Влияние гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот и активность β-глюкозидазы растений

Еремина, Надежда Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот и активность β-глюкозидазы растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот и активность β-глюкозидазы растений"

На правах рукописи

ЕРЕМИНА Надежда Александровна

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ И ПОВЫШЕННЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОМПАРТМЕНТАЦИЮ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И АКТИВНОСТЬ р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ

03 00.12 - «Физиология и биохимия растений»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2007

11111111111111111111

□□ЗОБОТЭ8

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Ершова Антонина Николаевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук Горина Ирина Николаевна

Ведущая организация. Санкт-Петербургский

государственный университет

Защита состоится 29 мая 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212 038 02 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, Воронеж, Университетская пл, 1

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан апреля 2007 г

Ученый секретарь .

диссертационного совета Брехова Л.И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Условия гипо- или аноксии являются нормальным этапом в ходе онтогенеза практически всех растений. Делаются попытки не только выяснить механизмы повреждения и адаптации растений в условиях кислородной недостаточности, но и создать растительные организмы, обладающие толерантностью к анаэробному стрессу как на молекулярном и клеточном уровнях, так и на уровне целого организма (Чиркова, 1998). При этом научные аспекты действия на растения стрессовых условий тесно соприкасаются и с проблемами защиты окружающей среды

В зависимости от газового состава среды и длительности гипоксиче-ского воздействия изменяются ответные реакции растительного организма (Crawfprd, 1978; Вартапетян, 2005). Эффективным адаптационным механизмом служит перестройка аминокислотного обмена, направленная в сторону образования так называемых «стрессовых» аминокислот (Андреева, 1989) ГАМК запасается тканями растений в неблагоприятных условиях в больших количествах без повреждения клеток и выступает как легко мобилизуемая защищенная форма сукцината при восстановлении нормального дыхания благодаря блокированию ее утилизации через реакции цикла трикарбоновых кислот (Shelp, 1995) Местом локализации накопленной ГАМК может являться вакуоль, где обнаружено значительное содержание отдельных аминокислот (Francis, 1999, Андреев, 2001) К сожалению, размеры вакуолярных фондов свободных аминокислот изучены только лишь для клеток небольшого количества растений Изменение же вакуолярного фонда аминокислот при стрессах, включая и гипоксический, практически ранее не исследовалось Одним из пу гей утилизации избыточного количества ГАМК является включение ее в клетках пророс гков гороха в процессы образования агликона специфического соединения изосукцинимид-ß-гликозида (ИС-гликозид) (Zemhanukhin et al, 1984) Показано, что в расщеплений этого гликозида участвует [З-глюкозидаза, которая представлена не только цитоплазматической, но и клеточносвязанной молекулярной формой (Ершова и др , 2000) Однако роль молекулярных форм клеточносвязанной ß-глюкозидазы растений остается не достаточно изученной, а для условий гипоксического стресса практически не рассматривалась

Цель исследования. Целью данной работы является изучение влияния гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на компар-тментцию свободных аминокислот у растений с различной устойчивостью и активность молекулярных форм ß-глюкозадазы растений.

Задачи работы.

1 Изучить с использованием мембранотропного соединения ДМСО распределение ряда свободных аминокислот, включая ГАМК, между ци-топлазматическим и вакуолярным фондами клеток бобовых и злаковых

растений, различающихся устойчивостью, в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода

2 Исследовать влияние регуляторов роста на процессы накопления и внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот у растений с разным типом обмена веществ в условиях гипоксического стресса и СОг-среды

3 Определить влияние гипоксии и повышенных концентраций углекислого газа на активность различных форм клеточносвязанной |3-глюкозидазы растений гороха

4 Выяснить характер связывания Р-глюкозидазы с клеточными стенками, а также исследовать динамику активности отдельных молеку-4 лярных форм Р-глюкозидазы в онтогенезе растений гороха

5 Изучить некоторые физико химические и кинетические свойства молекулярных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений при нормальной аэрации, в условиях гипоксии и ССЬ-среды

Научная новизна. Показана роль вакуоли в компартментации обмена не только вторичных метаболитов, но и ряда свободных аминокислот (аспартат, глутамат, а-аланин, ГАМК), что имеет важное значение в процессах адаптации аминокислотного звена метаболизма растений, обладающих разной степенью устойчивости к условиям гипоксического стресса в клетках растений Показано действие фитогоромонов кинетина и эпи-брассинолида (ЭБ) на процессы накопления «стрессовых» аминокислот, а-аланина и ГАМК, и их внутриклеточную локализацию в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода в клетках растений

Установлено существование, наряду с цитоплазматической, нескольких связанных с клеточными стенками молекулярных форм Р-глюкозидазы растений гороха Разработана схема очистки и получен элек-трофоретически гомогенный препарат адсорбированной молекулярной формы фермента Р-глюкозидазы. Исследованы физико-химические и кинетические параметры адсорбированной и ионосвязанной р-глюкозидазы Показаны изменения активности отдельных молекулярных форм р-глюкозидазы в ходе онтогенеза растений гороха.

Обнаружено, что высокие концентрации диоксида углерода вызывали более значительные изменения в накоплении и локализации свободных аминокислот в клетках растений, а также влияли на физико-химические свойства всех молекулярных форм Р-глюкозидазы растений гороха

Практическая значимость. Отработана методика исследования внутриклеточного распределения свободных аминокислот между цитоплазмой и вакуолью с использованием мембранотропного соединения ДМСО у растений, которая может применяться при изучении компартментации и других соединений при действии стрессовых воздействий

Проведенные исследования влияния фитогормонов кинетина и ЭБ на содержание и внутриклеточное распределение свободных аминокислот показали, что данные регуляторы роста можно использовать для повышения устойчивости растений к стрессовым факторам, в частности к гипоксии

Разработанные способы выделения и очистки кпеточносвязанной {}-глюкозидазы растений гороха могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре биологии растений и микробиологии Воронежского государственного педагогического университета при чтении лекций по физиологии растений, а также при выполнении курсовых и дипломных работ

Положения, выносимые на защиту:

1 Анализ объемов вакуолярных фондов клеток с использованием ДМСО свидетельствует, что разные виды растений значительно различаются по содержанию свободных аминокислот в этом клеточном компар-тменте

2 В условиях гипоксии значительно возрастает роль вакуолярного фонда в накоплении «стрессовых» аминокислот ГАМК и а-аланина и это не зависело от видовой принадлежности растений

3 Исследования действия фитогормонов кинетина и ЭБ показывают, что они могут сглаживать изменения в метаболизме растений, в частности в процессах образования и накопления «стрессовых» аминокислот (ГАМК, а-аланин), вызванных действием стрессовых факторов..

4 С использованием высокоочищенных (в том числе гомогенных) ферментных препаратов молекулярных, связанных с клеточными стенками, и цитоплазматической форм 0-глюкозидазы показано, что в условиях кислородной недостаточности изменялись величины Кш и Ушах С02-среда вызывала в ряде случаев более значительные изменения, чем условия обычной гипоксии этих параметров

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Экологическая ботаника наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), конференции, посвященной 65-летию Ботанического сада им проф Б М Ко-зо-Полянского (Воронеж, 2002), V съезде Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003), на 6-ой, 7-ой, 8-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2004 гг.), XI съезде РБО (Барнаул, 2003), всероссийской научно-практической конференции (Ярославль, 2003), VII международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов» (Белгород, 2002), научно-практической конференции «Регуляция продуктивного процесса

сельско-хозяйственных растений» (Орел, 2006) и XV FESPB Congress (Lyon, France, 2006)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 19 публикациях, включая 9 статей и 10 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 181 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (8 глав), заключения, выводов и списка литературы (212 источника), приложения Иллюстрированный материал включает 32 рисунка и 21 таблицу.

Работа выполнена в период обучения в аспирантуре, частично финансировалась по проекту Министерства образования и науки РФ в рамках тематических планов (2001-2003 годов), а также являлась частью научно-исследовательской работы кафедры, включенной в тематику РАН по проблеме «Растительный мир и его охрана»

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектами исследования служили 10-дневные проростки растений гороха (Рамонский 77), пшеницы (Мироновская озимая 808), кукурузы (Воронежская 77), сои (Белгородская 48), выращенные методом гидропоники (t° + 25°С, освещенность 1000 люкс/ см"2) Условия постановки опытов на растениях В опытах использовали различные газовые среды воздух, углекислый газ и азот (коммерческий из балонов), которые пропускали через затемненные вакуум-эксикаторы Надземную часть растений без корней и семядолей помещали в стаканчики с 0,1 М фосфатно-цитратным буфером (pH 7,0)

В ряде работ использовали регуляторы роста — кинетин и ЭБ ЭБ нам любезно был предоставлен В А. Хрипачом (Институт биоорганической химии БАН, Минск) Кинетин и ЭБ (10 мг/л), растворенные в 0,1 М фос-фатно-цитратном буфере (pH 7,0), вводили в наземную часть проростков в течение 12 часов в темновых условиях методом насасывания с транспира-ционным током

Внутриклеточную локализацию ряда свободных аминокислот

изучали с использованием мембранотропного соединения ДМСО по методике (Delmer, 1979), модифицированной нами Ранее (Ершова и др , 2001), эта методика была успешно использована для растений гороха

Хроматографическое определение содержания свободных аминокислот проводили по методу (Пасхина, 1964) в его микромодификации и содержание каждой аминокислоты рассчитывали по предварительно построенным калибровочным кривым, выражая в мМ г1 сырой массы

Активность ß-глюкозидазы определяли с ИС-гликозидом в качестве субстрата по количеству отщепленной свободной глюкозы (Ершова, Винокурова 2001) Содержание глюкозы измеряли с помощью глюкозо-оксидазного метода. За единицу активности ß-глюкозидазы (Е) принимали

количество фермента, которое катализировало расщепление 1 мкМ субстрата за 1 минуту при 37°С Удельную активность фермента выражали в Е - мг"1 белка

Препаративное выделение ИС-гликозида из растений проводили после хроматографического разделения гомогената по методике (Земляну-хин, Ершова, 1977)

Выделение цитоплазматической ß-глкжозидазы проводили, используя методику, отработанную ранее (Ершова, Винокурова, 2000)

Для выделения клеточносвязанных форм ß-глюкозидазы использовали методику (Чкаников и др , 1969), модифицированную нами Форму связывания с клеточными стенками ß-глюкозидазы определяли с помощью обработки фракций клеточных стенок различными системами растворителей (0,1 М фосфатно-цитратный буфер, 1 М NaCI), что позволило выделить несколько молекулярных форм Для очистки адсорбированной и ионосвязанной формы фермента использовали высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексах G-25 и G-100 Чистоту выделенной адсорбированной формы ß-глюкозидазы определяли методом электрофореза в ПААГ (Davis, 1964)

Кинетические свойства связанных с клеточными стенками молекулярных форм ß-глюкозидазы изучали на частично- и высокоочищенных препаратах Величины Км и Vmax определяли методом Лайнуивера - Бэрка (Диксон, Уэбб, 1982)

Содержание белка определяли методом Lowry (Lowry et al, 1951) или спектрофотометрически на СФ-56 (Россия), используя соответствующий коэффициент экстинции (Кочетков, 1992)

Статистическая обработка результатов. Все опыты по определению внутриклеточной локализации соединений проводились в 3-х биологических и 3-х химических повторностях В таблицах и на рисунках приведены результаты средних арифметических значений и их отклонения В исследованиях по определению активности ферментов приведены данные одного из типичных (3-4) опытов

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПАРТМЕНТАЦИИ АМИНОКИСЛОТ У БОБОВЫХ И ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ

Пространственно - разграниченные фонды аминокислот растительной клетки, таких как цитоплазма и вакуоль относятся к основным метаболическим компартментам клетки Установлена важная роль вакуоли в компартментции обмена как белковых, так и небелковых свободных аминокислот растений (Caroll, 1992) Содержание отдельных аминокислот в вакуолярном фонде может достигать 30 — 55% от общего клеточного фонда, причем эта величина может значительно возрастать в молодых клетках (Ahbert, 1982) К сожалению, размеры вакуолярных фондов аминокислот

растений мало изучены, а при стрессах, включая и гипоксический, практически ранее не исследовались. Это связано с тем, что определение размеров и скорости пополнения клеточных фондов аминокислот у растений при стрессах требует использования методов, позволяющих в достаточно короткие сроки как выделить отдельные клеточные органеллы, так и провести анализ содержащихся в них аминокислот Метод бумажной хроматографии в его микромодификации и использование мембранотропных соединений, селективно разрушающих тонопласт и плазмолемму, позволяют избежать этих сложностей В связи с этим нами была отработана методика для выделения цитоплазматического и вакуолярного компартментов свободных аминокислот в клетках растений с использованием мембранотроп-ного соединения ДМСО для разных растений из семейства бобовых и злаковых Данная методика была ранее использована для протопластов клеток (Delmer, 1979, Parr, 1984, Zhang, 1986, Корзун, 1999), и исследования вакуолярного клеточного компартмента аминокислот и ИС-гликозида в клетках растений гороха (Ершова и др, 1999). В предварительных экспериментах с нейтральным красным, была выбрана концентрация ДМСО у растений сои, пшеницы, кукурузы, которая селективно нарушала проницаемость плазмалеммы Данную концентрацию ДМСО далее использовали в опытах (15% ДМСО, инкубация 60 мин )

100 п _ -

on □ - цитоплазма ■ - вакуоль gQ Пшеница

ЁУШЛ

асп глу ала ГАМК асп глу ала ГАМК асп глу ала ГАМК

Рис 1 Распределение аминокислот между вакуолярными и цито-плазматическими фондами клетки бобовых и злаковых растений (% - от содержания в клетке)

Проведенные опыты показали (рис 1), что объемы вакуолярного фонда аминокислот значительно различались у разных видов растений Для представителей бобовых растений, таких как соя, отмечена преимущественно цитоплазматическая локализация, как белковых аминокислот, так и ГАМК Для гороха это было показано ранее (Ершова, Винокурва, 2001) Содержание анализируемых аминокислот составляло 55-60% общего содержания. Для злаковых растений отмечена возрастающая роль вакуолярного клеточного фонда в накоплении свободных аминокислот Это было

характерно для клеток проростков кукурузы и, наиболее ярко, проявлялось у проростков пшеницы Содержание анализируемых аминокислот в вакуолярном фонде этих растений достигало 65-77% общего клеточного фонда

Показано (Андреева, 1989, БЬе1р, 1995), что существенную роль в повышении устойчивости растений к стрессам играют не только белки, но и некоторые аминокислоты При этом содержание так называемых «стрессовых» аминокислот - ГАМК и а-аланина, значительно возрастает в клетках растений при действии дефицита кислорода Проведенные нами опыты на проростках бобовых и злаковых растений показали, что при действии С02— среды количество ГАМК возрастало при 6 - час экспозиции в 2 - 3 раза у всех растений В условиях же обычной гипоксии содержание ГАМК у пшеницы и сои увеличилось только в 1,5 раза (рис 2 е, б), а у кукурузы в 7 раз (рис 2г) Увеличение содержания ГАМК в клетках проростков кукурузы и сои происходило при этом в цитоплазме, а у пшеницы - в вакуолярном компартменте В то же время при действии на растения С02 — среды в клетках проростков кукурузы и пшеницы ГАМК преимущественно накапливалась в вакуоле, а у сои - в цитоплазме С увеличением сроков экспозиции растений, до 24 часов, в клетках начинал возрастать ва-куолярный фонд ГАМК Накопление же а-аланина происходило при всех сроках экспозиции у всех анализируемых растений в основном за счет увеличения вакуолярного фонда этой аминокислоты

Таким образом, нам впервые удалось выяснить размеры вакуолярного и цитоплазматического фондов «стрессовых» аминокислот у растений с разным типом обмена веществ и показать, что в условиях гипоксии значительно возрастала роль вакуолярного клеточного компартмента в накоплении данных аминокислот и это не зависело от видовой принадлежности растений

Имеются данные, что физиологически активные вещества существенно влияют на метаболизм аминокислот, способствуя изменению направленности биосинтетических процессов в клетках (Ершова, Винокурова, 1999) Как показали наши опыты при обработке растений кинетином в клетках проростков гороха увеличивалось содержание глутамата на 46% и а-аланина на 36% ЭБ вызывал более значительное увеличение содержания всех анализируемых аминокислот в клетках только проростков гороха Содержание ГАМК увеличилось вдвое, а остальных аминокислот на 40-50% ЭБ был более эффективен, чем кинетин и в пополнении аминокислотного пула у растений сои Содержание аспартата в проростках при обработке ЭБ возрастало до 300%, а глутамата и ГАМК на 42-25% соответственно В то же время нужно отметить, что у проростков кукурузы как кинетин, так и ЭБ вызывали не увеличение, а наоборот падение уровня аминокислот до 40-70% от уровня контрольных растений.

Ц в

24 часа а) а-аланин (соя)

в) а-аланин (кукуруза)

д) а-алаиии (пшеница)

100 : =Г

80 ! |

60 |

е.

40 |

20,

Ц В

6 часов

ц в

24 часа

г) Г'АМК (кукуруза)

е) Г'АМК (пшеница)

Рис. 2. Изменение содержания а-аланина И ГАМК при действии 6 и 24-час. гипоксии и ССЬ-среды в цитоплазматическом (Ц) и вакуолярпом (В) комлартментах клеток листьев проростков (Ц:В-% к общему содержанию к каетке; 1-1502-тииоксия, З-ССЬ-среда)

« В

6 часов

ц в

24 часа б) Г'АМК (соя)

Полученные данные показали, что под действием регуляторов роста в клетках бобовых растений наблюдается не только увеличение содержания аминокислот, но и изменение их внутриклеточной локализации за счет перераспределения их между цитоплазматическим и вакуолярным фондами, что могло быть результатом изменения проницаемости биологических мембран под действием регуляторов роста, а это приводило бы как к увеличению степени доступности субстратов к соответствующим ферментным системам, так и к изменению скорости активного транспорта аминокислот в вакуоль клеток через тонопласт

Таблица 1

Влияние газовых сред (6 час) на локализацию аминокислот в клетках проростков сои, обработанных регуляторами роста — кинетином и ЭБ (Ц - цитоплазма, В - вакуоль, Ц В - %, % к контролю без регуляторов роста)

Аминокислоты гипоксия СОг-среда + Кинетин + ЭБ

гипоксия СОг-среда гипоксия СОг-среда

% ЦВ % ЦВ % ЦВ % ЦВ % ЦВ % ЦВ

Аспартат 287 50 50 565 42 58 130 30 70 170 50 50 202 36 64 214 43 57

Глутамат 160 53 47 164 52 48 113 40 60 126 50 50 225 37 63 223 47 53

Алании 268 50 50 380 65 35 60 30 70 115 40 60 234 45 55 356 54 46

ГАМК 440 80 20 640 60 40 160 20 80 416 45 55 230 60 40 272 60 40

Ранее (Ершова и др, 1991, 1996) показано, что фитогормоны могут сглаживать изменения в метаболизме растений, в частности фосфолипид-ного состава мембран митохондрий, вызванные действием гипоксии В работе использовались проростки гороха и сои, на которых после обработки их фитогормонами испытывали воздействие разных газовых сред

Как видно из данных таблицы 1, как в условиях гипоксии, так и в СОг-среде содержание всех анализируемых аминокислот в клетках проростков сои, обработанные кинетином, уменьшалось При этом показано, что при действий гипоксии и кинетина для всех аминокислот, возрастал только вакуолярный компартмент клетки Однако в СОг-среде у проростков сои, обработанных кинетином, содержание аспартата и глутамата было поровну распределено между цитоплазмой и вакуолью а-Аланин и ГАМК имели вакуолярную локализацию При обработке растений ЭБ как в гипокси-ческих условиях, так и в СОг-среде в клетках проростков сои наблюдалось уменьшение содержания аминокислот Исключением был глутамат, содержание которого возрастало на 65% при действии гипоксии и на 160% при действии углекислого газа Показано, что при действии гипоксии и ЭБ для аспартата, глутамата, а-аланина возрастал вакуолярный фонд, а для ГАМК - цитоплазматический В СОг-среде у проростков сои ЭБ вызывал повышенное содержание в вакуолярном компартменте аспартата и глута-

мата, а а-аланина и ГАМК, наоборот, в цитоплазматическом компартменте клетки

Однако у проростков гороха при обработке регуляторами роста, как в гипоксических условиях, так и в СОг-среде снижение содержания изучаемых аминокислот не наблюдалось. Напротив содержание аспартата, глу-тамата, а-аланина увеличивалось в среднем на 15-45% Содержание ГАМК возрастало в 1,8 раза при действии на растения гипоксии и в 2 раза при действии углекислого газа Кинетин в среде азота вызывал повышенное содержание в цитоплазматическом компартменте аспартата и ГАМК, в ва-куолярном компартменте только а-аланина, а глутамат был поровну распределен между цитоплазмой и вакуолью в клетках проростков гороха В СОг-среде показано превалирование цитоплазматического фонда всех анализируемых аминокислот над вакуолярным

При действии гипоксии и С02-среды, а также при обработки ЭБ в клетках проростков гороха содержание аспартата, глутамата, а-аланина увеличивалось в среднем на 20-40% А содержание ГАМК при действии гипоксии возрастало на 140%, а углекислого газа - вдвое Содержание всех анализируемых аминокислот происходило за счет пополнения только ва-куолярного фонда клетки

Таким образом, проведенные исследования показали, что фитогор-моны, такие как кинетин, в меньшей степени ЭБ, могут сглаживать изменения в метаболизме аминокислот растений, вызванных действием стрессовых факторов, в частности гипоксии, что подтверждают полученные ранее данные по фосфолипидному обмену (Ершова, 1996)

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОСВЯЗАННЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА

Накопленная в условиях гипоксии в клетках проростков гороха ГАМК, при возвращении растений в аэробные условия может принимать участие в образовании агликона ИС-гликозида, специфического соединения растений гороха (гешЬапикЬш й а!, 1984), что позволяет нормализовать ее содержание в клетках растений Показано, что глюкоза образующаяся при расщеплении ИС-гликозида под действием фермента (3-глюкозидазы, вступала в процессы дыхательного обмена растений, а агли-кон мог служить донором соединений азота в клетках растений гороха Так как ранее было показано (Ершова и др , 2000), что активность цитоплазма-тической (3-глюкозидазы зависит от условий гипоксии, то свои дальнейшие исследования мы посвятили изучению клеточносвязанной Р-глюкозидазы, ее очистке, выделению и изучению свойств у растений при действии гипоксии и С02-среды

Используя различные элюирующие среды (Таказ1и, 1997) было установлено, что адсорбированная форма р-глюкозидазы легко снималась об-

работкой фракций клеточных стенок 0,1 М фосфатно-цитратным буфером (рН 4,8), а ионосвязанная форма 1 М ЫаС1 (4 час ) После этого фракция клеточных стенок еще содержала прочно связанную форму (3-глюкозидазы, которую считали как ковалентную

Таблица 2

Очистка клеточносвязанных форм (3 - глюкозидазы из проростков гороха

Р-ГЛЮ-кози-даза Стадия очистки Общая активность,Е Содержание белка, мг Удельная активность, Е/мг белка Степень очистки Выход

§ Исходная фракция 129,50 ±0,64 34,00 ±0,62 3,81 ±0,24 1 100

X X сВ Я о л к Фракционирование сульфатом аммония (60-100%) 119,01 ±0,87 7,30 ±0,97 16,42 ±0,27 4,3 91,9

ю о, о о ч Гель-фильтрация на С-25 83,85 ±0,64 3,65 ±0,32 22,96 ±0,87 6,0 64,7

с Гель-фильтрация на в-100 74,00 ±0,46 0,27 ±0,08 274,08 ±0,65 73,4 57,1

Исходная фракция 138,70 ±0,39 105,00 ±0,75 1,32 ±0,04 I 100

со к к се со « И Фракционирование сульфатом аммония (60-100%) 92,50 ±0,64 5,00 ±0,34 18,50 ±0,97 14,0 66,7

о X о ¡3 Гель-фильтрация на С-25 64,75 ±0,96 2,43 ±0,11 26,65 ±0,71 20,2 46,7

Гель-фильтрация на в-100 58,10 ±0,74 0,38 ±0,05 153,61 ±0,53 116,3 41,9

Полученные фракции адсорбированной и ионосвязанной (3-глюкозидазы были подвергнуты очистке с помощью высаливания сульфатом аммония и гель - фильтрации (табл 2), в результате чего были получены высокоочищенные препараты со степенью очистки 73,4 и 116,3 раза для этих форм фермента соответственно С помощью электрофореза в ПААГ было показано, что адсорбированная клеточносвязанная р-глюкозидаза была получена в гомогенном состоянии (рис 3) Величина ЯГ фермента составила 0,71, что отличается от значения И! для цитоплазмати-ческой формы, полученной ранее (Винокурова, 2001), и подтверждает наличие адсорбированной на клеточных стенках |3 - глюкозидазы, отличающейся по своим свойствам от цитоплазматической, в частности, по элек-трофоретической подвижности

--о H

Рис. 3. Электрофореграмма адсорбированной клеточносвязаппой [3-i люкозидазы Pi sum sativum L.. в Пол накриламидном геле (Г — фронт красителя, направление движения белка указано стрелкой)

Исследуемые формы клеточное вязан ной Р — глкжозидазы имели оптимум рН, четко сдвинутый в сторону кислых значений и составлял для молекулярных клеточное вяз энных форм фермента в фосфатно-цитратном буфере 4.8 ± 0,1, что совпадало со значениями других растений (Hosel., 1978; Akiyama, î 997). В тоже время это отличается от pi I — оптимума для цитоплазма™ чес кой [î - глюкозидазы проростков гороха (Ершова, Винокурова, 2000-2002; Erchova 2001), который был равен 5,2 ± 0,2.

Максимальную активность обе молекулярные формы - глюкозидазы проявляли при температуре ^30 - +40°С. Сходные значения имели глюкозидазы из листьев овса (Grunweller, 1985), нута (Dopico, 1991).

Определение термостабильности выеокоочищенных форм фермента проводили при температурах ОТ +20" -до +60°С при р.1 ! 4,8. Показано, что при т-45иС в течение 3 часов сохраняется 100% активности для адсорбированной формы и в течение 2 часов для и oi юс вязанной формы фермента. Ионосвязанная форма фермента при 60°С теряла за 2 часа почти 80% активности. Адсорбированная же форма фермента проявляла большую термостабильность. Для потери ее активности до 75% потребовалось 3 час а.

При хранении частично очищенных препаратов этого фермента было показано, что адсорбированная молекулярная форма сохраняла до 60% своей активности в течение 7 суток. Ионосвязанная молекулярная форма fi-глюкозидазы была более лабильной и сохраняла до 90% активности и те-

чение 4 суток Полученные ферментные препараты полностью теряли активность за 11 суток у адсорбированной молекулярной формы и за 15 суток у ионосвязанной молекулярной формы фермента р-глюкозидазы

Проведено изучение влияние ионов некоторых двухвалентных металлов на активность клеточносвязанных форм Р-глюкозидазы Ионы Са2+ и Mg2+ оказывали активирующее действие. Ионы Fe2+, Мп2+ и Си2+ в концентрации 25 мМ ингибировали активность ионосвязанной с клеточными стенками формы р-глюкозидазы В тоже время Fe2+ и Си2+ в концентрации 1 мМ лишь незначительно влияли на активность фермента Результаты наших опытов совпадают с данными работы (Zhang, 2001), где показано, что ионы Са2+ положительно влияли, а Си2+ подавлял активность р~ глюкозидазы

При определении кинетических параметров клеточносвязанной Р-глюкозидазы значение Km по ИС-гликозиду для адсорбированной клеточносвязанной Р-глюкозидазы составило 0,35 мМ, а для ионосвязанной формы - 0,92 мМ Соответственно Vmax для этих форм составляла 1,12 шкМ мин~'мг белка"1 и 2,36 шкМ • мин"'мг белка"1 Полученные величины значительно различались между собой и отличались от таковых для цитоплазма-тической Р-глюкозидазы гороха, что указывает на различные физико-химические и кинетические свойства фермента Для а-метил-р-гликозида Km у ионосвязанной формы фермента составила 161,3 мМ Вместе с тем, изученные молекулярные формы клеточносвязанной Р-глюкозидазы не гидролизовали трисахарид раффинозу, которая содержит P-D-фруктозу и глюкозу с a-D-связью

Изучение динамики изменения удельной активности всех форм Р-глюкозидазы в ходе онтогенеза растений гороха показало, что при прорастании семян в надземной части 5-дневных проростков активность всех молекулярных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы была выше, чем ци-топлазматической формы Их активность у проростков возрастала в 1,5-3 раза вплоть до 10-дневного возраста, а затем снижалась к 16 и 27 дню роста Цитоплазматическая р-глюкозидаза на всех этапах роста имела меньшую величину Подобная закономерность ранее была показана для Р-глюкозидазы прорастающих семян риса (Takashi, 1997)

Известно, что содержание ИС-гликозида также возрастало у десятидневных проростков (Ершова, 1996, Винокурова, 2001) При распаде этого соединения освобождается глюкоза, которая могла вступать как в дыхательный обмен, так и участвовать в синтезе других глюкозидов и полисахаров. Можно предположить, что и клеточносвязынные формы Р~ глюкозидазы могут активно участвовать в метаболизме веществ клеточной стенки молодых, активно растущих клеток растений гороха

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГИПОКСИИ И СО,-СРЕДЫ ПА АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ р-ПЛНЖОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА

Исследования влияние гипоксии и С О 2-среды на активность р-глюкозидазы, проведённые при 6 и 16 - часовом действии (рис. 4) показали, что активность клеточносвязанных форм р-глюкозидазы проростков гороха была всегда значительно выше, чем цитоп лазматической Р-глюкозидазы. При действии гипоксии в первые 6 часов активность цито-п лазматичес кой р-глюкшидазы возрастала на 30 - 40%, и далее менялась незначительно.

] б часов

Ц - интоплазматическая, А - адсорбированная, И - ионосиязанная

Рис. 4. Изменение активности цитоплазматической и клеточносвязанных форм р-глюкозидазы при помещении растений гороха в разные газовые среды: Ц-цитоллазматическая, А-адсорбированная, И-ионосвязанная, формы фермента; % от активности при аэрации

При действии 6-часовой гипоксии у клеточносвязанных молекулярных форм Й-глюкозидазы наблюдались более значительные изменения активности. Активность адсорбированной молекулярной фермы Р-ппокозидазы возрастала почти в 4 раза, а ионоевязанной - в 5 раз. При действии среды углекислого газа изменения в активности как цитоплазматической, так и клеточносвязанных форм Р-глюкозидазы носили такой же характер, что и при обычной гипоксии. При увеличении сроков экспонирования проростков до 16 часов отмечалось значительное уменьшение активности молекулярных форм клеточносвязанной р-глюкозидазы па 40 -50% по отношению к аэрируемому контролю (рис. 4).

Таблица 3

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (ИС-гликозид) различных форм р-глюкозидазы при помещении гороха в различные газовые среды в течении 6 часов

Форма фермента Контроль Гипоксия С02-среда

Кт, мМ V, Е/мин"1 Кт, мМ V, Е/мин"1 Кт, мМ V, Е/мин"1

Цитоплазматическая 0,730 ±0,009 0,260 ±0,002 0,650 ±0,009 0,151 ±0,007 0,570 ±0,008 0,090 ±0,011

Адсорбированная 0,125 ±0,003 0,430 ±0,005 0,091 ±0,003 0,222 ±0,007 0,078 ±0,007 0,120 ±0,005

Ионосвязанная 0,120 ±0,007 0,210 ±0,009 0,065 ±0,003 0,103 ±0,007 0,080 ±0,005 0,170 ±0,002

Исследование некоторых физико-химических свойств ферментов, в частности, Кт и Утах показало (табл 3), что при 6-часовой гипоксии и СОг-среды Кт снижалась как у цитоплазматической, так и у всех клеточ-носвязанных форм р-глюкозидазы Это указывало на увеличение степени сродства фермента к субстрату в этих условиях Однако с увеличением сроков экспозиции до 16 часов, Кт у клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы наоборот увеличивалась Особенно ярко это было выражено у ионосвязанной р-глюкозидазы

Такое уменьшение сродства фермента к субстрату (Кт с 0,13 мМ возрасла до 0,55 мМ) может объяснить тот факт, что активность данной формы фермента Р-глюкозидазы снизилась в этот период на 40% по отношению к контролю Данный характер изменения Кт обусловлен развитием приспособительных реакций растений к неблагоприятным внешним факторам

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стресс служит основой для быстрой ориентации организма в меняющихся условиях существования и наиболее экономичным средством поддержания гомеостаза Он проявляется на всех уровнях организации растения и во всех фазах действия неблагоприятного фактора Благодаря неспецифическим механизмам возможно повышение устойчивости к нескольким воздействиям, вызывающим сходные изменения в обмене веществ (Чиркова, 1998)

Нами проведено исследование особенностей обмена аминокислот и их компартментации, а также активности и физико-химических свойств фермента р-глюкозидазы у растений в условиях кратковременного (до суток) дефицита кислорода и повышенных концентраций диоксида углерода Было показано, что роль вакуолярного фонда в накоплении аминокислот

значительно различается у разных видов растений Для представителей бобовых, включая горох (Ершова и др , 2000) и сою, обнаружено преимущественно цитоплазматическая локализация, как белковых аминокислот, так и ГАМК Для представителей злаковых растений показана возрастающая роль вакуолярного клеточного фонда в накоплении аминокислот, которая хорошо проявлялась у проростков кукурузы, но наиболее ярко выражена в клетках листьев проростков пшеницы Полученные данные еще раз подчеркивают важную роль вакуоли в компартментации обмена не только вторичных метаболитов, но и ряда белковых аминокислот, таких как глу-тамат, аспартат, а-аланин и небелковой аминокислоты ГАМК

Проведенный анализ цитоплазматического и вакуолярного клеточных фондов свободных аминокислот у бобовых и злаковых растений в условиях дефицита кислорода показал разную скорость их пополнения Нами было показано, что для ГАМК при б-часовом действии гипоксии и С02 — среды в клетках растений сои происходило пополнение в основном цитоплазматического фонда У представителей злаковых культур (пшеница и кукуруза) возрастание содержание аминокислот отмечалось только за счет вакуолярного компартмента клеток В тоже время в клетках проростков кукурузы аминокислота ГАМК имела цитоплазматическую локализацию С увеличением сроков экспозиции, до 24 часов, начинал возрастать вакуо-лярный, метаболически инертный фонд ГАМК, что происходило, вероятно, за счет переброса в него избыточных количеств накопившейся аминокислоты, как ранее это предполагалось (Ершова, 1996) Накопление же а-аланина, в отличие от ГАМК, происходило при всех сроках экспозиции и у всех видов анализируемых растений только за счет увеличения вакуолярного фонда этой аминокислоты

Как известно, физиологически активные вещества существенно влияют на обменные процессы, включая и метаболизм аминокислот, что способствует изменению направленности биосинтетических процессов Проведенные эксперименты позволили нам изучить влияние регуляторов роста кинетина и эпибрассинолида на внутриклеточное распределение свободных аминокислот, таких как глутамат, аспартат, а-аланин и ГАМК в проростках бобовых (горох, соя) и злаковых (кукуруза) растений Под действием регуляторов роста в клетках бобовых растений наблюдается не только увеличение содержания аминокислот, но и изменение их внутриклеточной локализации за счет перераспределения их между ци-топлазматическим и вакуолярным фондами Можно предположить, что это является результатом изменения проницаемости биологических мембран под действием регуляторов роста, что ранее уже отмечалось в работе (Ершова, Хрипач, 1996), а это приводит как к увеличению степени доступности субстратов к соответствующим ферментным системам, так и к изменению скорости активного транспорта аминокислот в вакуоль клеток через тонопласт

Далее, мы попробовали выяснить, как обработка растений фито-гормонами влияет на содержание и вакуолярные фонды аминокислот, если их поместить на 6 часов в условия гипоксии или СОг-среды. В условиях гипоксии, так и в С02-среде содержание всех анализируемых аминокислот в клетках проростков сои при обработке кинетином уменьшалось Показано, что фитогормоны, такие как кинетин, в меньшей степени ЭБ, могут сглаживать изменения в метаболизме растений, вызванных действием стрессовых факторов, в частности гипоксии

Как известно (¿етйапикЪт й а1, 1984), накопленная при гипоксии ГАМК, при возвращении растений в аэробные условия, активно используются в процессах образования ИС - гликозида Показано, что в расщеплении этого гликозида участвует р-глюкозидаза проростков гороха, которая существует не только в виде цитоплазматической формы, но и в виде кле-точносвязаиных молекулярных форм (Ершова и др., 2000) Однако роль молекулярных форм клеточносвязанной р-глюкозидазы растений остается не достаточно изученной

С помощью выделения различных клеточных фракций в клетках рас-тёний гороха наряду с цитоплазматической формой фермента (3-глюкозидазы, обладающей способностью гидролизовать различные глико-зиды, выявили существование нескольких клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы адсорбированной, ионосвязанной и ковалент-носвязаннои, обладающих большей специфичностью к природному ИС-гликозиду.

Наибольшую активность обе молекулярные клеточносвязанные формы фермента проявляли в фосфатно-цитратном буфере при рН 4,8 ± 0,1 при температуре +37°С Адсорбированная форма фермента проявляла большую термостабильность, чем ионосвязанная форма Р - глюкозидазы Полученные ферментные препараты полностью теряли активность за 11 суток у адсорбированной молекулярной формы и за 15 суток у ионосвязанной молекулярной формы фермента Р-глюкозидазы Ионы Са2+ и М§2* оказывали активирующее действие Ионы Ре2+, Мп2+ и Си2+ в концентрации 25 мМ/л оказывали ингибирующее действие на активность ионосвязанной с клеточными стенками формы р-глюкозидазы. Клеточносвязанная р-глюкозидаза проявляет высокую специфичность как к типу гидролизуе-мой связи, гак и к агликоновой части субстрата, что характерно для большинства растительных глюкозидаз, как цитоплазматических (Ершова и др , 2000, ЕгвсЬэуа, 2001), так и клеточносвязанных При прорастании семян в надземной части 5-дневных проростков гороха активность всех молекулярных форм клеточносвязанной Р - глюкозидазы была выше, чем цитоплазматической формы Активность всех клеточносвязанных форм Р — глюкозидазы при росте проростка возрастала в 1,5-3 раза до 10-дневного возраста, а затем резко снижалась.

Защитные реакции растений на неблагоприятные воздействия приобретают адаптивный характер при возможности координации их с помощью различных систем регуляции При rano- и аноксии ферментная регуляция контролирует комплементарные перестройки обмена веществ, необходимые для образования достаточного для жизнедеятельности количество АТФ и интермедиатов, генерирования и окисления восстановленных кофакторов, детоксикации продуктов анаэробного метаболизма (Чиркова, 1998) Было установлено, что активность ряда ферментов изменяется под воздействием на растения факторов внешней среды, в частности, в условиях дефицита кислорода (Попова и др., 1991, Землянухин и др., 1988). Ранее было показано, что активность р-глюкозидазы проростков гороха (Ершова, Винокурова, 2001) возрастала в условиях гипоксии и СОг-среды. Однако влияние гипоксии на активность р-глюкозидазы более не изучалась, а клеточносвязанную форму р-глюкозидазы в этом аспекте совсем не исследовали В связи с этим мы исследовали влияние гипоксии и С02-среды на активность р-глюкозидазы, как растворимой, так и клеточносвязанной, при 6 и 16 -часовом действии. При исследовании активности фермента ¡3-глюкозидазы было показано, что активность всех молекулярны ч форм этого фермента при кратковременных экспозициях в меньшей степени зависела от снабжения тканей кислородом, а определялась содержанием в среде углекислого газа В условиях гипоксии и среды углекислого газа выявились не только существенные различия активности молекулярных форм фермента Р-глюкозидазы, но и физико-химических характеристик. Km 3-глюкозидазы снижалась как у цитоплазматической, так и у клеточносвя-занных форм Р-глюкозидазы Это указывало на увеличение степени сродства фермента к субстрату у растений, подвергнутых воздействию гипоксии и С02-среды. Однако с увеличением сроков экспозиции до 16 часов, Кш у клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы увеличивалась Такой характер изменения Кш Р-глюкозидазы может быть результатом развития приспособительных реакций растений при воздействии неблагоприятных внешних факторов Можно допустить, что стрессовые условия (гипоксия и СОг-среда) вызывают конформационные изменения фермента, связанные с изменениями активного центра, что приводит к изменению активности фермента

Таким образом, наши исследования показали, что гипоксия и повышенные концентрации углекислого газа влияют не только на образование, локализацию свободных аминокислот, но и на активность ряда ферментов, включая как ферменты дыхательного метаболизма, так и метаболизацию вторичных соединений

ВЫВОДЫ

1 Проведен анализ цитоплазматического и вакуолярного клеточных фондов свободных аминокислот в клетках бобовых и злаковых растений с использованием мембранотропного соединения ДМСО Показано, что в условиях обычной аэрации для представителей бобовых (соя) растений отмечена преимущественно цитоплазматическая локализация ряда аминокислот, таких как глутамат, а-аланин, аспартат и ГАМК. Для злаковых (пшеница, кукуруза) растений были показаны большие объемы вакуолярного клеточного фонда этих аминокислот.

2. Установлено, что в условиях гипоксического стресса изменяется как содержание свободных аминокислот, так и их внутриклеточное распределение в клетках растений При этом значительно возрастала роль вакуолярного клеточного компартмента и это не зависело от видовой принадлежности растений

3 Показано, что регуляторы роста кинетин и ЭБ в клетках бобовых растений вызывали не только увеличение содержания свободных аминокислот в клетках анализируемых растений, но и влияли на их внутриклеточную локализацию за счет перераспределения между цитоплазматиче-ским и вакуолярным клеточными фондами

4 Обнаружено, что фитогормоны в условиях гипоксии и С02-среды уменьшали накопление «стрессовых» аминокислот таких как ГАМК и а-аланин в клетках только устойчивых растений сои и не проявляли такого действия у менее устойчивых растений гороха

5 С использованием различных элюирующих смесей установлено существование нескольких клеточносвязанных молекулярных форм р-глкжозидазы - адсорбированной, ионосвязанной, ковалентносвязанной С применением модифицированной многостадийной очистки получена в электрофоретически гомогенном состоянии адсорбированная молекулярная форма р-глюкозидазы из растений гороха Высокоочищенные адсорбированная и ионосвязанная с клеточными стенками молекулярные формы фермента р-глюкозидазы получены со значениями удельной активности 274,08 Е/мг белка и 153,61 Е/мг белка соответственно Значение относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле составило 0,71 для адсорбированной молекулярной формы Р-глюкозидазы

6 Выявлено разное сродство молекулярных форм фермента р-глюкозидазы к субстратам Полученные значения Кт для адсорбированной и ионосвязанной молекулярных форм фермента свидетельствуют о высоком сродстве фермента к природному ИС-гликозиду и более низкого к а-метил- р-гликозиду и рафинозе

7 Определены значения рН-, температурного оптимумов и термостабильность адсорбированной и ионосвязанной с клеточными стенками молекулярных форм фермента р-глюкозидазы Установлена активация ио-

носвязанной молекулярной формы фермента ионами двухвалентных металлов (Mg2+, Са2+) в концентрациях 1мМ Ионы Fe2+, Мп2+ и Си2+ ингиби-руют данную форму фермента Р-глюкозидазы Показаны изменения активности всех молекулярных форм р - глюкозидазы в онтогенезе растений гороха.

8. Установлено, что в условиях кислородного стресса возрастала активность цитоплазматической формы Р-глюкозидазы растений гороха, а клеточносвязанной только в первые 6 часов При этом соответственно меняется величины Km и Vmax С02-среда вызывала в ряде случаев более значительные изменения, чем условия гипоксии, при этом Km менялась более значительно

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Ершова АН. Влияние гипоксии и повышенного содержания СО? на внутриклеточное распределение аминокислот в Pisum sativum / АН Ершова, Н В Винокурова, Н А. Гущина // Организация и регуляция фи-зиолого-биохимических процессов межрегион сб науч работ, посвященный памяти А А Землянухина - Воронеж, 2004 - С. 43-46

2 Ершова А.Н Вакуолярные фонды свободных аминокислот бобовых и злаковых растений /АН Ершова, Н.А Гущина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион сб науч. работ, посвященный памяти А А Землянухина-Воронеж, 2002 - Вып 4 - С 5154

3 Гущина Н А Внутриклеточная локализация аминокислот у растений в условиях гипоксического стресса /НА Гущина, А Н Ершова // 6-я Пущи некая конф. молодых учёных «Биология - наука 21-го века»- Пущине, 2002 -ТЗ -С 203.

4 Ершова А Н Влияние ЭБ на распределение аминокислот между вакуолярным и цитоплазматическим компартментами в растениях сои Интродукция растений /АН Ершова, Н.А Гущина // Охрана и обогащение биологического разнообразия видов. Материалы междунар. конф Воронеж изд-во В ГУ Воронеж, 2002.-С 105-107

5 Ершова А.Н. Распределение свободных аминокислот между цитоплазматическим и вакуолярным фондами разных растений /АН Ершова, Н В Винокурова, Н А. Гущина // Экологическая ботаника наука, образование, прикладные аспекты. Междунар науч. конф. Тез. докл. Изд-во Сыкт. Ун-та Сыктывкар, 2002 - С. 97.

6 Ершова А.Н Влияние гипоксии и С02 - среды на содержание и внутриклеточную локализацию свободных аминокислот в бобовых и злаковых растений / А.Н Ершова, Н.А Гущина // Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов Материалы VII Междунар. научно - практической экологической конференции Белгород: изд-во БелГУ Белгород, 2002. - С 160

7 Ершова А Н Хроматографический анализ отдельных компартмен-тов свободных аминокислот у растений в условиях гипоксического стресса /АН Ершова, Н А Гущина // Сорбционные и хроматографические процессы Воронеж изд-во ВГУ, 2002 -Т 2 - Вып 5-6 - С 630-637

8 Гущина Н А Активность Р-глюкозидазы в онтогенезе Pisum sativum L / Н А Гущина, А Н Ершова // 7-я Пущинская конф молодых ученых «Биология - наука 21-го века» -Пущино, 2003.-С 326

9 Ершова А Н Образование и компартментализация аминокислот у растений с разной устойчивостью в условиях гипоксии и повышенного содержания С02 /АН Ершова, Н А Гущина // Ботанические исследования в азиатской России Материалы XI Съезда Русского ботанического общ-ва Барнаул Изд "АзБука" Барнаул, 2003 - С 213-214

10 Ершова АН Влияние фитогормонов на объемы вакуолярного фонда аминокислот в клетках бобовых и злаковых / А Н Ершова, Н А Гущина // Физиология растений и экология на рубеже веков Ярославль, 2003 -С 201-202

11 Ершова А Н Исследование вакуолярных фондов аминокислот и глюкозидов в клетках Pisum sativum в условиях гипоксического стресса и С02-среды //АН Ершова, Н В Винокурова, Н А Гущина // V Съезд Общ-ва Физиол раст России Тез. докл - Пенза, 2003 - С 273-274

12 Ершова А Н Клеточносвязанная и цитоплазматическая р-глюкозидаза Pisum sativum, изменение в онтогенезе и при гипоксии /АН Ершова, Н А Гущина // V Съезд Общ-ва Физиологов Растений России и Междунар конф "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" Тез докл. - Пенза, 2003 - С 274-275

13 Ершова АН Выделение клеточносвязанных форм Р-глюкозидазы проростков гороха, их очистка и изменение в онтогенезе / А Н Ершова, Н А Гущина // Сорбционные и хроматографические процессы - Воронеж изд-во ВГУ, 2003 -Т 3 - Вып 6 - С 758-766

14 Ершова АН Влияние фитогормонов на внутриклеточное распределение свободных аминокислот в проростках бобовых и злаковых растений /АН Ершова, Н А Гущина // Организация и регуляция физио-лого-биохимических процессов межрегион, сб науч работ, посвященный памяти А А Землянухина - Воронеж, 2003 - С 41

15 Еремина Н А. Клеточносвязанная Р-глюкозидаза Pisum sativum, выделение и свойства /НА Еремина, А Н Ершова // 8-я Пущинская конф молодых ученых «Биология - наука 21-го века» - Пущино, 2004 - С 53.

16 Ершова АН Действие гипоксии и С02-среды на активность молекулярных форм Р-глюкозидазы проростков гороха /АН Ершова, Н А Гущина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов межрегион сб. науч. работ, посвященный памяти А А Землянухина - Воронеж, 2004 -С 38

17 Ершова АН Содержание аминокислот в вакуолярном и цито-плазматическом компартментах клеток в проростках бобовых и злаковых растений под влиянием регуляторов роста / АН Ершова, Н А Еремина // Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений: Материалы научно-практической конференции (ч 1) - Орёл, 2006. -С 312-316

18. Ершова АН Физико-химические и кинетические свойства кле-точносвязанных молекулярных форм ß-глюкозидазы проростков гороха / А Н. Ершова, Н А Еремина // Сорбционные и хроматографические процессы Воронеж- изд-во ВГУ, 2006 -Т 6 - Вып. 3 - С 432-440

19. Ershova А N Compartmentation of free amino acids in plants under hypoxia and CO2 media / AN Ershova, NA Eremma // Abst Book XV FESPB Congress, Lyon, France 2006 - P. 156.

Статьи № 7,13, 18 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ

Научное издание

ЕРЕМИНА Надежда Александровна

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ И ПОВЫШЕННЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОМПАРТМЕНТАЦИЮ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И АКТИВНОСТЬ Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 17 04 2007 Формах 60*84 1/16 Печать трафаретная Гарнитура «Тайме» Уел печ л 1,5 Уч-изд л 1,4 Заказ 161 Тираж 100 экз

Воронежский госпедуниверситет Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии университета 394043, г Воронеж, ул Ленина, 86

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Еремина, Надежда Александровна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КИСЛОРОДА.

1.1. Гипоксия как стрессовый фактор в жизни растений.

1.2. Дыхательный обмен растений в условиях гипо- и аноксии.

1.3. Влияние анаэробиоза на обмен белков и активность ферментов.

1.4. Обмен органических кислот и аминокислот у растений в условиях кислородной недостаточности.

1.4.1. Влияние гипоксии и повышенных концентраций

СОг на содержание органических кислот в клетках растений.

1.4.2. Влияние гипоксии и С02-среды на обмен аминокислот в клетках растений.

1.5. Особенности действия СОг-среды на растения.

ГЛАВА 2. КОМПАРТМЕНТАЦИЯ ОБМЕННЫХ ПРОЦЕССОВ РАСТЕНИЙ.

2.1. Вакуолярный компартмент и его роль в организации обменных процессов в клетках растений.

2.2. Роль вакуолярного компартмента в организации обмена органических кислот и аминокислот в клетках растений

2.3. Влияние гипоксии и высоких концентраций СО на состав вакуолярного фонда растительных клеток.

ГЛАВА 3. ПУТИ ОБРАЗОВАНИЯ ИС-ГЛИКОЗИДА И

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА ЕГО МЕТАБОЛИЗАЦИЮ.

3.1. Образование и локализация ИС-гликозида в клетках растений

3.2. Влияние регуляторов роста и гипоксии на скорость образования и утилизацию ИС-гликозида.

ГЛАВА 4. р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И ИХ РОЛЬ В РАСТЕНИЯХ.

4.1. р-Глюкозидаза и ее роль в метаболизме олиго- и арил-гликозидов растений.

4.1.1. Распространение и локализация р-глюкозидаз в растительных клетках.

4.1.2. Физико-химические свойства растительных р-глюкозидаз

4.1.3. р-Глюкозидазы и их активность в онтогенезе растений.

4.1.4. Влияние факторов среды на активность р-глюкозидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Методы исследования.

5.2.1. Условия постановки опытов.

5.2.2. Хроматографическое определение содержания свободных аминокислот.

5.2.3. Исследование внутриклеточного распределения соединений с использованием ДМСО.

5.2.4. Определение активности фермента р-глюкозидазы.

5.2.5. Препаративное выделение ИС-гликозида из растений и его агликона в растениях гороха.

5.2.6. Выделение цитоплазматической и клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы.

5.2.6.1. Выделение цитоплазматической Р-глюкозидазы из растений гороха.

5.2.6.2. Выделение клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы.

5.2.7. Получение высокоочищенных препаратов клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы.

5.2.7.1. Фракционирование с помощью сульфата аммония.

5.2.7.2. Гель-фильтрация.

5.2.7.3. Аналитический электрофорез.

5.2.8. Исследование кинетических характеристик Р-глюкозидазы

5.2.9. Определение количества белка.

5.2.10. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИИ АМИНОКИСЛОТ У БОБОВЫХ И ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОЙ АЭРАЦИИ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ФИТОГОРМОНОВ.

6.1. Распределение свободных аминокислот по фондам клетки в бобовых и злаковых растений.

6.2. Влияние гипоксии и повышенного содержание СО2 на образование и компартментализацию аминокислот у растений с разной степенью устойчивости.

6.3. Влияние фитогормонов на внутриклеточное распределение свободных аминокислот в проростках бобовых и злаковых растений.

6.4. Влияние фитогормонов на внутриклеточное распределение свободных аминокислот в проростках бобовых растений, помещенных в условия разных газовых сред.

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОСВЯЗАННЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ р - ГЛЮКОЗИДАЗЫ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА.

7.1. Выделение клеточносвязанной (3-глюкозидазы растений гороха

7.2. Получение высокоочищенных молекулярных форм

Р - глюкозидазы из растений гороха.

7.3. Исследование некоторых физико-химических и кинетических свойств клеточносвязанных молекулярных форм р - глюкозидазы проростков гороха.

7.4. Изменение активности различных молекулярных форм р-глюкозидазы в онтогенезе растений гороха.

ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ И С02-СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ Р - ГЛКЖОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА.

8.1. Действие гипоксии и СОг-среды на активность клеточносвязанной р-глюкозидазы проростков гороха.

8.2. Физико-химические и кинетические свойства клеточно-связанных форм (3 - глюкозидазы растений, подвергнутых действию гипоксического стресса и СОг-среды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот и активность β-глюкозидазы растений"

В зависимости от газового состава среды и длительности гипоксического воздействия изменяются ответные реакции растительного организма (Crawford, 1978; Вартапетян, 2005). Эффективным адаптационным механизмом служит перестройка аминокислотного обмена, направленная в сторону образования так называемых «стрессовых» аминокислот (Андреева, 1989). ГАМК запасается тканями растений в неблагоприятных условиях в больших количествах без повреждения клеток и выступает как легко мобилизуемая защищенная форма сукцината при восстановлении нормального дыхания благодаря блокированию ее утилизации через реакции цикла трикарбоновых кислот (Shelp, 1995). Местом локализации накопленной ГАМК может являться вакуоль, где обнаружено значительное содержание отдельных аминокислот (Francis, 1999; Андреев, 2001). К сожалению, размеры вакуолярных фондов свободных аминокислот изучены только лишь для клеток небольшого количества растений. Изменение же вакуолярного фонда аминокислот при стрессах, включая и гипоксический, практически ранее не исследовалось. Одним из путей утилизации избыточного количества ГАМК является включение ее в клетках проростков гороха в процессы образования агликона специфического соединения изосукцинимид-|3-гликозида (ИС-гликозид) (Zemlianukhin et al., 1984). Показано, что в расщеплении этого гликозида участвует (3-глюкозидаза, которая представлена не только цитоплазматической, но и клеточносвязанной молекулярной формой (Ершова и др., 2000). Однако роль молекулярных форм клеточносвязанной р-глюкозидазы растений остаётся не достаточно изученной, а для условий гипоксического стресса практически не рассматривалась.

Цель исследования. Целью данной работы является изучение влияния гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на компартментацию свободных аминокислот у растений с различной устойчивостью и активность молекулярных форм Р-глюкозидазы растений.

Задачи работы.

1. Изучить с использованием мембранотропного соединения ДМСО распределение ряда свободных аминокислот, включая ГАМК, между цитоплазматическим и вакуолярным фондами клеток бобовых и злаковых растений, различающихся устойчивостью, в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода.

2. Исследовать влияние регуляторов роста на процессы накопления и внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот у растений с разным типом обмена веществ в условиях гипоксического стресса и СО2-среды.

3. Определить влияние гипоксии и повышенных концентраций углекислого газа на активность различных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений гороха.

4. Выяснить характер связывания р-глюкозидазы с клеточными стенками, а также исследовать динамику активности отдельных молекулярных форм р-глюкозидазы в онтогенезе растений гороха.

5. Изучить некоторые физико-химические и кинетические свойства молекулярных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений при нормальной аэрации, в условиях гипоксии и СОг-среды.

Научная новизна. Показана роль вакуоли в компартментации обмена не только вторичных метаболитов, но и ряда свободных аминокислот аспартат, глутамат, а-аланин, ГАМК), что имеет важное значение в процессах адаптации аминокислотного звена метаболизма растений, обладающих разной степенью устойчивости к условиям гипоксического стресса в клетках растений. Показано действие фитогоромонов кинетина и эпибрассинолида (ЭБ) на процессы накопления «стрессовых» аминокислот, а-аланина и ГАМК, и их внутриклеточную локализацию в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода в клетках растений.

Установлено существование, наряду с цитоплазматической, нескольких связанных с клеточными стенками молекулярных форм (3-глюкозидазы растений гороха. Разработана схема очистки и получен электрофоретически гомогенный препарат адсорбированной молекулярной формы фермента J3-глюкозидазы. Исследованы физико-химические и кинетические параметры адсорбированной и ионосвязанной (3-глюкозидазы. Показаны изменения активности отдельных молекулярных форм (3-глюкозидазы в ходе онтогенеза растений гороха.

Обнаружено, что высокие концентрации диоксида углерода вызывали более значительные изменения в накоплении и локализации свободных аминокислот в клетках растений, а также влияли на физико-химические свойства всех молекулярных форм (3-глюкозидазы растений гороха.

Разработанные способы выделения и очистки клеточносвязанной (3-глюкозидазы растений гороха могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре биологии растений и микробиологии Воронежского государственного педагогического университета при чтении лекций по физиологии растений, а также при выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту;

1. Анализ объемов вакуолярных фондов клеток с использованием ДМСО свидетельствует, что разные виды растений значительно различаются по содержанию свободных аминокислот в этом клеточном компартменте.

2. В условиях гипоксии значительно возрастает роль вакуолярного фонда в накоплении «стрессовых» аминокислот ГАМК и а-аланина и это не зависело от видовой принадлежности растений.

3. Исследования действия фитогормонов кинетина и ЭБ показывают, что они могут сглаживать изменения в метаболизме растений, в частности в процессах образования и накопления «стрессовых» аминокислот (ГАМК, а-аланин), вызванных действием стрессовых факторов.

4. С использованием высокоочищенных (в том числе гомогенных) ферментных препаратов молекулярных, связанных с клеточными стенками, и цитоплазматической форм [3-глюкозидазы показано, что в условиях кислородной недостаточности изменялись величины Km и Vmax. ССЬ-среда вызывала в ряде случаев более значительные изменения, чем условия обычной гипоксии этих параметров.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), конференции, посвященной 65-летию Ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского (Воронеж, 2002), V съезде Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003), на 6-ой, 7-ой, 8-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2004 г.г.), XI съезде РБО (Барнаул, 2003), всероссийской научно-практической конференции (Ярославль, 2003), VII международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов» (Белгород, 2002), научно-практической конференции «Регуляция продуктивного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006) и XV FESPB Congress (Lyon, France, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 181 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (8 глав), заключения, выводов и списка литературы (212 источника), приложения. Иллюстрированный материал включает 31 рисунков и 21 таблицу.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Еремина, Надежда Александровна

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ цитоплазматического и вакуолярного клеточных фондов свободных аминокислот в клетках бобовых и злаковых растений с использованием мембранотропного соединения ДМСО. Показано, что в условиях обычной аэрации для представителей бобовых (соя) растений отмечена преимущественно цитоплазматическая локализация ряда аминокислот, таких как глутамат, а-аланин, аспартат и ГАМК. Для злаковых (пшеница, кукуруза) растений были показаны большие объемы вакуолярного клеточного фонда этих аминокислот.

2. Установлено, что в условиях гипоксического стресса изменяется как содержание свободных аминокислот, так и их внутриклеточное распределение в клетках растений. При этом значительно возрастала роль вакуолярного клеточного компартмента и это не зависело от видовой принадлежности растений.

3. Показано, что регуляторы роста кинетин и ЭБ в клетках бобовых растений вызывали не только увеличение содержания свободных аминокислот в клетках анализируемых растений, но и влияли на их внутриклеточную локализацию за счет перераспределения между цитоплазматическим и вакуолярным клеточными фондами.

4. Обнаружено, что фитогормоны в условиях гипоксии и СОг-среды уменьшали накопление «стрессовых» аминокислот таких как ГАМК и а-аланин в клетках только устойчивых растений сои и не проявляли такого действия у менее устойчивых растений гороха.

5. С использованием различных элюирующих смесей установлено существование нескольких клеточносвязанных молекулярных форм (3-глюкозидазы - адсорбированной, ионосвязанной, ковалентносвязанной. С применением модифицированной многостадийной очистки получена в электрофоретически гомогенном состоянии адсорбированная молекулярная форма р-глюкозидазы из растений гороха. Высокоочищенные адсорбированная и ионосвязанная с клеточными стенками молекулярные формы фермента Р-глюкозидазы получены со значениями удельной активности 274,08 Е/мг белка и 153,61 Е/мг белка соответственно. Значение относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле составило 0,71 для адсорбированной молекулярной формы р-глюкозидазы.

6. Выявлено разное сродство молекулярных форм фермента р-глюкозидазы к субстратам. Полученные значения Km для адсорбированной и ионосвязанной молекулярных форм фермента свидетельствуют о высоком сродстве фермента к природному ИС-гликозиду и более низкого к а-метил- р-гликозиду и рафинозе.

7. Определены значения рН-, температурного оптимумов и термостабильность адсорбированной и ионосвязанной с клеточными стенками молекулярных форм фермента р-глюкозидазы. Установлена активация ионосвязанной молекулярной формы фермента ионами двухвалентных металлов (Mg2+, Са2+) в концентрациях 1 тМ. Ионы Fe2+, Мп2+ и Си2+ ингибируют данную форму фермента р-глюкозидазы. Показаны изменения активности всех молекулярных форм Р -глюкозидазы в онтогенезе растений гороха.

8. Установлено, что в условиях кислородного стресса возрастала активность цитоплазматической формы р-глюкозидазы растений гороха, а клеточносвязанной только в первые 6 часов. При этом соответственно меняется величины Km и Vmax. СОг-среда вызывала в ряде случаев более значительные изменения, чем условия гипоксии, при этом Km менялась более значительно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стресс служит основой для быстрой ориентации организма в меняющихся условиях существования и наиболее экономичным средством поддержания гомеостаза. Он проявляется на всех уровнях организации растения и во всех фазах действия неблагоприятного фактора. Благодаря неспецифическим механизмам возможно повышение устойчивости к нескольким воздействиям, вызывающим сходные изменения в обмене веществ (Чиркова, 1998).

Нами проведено исследование особенностей обмена аминокислот и их компартментализации, а также активности и физико-химических свойств фермента Р-глюкозидазы у растений в условиях кратковременного (до суток) дефицита кислорода и повышенных концентраций диоксида углерода. Было показано, что роль вакуолярного фонда в накоплении аминокислот значительно различается у разных видов растений. Для представителей бобовых, включая горох (Ершова и др., 2000) и сою, обнаружено преимущественно цитоплазматическая локализация, как белковых аминокислот, так и ГАМК. Для представителей злаковых растений показана возрастающая роль вакуолярного клеточного фонда в накоплении аминокислот, которая хорошо проявлялась у проростков кукурузы, но наиболее ярко выражена в клетках листьев проростков пшеницы. Полученные данные еще раз подчеркивают важную роль вакуоли в компартментализации обмена не только вторичных метаболитов, но и ряда белковых аминокислот, таких как глутамат, аспартат, а-аланин и небелковой аминокислоты ГАМК.

Проведенный анализ цитоплазматического и вакуолярного клеточных фондов свободных аминокислот у бобовых и злаковых растений в условиях дефицита кислорода показал разную скорость их пополнения. Нами было показано, что для ГАМК при 6-часовом действии гипоксии и СО2 - среды в клетках растений сои происходило пополнение в основном цитоплазматического фонда. У представителей злаковых культур (пшеница и кукуруза) возрастание содержание аминокислот отмечалось только за счет вакуолярного компартмента клеток. В тоже время в клетках проростков кукурузы аминокислота ГАМК имела цитоплазматическую локализацию. С увеличением сроков экспозиции, до 24 часов, начинал возрастать вакуолярный, метаболически инертный фонд ГАМК, что происходило, вероятно, за счет переброса в него избыточных количеств накопившейся аминокислоты, как ранее это предполагалось (Ершова, 1996). Накопление же а-аланина, в отличие от ГАМК, происходило при всех сроках экспозиции и у всех видов анализируемых растений только за счет увеличения вакуолярного фонда этой аминокислоты.

Как известно, физиологически активные вещества существенно влияют на обменные процессы, включая и метаболизм аминокислот, что способствует изменению направленности биосинтетических процессов. Проведённые эксперименты позволили нам изучить влияние регуляторов роста кинетина и эпибрассинолида на внутриклеточное распределение свободных аминокислот, таких как глутамат, аспартат, а-аланин и ГАМК в проростках бобовых (горох, соя) и злаковых (кукуруза) растений. Под действием регуляторов роста в клетках бобовых растений наблюдается не только увеличение содержания аминокислот, но и изменение их внутриклеточной локализации за счет перераспределения их между цитоплазматическим и вакуолярным фондами. Можно предположить, что это является результатом изменения проницаемости биологических мембран под действием регуляторов роста, что ранее уже отмечалось в работе (Ершова, Хрипач, 1996), а это приводит как к увеличению степени доступности субстратов к соответствующим ферментным системам, так и к изменению скорости активного транспорта аминокислот в вакуоль клеток через тонопласт.

Далее, мы попробовали выяснить, как обработка растений фитогормонами влияет на содержание и вакуолярные фонды аминокислот, если их поместить на 6 часов в условия гипоксии или СС^-среды. В условиях гипоксии, так и в СОг-среде содержание всех анализируемых аминокислот в клетках проростков сои при обработке кинетином уменьшалось. Показано, что фитогормоны, такие как кинетин, в меньшей степени ЭБ, могут сглаживать изменения в метаболизме растений, вызванных действием стрессовых факторов, в частности гипоксии.

Как известно (Zemlianukhin et al., 1984), накопленная при гипоксии ГАМК, при возвращении растений в аэробные условия, активно используются в процессах образования ИС - гликозида. Показано, что в расщеплении этого гликозида участвует [3-глкжозидаза проростков гороха, которая существует не только в виде цитоплазматической формы, но и в виде клеточносвязанных молекулярных форм (Ершова и др., 2000). Однако роль молекулярных форм клеточносвязанной р-глюкозидазы растений остаётся не достаточно изученной.

С помощью выделения различных клеточных фракций в клетках растений гороха наряду с цитоплазматической формой фермента Р-глюкозидазы, обладающей способностью гидролизовать различные гликозиды, выявили существование нескольких клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы: адсорбированной, ионосвязанной и ковалентносвязанной, обладающих большей специфичностью к природному ИС-гликозиду.

Наибольшую активность обе молекулярные клеточносвязанные формы фермента проявляли в фосфатно-цитратном буфере при рН 4,8 ± 0,1 при температуре +30° - +40°С. Адсорбированная форма фермента проявляла большую термостабильность, чем ионосвязанная форма р глюкозидазы. Полученные ферментные препараты полностью теряли активность за 11 суток у адсорбированной молекулярной формы и за 15 суток у ионосвязанной молекулярной формы фермента р-глюкозидазы. Ионы Са2+ и Mg2+ оказывали активирующее действие. Ионы Fe2+, Мп2+ и Си2+ в концентрации 25 мМ оказывали ингибирующее действие на активность ионосвязанной с клеточными стенками формы р-глюкозидазы. Клеточносвязанная р-глюкозидаза проявляет высокую специфичность как к типу гидролизуемой связи, так и к агликоновой части субстрата, что характерно для большинства растительных глюкозидаз, как цитоплазматических (Ершова и др., 2000; Erschova, 2001), так и клеточносвязанных. При прорастании семян в надземной части 5-дневных проростков гороха активность всех молекулярных форм клеточносвязанной Р - глюкозидазы была выше, чем цитоплазматической формы. Активность всех клеточносвязанных форм р - глюкозидазы при росте проростка возрастала в 1,5-3 раза до 10-дневного возраста, а затем резко снижалась.

Защитные реакции растений на неблагоприятные воздействия приобретают адаптивный характер при возможности координации их с помощью различных систем регуляции. При гипо- и аноксии ферментная регуляция контролирует комплементарные перестройки обмена веществ, необходимые для образования достаточного для жизнедеятельности количество АТФ и интермедиатов, генерирования и окисления восстановленных кофакторов, детоксикации продуктов анаэробного метаболизма (Чиркова, 1998). Было установлено, что активность ряда ферментов изменяется под воздействием на растения факторов внешней среды, в частности, в условиях дефицита кислорода (Попова и др., 1991; Землянухин и др., 1988). Ранее было показано, что активность Р-глюкозидазы проростков гороха (Ершова, Винокурова, 2001) возрастала в условиях гипоксии и ССЬ-среды. Однако влияние гипоксии на активность р-глюкозидазы более не изучалась, а клеточносвязанную форму Р-глюкозидазы в этом аспекте совсем не исследовали. В связи с этим мы исследовали влияние гипоксии и СОг-среды на активность Р-глюкозидазы, как растворимой, так и клеточносвязанной, при 6 и 16 - часовом действии. При исследовании активности фермента Р-глюкозидазы было показано, что активность всех молекулярных форм этого фермента при кратковременных экспозициях в меньшей степени зависела от снабжения тканей кислородом, а определялась содержанием в среде углекислого газа. В условиях гипоксии и среды углекислого газа выявились не только существенные различия активности молекулярных форм фермента р-глюкозидазы, но и физико-химических характеристик. Km р-глюкозидазы снижалась как у цитоплазматической, так и у клеточносвязанных форм Р-глюкозидазы. Это указывало на увеличение степени сродства фермента к субстрату у растений, подвергнутых воздействию гипоксии и СОг-среды. Однако с увеличением сроков экспозиции до 16 часов, Km у клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы увеличивалась. Такой характер изменения Km р-глюкозидазы может быть результатом развития приспособительных реакций растений при воздействии неблагоприятных внешних факторов. Можно допустить, что стрессовые условия (гипоксия и СОг-среда) вызывают конформационные изменения фермента, связанные с изменениями активного центра, что приводит к изменению активности фермента.

151

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Еремина, Надежда Александровна, Воронеж

1. Андреев И.М. Функции вакуоли в клетках высших растений / И.М. Андреев // Физиология растений. - 2001. - Т. 48, № 5. - С. 777-787.

2. Бугорский П.С. О локализации Р-глюкозидазы в клетках лепестков розы / П.С. Бугорский, М.Н. Запрометов // Физиология растений. 1981. -Т. 28, №2.-С. 430-433.

3. Васильева И.С. Стероидные гликозиды растений и культура клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность / И.С.Васильева, В.А. Пасешниченко // Успехи биологической химии. -2000.-Т. 40.-С. 182-185.

4. Вартапетян Б.Б. Учение об анаэробном стрессе растений новое направление в экологической физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений / Б.Б. Вартапетян // Физиология растений. - 2005. - Т. 52.- С. 931 -953.

5. Винокурова Н.В. Пространственная структура, внутриклеточная локализация и ферменты катаболизма изосукцинимид-р-гликозида: автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.В. Винокурова; Воронеж, гос. ун-т. -Воронеж, 2001.-24 с.

6. Влияние модификаторов мембран на дыхательный газообмен и содержание пигментов клеток каллуса фасоли / Е.Г. Костина и др. // Депонир. в ВИНИТИ 15.06.92. № 1321 В 92. - 1992. - 14 с.

7. Влияние повышенной концентрации С02 на фотосинтез, углеводный и азотный метаболизм и рост растений горчицы / Т.Ф. Андреева и др. // Физиология растений. 1989. - Т. 36 .- С. 40-48.

8. Влияние экстремально высокой концентрации С02 на роста и биохимический состав микроводорослей / Т.В. Сергеенко и др. // Физиология растений. 2000. - Т. 47, № 5. - С. 722-729.

9. Войцековская С.А. Влияние анаэробиоза на свойства хроматина и состав его негистоновых белков в проростках пшеницы и риса / С.А. Войцековская, Т.Г. Бадьина, Т.В. Чиркова // Физиология и биохимия культурных растений. 1993. - Т. 25, № 1. - С. 58-66.

10. Генерозова И.П. Влияние аноксии и постаноксической аэрации на ультраструктуру митохондрий проростков пшеницы // Физиология растений. 1991. - Т. 38, № 5. - С. 938-947.

11. Генерозова И.П. О некоторых молекулярных механизмах адаптации проростков Oryza sativa к аноксии / И.П. Генерозова, М.С. Красавина, Л.И. Полякова, Б.Б. Вартапетян // Физиология растений. -1998. Т. 45, № 2. - С. 268-275.

12. Глотов Н.А. Окислительные процессы в митохондриях при гипоксии и их корреляция глутаминовой кислотой: автореф. дис. . докт. биол. Наук / Н.А. Глотов; Свердл. гос. ун-т. Свердловск, 1973. - 25 с.

13. Гормональный баланс проростков пшеницы и риса в условиях аноксии / В.В. Емельянов и др. // Физиология растений. 2003. - Т. 50, №6.-С. 922-929.

14. Гринева Г.М. Индуцированная этиленом активация ксиланазы в придаточных корнях кукурузы как ответ на стрессовое явление на корневое затопление / Г.М. Гринева и др. // Прикладная микробиология и биохимия. 2001. - Т. 37, № 6. - С. 722-725.

15. Губарь С.И. Рост и накопление гликозидов в каллусной культуре тканей женьшеня при длительном воздействии экзогенных фитогормонов / С.И. Губарь, Т.П. Гулько, В.А. Кунах // Физиология растений. 1997. -Т. 44, №1.-С. 97-104.

16. Гудвин Т. Введение В биохимию растений / Т. Гудвин, Э. Мерцер. М.: Мир, 1986. - С. 203-268.

17. Гуриелидзе К. Г. Локализация олигофуростанозидов и расщепляяющей их специфичной р-глюкозидазы в листьях Dioscorea deltoidea / К.Г. Гуриелидзе, В.А. Пасешниченко, И.С. Васильева // Физиология растений. 1986. - Т. 33, № 6. - С. 1144-1151.

18. Гуриелидзе К. Г. Гликогидролазы листьев и корневищ Dioscorea deltoidea Wall / К.Г. Гуриелидзе, В.А. Пасешниченко, И.С. Васильева // Биохимия. 1987. - Т.52, № 4. - С. 562-568.

19. Давыдова Е.Г. Компартментализация обмена пространственно разграниченных фондов аминокислот дрожжевой клетки / Е.Г. Давыдова, А.П. Басов, В.В. Рагинский // Биохимия. 1983. - Т. 48, № 8. -С. 1241-1248.

20. Джиффорд P.M. Глобальный фотосинтез и проблема пищевых и энергетических ресурсов / P.M. Джиффорд // Фотосинтез. Под ред. Говинджи. М.: Мир, 1987. Т. 2. - С. 411-453.

21. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982.-Т. 1.-392 с.

22. Дубинина Л. Ф. Компартментация продуктов фотосинтеза в вакуолях изолированных протопластов мезофилла Beta vulgaris / Л.Ф. Дубинина, Е.А. Кудрявцев, И.М. Бухаранова // Физиология растений. 1992. - Т. 39, Вып. 6. - С. 1098-1106.

23. Дубинина И.М. Вакуоли клеток мезофилла как промежуточный компартмент ассимилятов / И.М. Дубинина, Е.А. Бураханова, Л.Ф. Кудрявцева // Физиология растений. 2001. - Т. 48, № 1. - С. 40-46.

24. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди и трикарбоновых кислот в растениях / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1999. 192 с.

25. Ершова А.Н. Образование изосукцинимид-(3-гликозида и метаболизм гамма-аминомасляной кислоты в растениях гороха в нормальных и гипоксических условиях: автореф. дис. . канд. биол. наук / А.Н. Ершова; Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1978. 20 с.

26. Ершова А.Н. Динамика образования изосукцинимид-р-гликозида в процессе прорастания семян гороха / А.Н. Ершова // Вопросы биологии и почвоведения: сб. науч. работ / Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 1980. -С. 15-18.

27. Ершова А.Н. Действие и последействие анаэробиоза на метаболизм 14С-органических кислот в проростках гороха / А.Н. Ершова,

28. A.А. Землянухин, Л.В. Кудрявцева // Фотосинтез, дыхание и органические кислоты: сб. науч. работ / Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 1980.-С. 82-90.

29. Ершова А.Н. Влияние кинетина на содержание фосфолипидов проростков кукурузы в модифицированных газовых средах / А.Н. Ершова,

30. B.В.Чурикова, И.А.Стерлигова // Физиология и биохимия культурных растений. 1991. - Т. 23, № 3. - С. 250-256.

31. Ершова А.Н. Распространение и метаболизм изосукцинимид-р-гликозида в растениях / А.Н. Ершова // Деп. ВИНИТИ 20.10.92. № 3019 -В 92.-1992.- 14 с.

32. Ершова А.Н. Организация метаболических процессов растений в условиях дефицита кислорода и повышенного содержания углекислого газа: автореф. дис. . докт. биол. наук. / А.Н. Ершова; Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 1996. - 52с.

33. Ершова А.Н. Влияние эпибрассинолида на процессы перекисного окисления липидов Pisum sativum в условиях кислородного стресса / А.Н. Ершова, В.А. Хрипач // Физиология растений. 1996 - Т.44, №4.-С. 870-873.

34. Ершова А.Н. Исследование компартментации изосукцинимид-р-гликозида в клетках растений гороха / А.Н. Ершова, Н.В. Винокурова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: сб. науч. работ / Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 2000. - С. 55-58.

35. Ершова А.Н. Очистка и физико-химические свойства р-глюкозидазы растений гороха / А.Н. Ершова, Н.В. Винокурова // Теория и практика сорбционных процессов: сб. науч. работ / Воронеж, гос. ун-т. -Воронеж, 2000. С. 251-257.

36. Ершова А.Н. Влияние гипоксии и повышенного содержания С02 на внутриклеточное распределение аминокислот в Pisum sativum L /

37. А.Н. Ершова, Н.В. Винокурова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: сб. науч. работ / Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 2001.-С. 43-46.

38. Ершова А.Н. Роль углекислого газа в регуляции состава жирных кислот фосфолипидных компонентов мембран растений в условиях дефицита кислорода / А.Н. Ершова // Цитология. 2001. - Т. 43, № 4. -С. 346-347.

39. Жданов Ю. А. Система р-гликозидаз подсолнечника. Выделение ферментов и изучение их субстратной специфичности / Ю.А. Жданов, P.M. Кесслер // Биохимия. 1980. - Т. 45, № 12. - С. 2158-2164.

40. Захарова Н.С. р-Глюкозидазы листьев и корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris / Н.С. Захарова, Т.А. Петрова // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т. 36, № 4. - С. 458-461.

41. Землянухин А.А. Динамика образования у-аминомаслянной кислоты и изосукцинимид р-гликозида в проростках гороха /А.А. Землянухин, А.Н. Ершова // Физиология растений. 1983. - Т.30, № 2. -С. 341-348.

42. Землянухин А.А. Активность алкоголь- и лактатдегидрогеназы проростков гороха в условиях разных газовых сред // Ферменты, ионы ибиоэлектрогенез растений / А.А. Землянухин, А.Н. Ершова. Горький: ГГУ. - 1984.-С. 105-110.

43. Землянухин А.А. Метаболизм фосфолипидов проростков кукурузы в условиях N2- и СОг-среды / А.А. Землянухин, А.Н. Ершова,

44. B.И. Колесникова // Физиология растений. 1985. - Т.32, № 5. - С. 884894.

45. Землянухин А.А. Жирнокислотный состав липидов митохондрий проростков кукурузы, экспонированных в модифицированной атмосфере / А.А. Землянухин, А.Н. Ершова // ДАН СССР. 1986. - Т. 291, № 3.1. C. 762-764.

46. Землянухин А.А., Биохимия гипоксического метаболизма растений / А.А. Землянухин, Б.Ф. Иванов. Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1988.-190 с.

47. Иванов Б.Ф. Утилизация экзогенного этанола проростками гороха в бескислородной среде / Б.Ф. Иванов, А.А. Землянухин, А.М.М. Салам // Физиология растений. 1989. - Т. 36, № 1. - С. 135-142.

48. Иванов Б.Ф. Метаболизм аминокислот проростков гороха, экспонированных в измененных газовых средах / Б.Ф. Иванов, А.А. Землянухин, А.М.М. Салам // С.-х. биол. Сер. Биол. раст. 1994. - № 1. -С. 78-83.

49. Игамбердиев В.Д. Метаболизм органических кислот у растений в уловиях аноксии и избытка углекислого газа / В.Д. Игамбердиев, Б.Ф. Иванов // Цитология. 1991. - Т. 33, № 5. - С. 103.

50. Измайлов С.Ф. Метаболизм аминокислот в изолированных корнях Vicia sativa / С.Ф. Измайлов // Физиология растений. 1975. - Т. 21,Вып. 6.-С. 329-335.

51. Интенсивность гликолиза и устойчивость к гипоксии отделенных корней Pisum sativum / В.Ю. Андреев и др. // Физиология растений. -1996. Т. 43, № 2. - С . 273-278.

52. Интенсивность дыхания проростков гороха и кукурузы в условиях высотной гипоксии / Т.П. Астафурова и др. // Авиакосм, и экол. мед. 1996. - Т. 30, № 3. - С. 35-39.

53. Колупаев Ю.Е. Низкомолекулярные соединения азота в растениях в условиях стрессов: особенности метаболизма и возможное физиологическое значение / Ю.Е. Колупаев // Физиология и биохимия культурных растений. 1995. - Т. 27, № 5-6. - С. 324-335.

54. Компартментация Сахаров, в фотосинтезирующих листьях фасоли / Д.М. Гродзинский и др. // Физиология и биохимия культурных растений. 1976. - Т. 8, Вып. 4. - С. 381-383.

55. Косаковская И.В. Стресс растений: специфические и неспецифические реакции адаптационного синдрома / И.В. Косаковская // Укр. ботан. ж. 1998. - Т. 55, № 6. - С. 584-587.

56. Кунаева Р. М. Гидролитические и окислительные ферменты обмена фенольных соединений растений / P.M. Кунаева // Алма-Ата: Наука, 1986.- 158 с.

57. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных / Лукнер М. // М.: Мир, 1979. 548 с.

58. Молекулярная биология клетки/ Б.Д. Албретс и др. М.: Мир, 1994.-540 с.

59. Остаплюк Е.Д. Изменение активности митохондрий этиолированных проростков озимых культур в условиях острой гипоксии / Е.Д. Остаплюк, A.M. Силаева, В.П. Захарова // Регуляция физиологических функций растений. Киев, 1986. - с. 60-64.

60. Пасхина Т.С. Количественное определение аминокислот при помощи хроматографии на бумаге / Т.С. Пасхина // Современные методы биохимии // М.: Медицина, 1964. 248 с.

61. Парамонова Н.В. Нарушение синтеза крахмала в листе сахарной свеклы при активации фотосинтеза в условиях концентрации 02 и высокойконцентрации С02 / Н.В. Парамонова, С.Н. Чмора, Г.М. Кожаринова // Цитология. -1991. Т. 33, №9. - С.94.

62. Писхаренко В. П. Динамика содержания свободных аминокислот в органах плодовых растений / В. П. Писхаренко, Н. В. Титова. -Кишинев, 1986. 94с.

63. Полевой В.В. Фитогормоны / В.В. Полевой. Л.: ЛГУ, 1982.248 с.

64. Попова Т.Н. НАДФ изоцитратдегидрогеназа и превращение изоцитрата и 2-кетоглутарата в растениях, экспонированных в бескислородных средах / Т.Н. Попова, Б.Ф. Иванов, Л.А. Землянухин // Физиология растений. - 1991. - Т. 43, № 4. - С. 561-566.

65. Программа SCAN для структурного анализа линейных полисахаридов на основе данных 13С-ЯМР-спектров с использованием персональных компьютеров / Н.К. Кочетков и др. // Биоорганическая химия.-1992.-Т. 18, №1.-С. 116-125.

66. Розум Л.В. Гликозидазная активность листьев пшеницы и устойчивость к ржавчине / Л.В. Розум, Т.М. Сидорова, В.В. Чигрин // Физиология растений. 1983. - Т. 30, № 2. - С. 384-388.

67. Роль интермедиаторов пероксисомального метаболизма в условиях дефицита кислорода и избытка углекислого газа / В.Д. Игамбердиев и др. // Физиология растений. 1991. - Т. 38, № 5. - С. 930-937.

68. Титлянов Э.А. Локализация обмена органических кислот в зеленой растительной клетки / Э.А. Титлянов, И.М. Магомедов // Труды

69. Биол. почв, ин-та Дальневосточного науч. центра АН СССР. 1973. -Т. 13.-116 с.

70. Трофимова О.И. Некоторые особенности инициирования абсцизовой кислоты морозостойкого состояния клеток озимой пшеницы / О.И. Трофимова, А.И. Заботин // Вестник Башкирского университета. -2001.-№2.-С. 126-128.

71. Функционирование аскорбат-глутатионового цикла высших растений в условиях аноксии / В.Д. Игамбердиев и др. // Физиология и психофизиология мотиваций. 1998. - № 2. - С. 67-71.

72. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии / Т.В. Чиркова. Л.: ЛГУ. - 1988. - 244 с.

73. Чиркова Т.В. Растение и анаэробиоз / Т.В. Чиркова // Вестн. СПб. ун-та. 1998. - Сер. 3, № 2. - С. 41-52.

74. Чиркова Т.В. Синтез белка в растениях в условиях гипоксии и аноксии / Т.В. Чиркова, С.А. Войцековская // Успехи совр. биол. 1999. -№2, Т. 119.-С. 178-189.

75. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений/ Т.В. Чиркова// СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. 244 с.

76. Чкаников Д.И. Локализация р-глюкозидаз в клетках высших растений / Д.И. Чкаников, Г.А. Тарабрин, A.M. Шабанова, П.Ф. Константинов // Физиология растений. 1969. - Т. 16, № 2. - С. 322-325.

77. Abutidze М. The effect of metal ions on tea leaves p-glucosidase activity / M. Abutidze, N. Mchedlishvili, G. Pruidze // Bull. Georg. Acad. sci. -2000. V.161, No. 3. - P. 525-526.

78. Alibert S. Changes in biochemical composition of vacuoles isolated from Acer pseudoplatanus L. durinol cell culture / S. Alibert, A. Carrosco, A. Baudet // Biochtm. Et Biochys. Acta. 1982. - V. 721, No. 1. - P. 22-29.

79. Amthor J.S. Respiration in a Future, Higher-C02 World / J.S. Amthor, G.W. Koch, A.J. Bloom // Plant Cell Environment. 1991. - V. 14, -P. 13-20.

80. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells / D. Leocurieux et al. // Plant Cell. 2002. - V 14, No. 10. - P. 2627-2641.

81. Analysis of Soluble Calmodulin Binding Protein from Fava Bean Foots: Identification of Glutamate Decarboxylase as a Calmodulin-Activated Enzyme / V. Ling et al. // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 1135-1143.

82. Arazi T. Molecular and Biochemical Analysis of Calmodulin Interactions with the Calmodul in-Binding Domain of Plant Glutamate Decarboxylase / T. Arazi, G. Baum, W. Snedden, B. Shelp, H. Fromm // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 551-561.

83. Aurisano N. Abscisic Acid Induced Stress-Like Polyamine Pattern in Wheat Seedlings, and Its Reversal by Potassium Ions / N. Aurisano, A. Bertani, M. Mattana, R. Reggiani // Physiol Plant. 1993. - V. 89. - P. 687-692.

84. Aurisano N. Anaerobic Accumulation of 4 Aminobutyrate in Rice Seedlings: Causes and Significance / N. Aurisano, A. Bertani, R. Reggiani // Phytochemistry. - 1995. - V. 38. - P. 1147-1150.

85. Barley p-glucosidase: Expression during seed germination and maturation and partiae amino acid sequences / G. Simos et al. // Biochim. et Biophys. Acta. Gen. Subj. 1994. - V. 1199, No. 1. - P. 52-58.

86. Bertani A. Anaerobic Metabolism in Rice Roots // Plant Life under Oxygen Deprivation / A. Bertani, R. Reggiani // The Hague: SBP Publishing, 1991.-P. 187-199.

87. Bhallia P. Characteristics of a p-galactosidase associated with the stroma of chloroplasts prepared from mesophyll protoplasts of the primary leaf of wheat / P. Bhallia, M. Dalling // Plant Physiol. 1984. - V. 76, No. 1. -P. 92-95.л ,

88. Binding studies of Mn to a glycosidase system from sugar cane juice / M. E. Legaz et al. // Plant Physiol. And Biochem. 1991. - V. 29, No. 6. -P. 601-603.

89. Boiler J. Dynamics of vacuolar compartmentation / J. Boiler, A. Wieniken // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V. 37. - P. 137-164.

90. Bowes G. Facing the Inevitable: Plants and Increasing Atmospheric C02 Levels / G. Bowes // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. -V. 44.-P. 309-332.

91. Bown A. The Metabolism and Physiological Roles of 4-Amynobutyric Acid / A. Bown, B.J. Shelp // Biochem. (Life Sci Adv.). 1989. -V.87. - P. 21-25.

92. Carrol A.D. Dynamics of Nitrogenous Assimilate Partitioning between Cytoplasmis and Vacuolar Fractions in Carrot Cell Suspension Cultures / A.D. Carrol// Plant Physiol.-1992.-V. 100, No. 7. -P.l808-1814.

93. Cicek M. Structure and expression of a p-glucosidase from sorghum / M. Cicek, A. Esen // Plant Physiol. 1998. - V. 116, No. 4. - P. 1469-1478.

94. Clouse S. D. Brassinosteroids: Essential regulators of plant growth and development / S.D. Clouse, J.M. Sasse // Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. 1998. - P. 427-451.

95. Crawford R.M.M. Metabolic Adaptations to Anoxia / R.M.M. Crawford // Plant Life in Anaerobic Environments. Eds Hook D.D., Crawford R.M.M. Ann Arbor: Ann Arbor Science Publ. 1978. - P. 119-136.

96. Crunweller S. Characterization of membrane bound betta-glicosidase responsible for the activation of oat leaf saponins / S. Crunweller, Y. Kesselmeier // Phytochemistry. 1985. - V. 24, No. 9. - P. 1941-1943.

97. Dalcochinin (3-glucoside and its J3-glucosidase enzyme from Dalbergia cochinchinensis / J. Svasti et al. // Phytochemistry. 1999. - V. 50, No. 5.-P. 739-743.

98. Davis B.L. Disk Electrophoresis. Method and application to puman serum proteins / B.L. Davis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. - V. 121. -p. 404-427.

99. Delmer D.P. Dimethylsulfoxide as a Potential Tool for Analysis of comparmentation in Living Plant Cells / D.P. Delmer // Plant Physiol. 1979. -V. 64.-P. 623-629.

100. Dey P. M. Occurence of glycopratein glycosidases in mature suds of mung bean (Vigna radiata) / P. M. Dey// Phytochemistry. 1984. - V. 23, No. 2.-P. 257-260.

101. Dharmawardhana D.P. Coniferin specific (3-glucosidase from lignifying xylem of Pinus contarta / D.P. Dharmawardhana, В. E. Ellis, J.E. Carlson//Plant Physiol.- 1994.-V. 105,No. l.-P. 127.

102. Dopico B. Caracterization, hidrolytic activity and variations throughout growth of a cell wall p-glucosidase and a-galactosidase from Cicer arietinum epicotyls / B. Dopico, N. Gregorio, L. Emilia // Plant Physiol. -1991. V. 137, No. 4. - P. 477-482.

103. Duggelin T. Vacuolar localion of lipofuscin and praline - like compounds in senescent barley leaves / T. Duggelin, M. Scherllenberg, K. Bortlic // Plant Physiol. -1988. - V. 133, No. 4. - P. 492-497.

104. Eamus D. The Direct Effects of Increase in the Global Atmospheric CO2 Concentration on Natural and Commercial Temperate Trees and Forests / D. Eamus, P.G. Jarvis // Adv. Ecol. Res. 1989. - V. 19. - P. 1-55.

105. Effect of Anoxia on Wheat Seedlings. Influence of 02 Supply Prior to Anoxia on Tolerance to Anoxia. Alcoholic Fermentation, and Sugar Levels / I. Waters etal. //J.Exp. Bot.-1991.-V. 42.-P. 1437-1447.

106. Eksittikul T. Characterization of cynnoogenic betta-glicosidase from cassava / T. Eksittikul, M. Chulavatnatol // Arch. Biochem. and Biophys. -1988. V. 266, No. 1. - P. 263-269.

107. El-Diwany A.Y. Comparison of (3-glucosidase activities in different Debaryomyces strains / A.Y. El-Diwany, M.N. Selim // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1987. - V. 26, No. 6. - P. 552-554.

108. Erdmann B. Changes in the Root System of Wheat Seedlings Following Root Anaerobiosis: III. Oxygen Concentration in the Roots / B. Erdmann, E.M. Wiedenroth // Ann. Bot. 1988. - V. 62. - P. 277-286.

109. Ershova A.N. The role of isosuccinimide-beta-glucoside in the respiratory metabolism of Pisum sativum / A.N. Ershova // Plant Physiol. Biochem. 1996. - Sp. Issue. - P. 126.

110. Ershova A.N. Enzyme activity of antioxidative in plants with different tolerance under hypoxia and C02-media / A.N. Ershova, N.V. Popova // Acta Physiol. Plantarum. 2004. - V. 26, No. 3. - P. 224-225.

111. Esen A. Purification and partial characterization of maize (Zea mays L.) P-glucosidase / A. Esen // Plant Physiol. 1992. - V. 98, No. 1. - P. 174182.

112. Esen A. A specific P-glucosidase-aggregation factor is responsible for the |3-glucosidase null phenotype in Maize / A. Esen, D.J. Blanchard // Plant Physiol. 2000. - V. 122. - P. 563-572.

113. Falk A. Expression of a Zeatin О - Glucoside - Degrading p-glucosidase in Brassica napus / A. Falk, L. Rask // Plant Physiol. - 1995. -V. 108, No. 4.-P. 1369-1377.

114. Farrar J.F. The Effects of Increased Atmospheric Carbon Dioxide and Temperature on Carbon Partitioning, Source-Sink Relations and Respiration / J.F. Farrar, M.L. Williams // Plant Cell Environ. 1991. - V. 14. -P. 819-830.

115. Francis M. Plant vacuoles / M. Francis // Plant Cell. 1999. - V. 11, No. 4.-P. 587-599.

116. Gaba shunt in developing soy bean seeds in associated with gypoxia /B. Shelp etal. //Physiol. Plantarum.-1995.-V. 94,No. 1.-P. 213-218.

117. Gelmng C.A. Effects of Auxin and Abscisic Acid on Cytosolic Calcium and pH in Plant Cells / C.A. Gelmng, H.R. lining, R.W Parish. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 9645-9649.

118. Gonzalez L.F. Diferulate and lignin Formation is related to biochemical differences of wall-bound peroxidases / L.F. Gonzalez, M.C. Rojas, F.J. Perez // Phytochemistry. 1999. - V. 50, No. 5. - P. 711-717.

119. J3-Glucosidase activity is involved in scent production in Narcissus flowers / M. Reuveni et al. // Plant Sci. -1999. V. 147, No. 1. - P. 19-24.

120. Greenhouse Gases and Aerosols. Climate Change: The Scientific Assessment / R. Watson et al. // Eds Houghton J.T. Cambridge: Cambridge Univ. Press. 1990. - P. 1-40.

121. Glycosidases in plant tissues of some Brassicaceae: Screening of different cruciferous plants for glycosidase production / T. Sanaa et al. // Appl. Biochem. and Biotechnol. -1995. V. 55, No. 3. - P. 219-230.

122. Grttnweller S. Caracterization of a membrane bound p-glucosidase responsible for the activation of oat leaf saponins / S. Griinweller, J. Kesselmeier // Phytochemistry. 1985. - V. 24, No. 9. - P. 1941-1943.

123. Hartman-Schreier I. Purification and partial characterization of (3-glucosidase from papaya fruit / I. Hartman-Schreier, P. Schreier // Phytochemistry. 1986. - V. 25, No. 10. - P. 2271-2274.

124. Helea linamarase a nonspecific p-glucosidase / L. Dirk et al. // Plantphysiol. - 1987. - V.83, No. 3. - P. 557-563.

125. Hideaki U. The effects of increased atmospheric carbon dioxide on growth, carbohydrates, and photosynthesis in radish Raphanus sativus / U. Hideaki, S. Kousuke // Plant and Cell Physiol. 1998. - V. 39. - P. 34.

126. Hochachka P.W. Defense Strategies against Hypoxia and Hypothermia / P.W. Hochachka // Science. 1986. - V. 231. - P. 234-241.

127. Homeyer U. Transport of phenylalanine into vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts / U. Homeyer, G. Schultz // Planta. 1988. -V. 176, No. 3.-P. 378-382.

128. Hosel W. Characterization of a (3-glucosidase from Glycine max which hydrolyses coniferin and stnigrin / W. Hosel, R. Todenhagen // Phytochemistry. 1980. - V. 19, No. 7. - P. 1349-1353.

129. Idso S.B. Seasonal Fine-Root Biomass Development of Sour Oranges Trees Grown in Atmospheres of Ambient and Elevated C02 Concentration /S.B. Idso, B.A. Kimball // Plant Cell Environ. 1992. -V. 15.-P. 337-341.

130. Isolation and characterization of an enzyme with (3-glucosidase and (3-fucosidase activities from Dalbergia cochinchinensis Pierre / S. Chantragan et al. // J. Biochem. -1996. V. 119, No. 3. - P. 585-590.

131. Jolliffe P.A. Growth of bean plants at elevated carbon dioxide concentrations / P.A. Jolliffe, D.L. Ehred // Can.J.Bot. 1985. - V. 63, No. 11.-P. 2021-2025.

132. Yang Y. Activation of glyoxylate cycle enzymes in cucumber fruits exposed to С02J Y. Yang, H. Murayama, T. Fykyshima // Plant and Cell Physiol. 1998. - V.39, No. 5. - P. 533-539.

133. Kaiser J. Rapid appearance of phoptosynthetic products in the vacuoles isolated from barley mesophyll protoplast by a new fast method / J. Kaiser, E. Martinoia, A. Wiemken // Z. Pflanzen physiol. 1982. - V. 107, No. 2.-P. 103-113.

134. Kakes P. Linamarase and other (3-glucosidases are present in the cell walls of Trifolium repens / P. Kakes // Planta. 1985. - V. 166, No. 2. -P. 156-160.

135. Kentaro J. Purification and characterization of furosthand glycoside 26-0-(3-glucosidase from Costus speciosus rhizomes / J. Kentaro, E. Yutaka // Febs Lett. 1996. - V. 378, No. 2. - P. 157-160.

136. Kudabaeva N.S. Immobilization of wormwood P-glucosidase on mannose/ glucose specific lectin sorbents / N.S. Kudabaeva, V.M. Lakhtin, R.M. Kunaeva // 11 th Jnt. Lectin Conf., Tartu, June 4-9, 1989: Interlec 11: Book Abstrr. Тарту. - 1989. - P. 42.

137. Kutsuna N. Dynamic organization of vacuolar and microtubule structures during cell cycle progression in synchronized tobacco cells / N. Kutsuna, S. Hasezawa // Plant and Cell Physiol. 2002. - V. 43, No. 9. -P. 965-973.

138. Lalegerie P. |3-Glucosidase from sweet almond. II. Catalytic properties / P. Lalegerie // Biochimie (P.). 1988. - V. 56, No. 10. -P. 1297-1304.

139. Lecas M. Purification and partial characterization of |3-glucosidase from grape / M. Lecas, Y. Ziya, S. Jean-C. // Phytochemistry. 1991. - V. 30, No. 2.-P. 451-454.

140. Lemonoid-glucosid p-glucosidases activity in lemon seedlings / T.A. Ronneberget al. // Plant Physiol. 1995. - V. 39, No. 6. - P. 1305-1307.

141. Lieberei R. Metabolization of cianogenic glucosidases in Hevea brasiliensis / R. Lieberei, D. Selmar, B. Biehl // Plant Syst. And Evol. 1985. -V. 150, No. 1-2.-P. 49-63.

142. Lincoln T. The plant Vacuole / T. Lincoln // J. Exp. Biol. 1992. -V. 172.-P. 113-122.

143. Liu T.Y. Isosuccinimid-P-glicoside, the glucosil donor in synthesis of ethyl-p-glicoside by pea seeding and extrarts / T.Y. Liu, P.A. Castelfranco // Arch. Biochem. and Biophys. 1968. - V. 123, No. 3. - P. 645-646.

144. Liu T.J. The biosynthesis of ethyl-J3-glucoside in extacts of pea seedlings / T.J. Liu, P.A. Castelfranco // Plant Physiol. 1970. - V. 45, No. 4. -P. 424-428.

145. Li Zhen-Chag. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, P-D-glucosidase, malate dehydrogenates, and nonspecific aryl-esterase, in barley and oat primary leaves / Li Zhen Chag, Y.W. McClure // Plant Physiol.-1989.-V.90,No. l.-P. 185-190.

146. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phemol reagent / O.H. Lowry, N.L. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randal // J. Biol. Chem. -1951.-V. 193, No. 2.-P. 265-275.

147. Luijendijk T. J.C. Strictosidine glucosidase from suspension cultured Taberhaemontana divaricata / T. J.C. Luijendijk, A. Nowak, R. Verpoorte // Phytochemistry. 1996. - V. 41, No. 6. - P. 1451-1456.

148. Luo Y. Predicting Responses of Photosynthesis and Root Fraction to Elevated СОг'. Interaction among Carbon, Nitrogen, and Growth / Y. Luo,

149. СБ. Field, Н.А. Mooney // Plant Cell Environ. 1994. - V. 17. - P. 11951204.

150. Maccarrone M. Phytochrome control and anoxia effect on the activity and expression of soybean seedling lipoxigenases 1 and 2. / M. Maccarrone, G. A. Veldink, I.F.G. Vliegenthart // FEBS Lett. 1991. - V. 291, No. l.-P. 117-121.

151. Maroco J.P. Photosynthetic Acclimation of Maize to Growth under Elevated Levels of Carbon Dioxide / J.P. Maroco, G.E. Edwards, M.S.B. Ku // Planta. 1999.-V. 210.-P. 115-125.

152. Martinez M.Y. Betta-glicoside from the cellulolytic system of Alternaria alternata autolyzed cultures / M.Y. Martinez, C. Varguez // FEMS Microbiol. Left. 1988. - V. 55, No. 3. - P. 263-267.

153. Masayuki C. Purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside p-glucosidase from wheat (Triticum aestivum L.) seedling / C. Masayuki, A. Jshihara, H. Jwamura // Planta. 2000. - V. 210. - P. 432-438.

154. Mattana M. Expression of Glutamine Synthetase during the Anaerobic Germination of Oryza saliva L / M. Mattana, A. Bertani, R. Reggiani // Planta. 1994. - V. 195. - P. 147-149.

155. Mattana M. The Root Form of Ferredoxin-NADP+ Oxidoreductase is expressed in Rice Coleoptiles for the Assimilation of Nitrate / M. Mattana, I. Shoji, R. Reggiani // Planta. 1997. - V. 202. - P. 397-401.

156. McGee С. M. Acid glucasidase activities in the cotyledons of Pisum sativum / С. M. McGee, D. R. Murray// Plant Physiol. 1984. - V. 116, No. 5.-P. 467-472.

157. Mechanism of Cytoplasmic pH Regulation in Hypoxic Maize Root Tips and Its Role in Survival under Hypoxia / J.K.M. Roberts et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 3379-3383.

158. Minami Y. Purification and characterization of a betta-glucosidase from Polygonum tinctorium, which cataluzes preferentially the hydrolysis / Y. Minami, T. Kanafigi // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1996. - V. 60, No. l.-P. 147-149.

159. Minami Y. Tissue and intracellular localization of indicant and purification and characterization of indicant synthase from indigo plants / Y. Minami, O. Nishimura, M. Nishimura // Plant and Cell Physiol. 2000. - V. 41, No. 2.-P. 218-225.

160. Mohd A.Z., Santhi A. (3-Galactosidase and its significance in ripening mango fruit / A.Z. Mohd, A. Santhi // Phytochemistry. 1995. - V. 38, No. 5.-P. 1109-1114.

161. Muench D.G. Hypoxically Inducible Barley Alanine Aminotransferase: cDNA Cloning and Expression Analysis / D.G. Muench, A.G. Good // Plant Mol. Biol. 1994. - V.23. - P. 417-427.

162. Mujer C.V. Constitutive and inducible aerobic and anaerobic stress proteins in the Echinochloa complex and rice / C.V. Mujer, M.E. Rumpho, R.A. Kennedy//Plant Physiol.- 1993.-V. 101,No. l.-P. 217-226.

163. Nagahashi G. P-Glucosidase activity in corn roots. Problems in subcellular fractionation / G. Nagahashi, A. Baker // Plant Physiol. 1984. -V. 76,No. 4.-P. 861-864.

164. Nagahashi G. The pH dependent distribution of (3-glucosidase activity in isolated particulate fractions / G. Nagahashi, T. Seibles // Plant Science.- 1985.-V. 38.-P. 173-178.

165. Neuhaus J.- M. Sorting of proteins to vacuoles in plants cells / J M. Neuhaus, J. C. Rogers // Plant Mol. Biol. - 1998. - V. 38, No. 1-2. - P. 127144.

166. Nevins D.J. Relation of glucosides to bean hypocotyls growth / D.J. Nevins // Plant Physiol. 1970. - V.46, No. 3. - P. 458-462.

167. Ning Z.H. Effects of elevated C02 on canopy carbon sequestration, leaf stomatal density, and gas exchange of quercus shumardii and liquibar styraciflua / Z.H. Ning, K.K. Abdollahi // Scanning. 2001. - V.23, No. 2. -P. 150-151.

168. Nisius A. The stromacentre in Avena plastids: an aggregation of p-glucosidase responsible for the activation of oat leaf saponins / A. Nisius // Planta. 1988.- 173,No. 4.-P.474-481.

169. Nitrate Assimilation during the Anaerobic Germination of Rice: Expression of Ferredoxin-Dependent Glutamate Synthase / M. Mattana et al. // Planta. 1996. - V. 199. - P. 74-78.

170. Oba K. Subcellular localization of 2-|3-D-glucosyloxy-cinnamic acids and related p-glucosidase in leaves of Melilotus alba Desp / K. Oba, E. Conn, H. Canut, A. Boudet // Plant Physiol. 1981. - V. 868, No. 6. - P. 13591363.

171. Otegui M.S., Capp R., Staehelin L.A. Developing seeds of arabiclopsis. Store different minelals in two types of vacuoles and in the endoplasmic reticulum / M.S. Otegui, R. Capp, L.A. Staehelin // Plant Cell. 2002. V. 14,No. 6.-P. 1311-1327.

172. Parr A. Permeadilization of Cinchona ledgeriana cells by dimethylsulphoxide. Effects on alkaloid release and long-term membrane integrity / A.J. Parr, R.J. Robins, M.J.C. Rhodes // Plant cell repts. 1984. -V. 3, No. 6.-P. 262-265.

173. Peet M.M. Acclimation to high C02 in monoecions cucumbers. Vegetation and reproductive growth / M.M. Peet // Plant Physiol. 1986. -V. 80, No. 1. - P.59-62.

174. Plant growth in elevated CO2 alters mitochondrial number and chloroplast fine structure / K.L. Griffin et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -2001. V.98, No. 5. - P. 2473-2478.

175. Plant-Metabolism under Hypoxia and Anoxia / B. Ricard et al. // Plant Physiol. Biochem. 1994. V. 32. P. 1-10.

176. Reggiani R. Purification and Synthesis under Anaerobic Conditions of Rice Arginine Decarboxylase / R. Reggiani // Plant Cell Physiol. 1994. -V. 35.-P. 1245-1249.

177. Reggiani R. Incorporation of Nitrate Nitrogen into Amino Acids during the Anaerobic Germination of Rice / R. Reggiani, F. Bertini, M. Mattana // Amino Acids. 1995. - V. 9. - P. 385-390.

178. Reluctant for Glutamate Synthase Generated by the Oxidative Pentose Phosphate Pathway in Non-Photosynthetic Root Plastids / C. G. Bowsher et al. // Plant J. 1992. - V. 2. - P. 893-898.

179. Rogalski J. (3-Glucosidases from Plebian radiate / J. Rogalski, B. Longa-Kowalik // 7 th Int. Conf. Biotechnol. Pulp and Paper Ind., Vancouver, June 16-19,1988. 1988. - P. 91-97.

180. Saunder J. Localization and substrate specificity of glycosidases in vacuoles of Nicotiana rustica / J. Saunder, J. Gillespie // Plant Physioi. 1984. -V. 76,No. 4.-P. 885-888.

181. Schwacke D. Specific proline transporters in Arabidopsis and tomato / D. Schwacke, R. Frommer, B. Wolf// Plant Cell. 1995, No. 5. -P. 1099-1111.

182. Shang-sheng D. Очистка фермента, связанного с продуцированием линилоола, из Jasminum sambac / D. Shang-sheng, О. Hisayoshi, К. Sakata, Qi-ging // J. Zhejing Univ. Agr. and Life Sci. 1999. - V. 25, No. 4. -P. 421-424.

183. Sharma С. B. Multiple forms of (3-galactosidase in chick pea seedlings / Sharma С. В., Sharma T.N. // Phytochemistry.1977. V. 16, No. 7.-P. 1053-1054.

184. Sucrose synthase activity does not restrict glucolysis in roots of transgenic potato plants under hypoxic conditions / H. Biemelt et al. // Planta. -1999, No. 1.-P. 41-43.

185. Siriphanich J. Changes in cytoplasmic and vacuolar pH in harvested lettuce tissue as influenced by CO2/ J. Siriphanich, A. Kader // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1986. - V. 111, No. 1. - P. 73-77.

186. Smith A.M. Effect of Anaerobiosis on Carbohydrate Oxidation by Roots of Pisum sativum / A.M. Smith, T. Rees// Phytochemistry. 1979. -V. 18.-P. 1453-1458.

187. Smith A.M. Isolation and characterization of an enzyme with betta-glicosidase and betta-glicosidase activities from Daldergia cochinchinensis Pierre / A.M. Smith, T. Rees // Y. Biochem.- 1996. 119, No. 3. - P. 585-590.

188. Srisomsap C., Svasti Y. Isolation and characterization of an enzyme with betta-glicosidase and betta-glicosidase activities from Daldergia cochinchinensis Pierre / C. Srisomsap, Y. Svasti // J. Biochem. 1996. - 119, No. 3. - 585-590.

189. Subbaiah C.C. Involvement of Intracellular Calcium in Anaerobic Gene Expression and Survival of Maize Seedlings / C.C. Subbaiah, J. Zhang, MM. Sachs// Plant Physiol. 1994. V. 105. - P. 369-376.

190. Sue M. Purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside p-glucosidase from wheat (Triticum aestivum L.) seedlings / M. Sue, A. Jshihara, H. Jwamura // Planta. 2000. - V. 210, No. 3. - P. 432-438.

191. Takashi A. Purification and characterization of P-glucosidase from germinating rice seeds / A. Takashi // Plant and Cell Physiol. 1997. - V. 38. -P. 128.

192. Tanimoto E. Axial distribution of glycosidases in relation to cellular growth and ageing in Pisum sativum root / E. Tanimoto// J. Exp.Bot. 1985. -V. 36,No. 169.-P. 1267-1274.

193. Tapan K.B. p-Galactosidase activity in the germinating seeds of Vigna sinensis / K.B. Tapan// Phytochemistry. 1985. - V. 24, No. 12. -P. 2831-2833.

194. Thomas R.B. Direct and Indirect Effects of Atmospheric Carbon Dioxide Enrichment on Leaf Respiration of Glycine max (L.) Merr. / R.B. Thomas, K.L. Griffin // Plant Physiol. 1994. - V. 104. - P. 355-361.

195. Thompson C.J. Metabolic Evidence for Stelar Anoxia in Maize Roots Exposed to Low O2 Concentrations / C.J. Thompson, H. Greenway // Plant Physiol. 1991. - V.96. - P. 1294-1301.

196. Variety of responses of plant phenolic concentration to CO2 enrichment / J. Penuelas et al. // J.Exp. Bot. 1996. - V. 47, No. 32. - P. 1463-1467.

197. Vayda M.E. Hypoxic stress inhibits the appearance of wound response proteins in potato tubers / M.E. Vayda, H.J. Schaffer // Plant Physiol. -1988. V. 88., No. 3. - P. 805-809.

198. Vitek V. Sugar-like diphenylamine-positive metabolites in pea seedlings / V. Vitek // Biochem. Biophys. acta. 1964. - V. 93, No. 2. -P. 429-432.

199. Zemlianukhin A.A. Metabolism of Isosuccinimide-p-Glucoside in Pea Seedlings / A.A. Zemlianukhin, A.N. Ershova // Biochem. Physiol. Pflanzen. -1984. V.I79, No. 8. - P. 679-684.

200. Zhang H. Влияние ДМСО на проницаемость мембран, состав растворимых белков и состояние полисом в кусочках клубня картофеля / Н. Zhang, G. Shen, Н. Liang // Hangzhou Univ. Nature. Sci. Ed. 1986. -V. 13,No. l.-P. 84-88.

201. Zhang C. Purification and characterization of ginsenoside-(3-glucosidase from ginseng / C. Zhang, H. Yu, Y. Bao, F. Jin // Chem. Pharm. Bull. 2001. - V. 49, No. 7. - P. 795-798.

202. Zhejiang daxue xuebao / S. Dong, H. et al. // Nongye yu shengming kexue ban: J. Zhejiang Univ. Agr. and Life Sci. 1999. - V. 25, No. 4.-P. 421-424.

Информация о работе

Еремина, Надежда Александровна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот и активность β-глюкозидазы растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы