Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глюкогидролаза листьев юкки славной, участвующая в расщеплении олигофуростанозидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глюкогидролаза листьев юкки славной, участвующая в расщеплении олигофуростанозидов"

.АКАДЕМИЯ НАУК РЕСЛУЕШШ ГРУЗИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИИ и--. С.З.ДШШВДЗЕ

На правах рукописи УДК 547.918

ШРГАДЗЕ ЦКСАНА АЛЩСАНДРОВИА

П1ШОП1ДРОЛАЗА ЛИСТЬЕВ ШОД СЛАВНОЙ, УЧАСТВУЮЩАЯ В РАОЦЕДОЕНИИ ОЛИГОЗУРОСТАНОЗВДОВ

03.00.04 - Еиохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических тук

Тбилиси - 1992

ГМотя. выполнени в Институте фармакохимии им, И.Г.Кута-теладэе и в Инсти'оте биохимии растений им. С.В.Дурмишидзе ЛИ Республики Грузия.

Научные руководители - член-корр. АП РГ, доктор фармацевтических наук, заслуженный деятель науки, профессор Э.П.КЕ/ЕРТЕЛВДЭЕ

- кандидат биологических наук, стерший научный сотрудник К.Г.ГУРИШДОЕ

Официальное оппоненты - доктор биологических наук, профессор

О.Т.ХАЧЗДЗЕ

доктор технических наук, профессор Л.А.:>1УДЖРИ

Ведущая оргонигхшия - Тбилисский государственный медицинский

институт, хвфедра фармаяогнояии

Защита диссертатн состоится "/(> " <■/ ». 19Э2 г. р . // час, на заседании специализированного совета Д 007,04.01 при Институте биохимии растений им. С.В.Дурштоидае АН РГ по адресу: Зй00'^9 Тбилиси, Аллея Даг-ида Агшшснсбели, Ю-1Л> кн.

С диссертацией можно атткомиться в библиотеке Института биохимии растений им. С.В.Дурмжккдпе А.'1 РГ. , Автореферат разослан * ,//.','> 199?. г.

Ученый секретарь специализированного сошла, колдидат биологических неук

Ц М.В.Еендиониввили

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Синтез стероидных гормональных препаратов, весы/а широко применяемых почти по всех областях медицины, главным обрезом осуществляется на основе природных соединений растительного происхождения: стероидных сапогенинов и глю-коалкалоидов. Однако производство этих важна лекарствокшх средств ограничено из-за недостатка сырья для их синтеза.

В Института фармакохимии им. И.Г.Кутателадяе АН Грузии о предыдущие годы из листьев юкки славной ацеелен стероидны;! са-погенин-тирогенин, который оказался рентабельным прэмшлеюшм сырьем для синтеза стероидных гормональных препаратов. Разработана технология получения тигогенина из юкки славной, Создана промышленнал плантация растения.

В листьях йкки славной содержатся стероидные глнкозид» кик в спиростйнолоной, тан и в ^уростаноловой Тигогенин явля- '

ется генинои ряда спиристана.и для максимального его выделения из растительного сырья ваггае значение имеет оптимальное превращение олитаТуростанозидов в олигоепироетаиоэиди, осуществляемое ондогешюй у?-глюкозидазой.

В связи с этим, изучение специфичности и физико-химических свойств глюногидролаэы листьев юкки славной и влияния аутофзр-ментации на выход тигогенина может играть большую роль а оптимизации технологии производства данного вещества.

Цель _и.задачи исследования. Цельо диссертационного 'груда является изучение свойств уЗ-глвкозидпзы юкки славной и установление ее участия п превращении олигофуростаногждов в олиго-спиростанозиды.

Для достикения поставлешюй цели решались' следующие задачи: - исследование локализации й-глюназияазн и олигофуроета-

ноэидо'в в листьях юкки славной;

г'выделение и очистка ^ -глюкозидазы и изучение физико-химических свойств фермента;

- изучение специфичности р -глюкозкдаэы по отт-отению к аг-ликону и углеводному фрагмент субстарта на примере некоторых природных стероидных гликозидов;

- установление корреляционных связей мевду изменением -глюкозидазной активности и содержанием стероидных гликозидов

в течение вегетационного периода растения;

- изучение влияния аутоферментации листьев юкки славной на ткод тиготмна.

Ня.уцная нояяпна работы. Впервые в листьях юкки славной обнаружены две формы уЗ-г лга о.чидпзи. 1-ая форма катализирует превращение олигофуростонозидов в олигоспиростанозиды и расщег. -ляе т синтотимесиЯ субстрат 4-ни трофе ни л -уб -1) -глюк о пира коз ид, а 2-ая фо¿ыа - только синтетический. Определены их молекулярные массы, которые составляют 32000 и 68000, соответственно.

Усганоплена внутриклеточная локализация -глшозидазы в листьях юкки, славной, изменение активности фермента в процессе вегетации растения и некоторые его физико-хкмичеекке свойства.

Выявлена субстратная специфичность 1-ой фор« ^ -глэоко-зидазы по отношению к природным стероидным гликозидам. Доказано, что сродство фермента к природным субстратам не зависит от строения агликона или олигосахаридюго фрагмента при С-3 стероидного ядра.

Наказано, что в листькх шу.и славной олигофуростанозидн накапливаются в эпидермальный слой в нескольких расположенных рядоы 1.Л6ТКОХ.

Выявлена зависимость выхода тигогенина от условий аутоферментации.

Практическая значимость .работы. Разработан простой способ выделения высокоочи^ганно!1. суши олигофуростанозидов из эпидермиса листьев юкки славкой.

Предложены условия аутог'ерментации, позволяющие значительно увеличить виход тигогенинп из растительного сырья.

.Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на У Меядунпродно.Ч конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных веществ (Варна, Болгария, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работ.

Структура и объем диссертации._ Диссертация изложена на S'f О страницах мапинопксного текста, иллюстрирована 13 рисунками, 8 таблицами и одной схемой. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждений полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (191 наименование, в том числе 128 иностранных).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

0<1ъектом исследования служили листья растений юкки славной - Yucca glorioaa , сем. ARavacaae , произрастающей в открытом грунте на опытном поле лекарственных растений Института фармакохимии им. И.Г.Кутателадзе АН Грузии (г.Тбилиси).

Гистохимическое обнаружение олигофуростанозидов в срезах листьев юкки славной проводили с помощью метода Гуриелидзе и др. (1986). Срезы просматривали в световом микроскопа при увеличении 7x20. ;

Сумму фуростаноловых гликозидов выделяли из эпидермиса листа юкки славной. С этой целью из 500 г свежего сырья, собранного с каздого яруса растения, снимали эпндермяльнъгй слой, расти-

- б -

рали в ступке с водоЦ; экстракции поводили 2 раза. Гомогеьат фильтровали, сгущали и остаток яысушивг -л под вакуумом до постоянного веса. Количество олигофуростанозидов в остатке опрсделя- . ли спеятрофотометрически с использованием реактива Эрлиха (1У-рлелидэе и др., 1966).

Активность ¡1 -глюкозиа&эы по от:ювени» л олиго^ростаноаи-дам определял!! дельтозидом и суммой эндогенных фуростаноловьк глики^идов из листьев юкки славной в качестве субстрата. Количество нерасщеллив~лгося олигофуростанозиде определяли по цветной реакции с реактивом Эрлиха. ^ -глшозидаэчую активность по отношению синтетического субстрата 4-нитрофенил-у^ -/^-глюкопи-ранозида определяли по количеству отщепившегося свободного 4-нитрофенола.

За единииу активности -глвхозидезы принимали количество фермента, катализирующее расщепление I нмоль субстрата за I мин. Удельную активность фермента выражали в нмоль на I мг белка за I мин.

Определение белка пповодили фотометрическим методом, основанным на его о кдбнии красителем амидо-черным (Бузун и др., 1982).

При ионообменной хроматографии и гель-фильтрации белок в рлюате определяли спектрофотометричесм. на ($-26 при длине волны 280 им.

Белки фракционно высаливали сернокислым амонием при 4° и центрифугировали при 1000 в 30 мин.

Для ионообменной хроматографии использовали ДЭАЭ-целлюлозу (и йвзпа! Венгрия), активированную по общепринятой методике.

Гель-фильтрацио белка на сефадексе проводили по Детерману (1970). (Молекулярные массы определяли методом ;-ель-фильтрации на сефадексе о-200 (" йшгвас1а 1Две1п<я).

Субклеточную локализацию ^ -глюкозидазы в листьях я::ки славной изучали с помощью дифференциального центрифугирования бесклсточкого экстракта в градиенте сахарозы (Филиппович и др., 1983).

С це^ю повшения выхода тигогенина из листьев юкки славной нами проведен ; аутофермзнтация цельного и измельченного сырья термостатированием при различной температуре (от 25° до ?С°). Контрольные образцы сначала фиксировали острым паром. Содержала тигигенина в ферментированных образцах опре.'.елдли фотоколориметрическим методом, предложенным Институтом фармакохимии АН Грузии (Сулр"велидзе к др., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБиУЗДЕШЕ

Локализация олигофуростанозидов в листьях юкки славной

Рис Л. Продольный срез эпидермиса листа юкки славной. Темные клетки на светлом фоне - клетки-вместилища олигофуростянозидов,окрашенные р активом Эрли-ха. Угеличедае 7x20.

Как видно из рис. I, олигойфостанозиды накапливаются в нескольких расположенных рядом клетках эпидермиса. По мере накопления олигофуростянозидов, ареал клеток-вместилищ расширяется и охватывает почти весь эпидермальный слой. В тканям мезофилла листа олигофуростаноэвды гиггохимически не обнаруживаются.

- а -

Это свидетельствует об их активном транспорте из мезсфила, где они биосинтезируются в зпидермальний слой, где они накапливается.

Выделение фуростаноловых гликозидов из эпидермиса листьев юкки славной

Как нами било показано, олиго&'ростанозид» в основном на-каштиваются в эпидермисе листа юкки славной, сохранность которых обеспечивается отсутствием d данных клетках расщепляющегося их фермента. В этом легко можно убедиться тем, что при гомогенизации снятого эпидермиса водой или е цитрат-фосфатном буфере не происходит преобразование фуростяноэидов в спироетаноэиды, как это имеет место в случае целостного листа.

Легкость снятия эпидермиса с листовой пластинки юкки славной позволяет получигь высохоочи^ешый препара- олигофуроста-нозидоо. Эпидермис особенно легко снимается из свежих листьев верхнего и среднего яруса. Экстракцию ыскт проводить как водой, так и 70$-нда этанолом, однако при использовании воды препарат получается более чистым.

Таблица I

Олигофуростакозиды, выделенные из эпидермиса листьев DKKif славной

Ярус See hoc сня- Бес полу- Содержание Чистота растения листьев, того ченного олиго^уроста- препяра-г йпидор- препарата, но з идо в в та, % ыиса.мг мг лрг: арате, __мг_

Верхний 500 7000 740 585 79

Средний 500 5400 571 451 79

Нижний 500 ЗОСО 310 239 77

- э -

Как видно из табл. 1,"при помощи вышеописанного метода из листьев юкки славной легко можно по"учить високоочиценный препарат с^ростанозидов. Метод простой, легко выполним и успешно может быть использован с целью вцпеления фгуростаноловых глико-звдов в количестве.достаточном для лабораторных экспериментов.

Субклеточная локализация уб-глюкизидазн в листьях юкки славной

При дифференциальном центрифугировании гомогената листьев юкки славной основную часть активности 1-ой формы (участвующей в расцеплении олигофурсстанозидоя) обнаружили во фракции водорастворимых белков (надосадочкая кидкость от центрифугирования при 105000 й). Во фракциях, обогащенных хлоропластами и митохондриями, содержалось, соответственно, 10,3 и 3,5% всей активности этого фермента (табл. 2). В противоположность этим данн.да, в диоскорее дельтовидной более половины всей активности феррита, расщепляющего природный субстрат-дельтозид, обнаружена во фракции обогащенной хяоропластами.тогда как во фракции водорастворимых балков активность олигофуростатазидспецифичной уЗ -глю-козидазы ке отмечена (Г^риелидзе и др., 1986).

С помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы суспензии хлоропластов, разрушенных осмотическим шоком, получили фракцию грубых мембран хлоропластов, располагающихся на границе слоев 1,0 и 1,5 и сахарозы. В этой фракции нашли большую часть активности 1-ой формы ^ -глюкоэидазы.

Обработка связанной с мембранами хлоропластов 1-ой формы / -глюкоэидазы ацетоном и детергентом вызывает полную со та били-зацию фермента,тогда как в диоскорео дельтовидной обработка мембран этими ке детергентами влечет за собой полцу'ю инактивиза-цию олигр^роетянэзидспэцифичдай А -глюкозидазы.

Распределение активности 1-ой формы у#-глюкозидазн в субклеточных фракциях листьев юкки славной (Субстрат - сумма олигофуростанозидов из листьев юкки славной)

уракция ОбциЯ белок, мг Активность фермента % от общей ак-тивност;

Общая х/ Удельная хх/

Дифференциальное центрифугирование

¡¡сходный экстракт 98,8 45600 461,5 100

Хлоролласгняя фракция (осадок 50006 ) 10,7 4710,7 440,2 10,3

.Читохоилпилльная фракция (осадок 15000 й) 3,2 1753 547,6 3,8

Гйжпосоиальная фракция (осадок 105000к ) В,2 300 36,5 0,6

Растворимые белки (кадосадо'шая жидкость от центрифугирования 105000 с) 61 35000 573,7 76,7

Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы

Исходный раствор 100 45800 453,0 100

Хлоропласта 12,8 <1860 379,6 10,6

Грубые мембраны хлоронластов 3.4; 4720 1388,2 10,3

Тонкие мембраны хлоролластов и .18,3 16,6 0,04

Растворимые белки хлолопластов 7,0 0 0 0

х/ Общая активность в нмолях за Гмин, хх/ Удельная активность в нмолях на I мг белка за I мин.

Примечание: 0 - активность не обнаружена.

Приведенное выше данные свидетельствуют о том, что в юкке славной фермент локализован в мезо^чльной ткани листа, а субстрат фермента накапливается в клетках эпидермиса. Этот факт указывает на разную комлартментацию олигофуростанозидов и расщзпляю-щей их -глюкозидазы в листьях юкки славной.

Обоо'щая приведенные экспериментальное данные,можно заключить, что в мезофильной части юкки славной биосинтезируются стероидные глккозиды, которые быстро переходят в эпидермальный слой; тем самым обеспечивается сохранность фуростаноловой структуры, что необходимо для их дальнейшего транспорта в различных оргашх растения. При необходимости под действием фермента р-т^гло-зидазы указанные вещества превращаются в олигоспиростакочиды, обладающие значительной фунгицидной и антибактериальной активностью. Последняя способствует защите растений от неблагоприятных влияний внешней среды (промерзание, повыпеннчя влажность, водный дефицит), от поражения фитопатогениыми микроорганизмами.

Динамика активности ^ -глюкозидазы и накопления олигофуростанозидов в листьях юкки славной в течение периода вегетации

Во время вегетационного периода удельная активность 1-ой формы -глюкозидазы в листьях юкки славной подвергается значительным изменениям (рис. 2). В листьях верхнего и нижнего яруса активность 1-ой формы -глюкозидазы с мая до августа увеличивается несколько раз, а в листьях среднего яруса - резко повивается. С сентября активность фермента уменьшается и в периоде зимнего покоя практически не отмечается.

Сведения, полученные нами о динамике активности у^-глюко-зидазы в листьях юкки славной в течение периода вегетации, имеют важное значение для сбора и проведения ферментации сырья с целью

Рис.2. Динамика ахтивнос-• ти 1-ой формы ^-глюкоэидазы в листьях юкки славной в периоде вегетации растения.

1. верхний ярус;

2. средний ярус;

3. шшшй ярус.

повышения выхода тигогеиина.

Изучение динамики накопления тигогенина в листьях юкки славной (Пхеидзе и др., 15*76) показало следующую картину: минимальное содержание тиогенима отмечено зимой, с наступлением весеннего периода его количество значительно повышается и достигает максимума в иоле-сентябре, а с октября до декабря вновь уменьшается. Эти данные согласуются с нашими результатами: максимальная активность уЗ -глакозидазы наблюдается а иыле--г.пгусте и, по всей вероятности, тогда и происходит активное превращение олигофуросаноэидоп в олигоспиростанозиды (тигогекин является стероидным генином ряди спиростака).

С целью изучения динамики пнопления олигофуростакозмдов в листьях юкки славной вцаеляли их сумму методом Гуриелидзе и др. (1936). При атом показано, что содержание олиго&'ростано-зидов в листьях интактного растения строго контролируется и в течение года почти не меняется (табл. 3).

Динамика накопления олигофуростанозидов в листьях юкки славной по месяцам

Дата сбора Выход олигофуростанозидов, % от в/с сырья

18.01.90 5,4

22.02.90 5,?

19.03.90 „ 5,3

25.04.90 5,4

21.05.90 6,0

21.06.90 5.3

20.07.90 6,1

23.00.90 5,8

24.09.90 5,5

22.10.90 5,7

20.11.90 5,3

24.12.90 5,2

Выделение, очистка и характеристика -глюкозидазы из листьев пкхи славной

В таблице 4 представлена последовательность выделения И' очистки 1-ой формы р -глюкозидазы из свежих листьев юкки славной.

Бесклеточные экстракты листьев юкки славной катализировали расцепление как олигофуростанозидов, так и синтетического субстрата (4-нитрофенил-уЗ-/)-глюкопиранозид). На первом же этапе фракционирования сульфатом аммония достигалось разделение двух форм -глшозидпзы. 1-ая форма (до 3055 насыщения) расщепляла как олигофуростпнозиды, так и синтетический субстрат, а 2-ая форма (от 30$ до ЗОЯ насыщения сернокислым аммонием) -только синтетический субстрат. По-вид.имоцу, 2-ая форма ^ -глюкозидазы в данном растении участвует в гидролизе гликозидов нес-

Очистка 1-ой формы уЗ-глюкоэидазы листьев юкки славной

Стадия очистки

Общий Общая ак- Удельная Степень

белок, тивность актив- • очистки

мг ность

xx/

Выход фермента,./«

Исходный ферментный раствор

30$~ное фракционирование

диализ

Хроматография на ДЭАЭ.-целлшозе

1230 285216,5 55 200210

13 I80I20

231,8 I 100 3620 15 70

I3C55 60 63

х/ Общая активность в Нмолях за I мин.

хх/ Удельная активность в Нмолях на I мг белка за I шн.

тероидного происхождения, поэтому очистку этой формы не .проводили, а выделяли 1-ую форму,непосредственно участвующею в расцеплении фуростаноловых г: жозидов.

1-ая форт уй-глюкозидазы с колонки ДЭАЭ-целлюлозы элюиро-валась 0,2 М хлоридом натрия. Фермент был очищен в 60 раз по сравнению с исходным ферментным раствором (табл. 4). Выход 1-ой формы уЗ-глюкозидазы с колоти ДЭАЭ-целлюлозы составляет 63$ ст исходного ферментного раствора.

Все операции проводили при температуре 4°.

При гель-фильтрации с колоши с сефадексом G- 200 были получены две формы ji> -глюкозидазы с молекулярной массой 32000 и 68000. Пзрвая (мол.масса 32000) форыа расщепляла как олигофу-ростанозиды, тан и синтетический субстрат, а вторая форма (кол. масса £8000) гидролизовала только синтетический субстрат. При очистке молекулярная масса 1-ой формы /?-глакоаидазы не моги-

Ц|—^

У

Рис.3. Профиль элюции с колоши сефадекса й -2С0 р-глюкозида-зы листьев юкки славной.

Молекулярные массы: 320СО (I); 68000 (2).

■'■р мл

лась.

0 пределе (гае оптимума р!{ для обеих форм глюкогидролаэ из листьев юкки славной не выявило разницу между ними. Оба фермента проявляют максимальную активность при значении рН 6,3 <ркс. 4). В процессе очистки оптимум рН для 1-ой формы уЗ-пго-козидазы не изменялся.

Изучении влияния температуры на скорость.гликогддролазной реакции показало, что максимальная активность о беж форм Р-глокозидазы наблюдается при 37°,и они не отличаются сколько-нибудь выраленноЯ термостабилькостью.

Линейная зависимость скорости гликогидротзной реакции от времени инкубации наблюдается э течение 5 ми!гут в случае природных' субстратов и 45 мин. - синтетического. В связи с этим, при анализе расщепления природных субстратов фермент инкубировали в продолжении 5 мин, а в случае синтетического - 45 мин. Увеличение активности уЗ-глшоэидазы пропорционально количест-

/Й7 V.

1

•4»

4

(0

1,0

г»

Рис.4.' Влияние рН

а активность частично очищенной 1-ой формы уЗ-глш-козидазы.

(1) - дельто-зид;

(2) - 4-нитро-фенил-уЗ -£>--глюкогшрано-зид.

ву белка до концентрации 0,5 мг/мл. фи последующем повышении концентрации ее активность постепенно уыеньшаэтся.

С целью изучения субстратной, специфичности частично очищенной 1-ой формы уЗ-гликозидазы использовали как синтетический, так и некоторые природные субстраты (олигофуростаночиды), отличающиеся друг от друга строением агликона и олигосахаридной части при С-3 стероидного ядра. Показано (рис. 5), что кинетика гликогидролазной реакции подчиняется уравнению Ь!ихаелиса-А5ентен, что особенно отчетливо видно при представлении данных в двойных обратных координатах. Определение величины кш частично очищенной р -глюкозидазы для отдельных олигофуростанозидов, биосин-тезируицихся в различных растениях, покарало почти полное их совпадение,тогда как кт по отношению к синтетическом!' субстрату сильно отличается от них (табл. 5). Сродство 1-ой формы уЗ -гликозидазы к природному субстрату выие, чем к синтетическому и не зависит от строения олигосахаридного фрагмента, присоединенного к С-3 стероидного ядра, а такжз от строения аглл-кона.

тгу

- XI -

Я в!

I г

ТО"'

0,05

fl.il

А

I г

3 2 1

/¿и

/ <*■

с,3

р,6 '

Рис.5. Зависимость активности частично очтцоккой формы уЗ -глюкозидазм от концентрации субстратов.

(1) - сумма олигофуростаноэидов листьев юкки

славной;

(2) - дельтозид;

(3) - капсикоэид;

(4) - 4-нитрофенкл--уЗ -I) -глхжопиранозид.

Субстратная специфичность 1-ой формы Р -глюкозидазы листьев вкки славной

Субстрат кш ыМ v, (Мггл'оль на I мг белка за I мчн)

Сумма олигофуростанозидов листьев юкки славной 7 390

Дельтозид 7,6 396

Суша олигофуростанозидов соцветия лука краснеющего 7,9 384

протод! ^сцин 7,8 384

Цротодельтофолин 7,8 384

Томатсзиц 7,7 390

Капсико.чид 8,0 3/8

Излангозид 8,2 372

4-штрофенил~/? -[) -глыкопира-нозид 18,3 3

Величина кш д^я 2-ой формы -глюкозидазы в отношении 4-нитрофенил-^ -_£>-глюкопиранозида оказалась равной 25 мы.

Сравнение ингибирующего действия некоторых соединений на активность 1-ой формы уЗ -глюкозидазы лип- >ев юкки славной показало, что специфичным ингибитором для данного фермента является глюконо-1,6-лактон. Шследний в концентрации 20 мм почти полностью подавлял активность фермента, ]) -глюкоза, ЭДТА, галактоно-1,4~лактон и п-хлормеркурибензоат не ичгибировали зго активность. Избыток субстрата не подавлял активность у^-глюко-зидазы листьев юкки славной.

Влияние аутоферментации на выход тигогенина из листьев юкки славкой

С целью пов. л»»ния выхода тигогенина из листьев юкки слав-кгл нами проведена ау/оферментацяя цельного и измельченного сырья термостатированном при различной температуре (от 25° до 70°). В качестве контроля использовали заранее фиксированное остр» паром и высушенное при 37° сырье.

Как видно иэ таблицы б, содержание тигогенина б цельных и измельченных; листьях одинаково меняется в зависимости от температурных условий, однако, измельчение приводит к снижению выхода тигогеь..на.

Таблица 6

Содержание тигогенина в листьях юкки славной после аутоферментации (в % от в/с сырья)

Сырье Условия аутоферментации Контроль

25° 37° 50° 60° 70°

Цельные мгстья Измельченные листья 1,6 2,2 0,8 0,72 0,95 1,75 0,55 0,60 0.57 0,50 0,5 0,45

Наилучшие результаты получены во вреоя сушки при 37°. Дальнейшим повышением температуры в обоих случаях постепенно сшкается еыход тигогенина.

Реэулътатч эти согласуются с получениями нами данными при изучении свойгув эндогенно Я ^ -глюкозидазы юкки славной, когда было показано, что катализирующее превращение олигофуроста-нозидов в ояигоспиростанозиды оптимальное при температуре 37°. Уменьшекна гвхода тигогенина повышением температуры указывает на постепенную инактивацию фермента; а предварительная фиксация

свежих листьев острым паром вызывает полную инактивацию уЗ-глю-козидаэи, чем и можно объяснить наименьший выход генина из контрольных образцов.

Уменьшение выхода тигогешна измельчением свенесобранного сырья, па всей вероятности, объясняется следующим: на начальной стадии сушки цельных листьев продолжается биосинтез фуростано-ловых гликозидов из накопленных предшественников и в какой-то мере повышается количество олигофуросташзидов, а.с другой стороны, эндогенная уВ-глюкозидаза из-за разрушения клеточных структур (обусловленного высушиванием) приходит в контакт с фуростаноло-вкмк гликозндами и катализирует отщепление глюкозы от С-26 атома, с последующим образованием сгюрокетальной группы. Во время измальченз!я сырья, вероятно, происходит так называемое "рассеяние" ферментов и их субстратов, что приводит к подавлении биосинтеза олигофуростанозидов и гликогидролазной реакции.

Шлученные результаты должны иметь большое значение для оптимизации технологии производства тигогенина(являющегося спиростаноловым агликоном), так как предварительная аутофермен-тация растительного сырья повлечет за собой повышение выхода тигогенина.

Таким образсм, для промышленных целей листья юкки славной следует собирать во время максимальной активности уЗ-глюкози-дазы - в июле-в августе и проводить аутоферментацию цельных листьев при 37°.

ВЫВОДЫ

I. В листьях ккки славной обнаружены две формы уЗ-глако-зидазы: 1-ая форма, с молекулярной массой 32000, катализирует превращение олигофуростанозидов в олигоспиростенозиды и расщеп-

ляет синтетический субстрат 4-1штрофенил-у2-^_гдажо11ИР'=>шз11Д; 2-ал - с молекулярной массой 68000, гидролизует только синтетический субстрат. Изучены некоторые их физико-химические свойства.

2. Максимальная ферментативная активность J] -глюкозидазы юкки славной наблюдается в июле-августе. Накопление олигофуросга-иозидов в листьях интактного растения строго контролируется и примерно одинаково в продолжении.целого года.

3. Разр-зботан простой способ выделения суммы олигофуростанозидов из эпидермального слоя листьез гжк-i славной.

4. Установлена локализация олигофуростанозидов в эпидер-мяльный слой листа в нескольких расположенных рядом клетках, а расцепляющей их ji -глкзкозидазы в мезофильноЯ ткани, что указе-рает на разную компартментацию фермента и субстрата.

5. 3 результате изучения субстр?.. v.o'A специфичности 1-ой |£ормы jí-глскозидазы по отношению к природным стероидным глико-эидам оказалось, что сродство форманта к природным субстратам

но зависит от строения агликона и олигосахаридной части,присоединенного при С-3 стероидного ядра.

6. Показана возможность значительного повышения выхода тигогенина из листьев юкки славной при аутоферментации сырья и подобраны оптимальные условия для его производства.

Список публикаций по теме диссертации

I. Oioryadze Та.А., КопкзгкеШяе Е.Р. , Akhvledinnt K.Sh., Gurie-lidze K.Q. GlucohycU-olaeoo frora Yucca gloriosa leovea. - Procedí П£я of Fifth Int. Conference on Chemiotry and Biotechnology of BioloitlcFilly Active Uaturnl Products, Varna, Bulgarin, 11)69, v. 1, p. 499-501.

2. Гиоргадзе Ц.А., ГУркелидэе К.Г. Выделе№'о фуростаноловых глгасозидов из эпидермиса листьев Хиос« е1ог!оеа ь. -

- Сообщ. АН Грузии, 1931, т.Ш, Р I, с. 81-6...

3. Гиоргадзе Ц.А., Г^ряелидзе К.Г., Кемертелидзе Э.П., ГЬсеид-зе Т.А. Некоторые свойства глвкогидролаз из листьев Уисоа й1ог1ог1а , катализирующих раещеплсниз одигофуростанози-дов. - Сообщ. АН Грузии, 1991, т. 144, $ 3, с. 425-428.

4. Гуриелидзе К. Г., Гиоргадзе Ц.А., Кемертелидзе Э.П., Пруидзе Г.Н. Локализация олигофуростанозидов к расщепляющего их фермента в листьях юкки славной - Физиология растений. 1992, т.39, был.Э, с. 501-506.

ф/'

бГ/йоео ¿owtocivm ¿hoco ccciï&Ô&D

rmd pwoöoeob шсоето комгжжь&жгорош

PôLCCb C'dMOjCnC'JöOCO ôCVjnMPWOôSà

¿ a б " 7.3 s о J is «

®0<J00n,i ßorti>ör> JOO

^л^.ЭдоеодЛоаостй ЬфйЗ&л етаирлОл 3ß00i/0 атйэ^^о"'1 1

•ч