Организация метаболических процессов растений в условиях дефицита кислорода и повышенного содержания углекислого газа

Ершова, Антонина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Организация метаболических процессов растений в условиях дефицита кислорода и повышенного содержания углекислого газа
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Организация метаболических процессов растений в условиях дефицита кислорода и повышенного содержания углекислого газа"

РГ8 ОД 1 1 НОЯ 1985

На правах рукописи

ЕРШОВА АНТОНИНА НИКОЛАЕВНА

ОРГАНИЗАЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КИСЛОРОДА И ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕКИСЛОГО ГАЗА.

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических паук

Воронеж - 1996

Работа выполнялась в период 1974-1995 г. на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета и на кафедре ботаники Воронежского госпедуниверситета

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Землянухин А.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,профессор

Т.В. Чиркова

доктор биологических наук,-ведущий научный сотрудник

Н.А. Пронина

доктор биологических наук, профессор

А.Н. Пашков

Ведущая организация: Ботанический институт им.В.Л.Комарова РАН

седании диссертационного совета Д 063.48.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Воронежском государственном университете (394693, Воронеж, Университетская пл.,1 )

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Воронежского государственного университета

И____ 1996 года в :... часов на 8а-

Защита состоится

Автореферат разослан

/¿С

. 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,доктор биологических наук, профессор

Т.Н.Попова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем физиологии растений является выяснение механизмов адаптации к различным экстремальным условиям среды (Саляев,Кефели,1988; Веселова и др., 1993; Crawford, 1994). Исследования подобного рода важны как для разработки теории стрессов у растений, так и с практической точки зрения, позволяя использовать полученные знания для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, выведения устойчивых сортов, создания искусственных систем жизнеобеспечения.

Состав и Доступность атмосферного воздуха к клеткам растений является одним из наиболее подверженных изменениям экологических факторов. В процессе онтогенеза высшие растения или отдельные органы достаточно часто находятся в условиях дефицита кислорода (избыточное увлажнение, поливы, паводки, образование ледяной корки, наличие защитных покровов и т.д.).

Исследованию метаболических и анатомо-морфологических особенностей растений в условиях гипо- или аноксии посвящен целый ряд работ (Гринева, 1975; Гринева и др.,1988, 1993; Вартапетян, 1978, 1985; Vartapetian et al., 1990; Чиркова, 1983 - 1995, Закр-жевский, 1989, 1995; Crawford, 1985, 1994; Kennedy et al., 1992; Saglio, 1993; Fox et al., 1994). Однако в них в очень малой степени рассматривалось действие кратковременного (до суток) анаэробиоза, адаптационные перестройки при котором значительно отличаются от того, что наблюдается у растений в условиях длительного дефицита кислорода (Good, Muench, 1993). Практически не изучены особенности обменных процессов у растений после прекращения воздействия аноксических условии. В то же время эта проблема требует гораздо большего внимания, так как характеризовать степень адаптации растений к неблагоприятным условиям среды может и их способность восстанавливать нормальный обмен после действия различных по длительности повреждающих факторов (Чиркова, 1988; Crawford et al.,1994).

Крайне мало уделялось внимание исследованию влияния одного из важнейших компонентов газовой среды-углекислому газу, накопление которого в результате дыхательного метаболизма сопровождает и, даже усиливает, все эффекты гипо- и аноксии (Ракитина, 1985; Зем-лянухин и др.,1977, 1988; Andrews et al.,1989). Однако установлено, что исключение СОг из среды не предотвращало, а наоборот усиливало накопление в клетках растений таких токсических продук-

тов анаэробного метаболизма, как этанол (БгаиГогс} еЬ а1.,1984).

В отличие от исследований действия углекислого газа на организм человека и животных, которые ведутся достаточно широко (Гу-лый, Мельничук, 1978), изучение роли СОг в нефотосинтетическом метаболизме растений исследовалось гораздо в меньшей степени. Отсутствие . ясности в вопросе о способности повышенных концентраций диоксида углерода даже при кратковременном воздействии влиять на метаболические процессы растений, требовало проведения подобных исследований. При этом абсолютно остался не затронутым вопрос о влиянии углекислого газа на мембранные структуры растительных клеток, строение их липидного компонента и функционирование.

■ .Известна важная роль фитогормонов, в частности цитокининов, в процессах адаптации растений к различным стрессам (Жолкевич и др.,1993; апИ, Ыеишал et а1.,1990). Однако возможные механизмы действия цитокининов на растения в условиях гипо- и аноксии не исследовались.

'' Решение данных проблем позволило бы не только выяснить пути и механизмы адаптации растений к условиям кратковременного дефицита кислорода, но и определить роль углекислого газа в этих процессах; показать участие регуляторов роста в системе метаболических перестроек. Это имеет не только важное практическое, но и теоретическое значение с точки зрения выяснения адаптационных механизмов растений на дефицит кислорода, как-часть общего механизма адаптации :к стрессовым воздействиям.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось исследование метаболических процессов растенМ ( обмен органических кислот, аминокислот, липидов, активность ряда ферментов) в условиях кратковременного дефицита кислорода или повышенного содержания углекислого газа и при возобновлении аэрации, а также действие фитогормона кинетина на липидный обмен и структуру биологических мембран в условиях кислородного стресса.

Исходя из целей работы были поставлены следующие задачи:

- Изучить особенности обмена органических кислот цикла Креб-са • у растений с разной степенью устойчивости в условиях кратковременного дефицита кислорода и среды углекислого газа, а также при возобновлении аэрации, используя 14С-соединения.

- Выяснить возможные пути накопления у растений "стрессовых аминокислот"- ГАМК и аланина, в условиях кислородной недостаточ-

ности и повышенного содержания СОг, определить скорость их мета-болизации в постанаэробном периоде.

- Исследовать роль экзогенных 14С-субстратов и эндогенно образованных соединений в репарации дыхательного метаболизма растений после действия СОг-среды в сравнении с обычным анаэробиозом.

- Изучить влияние повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточный рН и активность ряда ферментов растений.

- Провести исследование участия ГАМК в реакциях, связанных с циклизацией ее углеродного скелета, используя разномеченные формы ГАМК и ингибиторный анализ.

- Разработать методы выделения и количественного определения соединения гликозидной природы. Выяснить распространение и роль этого соединения в метаболических процессах растений в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода.

- Исследовать влияние повышенных концентраций углекислого газа и дефицита кислорода на метаболизм отдельных групп липидов. Изучить фосфолипидный обмен и влияние СОг на степень ненасыщенности фосфолипидов мембран митохондрий слабо- и среднеустойчивых растений.

- Выявить влияние среды повышенного содержания диоксида углерода на метаболизм свободных жирных кислот митохондриального фонда.

- Определить скорость процессов перекисного окисления липидов у растений при различных сроках действия СОг-среды и при восстановлении нормальной аэрации.

- Исследовать влияние регулятора роста кинетина на метаболизм фосфолипидов, свободных и связанных жирных кислот растений в условиях разных газовых сред, а так же на процессы ПОЛ для выяснения возможного механизма защитного действия.

- Разработать на основании полученных результатов модель механизма регуляции углекислым газом метаболических процессов растений, обуславливающих систему адаптационных перестроек в условиях кислородного стресса.

Научная новизна работы. Изучены особенности действия повышенных концентраций углекислого газа на метаболические процессы слабо- и среднеустойчивых к дефициту кислорода растений и выявлены значительные различия в системе их биохимических перестроек. Показано, что при кратковременном воздействии диоксида углерода

происходят изменения в обмене органических кислот и аминокислот, которые характерны для растений при более длительных сроках анок-сии. Это позволяет считать накапливающийся в клетках в условиях дефицита кислорода СОг эффективным регулятором клеточного метаболизма, который включает триггерные системы, обеспечивающие выживание растений в этих условиях.

Показано , что накопление значительных количеств ГАМК в клетках растений, вызванное действием высоких концентраций СОг, может выполнять функции биохимического рН-стата, препятствующего возникновению клеточного ацидоза в этих условиях.

Установлено, что изменение активности фермента ГДК в меньшей степени зависело от снабжения тканей кислородом, а определялась наличием в среде углекислого газа и коррелировало со степенью устойчивости растений к аноксии.

Результаты изучения скорости восстановительных процессов, включая интенсивность дыхания, обмен органических кислот и аминокислот, а также процессы ПОЛ, свидетельствуют об обратимости реакции растений на действие высоких концентраций углекислоты и отсутствие токсического последействия.

Обнаружен новый путь метаболизма непротеиногенной аминокислоты ГАМК в растениях гороха, связанный с циклизацией углеродного скелета ГАМК и образованием пирролидоновой структуры. Данное соединение обладает высокой реакционной способностью и быстро глико-зидируется до соответствующего ИС-гликозида (изосукцинимид-р-гли-козид). Определены пути и скорость метаболизма ИС-гликозида у растений в зависимости от условий аэрации. Отмечено значение реакций образования ИС-гликозида в постанаэробной утилизации накопившейся в растениях ГАМК.

Установлено, что большое значение в превращениях ГАМК в условиях дефицита кислорода и повышенного содержания углекислого газа играет фондовая организация ее метаболизма. Предполагается, что именно цитоплазматическии фонд ГАМК участвует в образовании ИС-гликозида.

Впервые показано, что СО2 является эффективным регулятором липидного обмена растений. Изменение под действием углекислого газа содержания фосфолипидов и их жирнокислотного состава позволяет этому компоненту газовой среды активно влиять на структуру биологических мембран. Для неустойчивых растений диоксид углерода

является и более эффективным активатором процессов перекисного окисления липидов. Накопление продуктов перекисного окисления ли-пидов в виде диеновых коньюгатов и МДА, которые могут нарушать нативную структуру белков ферментов, является одним из механизмов регуляции углекислым газом ферментных систем растений.

Установлено, что одним из механизмов защитного действия фи-тогормона кинетина на растения может быть влияние его на липиднке компоненты мембран. При обработке кинетином у растений в условиях дефицита кислорода и повышенных концентраций СОг стабилизировался уровень фосфолипидов, предотвращалось падение ненасыщенности их жирных кислот и тормозились процессы перекисного окисления. Действие зпибрассинолида, фитогормона стероидной природы, на процессы окислительной деструкцию липидов было более эффективно, чем кинетина.

На основании проведенных экспериментальных исследований разработаны схемы регуляции диоксидом углерода обмена кислот ЦТК, ГАМК-шунта и образования ИС-гликозида, а так же липвдного обмена растений, включая процессы ПОЛ, в условиях кратковременного дефицита кислорода и при возобновлении аэрации. Предложена модель возможного механизма действия углекислого газа на метаболические процессы растений путем изменения активности ферментных систем в результате прямого влияния на них, действия через продукты катаболизма липидов, а так же для мембраносвязанных ферментов и за счет модификационных изменений липидных компонентов биологических мембран.

Практическая значимость. Результаты исследований показывают специфичность действия повышенных концентраций диоксида углерода на все стороны метаболизма растений, которое, однако, является обратимым и соответствует изменениям, характерным для растений в условиях обычного дефицита кислорода при более длительных сроках экспозиции. Это позволяет применять среду СОг при кратковременных экспозициях для выявления механизмов адаптации растений к условиям дефицита кислорода. Они экспериментально до!сазывают и необходимость включения определенных концентраций СОг (5-10%) в газовую среду, используемую для создания анаэробных условий для растений или его отдельных частей при исследовании процессов в лабораторных условиях.

Модифицированы методы определения скорости процессов ПОЛ в

тканях растений по образованию промежуточных продуктов - диеновых производных ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть использованы при определении степени устойчивости растений как к условиям дефицита кислорода, так и к действию других стрессовых факторов.

Данные исследования действия фитогормона кинетина и эпибрас-синолида позволяют предполагать возможность их использования для повышения устойчивости растений к условиям пониженного содержания кислорода, что связано с их способностью стабилизировать липидные компоненты биологических мембран.

Разработана методика определения состава свободных жирных кислот. Показана возможность проведения их анализа одновременно с исследованием жирнокислотных компонентов липидов митохондрий.

Предложены методы выделения и очистки ИС-гликозида из растительных тканей. Проведены исследования его биологической активности и показано, что он обладает адаптогенными свойствами, повышая резистентность животных к стрессовым нагрузкам. На эти работы получено авторское свидетельство (A.C. N 784051). Впервые разработаны методы количественного определения содержания ИС-гликозида, что позволило провести скрининг различных сортов гороха для выявления перспективных с целью получения данного гликозида.

Практическая значимость работы состоит в расширении и углублении представлений о роли углекислого газа в метаболических перестройках растений, попадающих в условия дефицита кислорода. Полученные данные показывают пути и механизмы регуляции клеточного метаболизма, что может найти применение в разработке способов повышения их устойчивости к стрессовым воздействиям, а, следовательно, и продуктивности.

Результаты исследований включены в курсы лекций по физиологии растений и биохимии, читаемых в ряде ВУЗов. Они используются при проведении лабораторных практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных автором в период 1973-1995 гг. докладывались и обсуждались на международных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях/ Онй были Представлены на 4-м Международном конгрессе по¡молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994); на симпозиуме Международного общества по анаэробиозу растений (Ламми.Финлян-

дия, 1995); на 10 конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Флоренция, 1996); на 2-м (Минск, 1990) и 3-м (Санкт-Петербург, 1993) Всесоюзных съездах физиологов растений,на 7-м делегатском съезде Всесоюзного ботанического общества (Донецк, 1983); 4-м Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979); на 6-й и 7-й Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 1980, 1984); на Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978); на Всесоюзной конференции "Проблемы и пути повышения устойчивости растений к болезням и экстремальным условиям среды" (Ленинград, 1981); на 2-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Москва, 1986); на 8-ой Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1987); на 1-й, 2-й, 3-ей Международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1991, 1993, 1995); на 1-й Всесоюзной конференции по растительным липидам (Казань, 1991); на Международной научной конференции "Промышленная ботаника: состояние и перспективы" (Донецк, 1993); на 3-м и 4-м Международных симпозиумах "Брассиностероиды - биорациональные, экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений" (Минск, 1993, 1995); на Международном совещании"Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты" (Сыктывкар, 1995); на республиканской конференции "Реализация генетической программы в ответе организма на фитогормоны и витамины" (Вильнюс, 1986); на ежегодном симпозиуме "Физико-химические'основы физиологии растений" (Пенза, 1996); на заседании секции ВОФР "Физиология мембран" (Чернигов, 1989); на'заседаниях Воронежского отделения Всесоюзного общества физиологов растений (1989), на отчетных конференциях Воронежского государственного университета и Воронежского госпедуниверситета.

Публикации^. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены более, чем в 60 публикациях, в том числе в обзорных работах и авторском свидетельстве на изобретение.

Структура и объем.диссертации. Диссертация изложена на 427 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (7 глав), заключения, выводов, списка литературы (457 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 47 рисунков, 5 схем, 90 таблиц.

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Объектами исследования служили проростки гороха (Pisum sativum L., сорт Рамонский 77), растения неустойчивого к действию гипо- и аноксии, а также кукурузы (Zea mays L., сорт Воронежская 76), растения среднеустойчивого, которые выращивались методом гидропонной культуры в темноте или на свету при 25°С. Использовали надземную часть проростков 10-12- дневного возраста. В некоторых случаях исследовали сухие и набухшие семена, семядоли и корни.

В ряде опытов анализировали и другие растения семейства Fa-baceae и Gramineae. Семена различных видов и сортов были получены из Всероссийского института растениеводства им. Н.И.Вавилова (Санкт-Петербург), Орловской опытной станции, Рамонского НИИ сахарной свеклы, Воронежского агроуниверситета.

Условия постановки опытов. В работе использовали радиоактивные препараты (14С- и 3Нг-), общей активностью 50-100 МБк ("Изотоп", Россия), которые растворяли в 0,2 М трис-HCl буфере рН 7.4. Ингибиторы вводили методом вакуум-инфильтрации. Регуляторы роста кинетин и ЭВ (10 мг/л) поступали в растения с транспирационным током.

После введения радиоактивных препаратов органических кислот и аминокислот с транспирационным током в темновых условиях (1-4 час), растения помещали в изолированные от окружающей среды вакуум-эксикаторы (объемом 3-3,5 л), через которые в течение 3 часов пропускали со скоростью 25 см3 сек-1 разные газовые среды: воздух, гелий (хроматографически чистый) или СОг из баллонов. При использовании азота его очищали от кислорода, пропуская через щелочные поглотители (содержание кислорода 0,5% v/v). В ряде опытов растения вновь возвращали в условия нормальной аэрации на 1-5 часов. При изучении липидного обмена после введения 2-14С-ацетата проростки помещали на 3-24 часа в условия разных газовых сред. В опытах по изучению скорости заполнения меткой отдельных фондов соединений проростки находились на растворах радиоактивных субстратов в течение всего времени опыта (1-10 час).

В ряде опытов в растения вводили синтезируемые биологическим методом препараты 1-14С-ГАМК (Cascales et al.,1970) и разномечен-ные.формы 14С-ИС-гликозида.

Радиохроматографический анализ спирторастворимых соединений проводили после фиксации растительного материала кипящим этанолом. Стирторастворимые соединения фракционировали с помощью ионообменных смол КУ-2 и AB-17. Разделение органических кислот, аминокислот и углеводов проводили на хроматографической бумаге "Ленинградская средняя" (Россия),"FN-15" и "FN-11" ("Filtrak", Германия) в соответствующих системах растворителей с последующим количественным их определением (Солдатенков, Мазурова, 1962; Пасхи-на, 1964; Павлинова, 1962).

Содержания ИС-гликозида и его агликона в тканях растений определяли по разработанной нами методике с помощью ТСХ и спектро-фотометрирования элюатов при 208 или 212 нм ("Spectromom-204", Венгрия).

Выделение, очистка ИС-гликозида и проведение физико-химического анализа. ИС-гликозид выделяли из надземной части проростков гороха после экстракции 80% этанолом, очистки хлороформом, ионо-обменниками КУ-2 и АВ-17, колоночной хроматографии на целлюлозе и препаративной бумажной хроматографии на "FN-17".

Полученные препараты кристаллизовали, подвергали кислотному гидролизу, определяли температуру плавления, проводили элементный анализ, снимали УФ- и ИК-спектры.

Определение активности ряда ферментов. Активность глутамат-декарброксилазы (ГДК) определяли по накоплению 1-14С-ГАМК по методике (Измайлов и др.,1978), модифицированной для наших объектов.

Активность АДГ и ЛДГ определяли спектрометрически по скорости окисления НАДНг при 340 нм (Чиркова, 1978).

Изменение активности цитохром с оксидазы проводили по скорости падения оптической плотности растворов при 550 нм (Гаври-ленко, Ладыгина, 1975).

Выделение митохондриальной фракции растительных клеток проводили методом дифференциального центрифугирования в соответствующей среде при +4°С (Гавриленко и др.,1975). В качестве маркерного фермента митохондрий определяли активность цитохром с оксидазы.

Определение интенсивности дыхания растений. Скорость поглощения кислорода определяли методом полярографии с использованием термостатируемой микроячейки полярографа TZ 213S (Чехия). Опреде-

ляли эндогенное дыхание, используя тканевые гомогенаты, которое рассчитывали в мкл Ог мг-1 белка. .

Выделяющийся при введении в растения 14С-субстратов дыхания

1 д

СО2 улавливали щелочными поглотителями, осаждали в виде бариевой соли и просчитывали радиоактивность.

Количественное определение белка в пробах проводили по методу (Lowry et al.,1951). В опытах с использованием тканевых гомо-генатов содержание белка определяли после предварительного кипячения проб с 0,5Н NaOH для полноты .экстракции белка (Масолов, Скарлат, 1965).

Выделение, очистка и фракционирование липидов. Липиды экстрагировали по методу (Нага, Norman, 1978) в присутствии антиок-сиданта ионола (0,001%), очищали от нелипидных примесей и фракционировали на пластинках с силикагелем "W" ("Merk", Германия) в соответствующей системе растворителей (Синютина и др.,' 1978). Фракцию фосфолипидов разделяли на классы на пластинах с силикагелем 60 G ("Merk", Германия) (Новицкая, 1972; Синютина, 1986). Содержание фосфолипидов определяли по фосфору (Gerlach et al., 1963)..

Анализ жирнокислотного состава фосфолипидов и свободных жирных кислот. Анализ жирных кислот фосфолипидов проводили после метанолиза по методу (Peisker,1964).

Свободные жирные кислоты из тканевого гомогената и митохонд-риальной фракции выделяли модифицированным нами методом (Берч-филд, Сторрс, 1964) и метилировали диазометаном (Войников и др., 1981), :

Метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии на "Chrom .42" (Чехия) с ПИД и колонкой 2,5м с 10%, ПЭГС на хроматоне N-AW ("Chemapol", Чехия). Температура камеры испарения +220°С, термостата +190°С. Скорость газа-носителя (гелия) 40 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин. Пики метиловых зфиров жирных кислот идентифицировали по времени удерживания в сравнении ер стандартной смесью К-101 Mixture Lot 1314 ("Sigma", США) и отдельными кислотами ("Serva", Германия). Содержание жирных кислот выражали в относительных величинах вЛ от суммы площадей пиков всех обнаруженных кислот, каждой пробы.

Определение продуктов ПОЛ. . Содержание. МДА определяли по реакции с ТБК.. (Steward ?t al., 1980; Жиров, Мерзляк и др., 1982),

анаэробиоз воздух |

а 8

£ А

Алании

1800

3 1400

1000

600

200

анаэробиоз воздух Ц

0 1 4 5 7

экспозиция, час

ГАМК

Рис. 1. Влияние СС>2- и гелиевого анаэробиоза на превращение аминокислот при введении в проростки кукурузы I, 2 -^С-2-огсоглутарата. (1 - воздух, 2 - СС>2 ,3 - гелий).

Рис. 2. Действие и последействие среды С(>2 на радиоактивность (А) и содержание (Б) органических йгслот при введении 2-' ^С-аланина в проростки кукурузы (а - через 1 час, Ь - через 3 часа, с - через 5 часов возобновления аэрации; I - сукцинат, II - малат, Б -% от контроля при аэрации)

ло накоплению в тканях растений этой дикарбоновой кислоты. 1,2-14С-2- оксоглутарат и 2-14С-аланин с разной скоростью поступали в отдельные фонды малата в условиях дефицита кислорода и среды углекислого газа.

При возобновлении аэрации после действия СО2-среды периода ' 3-часового аэрирования было достаточно для восстановления скорости метаболизации ди- и трикарбоновых кислот цикла Кребса. Радиоактивность и содержание сукцината снижались в результате использования на репараторные процессы. Радиоактивность малата и цитрата, наоборот возрастала до контрольного уровня у проростков кукурузы. Для растений гороха для этого требовался больший период аэрации.

В условиях кратковременной экспозиции углекислый газ в большей степени, чем обычный дефицит кислорода, вызывал и изменения в обмене аминокислот растений. У проростков кукурузы в условиях 3-часовой аноксии происходило накопление аланина и снижение радиоактивной метки в глутамате и аспартате. В то же время среда повышенной концентрации диоксида углерода была более эффективной в накоплении в клетках этих растений ГАМК (рис. 1), что ранее наблюдали только у растений при более длительных (сутки и более) сроках аноксического действия (Roberts et al.,1992).

Показано, что увеличение содержания аланина в условиях кис- . лородного дефицита является не только следствием активации реакций переаминирования с пируватом (Good et al.,1993), но и результатом торможения утилизации этой аминокислоты через реакции ЦТК. В большей степени это наблюдалось при действии на растения диоксида углерода (рис. 2). Экзогенный аланин в условиях повышенной концентрации СОг активно участвовал в накоплении ГАМК, которую наряду с аланином относят к стрессовым аминокислотам (Haldemann, Brandie, 1988).

Для проростков гороха, растения слабоустойчивого к дефициту кислорода, эффект накопления ГАМК был более значительным, если растения также испытывали влияние атмосферы углекислого газа. В опытах с введением различных 14С-субстратов не обнаружили снижения радиоактивности глутамата, реакции энзиматического декарбок-силирования которого служат основным поставщиком ГАМК в растениях (Streeter et al., 1972; Crawford et al., 1994).

Для выяснения механизма аккумуляции ГАМК у растений в уело-

250т

горох

12 12 I П

Рис. 3. Активность ГДК у растений в условиях кратковременного (3 час.) действия газовых сред (1 - гелий, 2 - СС>2,1 - определение в гомоге-нате, 2- частичная очистка).

виях действия среды повышенного содержания диоксида углерода провели исследование активности фермента глутаматдекарбоксилазы. Активность фермента ГДК определяли радиометрическим методом по скорости образования 1-14ГАМК ( рис.3). Обнаружено, что активность ГДК не меняется у исследуемых растений в условиях кратковременного дефицита кислорода, что совпадает с работами (Inatomi et al., 1971), но претерпевает значительные изменения при действии повышенных концентраций углекислого газа. У проростков кукурузы обнаружено почти двукратное возрастание активности этого фермента. Увеличение скорости образования ГАМК в результате реакций энзима-тического декарбоксилирования является одной из форм биохимического рН-стата клетки, реализующегося обычно при длительном анаэробном воздействии на растения (Fan, Lane et al.,1992; Snedden et al.,1995). В случае действия СОг это отмечалось в наших опытах уже при кратковременных экспозициях. В тоже время у проростков гороха активность ГДК снижалась, что может определять меньшую устойчивость данного растения к условиям гипо- и аноксии.

Показано, что изменение активности ГДК у растений в условиях повышенного содержания СОг не связано напрямую с падением рН ци-

топлазмы клеток, как это предполагалось ранее у растений в условиях аноксии (Lane, Stiller, 1970; Carrol, Fox et al.,1994). В опытах с проростками кукурузы и гороха обнаружено, что начиная с 0,5 часовой экспозиции растений в среде углекислого газа и до 6 часов величина внутриклеточного рН не падала, а даже несколько увеличивалась, в отличие от того, что наблюдалось при действии гелиевого анаэробиоза. Это совпадает с результатами работ, полученных с помощью флюоресцирующих зондов на других растительных объектах (Трофимова, Молотковский, 1993; Pronina, 1996) и свидетельствует о наличии значительной буферной емкости цитоплазмы, обеспеченной системой ряда биофизических и биохимических рН-ста-тов. В качестве -регулятора активности.ГДК в этом случае могла выступать внутриклеточная концентрация Са2+, которая значительно меняется в клеточных компартментах при недостатке кислорода (Sub-biach et al.,1994). По данным (Snedden et al.,1995), этот фермент относиться к Са2+/кальмодулин-регулируемым ферментам, что так же может объяснить наблюдаемые нами изменения активности ГДК у растений при очистке от низкомолекулярных примесей.

Таблица 2

Влияние газовых сред на превращение 2,3-3Н2-ГАМК в проростках гороха ( имп/мин г-1 сыр. массы)

После введения Газовые среды, 3 ч.

воздух Не С02

Фракции:(*103)

аминокислоты 42,6+6,0 14,5±0,6 18,2±0,6 42,0±1,0

орг. кислоты 6,1±0,1 8,7±0,8 8,4±0,4 5,5+0,4

сахара 85,0±6,0 114,0±3,0 86,4+1,7 80,5+1,5

Соединения:

манат 2300+50 2800±50 2900±400 1900+100

сукцинат 1960±20 3950+200 1790±60 1230±70

фумарат 590±60 1760+120 2960±100 2000±100

глутамат 4050±400 790+60 350±20 520+40

аспартат 730±20 304±10 230+20 240±30

аланин 5800180 2900+400 3880±100 700±40

Показано, что экзогенно введенная ГАМК (1-14С- и 2,3-3Нг-) активно участвует в метаболических процессах растений, при этом основной путь утилизации ее связан с реакциями ГАМК-шунта и цикла Кребса (табл.2). На это указывало появление значительной радиоактивной метки в кислотах цикла Кребса, аминокислотах- глутамате и аланине, а также высокая удельная радиоактивность выделяющегося при дыхании растений углекислого газа. Высокая активность ферментов ГАМК - шунта показана для целого ряда растений (Walton et al.,1993; Breitkreus et al.,1995). Углекислый газ в большей степени, чем обычный дефицит кислорода, тормозил утилизацию экзогенной ГАМК этим путем, подавляя активность ферментов ГАМК-трансами-наз и дегидрогеназы ПЯК. В то же время происходило и увеличение содержание этой аминокислоты, что свидетельствует о четко выраженных различиях превращения экзогенно введенной и эндогенного об-

Рис.4 Влияние газовых сред на работу ГАМК-шунта в растениях (1-глутаматдегидрогеназа, 2-глутаматдекарбоксилаза, 3-ГАМК-трансаминаза, 4-дегидрогеназа ПЯК, 5-сукцинатде-

Малат

ала. ПВКглу. 20Г асц. ОАД [2,3-%-]

гидрогеназа; щщ -ингибирование, а^ -активация)

разованного фонда этой аминокислоты. При возобновлении аэрации наблюдалась постепенная нормализация обмена аминокислот у растений.., Повышалась радиоактивность аспартата, глутамата. Снижалось и содержание ГАМК. На рис.4 приводится схема реакций ГАМК-шунта и показано влияние на скорость отдельных реакций у растений усло-вкй'дефицита кислорода и СОг-среды. .

• На основании анализа изменения удельной радиоактивности глутамата и ГАМК при введении различных 14С-соединений, показана ком-партментализации обмена не только глутамата (Измайлов,1986), но и ГАМК. Установлена разная доступность вводимых субстратов отдельным фондам ГАМК, пополнение которых осуществлялось с разной скоростью у растений в условиях гелиевого анаэробиоза и СОг-среды. Ци-топлазматический фонд этой аминокислоты быстро включался в метаболические процессы, в тоже время вакуолярный фонд (Бакапо, 1986), пополняющийся за счет переброса избытка накопленной ГАМК, отличался инерционностью, о чем свидетельствовала низкая скорость восстановления содержания этой аминокислоты в постанаэробном периоде.

В условиях дефицита кислорода, как известно (БаиНо, 1992), в клетках растений накапливаются продукты анаэробного метаболизма, такие как этанол и лактат, образование которых контролируется ферментами АДГ и ЛДГ. Показали,что углекислый газ подавлял активность этих ферментов на 15-40%, начиная с первых часов действия. В среде гелиевого анаэробиоза активность АДГ наоборот, возрастала вдвое через 8 часов, а ЛДГ через 24 часа экспозиции растений.

Рис. 5. Скорость поглощения растениями кислорода при действии СС>2 -среды (3 часа) и при возобновлении аэрации.

Повышенные концентрации углекислого газа в большей степени, чем условия обычного дефицита кислорода подавляли и процессы дыхания, что выражалось в снижении поглощения растениями кислорода (рис.5). Для проростков гороха это было более значительно, чем для растений кукурузы.

. Впервые показано, что при возвращении растений из среды СОг в условия нормальной аэрации, репарация дыхательного метаболизма происходила достаточно быстро (15-60 мин). Поглощаемый в этот период кислород использовался только на окисление эндогенно накопленных субстратов. Экзогенные сукцинат, 2-оксоглутарат и даже глюкоза включались в дыхательный метаболизм на более поздних этапах, на что указывала низкая величина удельной радиоактивности выделяемого растениями 14С02 в первые часы нормоксии при введении радиоактивных препаратов этих соединений.

Распространение и метаболизм изосукцинимид-в-гликозида

в растениях в нормальных и аноксических условиях

Во фракции электронейтральных соединений проростков гороха были обнаружены два вещества, которые по своим свойствам значительно отличались от обычных Сахаров (неспецифическая реакция с проявителями, поглощение УФ-света). Образование соединений происходило со значительной' скоростью в темновых условиях из различных 14С-соединений, особенно ГАМК. Отработав методы выделения, были получены химически чистые препараты этих веществ. На основании результаты физико-химического анализа (элементарный анализ, температура плавления, УФ- и ИК-спектры, кислотный гидролиз) соединения были идентифицированы как изосукцинимид-с-гликозид (C10H15O7N; М.м. 261) и его агликон (C4H5O2N; М.м 99). Хотя структура этих соединений была установлена ранее (Liu, Castelf-гапсо, 1968; Liu et al.,1970; ), однако ни пути образования, ни физиологическое значение их не были исследованы.

При анализе ряда бобовых и злаковых растений, было показано, что ИС-гликозид и его агликон являются специфическими метаболитами растений гороха. Разработав методику количественного определения установили, что содержание их значительно колеблется у разных сортов. При этом содержание гликозида обычно превалировало над агликоном и было лишь немногим меньше глюкозы, но превышало уро-

вень сахарозы. В этиолированных растениях его было на 50-80% меньше. Уменьшение содержания гликозида с возрастом и отсутствие его в сухих семенах свидетельствует о важной роли этого соединения для молодых и растущих тканей.

Предполагая по строению агликона,что именно ГАМК служит предшественником в образовании ИС-гликозида, вместе с 5-14С-глутама-том вводили ингибиторы образования и утилизации ГАМК (табл.3).

Таблица 3

Изменение удельной радиоактивности спирторастворимых соединений при введении в проростки гороха 5-14С-глутамата (% от контроля)

Соединения Вариант

С02-среда ПХМБ Арсенит

ГАМК 219,45 33,47 381,58

глутамат 96,14 95,62 172,25

КС-гликозид 60,79 50,00 12,46

агликон 89,28 43,64 21,79

Примененные ингибиторы блокировали образование ГАМК или ее утилизацию, что отражалось на скорости синтеза ИС-гликозида и аглико-на. Образование энзиматическим путем соединений с пирролидоновой структурой достаточно хорошо исследовано в тканях животных (Suie et al.,1974), но еще совсем не изучено для растений.

При введении 1-14С-глюкозы показано, что удельная радиоактивность гликозида более, чем в десять раз превышала таковую величину агликона, что свидетельствовало о интенсивно идущих в растениях реакций гликозидирования глюкозой эндогенного агликона. Установлено, что условия освещения существенно не влияли на скорость синтеза ИС-гликозида. В то же время образование агликона на свету несколько возрастало.

Исследовали скорость образования ГАМК и ИС-гликозида из различных 14-С-субстратов. Обнаружили, что удельная радиоактивность агликона уже в первые часы введения меченых аминокислот и органических кислот (рис.6) превышала таковую величину гликозида. Скорость синтеза агликона ИС-гликозида определялась доступностью ис-

экспозиция,тас

Рис. 6, Поступление радиоактивной метки в спирторастворимые соединения проростков гороха при введении 5-^С-глутамата (I) и (1 - аминокислоты, 2 - органические кислоты, 3 - углеводы, 4 - ГАМК, 5 - аланин, б - глутамат, 7 - аспартат, 8 - ИС-гликозид, 9 - аглихон).

пользуемых субстратов фонду ГАМК, участвующему в его синтезе. Относительно быстрое насыщение меткой фонда агликона свидетельствовала как о достаточно высокой скорости образования, так и о небольших его размерах. Интенсивное гликозидирование агликона эндогенной глюкозой служит и одним из путей нейтрализации метаболически и осмотически активной глюкозы. Накопление гликозида, как и других соединений этой группы происходит в вакуоли (Bowler, 1986; Szakiel et al.,1990). В то же время образование агликона в большей степени связано с цитоплазматическим фондом ГАМК.

При введении 1-14С- и 2,3-3Нг-ГАМК показали, что эта аминокислота активно метаболизируется через кислоты цикла Кребса, фонд которых насыщался достаточно быстро (рис.6). В то же время со значительной скоростью ГАМК включалась и в реакции образования агликона ИС-гликозида. Метаболизация ГАМК по пути образования

ИС-гликозида приобретала важное значение после заполнения меткой фонда органических кислот и аминокислот. В случае избыточного накопления ГАМК в клетках растений, местом локализации этой аминокислоты могла выступать вакуоль (Бакапо, Тозака, 1986).

Углекислый газ в большей степени, чем недостаток кислорода определял скорость образования ИС-гликозида из ГАМК и ее предшественников, что было показано в опытах с 2,3-3Нг-ГАМК (табл.4).

Таблица 4

Влияние газовых сред на скорость образования ИС-гликозида из 2,3-3Нг-ГАМК (имп/мин. г"1 сыр. массы)

Вариант

Сахароза

Глюкоза

Агликон

ИС-гликозид

После введения 3 часа воздух

СОг-среда гелий

420±100 840±10

880±30 1450±200

600±10 920±10

1480±70 1000±20

25500±400 8960+40

25500+100 23600+300

19400±200 12000±800

22400+170 21900+20

При возобновлении аэрации у растений к 3 часам происходила постепенная нормализация обменных процессов. Накопившаяся при анаэробиозе ГАМК утилизовалась в цикле Кребса через реакции ГАМК-шунта и по пути превращения ее в агликон специфического для обмена проростков гороха ИС-гликозида.

Исследовали пути метаболизма ИС-гликозида в нормальных и аноксических условиях, используя синтезированные нами разномечен-ный препараты этого соединения. При введении 1^-ИС-гликозида с меткой по углеводной части с высокой скоростью радиоактивная метка поступала из этого соединения в сахарозу, полисахариды (клетчатка), этил-0-гликозид , ГАМК, а так же в выделяемый при дыхании проростками углекислый газ. Показано, что СОг-среда не только в большей степени тормозила образование ИС-глико8ида, но и влияла на его утилизацию в растениях (рис.7). Уменьшение радиоактивности сахарозы, свидетельствует о зависимости синтетических процессов, проходящих в участием ИС-гликозида от условий аэрации. Образование же этил-е-гликозида в растениях в условиях СОг-среды, наоборот, несколько активизировалось, что могло способствовать утили-

1 2 3 456789 10

Рис. 7. Включение радиоактивной метки в соединениях при введении '4С-ИС-гли-козида с меткой по глюкозе в проростки гороха (а-3 часа в СС>2,Ь- через 3 часа аэрации после С(>2, 1 - спиртонерастворимый осадок, 2 -суммар -ный водно-спиртовой экстракт, 3 - фракция Сахаров, 4 - аминокислот, 5 - органических кислот, б - малат, 7 - сукцинат, 8 - глюкоза, 9-сахароза, 10-этил- В -гликозид).

зации в тканях растений накопившегося этанола.

При возобновлении аэрации синтез этил-б-гликозида продолжался, но в большей степени глюкоза из 14С-ИС-гликозида участвовала в образовании сахарозы, радиоактивность которой существенно возрастала, а также вступала в дыхательный метаболизм, о чем свидетельствовало увеличение включения метки в кислоты ЦТК и выделяемый углекислый газ.

Агликоновая часть ИС-гликозида после разрыва циклической структуры участвовала в азотном обмене,пополняя фонд аминокислот. Наибольшую удельную радиоактивность в опыте с введением в растения 14С-ИС-гликсзида, меченого по агликону, имела ГАМК. В другие аминокислоты метка попадала в результате реакции переаминирова-ния, при этом 14С с наибольшей скоростью включалась в аланин и глутамат. Наличие ферментативных систем, способных разрывать пир-ролидоновую структуру с образованием соответствующих аминокислот показано и для ряда других растений (МагеПэ е1 а1.,1976).

На основании результатов проведенных исследований мы разра-

Ацетил-КсА-

2-оксоглутарат

[г,а-с-]

цтк

пвк \

Глюкоза

Этил-/-пликозид

-Этанол

^опа^. i сахар

Сахароза

.ПОЛИСАХАРИДЫ (ЦЕЛЛЮЛОЗА]

Донор глюкозы

гяутамат-

[5 -'Тс-]

пхмб

1 \мнг0н

[1 14с 2

йте нн пи^ ^ 4

№] • га

Изосукцинимид^-гликозид

Агликан

го а>

Рис. 8. Схема путей образования и утилизации ИС-гликозпда в проростках гороха.

- подавление процессов; 9ЕЕ - действие С02 - среда; с^ -активация в постанаэробный период.

ботали схему образования и путей утилизации ИС-гликозида в проростках гороха, на которой показано влияния различных факторов среды, включая и среду повышенного содержания углекислого газа, на скорость отдельных реакций (рис.8).

Липидный обмен растений в условиях дефицита кислорода и повышенных концентраций СОг

Впервые проведены исследования влияния условий кратковременного анаэробиоза и повышенных концентраций диоксида углерода на липидный обмен растений. Липиды являются важнейшими компонентами биологических мембран, обуславливающих формирование первичных, неспецифических реакций растений на различные стрессы, включая и кислородный (Чиркова, 1988; Саляев, Кефели, 1988).

При введении 2-G14-ацетата, являющегося предшественником синтеза жирных кислот, обнаружили, что в условиях среды повышенного содержания углекислого газа в проростках кукурузы увеличивалось образование.нейтральных липидов и снижалось содержание фос-фолипидов. Уменьшение содержания фосфолипидов происходило за счет ингибирования диоксидом углерода образования практически всех классов фосфолипидов, о чем свидетельствовало торможение включения в них радиоактивной метки.

В отличие от этого, наблюдаемые при перенесении растений в среду инертного газа изменения, носили иной характер и не бшш связаны с существенными нарушениями в скорости синтеза отдельных групп липидов. Не отмечалось и резкого уменьшения содержания фосфолипидов, что определялось усилением синтеза ФХ и ФГ.

Установлено, что в липидах проростков кукурузы, начиная с 3-часовой экспозиции, снижалось содержание ненасыщенных жирных кислот, в первую очередь линолевой. Содержание моноеновых ненасыщенных кислот при этом могло несколько возрастать, что однако не приводило к существенному изменению показателя соотношения ненасыщенных/насыщенных жирных кислот (u/s) в течение суточной экспозиции. Для менее устойчивых проростков гороха снижение отношения u/s наблюдалось раньше и было особенно значительно при действии диоксида углерода (табл.5).

Таблица 5

Изменение жирнокислотного состава липидов проростков гороха в условиях разных газовых сред (% от суммы кислот)

Кислоты Экспозиция, 3 час.

воздух гелий С02

£ насыщенных кислот (s) L ненасыщенных кислот (и) U/S 23,21 73,21 3,16 29,00 71,40 2,46 29,71 69,84 2,35

СО2-среда в большей степени, чем инертный газ, вызывала падение ненасыщенности жирных кислот не только в общих липидах, но и особенно в фосфолипидах проростков кукурузы (табл.6).

Впервые проведен анализ фосфолипидов мембран митохондрий растений, испытавших воздействие СОг-среды. Показано, что в условиях повышенного содержания углекислого газа в большей степени, чем при обычном дефиците кислорода тормозилось образование фосфолипидов (рис.9) и уменьшалось содержание ФС и ДФГ, что отразилось на величине их удельной радиоактивности (рис.10).

В составе фосфолипидов митохондрий проростков в условиях кислородной недостаточности и атмосферы углекислого газа отмеча-

о И

о »

Р.

^ 12 3 4

Рис. 9. Влияние газовых сред на скорость включения

14с

из 2- 14с-

-ацетата в фосфолипиды митохондрий проростков кукурузы (I - воздух, II - среда азота, III - СО2; 1-3 час., 2-6 час., 3-9 час., 4-24 час.).

лось падение ненасыщенности их жирных кислот, которое было связано с уменьшением содержания как moho-, так и диеновых представи-

Таблица 6

Жирнокислотный состав фосфолипидов этиолированных проростков кукурузы, подвергнутых действию модифицированных газовых сред (X от суммы кислот)

Вариант Жирные кислоты

16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:0

Воздух:

3 ч 27,39 2,50 2,07 2,59 54,78 10,08

±0,29' ±0,08 ±0,01 ±0,19 ±0,11 ±0,22

6 ч 27,81 2,24 1,85 2,55 54,67 8,40

±2,06 +0,11 ±0,01 ±0,25 +1,34 ±0,35

9 ч 26,27 0,84 2,11 2,44 57,28 11,14

±2,46 ±0,05 ±0,02 ±0,22 +1,96 ±0,78

24 ч 28,83 0,90 2,42 1,82 51,29 14,72

±0,35 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,23 ±0,13

N2-анаэробиоз

3 ч 24,62 7,54 4,12- 1,14 43,78 10,10

±0,02 ±0,02 ±0,07 ±0,02 +0,36 ±0,02

6 ч 24,94 4,94 4,01 1,29 45,74 9,56

±0,19 ±0,14 ±0,06 ±0,23 ±0,20 ±0,04

9 ч 23,21 3,39 5,00 1,42 52,86 14,11

±0,27 ±0,16 ±0,34 ±0,01 ±0,90 ±0,12

24 ч 29,17 0,92 2,09 1,29 53,53 12,04

±0,09 ±0,09 ±0,16 ±0,07 ±0,57 ±0,70

С02:

3 ч 20,79 7,36 7,36 0,49 30,76 9,65

±0,66 ±0,26 ±0,10 ±0,17 +0,07 +0,09

6 ч 23,49 6,46 5,32 1,06 39,38 0,75

±0,05 ±0,04 ±0,11 ±0,03 +0,48 ±0,03

9 ч 29,42 1,92 2,47 2,47 51,68 12,04

±0,15 ±0,09 ±0,04 ±0,04 ±0,45 ±0,76

24 ч 28,56 1,93 2,49 2,99 48,63 15,41

±0,88 ±0,33 ±0,09 ±0,73 +2,30 ±0,81

30 20

о ю к О.

ФС

0 3 6 9

ФЭА

0 3 6 9

ФХ

0 3 6 9

ДФГ

® 3 ® ® экспозиция, час 24

Рис. 10. "Удельная радиоактивность фосфолипидов митохондрий проростков кукурузы, помещенных в условия аэрацки(1), дефицита кислорода(2) и среды С02 (3).

телей. При действии диоксида углерода это происходило значительно быстрее. Как известно (МагНак, 1977), снижение ненасыщенности фосфолипидных компонентов приводит к более плотной упаковке цепей жирных кислот фосфолипидов и увеличению жесткости мембран, что вызывает изменения как проницаемости мембран, так и активности ряда мембраносвязанных ферментов (Нагжхх!, 1985,1994).

Проанализировали состав свободных жирных кислот митохондрий, являющихся высокоэффективными регуляторами их структурного состояния. Показано, что в условиях аноксии и среды углекислого газа в фонде свободных жирных кислот увеличивалось содержания ненасыщенных жирных кислот, таких как пальмитолеиновая и линолевая. В большей степени это было характерно для растений, находящихся в среде СОг и совпадало по времени с падением в составе фосфолипидов митохондрий содержания этих жирных кислот. Увеличение содержания ненасыщенных кислот среди свободных жирных кислот растений в условиях дефицита кислорода отмечалось ранее (Гринева, 1975) и

объясняется как результат увеличения активности фосфолипаз (Уаг-1ареЬ1ап е1 а1., 1980). В то же время, нельзя исключить и влияние условий дефицита кислорода и, особенно, повышенного содержания углекислого газа на скорость межмолекулярного обмена между фондами свободных и связанных в фосфолипидах жирных кислот, которые играют важную роль в метаболизме различных классов липидов (Верещагин, 1972; Грибанов, 1979). ..

Показано, что специфичность действия диоксида углерода определяется его способностью даже при кратковременных экспозициях влиять на проницаемость мембран митохондрий, вызывать изменения активности мембраносвязанных ферментов, а так же скорости образования свободных жирных кислот, что приводит к изменению функционирования, и, вероятно, уль'траструктуры этих органелл клетки.

Влияние регуляторов роста на липидный обмен растений в условиях разной газовой среды

Установлено, что при обработке растений кинетином, который относят к фитогормонам защитного действия (Випзе, Е^пег, 1992), качественный состав фосфолипидов растений не изменялся, но повышалось их содержание (табл.7), что согласуется с данными других авторов (УазЬ е1 а1.,1988). При этом в составе фосфолипидов возрастал уровень ФС, ФХ и ФЭА. Количество же ФГ, наоборот, снижалось почти в два раза.

Впервые исследовано действие кинетина на липиды растений, находящихся в условиях дефицита кислорода или повышенного содержания С02. Показано, что при действии кинетина у растений, нахо-

Таблица 7

Влияние кинетина на содержание фосфолипидов в проростках кукурузы в условиях разных газовых сред (% от контроля)

Вариант

+ Кинетин

После обработки Через 9 часов: воздух гелий С02

100 100 84,9+4,7 54,5+2,3

161,8+5,2 101,2±0,8 96,2±1,8 88,5+0,6

дящихся в.условиях модифицированных газовых сред, не только замедлялся распад фосфолипидов, но и нормализовался уровень отдельных фосфолипидных компонентов. В составе жирных кислот фосфолипидов проростков в условия кислородного стресса при действии кине-тина снижалось содержание насыщенных жирных кислот, таких как ми-ристиновая и стеариновая, и увеличивался уровень линолевой кислот, особенно у растений в варианте с СОг-средой.

Установлено, что обработка растений кинетином вызывала изменения в фонде свободных жирных кислот. Если растения помещали в условия кислородного дефицита, то под действием кинетина предотвращалось увеличение содержания среди свободных кислот ненасыщенных кислот.' Особенно заметно защитное действие кинетина проявлялось при действии на растения СОг-среды (рис.11).

Был проведен анализ жирнокислотных компонентов фосфолипидов мембран митохондрий растений, обработанных кинетином. Показано, что при действии, кинетина в фосфолипидах мембран увеличивалось

14:0 16:0 16:1 18:0 18:2

Рис. 11. Влияние кинетина (к) на содержание отдельных свободных жирных кислот проростков кукурузы (% от суммы) в условиях разных газовых сред (1 - воздух, 2 - гелий, 3 - СС>2 - среда).

почти на 30% содержание линолевой кислоты, но падал уровень олеиновой (табл.8), что приводит к снижению уровня ненасыщенности фосфолипидов мембран митохондрий. Это вызывает увеличению проницаемости мембран и улучшает условия для внутриклеточного транспорта веществ, что отмечалось ранее для этого фитогормона (Stillwell et al.,1985; Liu, Bushnell et al.,1987). В то же время полученные результаты не подтверждают представление ряда авторов (Sentjure, Schara, 1992), о способности этого фитогормона увеличивать текучесть биологических мембран. Как показали наши исследования, это действие кинетина проявляется только у растений в условиях действия неблагоприятных факторов среды, включая и условия кислородного стресса.

Полученные результаты свидетельствуют, что в основе защитного действия кинетина на растения, находящиеся в стрессовых условиях, лежит способность этого фитогормона предотвращать изменения

Таблица 8

Влияние кинетина на состав жирных кислот фосфолипидов митохондрий проростков кукурузы (% от суммы кислот)

Кислоты

Вариант

контроль

+ кинетин

Ci4:0

Ci6:0 Ci8: о Cl8:l Cl8:2

следы 34,82+2,23 19,50+0,14 22,23+0,51 25,17±1,14

следы 40,35+9,50 13,53+0,22 13,26+0,53 32,20±1,22

E насыщенных кислот (s) 48,32 53,91

£ ненасьпд. кислот (u) 47,40 ^5,46

u/s 0,98 0,83

в составе фосфолипидных компонентов их мембран. Повышая ненасыщенность фосфолипидов и предотвращая их распад кинетин способствует увеличению текучести, пластичности, а следовательно и стойкости, мембран растительных клеток в условиях кислородного стресса и; особенно, среды повышенных концентраций диоксида углерода;

Процессы переписного окисления липидов растений в условиях недостатка кислорода и повышенного содержания СОг в среде

Для выяснения роли процессов пероксидации липидов в снижении ненасыщенности жирных кислот фосфолипидных компонентов мембран растений в условиях Ог-дефицита исследовали влияние разных газовых сред на процессы ПОЛ. Скорость процессов оценивали не только по образованию одного из конечных продуктов ПОЛ - малонового ди-альдегида, но и по накоплению промежуточных продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот- коньюгированных диенов и кетодиенов (триенов).

Показано, что у неустойчивых к аноксии проростков гороха содержание диеновых и триеновых производных ненасыщенных жирных кислот увеличилось на 20-40% по сравнению с аэрируемыми растениями через три и шесть часов действия среды гелия и СОг. Содержание МЦА при этом так же возрастало до 24 часов экспозиции растений в в условиях повышенных концентраций диоксида углерода (табл.9). Увеличение содержание одного из диенов при обработке 30% СОг плодов наблюдали (Ргизку е1 а1.,1992).

Таблица 9

Содержание МДА в проростках гороха при разных сроках экспонирования в газовых средах (мкмоль г-1 сыр. массы)

Экспозиция, час Вариант

воздух % гелий % С02 %

6 24 10,23±0,06 8,85±0,21 100,0 100,0 12,71+0,47 124,2 5,03±0,80 56,8 13,30+0,17 130,0 12,65±0,43 142,9

В то же время у более устойчивого растения кукурузы происходило торможение скорости процессов ПОЛ в первые часы экспозиции как в условиях дефицита кислорода, так и, особенно, при действии среды двуокиси углерода. Содержание триенов при 3-6 часовой экс-

позиции в среде инертного газа составляло лишь 18-21% от уровня контрольных растений, а в атмосфере углекислого газа падало до 15%. В этот период у растений отмечался и более низкий уровень МДА (рис.12). Однако, к 24 часам у растений в условиях дефицита кислорода содержание МДА в тканях проростков кукурузы возрастало до уровня аэрируемых растений, а у проростков в среде углекислого газа превышало эту величину почти на 30%. Увеличение содержания МДА при длительной аноксии наблюдали и в корнях растений (Чиркова и др., 1991; Закржевский и др.,1995; Crawford et al.,1994).

Так как при воздействии анаэробного стресса падает активность липоксидазы, участвующей в процессах образования активных радикалов (Maccarrone, Veldlnk et al.,1991), мы предполагаем, что значительная активация ПОЛ у растений, наблюдаемая в этот период особенно при действии на растения СОг, могла быть результатом не усиления ферментативной части ПОЛ, а следствием активации у этих растений неферментативных свободнорадикальных процессов перекис-ного окисления, что уже показано для тканей животных (Di Pierro Donato et al.,1992; Дубинина, 1989).

Полученные результаты по изучению скорости процессов ПОЛ у растений объясняют колебание уровня содержания ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов растений на разных этапах действия га-

О 3 в

экспозиция, час

Рис. 12. Влияние газовых сред на образование МДА в проростках кукурузы. (1-воздух, 2-гелий, З-СО2).

зовых сред. Для среднеустойчивых проростков кукурузы на первых этапах (3-6 часов) действия условий дефицита кислорода содержание основной ненасыщенной жирной кислоты фосфолипидов митохондрий ли-нолевой не падало, а даже несколько возрастало, что совпадает с данными по торможению в этот период скорости процессов ПОЛ. С увеличением сроков анаэростатирования растений до 24 часов уровень ненасыщенности фосфолипидов мембран митохондрий снижался. Особенно значительно это происходило у растений в условиях СОг. Именно в этот период отмечалось восстановление или даже активация процессов ПОЛ.

У проростков гороха уже с первых часов действия анаэробиоза и среды повышенных концентраций диоксида углерода происходило значительное уменьшение содержания линолевой кислоты, основного субстрата процессов ПОЛ. Очевидно, что отсутствие активных систем антиоксидантной защиты определяет низкую устойчивость этих растений к условиям недостатка кислорода и повышенного содержания С0<?.

Исследовали влияние условий реаэрации растений на процессы ПОЛ, которые по мнению ряда авторов вызывают больший вред, чем повреждения от самой аноксии (Pfister-Silber, Brandie, 1994 ). Обнаружено, что после кратковременного (3 час.) периода воздействия двуокиси углерода, уже через час отмечалось усиление скорости процессов ПОЛ у растений. Для проростков гороха через час нор-

Рнс.13. Действие ( 3 час ) и последействие СС>2 - среды па образование МДА в растениях (а-1 час, Ь- 3 часа нормоксии ).

-эе-

кукуруза

горох

моксии содержание МДА еще больше возрастало. Для растений кукурузы, после первоначального подавления процессов ПОЛ, отмечалась меньшая активация этих процессов (рис.13). Показано, что и нормализация скорости процессов ПОЛ после действия СО2-среды быстрее происходила у более устойчивых к дефициту кислорода проростков кукурузы. Это может быть связано с возрастанием активности ферментов антирадикальной защиты, в частности, СОД (Van Toal, Bolles, 1991), что является одним из механизмов защиты от "постанок-сического" повреждения тканей (Crawford et al.,1994; Pfister-Sil-ber, Brandie, 1994) и аналогично tow. что наблюдается у животных при реоксигенации тканей.

Показано,' что фитогормоны кинетин и эпибрассинолид, относящийся к новому классу гормонов стероидной природы, оказывали значительное влияние на процессы пероксидации липидов.

Таблица 10

Образование диеновых производных ненасыщенных жирных кислот в проростках гороха в условиях разной газовой среды в течение 6 часов (мкмоль г-1 сыр.массы, % от контроля)

Газовые среды . Фитогормоны

контроль + кинетин + ЭБ

Воздух Гелий СОг-среда 7,15 0,15 (100,0%) 7,22 0,13 (103,0%) 7,81 0,18 (109,7%) 6,84 0,16 (95,7%) 6,66 0,04 (93,1%) 7,29 0,16 (102,0%) 6,83 0,07 (95,5%) 6,22 0,12 (87,1%) 5,54 0,03 (78,8%)

Предобработка ЭБ предотвращала (табл.10), вызываемое действием повышенных концентраций углекислого газа, накопление в проростках гороха диеновых производных ненасыщенных жирных кислот. Действие кинетина на образование продуктов ПОЛ у растений з разных газовых средах было аналогичным, но менее выраженным.

Как было показано (ЬезИеш et а1.,1978; ЬеэЬет, 1984), цито-кинины снижают активность липоксигеназы и подавляют таким образом

Глицерофосфат НАДФН

Глицерин

Рис.14 Схема регуляции метаболизма липидов растений в условиях дефицита кислорода и высоких концентраций СОг (I—1 - ингибирование,- активация, темные - СОг, К - кинетин, ЭБ - эпибрассинолид)

образование в тканях растений свободных радикалов (Мерзляк, Румянцева и др., 1986). Действие эпибрассинолида также может быть связано с его влиянием на активность фермента липоксигеназы, однако нельзя исключить и возможность этого соединения выступать в роли антиоксиданта.

Для более устойчивых к условиям аноксии проростков кукурузы защитное действие кинетина и ЭБ может проявиться при более длительных сроках действия дефицита кислорода, когда системы антиок-сидантной защиты не справляются с увеличением образования свободных радикалов и процессы ПОЛ резко активируются.

Обобщая получённыё результаты исследований мы приводим возможную схему регуляции метаболизма липидов растений в условиях кратковременного'дефицита кислорода и СОг-среды. На схеме показаны места воздействия газовых сред на процессы обмена отдельных классов липидов, образования фосфолипидов и их жирнокислотный состав, метаболизм свободных жирных кислот, скорость процессов ПОЛ, а также показана роль фитогормонов кинетина и ЭБ в адаптационных процессах растений при кислородном стрессе (рис.14).

Заключение

На данный момент времени существует целый ряд теорий адаптации растений к условиям гипо- и аноксии. Одна из них, метаболическая теория R.Crawford (1978), предполагает наличие общего механизма адаптации к условиям дефицита кислорода, связанного с активностью малик-энзима. Однако работы последних лет показали большую вариабельность метаболических перестроек у растений разных экологических групп, включающих как специфические ,так и неспецифические реакции.

Нами проведено исследование особенностей метаболических процессов растений в условиях кратковременного дефицита кислорода и повышенных концентраций диоксида углерода. При этом оценивалась и скорость репараторных процессов при возобновлении аэрации. Полученные данные показали важную роль в адаптационных перестройках растений углекислого газа, который, накапливаясь как продукт дыхательного метаболизма, выступал в качестве одного из факторов, включающего триггерные системы, обеспечивающих, выживание растительных организмов в условиях кислородного стресса.

Обнаружено, что диоксид углерода в большей степени, чем лишение растений кислорода, вызывал нарушения функционирования цикла Кребса, что приводило к увеличению в тканях слабо- и сред-неустойчивых растений содержания сукцината. Накопление этой ди-карбоновой кислоты происходило как за счет конкурентного ингиби-рования двуокисью углерода активности СДГ, так и в результате усиления образования этой кислоты в реакциях восстановительного ресинтеза. Это способствовало не только утилизации избытка восстановительных эквивалентов, но и препятствовало развитию клеточного ацидоза. Показано, что у исследуемых растений рН цитоплазмы клеток в период 0,5-6 часов действия среды повышенных концентраций СОг не снижался, а даже несколько возрастал, что свидетельствует о значительной буферной емкости цитоплазмы, обеспеченной рядом биофизических и биохимических рН-статов. Подобную стабилизацию внутриклеточной рН при действии повышенных концентраций диоксида углерода наблюдали и на других объектах (Pronina,1996; Трофимова, Молотковский, 1993).

К одной из систем биохимического рН-стата можно отнести и образование в клетках растений гамма-аминомасляной кислоты, которое способствует метаболическому связыванию Н+ в реакциях энзима-тического декарбоксилирования глутамата. Показано, что при действии диоксида углерода в клетках среднеустойчивого растения кукурузы происходило накопления не аланина, а ГАМК, что обычно наблюдается у этого растения при достаточно длительных сроках анаэрос-татирования (Roberts et al.,1992). Образование глутамата и аспар-тата у растений в этих условиях было подавлено.

При исследовании активности фермента глутаматдекарбоксилазы было показано, что активность этого фермента при кратковременных экспозициях в меньшей степени зависела от снабжения тканей кислородом, а определялась содержанием в среде углекислого газа. В условиях среды СОг выявились существенные различия активности ГДК, которые коррелировали со степенью устойчивости растений к дефициту кислорода. Для среднеустойчивых проростков кукурузы наблюдали значительную активацию фермента, что способствовало утилизации избытка Н+ и поддержанию гомеостаза клеток. Для неустойчивых проростков гороха реализовался другой механизм накопления ГАМК, который был связан не с усилением образования, а с торможением утилизации этой аминокислоты в результате подавления диоксидом угле-

рода ферментов ГАМК-трансаминаз и дегидрогеназы ПЯК, что наблюдали при введение экзогенной меченой ее формы в растения.

Обнаружено, что в отличие от условий обычного дефицита кислорода, повышенные концентрации углекислого газа при кратковременном (до суток) действии подавляли и активность ферментов конечных этапов гликолитического распада углеводов АДГ и ЛДГ, что переключало пути дыхательного метаболизма растений на образование вместо токсичных этанола и лактата, сукцината, маната, ГАМК и, в меньшей степени, аланина.

При исследовании репараторных процессов после действия на растения среды СОг было показано, что нормализация метаболизма кислот цикла Кребса и связанных с ним аминокислот, быстрее проходила у более устойчивых растений. Интенсивность дыхания так же быстрее восстанавливалась у этих растений. Поглощаемый в этот пе5 риод кислород использовался преимущественно на окисление эндогенно накопленных продуктах анаэробного обмена. Полученные данные свидетельствуют, что кратковременное воздействие даже очень высоких концентраций углекислого газа на метаболические процессы растений является достаточно легко обратимым и это позволяет накапливающейся в клетках растений углекислоте являться одним из основных факторов, обеспечивающих адаптационные перестройки метаболизма растений к условиям дефицита кислорода.

Проведено подробное исследование метаболизма экзогенной и эндогенно образованной ГАМК в условиях разного снабжения тканей кислородом и повышенных концентраций СОг. Обнаружено, что у исследуемых растений достаточно активно функционируют реакции ГАМК-шунта, скорость которых регулировалась газовым составом среды. На основании проведенных исследований и литературных данных показана важная роль компартментации обмена ГАМК как при действии СОг-среды, так и при возобновлении аэрации.

Обнаружен новый путь утилизации ГАМК в проростках гороха, что расширяет наше представление о роли этой непротеиногенной аминокислоты в растениях. Он связан с циклизацией ее углеродного скелета с образованием пирролидоновой структуры и гликозидирова-ния до изосукцинимид-в-гликозида. Показано, что образование этого соединения проходило со значительной скоростью при введении ГАМК и ее предшественников, особенно после заполнения углеродом этого соединения фондов органических кислот и аминокислот. Важное зна-

чение этот путь приобретал и в постанаэробном периоде, способствуя снижению содержания накопившейся при дефиците кислорода ГАМК.

Впервые исследованы пути метаболизации обнаруженного ИС-гли-козида и показано, что данное соединение не является метаболически инертной формой запасания углерода и азота. При необходимости он легко распадался. При этом освободившаяся глюкоза вступала в дыхательный метаболизм, а агликон, после разрыва циклической структуры - в обмен аминокислот. Показано, что ИС-гликозид мог служить и донором глюкозы в синтезе других гликозидов (этил-е-гликозид), олигосахаров (сахарозы) и полисахаридов (клетчатки) .

Важное значение для понимания механизма действия диоксида углерода на метаболические процессы растений, на наш взгляд, имеют и результаты исследования липидного обмена, особенно фосфоли-пидного состава мембран. Именно мембраны, как известно, определяют неспецифические реакции адаптации растений на действие стрессовых факторов (Саляев и др.,1988). Показано, что при действии среди СОг в растениях в большей степени, чем в условиях дефицита кислорода, снижалось содержание фосфолипидов в результате ингиби-рования образования практически всех классов. При этом уменьшалась и степень ненасыщенности их жирнокислотных компонентов, что показано для митохондриальных мембран. Эти изменения носили фазовый характер. Для менее устойчивых к дефициту кислорода проростков гороха они наблюдались раньше и были более значительными при действии на растения повышенных концентраций углекислого газа. Увеличение в фонде свободных жирных кислот митохондрий содержания полиненасыщенных жирных кислот свидетельствовало и об усилении у растений распада фосфолипидов.

Изучение влияния кинетина на растения, находящиеся в условиях разных газовых сред показало, что одним из механизмов защитного действия этого фитогормона на растения может являться способность его стабилизировать липидные компоненты биологических мембран, предотвращая их распад, и поддерживать в них рыхлую упаковку цепей жирных кислот за счет увеличения содержания полиненасыщенных кислот. Это сохраняет пластичность и способность к нормальному функционированию мембран растений в условиях кислородного стресса и среды СОг-

Кребса (Землянухин и др.,1988) , глиоксилатного пути (Игамбердиев и др.,1991), активность ферментов ГАМК-шунта и конечных, этапов гликолиза (АДГ и ЛДГ). При этом диоксид углерода может выступать в роли конкурентного ингибитора ферментов и влиять на активность ферментов через продукты катаболизма липидов (гидроперекиси, МДА). Для мембраносвязанных ферментов эта регуляция осуществляется и за счет модификации липидных компонентов биологических мембран, что является одной из форм регуляции модуляционного типа. Уменьшение ненасыщенности жирных кислот липидов вызывает изменение физических свойств мембран. Они становятся более жесткими, что влияет на конформацию активного центра и доступность субстратов.

На рис.15 на основании проведенных нами исследований и анализа литературных данных приведена обобщенная схема возможных механизмов действия СОг на метаболические процессы растений за счет регуляции активности ферментов на примере ферментов ЦТК и ГАМК-шунта.

Выводи

1. Выявлены значительные различия в адаптационных перестройках метаболических процессов слабо- и среднеустойчивых растений в условиях аноксии и среды повышенного содержания углекислого газа. При кратковременном воздействии углекислого газа отмечены изменения в обмене органических кислот цикла Кребса й связанных с ним аминокислот, которые характерны для растений при более длительных сроках аноксии.

- 2. Обнаружено, что СОг-среда подавляла активность ферментов конечного этапа гликолиза АДГ и ЛДГ, что обеспечивало переключение дыхательного метаболизма растений на накопление безвредных для клетки соединений, таких как сукцинат, малат, гамма-аминобу-тират и, в меньшей степени, аланин. Образование гамма-аминобути-рата является одним из механизмов биохимического рН-стата, препятствующего развитию клеточного ацидоза у среднеустойчивых растений, особенно при действии повышенных концентраций углекислого газа. - .

3. Активность глутаматдекарбоксилазьг, обеспечивающей образование' ГАМК, в большей степени регулировалась диоксидом углерода,

чем содержанием кислорода в среде обитания растений. Установлено наличие корреляции активности этого фермента при действии СОг-среды с устойчивостью растений к условиям дефицита кислорода.

4. Показано, что компартментация обмена ряда аминокислот, включая и ГАМК, играет важную роль в их метаболизме в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода. Выявлено наличие по крайней мере двух фондов ГАМК, пополнение которых определяется природой экзогенных субстратов. СОг-среда влияла как на механизмы поступления в них углерода различных соединений, так и на пути утилизации ГАМК в постанаэробный период.

5. Установлено, что при возвращении растений в условия нормальной аэрации после кратковременного дефицита кислорода и атмосферы углекислого газа восстанавливалось дыхание и происходила нормализация обмена органических кислот и аминокислот. Поглощенный растениями кислород использовался в этот период на окисление эндогенно накопленных субстратов. Экзогенные соединения, такие как сукцинат и глюкоза поступали в пул дыхательных субстратов значительно позже. Восстановление дыхания после действия СОг-среды происходило быстрее у более устойчивых растений кукурузы. При этом в клетках уменьшалось содержание сукцината, что также свидетельствовало об отсутствии токсического последействия высоких концентраций СОг на обмен растений.

6. Обнаружен новый путь утилизации ГАМК в проростках гороха, связанный с циклизацией ее углеродного скелета и дальнейшего гли-козидирования с образованием ИС-гликозида. Показаны изменения содержания этого гликозида в онтогенезе растений, влияние на его синтез условий освещения, ингибиторов, СОг-среды. Определена скорость образования гликозида из различных предшественников.

7. Показано, что ИС-гликозид является своеобразной формой запасания углерода и азота и при необходимости легко вступает в метаболические процессы растений. ИС-гликозид может служить донором глюкозы для синтеза гликозидов (этил-в-гликозид), сахарозы и полисахаридов. Образование ИС-гликозида в постанаэробном периоде играет важную роль в нормализации уровня ГАМК.

8. Выявлены существенные отличия влияния СОг-среды на липид-ный обмен растений и фосфолипидный состав их мембран при кратковременном (до суток) воздействии. Углекислый газ в большей степени изменял содержание отдельных фосфолипидов, приводил к падению не-

насыщенности их жирных кислот в первую очередь за счет диеновых кислот. В то же время содержание полиненасыщенных жирных кислот значительно возрастало среди свободных жирных кислот цитоплазма-тического и, особенно, митохондриального фонда. Отмечено, что изменения в составе жирных кислот фосфолипидов слабо- и среднеус-тойчивых растений отличались только временем их проявления, что может характеризовать стойкость их мембран к стрессовому воздействию.

9. Установлено, что в условиях дефицита кислорода и, особенно, СОг-среды, У растений активируются процессы ПОЛ, что вызывает накопление в их клетках как первичных (диеновых коньюгатов), так и конечных (МДА) продуктов пероксидации полиненасыщенных жирных кислот. Для неустойчивых растений (проростки гороха) это наблюдалось уже в первые часы действия, для более устойчивых проростков кукурузы - при более длительном периоде воздействия, что связано с истощением к этому времени систем антирадикальной защиты.

10. Регулятор роста кинетин влияет на фосфолипиды мембран растений, повышая содержание в них полиненасыщенных жирных кислот, в основном линолевой. Особенно значительно действие этого фитогормона проявлялось у растений при действии кислородного стресса и среды углекислого газа. Показано, что одним из механизмов защитного действия кинетина и регулятора роста из группы брассиностероидов эпибрассинолида может являться их способность подавлять процессы пероксидации липидных компонентов биологических мембран.

11. Обсуждаются возможные механизмы действия углекислого газа на метаболические процессы растений за счет влияния на активность как растворимых, так и мембраносвязанных ферментов. Предполагается, что накапливающийся при анаэробиозе СОг является эффективным регулятором триггерных механизмов, обеспечивающих адаптационные перестройки метаболизма растений в условиях кислородного стресса.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Ершова А.Н. Некоторые особенности обмена органических кислот и аминокислот в проростках гороха в темноте // Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов

организма. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1974. С.15-17.

2. Землянухин A.A., Макеев A.M., Иванов Б.Ф., Ершова А.Н. Исследование метаболизма r-аминомасляной кислоты в проростках гороха в условиях различного состава атмосферы // Физиология растений. 1974. Т.21. Вып. 5. С. 1025-1033.

3. Ершова А.Н. Применение ингибиторов для изучения образования сахароподобных производных гамма-аминомасляной кислоты // Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов организма. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1977. С. 33-35.

4. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Гамма-аминомасляная кислота как предшественник в образовании гликозида в проростках гороха // Научные доклады высшей школы. Биол. науки. 1977. N8. С.100-105.

5. Ершова А.Н. Превращение 14С-аминокислот в растениях в условиях гипоксии // Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Азотный и белковый обмен растений". Тбилиси, 1978. С.94.

6. Рамадан A.C., Ершова А.Н., Землянухин A.A. Превращение 1,4-14С-сукцината в проростках кукурузы после воздействия высоких концентраций углекислого газа // Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов организма.- Воронеж: Изд-во ВГУ, 1979. С. 10S-111.

7. Ершова А.Н., Землянухин A.A. Последействие углекислого и гелиевого анаэробиоза на утилизацию ГАМК в растениях // Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов организма.- Воронеж: Изд-во ВГУ, 1979. С.33-39.

8. Землянухин A.A., Иванов Б.Ф., Ершова А.Н. Организация метаболизма гамма-аминомасляной кислоты в растениях // Успехи сов-ремен. биологии, 1979. Т.87. Вып.2. С. 185-197.

9. Ершова А.Н., Землянухин A.A., Кудрявцева Л.В. Действие и последействие анаэробиоза на метаболизм 14С-органических кислот в проростках гороха // Фотосинтез, дыхание и органические кислоты. Воронеж:Изд-во ВГУ, 1980. С.82-90.

10. A.c. N784051 СССР, А 61 К 31/70. Применение изосукцини-мид-ß-гликозида в качестве средства для повышения резистентности организма животных/Бузлама B.C..Землянухин A.A..Ершова А.Н. 1980.

11. Ершова А.Н. Динамика образования изосукцинимид-ß-гликозида в процессе прорастания семян гороха // Вопросы биологии и почвоведения. Воронеж: Изд-во ВГУ. С.15-18.

12. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Последействие анаэробиоза и

высоких концентраций СОг на утилизацию гамма-аминомасляной кислоты в проростках гороха // Физиология растений. 1981. Т.28. Вып.2. С.367-376.

13. Ершова А.Н. Превращение изосукцинимид-в-гликозида в проростках гороха в условиях разных газовых сред // Вопросы биологии и почвоведения. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1981. С.39-44.

14. Ершова А.Н., Землянухин A.A., Евлаков П.Д. Изменение активности глутаматдекарбоксилазы и pH внутриклеточного содержимого проростков гороха в зависимости от газового состава среды // Регуляция физиологических процессов растений. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1982. С.56-60.

15. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Динамика образования г-аминомасляной кислоты и изосукцинимид-в-гликозида в проростках гороха // Физиология растений. 1983. Т.30. Вып.2. С.341-348.

16. Ершова А.Н., Землянухин A.A., Джек К.Ченда. Адаптация растений к гипоксии и избыточному СОг в окружающей среде // VII Всесоюзн. ботанический съезд. Тезисы докл. М. 1983.С.341.

17. Землянухин A.A., Ершова А.Н., Рамадан A.C. Действие и последействие анаэробиоза в атмосфере СОг и гелия на превращение органических кислот и аминокислот в проростках кукурузы // Физи-ол. и биохимия культурных растений. 1983, Т.15. N1. С.8-14.

18. Zemlianukhin A.A., Ershova A.N. Metabolism of isosucci-nimide-ß-glucoside in pea seedlings // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1984. V. 179. N8. S.679-684.

19. Ершова А.Н., ЧендаД.К., Колесникова В.И. Метаболизм фосфолипидов митохондрий кукурузы в разных газовых средах // Труды XIV конференции молодых ученых биол. ф-та Московского университета. 1984. 4.1. С. 130-132.

20. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Активность алкоголь- и лак-татдегидрогеназы проростков гороха в условиях разных газовых сред // Ферменты, ионы и биоэлектрогенез растений. Горький: ГГУ, 1984. С. 105-110.

21. Землянухин A.A., Ершова А.Н., Колесникова В.И. Метаболизм фосфолипидов проростков кукурузы в условиях N2- и СОг-среды // Физиология растений. 1985. Т.32. Вып.5. С. 884-894.

22. Чурикова В.В., Ершова А.Н., Стерлигова И.А. Влияние ки-нетина на метаболизм липидов проростков кукурузы // Материалы респуб. науч. конференции "Реализация генетической программы в

ответе организма на фитогормоны и витамины". Вильнюс. 1986. С.118-119.

23. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Жирнокислотный состав липи-дов митохондрий проростков кукурузы, экспонированных в модифицированной атмосфере // ДАН СССР. 1986. Т.281. N3. С. 762-764.

24. Землянухин A.A., Ершова А.Н., Ченда Д.К. Действие высоких концентраций двуокиси углерода и гипоксии на липидный обмен в проростках кукурузы // Физиология устойчивости растений и регуляторы роста. Саранск:, Мордовск. ун-т. 1987. С. 40-51.

25. Землянухин A.A., Ершова А.Н. Изучение образования и роли гликозида из Pisum sativum (L.) // VIII Всесоюзн. конференция "Химия и биохимия углеводов". Тезисы докл. Тбилиси. 1987. С. 70-71. V"/'

26. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Влияние кинетина на обмен фосфолипидов проростков кукурузы в нормальных условиях и при гипоксии // Вопросы регуляций ростовых процессов у растений. Москва: МОПИ. 1988. С. 74-78.

27. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Жирнокислотный состав фосфолипидов проростков кукурузы при обработке кинетином // Рост растений и его гормональная регуляция. Москва: МОПИ. 1988. С.83-86.

28. Ершова А.Н., Землянухин A.A. Метаболизм липидов растений в условиях гипоксии и CÜ2-среды // II Всесоюзн. съезд ВОФР. Тезисы докл. Москва. 1990. С.32.

29. Ершова А.Н. Метаболизм свободных жирных кислот растений при действии .кинетина // Научный отчет N 02-91.0041382. Москва. 1991. 9с. " .

30. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Влияние кинетина на липиды растений в разных условиях газовой среды // Регуляторы роста и развитие растений. Тезисы докл. Москва. 1991. С.12.

31. Ершова А.Н., Чурикова В.В., Стерлигова И.А. Влияние кинетина на содержание фосфолипидов проростков кукурузы в модифицированных газовых средах // Физиол. и биохимия культурных растений. 1991. Т.23. N3. С.250-256.

32. Ершова А.Н,, Чурикова В.В. Метаболизм жирных кислот проростков кукурузы, обработанных кинетином // Рост растений. Пути регуляции. Москва: МОПИ. 1991. С.99-102.

33. Ершова А.Н. Влияние кинетина на липиды мембран растений // Тезисы докл. II съезда ВОФР. Москва. 1992. ч.2. С.253.

34. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Фосфолипидный состав мембран митохондрий проростков кукурузы при обработке кинетином // Ростовые процессы и их регуляция. Москва: МПУ. 1992. С.65-69.

35. Ершова А.Н., Смирнов В.И. Исследование перекисного окисления жирных кислот липидов проростков кукурузы при повышенных концентрациях СОг в среде // Промышленная ботаника, состояние и перспективы развития. Межд. науч. конф. Тезисы докл. Донецк. 1993. С.101-102.

36. Ершова А.Н., Смирнов В.И. Влияние гипоксии и эпибрасси-нолида на процессы перекисного окисления липидов проростков гороха //Брассиностероиды-биорацион., экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений. Межд. науч. симпозиум. Тезисы докл. Минск. 1993. С.25.

37. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Влияние кинетина на образование свободных жирных кислот проростков кукурузы при гипоксии // III съезд ВОФР. Тезисы докл. Санкт-Петербург. 1993. С.560.

38. Ершова А.Н., Смирнов В.Н. Перекисное окисление липидов растений в условиях гипоксии и СО2-среды. Там же, с.559.

39. Ершова А.Н. Действие кинетина на метаболизм фосфолипидов растений в разных газовых средах // Научный отчет N02.94.0004575. Москва. 1994. 22 С.

40. Ершова А.Н., Чурикова В.В. Метаболизм жирных кислот проростков кукурузы, отработанных кинетином // Межд. конф. "Регуляторы роста и развитие растения". Тезисы докл. Москва. 1993. ч.1. С.18.

41. Ershova A.N., Zemlianukhin A.A. Free fatty acids metabolism of corn seedlings under hypoxia // 4 th Intern. Congress of Plant Molecular Biology. Amsterdam. 1994. Abstr. book. 8.5 N1482.

42. Ершова А.Н. Фосфолипиды и скорость процессов ПОЛ у растений при обработке кийетином // III Межд. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Тезисы докл. Москва. 1995. С.62.

43. Ершова А.Н., Рослякова Г.Н. Образование продуктов перекисного окисления липидов у растений, отработанных эпибрассиноли-дом, в условиях кислородного стресса. Там же, с.63-64.

44. Ершова А.Н. Действие и последействие высоких концентраций СОг в среде на дыхательный метаболизм растений // Материалы межд. совещания "Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты" . Сыктывкар. 1995. С. 55-57.

45. Ershova A.N., Zemlianukhin A.A. Lipid metabolism in plants under, hypoxia and CCfe-media // Symposium Intern. Society for Plant Anaerobiosis. Lammi. Finland. 1995. Abstr. book. P.17.

46. Ершова A.H. Влияние эпибрассинолида на процессы перекис-ного окисления липидов в растениях // IV Межд. конф. "Брассинос-тероиды-биорацион., экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений". Тезисы докл. Минск. 1995. С.12-13.

47. Ershova A.N. Influence of kinetin on lipid exchange of plants under different conditions of gas medium // Ann. sumposium Physical-chemical basis of plant physiology. Penza. 1996. Abst. P.45-46.

48. Ершова A.H., Хрипач В.А. Влияние эпибрассинолида на процессы перекисного окисления липидов Pisum sativum в условиях кислородного стресса // Физиология растений, 1996. Т.43. N.5

49. Ershova A.N. The role of isosuccinimide-beta-glucoside in the respiratory metabolism of Pisum sativum seedlings. // Plant Physiol. Biochem. Special issue. 10th FESPP Congress. 1996. Abstr.1034. P.196.

Информация о работе

Ершова, Антонина Николаевна
доктора биологических наук
Воронеж, 1996
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы