исследовать возможные механизмы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования при накоплении свободных жирных кислот и влияние этого процесса на генерацию активных форм кислорода.

Научная новизна работы. Исследование влияния факторов, индуцирующих липолиз и (З-окисление жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на пероксисомальный метаболизм показало, что мобилизация запасных липидов связана с несопряженным окислением в пероксисомах и работой глиоксилатного цикла как в растительных, так и в животных тканях. Впервые для тканей млекопитающих (для печени и почек крыс) "показана индукция ферментов глиоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат направлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса клетки. Установлено, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза, локализованы в микротельцах животных тканей. Наличие в этих органоидах ферментов ¡3 -окисления жирных кислот позволяет считать их полноценными глиоксисомами. Впервые получен гомогенный препарат изоцтратлиазы из животной ткани, изучены его физико-химические свойства и показана регуляция активности данного фермента сахарофосфатами.

Установлено, что интенсивное образование янтарной кислоты в глиоксилатном цикле приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так, при прорастании семян злаковых обнаруживается глиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является быстрое, не связанное с запасанием энергии, окисление сук-цината непосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль эпектронтранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины в период интенсивной работы глиоксилатного цикла при прорастании происходит шунтирование цикла Кребса через аминотрансферазные реакции, что позволяет обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной метаболизации сукцината.

кислотами посредством АТР/АБР антипортера. Обнаружено, что ингибирование альтернативной оксидазы приводит к значительному увеличению интенсивности генерации перекиси водорода митохондриальной электронтранспортной цепью, и что скорость продукции АФК коррелирует с активностью альтернативной оксидазы. То есть альтернативная оксидаза может выступать защитным механизмом, снижающим образование активных форм кислорода, а индукция "свободного окисления", по-видимому, представляет собой универсальную стратегию защиты от стрессоров различной природы, вызывающих генерацию активных форм кислорода.

Практическая значимость исследования. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биохимических механизмах участия митохондриальных и пероксисомальных процессов в адаптации растительной и животной клеток. Показанное разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях растений, подвергшихся воздействию пониженных температур, является объяснением снижения продуктивности сельскохозяйственных растений. Представленные данные важны для получения новых сортов растений, обладающих повышенной экспрессией механизмов устойчивости к холоду.

Изучение механизмов продукции активных форм кислорода в растительных митохондриях также важно для понимания механизмов адаптации растений к стрессорам различной природы, так как ранее было показано, что в этих условиях наблюдается окислительный взрыв, когда происходит резкое увеличение продукции супероксидрадикапа и перекиси водорода

Разработанная схема выделения электрофоретически гомогенных препаратов изоцитратлиазы, аконитазы и малатдегидрогеназы может быть использована для получения коммерческих препаратов ферментов. Найденный метод стабилизации ферментов позволяет сохранять их активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность использования препарата для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях для количественного определения маната, цитрата, изоцитрата.

растений семейства злаковых, возможна разработка гербицидов, частично ингибирующих основной путь окисления сукцината - сукцинатдегидрогеназу и подавляющих развитие растений, не обладающих альтернативной системой окисления янтарной кислоты.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты исследований вошли в курсы лекций по «Биохимии и молекулярной биологии», «Биоэнергетике», «Физиологии растений» и «Дыханию растений».

Дпробаиия работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на IX (Брно, Чехия, 1994 г.), X (Флоренция, Италия, 1996) и XI (Варна, Болгария, 1998) Конгрессах Федерации европейских обществ физиологов растений; 12-ой Европейской биоэнергетической конференции (Аркашон, Франция, 2002); 2-ой (Вена, Австрия, 1996) и 5-ой (Ницца, Франция, 2001) конференции «Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс»; школе ФЕБО «Митохондрии в жизни и смерти клетки» (Москва, 2001); 579 конференции Биохимического общества (Кочестер, Великобритания, 2003); Конгрессе «Гены, семейства генов и изоферменты» (Берлин, Германия, 2003); Всероссийском совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001); 4 и 5 съезде Общества физиологов растений (Москва, 1999 и Пенза, 2003); Съезде Русского ботанического общества (Санкт Петербург, 1998); ежегодных научных сессиях Воронежского государственного университета (1996-2002) и биоэнергетическом семинире НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ (20022003). Результаты, представленные в работе, удостоены Премии Европейской академии для молодых ученых СНГ за 1997 и Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся достижения в области науки и техники для молодых ученых за 1998 год.

страниц, 64 рисунка, 35 таблиц. В работе использовано 465 литературных источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. При использовании в качестве объектов исследования проростков культурных растений этиолированные растения выращивали гидропонным способом в темноте при температуре 25°С, зеленые - при 14-ти часовом освещении дневным светом. Выбор вида растения мотивировался различиями в типе основного обмена и

особенностями запасающих органов семян. При работе с животными трехмесячные лабораторные крысы (Rattus rattus L.) выращивались при нормальном питании и затем помещались в условия пищевой депривации при свободном доступе к воде на срок до 7 суток. Для получения печени опытных животных предварительно усыпляли этиловым эфиром и производили декапитацию.

Выделение клеточных органелл. Выделение .субклеточных фракций из органов растений проводили методами дифференциального центрифугирования и изоплотностного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Schnarrenberger et ai., 1971). Маркерными ферментами для митохондрий являлись сукцинатдегидрогеназа и фумаратгидратаза, для глиоксисом - каталаза, для цитозоля - алкогольдегидрогена^а. Для очистки митохондрий от примесей использовали самогенерирующийся градиент Percoll (Wagner, 1995).

Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили при 25°С с помощью спектрофотометрических методов. Активность изоцитратлиазы определяли по методу Dixon и Kornberg (1959) при 324 нм. Малатсинтазу определяли при 412 нм по формированию комплекса СоА и дитио-бис-нитробензойной кислоты (ДТНБ) (Hock, Beevers, 1966). Активность МДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования НАДН. Для определения активности АГ применяли метод, основанный на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом или использовали вспомогательный фермент изоцитратдегидрогеназу. Продукты реакции, катализируемой ГСО, определяли с использованием вспомогательных ферментов. Возможность образования маната и оксалоацетата анализировали при 340 нм, добавляя МДГ (15 ФЕ/мл) и соответственно НАД* (0,6 мМ) или НАДН (0,2 мМ). Возможность образования лактата и пирувата анализировали, добавляя ЛДГ (0,15 ФЕ/мл) и соответственно НАД1" и НАДН. Определение пероксида водорода проводили с использованием пероксидазы и о-дианизидина при 435 нм (Piedras et al., 1992).

Выделение и очистка ферментов. Для получения высокоочищенных препаратов ферментов после гомогенизации материала проводили

фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-фракгогене, и гель-хроматографию на Toypearl HW-65. Все операции проводили в холодной комнате при 0....4°С.

Исслелование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных или частично очищенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования осуществляли с использованием линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982).

Радиоизотопные исследования. Учет |4С02, выделяющегося в ходе метаболизма 1,4-иС-сукцината, проводили при 25°С в течение 2,5 ч с интервалом отбора проб 0,5 часа. Разделение на фракции аминокислот, органических кислот и Сахаров проводили путем ионообменной и бумажной хроматографии (Солдатенков, Мазурова, 1971). Радиоактивность проб просчитывали на сцинтилляционном счетчике СБС-2 (Россия) в сцинтилляционной жидкости ЖС-8И (Россия).

Полярографический анализ и определение скорости генерации Н202. Интенсивность митохондриального дыхания определяли с помощью закрытого кларковского электрода. Субстратом дыхания служил 5 мМ сукцинат. Для ингибирования комплекса I ЭТЦ использовали 2 ¡J.M ротенон, СДГ - 1-20 мМ малонат, комплекса Ш - 1-2 цМ антимицин или 1 цМ миксотиазол, цитохромоксидазы - 1-5 мМ KCN или азид натрия, альтернативной оксидазы - 0,2-5 мМ SHAM, АТФазы - 2 ¡iM олигомицин. Измерение интенсивности продукции Н2О2 проводили с помощью флюоресцентного метода на флюориметре MPF-4 (Hitachi), образования супероксидрадикала - спектрофотометрически с помощью эпинефрина или по интенсивности сигнала ЭПР спиновой ловушки TIRON.

Б лот-анализ. Для определение уровня экспрессии альтернативной оксидазы использовались антитела на альтернативную оксидазу из Sauromatum guttatum, для определения количества мРНК, кодирующей сукцинатдегидрогеназу, был подготовлен радиоактивно меченый зонд.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4-кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы

осуществляли в ■ трех повторностях. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 (Лакин, 1990).

ИНДУКЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ

С помощью гистологических исследований для крыс было показано, что пищевая депривация сначала вызывает снижение содержания гликогена в тканях печени, но затем наблюдается его ресингез (Лебкова, 1982). Кроме того в печени крыс было обнаружено цианид-устойчивое немитохондриальное ß-окисление жирных кислот. Эта активность проявлялась во фракции пероксисом (Lazarow, 1978). В растениях специализированные пероксисомы, т.н. "глиоксисомы" содержат ферменты как ß-окисления, так и глиоксилатного цикла (Cooper, Beevers, 1969) и одной из основных их функций является обеспечение интенсивного протекания глюконеогенеза. Традиционно считается, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза отсутствуют в животных тканях, обнаруживаясь только в микроорганизмах и высших растениях (Beevers, 1979). Однако, во время личиночных стадий онтогенеза и в эмбриогенезе некоторых нематод была показана индукция ферментов глиоксилатного цикла (Khan, McFadden, 1980). Для личинок Ascaris suum было установлено, что изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в митохондриях и обеспечивают синтез гликогена из жирных кислот (Rubin, Trelease, 1976). Кроме того, некоторые биохимические и цитохимические исследования показали присутствие ключевых ферментов глиоксилатного цикла в тканях высших животных. Так активность изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживалась в почечных канальцах Bufo marinus (Goodman et al., 1980), в печени морских свинок (Jones, 1980) и цыплят (Davis et al., 1990).

Изучение активности ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс показало отсутствие ферментативной активности изоцитратлиазы и малатсинтазы (рис.1). Но на 3-й день пищевой депривации нами наблюдалась индукция этих ферментов, а на 5-й день голодания активность изоцитратлиазы и малатсинтазы была максимальной и составляла для гомогената ткани печени 0,06 и 0,03 ФЕ/мг белка, соответственно.

Время голодания, дней Рис. 1. Изменение активности ключевых ферментов глиоксилатного

цикла в печени крыс при голодании. I - изоцитратлиаза; 2 — малатсинтаза.

Изучение индукции остальных ферментов, участвующих в глиок-силатном цикле, показало, что при голодании в печени крыс увеличивается активность малатдегидрогеназы и цитратсинтазы. На пятый день голодания она увеличилась соответственно на 100 и 90%, причем наблюдалось возрастание как общей, так и удельной активности. Кроме того увеличивалась активность ацил-СоА дегидрогеназы, ключевого фермента |3-окисления жирных кислот. Удельная активность аконитатгидратазы было показано, что ее максимальна из всех ферментов глиоксилатного цикла у неголодавших животных, и она увеличивается при голодании в наименьшей степени (табл.1).

Индукция экспериментального диабета введением аллоксана вызывала появление изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей. Активность ключевых ферментов глиоксилатного цикла обнаруживалась в период с 7-го по 30-й день после инъекции аллоксана. Через 7 дней после введения аллоксана удельная активность изоцитратлиазы в гомогенате печени крыс составляла 0,040, а малатсинтазы 0,022 ФЕ/ мг белка (Рис. 2). Определение активностей этих ферментов в других тканях показало, что изоцитратлиаза и малатсинтаза присутствуют также в почках крыс с экспериментальным

диабетом. Кроме того, было обнаружено повышение активностей малатдегидрогеназы, цитратсинтазы и аконитатгидратазы в печени крыс после инъекции аллоксана. Таким образом, установлено наличие активностей всех ферментов глиоксилатного цикла в печени и почках крыс с экспериментальным диабетом.

Таблица 1

Индукция ферментов глиоксилатного цикла и Р-окисления жирных кислот при голодании

Фермент Дней Общая активность в Удельная активность,

голодания печени, ФЕ ФЕ / мг белка

Малатдегид- 0 12,5 ±0,5 0,060±0,003

рогеназа 5 24,6±0,8 0,120+0,005

Цитрат- 0 10,8±0,3 0,056±0,002

синтаза 5 21,5+0,4 0,101±0,003

Аконитат- 0 19,6±0,4 0,093±0,003

гидратаза 5 30,2±0,4 0,145+0,003

Ацил-СоА- 0 8,2+0,3 0,039±0,002

дегидрогеназа 5 14,1±0,5 0,069±0,005

Для определения субклеточной локализации ключевых ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы в печени крыс нами использовалось изоплотностное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. При этом применялся линейный градиент. В качестве ферментов-маркеров для микротелец использовалась каталаза, для митохондрий -сукцинатдегидрогеназа и фумараза, для цитозольной фракции алкогольдегидрогеназа. Изоцитратлиаза и малатсинтаза были обнаружены преимущественно во фракции с максимальной удельной активностью каталазы, то есть в печени крыс ключевые ферменты глиоксилатного цикла малатсинтаза и изоцитратлиаза локализованы в микротельцовой фракции (Рис.3).

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

ИЦЛ МС МДГ ЦС АГ Ферменты

Рис. 2. Активность ферментов глиоксилатного цикла при индуцированном аллоксаном диабете. 1 - контрольные животные; 2 - крысы с экспериментальным диабетом.

Наличие второго пика активности изоцитратлиазы и малатсинтазы связано с цитозольной фракцией и, по-видимому, объясняется солюбилизацией ферментов из микротелец при выделении. Увеличение активности других ферментов глиоксилатного цикла - малатдегидрогеназы, цитратсинтазы и фермента, окисляющего жирные кислоты, ацил-СоА-дегидрогеназы (А-СоА-ДГ) также связано с пероксисомальной фракцией (Табл. 2). Это заключение можно сделать, принимая во внимание, что активность А-СоА-ДГ, МДГ и ЦС увеличивалась во фракции митохондрий и в цигозоле только в 1,3-1,6 раза, а увеличение их активности в пероксисомальной фракции достигало 10 раз. Для аконигатгидратазы наблюдалось увеличение активностей как цитоплазматической так и митохондриальной формы.

Для изучения каталитических и регуляторных свойств изоцитратлиазы из печени голодающих крыс нами была проведена очистка фермента, результаты которой приведены в таблице 3.

5 10 15 20 25 Номер фракции

ш в

0.16

10 20 30 Номер фракции

Б.

10 20 .30

Номер фракции

В.

Рис. 3. Выявление субклеточной локализации ферментов глиоксилатного цикла при изоплотностном центрифугировании. 1 - белок; 2 - плотность градиента; 3 - каталаза 4 - алкогольдегидрогеназа; 5 - сукцинатдегидрогеназа; 6 - изоцитратлиаза; 7 - малатсинтаза

Таблица 2.

Субклеточная локализация ферментов глиоксилатного цикла в печени интакгных и опытных крыс

Активность ферментов, ФЕ Контрольные животные 5-ти дневное голодание

Цито-золь Митохондрии Перок-сисомы Цитозоль Митохон -дрии Перок-сисомы

ИЦЛ 0 0 0 0,125 0,035 0,280

MC 0 0 0 0,081 0,036 0,172

ЦС 0,080 0,125 0,025 0,120 0,182 0,256

МДГ 0,120 0,185 0,029 0,175 0,220 0,235

АГ 0,092 0,040 0,008 0,190 0,090 0,028

А-СоА-ДГ 0,032 0,085 0,018 0,042 0,110 0,056

Белок, мг 6,45 5,51 3,24 6,51 5,68 3,39

Таблица 3

Очистка изоцитратлиазы из печени голодающих крыс

Стадия Общая Общий Удельная Вы- Степень

активность, белок, мг активность, ход, очистки

ФЕ ФЕ/мг белка %

Гомогенат 24,8 276,0 0,09 100 1,0

Фракционирование 15,1 72,0 0,21 60,8 2,3

сульфатом аммония

(50-70 %

насыщения)

Гельфильтрация на 16,7 62,0 0,27 67,3 3,0

Сефадексе G-25

Хроматография на 5,7 2,2 2,60 23,1 28,9

ДЭАЭ- целлюлозе

Гельфильтрация на 2,0 0,3 9,04 8,2 100,5

Toyopearl

HW-65

Применение фракционирования (N114)2804, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на Тоуореаг1 Ь^-65 позволило получить препарат с удельной активностью 9,0 ед. на 1 мг белка,

что соответствует 100-кратной очистке, и 8,2 % выходом фермента. Электрофоретические исследования полученного препарата изоцитратлиазы из печени голодающих крыс и крыс с экспериментальным диабетом показали наличие лишь одной белковой полосы с относительной электрофоретической подвижностью 0,54. То есть полученный нами препарат был электрофоретически гомогенен.

Активность высокоочищенной изоцитратлиазы при хранении препарата фермента при 4°С снижалась за первые двое сутбк на 15 %, а в дальнейшем примерно на 20-30 % каждые сутки. При разработке условий длительного хранения полученного ферментативного препарата было установлено, что оптимальными для изоцитратлиазы являются следующие условия: среда, содержащая 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,5), 3 мМ NaCl2, 3 мМ дитиотрейтол, 25 % глицерин, и температура -15°С. При таких условиях в течение 5 дней сохранялось 90 % исходной активности, 20 дней - 65 %.

При определении молекулярной массы изоцитратлиазы с помощью гель-фильтрации на Toyopearl HW-65 установлено, что ее значение составляет 145 кДа. Изучение каталитических свойств изоцитратлиазы показало, что фермент подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, и что значение Км по изоцитрату составило 70 мкМ. рН оптимум изоцитратлиазы из печени крыс при определении в трис-HCl буфере равен 7,4.

Исследование влияния интермедиатов клеточного метаболизма на активность изоцитратлиазы позволило обнаружить, что глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат ингибируют данный фермент по конкурентному типу. Рассчитанные по методу Диксона (1982) значения констант ингибирования составили для глюкозо-1-фосфата 1,1 мМ, для глюкозо-6-фосфата 1,9 мМ. 0,1 мМ ADP вызывал активацию фермента на 65-70 %. Инкубация с АТР, NAD и NADH не оказывала существенного влияния на активность изоцитратлиазы.

Малатсинтаза из печени голодающих крыс была очищена с помощью преципитации (NH4)2S04 и гель-фильтрации на сефадексе G-25 в 5,2 раза с выходом 45 %. Малатсинтаза из печени крыс также характеризуется кинетикой Михаэлиса-Ментен с Км (по ацетил-КоА) 0,2 мМ и Км (по глиоксилату) = 3,0 мМ, рН оптимум составил 7.6.

Индукция малатдегидрогеназной активности связана с появлением новой изоформы МДГ, Электрофоретические исследования, проведенные в 15% полиакриламидном геле, показали, что по сравнению с контрольными

животными, в гепатоцитах которых присутствуют две изоформы МДГ с Rf 0.08 и 0.14, у голодающих животных появляется дополнительная изоформа с коэффициентом электрофоретической подвижности 0.16 (Рис.4). Индуцированная голоданием изоформа была выделена с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-Toyopearl. При элекрофоретическом анализе разделенных изоформ было показано, что изоформа МДГ1, элюировавшаяся в интервале 25-40 мМ KCl, соответствует изоформе с Rf 0,08 , изоформа МДГ2, элюировавшаяся в интервале 55-70 мМ - Rf 0,14, а индуцируемая голоданием изоформа МДГЗ, элюировавшаяся 130-140 мМ KCl, имеет Rf 0,16. Показано, что индуцированная форма МДГЗ имеет пероксисомальную локализацию, изоформа МДГ1 - митохондриальное происхождение, а изоформа МДГ2 - цитозольное.

Рис. 4. Изоферментный спектр малатдегидрогеназы из печени контрольных (правый слот) и голодающих (левый слот) крыс.

Исследование ее каталитических характеристик пероксисомальной МДГЗ показало существенное сходство с цитозольной формой. Отличительной особенностью данной изоформы является ее большее сродство к ИАБН. Важным для регуляции внутриклеточного распределения малата и оксалоацетата представляется более высокая устойчивость пероксисомальной и митохондриальной форм МДГ к ингибирующему действию сукцината, являющегося продуктом глиоксилатного цикла (Табл. 4.).

Таблица 4.

Каталитические свойства изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс

Изо-форма Диапазон элюции с DEAE-Toyopearl pH оптимум Км (по NADH), мкМ Коэффициент Хилла к, (АТР), мМ К, (сук-цинат), мМ к, цитрат, мМ

МДГ1 25-40 мМ KCl 8,5 90 2,40 1,8 4,0 3,2

МДГ2 55-70 мМ KCl 7,8 58 1,51 5,1 3,5 2,6

МДГЗ 130-140 мМ KCl 7,8 50 1,57 6,4 3,8 3,0

В наших исследованиях была установлена индукция как цитоплазматической, так и митохондриальной изоформ АГ в гепатоцитах контрольных и опытных крыс. Показано, что в обоих случаях максимальное значение активности фермента обнаруживается в цитозольной фракции. Из полученных результатов видно, что соотношение активностей цитозольной и митохондриальной форм аконитазы у контрольных животных составило 79% и 21 % (0.80 и 0.18 ФЕ на 1 г печени), а у голодающих животных 83% и 17% (2.00 и 0.53 ФЕ на 1 г печени).

Обнаружение аконитазной активности в пероксисомальной фракции (Табл. 2) может объясняться как перекрестным загрязнением митохондрий, так и наличием специальной пероксисомальной изоформы. т.к. процент содержания АГ в пероксисомах был лишь на 10-25% вьцре чем для маркерных ферментов митохондрии и цйтозоля. Кроме того, аконитатгидратаза в этих органеллах может ингибироваться за счет связывания с железом, входящим в состав этого фермента, высокими концентрациями Н2О2, присутствующими в микротельцах, (Уеп^ие1 е1 а!., 1991), что может затруднять детекцию фермента. Очевидно, для окончательного решения о присутствии АГ в пертжсисомах требуются исследования с помощью иммунофлюоресцентных методов и ЭПР.

Для изучения физико-химических и регуляторных свойств были выделены изоформы АГ из цитоплазмы и митохондрий гепатоцитов голодающих крыс (Табл. 5, 6). Полученные препараты аконитазы были сходны с ферментом, выделенным ранее из тканей нормальных животных, по уровню удельной

Таблица 5

Очистка цитоплазматической аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих

крыс

Стадии очистки Объем, мл Общая активность, ФЕ Количество белка, мг Удельная активность, ФЕ/мг белка Выход, % Степень очистки

Цитозольная фракция 30,5 11,5 238,200 0,048 100 1

Фракционирование (Ш^БО^ 35-65% 5,0 8,5 82,520 0,103 74 2,2

Гель-фильтрация на сефадексе С-25 8,0 6,1 30,960 0,197 53 4,1

Хроматография на ДЭАЭ- Тоуореаг1 9,5 2,9 0,720 4,028 25 84,0

Гель-фильтрация наТоуореаг! HW-65 6,0 1,1 0,099 11,110 10 231,5

Таблица 6. Очистка митохондриальной аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс

Стадии очистки Объем, мл Общая активность, ФЕ Количе ство белка, мг Удельная активность, ФЕ/мг белка Выход, % Степень очистки

Фракция митохондрий 2,0 2,60 51,190 0,050 100 1

Фракционирование (ЫН4)2504,35-65% 4,8 2,10 20,000 0,105 81 2,1

Гель-фильтрация на сефадексе в-25 10,0 1,05 6,300 0,167 40 3,3

Хроматография на ДЭАЭ- Тоуореаг1 7,5 0,64 0,307 2,085 25 41,7

Гель-фильтрация на Тоуореаг! 1^-65 5,0 0,38 0,062 6,129 15 122,6

активности электрофоретически гомогенных препаратов, значениями констант Михаэлиса, рН оптимума. Это показывает, что изменение общей активности аконитазы при голодании вызывается, прежде всего, увеличением количества фермента.

Показано, что аконитаза из гепатоцитов голодающих крыс может ингибироваться органическими кислотами, такими как малат, сукцинат, глиоксилат, оксалоацетат, транс-аконитат, фумарат, причем устойчивость к этим интермедиатам значительно выше у цитОзольной формы фермента. Наиболее эффективными ингибиторами митохондриапьной аконитазы были глиоксилат, сукцинат и фумарат (Табл. 7). Накопление двух последних интермедиатов цикла Кребса может обуславливаться как ингибированием сукцинатдегидрогеназы и фумаратгидратазы, так и активацией дикарбоксилатного переносчика, транспортирующего сукцинат, образующийся в пероксисомах в глиоксилатном цикле (Cooper, Beevers, 1969). В этом случае ингибирование аконитазы позволяет использовать дикарбоновые кислоты на глюконеогенетические процессы. Цитозольная форма фермента была также более устойчива при хранении и при воздействии перекиси водорода, разрушающей железосерные кластеры фермента.

Таблица 7

Влияние интермедиатов клеточного метаболизма на активность аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс.

Значения констант ингибирования (К,), мМ

Изоформа фермента Транс-акон'итат Сукцинат Глиоксилат Оксалоацетат Малат Фумарат

Цитоплаз-матическая 3,41 0,61 0,42 2,80 1,81 0,51

Митохонд-риапьная 1,37 0,33 0,14 1,03 2,94 0,40

Таким образом, нами впервые была исследована индукция ключевых ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс при голодании и индуцированном экспериментальном диабете. Присутствие изоцитратлиазы и малатсинтазы в этих тканях делает возможным нормальное функционирование глиоксилатного цикла, обеспечивающего конденсацию двух молекул ацетил-СоА в одну молекулу сукцината. Глиоксилатный цикл был открыт у микроорганизмов, выращиваемых на ацетате (Kornberg, Krebs,

1957). Для этих организмов основной его функцией считается вовлечение Сэ-органических соединений в анаболические процессы. Для растений наличие ферментов глиоксилатного цикла впервые было показано в работе (Kornberg, Beevers, I960). Наиболее высокая его интенсивность наблюдается в жирозапасающих органах семян при прорастании (Lazarow, 1978). В этих тканях основной функцией глиоксилатного цикла является обеспечение процесса превращения запасных жиров в углеводы. Подобную роль глиоксилатный цикл играет и у личинок некоторых нематод (Khan, McFadden, 1980), где активность его ключевых ферментов изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживается на ранних этапах онтогенеза.

ИЗУЧЕНИЕ ГЛИОКСИСОМАЛЬНОЙ СУКЦИНАТОКСИДАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ ЗЛАКОВ

Изучение влияния ингибиторов на метаболизм меченого сукцината показало, что в семенах злаковых растений таких, как кукуруза и пшеница, процесс окисления сукцината не чувствителен к ТТФА - ингибитору СДГ. Введение этого ингибитора в среду инкубации приводило к интенсификации процесса выделения иС02 (120 % от контроля) (рис.5). В присутствии ТТФА отмечалось также снижение накопления радиоактивной метки в сахарах .

~i-г

60 80 100 120 140 160 Время, мин

' S мМ фторацетата

• Контроль

• 8 мМ ТТФА

Рис. 5.

Декарбоксширование 1,4-ыС-сукцината щитками кукурузы

Фторацетат незначительно ингибировал выделение ИС02 в первые два часа инкубации. Введение в инкубационную среду этого ингибитора приводило к резкому (почти в 4 раза) увеличению радиоактивности аминокислот и заметному (на 40 %) снижению радиоактивности фракции органических кислот.

При исследовании метаболизма сукцината в запасающих органах различных растений было показано, что в щитках кукурузы и пшеницы сукцинат метаболизируется не только в митохондриях, но и в глиоксисомах, причем в микротельцах сукцинат превращается непосредственно в малат. Для этого нами проводились исследования метаболизации 2,3-'4С-сукцината в изолированных митохондриях и глиоксисомах, выделенных с помощью изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы из щитков кукурузы. Показано, что в митохондриях сукцинат превращался преимущественно в фумарат. Для глиоксисом установлено, что радиоактивный сукцинат метаболизируется преимущественно в малат (Табл. 8).

В результате последующих исследований нами был обнаружен, частично очищен и охарактеризован фермент, обеспечивающий данный процесс - глиоксисомальная сукцинатоксидаза, катализирующая окисление сукцината в малат с образованием перекиси водорода.

Таблица 8

Включение радиоактивной метки в органические кислоты после инкубации органелл с 2,3-иС-сукцинатом

Органическая кислота Радиоактивность, имп/мин мг белка

Интактные Разрушенные Интактные

глиоксисомы глиоксисомы митохондрии

Сукцинат 18320 19900 19600

Малат 3100 4700 130

Фумарат 70 80 4300

Гликолат 950 800 300

Цитрат 100 100 300

С02 80 100 100

Для изучения глиоксисомальной сукцинатоксидазы производили выделение фракции митохондрий и глиоксисом. Активность ГСО в этой фракции составляла соответственно 0,025 и 0,013 ФЕ/мг белка для щитков кукурузы и пшеницы. Активность ГСО во фракции глиоксисом из щитка кукурузы, полученной в результате изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, равнялась 0,315 ФЕ/мг белка, что соответствовало 12-кратной очистке по сравнению с общей фракцией митохондрий и глиоксисом и 37-кратной очистке по сравнению с гомогенатом тканей щитка кукурузы.

Изучение влияния детергентов на активность глиоксисомальной сукцинатоксидазы показало, что наиболее эффективен 0,05 % раствор дигитонина. В его присутствии активность ГСО равнялась 0,026 ФЕ/мг белка (измерение в общей фракции митохондрий и глиоксисом). Увеличение до 0,1 % или уменьшение до 0,01 % концентрации дигитонина в среде ресуспендирования снижало активность ГСО на 25 и 20 % соответственно. Разрушение органоидов осмотическим шоком было менее эффективным. После него изучаемый фермент сохранял только 70 % активности. Наименее удобным оказалось разрушение органелл с помощью ультразвука (сохранялось 42 % активности), Твином 80 (в зависимости от концентрации выявлялось 50-60 % активности ГСО) и Тритоном Х-100 (30-35 % активности).

Для проростков кукурузы была изучена зависимость глиоксисомальной сукцинатоксидазы от возраста (Рис. 6). Показано, что активность ГСО появляется в щитках 2х-дневных этиолированных проростков и составляет 0,11 ФЕ/г сырой массы. Максимальную активность 0,193 ФЕ/г сырой массы наблюдали на 4-й день прорастания в период максимальной интенсивности протекания глиоксилатного цикла. К 7 дню развития щитка активность снижалась до 0,08 ФЕ/г сырой массы. Для сукцинатдегидрогеназы было показано, что максимум ее активности наблюдается в щитке кукурузы на 5-й день прорастания.

Глиоксисомальная сукцинатоксидаза, выделенная из щитка кукурузы, имеет широкий оптимум рН, сдвинутый в щелочную область. Оптимальное значение рН составило для ГСО 7,8 (Рис. 7). Для сукцинатдегидрогеназы из щитков кукурузы значение рН оптимума несколько отличается и составляет 7,5.

012345678 Возраст проростков, суток

—•— активность ГСО —■- активность СДГ

Рис. 6. Активность глиоксисомальной сукцинатоксидазы и сукцинат-дегидрогеназы в щитках при прорастании семян кукурузы

1 - ГСО; 2 - СДГ

Рис. 7. рН - зависимость глиоксисомапьной сукцинатоксидазы и сукцинатдегидрогеназы.

Определение по методу двойных обратных координат константы Михаэлиса по сукцинату для глиоксисомальной сукцинатоксидазы показало, что она является менее специфичной по субстрату, чем сук-цинатдепидрогеназа. Для ГСО Км (по сукцинату) равняется 18+4 мМ, а Км СДГ (по сукцинату) - 0,8±0,1 мМ. Ингибиторы сукцинатдегидрогеназы 0,058 мМТТФА и 1-10 мМ малонат не влияли на активность глиоксисомальной < сукцинатоксидазы. Квинокрин, ингибитор флавиновых оксидаз в концентрации 0,5 мМ, полностью подавлял реакцию глиоксисомального окисления сукцината.

Высокое значение Кч для сукцината глиоксисомальной сукцинатоксидазы заставляет предположить, что функционирование данного комплекса необходимо именно для быстрого окисления сукцината, минуя аденипатный контроль в митохондриях и реакциях ЦТК. В этой связи можно говорить о разделении фракций между сукцинатдегидрогеназой и глиоксисомальной сукцинатоксидазой.

Таким образом, наши исследования показали, что в глиоксисомах щитка злаковых в условиях интенсивной мобилизации жирных кислот функционирует альтернативный путь окисления сукцината, катализируемый флавин-содержащей ферментной системой. Малат и Н2О2 идентифицированы как продукты этого окисления. Основной функцией данного процесса является быстрое, несопряженное с запасанием энергии окисление сукцината при его интенсивном образовании в глиоксилатном цикле, минуя аденилатный контроль, осуществляемый в митохондриях, что особенно важно для щитка, который находится в частично гипоксических условиях. Данный путь связан с образованием ряда аминокислот и органических кислот из запасных липидов, и его функционирование наиболее интенсивно в период максимальной активности глиоксилатного цикла. В настоящее время обнаружена аналогичная система окисления ИАОН в растительных пероксисомах (Ьорег-НиеПаэ е1 а1., 1999). Однако данный путь не универсален и в эндосперме клещевины активация метаболизма сукцината достигается активацией амнотрансфераз. Ранее для животных тканей, находящихся в стрессовых условиях (в первую очередь гипоксических), было показано функционирование цикла Браунштейна, шунтирующего цикл Кребса через аспартатаминотрансферазную реакцию (Кондрашова, 1991).

ВЛИЯНИЕ ИНДУКЦИИ НЕСОПРЯЖЕННОГО И РАЗОБЩЕННОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ НА ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

Ранее было показано, что при воздействии стрессоров различной природы (пониженные температуры, засуха, поранение, добавление ингибиторов электронного транспорта), вызывающих увеличение генерации активных форм кислорода, у растений наблюдается индукция в митохондриях путей несопряженного транспорта электронов, обходящих генераторы ДцН+ электронтранспортной цепи, в частности цианид-устойчивой оксидазы (Mcintosh, 1999). Для животных тканей было установлено, что образование супероксидрадикала незначительно при низком трансмембранном потенциале и экспоненциально возрастает с увеличением дельта пси. Также было обнаружено, что скорость Ог"-генерации коррелирует со степенью восстановленности цитохрома bj« (b|) (Lin, Huang, 1996). Одним из механизмов для регуляции образования супероксида у животных выступает разобщение свободными жирными кислотами (Korshunov et al., 1998).

В наших исследованиях чтобы стимулировать окислительный стресс цветная капуста инкубировалась в течение 2 дней в атмосфере, содержащей 50-60 % кислорода. Содержание малонового диальдегида (МДА), продукта перекисного окисления липидов, было 1.1 цмоль на 1 мг белка в контрольных митохондриях и 3.1 цмоль на 1 мг белка в митохондриях из обработанных кислородом тканей (Табл. 9), указывая, что повышенная концентрация кислорода на начальных этапах вызывала усиление продукции АФК.

Таблица 9

Влияние гипероксидной атмосферы на окисление сукцината в митохондриях

из цветной капусты

Условия инкубации Скорость дыхания, пмоль Ог мин"1. мг белка-1 CN-устойчивое дыхание, пмоль 02 ,мин"1. мг белка-1 Образование 02 >пмоль ■1 мин .мг белка ' Содержание МДА, цмоль мг белка '

Контроль 207,0 ± 14,0 35,0 ±5,1 21,0 ± 1,4 1,1 (2) ±0,8

40% кислород, 2 дня 199,0 ± 15,4 78,0 ±6,1 15,0 ±0,8 3,2 (2) ± 0,8

При этом установлено нелинейное отношение между потреблением кислорода и восстановлением <3 для митохондрий из цветной капусты, инкубированной при повышенной концентрации кислорода, что указывает на увеличение участия АОХ в дыхании. Это предположение было подтверждено при полярографическом определении интенсивности цианиднечувствительного дыхания (Табл. 9) и измерении концентрации белка альтернативной оксидазы с помощью иммуноферментного анализа (Рис. 8).

Инкубация растений при пониженной температуре (4°С) вызывала увеличение содержания альтернативной оксидазы только в наименее холодоустойчивом растении - зеленом перце (Рис. 8), тогда как в картофеле и цветной капусте содержание АО не менялось. Интенсивный свет снижает скорость поглощения кислорода растительными митохондриями, повышая при этом вклад цианид-резистентного дыхания. Эта индукция коррелировала с накоплением в тканях МДА. Показано, что регуляция интенсивности дыхания может быть опосредована через фитохромную систему, ингибируясь красным светом. В тех митохондриях, где была индуцирована АО, продукция перекиси водорода была снижена по сравнению с контролем.

Рис. 8. Экспрессия альтернативной оксидазы в митохондриях цветной капусты (А) и зеленого перца (Б).в контрольных растениях (сС b ЬрС) и после 48-часовой инкубации при 4°С (с4С и Ьр4С) или в атмосфере с 50% содержанием кислорода (сОХ).

Несопряженная альтернативная оксидаза функционирует при более высоких соотношениях CoQH2/CoQ, чем цитохромоксидаза (Van den Bergen et aL, 1994). Это отношение обычно увеличивается при переходе из состояния 3 в состояние 4, когда риск паразитических реакций одноэлектронного восстановления кислорода увеличивается. Поэтому несопряженное реокисление QH2 может обеспечиваться альтернативной

оксидазой, предотвращая образование активных форм кислорода митохондриальной ЭТЦ в стрессовых условиях.

При исследовании влияния степени ингибирования альтернативной оксидазы на скорость генерации перекиси водорода было выяснено, что ингибирование цианид-резистентного пути вызывает экспоненциальный рост интенсивности продукции Н202 в изолированних митохондриях.

Рис. 9. Изменение интенсивности флюоресценции дигидрофлюоресциин дшцетата при добавлении ингибиторов электронного транспорта к митохондриям га гороха (левая панель) и печени крыс (правая панель). Мтх -митохондрии (0,4 мг белка на мл среды), анти - 1 рМ антимицин А, рот - 10 рМротенон, SHAM- 1 мМсалицилгидроксамат

Для изучения скорости генерации перекиси водорода митохондриями использовался флюорометрический метод. Для митохондрий из семядолей гороха показано, что при дыхании на эндогенных субстратах скорость продукции Н202 митохондриями составляет 0,1 нмоль/мин. мг белка. Добавление 2 рМ антимицина А увеличивало интенсивность генерации Н202 в 1,6 раза, 2 рМ ротенон незначительно изменял скорость данного процесса. Ингибирование альтернативной оксидазы 1 мМ SHAM чрезвычайно сильно интенсифицировало процесс генерации перекиси водорода. В этих условиях она составляла 4,27 нмоль/мин.мг белка, то есть увеличивалась более чем з 40 раз по сравнению с контролем. В качестве контроля изучалось образование Н202 митохондриями после частичной тепловой денатурации (70°С, 10 минут). Данный режим денатурации использовался для предотвращения

нарушения липидного состава мембран. Подвергнутые тепловой обработке митохондрии лишь с малой интенсивностью генерировали перекись водорода (0,05 нмоль/мин.мг белка). Добавление ротенона, антимицина и SHAM вызывало лишь незначительное изменение скорости этого процесса. Таким образом, генерация перекиси водорода вызывается не химическими реакциями, а обусловлена функционированием ферментных систем, денатурирующихся при тепловой обработке. Для митохондрий из сои и цветной капусты было показано сходное влияние на скорость образования пероксида водорода ингибиторов элекгронтранспортной цепи. При изучении процесса генерации перекиси водорода в митохондриях из печени крыс было показано, что антимицин А является индуктором генерации пероксида водорода, увеличивая скорость его образования с 0,19 до 0,4 нмоль/мин.мг белка (Рис. 9). SHAM в данной системе выступал как антиоксидант, вызывая ингибирование скорости образования Н2О2 до 0,1 нмоль/мин.мг белка, что еще раз подтверждает, что действие салицилгидроксамата в растительных митохондриях связано не с химическим образованием перекиси водорода, а с нарушением работы электронтранспортной цепи митохондрий. Изучение скорости образования 02"- митохондриями гороха с помощью спиновых ловушек и окисления эпинефрина показало, что накопление перекиси может объясняться увеличением скорости продукции супероксид-радикала.

При изучении зависимости скорости генерации супероксидрадикала от величины мембранного потенциала нами установлено, что для митохондрии из цветной капусты данная зависимость носит нелинейный характер, и снижение мембранного потенциала всего на 20% от контрольных значений приводит к двукратному снижению интенсивности генерации супероксидрадикала. Что касается влияния уровня восстановленное™ хинонов, то критическим для регуляции скорости образования АФК было снижение восстановленное™ убихинона с 70 до 40%.

Индукция альтернативной оксидазы в растительных митохондриях повышенным содержанием кислорода в атмосфере снижала скорость генерации АФК, и повышала гиперболичность зависимости скорости генерации 0{ от мембранного потенциала. Снижение дельта пси на 20% вызывает уже 3-х кратное падение скорости образования супероксида, то есть снижение мембранного потенциала является важным механизмом ограничения продукции активных форм кислорода в растительных митохондриях (Рис. 10).

О 30 -

2 20 -о

о 10 -

о ■ ___

ш о -I-,-,-,-1---1---1-'-1 г I

О 50 100 150 200 250 300

пмольО 2/мин. мг белка

Рис 10 Влияние повышенной экспрессии альтернативной оксидазы после инкубации в гипероксидной атмосфере на уровень восстановленное™

убихинона (А) и генерацию супероксидрадикала (Б) в митохондриях из

цветной капусты. 1- митохондрии из растений, инкубированных в пшероксиднои атмосфере; 2 - контрольные растения.

При изучении механизмов разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования у растений было показано, что инкубация клубней картофеля в течение 48-96 часов при температуре 4°С не вызывала иджукции альтернативной оксидазы, а приводила к снижению митохондриального ДТ. Это было установлено на основе факта, что начальный уровень ответа на сафранин (перед первой добавкой ресопрягающего агента) был ниже в митохондриях из растений, обработанных холодом. В растениях, инкубировавшихся при 4°С, накапливаются свободные жирные кислоты, так как добавка БСА повышала мембранный потенциал сильнее, чем в митохондриях из контрольных растений (Рис. 11). Свободные жирные кислоты могут играть роль дыхательных субстратов и медиаторов терморегуляторного разобщения. Чувствительность ДТ к добавкам экзогенного лаурата была также сильнее для митохондрий из обработанных холодом клубней картофеля. Добавка 30 цМ лаурата к этим митохондриям вызывала изменение оптической плотности по сафранину в 1,5 раза большее, чем в контрольных растениях.

ADP проявлял выраженный ресопрягающий эффект. Даже добавка 5 цМ ADP вызывала повышение мембранного потенциала в олигомицин-содержащей среде в присутствии микромолярных концентраций жирных кислот. С0 5 для ресопрягающего эффекта ADP составила 1.5 цМ. GDP, добавленный после жирной кислоты также вызывал ресопрягающий эффект, но он был менее эффективен (С 0.5=50 дМ) . Глутамат (4 шМ) и 2 тМ малонат не повышали ДЧ7.

GDP и ADP вызывали повышение мембранного потенциала на митохондриях картофеля также и в состоянии 4. Было показано, что ресопрягающее действие GDP и ADP было конкурентно по отношению друг к другу, то есть эффект GDP блокировался в присутствии ADP. Хотя GDP имел некоторый ресопрягающий эффект, не было установлено влияния этого нукпеотида на кинетику транспорта и фосфорилирования ADP. В присутствии или отсутствии GDP К\а для транспорта и фосфорилирования ADP составляла 160 цМ. К, для CAtr составила 20 пМ, что сопоставимо с животными митохондриями (Рис. 12). Добавка КАтр до лаурата вызывала ресопрягающий эффект, который был более выражен для митохондрий из клубней,

BSA Lau

Mito

AOP 20 цМ

8SA V*

i St(

ADP 1 ADP Lau ADP SfiM 200 цМЬ^ J iiiM 1

DNP

BSA Lau

ГЦ-

Mito

BSA

CAtr \H

Lau ADP A„n

ADP I J. ADP 5цМ

BSA DNP

. ™ J um ,

DNP

II %

2 мин

Рис. 11. Эффект инкубации in vivo при 4°C, разобщителей и некоторых ресопрягающих веществ in vitro на митохондрии из клубней картофеля.Инкубационная среда содержала 250 мМ сахарозы, 10 мМ MOPS, 0,5 мМ ЭГТА, 3 мМ КН,Р04 (pH 7.4), 100 цМ TMPD, 5 мМ аскорбат, одигомицин (2 цг/.мг белка), 2 цМ ротенон, 7 цМ сафранин О, митохондрии (0,4 мг белка/мл). Добавки: Lau-10 цМ лаурат, CAtr -1 цМ карбоксиатракгалат, DNP -100 цМ динитрофенол, BSA - 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина ______ -—

Г ¡.'г-С. НАЦИОНАЛЬНА* \

[ ' БИБЛИОТЕКА I \ С.Петербург !

I ла «МШ ЖТ I

инкубированных при 4°С. Нуклеотиды (GDP, АТР и UDP в концентрации до 2 тМ) не имели ресопрягающего эффекта после добавки КАтр. Использование же карбоксиатгакгилата при воздействии на реконструированный в протеолипосомах UCP из арабидопсиса не вызывало значимых эффектов ни в присутствии, ни в отсутствии GDP.

Атрактилат (Атр), другой ингибитор ATP/ADP антипортера в концентрации 10 цМ имел ресопрягающий эффект, который, однако, был меньше, чем при добавлении карбоксиатракгилата. Добавление КАтр после атрактилата вызывало дополнительное увеличение Д*Р. ADP после внесения 10 цМ Атр и 60 цМ лаурата приводил к повышению Д*Р. Нами изучался также ресопрягающий эффект других нежели ADP и GDP нуклеотидов. Так, в частности, АТР (200 цМ) вызывал сходное с ADP действие. 250 цМ CDP и ГОР, не приводили к значимому ресопрягающему эффекту после добавки лаурата. 250 цМ UDP увеличивал мембранный потенциал аналогично 20 цМ ADP. При изучении воздействия данного препарата UDP в концентрации до 1 шМ на митохондрии из печени крыс показано отсутствие какого-либо ресопрягающего эффекта. Предварительное внесение в среду КАтр блокировало повышение Ах¥ при добавлении 250 joM UDP.

В связи с различным ресопрягающем действием карбоксиатрактилата и атрактилата нами было изучено действие этих ингибиторов на транспорт нуклеотидов ADP/ATP антипортером. Мы исследовали снижение при добавке 100 ¡iM ADP к митохондриям, среда инкубации которых содержала фосфат, магний, TMPD и аскорбат в отсутствии олигомицина (явление дыхательного контроля). Было установлено, что добавление ADP вызывало циклическое снижение мембранного потенциала, a UDP не вызывал подобного эффекта. 10 р.М атрактилат, в отличие от олигомицина, не блокировал ADP-зависимого снижения ДЧ*.

При изучении скорости поглощения кислорода изолированными митохондриями было установлено, что лаурат не снижал, а КАтр, ADP, GDP, АТР и UDP не повышали скорости дыхания при использовании в качестве субстрата 5 шМ аскорбата (в присутствии 100 цМ TMPD и 2 цг на мг белка олигомицина). Сходные данные были получены при использовании в качестве субстрата 5 шМ сукцината. Это показывает, что снижение ДТ лауратом, так же как и его повышение КАтр и нуклеотидами не связано с ингибированием или стимуляцией дыхания.

ADP

50 SO 100 100 200 ЦМ

CAtr 8SA ONP

зз зз 6666 6.e

S.6 14 пМ \

\\ I

GDP, 1 mM

5 1

^ 2 мин ^

AOP CAtr

,50 50 100 100 200 цМ 33 33 666666 14ПМ

DNP

Рис. 12. Влияние GDP на транспорт и фосфорилирование ADP и ингибирование ATP/ADP антипортера карбоксиатракгилатом. Состав среды инкубирования и добавки аналогичны рис. 11.

Ранее были при изучении GDP-, GTP- или АТР-индуцированого повышения мембранного потенциала на фоне разобщения экзогенными жирными кислотами были получены данные о наличии функциональной активности разобщающего белка растений (PUMP) и показано участие этого белка в ограничении образования активных форм кислорода (Vercesi, 1999). Причем было показано, что разобщение дыхание и фосфорилирования жирными кислотами характерно для растений, в которых низка экспрессия альтернативной оксидазы (Sluse et al., 1998). Однако наши эксперименты показывают, что при адаптации к холоду разобщение жирными кислотами также активируется посредством ADP/ATP-антипортера. Это было характерно для клубней картофеля, где содержание альтернативной оксидазы несущественно. В наших опытах 250 рМ ADP и 1 мМ GDP не вызывали увеличения Д4? в присутствии КАтр, что свидетельствует о том, что в митохондриях из клубней картофеля уровень экспрессии UCP чрезвычайно низок и экспозиция растений на холоде увеличивает его незначительно. Другим объяснением может быть то, что холод не только повышает содержание PUMP, но и понижает чувствительность к нуклеотидам. Накопление свободных жирных кислот вызывает утечку протонов через ADP/ATP-антипортер, снижение мембранного потенциала и следовательно скорость образования активных форм кислорода.

Ранее было установлено, что содержание ротеноннечувствительных NADH дегидрогеназ существенно увеличивается при переходе растений к фотосинтетическому метаболизму (Moller, 2002). Это позволяет предположить, что одним из физиологических эффектов данного феномена является снижение скорости образования АФК по аналогии с другим несопряженным комплексом растительной ЭТЦ - альтернативной оксидазы. Необходимость подобного эффективного контроля образования АФК в фотосинтезирующися тканях обсуждалась В.П.Скулачевым (Skulachev, 1996). Нами изучался влияние света на активность сукцинатдегидрогеназы и скорость окисления сукцината митохондриями. Показано, что переход от темноте к нормальной освещенности (30 Дж м"2 с'1) активировал СДГ в зеленых листьях шпината и кукурузы в течение первых 30 минут инкубации, а затем происходило существенное снижение ее активности. Свет высокой интенсивности (60 Дж м"2 с'1) также уменьшает активность СДГ и скорость окисления сукцината в листьях. При этом возрастал вклад альтернативной оксидазы в терминальный транспорт электронов. Свет с длиной волны 660 нм

был наиболее эффективен для индукции этих эффектов. Белый и красный свет вызывали также снижение содержания мРНК, кодирующей флавопротеин СДГ. Установлено, что свет не влияет непосредственно на изолированный белок. Делается заключение, что в регулировании окисления сукцината и митохондриального темнового дыхания в целом может участвовать фитохромная система. Снижение скорости дыхания же позволяет снизить проток электронов через митохондриальную ЭТЦ и снизить вероятность образования АФК при высоком соотношении ATP/ADP и NADH/NAD4" в клетке. Кроме того для зеленых листьев нами установлена возможность обратного транспорта электронов с цитохрома с на альтернативную оксидазу с затратой мембранного потенциала. Ранее подобная возможность установлена для митохондрий семядолей фасоли (Wilson, 1978). B.Wilson также показал существование электронного потока, который ингибировался антимицином А, салицилгидроксаматом, актилгуанидином, низкими концентрациями разобщителей и олигомицином. Наличие системы, позволяющей окислять аскорбат в митохондриальной ЭТЦ, может служить для окисления цитоплазматического НАДН, который восстанавливает дегидроксиаскорбат через глутатион. Таким образом, существует принципиальная возможность обратного транспорта электронов в растительной ЭТЦ в условиях, когда высок энергетический статус клетки, то есть при интенсивном фотосинтезе или интенсивном дыхании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей представленного исследования являлось изучение роли окислительных процессов, не связаных с запасанием энергии, в адаптации организмов к изменению условий окружающей среды, когда происходит увеличение образования активных форм кислорода и происходит мобилизация запасных веществ, среди которых наиболее важную роль играют липиды, превращающиеся в жирные кислоты.

Для выяснения роли процессов «свободного окисления» нами в первую очередь были изучены условия, приводящие к интенсификации окислительных процессов, перевосстановлению пула NAD+ и возникновению в клетке состояния переполнения («overflow»), при котором возрастает роль несопряженного с запасанием энергии дыхания (Lamberts, 1982).

Ключевым процессом, связывающим ß-окисление жирных кислот и .метаболизм органических кислот, является глиоксилатный цикл, приводящий

к образованию сукцината из ацетил-СоА (рис. 13). Данный процесс играет важную роль в утилизации запасных жирных кислот и обеспечивает активацию окислительных процессов в митохондриях посредством интенсификации работы цикла Кребса через окисление сукцината комплексом ПЭТЦ.

Изоцитрат

Аконитат X

t 2-оксоглутарат

Цитрат |

| Сукцинил-СоА

Оксапоацетат j

Малат Сукцинат „ ЧФумарат^

Стимулирует протонную Н* проводимость

-------жк

Ацил-карнитин

Нейтральный липид

■Сукцинат

Цитохромный путь

Глюкозо-1 -фосфат

Цитозоль

Малат«—Сукцинат жк >

Глиоксилат *-Изоцитрат

L^-Ацетил-СоА |

♦ *""» ЖК. Аконитат

Мала^ АЦети>СоА t 3 Окетлоацетат^У^у

Рис. 13. Схема путей метаболизма жирных кислот при их интенсивной метаболизации. 1 - митохондрия: 2 - внутренняя митохондриапьная мембрана; 3 - пероксисома.

Традиционно считается, что глиоксилатный цикл, активно функционирующий в растительных тканях и у микроорганизмов, обеспечивающий интенсивную продукцию сукцината, отсутствует в животных тканях. Нами было установлено, что 5-ти дневное голодание и индукция сахарного диабета введением аллоксана вызывала активацию ключевых ферментов окисления жирных кислот в пероксисомах крыс. Образующиеся в пероксисомах FADH2 и NADH здесь же преимущественно окисляются с образованием перекиси водорода (Luster, Donaldson, 1987). То есть показано, что биохимическим механизмом утилизации жирных кислот является пероксисомальное Р-окисление и индукция ферментов

глиоксилатного цикла. Окисление жирных кислот не связано с аккумуляцией энергии и, в первую очередь, обеспечивает глюконеогенетические процессы для компенсации затрат углеводов в голодающих тканях Ключевые ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза обнаруживаются в печени крыс на третий день голодания и достигают максимального значения активности к 5 дню пищевой депривации.

Интенсивное образование сукцината в жирозапасающих тканях семян при прорастании высших растений также' обеспечивается за счет метаболизации жирных кислот и функционирования глиоксилатного цикла (Beevers, 1968). Изучение влияния ингибиторов на метаболизм меченого сукцината показало, что в проростках семян злаковых растений, таких как кукуруза и пшеница, процесс окисления сукцината не чувствителен к теноилтрифторацетону (ТТФА) - ингибитору СДГ. После разделения клеточных органелл с помощью изоплотностного центрифугирования было показано, что сукцинат метаболизируется не только в митохондриях, но и в глиоксисомах, причем в микротельцах сукцинат превращается в малат. В результате последующих исследований нами был обнаружен, частично очищен и охарактеризован фермент, обеспечивающий данный процесс -глиоксисомальная сукцинатоксидаза (ГСО), катализирующая окисление сукцината в малат с образованием перекиси водорода (рис. 13). Квинакрин -ингибитор флавиновых оксидаз, подавлял процесс глиоксисомального окисления сукцината. Это позволяет предположить, что изучаемая нами ферментная система является флавинсодержащей. Активность ГСО коррелирует с интенсивностью протекания глиоксилатного цикла и достигает максимального значения 0,17 ФЕ на 1 г сырой массы на 4 день прорастания семян. Наличие в глиоксисомах жирозапасающей ткани семян злаков альтернативной системы, окисляющей сукцинат, по-видимому, позволяет осуществлять регуляцию распределения сукцината, интенсивно образующегося при работе глиоксилатного цикла. При низких концентрациях субстрата активность ГСО незначительна, основная часть сукцината транспортируется в митохондрии и окисляется через СДГ. При прорастании мобилизация жирных кислот для глюконеогенеза приводит к резкой интенсификации образования янтарной кислоты. Митохондриальная сукцинатдегидрогеназа ингибируется при накоплении ATP, NADH, оксалоацетата и СОг и не может обеспечивать ее быстрое окисление. И в этой ситуации очевидно выгодным является быстрое окисление, не связанное с

запасанием энергии, которое осуществляется глиоксисомальной сукцинатоксидазой. В настоящее время обнаружена аналогичная система окисления NADH в растительных пероксисомах (Lopez-Huertas et al., 1999).

Еще одной функцией свободного окисления является контроль образования активных форм кислорода. Генерация АФК является «врожденным» свойством аэробного метаболизма. Супероксид как побочный продукт постоянно продуцируется митохондриями при окислении субстратов дыхания (Chance et al., 1979). Только за счет этого, неразрывно связанного с жизнью процесса, в теле человека ежедневно генерируется около 10 грамм супероксида (Halliwell, 1994).

Специальные молекулы-антиоксиданты, такие как а-токоферол, витамин С, каротиноиды, карнозин, ' ансерин, глутатион, защищают клетки путем не-ферментативных реакций с АФК. Ферменты, обнаруженные во всех аэробных клетках, такие как супероксиддисмутаза, глутатион-пероксидаза, каталаза, призваны снижать общую концентрацию АФК за счет избирательных реакций с отдельными их видами. Во многих клетках также существуют специальные белки, особым образом связывающие ионы меди и железа, делая их недоступными для реакций с кислородом и генерации АФК. Помимо этого, практически любые клетки имеют разнообразные ферменты, репарирующие повреждения, вызванные АФК (Halliwell, 1994; Skulachev, 1996).

Но в данной работе приведены экспериментальные данные о том, что образование активных форм кислорода может подавляться как за счет снижения мембранного потенциала при разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования жирными кислотами через ATP/ADP антипортер или транспорте электронов через альтернативную оксидазу, так и за счет того, что несопряженное с генерацией энергии свободное окисление дыхательных субстратов кислородом является основным способом снижения уровня кислорода в клетках, необходимого для образования АФК. Аналогично функционируют оксидазы дыхательной защиты бактерий, механизм "мягкого разобщения" у животных (Dalton, Postgate, 1969; Starkov et al., 1996).

Обработка растений повышенной концентрацией кислорода, пониженной температурой, интенсивное освещение вызывали накопление продуктов перекисного окисления липидов и индукцию альтернативной оксидазы. В тех митохондриях, где наблюдается индукция АОХ

(обработанный охлаждением перец и инкубированная при повышенной концентрации кислорода цветная капуста) продукция перекиси водорода понижена по сравнению с контролем.

Показано, что для растительных митохондрий незначительное снижение мембранного потенциала (на 15-20%) вызывает 2-х кратное снижение скорости генерации АФК. Подобный эффект существенно усиливается при переключении потока электронов от убихинона с цитохромного пути к альтернативной оксидазе. Bfcmo показано, что в тканях с высоким уровнем экспрессии альтернативной оксидазы добавление SHAM значительно ускоряло продукцию перекиси водорода и супероксидрадикала, то есть альтернативная оксидаза может участвовать в регуляции образования активных форм кислорода. Другим механизмом снижения продукции АФК является снижение мембранного потенциала (Korshunov et al., 1997). При инкубация при 4°С в клубней картофеля активность альтернативной оксидазы не изменялась, а наблюдалась аккумуляция свободных жирных кислот и разобщение митохондрий жирными кислотами в клубнях картофеля, частично опосредованое функционированием ATP/ADP антипортера. Индукция несопряженного или разобщенного дыхания, то есть процессов свободного окисления, по-видимому, обеспечивает как снижение мембранного потенициала и поддержание компонентов элекгронтранспортной цепи относительно окисленными, так и снижение внутритканевой концентации кислорода по подобию дыхательной защиты у A.vinelandi. Оба этих механизма могут снижать скорость образования активных форм кислорода.

Особое место занимает окисление дыхательных субстратов в пероксисомах. Эти органоиды, имеющиеся почти во всех эукариотических клетках, производят перекись водорода как побочный продукт окисления жирных кислот и других органических соединений. Все микротельца содержат специфическую систему переноса электронов, характеризующуюся образованием и эффективной детоксикацией перекиси водорода и не связанную с генерацией протонного потенциала и синтезом АТР. Учитывая отсутствие ДНК в этих органоидах клетки, можно предположить, что в процессе эволюции ферменты, осуществляющие быстрое, несопряженное окисление, связанное с одноэлектронным переносом и генерацией активных форм кислорода, оказались компартментированы в специальном органоиде, насыщенном супероксиддисмутазой, каталазой и пероксидазой (De Duve, 1983), где подобное "опасное производство" не может повреждать систему

переноса генетической информации. Можно предположить, что появление современных разновидностей микротелец являлось одним из дополнительных механизмов защиты ДНК-содержащих компартментов от активных форм кислорода.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что мобилизация жирных кислот может быть связана с работой глиоксилатного цикла как в растительной, так и в животной клетках. Пероксисомы из печени голодающих крыс и крыс с экспериментальным диабетом содержат ключевые ферменты (3-окисления и глиоксилатного цикла, то есть являются глиоксисомами.

2. Установлено, что в печени крыс при голодании происходит индукция ферментов глиоксилатного цикла: изоцитратлиазы, малатсинтазы, аконитатгидратазы, цитратсинтазы и малатдегидрогеназы. Изоцитратлиаза и малатсинтаза впервые появляются в печени на 3-ий день пищевой деп-ривации, а для малатдегидрогеназы на 5-ый день голодания обнаруживается новая пероксисомальная изоформа.

3. Получена в гомогенном состоянии изоцитратлиаза из животных тканей. Изоцитратлиаза из печени крыс имела удельную активность 9,04 ФЕ/мг белка, ее выход при очистке составил 8,2%, а степень очистки равнялась 100,5. Показано, что ИЦЛ из животных и растительных тканей имеют сходные физико-химические и каталитические свойства. Установлено, что АОР является активатором, а глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат являются конкурентными ингибиторами изоцитратлиазы из печени крыс.

4. Метаболизация жирных кислот через глиоксилатный цикл при прорастании семян масличных растений обеспечивается активацией пероксисомального окисления, в частности установлено, что в жирозапасающих органах злаковых растений функционирует гли-оксисомальное окисление сукцината до малата с образованием перекиси водорода.

каталитических свойств данного фермента показало, что он обладает значительно меньшим сродством к субстрату, чем митохондриальная сукцинатдегидрогеназа.

6. Ингибирование альтернативной оксидазы салицилгидроксамовой кислотой приводило к значительному увеличению скорости генерации перекиси водорода растительными митохондриями при окислении сукцината. Антимицин А, ингибирующий элекгронтранспортную цепь митохондрий за счет блокирования работы Q-цикла, увеличивал интенсивность индуцируемой SHAM продукции АФК. Сделано предположение, что одной из функций альтернативной оксидазы является защита митохондриальной ЭТЦ от избыточной генерации активных форм кислорода.

7. Содержание альтернативной оксидазы в растительных митохондриях увеличивается при инкубации растений в атмосфере с повышеным содержанием кислорода, при низких температурах, интенсивном освещении. Индукция альтернативной оксидазы приводила к снижению скорости образования активных форм кислорода.

8. Ускорение митохондриального дыхания в митохондриях клубней картофеля достигается аккумуляцией свободных жирных кислот и разобщением дыхания и окислительного фосфорилирования жирными кислотами через ATP/ADP антипортер. Снижение мембранного потенциала на 20% приводило к 2-3 кратному снижению скорости образования АФК. Присутствие альтернативной оксидазы увеличивало нелинейность этой зависимости.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ по теме диссертации

1. Епринцев А.Т., Попов В.Н. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях. // Воронеж, Изд-во Воронежского госуниверситета, 1999, 191 с.

2. Игамбердиев А.У., Попов В.Н., Фалалеева М.И. Особенности метаболизма сукцината в жирозапасающей ткани прорастающих семян злаков И Физиология растений. 1995. Т. 42, N1, С. 100-105.

3. Igamberdiev A.U., Popov V.N., Falaleeva M.I. Alternative system of succinate oxidation in glyoxysomes of higher plants. // FEBS Letters. 1995. 367, 287-290.

4. Игамбердиев А.У., Попов В.Н. Роль реакций переаминирования в метаболизме сукцината в эндосперме проростков клещевины // Физиология растений. 1996. Т. 43. Вып.4.548-553.

5. Popov V.N., Igaraberdiev A.U., Schnarrenberger С., Volvenkin S.V. Induction of the Glyoxylate Cycle Enzymes in Rat Liver upon Food Starvation // FEBS Lett. 1996. 390, p. 258-260.

6. Попов B.H., Игамбердиев А.У., Волвенкин C.B. Очистка и свойства изоцихратлиазы и малатсинтазы из печени голодающих крыс // Биохимия. 1996. Т. 61. Вып. 10, С. 1902-1907.

7. Popov V.N., Siraonyan R.A., Skulachev V.P., Starkov A.A. Inhybition of alternative oxydase induses H202 production in plant mitochondria // FEBS Letters, 1997 V. 415, N1, P. 87-90.

8. Popov V.N. , Volvenkin S.V., Eprintcev A.T., Igamberdiev A.U. Presence of Glyoxylate Cycle Enzymes in Liver of Alloxan-Treated Rats // FEBS Letters 1998, V.440. P. 55-58.

9. Волвенкин С. В., Попов В.Н., Епринцев А. Т. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом. //Биохимия. 1999. Т.64, Вып. 9. С. 35-41.

10. Попов В.Н., Волвенкин С.В., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс // Известия РАН, Серия биологическая 2000, N6, С.663-667.

11. Попов В.Н., Волвенкин С.В., Косматых Т.А., Алеид Суад, Епринцев А.Т. Индукция изоформ малатдегидрогеназы в печени крыс при пищевой депривации // Биохимия. 2001. Т. 66, N 5, С. 617-623.

12. Popov V.N., Purvis А.С., Skulachev V.P, Wagner A.M. Stress-induced changes in ubiquinone concentration and alternative oxidase in plant mitochondria // Bioscience Reports. 2001. V. 21, N 3. P. 369-379.

13. Popov V., Markova O., Mokhova E., Skulachev V.P. Effects of in vivo cold exposure and in vitro uncouplers and recouplers on potato tuber mitochondria // Biochem. Biophys. Acta. 2002 V. 1553, P. 232-237.

14. Трухина Ю.О. Метальникова E.A., Попов B.H., Епринцев А.Т. Субклеточная локализация и выделение оксалоацетатдекарбоксилазы из листьев кукурузы. // Физиология растений. 2002. Т. 49, Вып. 5, С. 711-717.

15. Епринцев А.Т., Семенова Е.В., Попов В.Н. Индукция изоферментов аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс // Биохимия. 2002. Т. 67, N 7. С. 959-966.

16. Попов В.Н., Рууге Э.К., Старков А.А. Влияние ингибиторов электронного транспорта на образование активных форм кислорода при окислении сукцината митохондриями гороха // Биохимия. 2003. Т. 68, N 7. С. 910-916.

17. Popov V.N., Eprintcev A.T., Igamberdiev A.U. The separation and charachterisation of glycolate oxydase from maize mesophill and shuttle bindle cells // J. Plant Physiol. 2003. V 160, N 8. P. 851-857.

18. Popov V.N. Possible role of free oxidation processes in regulation of reactive oxygen species production in plant mitochondria (review) // Biochem. Soc. Transactions. 2003. V. 31, N. 6, P. 1322-1325.

19. Popov V.N., Plauman M., Schnarrenberger C. Regulation of succinate dehydrogenase activity in plants by light // Planta. 2003. V.218, N 2. P. 188-193.

20. Епринцев A.T., Шевченко М.Ю., Попов B.H. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки Papilio machaon LЛ Биохимия. 2003. Т. 68, N 12. С. 1931-1936.

21. Pinheiro M.A.A., Popov V.N., Eprintsev А.Т., Igamberdiev A.U. The tricarboxylic acid cycle transformation in conditions of intensive gluconeogenesis in castor bean endosperm // Plant Physiol, and Biochem. 1996. Special issue, P. 118.

22. Popov V.N., Igamberdiev A.U. The role of redused oxygen species in succinate oxidation in glyoxysomes of higher plants // Book of Abstracts of 2nd International conference "Oxygen, free radicals and environmental stress in plants", Vienna, Austria, 1996, P. 65.

23. Skulachev V.P., BertsovaYu., Bogachev A.V., Korshunov S.S., Popov V.N., Simonyan R.A., Starkov A.A. "Respiratory Protection: Role of non-coupled and uncoupled respiratory Chains in preventing 0{ formation" // Abstracts of Meeting in Honnor of Licio Azzone "New Perspectives in Mitochondrial Research", Padova (Italy), September 18-21, 1997, P.46-47.

24. Popov V.N., Starkov A. Alternative Oxidase as a Possible Pathway of Oxygen Stress Preservation in Plant Mitochondria // 11 Congress of Federation of European Societies of Plant Physilogy, Varna, Bulgaria 7-11 September 1998. Bulgarian Journal of Plant Physilogy, V 45(suppl.), P.101.

25. Popov V.N., Simonian R.A., Skulachev V.P., Starkov A.A Inhybition of alternative oxidase increases production of H202 in plant mitochondria. // JUBMB-JUPAB Bioenergetic group-Tenth European Bioenergetics Conference (Goteborg, Sweeden). EBEC Reports, 1998, V.10, P. 123

26. Попов B.H., Епринцев A.T., Игамбердиев А.У. Влияние света на метаболизм растений семейства Толстянковые.// Тезисы докладов Съезда Русского ботанического общества, 1998, Санкг Петербург, С.68.

27. Попов В.Н., Старков А.А. Ингибирование альтернативной оксидазы в растительных митохондриях стимулирует продукцию восстановленных форм кислорода. // Тезисы докладов 4 съезда Общества физиологов растений. Москва, 1999. С. 86-87.

28. Попов. В.Н. Индукция альтернативной оксидазы и убихинона в митохондриях высших растений стрессовыми условиями // Материалы 9 международной конференции молодых ботаников. 2000. СпБ: Ботанический институт, с. 59.

29. Popov V.N., Wagner A.M. The relationships between the rate of respiration, ubiquinone reduction, membrane potential and superoxide production in cauliflower mitochondria // Abstract Book of 5th Conference on Oxygen, Free Radicals and Oxidative Stress in Plants. Nice, 2001. P. 78

, 30. Семенова E.B., Косматых T.A., Шевченко М.Ю., Попов В.Н., Епринцев, А.Т. Использование метода ионообменной хроматографии для разделения множественных форм аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы из гепатоцигов крыс // Теория и практика сорбционных процессов. 2001. Т. 1, Вып.1., С. 96-101.

31. Епринцев А.Т., Семенова Е.В., Попов В.Н. Очистка изоформ аконитатгидратазы методом ионообменной хроматографии из гепатоцитов голодающих крыс // Теория и практика сорбционных процессов. 2001. Т. 1, Вып.2., С. 257-263/ ■

32. Епринцев А.Т., Семенова Е.В., Попов В.Н. Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс // Вестник ВГУ, Серия химия, биология. 2001, N1, С. 55-58.

33. Попов В.Н. Участие ATP/ADP антипортера в разбщающем эффекте жирных кислот в растительных митохондриях // Тезисы докладов III Съезда Биохимического общества. СПб 2002, С. 258.

34. Popov V. N. ATP/ADP antiporter participates in fatty acids mediated uncoupling in potato mitochondria // Biochem. Biophys. Acta (Bioenergetics), EBEC Short Reports, 2002, V. 12, P. 269.

35. Попов B.H., Москалёв E.A., Зузу M., Шевченко М.Ю., Епринцев А.Т. Разработка праймеров и проведение ПЦР для идентификации гена изоцитратлиазы в геноме животных // Вестник ВГУ, Серия химия, биология. 2003, N2, С. 77-82.

36. Popov V., Wagner A.M., Krab K.Ccr.tro! of superoxide production in caulliflower mitochondria // Stress, Signalling and Control. Abstracts of Biochem. Soc. Meeting 679.2003. P. 50.

37. Popov V.N., Plauman M., Schnarrenberger C. Succinate dehydrogenase activity depends on light in plant mitochondria // Abstracts of XII International Congress "Genes, Genes Families and Isozymes". 2003. P. 35.

Заказ № 472 от 31.07.2003 г. Тираж 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

2.003-/I f 13465

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Попов, Василий Николаевич

Введение

I. Литературный обзор

Глава 1. Активные формы кислорода и биохимическая адаптация окислительных процессов у растений и животных

1.1. Стресс, как совокупность ответных реакций организма на изменения условий окружающей среды

1.2. Окислительный стресс, генерация активных форм кислорода и «свободное т окисление» как способ защиты от них

1.3. Возникновение гипоксических состояний при прорастании семян и механизмы адаптации к дефициту кислорода

1.4. Изменение температуры окружающей среды как фактор, регулирующий окислительные процессы

Глава 2. Биохимические механизмы свободного окисления дыхательных субстратов 40 2.1. Пути несопряженного транспорта электронов в митохондриях

2.1.1. Общая характеристика сукцинатдегидрогеназной системы

2.1.1.1. Регуляция активности СДГ

2.1.1.2. Экспрессия и репрессия генов СДГ

2.1.2. Несопряженное окисление в ЭТЦ растительных митохондрий при различных физиологических состояниях клетки

2.1.2.1. Альтернативная оксидаза

2.1.2.2. Ротенон-нечувствительные НАДН и НАДФН дегидрогеназы

2.1.2.3. Явление монополизации ЭТЦ

2.1.3. Электронный транспорт, несопряженный с запасанием энергии, у 1 бактерий.

2.2. Механизмы увеличения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий эндогенными и искусственными разобщителями 67 2.3. Пероксисомы - органоиды, совмещающие несопряженное окисление и детоксикацию активных форм кислорода

2.3.1. Микротельца и их метаболическая функция

2.3.2. Трансформации жиров в углеводы и ее связь с пероксисомами

2.3.3. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза

2.3.3.1. Распространение и локализация глиоксилатного цикла

2.3.3.2. Экспрессия и регуляция работы глиоксилатного цикла

2.3.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных

2.3.3.4. i-гёйоёа ё naiendaa ё^бёоЗабёёа^О ёд дкдёё-гшб ldaaie^iia

II. Объекты и методы исследования

Глава 3. Использованные материалы и методы

3.1. Объекты исследования

3.2. Выделение клеточных органелл

3.3. Определение активности ферментов

3.4. Выделение и очистка ферментов

3.4.1. Экстракция

3.4.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

3.4.3. Гель-фильтрация

3.4.4. Ионообменная хроматография

3.5. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов

3.6. Радиоизотопные исследования

3.7. Аналитический электрофорез

3.8. Определение молекулярной массы

3.9. Анализ интенсивности дыхания митохондрий, мембранного потенциала, уровня восстановленности хинонов и скорости генерации активных форм кислорода

ЗЛО. Блотинг-анализ

3.11. Определение количества белка

3.12. Определение содержания хлорофилла

3.13. Статистическая обработка экспериментальных данных 115 III. Результаты исследования.

Глава 4. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в животных тканях при голодании и индуцированном диабете как биохимический механизм ускоренной мобилизации запасных липидов

4.1. Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при голодании

4.2. Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при экспериментальном диабете

4.2.1. Разработка модели экспериментального диабета

4.2.2. Индукция ферментов глиоксилатного цикла при экспериментальном диабете

4.3. Изучение субклеточной локализации глиоксилатного цикла в животных тканях

4.4. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс и изучение ее свойств

4.5. Изучение малатсинтазы из печени голодающих крыс

4.6. Индукция изоформ малатдегидрогеназы в печени крыс при пищевой депривации

4.7. Индукция аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс

Глава 5. Альтернативный путь окисления сукцината в глиоксисомах жирозапасающих растений индуцируется при прорастании

5.1. Влияние ингибиторов метаболизма на декарбоксилирование меченого сукцината

5.2. Метаболизм 2,3-14С-сукцината щитками кукурузы

5.3. Окисление сукцината изолироваными глиоксисомами

5.4. Влияние сукцината на интенсивность гашения супероксидных радикалов

5.5. Характеристика глиоксисомальной сукцинатоксидазы из щитка злаковых

Глава 6. Влияние индукции несопряженного и разобщенного окисления в митохондриях на образование активных форм кислорода

6.1.Холод как фактор, регулирующий несопряженное и разобщенное окисление в растительных митохондриях 183 6.1.1 Инкубация растений при пониженных температурах приводит к ускорению

0 дыхания митохондрий и индукции альтернативной оксидазы

6.1.2. Разобщенное дыхание митохондрий как механизм адаптации к холоду в митохондриях из клубней картофеля

6.2. Роль процессов "свободного окисления" в адаптации растений к атмосфере с повышенным содержанием кислорода и регуляции образования активных форм кислорода

6.2.1. Гипероксидная атмосфера индуцирует несопряженное окисление сукцината с помощью альтернативной оксидазы

6.2.2. Ингибирование альтернативной оксидазы приводит к ускорению генерации активных форм кислорода в растительных митохондриях

6.3. Влияние светового режима на окислительные процессы в растительных митохондриях.

6.3.1. Влияние света на активность ферментов цикла Кребса, фото дыхания и функционирование ЭТЦ митохондрий в высших растениях

6.3.2. Красный свет как регулятор активности сукцинатдегидрогеназы 245 6.4 Роль реакции переаминирования в превращении сукцината в эндосперме клещевины при прорастании 256 IV. Заключение 272 Выводы 277 Список использованной литературы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АО, АОХ альтернативная оксидаза

АОА - аминооксиацетат

Атр - атрактилат

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГАМК- у-аминомасляная кислота

ГСО - глиоксисомальная сукцинатоксидаза

ГЦ - глиоксилатный цикл

ДТТ - дитиотрейтол

ДХФИФ- дихлорфенолиндофенон

ИЦЛ - изоцитратлиаза

КАтр - карбоксиаттрактилат

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогеназа мс - малатсинтаза

ПЯК - полуальдегид янтарной кислоты пякдг- дегидрогеназа полуальдегида янтарной кислоты сдг- сукцинатдегидрогеназа

СУР - сукцинат: убихинон редуктаза

ТТФА- теноилтрифторацетон

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ФМС - фенозинметасульфат

ФР - фумаратредуктаза цтк - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА - этиленглицеринтетрауксусная кислота

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

ЯК - янтарная кислота

ВНАМ - бензогидроксамовая кислота

CoQ"*, Q"e- убисемихинон

CRP - сАМФ рецептирующий белок

DNP - динитрофенол

FCCP - карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон

FNR - регуляторная система восстановления фумарата и нитрата

Q -QH2 -QPs -SHAMубихинон COQубихинол CoQHg цитохром b обогащенная фракция салицилгидроксамовая кислота

TMPD- N,N,N',N' тетраметил-п-фенилендиамин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода"

Актуальностьпроблемы. Существование множественных

I метаболических путей, обеспечивающих сходные процессы, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма, как целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным факторам. И в этой связи одним из важнейших направлении является изучение клеточного " дыхания, которое может обеспечивать клетку энергией, а может быть не сопряженно с запасанием энергии, и его координация с метаболизмом различных классов органических соединений. Это относится и к окислительному метаболизму митохондрий и пероксисом в период интенсивного функционирования глиоксилатного цикла, так как организация метаболизма жирных кислот представляет особый интерес. Нейтральные липиды являются основной запасной формой органического вещества и от возможности их щ быстрой утилизации зависит скорость адаптации организма. Р-окисление жирных кислот может протекать как в митохондриях, обеспечивая энергетические потребности клетки, так и в пероксисомах (Lazarow, 1978). Органеллы эти интересны тем, что протекающие здесь окислительные процессы не связаны с запасанием АТР. Образующиеся в пероксисомах NADH и FADH2 окисляются там же кислородом с образованием супероксидрадикала и перекиси водорода (Luster, Donaldson, 1987; Lopez-Huertas et al., 1999). Пероксисомы изолированы мембраной от цитоплазмы и образующиеся там активные формы Ш кислорода немедленно детоксицируются присутствующими в избытке супероксиддисмутазой, каталазой, пероксидазой. Основными субстратами, окисляемыми в пероксисомах, являются жирные кислоты, особенно в период интенсивного использования запасных липидов для глюконеогенеза. Процесс мобилизации запасных жиров для синтеза углеводов, по-видимому, протекает во всех живых организмах. Однако, для тканей высших животных биохимический механизм данного процесса остается невыясненным (Лебкова, 2000). Считается, что окисление липидов может приводить к образованию кетоновых тел и их последующему вовлечению в энергетический обмен. Наличие ферментов Р-окисления жирных кислот в животных пероксисомах (Lazarow, 1978) и феномена ресинтеза гликогена в печени крыс при глубоком голодании (Лебкова, 1984) позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла, позволяющих конденсировать две молекулы ацетил-КоА, образующегося при р -окислении, в сукцинат как это происходит в растительной и бактериальной клетках.

Принято считать, что сукцинат, интенсивно образующийся в глиоксилатном цикле, при прорастании жирозапасающих семян далее окисляется в отрезке цикла Кребса до оксалоацетата и последний вступает в глюконеогенез. Однако нет данных о том, сбалансирована ли скорость глиоксисомальных и митохондриальных процессов, особенно в период максимальной активности глиоксилатного цикла. Кроме того, известно, что для функционирования глюконеогенетического пути необходимо высокое содержание в клетке восстановленных пиридиннуклеотидов и АТФ, тормозящее работу электронтранспортной цепи митохондрий, в частности, сукцинатдегид-рогеназного комплекса (Affourtit et al., 2001). Таким образом, есть основание предполагать наличие альтернативных путей окисления сукцината в период прорастания масличных семян.

Кроме того, функционирование митохондрий в условиях высокого соотношения НАДН/НАД+ и АТФ/АДФ и высокого мембранного потенциала, а так же при повышенных концентрациях кислорода, при пониженных температурах, засухе, поранениях может приводить к генерации активных форм ^ кислорода (супероксид-радикала, перекиси водорода, гидроксил-радикала), способных повреждать митохондриальную ДНК (Skulachev, 1996). Ранее было показано, что клеточное дыхание in vivo в норме происходит не только сопряженно с запасанием энергии, но и без такого сопряжения. Второй тип дыхания был назван свободным. Было высказано предположение, что свободное окисление участвует в терморегуляторном термогенезе, в образовании или jk разрушении метаболитов, детоксикации ксенобиотиков и даже (косвенно) в запасании энергии (Скулачев, 1989), и было предположено, что понижение внутриклеточной концентрации О2, приводящее к ограничению образования АФК, также является специфичной функцией дыхательной системы клетки (Скулачев, 1994). Этот процесс и наличие защитных механизмов активно изучались для животных тканей и микроорганизмов, но остаются относительно малоисследованными для растительных митохондрий. Так, в частности, было щ показано участие так называемого «мягкого» разобщения у животных и дыхательной защиты у Azotobacter vinelandi в регуляции скорости образования активных форм кислорода. Растительные митохондрии обладают широким спектром путей свободного окисления, роль которых возрастает при адаптации к повышенным или пониженным температурам, изменению состава атмосферы и светового режима. Наличие в растительных митохондриях альтернативной оксидазы, работа которой не связана с образованием АТФ и генерацией протонного потенциала, определяет возможность либо сопряженного окисления убихинола через цитохромный путь, либо быстрое несопряженное окисление через альтернативную оксидазу, вызывающее термогенез (Wagner, Moore, 1997).

В этой связи ключевым является вопрос об участии путей несопряженного и разобщенного окисления в регуляции образования активных форм кислорода.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение роли процессов свободного окисления в мобилизации запасных липидов и защите организма от избыточной генерации активных форм кислорода. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние факторов, индуцирующих липолиз и р-окисление * жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на функционирование глиоксилатного цикла и окислительных процессов в пероксисомах.

3. Выделить отдельные ферменты, обеспечивающие функционирование щ глиоксилатного цикла, изучить их физико-химические, каталитические характеристики и регуляцию.

5. Выявить механизмы генерации активных форм кислорода в растительных митохондриях и роль процессов свободного окисления в регуляции этого процесса.

Научная новизна работы. Исследование влияния факторов, индуцирующих липолиз и р-окисление жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на пероксисомальный метаболизм показало, что мобилизация запасных липидов связана с несопряженным окислением в пероксисомах и работой глиоксилатного цикла как в растительных, так и в животных тканях. Впервые для тканей млекопитающих (для печени и почек крыс) показана индукция ферментов глиоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат направлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса клетки. Установлено, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в микротельцах животных тканей. Наличие в этих органоидах ферментов р -окисления жирных кислот позволяет считать их полноценными глиоксисомами. Впервые получен гомогенный препарат изоцитратлиазы из животной ткани, изучены его физико-химические свойства и показана регуляция активности данного фермента сахарофосфатами.

Установлено, что интенсивное образование янтарной кислоты в глиоксилатном цикле приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так, при прорастании семян злаковых обнаруживается глиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является быстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сук-цината непосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль электронтранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины в период интенсивной работы глиоксилатного цикла при прорастании происходит шунтирование цикла Кребса через аминотрансферазные реакции, что позволяет I обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной метаболизации сукцината.

Показано, что пониженная температура, атмосфера с повышенным содержанием кислорода и увеличение интенсивности света - факторы, активирующие образование активных форм кислорода (Mcintosh, 1999), интенсифицируют процессы свободного окисления. В частности, показана ш активация цианидрезистентной альтернативной оксидазы и разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования свободными жирными кислотами посредством ATP/ADP антипортера. Обнаружено, что ингибирование альтернативной оксидазы приводит к значительному увеличению интенсивности генерации перекиси водорода митохондриальной электронтранспортной цепью, и что скорость продукции АФК коррелирует с активностью альтернативной оксидазы. То есть альтернативная оксидаза может выступать защитным ф механизмом, снижающим образование активных форм кислорода, а индукция свободного окисления", по-видимому, представляет собой универсальную стратегию защиты от стрессоров различной природы, вызывающих генерацию активных форм кислорода.

Представленные данные важны для получения новых сортов растений, обладающих повышенной экспрессией механизмов устойчивости к холоду.

Обнаружение феномена индукции глиоксилатного цикла при голодании в печени высших животных может служить основой для разработки тест-систем обнаружения нарушений обмена веществ, связанных с мобилизацией запасных жиров. На основе полученных данных о существовании альтернативной глиоксисомальной сукцинатоксидазы, специфичной для растений семейства злаковых, возможна разработка гербицидов, частично ингибирующих основной путь окисления сукцината - сукцинатдегидрогеназу и подавляющих развитие растений, не обладающих альтернативной системой окисления янтарной кислоты.

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на IX (Брно, Чехия, 1994 г.), X (Флоренция, Италия, 1996) и XI (Варна, Болгария, 1998) Конгрессах Федерации европейских обществ физиологов растений; 12-ой Европейской биоэнергетической конференции (Аркашон, Франция, 2002); 2-ой (Вена, Австрия, 1996) и 5-ой (Ницца, Франция, 2001) конференции «Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс»; школе ФЕБО «Митохондрии в жизни и смерти клетки» (Москва, 2001); Всероссийском совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001); 4 съезде Общества физиологов растений (Москва, 1999); Съезде Русского ботанического общества (Санкт Петербург, 1998); Международном совещании "Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты" (Сыктывкар, 1995); ежегодных научных сессиях Воронежского государственного университета (1996-2002) и биоэнергетическом семинире НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ (2002-2003). Результаты, представленные в работе удостоены Премии Европейской академии для молодых ученых СНГ за 1997 и Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся достижения в области науки и техники для молодых ученых за 1998 год.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 6 глав, 312 страниц, 64 рисунка, 35 таблиц. В работе использовано 465 литературных источников.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава 1. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ У РАСТЕНИЙ И

ЖИВОТНЫХ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Попов, Василий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что мобилизация жирных кислот может быть связана с работой глиоксилатного цикла как в растительной, так и в животной клетках. Пероксисомы из печени голодающих крыс и крыс с экспериментальным диабетом содержат ключевые ферменты р-окисления и глиоксилатного цикла, то есть являются глиоксисомами.

2. Установлено, что в печени крыс при голодании происходит индукция ферментов глиоксилатного цикла: изоцитратлиазы, малатсинтазы, аконитатгидратазы, цитратсинтазы и малатдегидрогеназы. Изоцитратлиаза и малатсинтаза впервые появляются в печени на 3 день пищевой депривации, а для малатдегидрогеназы на 5 день голодания обнаруживается новая пероксисомальная изоформа.

3. Получена в гомогенном состоянии изоцитратлиаза из животных тканей. Изоцитратлиаза из печени крыс имела удельную активность 9,04 ФЕ/мг белка, ее выход при очистке составил 8,2%, а степень очистки равнялась 100,5. Показано, что ИЦЛ из животных и растительных тканей имеют сходные физико-химические и каталитические свойства. Установлено, что ADP является активатором, а глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат являются конкурентными ингибиторами изоцитратлиазы из печени крыс.

5. Выявлено, что глиоксисомальная сукцинатоксидаза является флавинсодержащим ферментом, максимальная активность которого обнаруживается на четвертый день прорастания семян злаковых растений и ее активность корелирует с работой глиоксилатного цикла. Изучение каталитических свойств данного фермента показало, что он обладает значительно меньшим сродством к субстрату, чем митохондриальная сукцинатдегидрогеназа.

6. Ингибирование альтернативной оксидазы салицилгидроксамовой кислотой приводило к значительному увеличению скорости генерации перекиси водорода растительными митохондриями при окислении сукцината растительными митохондриями. Антимицин А, ингибирующий электронтранспортную цепь митохондрий за счет блокирования работы Q-цикла, увеличивал интенсивность индуцируемой SHAM продукции АФК. Сделано предположение, что одной из функций альтернативной оксидазы является защита митохондриальной ЭТЦ от избыточной генерации активных форм кислорода.

7. Содержание альтернативной оксидазы в растительных митохондриях увеличивается при инкубации растений в атмосфере с повышеным содержанием кислорода, при низких температурах, интенсивном освещении. Индукция альтернативной оксидазы приводило к снижению скорости образования активных форм кислорода.

8. Ускорение митохондриального дыхания в митохондриях клубней картофеля достигается аккумуляцией свободных жирных кислот и разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования жирными кислотами через ATP/ADP антипортер. Снижение мембранного потенциала на 20% приводило к 2-3 кратному снижению скорости образования АФК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для выяснения роли процессов «свободного окисления» нами в первую очередь были изучены условия, приводящие к интенсификации окислительных процессов, перевосстановлению пула NAD+ и FAD и возникновению в клетке состояния переполнения («overflow»), при котором существенно возрастает роль несопряженного с запасанием энергии дыхания (Lamberts, 1982).

Ключевым процессом, связывающим Р-окисление жирных кислот и метаболизм органических кислот, является глиоксилатный цикл, приводящий к образованию сукцината из ацетил-СоА (рис. 64). Данный процесс играет важную роль в утилизации запасных жирных кислот и обеспечивает активацию окислительных процессов в митохондриях посредством интенсификации работы цикла Кребса через окисление сукцината комплексом II ЭТЦ.

Традиционно считается, что глиоксилатный цикл, активно функционирующий в растительных тканях и у микроорганизмов и обеспечивающий интенсивную продукцию сукцината, отсутствует в животных тканях.

Нами было установлено, что 5-ти дневное голодание и индукция сахарного диабета введением аллоксана вызывала активацию ключевых ферментов окисления жирных кислот в пероксисомах крыс.

Рис. 64. Схема метаболизма янтарной кислоты в стрессовых условиях. 1 -митохондрия; 2 - внутренняя митохондриальная мембрана; 3 - пероксисома.

Образующиеся в пероксисомах FADH2 и NADH здесь же преимущественно окисляются с образованием перекиси водорода (Luster, Donaldson ), т.е. показано, что биохимическим механизмом утилизации жирных кислот является пероксисомальное Р-окисления и индукция ферментов глиоксилатного цикла, не сопряженные с запасанием энергии. Ключевые ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза обнаруживаются в печени крыс на третий день голодания и достигают максимального значения активности к 5 дню пищевой депривации. Для изучения физико-химических характеристик и механизмов регуляции нами был получен электрофоретически гомогенный препарат изоцитратлиазы из печени голодающих крыс. Учитывая наличие в пероксисомах ферментов (3-окисления и ферментов окисляющих NADH с образованием перекиси водорода, микротельца печени крыс в изучавшихся стрессовых условиях можно считать полноценными глиоксисомами, в которых окисление жирных кислот не связано с аккумуляцией энергии и, в первую очередь, обеспечивает глюконеогенетические процессы для компенсации затрат углеводов в голодающих тканях.

Интенсивное образование сукцината в жирозапасающих тканях семян при прорастании высших растений также обеспечивается за счет метаболизации жирных кислот. Изучение влияния ингибиторов на метаболизм меченого сукцината показало, что в проростках семян злаковых растений, таких как кукуруза и пшеница, процесс окисления сукцината не чувствителен к теноилтрифторацетону (ТТФА) - ингибитору СДГ. После разделения клеточных органелл с помощью изоплотностного центрифугирования было показано, что сукцинат метаболизируется не только в митохондриях, но и в глиоксисомах, причем в микротельцах сукцинат превращается в малат. В результате последующих исследований нами был обнаружен, частично очищен и охарактеризован фермент, обеспечивающий данный процесс - глиоксисомальная сукцинатоксидаза (ГСО), катализирующая окисление сукцината в малат с образованием перекиси водорода (рис. 64). Квинакрин - ингибитор флавиновых оксидаз, подавлял процесс глиоксисомального окисления сукцината. Это позволяет предположить, что изучаемая нами ферментная система является флавинсодержащей. Активность ГСО коррелирует с интенсивностью протекания глиоксилатного цикла и достигает максимального значения 0,17 ФЕ на 1 г сырой массы на 4 день прорастания семян. Наличие в глиоксисомах жирозапасающей ткани семян злаков альтернативной системы, окисляющей сукцинат, по-видимому, позволяет осуществлять регуляцию распределения сукцината, интенсивно образующегося при работе глиоксилатного цикла. При низких концентрациях субстрата активность ГСО незначительна, основная часть сукцината транспортируется в митохондрии и окисляется через СДГ. При прорастании мобилизация жирных кислот для глюконеогенеза приводит к резкой интенсификации образования янтарной кислоты. Митохондриальная сукцинатдегидрогеназа ингибируется при накоплении АТР, NADH, оксалоацетата и С02 и не может обеспечивать ее быстрое окисление. И в этой ситуации очевидно выгодным является быстрое окисление, не связанное с запасанием энергии, которое осуществляется глиоксисомальной сукцинатоксидазой. В настоящее время обнаружена аналогичная система окисления NADH в растительных пероксисомах (Lopez-Huertas et al., 1999).

Обработка растений повышенной концентрацией кислорода, пониженная температура, интенсивное освещение вызывали накопление продуктов перекисного окисления липидов и индукцию альтернативной оксидазы. В тех митохондриях, где наблюдается индукция АОХ (обработанный охлаждением перец и инкубированная при повышенной концентрации кислорода цветная капуста) продукция перекиси водорода понижена по сравнению с контролем.

Показано, что для растительных митохондрий незначительное снижение мембранного потенциала (на 15-20%) вызывает 2-3 кратное снижение скорости генерации АФК. Подобный эффект может возникать при переключении потока электронов от убихинона с цитохромного пути к альтернативной оксидазе. Было показано, что в тканях с высоким уровнем экспрессии альтернативной оксидазы добавление SHAM значительно ускоряло продукцию перекиси водорода. 2 mkM антимицин увеличивал SHAM-зависимую генерацию Н202. Изучение скорости образования 02"' митохондриями гороха с помощью ЭПР и окисления эпинефрина показало, что накопление перекиси может объясняться значительным увеличением скорости продукции супероксидрадикала.

При инкубация клубней картофеля, в которых активность альтернативной оксидазы не изменялась, при 4°С в течение 48-96 часов наблюдалась аккумуляция свободных жирных кислот и увеличение эффекта разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования, которое снималось добавлением БСА и частично ADP, АТР, GDP, UDP, карбоксиапрактилата и аттрактилата. UDP и GDP были менее эффективны, чем ADP и АТР, а аттрактилат был менее эффективен по сравнению с карбоксиаттрактилатом. Ресопрягающий эффект нуклеотидов отсутствовал в случае их добавления после КАтр. Таким образом, индуцированное холодом разобщение митохондрий жирными кислотами в клубнях картофеля частично опосредовано функционированием ATP/ADP антипортера. Что касается возможного участия термогенин-подобных разобщающих белков, то их обнаружение с помощью вестерн-блотгинга не сопровождалось наличием КАтр-нечувствительного ресопряжения пуриновыми нуклеотилами после добавления жирных кислот. Предполагается, что их вклад в разобщение митохондрий клубней картофеля был несущественным или же данный механизм в растительных митохондриях не чувствителен к нуклеотидам.

Таким образом, показано, что при воздействии стрессоров различной природы мобилизация запасных жирных кислот приводит к образованию сукцината и связана с пероксисомами и работой глиоксилатного цикла как в растительных, так и в животных тканях. Впервые получен гомогенный препарат изоцитратлиазы из животной ткани, изучены его физико-химические свойства. Показано, что интенсивное образование янтарной кислоты приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так, при прорастании семян злаковых функционирует впервые обнаруженная нами глиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является быстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сукцината непосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль электронтранспортной цепи митохондрий.

Установлено, что скорость образования активных форм кислорода контролируется активность механизмов несопряженного и разобщенного дыхания. Это может происходить как за счет снижения мембранного потенциала при разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования жирными кислотами через ATP/ADP антипортер или транспорте электронов через альтернативную оксидазу, так и за счет того, что несопряженное с генерацией энергии свободное окисление дыхательных субстратов кислородом является основным способом снижения уровня кислорода в клетках, необходимого для образования АФК. Аналогично функционируют оксидазы дыхательной защиты бактерий, механизм "мягкого разобщения" у животных и окисление дыхательных субстратов в пероксисомах. Концепция "свободного окисления" была впервые сформулирована В.П.Скулачевым более 30 лет назад (Скулачев 1969) для объяснения феномена теплопродукции при охлаждении в неспециализированных тканях. В настоящее время можно утверждать, что "свободное окисление" представляет собой универсальную стратегию биохймической адаптации к стрессорам различной природы. Физиологическим значением данного явления может быть ограничение генерации активных форм кислорода и ускоренная мобилизация запасных питательных веществ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Попов, Василий Николаевич, Воронеж

1. Благовещенский А.В. Теоретические основы действия янтарной кислоты нарастения. Наука, 1968.- 117с.

2. Васильева Е.Д. Особенности обмена жиров у млекопитающих при голодании

3. Успехи физиологических наук.- 1997.- V. 8, N 3.- Р. 97-127.

4. Вартапетян Б.Б. Кислород и структурно-функциональная организациярастительной клетки. XLIII Тимирязевские чтения. М.- 1985.- 89 с.

5. Виноградов А.Д. Ингибирование окисления янтарной кислоты оксалоацетатом // Биохимия.-1967.-Т.32, N 6.-С.1271-1277.

6. Виноградов А.Д., Зимакова Н.И., Солнцева Т.И. О механизме ингибированиясукцинатдегидрогеназы оксалоацетатом // Доклады академии наук СССР.-1971.-Т. 201, N 2.- С.359-362.

7. Виноградов А.Д., Гаврилова Э.В., Головешкина В.Г. Кинетические иструктурные характеристики компонентов СДН, реагирующих с естественными и искусственными акцепторами электронов // Биохимия.-1976.- Т.41, N 7.-С.1155-1168.

8. Виноградов А.Д. Сукцинат-убихинон редуктазный участок дыхательной цепи

9. Биохимия. 1986.- Т.51, N 12.- С. 1944-1973.

10. Войников В.К., Грабельных О.И., Побежимова Т.П., Корзун А.В.,

11. Турчанинова В.В., Колесниченко А.В. Влияние различных термогенных систем митохондрий на температуру проростков озимой пшеницы во время холодового шока // Доклады РАН,- 2001.- Т.378, N 5.- С.700-702.

12. Гаврикова Э.К., Головешкина В.Г., Виноградов А.Д. Новый каталитическийактивный центр сукцинатдегидрогеназы // Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляции ферментативных процессов,- М.: Наука, 1977.- С.123-130.

13. Ю.Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высшая школа. 1975.- 391 с.

14. Н.Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивых растений. М.- 1988. 280 с.

15. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.- М.: Наука, 1982.- 312с.

16. Гринева Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке кислорода //

17. Успехи современной биологии.- 1975.- Т.80, Вып.2.- С.238-243.

18. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений.- Киев: Наукова думка, 1973.- 273 с.

19. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М: Мир, 1986.- Т.2.-234 с.

20. Детерман Г. Гель-хроматография.- М.: Мир, 1970.- 252с.

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.- М.: Мир. 1982.-Т.З.- С.1118.

22. Епринцев А.Т., Землянухин Л.А., Алексюк М.П. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из щитка кукурузы // Биохимия.- 1995. Т.60.- N 8, С. 1244-1250.

23. Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Активность и изоформы малатдегидрогеназы в высоко- и низкомасличных сортах кукурузы // Физиология растений.- 1995.- Т.42, Вып.5.- С. 759-764.

24. Жигачева И.В., Мохова Е.Н., Скулачев В.П. Активация внешнего пути свободного окисления в митохондриях печени при охлаждении крыс // Докл. Академии наук СССР,- 1976.- Т.227, N 2.-С. 493-496.

25. Зайцева М.Г., Зубкова Н.К. Накопление и потери катионов митохондрии приизменении их метаболических состояний // Физиология растений.- 1979.-Т.26, N 5.- С.1085.

26. Зайцева М.Г., Зубкова Н.К. Фонд катионов митохондрий корней пшеницы испособность к окислению сукцината // Физиология растений.- 1985.- Т.32, N4.-C.762-768.

27. Землянухин А. А., Чеботарев Л. Н. Действие видимого света на метаболизмэтиолированных растений. // Тезисы докладов всесоюзной конференции «Свет и растения». Киев, 1975. С. 80 86.

28. Землянухин А.А., Епринцев А.Т., Землянухин Л.А., Игамбердиев А.У.

29. Очистка аконитатгидратазы из высших растений // Физиология растений,-1984,- V. 31.- Р. 337-343.

30. Землянухин А.А., Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У.

31. Глиоксилатный цикл растений.-Воронеж: Изд-во ВГУ, 1986.-148с.

32. Землянухин А.А., Землянухин Л.А. Метаболизм органических кислотрастений.-Воронеж: Изд-во ВГУ, 1995.-152с.

33. Землянухин А.А., Игамбердиев А.У. Регуляция активности изоцитратлиазы врастениях конопли // Физиология растений.-1985.-Т.32, В.4.-С.739-746.

34. Землянухин А.А.,Игамбердиев А.У.,Преснякова Е.Н. Выделение ихарактеристика изоцитратлиазы из щитка кукурузы // Биохимия.- 1986.-Т.51, Вып.З.- С.442-448.

35. Землянухин Л.А., Игамбердиев А.У., Землянухин А.А. Очистка и свойстваизоцитратлиазы из подсолнечника // Биохимия.-1984.- Т.49, N 3.- С. 387393.

36. Зыкова В.В., Грабельных О.И., Владимирова С.В., Королева Н.А.,

37. Колесниченко А.В., Войников В.К. Стрессовый разобщающий растительный белок БХШ 310 индуцирует перекисное окисление липидов в митохондриях пшеницы при гипотермии // Доклады Академии наук.- 2000.-T.372,N4.-C. 562-564.

38. Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений.-Воронеж: Изд-во ВГУ, 1990.-148с.

39. Игамбердиев А.У., Землянухин А.А., Мещерякова И.В. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений // Физиология растений.- 1986.- Т. 33, Вып. 6.- С. 1113-1120.

40. Игамбердиев А.У., Иванов Б.Ф., Родионова М.И. Окисление сукцината в глиоксисомах щитка кукурузы // Физиология растений,- 1990.- Т.37, Вып.З.- С.505-510.

41. Игамбердиев А.У.,Родионова М.И. Роль глиоксилатного цикла в метаболизме ацетата и других органических кислот в щитках прорастающих семян кукурузы // Физиология растений.- 1991.- Т.38, Вып.З.- С.492-498.

42. Игамбердиев А.У., Фалалеева М.И. Выделение и характеристика сукцинатдегидрогеназного комплекса митохондрий растений // Биохимия. 1994.- Т.59, N 8.- С.895-900.

43. Кондрашова М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования и окисления карбоновых кислот при разных функциональных состояниях ткани. // Биохимия.- 1991.- Т.56, вып.З.- С.388-403.

44. Кондрашова М.Н., Сирота Т.В., Темнов А.В., Белоусова Ж.В. Обратимая организация митохондрий в ассоциаты как фактор, регулирующий дыхание //Биохимия.- 1997.- Т. 62, N. 2.- С. 129-137.

45. Кондрашова М.Н. Терапевтическое действие янтарной кислоты.- Пущино, 1976.-162С.

46. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., Бабский A.M. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий // Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза.-Новосибирск.: Наука, 1987.-С.40-66.

47. Кондрашова М.Н., Хижняк Е.П., Тяжелое В.В. Образование тепла в митохондриях при окислении нразличных субстратов // Биофизика. 1988.Т. 33, N3.- С. 527-528.

48. Котляр А.В. Активация комплекса I в реакции окисления НАДН и в Н-зависимом восстановлении НАД сукцинатом // Биохимия.-1990.- Т.55, N.2.-С. 195-200.

49. Котляр А.В., Виноградов А.Д. Константы диссоциации комплексов СДГ с сукцинатом, фумаратом и малонатом // Биохимия.- 1984.-Т.49, N3.- С.511-518.

50. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа, 1980, 293с.

51. Лебкова Н.П. Трансформация липидов в гликоген в клетках животных ичеловека // Архив Патологии.- 1982.- Т. 6.- С. 68-73.

52. Лебкова Н.П. К вопросу о механизме обратимости жировой дистрофии //

53. Архив патологии.- 1983.- Т. 20, N3.-C. 32-37.

54. Лебкова Н.П., Колесова О.Е., Горбунова В.Д., Бобков Ю.И., Петрович Ю.А.

55. Данные авторгафических исследований внутриклеточной трансформации жирных кислот в гликоген в крысах с аллоксановым диабетом // Бюллютень эксп. биол. мед.- 1984.- V.98, N 12.- Р. 734-736.

56. Лебкова Н.П. Современные механизмы представления о внутриклеточныхмеханизмах обеспечения энергетического гомеостаза в норме и при патологии // Известия РАМН,- 2000.- N. 1.- С. 16-22.

57. Левашов М.М., Мишукова Е.А., Сивкова В.Г., Скулачев В.П. Энергетическийметаболизм у голубя при теплопродукции после гипотермии // Биохимия.-1965.- Т. 30, N 4.- С. 864-874.

58. Либерман Е.А., Топалы В.П., Цофина Л.М. Сравнение свойств биомолекулярных мембран фосфолипидов мозга, митохондрии и бактерии // 1970.- Биофизика.- T.XV, Вып.1, С. 69-74.

59. Манойлов С.Е. Биохимические основы злокачественного роста. Л.: Медицина, 1971. 230с.

60. Маслова Г.М., Рийхман Л.М., Скулачев В.П. Свободное окисление в дыхательной цепи как механизм окислительного гидроксилирования // Успехи совр. биол.- 1969.- Т. 67, N3.- С. 400-422.

61. Мауэр Г. Диск-электрофорез.М: Мир, 1971.- 222с.

62. Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии. Изд-во МГУ, 1979.430 с.

63. Панин Л. Е. Энергетические аспекты адаптации. -М.: Мир. 1987. 225 с.

64. Пинейру де Карвалью М.А.А., Землянухин А.А., Епринцев А.Т. Ма-латдегидрогеназа высших растений. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991. 216 с.

65. Попова Т.Н. Изоцитратдегидрогеназы: изоформы, локализация, свойства ирегуляция //Биохимия,- 1993,- Т.59, N12.- С.1861-1879.

66. Ракитин А. В. Действие красного света в смешанном светопотоке на продукционный процесс растений. Томск. 2001. 21с.

67. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Микробиология.- 2001.- Т. 70, N 4.-С. 531-535.

68. Романова Т. Д., Курбская О. Г. Изменение темнового дыхания и егоотдельных компонентов в процессе зеленения и после действия экстремальной температуры. // Физиология и биохимия культурных растений.- 1987.- Т.19, № 5.- С. 461 -467.

69. Родионова М.И. Особенности метаболизма сукцината в растениях: Дис.канд.биол.наук. Воронеж, 1993. 174с.

70. Рубин Б.А., Логинова Л.Н. Альтернативные пути биологического окисления.1. М.:ВИНИТИ, 1979. 138 с.

71. Селье Г. На уровне целого организма. М:Мир. 1972.- 268 с.

72. Семихатова О.А. Энергетика дыхания растений в норме и при экологическом стрессе. XLVIII тимирязевские чтения. М.- 1990. 72 с.

73. Скулачев В.П. Аккумуляция энергии в клетке. М.:Наука.- 1969. 186 с.

74. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии.-М.:Высшая школа.- 1989. 271 с.

75. Скулачев В.П. Понижение внутриклеточной концентрации 02 является специфичной функцией дыхательной системы клетки //Биохимия.-1994.-Т.59, N12.-C.1910-1912.

76. Солдатенков С.В., Мазурова Т.А. Анализ органических кислот методомионного обмена и хроматографии на бумаге // Биохимические методы в физиологии растений.- М.: Наука, 1971.-С.86-102.

77. Филиппова JI. А., Мамушина Н. С., Заленский О. В. О функционированииосновных этапов темнового дыхания во время фотосинтеза // Ботан. журнал.- 1982.- Т. 67, № 9.- С. 1169 1178.

78. Филиппова JI. А., Мамушина Н. С., Зубкова Б. К. Развитие представлений овзаимосвязи фотосинтеза и дыхания. // Эколого-физиологическое исследование фотосинтеза и дыхания растений,- JI.: Наука, 1989.- С. 168 — 183.

79. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярныекомплексы.-М.: Мир, 1986.- 376с.

80. Хочачка П., Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации. М.:Мир.- 1977.399 с.

81. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. Л.:ЛГУ.- 1988.244 с.

82. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СпбГУ.- 2002.- 241 с.

83. Шахов А. А. Фотоэнергетика растений и урожай. М.: Наука, 1993. 411с.

84. Шугаев А.Г. Окислительная активность митохондрий, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы второго года вегетации // Физиология растений.- 1990.- Т.37, вып. 2.- С. 263-270.

85. Шугаев А.Г., Выскребенцева Э.И. Действие ротенона на окисление НАДзависимых субстратов митохондриями корнеплода сахарной свеклы. // Физиология растений.-1985.- Т.32, вып.6.- С.1071-1076.

86. Шугаев А.Г.,Выскребенцева Э.И. Сукцинат монополизирует дыхательнуюцепь митохондрий растущих плодов сахарной свеклы // Физиология растений,- 1988.- Т.35, вып.З.- С.421-428.

87. Шугаев А.Г., Выскребенцева Э.И. Конкурентные отношения при совместномокислении экзогенного НАД(Ф)Нг и интермедиатов цикла трикарбоновых кислот в митохондриях корнеплода сахарной свеклы // Физиология растений.- 1994.-Т.41, Вып.1.- С.49-55.

88. Щипарев С.М., Чупрова Г.В., Полевой В.В. Секреция кислот изолированными щитками кукурузы // Вестн.ЛГУ.Биология.- 1976, N 21.-С.314-319.

89. Abeysinghe S.I., Baker P.J., Rice D.W., Rodgers H.F., Stillman T.J., Ко Y.H.,

90. McFadden B.A., Nimmo H.G. Use of chemical modification in the crystallization of isocitrate lyase from Escherichia coli // Journal of Molecular Biology.- 1991.-V.220, N 1.- P.13-16.

91. Ackrell B.A., Ball M.B., Kearney E.B. Peptided from complex II active in reconstitution of succinateubiquinone reductase // J.Biol.Chem.-1980.-V.255, N 7.-P.2761-2769.

92. Ackrell, B.A., and Jones, C.W. The respiratory system of Azotobacter vinelandii. 1. Properties of phosphorylating respiratory membranes // Eur.J.Biochem.-1971,- V. 20.- P. 22-28.

93. Ackrell BA., Kearney EB., Mowery P., Singer ТР., Beinert H., Vinogradov AD.,

94. White GA. Factors controlling the turnover number of succinate dehydrogenase: a new look at an old problem // Advances in Experimental Medicine & Biology.-1976.-V. 74.- P.161-181.

95. Agrawal, P., Garg, G., and Gollakota, K. Studies on two isozymes of aconitase from Bacillus cereus Т. III. Enzymatic properties. // Biochem. Biophys. Res. Communs.- 1976.- V. 70,- P. 987-996.

96. Akerman К. E. O., Wikstrom M. K. F., Safranine as a probe of the mitochondrialmembrane potential // FEBS Lett.- 1976. -V. 68,- P. 191-197.

97. Affourtit C., Krab K., Leach G.R., Whitehouse D.G., Moore A.L. New insight intothe regulation of plant succinate dehydrogenase // J. Biol. Chem.- 2001a.- V. 276, N35.- P. 32567-32574.

98. Affourtit C., Krab K., Moore A.L. Control of plant mitochondrial respiration //

99. Biochem. Biophys. Acta (Bioenergetics). 2001b. - V. 1504, N.l.- P.59-69.

100. Allen R.D., Trelease R.H., Thomas T.L. Regulation of isocitrate lyase gene expression in sunflower // J.Plant Physiol.- 1988.-V.86, N 2.- P.527-532.

101. Altman M., Robin E.D. Survival during prolonged anaerobiosis as a function of anunusual adaptation, involving lactate dehydrogenase subunits // Сотр. Biochem. Physiol.- 1969.- V. 30.- P. 1179-1187.

102. Andreyev A. Yu., Bondareva Т. O., Dedukhova V. I., Mokhova E. N., Skulachev

103. V.P., Tsofina L. M„ Volkov N. I., Vygodina Т. V. The ATP/ADP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria // Eur. J. Biochem.- 1989.- V. 182.- P. 585 592.

104. Attridge TH, Smith H A phytochrome-mediated increase in the level of phenylalanine ammonia-lyase activity in the terminal buds of Pisum sativum // Biochem Biophys Acta.- 1967,- V. 148.- P. 805-807

105. Azcon-Bieto J., Salom C.L., Machie N.D., Day D.A. The regulation ofmitochondrial activity during greening and senescence of soybean cotyllidons.// Plant Physiol. Biochem.-1989. -V.27, N6.- P.827-836.

106. Babior BM, Woodman RC. Chronic granulomatous disease // Semin. Hemarol.-1990.- V. 27.- P.247-259.

107. Backman L., Johansson G. Enzyme-enzyme complexes between aspartate aminotransferase and malate dehydrogenase from pig heart muscle // FEBS Lett.- 1976.- V. 65, N 1, P. 39-43.

108. Baginsky M.L., Hatefi Y. Reconstitution of succinate coenzyme Q reductase and succinate oxidase activities by a a highly purified, reactivated succinic dehydrogenase //Biochem. and Biophys.Res.Communs.- 1968.- V.32, N 6.-P.945-950.

109. Barrett J., Ward C.W., Fairbairn D. The glyoxylate cycle and the conversion oftriglicerides to carbonhydrates in developing eggs of Ascaris lumbricoides // Сотр. Biochem. and Physiol.- 1970.- V.35, N4.- P. 577-585.

110. Baum G., Chen G., Arazi Т., Takatsuji H., Fromm H. A plant glutamate decarboxylase containing a calmodulin binding domain //J.Biol.Chem.-1993.-V.268.- P.19610-19617.

111. Beeckmans S., Kanarek L. Demonstration of Physical Interaction between Consicutive Enzymes of the Citric Acid Cycle and of Aspartate Aminotransferase // Europ. J. Biochem.- 1981.V.117, N.3.-P.527-535 .

112. Beeckmans S., Khan AS., Van Driessche E., Kanarek L. Specific association between the glyoxylic-acid-cycle enzymes isocitrate lyase and malate synthase // European Journal of Biochemistry.- 1994.- V.224, N1,- P. 197- 201.

113. Beevers H. Microbodies in higher plants.//Ann.Rev.Plant Physiol.-1979.-V.30.-P.159-193.

114. Behari R., Baker A. The carboxyl terminus of isocitrate lyase is not essential for import into glyoxysomes in an in vitro system // Journal of Biological Chemistry.- 1993.- V.268, N10,- P.7315-7322.

115. Behrends W. Birkhan R. Kindl H. Transition form of microbodies. Overlapping of two sets of marker proteins during the rearrangement of glyoxysomes into leaf peroxisomes // Biological Chemistry HoppeSeyler.- 1990.- V. 371, N1.-P.85-94.

116. Beinert, H., Kennedy, M.C., and Stout, C.D. Aconitase as Iron-minus sign Sulfur Protein, Enzyme, and Iron-Regulatory Protein // Chem. Rev.- 1996.- V. 96.- P. 2335-2373.

117. Bellion E., Woodson Y. Two distinct isocitrate leases from Pseudomonas species. // Y.Bacteriol.-1975.-V.122, N 4.- P.557-564.

118. Berthold DA. Siedow JN. Partial purification of the cyanide-resistant alternative oxidase of skunk cabbage (Symplocarpus foetidus) mitochondria // Plant Physiology.- 1993.-V. 101, N1.-P.113-119.

119. Bertcova, Y,V., Bogachev, A.V., Skulachev, V.P. Generation of protonic potential by the bd-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii // FEBS Lett.-1997.- V. 414,- P. 369-372.

120. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. Cytochrome d induction in Escherichia coli growing under unfavorable conditions // FEBS Lett.- 1993.-V. 336.- P. 75-78.

121. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., Shestopalov, A.I., and Skulachev, V.P. Induction of the Escherichia coli cytochrome d by low delta mu H+ and by sodium ions // Eur.J.Biochem.- 1995.-V. 232.- P. 304-308.

122. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. H+/e- stoichiometry for NADH dehydrogenase I and dimethyl sulfoxide reductase in anaerobically grown Escherichia coli cells //J.Bacteriol.- 1996.-V. 178.- P. 6233-6237.

123. Borovskii G., Stupnikova I., Antipina A., Downs C., Voinikov V. Accumulation of dehydrin-like proteins in the mitochondria of cold-treated planys // J. Plant Physiol., 2000,- V.156.- P.797-800.

124. Borst P. How proteins get into microbodies (peroxisomes, glyoxysomes, glycosomes) // Biochimica et Biophysica Acta.- 1986.-V. 866, N4.-P. 179-203.

125. Borst P. Peroxisome biogenesis revisited // Biochimica et Biophysica Acta.-1989.-V. 1008, N 1.-P.1-13.

126. Boveris A., Chance B. The mitochondrial ggeneration and hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen // Biochem. J.- 1973.- V.134.-P. 707-716.

127. Bown A., Shelp B.J. The metabolism and physiological roles of 4-aminobutyric acid // Biochem (Life Sci Adv.).-1989.-V.8.- P.21-25.

128. Bowyer P., De Lucas JR., Turner G. Regulation of the expression of the isocitrate lyase gene (acuD) of Aspergillus nidulans // Molecular & General Genetics.- 1994.-V. 242, N4.-P.484-489.

129. Brailsford M.A., Thompson A.G., Kaderbhai N., Beechey R.B. Piruvate metabolism in castor bean mitochondria//Biochem.J.- 1986.-V.239.-P.355- 361.

130. Breidenbach R.W., Kahn A., Beevers H. Characterization of glyoxysomes from castor bean endosperm // Plant Physiol. 1968.-V.43. N4.-p.703-713.

131. Breitkreuz K.E., Shelp В J. Subcellular compartmentation of the 4-aminobutyrate shunt in protoplasts from developing soybean cotyledons // Plant Physiol.-1995.-V.108, N 1.- P.99-103.

132. Burdon R.H., O'Kane D., Fadzillah N., Gill V., Boyd P.A., Finch R.R. Oxidative stress and responses in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa subjected to chilling and salinity stress // Biochem. Soc. Trans.- 1996.- V.24, N2.- P. 469-472.

133. Burke J.J., Siedow J.N., Moreland D.E. Succinate dehydrogenase. A partical purification from mung bean hypocotils and soybean cotiledons // Plant Physiol.-1982,- V.70, N6.P.1577-1581.

134. Cammack R., Patil DS., Weiner JH. Evidence that centre 2 in Escherichia coli fumarate reductase is a 4Fe-4S. cluster // Biochimica et Biophysica Acta.-1986.- V. 870, N3.-P.545-551.

135. Carroll A.D., Fox G.G., Laurie S.,Phillips R.,Ratcliffe R.G.,Stewart G.R. Ammonium Assimilation and the Role of у -aminobutyric Acid in pH Homeostasis in Carrot Cell Suspensions // Plant Physiol. 1994. V.106. N 4. P.513.

136. Chance B, Sies H, Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs //Physiol Rev.- 1979.- V. 59.- P.527-605.

137. Cioni M., Pinzauti G., Vanni P. Comparative biochemistry of glyoxylate cycle.// Comp.Biochem. and Physiol.-1981.-V.70, B, N 1.- P. 1-26.

138. Coleman P.S., Lavietes B.B. Membrane Cholesterol, Tumorigenesis and the Biochemical Phenotype of Neoplasma // Critical Reviews in Biochemistry. 1981. V.ll. P.341.

139. Colonna W.J., McFadden B.A. Isocitrate lyase from parasitic and free-living nematodes // Arch. Biochem. Biophys.- 1975 .- V. 170, N4,- P.608-619.

140. Conte G.P., Tripp M. Succinic acid dehydrogenase activity in the gill epithelium of evryhaline fishes // Jut J. Biol.Chem.-1970.-V.l, N 2.- P. 129-13 8.

141. Cooper T.G., Beevers H. Mitochondtia and glyoxysomes from castor bean endosperm //J.Biol.Chem.-1969.-V.244, N 13.- P.3507-3513.

142. Cooper A., Gutman M. Accelerated catalysis by active succinate dehydrogenase: a refiction of a novel regulatory site // FEBS Lett.-1976.-V.67, N 2.- P.130-133.

143. Cortay JC., Negre D., Galinier A., Duclos В., Perriere G., Cozzone AJ. Regulation of the acetate operon in Escherichia coli: purification and functional characterization of the IclR repressor // EMBO Journal.- 1991.-V. 103.-P.675-679.

144. Courtois-Verniquet F., Douce R. Lack of aconitase in glyoxysomes and peroxisomes // Biochemical Journal. 1993,- V. 294, Pt 1.-P. 103-107.

145. Cowley R.C., Palmer J.M. The interaction between exogenus NADH oxidase in jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) mitochondria // J.Exp.Bot.-1980.-V.31,N 120.-P.199-207.

146. Crawford L.A., Bown A.W.,Breitkreuz K.E.,Guinel F.C. The synthesis of y-aminobutyric acid in response to treatments reducing cytosolic pH // Plant Physiol. 1994. V.104. N 4. P.865.

147. Dalton, H., and Postgate, J.R. Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture // J.Gen.Microbiol. 1969.- V. 56.- P. 307319.

148. Davis B.J., Ornstein L. A new high resolution electrophoresis method. Delivered at the society for the study at the New York Academy of Medicine. 1959. March 24.- P.l 12-118.

149. Davis K.A., Hatefi X. Succinate dehydrogenase. Purification molecular properties and substructure // Biochemistry.- 1971,- V.10.- P.2509-2516.

150. Day D.A., Moore A.L., Dry I.B., Wiskich J.T., Azcon-Bieto J. Regulation of Nonphosphorylating Electron Transport Pathways in Soybean Cotyledon Mitochondria and Implication for Fat Metabolism // Plant Physiol. 1988. -V.86, N 4.- P.l 199-1211.

151. Dedukhova VI, Mokhova EN, Skulachev VP, Starkov AA, Arrigoni-Martelli, and Bobyleva EA Uncoupling effect of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles //FEBS Lett.- 1991.-V. 295.- P. 51-54.

152. De Duve C. Microbodies in the living cell //Sci. Amer.- 1983.- V. 248, N 5,-P.52-62.

153. De Duve C. Baudhuin P. Peroxisomes (microbodies and related particles) // Physiological Reviews.-1966.-V. 46(2) P.323-357.

154. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay methods for the key enzymes of the glyoxylate cycle // Biochem. J. 1959.- V. 72, N1.-P.3.

155. Dry, I.B., Moore, A.L. & Day, D.A. Regulation of alternative pathway activity in plant-mitochondria non-linear relationship between electron flux and the redox poise of the quinone pool. // Arch. Biochem. Biophys.- 1989.-V. 273.-P. 148157.

156. Dunham S.M., Thurston C.F. Control of isocitrate lyase synthesis in Chlorella fusca var.vacuolata //Biochem.Y.-1978.-V.176, N 2.- P. 179-185.

157. Duntze W., Neuman D., Gancedo Y.M., Atzpodien W., Holzer H. Studies on the regulation and localization of the glyoxylate cycle enzymes in Saccharomyces cerevisiae //Eur.Y.Biochem.-1969.-V.10, N 1,- P.83-89.

158. Eisenstein, R.S., Barton, H.A., Pettingell, WH. Jr., Bomford, A.B. Isolation, characterization, and functional studies of rat liver iron regulatory protein 1. // Arch. Biochem. Biophys.- 1997.- V. 343.- P. 81-91.

159. Eising R., Trelease RN., Ni WT. Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaf-type peroxisomes of sunflower cotyledons // Archives of Biochemistry & Biophysics.- 1990.-V. 278, N l.-P.258-64.

160. Eldan M., Mayer A.M., Poljakoff-Mayber A. Difference in subcellular localization of isocitrate lyase in lettnce seeds of different ages .//Plant and cell.Physiol.-1974.-V. 15., N 1.- P.169-173.

161. Elgersma Y., Tabak H.F. Proteins involved in peroxisome biogenesis and functioning // Biochim.Biophys.Acta.-1996.-V. 1286, N 3.- P.269-283.

162. Emptage, M.H., Dreyer, J.L., Kennedy, M.C., and Beinert, H. // J.Biol.Chem.-1993.- V. 219.- P. 11106-11111. Aconitase, a two-faced protein: enzyme and iron regulatory factor // FASEB J.- 1993 .- V.7, N15,- P. 1442-1449.

163. Evelson, P., Gonzalez-Flecha, B. Time course and quantitative analysis of the adaptive responses to 85% oxygen in the rat lung and heart // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.- V. 1523.- P. 209-216.

164. Faber KN. Keizer-Gunnink I. Pluim D. Harder W. Ab G. Veenhuis M. The N-terminus of amine oxidase of Hansenula polymorpha contains a peroxisomal targeting signal // FEBS Letters.-1995.-V. 357, N 2.- P. 115-120.

165. Fernandez E., Fernandez M., Moreno F., Rodicio R. Transcriptional regulation of the isocitrate lyase encoding gene in Saccharomyces cerevisiae // FEBS Letters.-1993.-V. 333, N3.-P.238-242.

166. Fernandez E., Moreno F., Rodicio R. The ICL1 gene from Saccharomyces cerevisiae // European Journal of Biochemistry.- 1992.- V. 204, N3.-P.983-990.

167. Firenzuoli A.M., Vanni P., Mastronuzzi E., Zanobini A., Baccari V. Enzymes of glyozylate cycle in conifers // Plant Physiol.-1968.-V.43, N 7,- P. 1125-1128.

168. Flabell R.B., Woodward D.O. Metabolic role, regulation of synthesis, cellular localization and genetic contriol of glyoxylate shunt enzymes in Neurospora crassa// J.Bacteriol.-1971, V.105, N 1.- P.200-210.

169. Fluhr R., Hakel E. Succinil-CoA syuthetase in greening maize leaves // Phytochemistry.-1975.- V.14, N 10.- P.2157-2160.

170. Fortnagel P., Treese E. Inhibition of aconitase by chelation of transition metals causing inhibition of sporulation in Bacillus subtilis //Y.Biol.Chem.-1968.-V.243, N 20.- P.5289-5295.

171. Freminet A, Leclerc L, Poyart C, Huel C, Gentil M. Alanine and succinate accumulation in the perfused rat heart during hypoxia // J. Physiol. (Paris).-1980.- V.76, N 2.- P. 113-117.

172. Frevert J., Koller W., Kindl H. Occurence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds.// Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem.-1980.-V.361,N 10.- P.1557-1565.

173. Fridovich I. Superoxide dismutases // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology / Ed.Meister A.N.Y.: John Wiley & Sons, 1986. V.58.P.61.

174. Gardestrom P., Wigge B. Influence of photorespiration on ATP/ADP ratios in the chloroplasts, mitochondria, and cytosol, studied by rapid fractionation of barley (Hordeum vulgare) protoplasts // Plant Physiol.- 1988.- V. 88.- P. 69-76.

175. Gawron O., Mahajan K.P., Limetti M. Ill CoQ and SDH activity of the Keilin-Hartree respiratory particle //Arch.Biochem. and Biophys.-1969.-V.129, N 2.-P.461-467.

176. Gemmrich A.R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern Anemia phyllitids // Phytochemistry.-1979.-V. 18, N 6,- P.1143-1146.

177. Gerhard B. Microbodies / Peroxisomen pflanzlicher Zellen //Cell Biology Monographs.-Wien: Springer-Verlag.l978.-V.5.-283p.

178. Gerhard B. Enzyme activities of the b -oxydation pathway in spinach leaf peroxisomes // FEBS Lett.-1981 .-V. 126, N 1.- P.71 -73.

179. Giachetti E., Vanni P. Effect of Mg2+ and Mn2+ on isocitrate lyase, a nonessential^ metal-ion-activated enzyme. A graphical approach for the discrimination of the model for activation // Biochemical Journal.- 1991.- V. 276, Pt 1.-P.223-230.

180. Gietl C. Glyoxysomal malate dehydrogenase from watermelon is synthesized with an amino-terminal transit peptide // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.- 1990.- V.87, N15.-P.5773-5777.

181. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles // Biochimica et Biophysica Acta.- 1992.- V.1100, N3.-P.217-234.

182. Glover Ж. Andrews DW. Rachubinski RA. Saccharomyces cerevisiae peroxisomal thiolase is imported as a dimer // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.-1994.-V.91.- N 22.-P.10541-10545.

183. Glusker, J.P. Aconitase. In: Enzymes. New York London.- 1971.- V. 5.- P. 413-439.

184. Goodman D.B.P., Davis W.L., Jones R.G. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: Possible stimulation by aldosterone //Proc.Nath.Acad.Sci.-1980.-V.77, N3.-P.1521-1525.

185. Gould SJ. Keller GA. Hosken N. Wilkinson J. Subramani S. A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes // Journal of Cell Biology.- 1989.-V. 108, N5 .-P. 1657-1664.

186. Gould SJ. Keller GA. Subramani S. Identification of peroxisomal targeting signals located at the carboxy terminus of four peroxisomal proteins // Journal of Cell Biology.-1990.-V. 107, N3.- P.897-905.

187. Graves L.B., Hanzely L., Trelease R.N. The occurence and fine structural characterisation of microbodies in Euglena gracilis //Protoplasma.-1971.-V.72, N 2.- P.141-152.

188. Gred C., Vanleberghe R.F., Turpin D.H. Anaerobic metabolism in the Nlimited green alga Selenastrum minitum // Plant Physiol. 1990.- V.94.- N.3. P. 11161123.

189. Grivennikova VG., Vinogradov AD. Kinetics of ubiquinone reduction by the resolved succinate: ubiquinone reductase // Biochimica et Biophysica Acta.-1982.- V.682, N3.-P.491-495.

190. Guest JR. Oxygen-regulated gene expression in Escherichia coli. The 1992 Marjory Stephenson Prize Lecture // Journal of General Microbiology.- 1992. V.138, Pt 11.-P.2253-2263.

191. Gutman M. Electron flux through the mitochondria ubiquinone // Biochem. et Biophys.acta.-1980.- V.594, N 1.-P.53-59.

192. Halliwell, В. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? //Lancet.- 1994.-V. 344.- P. 721-724.

193. Halliwell B, Gutteridge JMC. Iron toxicity and oxygen radicals .-In Free radicals in biology and medicine.- 1989.- 2nd ed. Oxford: Clarendon Press. 288 p.

194. Hanstein W.G. Uncoupling of oxidative phosphorylation // Biochim.Biophys.Acta. 1976.- V.456.- P. 129.

195. Hatefi Y. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system //Annu.Rev.Biochem.-1985.-V.54.- P. 1015-1070.

196. Hattori Т., Asahi T. The presence of two forms of succinate dehydrogenase in sweet potato roots mitochondria .//Plant and Cell Physiol.-1982.-V.23, N 2.-P.515-523.

197. Hayashi M., De Bellis L., Alpi A., Nishimura M. Cytosolic aconitase participates in the glyoxylate cycle in etiolated pumpkin cotyledons // Plant & Cell Physiology.- 1995.- V.36, N4.-P.669-680.

198. Hederstedt J., Holingren E., Rufberg L. Characterisation of a succinate dehydrogenase complex solubilized from thge cytoplasmic membrane of Bacillus subtilis with the nonionic detergent Triton X-100 // J.Bacteriol.- 1979.- V.67, N 2.- P.370-376.

199. Hederstedt L., Rutberg L. Succinate dehydrogenase a comparative review // Microbiological Reviews.- 1981.- V.45, N4.-P.542-555.

200. Hemrika-Wagner, A.M., Kreuk, K.C.M. & Van der Plas, L.H.W. Influences of growth temperature on respiratory characteristics of mitochondria from callus-forming potato tuber discs. // Plant Physiol.- 1982.- V. 70.- P. 602-605.

201. Hiatt T.P. Preparation and some properties of soluble succinate dehydroghenase from higher plauts // Plant.Physiol.-1961.-V.36.- P.552-557.

202. Hicks D.S., Donaldson R.P. Electron transport in glyoxysomal membranes // Arch .Biochem and Biophys.-1982.-V.215, N 2.- P.280-288.

203. Hoefnagel MH. Millar AH. Wiskich JT. Day DA. Cytochrome and alternative respiratory pathways compete for electrons in the presence of pyruvate in soybean mitochondria // Archives of Biochemistry & Biophysics.- 1995,- V.318, N2.-P.394-400.

204. Holingren E., Hederstedt L. Rufberg L. Role of heme in synthesis and membrane binding of succinate dehydrogenase in Bacillus subtilis // J.Bacteriol.-1979.-V.138, N 2.- P.377-382.

205. Hohl C., Oestreich R., Rosen P., Wiesner R., Grieshaber M. Evidence for Succinate Production by Reduction of Fumarate du-ring hypoxia in isolated adulf rat heart cells // Arch.Biochem.Biophys.-1987.-V.259, N.2, P.527-535.

206. Hollingren E., Hederstedt L., Rufberg K. Role of heme in syntesis and membrane binding of succinate dehydrogenase in Bacillus subtilis // J. Bacterid.- 1979.-V.138, N.2.-P.377-382.

207. Holmes RP. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embryonic chick liver// Biochimica et Biophysica Acta.- 1993,- V.1158, N1.-P.47-51.

208. Huang A.H.C. Metabolism in plant peroxisomes // Recent Adv.Phytochem.-1982.-V.16.- P.85-123.

209. Huang A., Bowman P.D., Beevers H. Immunological and biochemical studies of isozymes of malate dehydrogenase and citrate synthetase in castor bean glyoxysomes // Plant Physiol.-1974.-V.54. N 2,- P.277-279.

210. Hunt L., Fletcher Y. Intracellular location of isocitrate lyase in leaf tissue // Plant Sci.Lett.-1977.-V.10.- P.243-247.

211. Hunt L., Skvarla J., Fletcher J. Subcellular localization of isocitrate lkyase in nongreen tissue culture cells // Plant Physiol.-1978.-V.61, N 6.- P.1010-1013.

212. Igamberdiev A.U., Kleczkowski L. Glyoxylate metabolism during photorespiration: A cytosol connection // Handbook on Photosynthesis (M.Pessarakli, ed.).- 1996.- NY: Marcel Dekker Inc.- P.269-279.

213. Iuchi S., Lin EC. arcA (dye), a global regulatory gene in Escherichia coli mediating repression of enzymes in aerobic pathways // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.- 1988.- V.85, N6.-P.1888-1892.

214. Iuchi S., Lin EC. Purification and phosphorylation of the Arc regulatory components of Escherichia coli // Journal of Bacteriology.- 1992.- V.174, N17.-P.5617- 5623.

215. JanssenBJ. A cDNA clone for isocitrate lyase from tomato// Plant Physiology.-1995.- V.108, N3.- P.1339.

216. Jarmuszkiewicz W., Milani G., Fortes F.,. Schreiber A.Z., Sluse F.E., Vercesi A.E. First evidence and characterization of an uncoupling protein in fungi kingdom: CpUCP of Candida parapsilosis // FEBS Letters.- 2000.- V. 467.- P. 145-149.

217. John P.C., Syrett P.J. The purification and properties of isocitrate lyase from Chlorella. // Biochem.J.-1967.-V.105, N 2.- P.409-416.

218. Jones C.T. Is there a glyoxylate cycle in the liver of the feal Quinea pig? // Biochem. and Biophys.-1980.-V.95, N 2.- P.849-856.

219. Jones RW, Sheard RW Phytochrome, nitrate movement, and induction of nitrate reductase in etiolated pea terminal buds // Plant Physiol.- 1975.- V. 55.- P.954-959.

220. Kagawa Т., Mc Gregor D.J., Beevers H. Development of enzymes in the cotyledons of watermelon seedlings // Plant Physiol.-1973.-V.51, N 1.- P.66-71.

221. Kamp F. and Hamilton J.A. pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop of un-ionized fatty acids // Proc.Natl.Acad.Sci. USA.- 1992,-V.89.- P. 11367-11370.

222. Kato A., Hayashi M., Mori H., Nishimura M. Molecular characterization of a glyoxysomal citrate synthase that is synthesized as a precursor of higher molecular mass in pumpkin // Plant Molecular Biology.- 1995.- V.27, N2.-P.377- 390.

223. Kausch A.P. Biogenesis and cytochemistry of unspecialized peroxisonmes in root cortical cells of Yucca torreyi L. // Eur.J.Cell.Biol.-1984.-V.34, N 2.- P.239-247.

224. Kearney E.B., Mayr M., Singer T.P. Regulatory properties of succinate dehydrogenase activation by succinil-CoA, pH and anions // Biocem. and Biophys. Res. Communs.- 1972.- V.46, N2.- P. 531-537.

225. Kesseler A. Diolez P. Brinkmann K. Brand MD. Characterisation of the control of respiration in potato tuber mitochondria using the top-down approach of metabolic control analysis // European Journal of Biochemistry.- 1992.- V.210, N3.- P.775-784.

226. Khan F.R., McFadden B.A. Enzyme profiles in seedling development and the effect of itaconate, an isocitrate lyase directed reagent // Plant Physiol.-1979.-V.64, N 2.- P.228-231.

227. Khan F.R., Mc Fadden B.A. Embryogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett.-1980.-V.l 15, N 2.- P.312-314.

228. Khan F.R., Saleemuddin M., Siddiqi M., Mc Fadden B.A. Purification and properties of isocitrate lyase from flax seedlings // Arch.Biochem. and Biophys.-1977, V.183, N 1.- P.13-23.

229. Khan F.R. Salcemuddin M., Siddigi M., Mc Fadden B.A. The appearance and decline of ioscitrate lyase in flax seedlings // J.Biol.Chem.-1979.-V.254, N 15.-P.6938-6944.

230. Khan AS., Van Driessche E., Kanarek L., Beeckmans S. The purification and physicochemical characterization of maize (Zea mays L.) isocitrate lyase // Archives of Biochemistry & Biophysics.- 1992.- V. 297, N1.- P.9-18.

231. Kirino T. Ischemic tolerance // J Cereb Blood Flow Metab.- 2002.- V. 22, N11.-P. 1283-1296

232. Koller W., Frevert J., Kindl H. Incomplete glyoxysomes appearing at a late stage of maturation of cucumber seeds // Z.Naturforsch.-1979.-Bd 34, Ser.C., N 12.-S.1232-1236.

233. Konstantinov A.A., Peskin A.V., Popova E.Yu., Khomutov G.B., Ruuge E.K. Superoxide generation by the respiratory chain of tumor mitochondria // Biochim Biophys Acta 1987.- V. 894, N 1.-P. 1-10.

234. Konstantinov AA, Ruuge EK. Semiquinone Q in the respiratory chain of electron transport particles: electron spin resonance studies // FEBS Lett.- 1977.-V. 81,N. l.-P. 137-141.

235. Konstantinova, S.G., Russanov, E.M. Aconitase activity in rat liver // Сотр. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol.- 1996.- V. 113.- P. 125-130.

236. Kornberg H.L. The metabolism of C2 compounds in microorganismes. I. The incorporaion of (2-14C) acetate by Pseudomonas grown on ammonium acetate // Biochem.J.-1958.-V.68, N 3.- P.535-542.

237. Kornberg H.L., Beevers H. The glyoxylate cycle as a stage in the conversion of fat to carbohydrase in castor beans // Biochem.Biophys. Acta.-1957.-V.26.-P.531-537.

238. Kornberg H.L., Krebs H.A. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modified tricarboxylic acid cycle//Nature.- 1957.-V.157,-P.988-991.

239. Korshunov SS, Korkina OV, Ruuge EK, Skulachev VP, Starkov AA. Fatty acids as natural uncouplers preventing generation of 02.- and H202 by mitochondria in the resting state // FEBS Lett.- V. 435, N 2-3.- P. 215-218

240. Korshunov, S.S., Skulachev, V.P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. //FEBS Lett.- 1997.-V. 416.-P. 15-18.

241. Koster A., Heisig M., Heinrich P.C., Just W.W. In vitro synthesis of peroxisomal membranwe polypeptides //Biochem.Biophys.Res.Communs.-1986.-V.137, N 2.-P.626-632.

242. Krebs H.A. The history of the tricarboxylic acid cycle //Perspect Biol.Med.-1970.-V.14.- P. 154-170.

243. Kregel КС. Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance // J Appl Physiol.- 2002.- V. 92, N 5.-P. 2177-2186

244. Krivanek J., Novakova L. Differential sensitivity of the brain ATPdependent and GTP-dependent succinyl-CoA synthetase to vanadium ions. Developmental aspects // Physiological Research.- 1992.- V.41, N5,- P.345-350.

245. Kromer, S. Respiration during photosynthesis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 1995.- V. 46.- P. 45-70.

246. Kromer, S., Stitt, M., Heldt, H. W. Mitochondrial oxidative phosphorylanon participating in photosynthetic metabolism of a leaf cell. // FEBS Lett.- 1988.- V. 226.- P. 352-356.

247. Kromer, S., Malmberg, G., Gardestrom, P. Mitochondrial contribution to photosynthetic metabolism. A study with barley leaf protoplasts at different light intensities and CO; concentrations // Plant Physiol.- 1993.- V. 102,- P. 947-955.

248. Kroetz D.L., Yook P., Coester p., Bianchi P., Pineau T. Peroxisome Proliferator-activated Receptor a controls the hepatic CYP4A induction adaptive response to Starvation and diabetes // J. Biol. Chem.- V. 273,- P. 31581-31589.

249. Ksenzenko M., Konstantinov A.A., Khomutov G.B., Tikhonov A.N., Ruuge E.K.Effect of electron transfer inhibitors on superoxide generation in the cytochrome bcl site of the mitochondrial respiratory chain // FEBS Lett.- 1983.-V. 155, N 1.- P. 19-24.

250. Kuno N., Furuya M. Phytochrome regulation of nuclear gene expression in plants // Cell Developmental Biol. 2000,- V. 11.- P. 485^193.

251. Laloi M., Klein M., Riesmeier J. W., Muller-Rober В., Fleury C., Bouilland F., Ricquier D. A plant cold-induced uncoupling protein // Nature.- 1997.- V. 389.-P. 135-136.

252. Lamb Y.E., Riezman H., Becker W.M., Leaver J. Regulation of glyoxysomal enzymes during germination of cucumber. II. Isolation and immunological detection of isocitrate lyase and catalase // Plant Physiol.-1978.-V.62, N 3.-P.754-760.

253. Lambers H. Cyanide-resistant respiration. A non-phosphorylationg electron transport pathway acting as energy overflow // Physiol. Plant.- 1982.- V.55, N 4.-P.478-484.

254. Lance CI., Rustin P. The Central Role of Malate in Plant Metabolism // Physiol. Veg. 1984. V.22. N 5. P.625-641.

255. Latruffe N. and Vamacq J. Peroxisome proliferators and peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) as regulators of lipid metabolism // Biochimie.-1997.- V. 79.- P. 81-94.

256. Lazarow, P.B. Rat liver peroxisomes catalize the P-oxidation of fatty acids // J. Biol. Chem.- 1978.- V. 253.- P. 1522-1528.

257. Lazarow, P. В and De Duve, C. A fatty acyl-CoA oxidizing system in rat liver peroxisomes; enhancement by clofibrate, a hypolipidemic drug // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976.- V. 73.- P. 2043-2046.

258. Lazarow P.B., Fujiki J. Biogenesis of peroxisomes // Ann.Rev.Cell Biol.-1985.-V.I.- P.489-530.

259. Ledenev AN, Konstantinov AA, Popova E, Ruuge EK. A simple assay of the superoxide generation rate with Tiron as an EPR-visible radical scavenger// Biochem Int- 1986,- V.13, N 2.- P. 391-396.

260. Leif, H., Sled', V.D., Ohnishi, Т., Weiss, H., and Friedrich, T. Isolation and characterization of the proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductase from Escherichia coli // Eur .J. Biochem.- 1995.- V.230.- P. 538-548.

261. Lin EC., Iuchi S. Regulation of gene expression in fermentative and respiratory systems in Escherichia coli and related bacteria // Annual Review of Genetics.-1991,- V.25, P.361-387.

262. Ling V., Snedlen W.A., Shelp B.J., Assman S.M. Analysis of a soluble calmodulin binding protein from fava bean roots: identification of glutamate decarboxylase as a calmodulin activated enzyme // Plant Cell.-1994.-V.6.-P.l 135-1143.

263. Liochev SI, Fridovich I. The role of 02.- in the production of HO.: in vitro and in vivo // Free Radic. Biol. Med.- 1994.- V. 16.- P.29-33.

264. Lombardo A., Carine K., Scheffler IE. Cloning and characterization of the iron-sulfur subunit gene of succinate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // Journal of Biological Chemistry.- 1994- V. 265, N18.- P.10419-10423.

265. Lombardo A., Cereghino GP., Scheffler IE. Control of mRNA turnover as a mechanism of glucose repression in Saccharomyces cerevisiae // Molecular & Cellular Biology.- 1992.- V.12, N7.- P.2941-2948.

266. Lopez-Huertas E., Corpas F.J., Sandalio L.M., del Rio L.A. Characterisation of membrane polipeptides from pea leaf peroxisomes involved in superoxide generation // Biochem. J.- 1999.- V.337.- P.531-536.

267. Lowry O., Rosenbrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin-phenol reagent // J.Biol.Chem. 1951.- V.194.- P.265-275.

268. Liu F., Thatcher J.D., Barral J.M., Epstein H.F. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegants: a developmentally regulated protein of intastine and muscule //Developmental Biology.- 1995.- V.169.- P. 399-414.

269. Liu S.S., Huang J.P. Proc. of Intern. Symp. on Natural Antioxidants: Molecular Mechanisms and Health Effects.- 1996.- D.Moores, ed. AOCS Press, Champaign, IL.- P. 112-118.

270. Liu S.S Cooperation of a "reactive oxygen cycle" with the Q cycle and the proton cycle in the respiratory chain—superoxide generating and cycling mechanisms in mitochondria // J Bioenerg Biomembr.- 1999.- V. 31, N 4.-P.367-376.

271. Luster D.G., Donaldson R.P. Orientation of electron transport activities in the membrane of intact glyoxysomes isolated from castor bean endosperm // Plant Physiol. 1987. V.85. N 3. P.796.

272. Mackenzie, S., Mcintosh, L. Higher plant mitochondria // Plant Cell.- 1999,- V. 11.-P. 571-579

273. Macri F., Vianello A., Petrussa E., Mokhova E. N. Effect of carboxyatractylate on transmembrane electrical potential of plant mitochondria in different metabolic states // Biochem. Mol. Biol. Int.- 1994.- V. 34.- P. 217-224.

274. Malhotra O.P., Srivastava P.K. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm //Arch.Biochem. and Biophys.-1982.-V.214, N 1.- P. 164171.

275. Manodori A., Cecchini G., Schroder I., Gunsalus RP., Werth MT., Johnson MK. 3Fe-4S. to [4Fe-4S] cluster conversion in Escherichia coli fumarate reductase by site-directed mutagenesis // Biochemistry.- 1992.- V.31, N10,- P.2703-2712.

276. Matsushita, K., Ohnishi, Т., and Kaback, H.R. NADH-ubiquinone oxidoreductases of the Escherichia coli aerobic respiratory chain // Biochemistry.- 1987.- V. 26.- P. 7732-7737.

277. Maxwell D.P., Maxwell M.D., Nanssler G., Armentrout W.H., Murroy G., Hock H.C. Microbodies and glyoxylate cycle enzymes activities in filamentous fungi // Planta.- 1975.- V.124.N 1.- P.109-123.

278. McCullough W., Shanks A. Properties of genes involved in the control of isocitrate lyase production in Aspergillus nidulans // Journal of General Microbiology.- 1993.- V.139, Pt 3.- P.509-511.

279. McFadden B.A., Howes W.V. Crystallization and some properties of isocitrate lyase from Pseudomonas indigofera // J.Biol.Chem.- 1963.- V.238, N 15.-P.1737-1742.

280. Mcintosh L. Molecular biology of the alternative oxidase // Plant Physiology.-1994.- V.105, N3.- P.781-786.

281. McKindly M.P., Trelease R.N. Glyoxilate cycle enzymes and catalase in digitonin-fractionated mitochondria in Turbatrix aceti // Protoplasma.- 1978.-V.94, N2.- P.249-261.

282. McLaughlin S.G.A., and Dilger J.P. Transport of protons across membranes by weak acids //Physiol.Rev.- 1980.-V.60.-P.825-863.

283. McLaughlin Y.C., Smith S.M. Metabolic regulation of glyoxylate cycle enzyme synthesis in detached cucumber cotyledons and protoplasts //Planta.- 1994.-V.195, N 1.- P.22-28.

284. McNew JA. Goodman JM. An oligomeric protein is imported into peroxisomes in vivo // Journal of Cell Biology.-1994.-V. 127, N 5.- P. 1245-57.

285. Melin L., Rutberg L., von Gabain A. ranscriptional and posttranscriptional control of the Bacillus subtilis succinate dehydrogenase operon // Journal of Bacteriology.- 1989.- V.171,N4.- P.2110-2115.

286. Millar A.N. Bergersen. F.J. and Day. D.A. Regulation of Alternative Oxidase Activity by Pyruvate in Soybean Mitochondria // Plant Physiol. Biochem.-1994.- V. 32.- P. 847-852.

287. Millerd A., Morton R.K., Wells Y.R.E. Role of isocitrate lyase in synthesis of oxalic acid in plants // Nature.- 1962.-V. 196, N 4858.- P.955-956.

288. Millhouse J., Wiskich J.T. Control of the Citric Acid Cycle in Mitochondria from Germinating Castor Bean Endosperm // Plant.Sci.- 1986.- V.46, N 1.- P. 15-34.

289. Minagawa N. Koga S. Nakano M. Sakajo S. Yoshimoto A. Possible involvement of superoxide anion in the induction of cyanide-resistant respiration in Hansenula anomala // FEBS Letters.- 1992.- V.302, N3.- P.217-219.

290. Moll R., Schafer G. Purification and characterisation of an archaebacterial succinate dehydrogenase complex from the plasma membrane of the thermoacidophile Sulfolobus acidocaldarius // European Journal of Biochemistry.- 1991.- V.201,N3.- P.593-600.

291. Moller I.M. A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases // Trends Plant Sci.-2002.-V. 7, N 6.- H. 235-237.

292. Moore A.L., Dry J.B., Wiskich J.T. Measurment of the redox state of the ubiquinone pool in plant mitochondria // FEBS Letter.- 1988.- V.235, N 1-2.-P.76- 80.

293. Moore AL. Umbach AL. Siedow JN. A structural model of the alternative oxidase of plant mitochondria // Biochemical Society Transactions.- 1995,- V.23, N2.- P.151S.

294. Moreau R.A., Huang L.H.C. Gluconeogenesis from storage wax in the cotyledons of yojoba seedlings // PI. Physiol. 1977.- V.60.- P.329-333.

295. Mullen R.T., Gifford D.J. Isocityrate luase from germinated loblolly pine megagametophytes: Enzyme purification and immunocharacterization //Plant Physiol, and Biochem.- 1995.- V.33, N 1.- P.87-95.

296. Muller M., Hogg Y.F., De Duve C. Distribution of tricarboxylic acid cycle enzymes and glyoxylate cycle enzymes between mitochondria and peroxisomes in Tetrahymena pyriformis //J.Biol.Chem.-1968.-V.243.- P.5385-5395.

297. Murray R. K, Granner D. K,. Mayes P. A., Rodwell, V. W. Herper's Biochemestry. Appleton & Lange.- 1988.- P. 384.

298. Muto S., Beevers H. Lipase activities in castor bean endosperm during germination // Plant Physiol.-1974. -V.54.- P.23-28.

299. Nakayma N., Sugimoto J., Asahi J. Presence of soluble succinate dehydrogenase in dry pea cotyledons that is assembled into the mitochondria inner membrane during seed imbibition // Plant Physiol.- 1980- V.65, N 2,- P.229-233.

300. Neuburger M., Day D.A., Douse R. Transport of NAD in percoll purified potato tuber mitochondria. Inhibition of NAD-influx efflux by N-4-arido-2- nitrophenil-L-aminobutiril-3-NADH // Plant Physiol.- 1985.- V.78, N2.- P. 405-412.

301. Nielson A.M., Taylor G.A. Photogetotrophic utilization of acetate by wild type and an acetate adapted mutant of Phodopseudomonas capsulata //Arch.Microbiol.-1979.-V.120.-N 1.- P.39-42.

302. Nishimura M., Beevers H. Subcellular distribution of gluconeogenetic enzymes in germinating castor bean endosperm // Plant Physiol.- 1979.- V.64.- P.31 -37.

303. Oelze-Karow H, Schopfer P, Mohr H. Phytochromemediated repression of enzyme synthesis (lipoxygenase): A threshold phenomenon // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1970.- V. 65.- P. 51-57.

304. Oestreicher G., Hogue P., Singer T.P. Regulation of succinate dehydrogenase in higher plants. Activation by substrates, reduced coenzyme Q, nucleotides and anions // Plant Physiol.-1973.- V.52.- P.622-626.

305. O'Kane D., Gill V., Boyd P., Burdon R. Chilling, oxidative stress and antioxidant responses in Arabidopsis thaliana callus // Planta.- 1996.- V. 198, N3.- P. 371377.

306. Olsen LJ., Ettinger WF., Damsz В., Matsudaira K., Webb MA., Harada JJ. Targeting of glyoxysomal proteins to peroxisomes in leaves and roots of a higher plant // Plant Cell.- 1993.- V.5, N8.- P.941-952.

307. Ono K., Okinashi M., Jnui H., Miytake K., Kitaora S. Purification and characterization of isocitrate lyase from ethanol-grown Euglena gracilis // J.Eucaryotic Microbiology.-1994.-V.41, N 6.- P.536-539.

308. Onyeocha I., Behari R., Hill D., Baker A. Targeting of castor bean glyoxysomal isocitrate lyase to tobacco leaf peroxisomes // Plant Molecular Biology.- 1993.-V.22, N3.- P.385-396.

309. Ordiz I., Herrero P., Rodicio R., Moreno F. Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae is mediated by an internal decapeptide sequence // FEBS Letters.- 1995,- 367, N3,- P.219-222.

310. Ordiz I., Herrero P., Rodicio R., Moreno F. Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae is mediated by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits Tpkl and Tpk2 // FEBS Lett.- 1996.-V. 385, N 1.- P. 43-46.

311. Osumi M., Kazama H., Sato S. Microbody-associated DNA in Candida tropicalis pK 233 cells //FEBS Lett.-1978.-V.90, N 2.- P.309-312.

312. Palmer J.M. The mechanism and regulation of malate oxidation in isolated plant mitochondria//Physiol. Veg.- 1984,- V.5.- P.665-673.

313. Parsons, H.L., Yip, J.Y.H., Vanlerberge, G.C. Increased respiratory restriction during phosphate-limited growth in transgenic tobacco cells lacking alternative oxidase // Plant Physiol.- 1999.-V. 121.- P. 1309-1320.

314. Perez-Esteban J, SanJose C, Jaspe A. Lipase activity of Pseudomonas fluorescens in cold raw skim milk with different lipid supplements // Folia Microbiol (Praha).- 1997.- V. 42, N 4.- P.345-348

315. Perkins W.R. and Cafiso D.S. Characterization of H+/OH- currents in phospholipid vesicles // J. Membr. Biol.- 1987.- V.96.- P. 165- 173.

316. Pinzauti G., Giachetti E., Vanni P. Isocitrate lyase of conifers (Pinus pinea).// Int. J.Biochem.-1982.-V. 14, N 4.- P.267-275.

317. Pobezhimova Т., Voinikov V., Varakina N. The Effect of Temperature on the Energetic Activity of Maize Mitochondria // Plant Science. 1996. V.1114. P.29-33.

318. Pollock J., binder R., Salton M. Characterization of the membranebound succinate dehydrogenase of Micrococcus lysodeikticus // J.Bacteriol.-1971.-V.107, N 1.- P.230-238.

319. Poole, R.K. Oxygen reactions with bacterial oxidases and globins: binding, reduction and regulation // Antonie van Leewenhoek.- 1994.- V. 65.- P. 289310.

320. Poole, R.K., and Hill, S. Respiratory protection of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii—roles of the terminal oxidases // Bioscience Reports.-1997.-V. 17, N3.-P. 303-317.

321. Popov V.N., Simonyan R.A., Skulachev V.P., Starkov A.A. Inhibition of alternative oxidase activity stimulates H202 production in plant mitochondria // FEBS Letters.- 1997.- V. 415, N1.- P. 87-90.

322. Post, E., Kleiner, D., and Oelse, J. Whole cell respiration and nitrogenase activities in Azotobacter vinelandii growing in oxygen controlled continuous culture //Arch.Microbiol.- 1983.- V.134.- P. 68-72.

323. Prasad Т.К., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. Evidence for Chilling-Induced Oxidative Stress in Maize Seedlings and a Regulatory Role for Hydrogen Peroxide // Plant Cell.- 1994.- V.6, N1.- P. 65-74.

324. Purvis, A.C., Shewfelt, R.L. Does the alternative pathway ameliorate chilling injury in sensitive plant-tissues? // Physiol. Plant. -1993,- V. 88.- P. 712-718.

325. Purvis, A.C., Shewfelt, R.L. & Gegogeine, J.W. Superoxide production by mitochondria isolated from green bell pepper fruit // Physiol. Plant. -1995.- V. 94, P. 743 749.

326. Purvis, A.C. Role of the alternative oxidase in limiting superoxide production by plant mitochondria//Physiol. Plant.- 1997.-V. 100.-P. 165-170.

327. Quest J.R., Dallison M.G., Wilde R.J., Wood D. Structural comparison of the succinate dehydroOgenase and fumarate reductase of Escherichia coli. //Flavins and Flavoproteins proc. 8 the Jut.Symp., Berlin, New York.-1984.- P.225-228.

328. Raghavendra A.S., Padmasree K., Saradadeve K. Interdenendence of photosyntesis and resoiration in plant cells: Interaction between chloroplasts and mitochondria//Plant Sci.- 1994.- V. 97.- P. 1368-1371.

329. Rauen U., Polzar В., Stephan H., Mannherz H.G., De Groot H. Cold-induced apoptosis in cultured hepatocytes and liver endothelial cells: mediation by reactive oxygen species // FASEB J.- 1999.- V.13.- P. 155-168.

330. Reddy TL., Weber MM. Solubilization, purification, and characterization of succinate dehydrogenase from membranes of Mycobacterium phlei // Journal of Bacteriology.- 1986. V.167, N1.- P. 1-6.

331. Reich J., Selkov E. Energy metabolism of the cell: theoretical treatise // L.: Acad. Press, 1981.- 345p.

332. Reynolds SJ., Smith SM. The isocitrate lyase gene of cucumber: isolation, characterisation and expression in cotyledons following seed germination // Plant Molecular Biology.- 1995.- V.27, N3.- P.487-497.

333. Riche P.R., Bonner W.D. EPR srudies of higher plant mitochondria and its relation to alternative respiratory oxidation // Biochim amd Biophys.acta.-1978.-V.501, N 1.- P.381-395.

334. Riche P.R., Moore A.L., Bonner W.D. The effects of bathophenauthroline bathophenauthrolinessulphonate and 2.Thenoyltriffuoroacetone on mungbean mitochondria and subnitochondrial particles // J.Biochem.-1977.-V.162.- P.205-208.

335. Riezman H., Weir E., Leaver C., Titus D., Becker W. Regulation of glyoxysomal enzymes during germination of cucumber. III. In vitro translation and characterization of four glyoxysomal enzymes // Plant Physiol.-1980.-V.65, N 1.-P.40-46.

336. Ricquier D., Bouillaud F. The uncoupling protein homologues: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP // Biochem J.- 2000.- V. 345, N 2,- P. 161-179

337. Roche Т., McFadden B.A., Williams J.O. Modification of the active site of isocitrate lyase from Pseudomonas indigofera // Arch.Biochem. and Biophys.-1971.- V.147, N 1.- P. 192-200.

338. Rottenberg H., Decoupling of oxidative phosphorylation and photophosphorylation // Biochim.Biophys.Acta.- 1990.- V.1018.- P.l-17.

339. Rua J., Soler J., Busto F., de Arriaga D. The pH dependence and modification by diethyl pyrocarbonate of isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus // European Journal of Biochemistry.- 1995.- V. 232, N 2.- P.381-390,

340. Rubin H., Trelease R.N. Subcellular localization of glyoxylase cycle enzymes in Ascaris suum larvae //J.Cell Biol.- 1976.- V.70.- P.374-383.

341. Ruuge E.K., Ledenev A.N., Lakomkin V.L., Konstantinov A.A., Ksenzenko M.Yu.Free radical metabolites in myocardium during ischemia and reperfusion // Am. J. Physiol.- 1991.- V. 261, N4 Suppl.- P. 81-86.

342. Samartsev VN, Mokhova EN, Skulachev VP.The pH-dependent reciprocal changes in contributions of ADP/ATP antiporter and aspartate/glutamate antiporter to the fatty acid-induced uncoupling // FEBS Lett.- 1997.- V. 412, N1 .P. 179-182.

343. Sandalio L.M., Del Rio L.A. Intraorganellar distribution of superoxide dismutase in plant peroxisomes //Plant Physiol. 1988. V.88. N 4. P.1215.

344. Sandeman RA., Hynes MJ., Fincham JR., Connerton IF. Molecular organisation of the malate synthase genes of Aspergillus nidulans and Neurospora crassa // Molecular & General Genetics.- 1991.- V.228, N3.- P.445-452.

345. Santos MJ. Imanaka T. Shio H. Small GM. Lazarow PB. Peroxisomal membrane ghosts in Zellweger syndrome—aberrant organelle assembly // Science.-1988.-V. 239, P. 1536-1538.

346. Satya Narayan V., Nair P.M. The 4-aminobutyrate shunt in Solanum tuberosum //Phytochemistry1986.-V.25.- P.997-1001.

347. Satya Narayan V., Nair P.M. Metabolism, enzymology and possible roles of 4-aminobutyrate in higher plants // Phytochemistry.-1990.-V.29.- P.367-375.

348. Sautter C., Keller G., Hock B. Glyoxysomal citrate synthase from watermelon cotyledons immunocytochemical localization and heterologous translation in Xenopus oocytes // Planta.-1988.-V.173, N 3.- P.289-295.

349. Saviani E. E., Martins I. S. Fatty acid-mediated uncoupling of potato tuber mitochondria // Biochem. Mol. Biol. Int.- 1998.- V. 44.- P. 833 839.

350. Schnarrenberger C.A., Oeser A., Tolbert N.E. Development of microbodies in sunflower cotyledons and castor bean endosperm during germination // Plant Physiol. 1971. V.48. N 5. P.566.

351. Scholer A., Schuller HJ. Structure and regulation of the isocitrate lyase gene ICL1 from the yeast Saccharomyces cerevisiae // Current Genetics.- 1993.- V.23, N5-6.- P.375-381.

352. Scholze, H. Studies on aconitase species from Saccharomyces cerevisiae, porcine and bovine heart, obtained by a modified isolation method // Biochim. Biophys. Acta.- 1983.- V. 763.- P. 133 137.

353. Schumacker P.T. Hypoxia, anoxia, and 02 sensing: the search continues // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.- 2002.- V. 283, N 5, P. 918-921.376.377.378.379.380.381.382.383384,385386387388389390391392

354. Selman С., McLaren J.S., Himanka M.J., Speakman J.R. Effect of long-term cold exposure on antioxidant enzyme activities in a small mammal // Free Radic. Biol. Med. 2000.- V.28, N8.- P.1279-1285.

355. Shelp B.Y., Walton C.S., Snedden W.A., Tuin L.G., Oresnik J.J., Layzell D.B. Gaba shunt in developing soybean seeds is associated with hypoxia // Physiol.Plantarum.-1995.-V.94, N 2.- P.219-228.

356. Siedow JN. Umbach AL. Moore AL. The active site of the cyanide-resistant oxidase from plant mitochondria contains a binuclear iron center // FEBS Letters.-1995.- V. 362, N1.- P. 10-14.

357. Silverthom J., Tobin E. M. Demonstration of transkriptional regulation of specific genes by phitochrom action // Proc. Natl. Acad. sci. USA. 1984. Vol. 81, №4. P. 1112-1116.

358. Silverman PM., Rother S., Gaudin H. Arc and Sfr functions of the Escherichia coli K-12 arc A gene product are genetically and physiologically separable // Journal of Bacteriology.-1991.- V. 173, N18.- P.5648-5652.

359. Simonyan R., Skulachev V.P. Thermoregulatory uncoupling in heart muscle mitochondria: involvement of the ATP/ADP antiporter and uncoupling protein // FEBS Lett.- 1998.- V. 436, N 1.- P. 81-84.

360. Simonyan RA, Jimenez M, Ceddia RB, Giacobino JP, Muzzin P, Skulachev VP. Cold-induced changes in the energy coupling and the UCP3 level in rodent skeletal muscles // Biochim Biophys Acta.- 2001.- V. 1505, N2-3,- P. 271-279.

361. Singer T.P., Gutman M., Kearney E. On the meed for regulation of succinate dehydrogenase //FEBS Lett.-1971.-V.17, N1.- P. 11-18.

362. Singer Т., Gutman M., Massey J. Iron-sulfur flavoprotein dehydrogenases // Iron sulfur Proteins.-N.Y.-L.: Acad.Press.-1973.-V.l.- P.225-300.

363. Singer T.P., Kearney E.B. Solubilization assay and purification of succinate dehydrogenase // Biochem Biophys. Acta.-1954.-V.15.- P.151-153.

364. Skulachev V. P. Membrane bioenergetics. Springer, Berlin.- 1988. 566 p.

365. Skulachev V. P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation //FEBS Lett.- 1991.-V. 294.-P. 158-162.

366. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidation in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants.// Quart. Rev. of Biophys. 1996.- V.29. P. 169-202.

367. Skulachev V.P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation // Biosci Rep.- 1997.- V. 17, N 3.- P. 347-366

368. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics //Biochim. Biophys. Acta.- 1998.- V. 1363.- P. 100-124.

369. Skulachev V. P. Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling. // J. Bioenerg. Biomembr.- 1999.- V. 31.- P. 431-445.

370. Skulachev V.P., Sharaf A.A, Liberman E.A. Proton conductors in the respiratory chain and artificial membranes //Nature.- 1967.- V.216.- P.718.

371. Skulachev V.P., Sharaf A.A, Yagujinsky L.S., Yasaitis A.A., Liberman E.A., Topaly V.P. The effect of uncouplers on mitochondria, respiratory enzyme complexes and artificial phospholipid membranes // Currents Modern Biol.-1968.- V.2.- P.96.

372. Snedden W.A., Arazi Т., Fromm H., Shelp B.J. Calcium / Calmodulin activation of soybean glutamate decarboxylase // Plant Physiol.-1995.-V.108, N 3.- P.543-549.

373. Sones R.W., Kranz R.G., Gennis R.S. Immunochemical analysis of the membrane bound succinate dehydrogenase of Escherichia coli // FEBS Lett.-1982.-V.142, N 1.- P.81-85.

374. Spector L.B. Citrate cleavage and related enzymes.-In.: Enzymes. New York-London, 1972, p.357-389.

375. Spiro S., Guest JR. Adaptive responses to oxygen limitation in Escherichia coli // Trends in Biochemical Sciences. -1991a.- V. 16, N8.- P.310-314.

376. Spiro S., Guest JR. FNR and its role in oxygen-regulated gene expression in Escherichia coli //FEMS Microbiology Reviews.-199lb.- V. 6, N4,- P.399-428.

377. Starkov A.A., V.I.Dedukhova, V.P.Skulachev 6-ketocholestanol abolishes the effect of the most potent uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria //1994.- FEBS Lett.- V.355.- P.305-308.

378. Steffan J.S., Minard K.I., McAlister-Henn L. Expression and function of heterologous forms of malate dehydrogenase in yeast // Arch. Biochem. Biophys.- 1992,- V. 293, N 1.- P. 93-102.

379. Storey K.B. Oxidative stress: animal adaptations in nature // Braz J. Med. Biol. Res.- 1996.- V.29, N12.- P. 1715-1733.

380. Surendranathan K.K., Nair P.M. Purification and characterization of a natural inhibitor for isocitrate lyase present in gamma-irradiated preclimacteric banana //Plant Sci.Rett.-1978.- V.12, N 2.- P.169-175.

381. Swinkels BW. Gould SJ. Subramani S. Targeting efficiencies of various permutations of the consensus C-terminal tripeptide peroxisomal targeting signal // FEBS Letters.-1992.-V. 305, N2. P.133-136.

382. Szabo A.S., Avers C.J. Some aspect of regulation of peroxisomes and mitochondria in yeast //Ann.N.Y.Acad.Sci.-1969.-V.168.- P.302-312.

383. Taylor A. O, Bonner B. A. Phytochrome in plants // Plant Phisiol. 1968. Vol. 59. P.376 379.

384. Thermer R.R., Anding G., Matzner P. Kinetic action on the development of microbody enzymes in sunflower cotyledons in the dark //Planta.-1976.-V.128, N 1. p.41-47.

385. Ting H.P., Wilson D.G., Chance B. Effects of uncouplers of oxidative phosphorylation on the specific conductance of bimolecular lipid membranes // Arch.Biochem.Biophys.- 1970.- V.141.- P.141.

386. Titus DE., Becker WM. Investigation of the glyoxysome-peroxisome transition in germinating cucumber cotyledons using double-label immunoelectron microscopy //Journal of Cell Biology .-1985.- V. 101, N4,- P.1288-1299.

387. Tolbert N.E. Microbodies-peroxisomes and glyoxysomes.//Ann.Rev.Plant Physiol.-1971.-V.22.- P.45-74.

388. Trelease R.N., Biogenesis of glyoxysomes //Ann.Rev.Plant Physiol.- 1984.-V.35.- P.321-347.

389. Tsukamoto T. Shimozawa N. Fujiki Y. Peroxisome assembly factor 1: nonsense mutation in a peroxisome-deficient Chinese hamster ovary cell mutant and deletion analysis // Molecular & Cellular Biology.-1994,- V.14.- N 8.- P.5458-5465.

390. Turrens JF., Boveris A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria // Biochem. J.- 1980.- V.191.-P.421-427.

391. Umbach AL. Wiskich JT. Siedow JN. Regulation of alternative oxidase kinetics by pyruvate and intermolecular disulfide bond redox status in soybean seedling mitochondria//FEBS Letters. -1994.- V.348, N2.- P. 181-184.

392. Van Breusegem F., Slooten L., Stassart J.M., Moens Т., Botterman J., Van Montagu M., Inze D. Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize // Plant Cell Physiol.- 1999.- V. 40, N5.- P. 515-523.

393. Van Hellemond JJ., Tielens AG. Expression and functional properties of fumarate reductase // Biochemical Journal.-1994.- V. 304, Pt 2.- P.321-331.

394. Vanlerberghe GC. Mcintosh L. Mitochondrial electron transport regulation of nuclear gene expression. Studies with the alternative oxidase gene of tobacco // Plant Physiology.-1994.- V. 105, N3,- P.867-874.

395. Vanni P., Vincenzini M.T. The presence of isocitrate lyase and malate synthase activity in germinating Ginkgo biloba seeds.// Experientia.-1972.-V.28, N 4.-P.405-406.

396. Vanni P., Vincenzini M.T., Nerozzi F.M., Sinna S.P. Studies on isocitrate lyase isolated from Lupinus colyledons // Can.J.Biochem.-1979.-V.57, N 9,- P. 11311137.

397. Vaughn K.C., Stegink S.Y. Peroxisomes of soybean root nodule vascular parenchyma cells contain a "nodule-specific" urate oxidase // Physiol. Plantarum.- 1987.-V.71, N 3.- P.251-256.

398. Vercesi A. E., Martins I. S., Silva M. A. P., Leite H. M. F., Cuccovia I. M., Chaimovich H. PUMPing plants //Nature.- 1995.-V. 375,- P. 24.

399. Verniquet F. Gaillard J. Neuburger M. Douce R. Rapid inactivation of plant aconitase by hydrogen peroxide // Biochemical Journal.-1991.- V. 276, Pt 3.-P.643-648.

400. Vincenzini M.T., Nerozzi F., Vincieri F., Vanni B. Isolation and properties of isocitrate lyase from Lupinus seeds //Phytochemistry.-1980.-V. 19, N 5.- P.769-774.

401. Vinogradov AD., Winter D., King ТЕ. The binding site for oxaloacetate on succinate dehydrogenase // Biochemical & Biophysical Research Communications.-1972.- V. 49, N2.- P.441-444.

402. Vinogradov AD., Zuevsky W. The sulfhydryl groups and stability of the soluble succinate dehydrogenase // FEBS Letters.-1973.- V. 36, N1.- P.99-101.

403. Vinogradov AD., Gavrikova EV., Goloveshkina VG. A new ferricyanide reactive site in soluble succinate dehydrogenase // Biochemical & Biophysical Research Communications. -1975b.- V. 65, N4,- P.1264-1269.

404. Vinogradov AD., Gavrikova EV., Zuevsky W. Reactivity of the sulfhydryl groups of soluble succinate dehydrogenase // European Journal of Biochemistry.-1976a.- V. 63, N2.- P.365-371.

405. Vinogradov AD., Goloveshkina VG., Gavrikova EV. Regulation of succinate dehydrogenase: does the membrane environment change the catalytic activity of the enzyme? // Advances in Enzyme Regulation.-1976b.- V. 15:23- P.31.

406. Vinogradov A.D., Grivennikova V.G., Gavrikova E.V. The catalytic activity of soluble and membrane bound succinate dehydrogenase // FEBS Lett.-1977.-V.73, N 2.- P.235-238.

407. Vinogradov AD., Gavrikov VG., Gavrikova EV. Studies on the succinate dehydrogenating system. II. Reconstitution of succinate-ubiquinone reductase from the soluble components // Biochimica et Biophysica Acta.-1980.- V. 592, N1.- P.13-27.

408. Wagner A.M. A role for active oxygen species as second messengers in the induction of alternative oxidase gene expression in Petunia hybrida cells II FEBS Letters.- 1995.- V. 368, N2.- P.339-342.

409. Wagner A.M., Krab, K. The alternative respiration pathway in plants: role and regulation. // Physiol. Plant. 1995.- V. 95.- P. 318-325.

410. Wagner A.M., Kraak M.H.S., van Emmerik W.A.M., van der Plas L.H.W. Respiration of plant mitochondria with various substrates: Alternative pathway with NADH and TCA cycle derived substrates II Plant Physiol.Biochem.-1989.-V.27, N 6.- P.837-845.

411. Wagner A.M., Moore A. Alternative oxidase: its possible role // Bioscience Reports. 1997.- V. 17, P. 319-333.

412. Walker W.H., Singer T.P., Ghista S. Studies of succinate dehydrogenase 8-hystidil-FAD as the active occupy of succinate dehydrogenase // Eur.J.Biochem.-1972.- V.29, N 2.- P.279-289.

413. Walker W.H., Singer T.P. Idenrification of the covalently bound flavin of succinate dehydrogenase as 8-(histidyl)-flavinadenine dinucleotide // J.Biol.Chem.-1970.-V.245, N 6.- P.4224-4225.

414. Weisiger R.A., Fridovich I. Superoxide dismutase. Organelle specificity // J.Biol.Chem.- 1973. -V.248,N 10,- P.3582-3588.

415. Whelan J. Mcintosh L. Day DA. Sequencing of a soybean alternative oxidase cDNA clone //Plant Physiology.- 1993 .- V.103, N4.- P.1481.

416. Whelan J. Smith MK. Meijer M. Yu JW. Badger MR. Price GD. Day DA. Cloning of an additional cDNA for the alternative oxidase in tobacco // Plant Physiology.-1995.- V. 107, N4.- P.1469-1470.

417. Wiesner R.J., Rosen P., Grieshaber M.K. Pathways of succinate formation and their contribution to improvement of cardiac function in the hypoxic rat heart // Biochem. Medicine and Metabolic Biology.- 1988.-V.4.- P. 19-34.

418. Wilson B. Cyanide-insensetive oxidation of ascorbate+NNN'N'-tetramethil-p-phenilenediamine mixture by mung-bean (Phasoleus Aureus) Mitochondria // Biochem J.- 1978.- V.176.- P. 129-136.

419. Wilson D.F., Brooks E., Inhibition of mitochondrial respiration by hydroxylamine and its relation to energy conservation // Biochemistry.- 1970.-V.9.- P. 1090.

420. Wilson, T.M., Lehmann, J.M., Moore, L.B., Smith-Oliver, ТА., Wilkison, W.O. and Kliewer, SA. Peroxisomes. Biology and role in toxicology and desease symposium.- Aspen Co & NY Acad Sci.- 1995.- P. 231.

421. Wolins NE., Donaldson RP. Specific binding of the peroxisomal protein targeting sequence to glyoxysomal membranes // Journal of Biological Chemistry.-1994.- V. 269, N2.- P.l 149-1153.

422. Wood D., Darlison MG., Wilde RJ., Guest JR. Nucleotide sequence encoding the flavoprotein and hydrophobic subunits of the succinate dehydrogenase of Escherichia coli //Biochemical Journal. -1984.- V.222, N2,- P.519-534.

423. Woodcock E., Merrett M.Y. Malate synthase messenger Euglena // Arch.Microbiol.-1980.-V.124, N 1.- P.33-38.

424. Woodward Y., Merrett M.Y. Induction potential for glyoxylate cycle enzymesa during the cell cycle of Euglena gracilic.//Eur.Y.Biochem.-1975.-V.55.- P.555-559.

425. Wu.,G., Hill, S., Kelly, M.J.S., Sawers, G., and Poole, R.K. The cydR gene product, required for regulation of cytochrome bd expression in the obligate aerobe Azotobacter vinelandii, is an Fnr-like protein // Microbiol.- 1997.- P. 299311.

426. Yagi, T. Inhibition by capsaicin of NADH-quinone oxidoreductases is correlated with the presence of energy-coupling site 1 in various organisms // Arch.Biochem.Biophys.- 1990.- V. 281.- P. 305-311.

427. Yu C.A. Yu L. Mitochondrial ubiquinol-cytochrome с reductase complex: crystallization and protein: ubiquinone interaction // Journal of Bioenergetics & Biomembranes.- 1993.- V. 25, N3.- P.259-273.

428. Yu C.A., Yu L. Structural role of phospholipids in ubiquinol-cytochrome с reductase // Biochemistry.-1980.- V. 19, N25.- P.5715-5720.

429. Yu L., Wei Y.Y., Usui S., Yu C.A. Cytochrome b560 (QPsl) of mitochondrial succinate-ubiquinone reductase. Immunochemistry, cloning, and nucleotide sequencing // Journal of Biological Chemistry. -1992,- V.267, N34,- P.24508-245015.

430. Zhang JZ., Gomez-Pedrozo M., Baden CS., Harada JJ. Two classes of isocitrate lyase genes are expressed during late embryogeny and postgermination in Brassica napus L. // Molecular & General Genetics.-1993.- V. 238, N1-2,- P. 177184.

431. Zhang JZ., Laudencia-Chingcuanco DL. Comai L. Li M. Harada JJ. Isocitrate lyase and malate synthase genes from Brassica napus L. are active in pollen // Plant Physiology.- 1994.-V. 104, N3.- P.857-864.

432. Zhuang H, Hamilton-Kemp TR, Andersen RA, Hildebrand DF. The impact of alteration of polyunsaturated fatty acid levels on C6-aldehyde formation of Arabidopsis thaliana leaves // Plant Physiol.- 1996.- V. 111, N.3.- P. 805-812.

Информация о работе

Попов, Василий Николаевич
доктора биологических наук
Воронеж, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы