Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности Yucca torreyi Shafer.: размножение растений и получение стероидных гликозидов in situ и in vitro

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности Yucca torreyi Shafer.: размножение растений и получение стероидных гликозидов in situ и in vitro"

Украинская Академия Аграрных Наук Государственный Никитский ботанический сад

0 г ~ ОД

1

IС ЦП«.

Карпов Павел Андреевич

УДК 582.572.228: 581.16: 573.6: 581.19

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ Yucca torreyiSHAFER.: РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ П ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ in situ И in vitro

03.00.биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ялта - 2000

Диссертация является рукописью

Работа выполнена в отделе экспериментальной биологии Государственного Никитского ботанического сада УААН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, член-корр. УААН, Лищук Адольф Иванович Государственный Никитский ботаничесю сад УААН, заведующий отделом

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, член-кор. HAH Украины Блюм Ярослав Борисович, Институт клеточной биологии и генетической инженерии HAH Украины, заведующий лабораторией.

доктор биологических наук, Бугара Александр Михайлович, Институт эфиромасличных и лекарственных растений УААН, заведующий лабораторией

Ведущее учреждение Институт молекулярной биологии и

генетики HAH Украины

Защита состоится 26 мая 2000 г. в 13:00 часов на заседа! специализированного ученого совета Д 53.369.01 при Государствен^ Никитском ботаническом саде УААН по адресу: 98648, Крым, г. Ял Государственный Никитский ботанический сад УААН. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиот Государственного Никитского ботанического сада УААН по адресу: 98648, Крым, г. Ялта, Государственный Никитский ботанический i УААН.

E-mail: flora@gnbs.crimea.ua

Автореферат разослан " Z1 " Лп^сиМ 2000г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета,

кандидат биологических наук С.Е. Садогура

р М 6- У^кй.р

<//?• JL, 0.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Представители рода Yucca L. издревле находили ирокое хозяйственное применение, а во второй половине XX века стали стивно использоваться, как ценные источники стероидных гликозидов. ?ruse et al., 1973) Согласно литературным данным, стероидные гликозиды "Г) исследованы у 16 представителей рода.

По последним данным род Yucca L. насчитывает 42 вида, 12 из эторых представлены в Арборетуме ГНБС. Среди них Y.torreyi Shafer. 5ляется наиболее крупной и высокодекоративной.

Yucca torreyi Shafer. (син. Y. macrocarpa Engelm.) - небольшое дерево, роизрастающее только на юго-западе Техаса, значительно юго-восточнее ью-Мехико, с ареалом простирающимся в глубь Мексики.

На юге Украины юкки широко используются в декоративном щоводстве, однако внедрение Y. torreyi как декоративного и дарственного растения сдерживается из-за отсутствия опылителя pegeticula yuccasellä), что затрудняет получение семян. Традиционные тособы вегетативного размножения малоэффективны и не применимы к зким крупным видам как Y. torreyi. (Голубев и др., 1973)

Достижения последних лет в области культуры органов и тканей родемонстрировали огромную возможность клеточных технологий как в азмножении ценных генотипов, так и в получении биологически кгивных веществ. (Носов, 1992; Бутенко, 1999) Методы клонального икроразмножения были разработаны для Y. elephantipes Regel. (Pierik, et I., 1983) и Y. schidigera (Kaneda et al., 1987). Данные об использовании иотехнологических методов в размножении и получении стероидных иикозидов Y. torreyi в литературе отсутствуют.

Связь работы с научными программами, планами, темами, [сследования выполнялись в отделе экспериментальной биологии Ъсударственного Никитского ботанического сада HAH Украины, в ериод с 1997 по 1999гг. в соответствии с разделом тематического плана к 0197U004314 - "Изучить физиолого-биохимические основы адаптации лодовых и декоративных культур с целью оптимизации продукционного роцесса и разработки теоретических аспектов селекции экологически стойчивых форм", а также планом аспирантской подготовки.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось зучение биологических и биохимических особенностей растений Y. torreyi нтродуцированных в Никитский ботанический сад, возможности их еменного и клонального микроразмножения, а также определение пособностей растений различного возраста, культуры клеток и тканей in Uro синтезировать стероидные гликозиды. В ходе работы необходимо ¡ыло решить следующие задачи:

1зучить морфобиологические и биометрические особенности плодов и гмян Y.torreyi, полученных при искусственном опылении в условиях ин-

тродукции на Южном Берегу Крыма, и выявить взаимосвязь с развитие; проростков in vivo и in vitro.

2. Подобрать оптимальные условия для индукции адвентивного побе гообразования in vitro в культуре эпикотиля Y.torreyi. Разработать спосо1 микроразмножения растений в условиях in vitro.

3. Индуцировать каллусообразование из различных эксплантов Yuca torreyi и выявить способность каллуса синтезировать стероидные гликози ды; установить взаимосвязь их синтеза с гистогенезом и морфогенезом.

4. Отобрать каллус, обладающий способностью синтезировать СГ npi отсутствии выраженных признаков гистогенеза и морфогенеза, и провеет] его цитоморфометрический анализ.

5. Определить место первичного синтеза СГ в культуре изолирован ных органов и тканей in vitro.

6. Провести методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) сравни тельное изучение содержания СГ в вегетативных и репродуктивных орга нах и тканях растений Y.torreyi, способных и не способных завязыват полноценные плоды и семена при искусственном опылении в условиях ин тродукции на ЮБК, а также в ювенильных растениях различного возрас та.

Научная новизна работы. Впервые определены корреляции межд; морфометрическими характеристиками семян и плодов, полученных npi искусственном опылении. В процессе изучения потенциальных возможно стей семенного размножения Y.torreyi установлена взаимосвязь морфоло гических и весовых характеристик семян с их всхожестью. Показана зави симость всхожести семян Y.torreyi in vivo и in vitro с их выполненностью сроками и условиями хранения. Определены стадии развития проростко Y.torreyi и их продолжительность в условиях in situ и in vitro. Исследован способность каллуса различного происхождения синтезировать стероид ные гликозиды. Выявлена взаимосвязь начала синтеза СГ в культурах кал луса с гистогенезом и морфогенезом. Получен каллус Y.torreyi, синтези рующий СГ при отсутствии признаков гистогенеза, и проведен его цито морфометрический анализ. Впервые определены три пути индукции обра зования адвентивных побегов Y.torreyi, и разработаны два способа полу чения растений в условиях in vitro. Обнаружены СГ в вегетативных и ре продуктивных органах в условиях in situ. Отмечено их максимальное со держание в семенах и установлена химическая структура преобладающей гликозида.

Практическое значение полученных результатов. Данные, получен ные в результате морфологического и морфометрического анализа плодо: и семян Y.torreyi, имеют значение при отборе посевного материала. Уста новлено, что семена Y.torreyi, находящиеся в плодах, сохраняют всхожест] более длительное время, чем изолированные семена в бумажных пакетах.

Разработаны три пути индукции адвентивного побегообразовани Y.torreyi, позволяющие за один цикл культивирования (1-2месяца)получат от материнского побега 7 дочерних. Определены питательная среда дл укоренения микропобегов и условия адаптации in vivo растений, получег

.ix in vitro. Применение способа клонального микроразмножения дает 1Сокий выход растений по сравнению с традиционными способами менного и вегетативного размножения Y.torreyi, имеющей ярко сраженное апикальное доминирование.

Проведенные исследования по анализу СГ в органах и тканях [стений Y torreyi являются основой для дальнейших более глубоких [мических и фармакологических исследований, а выявленные кономерности синтеза СГ в культурах изолированных органов и тканей ляются основой для разработки модели производства СГ ютехнологическими методами.

Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном сборе 1Стительного материала, постановке экспериментов и обработке щученных данных, анализе литературы, подготовке и написании |учных статей, оформлении диссертационной работы. Совместно с |учным руководителем произведены выбор объектов исследований, воение методик и разработка структуры диссертационной работы.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации жладывались на международных конференциях: на сессии совета зтанических садов Украины "Ботанические сады - центры сохранения юлогического разнообразия мировой флоры" (Ялта, 1995); конференции ран СНГ "Интродукция лекарственных нетрадиционных культур" 'рым, Алушта, 1995); 20М международном симпозиуме посвященном 200-тию дендрологического парка «Софиевка» "Старинные парки и юблемы их сохранения" (Умань, 1996); "Четверта м1жнародна шференшя з медично? ботанжи" (Кшв,1997); на VII Международной >нференции "In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm eservation" (Москва, 1997); "II International Symposium on Plant Biotec->logy" (Kyiv, 1998); "Интродукция растений и отдаленная гибридизация" Москва, 1998); 7th International Meeting of Young Scientists in Horticulture .ednice, Czech Republic, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 -атьи в специализированных научных изданиях и 8 - материалы и тезисы 1учных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 13делов, выводов и перечня цитируемой литературы, который включает \1 источников, в том числе 162 зарубежных авторов. Работа изложена на г3 страницах машинописного текста и содержит 58 рисунков, 28 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Проведен анализ данных, опубликованных в отечественной и рубежной литературе по биологии представителей р.Yucca L., биологии с семенного размножения in vivo, in situ, и in vitro, а также литературы, освященной клональному микроразмножению представителей Yucca sp. in tro. Проработана литература, посвященная изучению стероидных глико-

зидов представителей p. Yucca L. в условиях in vivo и in vitro и хозяйствен ному применению юкк. Проведен анализ литературы, посвященной про ir. водству стероидных гликозидов методами современной биотехнологии.

РАЗДЕЛ 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

В качестве объектов исследования были использованы органы и ткг ни растений Yucca torreyi Shafer., растущие в арборетуме ГНБС были ра: делены на способные завязывать плоды и давать полноценные семена, и способные завязывать плоды и семена, а также ювенильные растения ра: личного возраста.

2.2. Материалы и методы исследований

При проведении исследований и постановке опытов придерживалис методов, принятых в биотехнологии, биохимии, ботанике. Семена У. toi reyi были получены при искусственном опылении (гейтоногении) с учето] рекомендаций Ф.Н. Русанова (1959), В.Н. Голубева и др. (1973), А.П. Мак симова и др., (1989).

Определение СГ проводили методом ТСХ на пластинах Silufol U\ 254, Silufol UV-366 (фирма "Kavaler", Чехия) в системе п-бутанол : этанол аммиак (7:2:5) согласно общепринятой методике (Кинтя и др., 1979, 198' Зурабян, 1989; Hostettman & Marston, 1995). В качестве проявителей ис пользовали фосфорно-вольфрамовую кислоту и реактив Эрлиха. Анали структуры преобладающего гликозида семян проводился с привлечение! ЯМР- и 13С-спектроскопий. .

Гистохимическое определение СГ проводили на свежем материал (Brunarska et al., 1978; Гуриелидзе и др., 1992) с помощью реактивов Сань (Sannie et al., 1975) на олигоспиростанозиды (ССГ). Эрлиха (Kiyosawa « al., 1968) на олигофуростанозиды (ФСГ) и Лафона (Brunarska et al.,197£ на общие сапонины. Создание библиотеки цифровых изображений хрома тограмм и оттисков срезов листьев выполняли методом компьютерног сканирования с применением сканеров PRIMAX Colorado 600р PRIMAX Colorado C4800 при оптическом разрешении 400 dpi с примене нием интерполяризации.

Приготовление временных препаратов и цитометрические исследовг ния проводились по общепринятой методике (Паушева, 1980).

При получении асептической культуры, органов, тканей растени Y.torreyi, придерживались как принятых в биотехнологии мете дов(Бутенко, 1964, 1999; Здруйковской-Рихтер, 1974; Калинин и др., 198( 1992; Катаева, Бутенко, 1983; George et al., 1987; Dixon & Gonzales, 199' Gamborg & Phillips, 1995), так и методов, разработанных в отделах экспе риментальной биологии и биотехнологии ГНБС. В качестве первичны эксплантов были использованы семена местной репродукции и изолиро ванные из них зиготические зародыши.

Асептическую работу проводили в ламинар-боксе БП-4-004. Культи вирование in vitro осуществлялось на модифицированных питательны

едах МС (Murashige & Skoog, 1962) и QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), a кже на средах, содержащих полную и половинную концентрации макро-микросолей.

Экспланты культивировали в колбах Эрленмейера объемом 300мл ермания), на СУВРе, при 24-28°С и 16-часовом фотопериоде. Освещение уществляли с помощью люмшшсцентных ламп ЛФР-150. гриодичность субкультивирования составляла 2-3 месяца.

Для исследования процессов морфогенеза в питательные среды одили фитогормоны: БАП, ИУК, ИМК, НУК, 2,4-Д. При проведении 1ытов по индукции закладки адвентивных почек, эпикотили проростков, щученных в асептических условиях на среде МС (1962), не содержащей ггогормоны, помещали на агаризованные среды МС и QL, содержащие пличные концентрации и соотношения НУК (0; 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3.0; 10,0 7л) и 6-БАП (0; 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3.0; 10,0 мг/л).

Статистическую обработку данных проводили с помощью юграммы STA TJSTICA for Windows 5.1С, Copyright© StatSoft, Inc. 1984-•96 (WEB:http:/vvww.statsoftinc.com) Корреляционные зависимости 1енивались на основании линейного коэффициента корреляции по ирсону (г) (Лакин, 1973).

РАЗДЕЛ 3. БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛОДОВ, ЕМЯН И ПРОРОСТКОВ Yucca torreyi Shafer. В СВЯЗИ С СЕМЕННЫМ РАЗМНОЖЕНИЕМ В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ

3.1. Бноморфометрическне характеристики плодов и семян Y. torreyi

В ходе проводившихся исследований плоды и семена были получены эи искусственном опылении путем гейтоногении в 1994, 1996 и 1997 го-

IX.

3.1.1. Коррелятивные связи биометрических параметров плодов

Длина и диаметр плодов варьировали от 4,5см до 10см и от 1,8см до :м соответственно. При этом масса плодов составляла от 6,12г до 20,07г зависела от количества семян, которое вариировало от 9шт до 59шт. ри вычислении коррелятивных связей между такими биометрическими араметрами плодов как масса, длина и ширина обнаружена положитель-ая связь, что подтверждается значениями и величинами коэффициентов эрреляций. Для массы и длины плодов r=0,99, а для массы и диаметра подов г=0,91. Таким образом, масса плода находится в выраженной пря-ой коррелятивной связи с его линейными размерами, которые также по-эжительно коррелируют между собой (г=0,90).

3.12 Бноморфометрическне свойства семян Y.torreyi и их взаимосвязь бноморфометрическимн показателями плодов и всхожестью

Для Y.torreyi характерны крупные, черные семена. Вес 1000 семян чсса torreyi составлял 147,6г.

Весовые характеристики семян варьировали в разные годы (Табл.1). Их асса укладывалась в нормальное распределение. Анализ весовых биометри-еских показателей плодов и семян из них (Табл.2) выявил корреля-

корреляционную зависимость между параметрами плода и показателями семян, и их связь с всхожестью (Табл.3).

Таблица 1 - Весовые характеристики семян трех урожаев

Год п Общий вес mid min шах Масса семен!

(шт.) (мг) (мг) (мг) (мг) (мг)

1994 132 20961 158,80 63 212 137.5+74.5

1996 283 45952 162,38 64 275 169.0+105.

1997 404 54022 111,5 22 201 111.5+89.5

Таблица 2 - Весовые биометрические показатели плодов и

Плоды Семена

} m L 0 полноценные суммарный вес полноценных — шах min

(» (см) (см) семена (шт.) семян (мг) х ±sx (мг) (МГ)

19,3 9,5 2,8 56 8149 101 +79 180 22

20,07 10,0 3,0 59 7872 110,5 + 66,5 177 44

15,06 8,0 2,8 44 6150 135,5 + 65,5 201 70

10,66 6,5 2,6 37 4817 110 + 75 185 35

9,6 6,0 2,5 28 2822 90,5 + 47,5 138 43

9,47 5,2 2,5 39 5348 109,5 + 68,5 178 41

6.95 5,0 2,0 18 2802 119,5 + 65,3 185 54

6,12 4,5 1,8 17 2018 123,5 + 25,5 149 98

6,99 5,0 2,0 30 3869 107,5 + 60,5 168 47

) 6,85 4,5 2,0 9 1173 129,5 + 25,5 155 104

Таблица 3 - Значения коэффициентов корреляции (г) биометрических

Семена

п суммарный вес выполненных семян х ±sx max mir

Вес плода 0,92 0,92 -0,91 0,46 -0,5

Длина плода 0,91 0,91 -0,92 0,45 -0,5

Диаметр плода 0,91 0,87 -0,92 0,48 -0,6

С увеличением в плоде Y.torreyi числа семян, происходит параллельное увеличение их массы, хотя последний показатель заметнс отстает (г=0,22). В свою очередь, количество выполненых семян четкс положительно коррелировало с числом взошедших семян (г=0,99) Выраженая положительная корреляция также обнаружена между весо\ семян и их всхожестью (г=0,89). На основании выявленные корреляционных связей установлено, что при максимальном завязыванш семян в плоде Y.torreyi их посевные качества снижаются, и лучшим! являются семена из плодов, выполненных не более чем на 70-80 % Вероятно, это связано с тем, что в природе 20-40 % развивающихся семя! поедаются гусеницами опылителя, вследствие чего происходит разгрузк; плода и перераспределение питательных веществ.

РАЗДЕЛ 4. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ Yucca torreyi В УСЛОВИЯХ IN VITRO В СВЯЗИ С МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕМ

3.1.3, Морфология проростков Y.torreyi in vivo и in vitro

Всхожесть свежесобранных семян составляла 95-98%. При хранении их умажных пакетах она быстро падала и к концу второго года практически »ачивалась. Однако при сохранении семян внутри плодов всхожесть со-вила 70-80%. (Рис.1)

В процессе изучения развития проростков на ранних этапах онтогенеза свежесобранных морфологически выполненных семян в условиях in vivo i vitro, было выявлено 7 стадий (I, II, III, ..., VII), причем, продолжитель-ггь соответствующих стадий в условиях in vitro была выше, чем in vivo ic.2).

Показано, что тичество взо-цших семян в ювиях in vivo ггавило 89-95%. нако, при вве-ши в культуру vitro изолиро-1ных зиготиче-IX зародышей печали их более ужную, 100% -ю всхожесть.

S щ

fe pi ш

te

"fi M! ш

12 24

Сроки хранения семян (месяцы)

Рис. 1. Влияние сроков хранения на всхожесть семян ¥Логгеу1

1-всхожесть семян, хранившихся в бумажных пакетах;

2-всхожесть семян, хранившихся в плодах

I

II

II

IV

VI

VII

lit vivo

26+14

,5±0,5

1,510.5

US ±0,5

2,5 + 0,5

2,5 ± 1,5

4 ± 2

in vitro

74±64|2,5±0,5l 412 I 4±2 |3,5±1.5| 5±3

7 + 4

УВР:

r22°C

гвешенне: i-часовой этопернод, ампы -ЛФР150 ЮВт

убстрат in vivo: довая земля: >рф: песок :1:1)

убстрат in vitro: аризованная »гормональная >еда MC

Jsi

1см

1. семя;

2. корень проростка;

3. зона всасывания;

4. связник;

5. придаточные корни;

6. первый лист проростка;

7. второй лист проростка

fue. 2. Продолжительность (сутки) стадий развития проростков Y.torreyi

in vivo и in vitro

Клональное микроразмножение юкк in vitro является перспективным методом размножения наряду с традиционным семенным. Нами были определены три пути индукции образования адвентивных почек с использованием модифицированных в отделе Экспериментальной биологии сред МС и QL, содержащих 6-БАП, ИМК и НУК (Рис.3).

Рис. 3. Пути клонального микроразмножении Y.torreyi in vitro

1- изолированное ссмя; 2 - изолированный зародыш; 3- культивирование изолированных зародышей на среде QL + 2мг/л БАП + 0,4мг/л ИМК; 4- образование адвентивных побегов на среде QL + 2мг/л БАП + 0,4мг/л ИМК; 5- активное образование адвентивных побегов нг среде QL + 2мг/л БАП + 0,4мг/л НУК; 6- культивирование изолированных зародышей на среде QL + 2мг/л БАП + 0,4мг/л НУК; 7- образование адвентивных побегов на среде QL-+ 2мг/л БАП + 0,4мг/л НУК; 8- Укоренение микрочеренков на среде МС + 0,1 мг/л НУК; 9-культивирование изолированных зародышей на среде МС без фитогормонов; 10- молоды« растения на безгормональной среде МС; 11- образование придаточных побегов на среде МС + 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК; 12- адаптация корнесобственных растений in vivo.

Лучшая закладка адвентивных почек (в среднем 1:8) происходила при последовательном культивировании эпикотилей и микропобегов полученных в результате развития зиготических зародышей на питательных средах: QL, дополненной 2 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИМК и QL содержащей 2 мг/л БАП и 0,4 мг/л НУК. Активный ризогенез отмечали нг среде МС с 0,1 мг/л НУК. Приживаемость растений достигала 80-95% npi пикировке регенерантов в почву, взятую с плато Ай Петри. (Табл.4, 5,6)

Таблица 4 - Эффективность адвентивного побегообразования

Способ Количество адвентивных побегов

[икроразмножения min max S + x

I 1 6 3,5 ±2,5

II 2 14 8 + 6

III 2 10 6 + 4

блица 5 - Индукция развития почек и образования побегов ЕЛмтеу/ при

Способ Число почек (%) Число побегов/ Интенсивность

□размножения развивающим образующих адвенгнвные побеги эксплант (шт.) пролиферации*

I 75 ±25 41 ±25 3,5+2,5 _

II 42,85 ±7.15 85.7 ± 14,3 8±6 +

III 35 ± 15 55 ±5 б±4 +

♦Примечание: + активная, ± средняя, - низкая 1 блица 6 - Основные характеристики растений УЛоггеуг, полученных из

:об микро-лножеиия Средняя длина главного корня (см) Высота надземной части растения (см) Среднее количество листьев (шт.) Окраска листьев

I 10±3 7,5±3 3±1 зеленая

II 11,5±4,5 12±6 3,5±1,5 светло-зеленая

III 9,75±2,25 9,5±2,5 3,5±1,5 светло-зеленая

Как показали результаты опытов, потенциальная эффективность мик-эазмножени У. torreyi через индукцию адвентивного побегообразования 'itro, значительно превосходит возможности культуры in vitro изолиро-[ных зиготических зародышей (Табл.7).

Таблица 7 - Сравнительная характеристика результатов

Показатель Тип экспланта

Зиготический Апекс (эпикотиль)

родолжительность начального оста до первого пассажа (мес.) 1-1,5 1-2

йициагг размножения (штУгод) 400* 1,38-10" - 2,1-108

Питательные среды: дуцируюшие развитие 5 укоренения МС, 1/2МС, QL, 1/2QL МС, 1/2МС, QL, 1/2QL QL+гмг/л БАП+0,4мг/л НУК; МС+1мг/л БАП+0,1мг/л НУК МС+0,1мг/л НУК

Количество укоренившихся микропобегов, % 98- 100% 95- 100%

ижнваемость растений в почвен-ых условиях (через 45 суток), % 90 - 95% 80 - 95%

1родолжителыюсть культиви-вания от введешм экспланта до получения регенеранта (мес.) 1 1,5-2

1То соответствует числу семян, получаемых при искуственном опылешш 100 цветков при реальном, в условиях интродукции, 15 % - ном завязывании плодов

При работе с культурой каллуса было обнаружено, Что активное кал-лусообразование происходило на среде МС с 0,5 мг/л БАП и 4 мг/л 2,4-/] (Табл.8). Активный каллусогенез наблюдали из зиготических зародышей средний - из высечек листа, слабый - из высечек Корней. Каллус зародышевого происхождения обладал высоким морфогенетическим потенциалом, реализуемым через геммогенез, ризогенез и эмбриоидогенез. Аналогичные типы морфогенеза о1ыечеНы в каллусе листового происхождения однако способность их к морфогенезу была ниже. Низкий морфогенетичй-ский потенциал отмечали у каллусов корневого происхождения.

Таблица 8 - Индукция каллусообразовяння на модифицированной среде _ МС, содержащей 0,5мг/л БАП и 4мг/л 2,4-Д _

Первичный Число экспланГов (шт.) Цвет Плотность

эксплант всего образующих каллус каллуса каллуса

зародыш 30 27 светло-лимонный плотный

лист* 30 16 белый средней плотности

корень 30 3 белый средней плотности

*-выссчкИ листьев брались из базальной (влагалищной) зоны листа

Первичный каллус без признаков гистогенеза и морфогенеза н< содержал СГ. Синтез СГ приурочен к началу гистогенеза, и очаги синтез; находились вблизи дифференцирующихся проводящих элементов. Пр( этом сами проводящие элементы не содержали сапонины.

РАЗДЕЛ 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ Yucca torrcyi Shafer.

При изучениии способности интактных растений синтезировать CI были исследованы листья, корни, цветки и семена.

Результаты гистохимического анализа СГ в листьях растений Y.torreyi вступивших в репродуктивную фазу, были идентичны для растений, спо собных и не способных завязывать семена, и показали различную локалИ зацию олигоспиростанозидов и олигофуростанозидов в тканях листьев Проводящие элементы ксилемы и механические пучки реакции на сапонИ ны не давали. Интересно то, что наблюдалась некоторая симметрия в по ложении клеток-Вместилищ олигофуростанозидов относительно устьиЧ ного аппарата в эпидермисе листа.

Анализ СГ в листьях растений различного возраста, растущих в услО виях in vivo и in vitro, выявил зависимость накопления СГ от возраста рас тений и зоны лийа. Содержание СГ было выше в базальной части Листье] однолетних растений, растущих in vivo, по сравнению с растениями, рас тущими in vitro.

Сравнительный ТСХ-аНализ олигоспиростанозидов и олигофуроста нозидов растений, вступивших в репродуктивную фазу, способных и Н способных Завязывать полноценнее семена показал различий в хроматй графической подвижности и в числе СГ. При этом общее число обнару женных СГ в листьях растений, способных завязывать семена, составило

¡6 (23 ССГ й 13 ФСГ), а в листьях растений, не способных завязывать сб-iena - 34 (24 ССГ и 10 ФСГ)-

Определение СГ в корнях растйний, йступйвших в репродуктивную фа-у, было затруднено из-за присутствия в ризодерме обильного темнй-ЕраснОго пигмента, препятствующего хроматографированию. Тем не Mitee в них содержалось не менее четырех СГ. Как показали данные гистохимического анализа, содержание ССГ и ФСГ в корнях зависило от возраста растения. Причем, последние были локализованы преимущественно > ЦОЦ и значительно а меньших количествах в клетках первичной коры. 1Г также обнаруживались в корнях растений, растущих in vitro, но отсут-:твовали в культурах корней, индуцированных из изолированных зиготи-(еских зародышей.

В результате определения места первичного синтеза СГ установлено, что >лигофуростанозиды и олигОспиростанйзиды присутствуют в побегах и в сорнях растений растущих in vitro. В культуре адвентивных побегов отмечали юложительную реакцию исключительно на олигофуростгШозиды. Однако в сультуре корней СГ не обнаружены. В индуцированных из каллуса корнях и (мбриоидах, находящихся на ранних стадиях развития, СГ отсутствовали. 1аряду с этим, в регенерирующих из калЛуса почках обнаружены олигофурй-;танозиды (Табл.9). На основании Этого, мы можем утверждать, что в расте-(иях Y.torreyi местом синтеза СГ являются побеги.

Таблица 9 - Присутствие стероидных гликозидов in vitro в морфогбнных

структурах

Морфогенные структуры ОлпГофуростапозпды Олпгоспиростаношды

Побеги (ювннильные растения) да да

Корни (ювинильные растения) да да

Культура пазушных побегов да нет

нет нет

Почки (регенерирующие из каллуса) да нет

Корни (регенерирующие из каллуса) нег нет

ЭмбрИонды (регенерирующие га каллуса) нет нет

;ильн0 различались по составу СГ, причем, наибольшее разнообразие на-Злюдалн в Цветках V порядка. В цветках III порядка, находящихся на стащи рыхлого бутона, и являющихся наиболее готовыми к опылению при-;утствовало 6 СГ. При ТСХ-анализе цветков соответствующих порядков, застений, способных и не способных завязывать семена, различия в составе СГ обнаружены не были. При хроматографировании йытяжек из частей дветкОв, растений, способных и не способных к зайязыванию семян, обнаружено, что количество СГ в соответствующих частях было идентично. Кроматографическая подвижность в случае с частями, ответственными за }ыполнение репродуктивной функции, различалась, а в случае с частями, ¡епосредственно не связанными с репродуктивной функцией, была идентична. Всего по данным ТСХ, из цветков различного порядка выделены не менее 28 индивидуальных соединений.

В результате гистохимической реакции с реактивом Лафона СГ был обнаружены как в перисперме, так и в зародыше семени. ТСХ показал« наличие в семенах 9 СГ - 2 ФСГ и 7 ССГ с преобладанием первого третьего.

Специфические реакции с реактивом Эрлиха и Санье свидетельствую о наличии олигофуростанозидов в зародыше при их практически полно] отсутствии в пересперме. Это подтверждается ТСХ, показавшей присутст виг в зародыше двух олигоспиростанозидов и двух олигофуростанозидо! с преобладанием последних. В то же время в перисперме преобладал олигоспиростанозиды, о чем свидетельствуют данные гистохимического : ТСХ анализов.

СГ семян составляли 20 % от их массы и были представлены преиму щественно производными двух генинов, с преобладанием более полярнс го, который был выделен в чистом виде с 10 %-ным выходом от масс! семени. Он оказался близким по хроматографической подвижности к ти гогенину и смилагенину и более полярным по отношению к гекогенину.

Анализ структуры с привлечением ЯМР и 13С спектроскопии, показах что данный гликозид является 3-о-р-0-глюкопиранозил-(1-»2)-о-Р-0 галактопиранозидом сарсапогенина. (Табл.10, Рис.4)

■К-ЯМР спектр 1(5, м.д., О-ТМС, C5D5N): 5:34 (д, Ji.2=V,8Fh, Н-1 Gal), 4,98 (д, Ji,2=7,5n Н-1 Glc), 3,45 (ад, J26a,26b=10,5 Гц, J26»,25e=2,5ru, Н-26а), 1,24 (ц, Д27.25=63Гц, 27-СНз), 1,16 (г J21,20=6,6Гц, 21-СНз), 1,04 (с, 19-СНз), 0,91 (с, 18-СНз).

Таблица 10 - Химические сдвиги сигналов атомов 1JC гликозида 1, (5, м.д., О-ТМС, CSDSN)

с- Хим. С- Хим. С- Хим.

атом "двиг атом Сдвиг атом Сдвиг

Gal

Г 102,0 1 30,7 15 30,7

2' 81,1 2 26,8 16 81,1

3' 75,2 3 76,1 17 62,7

4' 69,5 4 31,9 18 16,3

5' 76,2 5 36,7 19 23,7

6' 61,8 6 26,6 20 42,3

7 26,6 21 14,5

Glc 8 35,4 22 109,4

1" 105,3 9 40,2 23 26,3

2" 74,8 10 35,0 24 26,0

3" 77,6 11 21,0 25 27,3

4" 71,6 12 40,2 26 64,9

5" 77,8 13 40,7 27 16,0

6" 62,8 14 56,4

Рис.4. 3-о-Р-0-глюкопиранозил-(1->2) o-P-D-галактопиранозид сарсапс генина, выделенный из семя Y.torreyi

РАЗДЕЛ 6. ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА СГ В КУЛЬТУРАХ ТКАНЕЙ У. ¡огтеу!

Изучая возможность получения СГ методом культуры тканей, бы проанализирован каллус УЛоггеуг листового, корневого и зародышевого происхождения.

ТСХ анализ показал практически полное отсутствие СГ, как в первич-1 каллусе, так и в питательной среде.

При гистохимическом анализе каллуса только в зонах пролиферации »водящих элементов наблюдали положительную реакцию на олигофуро-нозиды. Сами проводящие элементы положительной реакции на СГ не али.

Положительную реакцию на олигофуростанозиды давали клетки при-[зительно среднего размера, соседствовавшие с мелкими и более круп-пи клетками, не дававшими характерное окрашивание. Введение в пита-ьную среду 0,01%, 0,1%, 1% холестерина как естественного предшест-ника СГ положительного результата не дало, хотя ТСХ анализ показал [сутствие холестерина в каллусных тканях во всех вариантах. Наряду с этим в процессе культивирования микропобегов в их основа-[ был получен каллус активно нараставший на среде содержащей 2 и БАП и 0,4 мг/л НУК без проявлений гистогенеза. Гистохимический анализ этого каллуса показал наличие в нем групп ток, содержащих олигофуростанозиды, дававших положительную реак-о с реактивом Эрлиха (Рис.5). При ТСХ вытяжки из этого каллуса были [аружены два олигофуростанозида: У1 с Иг= 0,32 и У2 с Кг = 0,23. спиростанолового ряда отсут-овали, что, очевидно, связано гсутствием в недифференциро-ных тканях (3-глюкозидазы, 'словливающей переход оли->уростанозидов в спиростано-1ые аналоги.

Математическое выражение сазателей величин ядерноплаз-1ного отношения клеток этого луса, так же как и величины >емов клеток и ядер укладывая в экспоненциальное распре-ение (Рис.6).

Между объемом ядра и объемом клетки обнаружена значительная кор-ятивная связь (г=0,68). Объем ядра и величина ядерно-плазменного от-иения находились в слабо выраженной положительной корреляции 0,21). Слабая, причем, отрицательная корреляционная зависимость на-□далась между объемом клетки и ядерно-плазменным отношением, (г=-

Количество клеток с положительной реакцией на СГ в этом каллусе со-вляло 33% (Рис.7). Полученные данные свидетельствуют как о морфоло-еской, так и о биохимической гетерогенности популяции клеток иссле-мого каллуса.

Таким образом, можно сделать вывод, что в первичном каллусе >ггеу1 СГ отсутствуют. Их появление приурочено к началу гистогенеза, и

. ^ • •...-а. , с

Рис. 5. Клетки каллуса с положительной реакцией на олигофуростанозиды (90x10)

Таблица 11 - Цитометрические характеристики клеток каллуса К (оггеуч

Клетки Параметры клеток Параметры ядер Ядерно-плазменное отношение Объем ядрышка Ядерно-ядрышковое отношение

(мкм) а М±ш (мкм) V М±ш и М±ш (мкм) й М±ш (мкм) V М±гп М±Ш М±Ш М±ш

все клетки каллуса 330±300 117±93 3073333,165± ±3069013,273 33±27 33 ±27 18017,549145 + + 17981,550045 0,112691183± +0,112308817 35,436614064+ ±34,874128126 0,148148675129± ±0,1481670665

содержащие сапонины 162+108 75 ±45 297836,3039+ 28-1336,6414 34,5±25,5 19,5+10,5 6810,57973125± ±6689,08276875 0,073584333± ±0,072618149 35,436614064± ±34,874128126 0,1487424148895± ±0,1475529668895

<=-.02 (-0..02] (.04,,061 (,03..1| (.12..14] (,16„181 (,2„22] >,24 (-.02,-0] (.02.04] (,0с„06] (,1„12] (.14..16) (,18„21 (,22,,24]

ВЕЛИЧИНА

Рис. 6. Распределение клеток каллуса з завкси:;оеги от шачеьта $5дскис-плазмен«ого отксшеаия

Клетки, содержащие сапонины

□ Клетки, содержащие сапонины

Рис. 7. Соотношение клеток с положительной и отрицательчой реакцией на сапонины

чагами синтеза являются дифференцирующиеся сосуды, хотя, как было оказано, синтез возможен и в каллусе без видимых признаков истогенеза, причем, в последнем случае СГ обнаруживаются только в асти клеток, которые, вероятно, являются местами их синтеза. В пользу оследнего говорит тот факт, что в клетках каллуса без признаков истогенеза СГ представлены исключительно физиологически еактивными олигофуростанозидами, являющимися также транспортной юрмой СГ и способными переходить в спиростаноловые гликозиды, оторые в свою очередь обладают значительной физиологической ктивностью и, согласно литературным данным (Miura et al., 1987; Госов,1991), оказывают влияние на цитодифференциацию и морфогенез.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения качественного посадочного материала Yucca torreyi hafer. и максимального выхода растений при семенном размножении в словиях интродукции на ЮБК рекомендуется использовать семена, из лодов, выполненных не более чем на 70 % и хранившихся не более двух [есяцев.

2. При необходимости длительного сохранения семян Y. torreyi елессообразным является хранение их внутри неповрежденных плодов.

3. Целесообразным является использование клонального [икроразмножения in vitro через индукцию образования адвентивных очек в культуре эпикотиля для массового тиражирования растений Y. tor-eyi.

ВЫВОДЫ

. Изучены взаимосвязи всхожести семян Yucca torreyi Shafer. с морфологией семян и плодов, полученных при искусственном опылении. Показано, что средняя масса семян находится в отрицательной, близкой к функциональной, связи (г=-0,91) с массой плода, а всхожесть семян находится в близкой к функциональной положительной связи (г=0.89) с их массой. . В процессе изучения развития проростков Yucca torreyi Shafer. на ранних этапах онтогенеза выявлено семь стадий, общая продолжительность которых в условиях in vitro на безгормональной среде МС и в условиях in vivo составила 138 и 140 суток соответственно. . Показано, что всхожесь свежесобранных выполненных семян Yucca torreyi Shafer. при посеве в почвенную смесь и на безгормональную питательную среду МС составляла 78-89% и 85-98% соответственно. •. Выявлена обратная зависимость всхожести семян Yucca torreyi Shafer. в условиях in vivo и in vitro от сроков хранения, наименее выраженная при сохранении семян внутри плодов. >. Разработаны способы микроразмножения растений Y.torreyi в условиях in vitro: 1) развитие полноценных проростков в культуре зародышей и

дальнейшее получение растений; 2) адвентивное побегообразование в культуре эпикотиля, ризогенез микропобегов и получение регенерантов.

7. Показано, что синтез стероидных гликозидов Y.torreyi приурочен к началу гистогенеза. Однако получен каллус без признаков гистогенеза, в 35% клеток которого содержались два олигофуростанозида (Rf=0,32; Rf--0,23).

8. Обнаружены СГ в листьях, корнях, цветках и семенах, их частях и тканях. Определена локализация СГ в тканях и клетках листьев и корней различного возраста и в семенах. Установлена зависимость изменения в составе СГ от места расположения тканей и органов, возраста самого растения Y.torreyi, а также его способности завязывать семена. Показано, что высокое содержание СГ было в семенах и цветках.

9. Впервые установлена структура преобладающего гликозида семян Yucca torreyi, являющегося 3-о-Р-В-глюкопиранозил-( 1 ->2)-o-|3-D-галакто-пиранозидом сарсапогенина, составляющего 10 % от массы семени, при общем содержании суммы СГ, составлявшей 20 %.

10. Отрицательная реакция на СГ при ТСХ и гистохимическом анализе в культуре корней in vitro и положительная - в культуре микропобегов доказали, что у Yucca torreyi Shafer. синтез СГ происходит в надземной части растения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов семян некоторых представителей рода Yucca. И Бюл. Никит, ботан. сада. -1997. - Вып.78. -С.92.-95.

2. Лищук А.И., Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов Yucca macrocarpci в вегетативных органах. // Бюл. Никит, ботан. сада. -1997.-Вып.78. -С.95-99.

3. Карпов П.А., Чирва В.Я. Изучение стероидных гликозидов в репродуктивных органах Yucca macrocarpa Engelm. // Бюл. Держ. HiKiT. ботан. саду. -1998. -Вип.80. - С. 168-174.

4. Гришковец В.И., Карпов П.А., Иксанова C.B., Чирва В.Я. Стероидный гликозид из семян Yucca macrocarpa. II Химия природных соединений. -1998. -Вып.6. -С.828-830.

5. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Перспективы размножения Юкки крупноплодной (Yucca macrocarpa Engelm.) в условиях интродукции. // Тез. докл. сессии совета Ботанических садов Украины. "Ботанические сады - центры сохранения биологического разнообразия мировой флоры." - Ялта. -1995. - С. 136

б. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Семенное размножение видов юкки в условиях Южного берега Крыма. // Селекция, экология, технологии возделывания и переработки нетрадиционных растений (посвящается творческому наследию Л.П. Симиренко): Материалы IV ме-

леждунар. научно-производственной конф. г. Алушта, 11-17 сентября, 995: Тез. докл. - Симферополь, 1996. - С.73.

7. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А., Капелев О.И. Арбо-)етум Никитского ботанического сада - источник генофонда однодольных февесных интродуцентов. // Тез. доп. 2 го м1жнар. симпоз1уму присвячено-о 200-р1ччю дендролопчного парку «Софй'вка». "Старовинш парки i про->леми Ух збереження". - Умань. -1996. - С. 100.

8. Карпов П.А., Новикова В.М., Гришковец В.И., Максимов А.П., in рва В.Я. Возможности использования видов рода Юкка {Yucca Ь.)для юлучения стероидных гликозидов. // Четверта м1жнародна конференщя з 1едичноУ боташки / г.Ялта, 24-26 сентября 1997г.: Тез. доп. -Кшв. -1997. -Г.394-395.

9. Novikova V.M., Karpov Р.А. Culture in vitro of some kinds Yucca. // In 'itro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation: VII In-ern. Conf. Moscow / Russia, Nowember 25-28, 1997. ABSTRACTS. Moscow, 997. -P.44-45.

10. Novikova V.M., Kapelev O.I., Karpov P.A. Culture of tissues of some irboreal monocotyledonous plants. // II International Symposium on Plant Biotecnol. Kyiv. / Ukraine, October 4-8, 1998. ABSTRACTS. Kyiv, 1998. ->.92.

11. Карпов П.А., Новикова B.M., Максимов А.П. Юкка крупноплодная Yucca macrocarpa Engelm.) перспективы изучения и культивирования. // Интродукция растений и отдаленная гибридизация.: Междунар. конф., •.Москва / Россия, 15-17 декабря, 1998г. Тез. докл. Москва, 1998. - С.57-58.

12. Карпов П.А. Гистохимическое определение локализации стероид-[ых гликозидов в листьях Yucca macrocarpa Engelm. // Int. Meeting of Young scientists in Horticulture: 7lh Int. Conf. Lednice / Czech Republic, September 4-16, 1999. Materials. Lednice, 1999. -P. 172-176.

Карпов П.А. Бтлопчш особливост! Yucca torreyi Shafer.: розмноження юслил i одерзкання стероУдннх пгикозид!в in situ та in vitro. - Рукопис.

Дисерташя на здобуття наукового ступеня кандидата бшлопчннх на-к з спещальносп 03.00.20. - б!отехнолопя. - Державнин HiKiTCbKiul бо-aiii'nmfi сад УААН, Ялта, 2000.

Дисертац1я присв'ячена вивченню б1олог1чних особливостей Ъсса torreyi Shafer. (син. Y.macrocarpa Engelm.) в зв'язку з розмно-<енням рослин i одержання стеро'щних гл1козид1в in situ та in vitro. 5ивчеш можливост1 HaciHHoro i клонального м)кророзмноження. Роз-юблен1 три способи ¡ндукц1'1 адвентивного пагоноутворення in vitro культур! ешкотилю. Досл!джено наявн$сть стеро'щних гл1козид1в в ист1, KopiHui, кв1тках i насшш. Встановлено, що найвищий BMicT терощних гл1козид1в в HaciHHi, а переважний гл1козид нас1ння е З-о->-0-глюкошранозил-(1->2)-о-Р-В-галактошранозидом capcanoreHina. Означено, що в Y.torreyi синтез стероУдних гл1козид1в вщбу-аеться в надземнш частин! рослини. Встановлений взаемозв'язок интезу стеро'щних гл1козид!в з пстогенезом i морфоге-

незом. Одержаний калюс синтезуючий схшгофуростанозиди при вщсутносп ознак пстогенезу i дана його цитоморфометрична характеристика.

1ÚH040BÍ слова: юкка, in situ, in vitro, мжророзмноження, насшня, проросток, калюс, морфогенез, стерощш глжозиди.

Карпов П.А. Биологические особенности Yucca torreyi Shafer.: размножение растений и получение стероидных гликозидов in situ и in vitro. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук ио специальности 03.00.20. - биотехнология. - Государственный Никитский ботанический сад УААН, Ялта, 2000.

Диссертация посвящена изучению биологических особенностей Yucca torreyi Shafer. в связи с размножением растений и получением стероидных гликозидов in situ и in vitro. В результате проведенных исследований изучены биологические особенности семенного размножения, развития проростков Y.torreyi in situ и in vitro. Изучены взаимосвязи всхожести семян У. torreyi с морфологией семян и плодов, полученных при искусственном опылении в условиях интродукции. Установлено, что средняя масса семян находится в отрицательной, близкой к функциональной, связи (г=-0,91) с массой плода, а всхожесть семян находится в близкой к функциональной положительной связи (г=0,89) с их массой. На ранних этапах онтогенеза, выявлено семь стадий развития проростков, продолжительность которых в условиях in vitro на безгормональной среде МС (Murashige & Skoog, 1962) была больше, чем в условиях in situ. Показано, что всхожесь свежесобранных выполненных семян Yucca torreyi Shafer. при посеве в почвенную смесь и на безгормональную питательную среду МС составляла 7889% и 85-98% соответственно. Выявлена обратная зависимость всхожести семян Y. torreyi в условиях in vivo и in vitro от сроков хранения, наименее выраженная при сохранении семян внутри плодов. Разработаны способы получения растений Y. torreyi в условиях in vitro: 1) получение полноценных проростков в культуре изолированных зиготических зародышей; 2) адвентивное побегообразование в культуре эпикотиля, с использованием питательных сред МС (1962) и QL (Quoirin & Lepoivre, 1977) с добавлением ИМК, НУК и БАП. Обнаружены стероидные гликозиды (СГ) в листьях, корнях, цветках и семенах, их частях и тканях Y. torreyi. Определена локализация СГ в тканях и клетках листьев и корней различного возраста и в семенах. Установлена зависимость изменения в составе СГ от места расположения тканей и органов, возраста самого растения Y.torreyi, а также его способности завязывать семена. Показано, что высокое содержание СГ было в семенах и цветках. Впервые установлена структура преобладающего гликозида семян Y.torreyi, являющегося 3-о-(3-0-глюкопиранозил-(1-»2)-o-p-D-галактопиранозидом сарсапогенина, составляющего 10 % от массы семени, при общем содержании суммы СГ составлявшей 20%. Установлено, что синтез стероидных гликозидов Y. torreyi приурочен к началу гистогенеза. Однако, получен кал-

ус без признаков гистогенеза, в 35 % клеток которого содержались два лигофуростанозида (Rf=0,32; Rf=0,23). На основании отрицательной еакции на СГ при ТСХ и гистохимическом анализе в культуре корней in itro и положительной - в культуре микропобегов, доказали, что у Yucca irreyi Shafer. снтез СГ происходит в надземной части растения.

Ключевые слова: юкка, in situ, in vitro, микроразмножение, семя, роросток, каллус, морфогенез, стероидные гликозиды

Karpov Р.А. Biological features Yucca torreyi Shafer.: a propagation of lants and obtaining of steroid glycosides in situ and in vitro. - Manuscript.

Thesis for degree of candidate of biological sciences on the speciality 3.00.20. - biotechnology. - State Nikita botanical garden UAAS, Yalta, 2000.

The dissertation is devoted to study of biological features of Yucca tor-eyi Shafer. (syn. Y.macrocarpa Engelm.) in connection with a propagation of lants and reception of steroid glycosides in situ and in vitro. The opportunities f a seed and microclonal propagation are investigated. Three ways of an in-uction of adventitious shoots in vitro in culture of epicotyl are developed. The resence of steroid glycosides in leavs, roots, flowers and seeds is investigated, 'he high content of steroid glycosides in seeds is shown. A dominating glyco-ide of seeds, hase determined 3-o-p-D-glucopyranosyl-(l->2)-o-|3-D-alactopyranoside of sarsapogenin. It is also determined, that at Y.torreyi the ynthesis of steroid glycosides occurs in an above-ground part of a plant. The iterrelation of synthesis of steroid glycosides with histogenesis and morpho-enesis is established.

It is obtained a callus synthesized oligofurostanols at the absence of his-ogenesis and its cytomorphometric characteristic is given.

Key words: yucca, in situ, in vitro, micropropagation, seed, seedling, alius, morphogenesis, steroid glycosides.