Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания при адаптации растений к условиям гипобарической гипоксии

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания при адаптации растений к условиям гипобарической гипоксии"

I о О Д М НОЯ '-97

На правах рукописи.

Астафурова Татьяна Петровна

ВЗАИМОСВЯЗЬ ФОТОСИНТЕЗА И ДЫХАНИЯ ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ К УСЛОВИЯМ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

С.-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории фотосинтеза научно-исследовательского института биологии н биофизики и на кафедре ботаники Томского государственного университета.

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор Т.В. Чиркова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.В. Удовенко

доктор биологических наук И.М. Кисшок

доктор биологических наук, профессор А.К. Юзбеков

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза Российской Академии наук.

Защита диссертации состоится " 1997 г.

в " /'У " час. на заседании Диссертационного Совета Д020.18.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44. Факс: (812)311-87-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Автореферат разослан ". Г _" /-¿¿О^Д^С 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Э.А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К числу факторов, наименее изученных в физиологии растений, относится гипобарическая гипоксия, которая развивается в тканях при разрежении атмосферного воздуха. В естественной среде обитания такая ситуация возникает в услов1их высокогорья, где действует комплекс факторов, из которых наиболее изученными являются световые и температурные модификации. Интерес к действгао разреженной атмосферы стал возрастать не только в связи с освоением высокогорных районов проживания, но и с развитием космических исследований, созданием искусственных систем жизнеобеспечения, а также с решением экологических задач, связанных с формированием климата.

Особенности гипобарической среды характеризуются одновременным снижением парциального давления газов, среди которых наибольшее значение для растений имеют О2 и СО2. Как функционируют и взаимодействуют в этих условиях основные энергопреобразугощие процессы - фотосинтез и дыхание? Как осухцествляется рост и развитие растений? Эти и другие вопросы к настоящему времени мало изучены, а появляющиеся в литературе сведения весьма противоречивы. Встречаются единичные данные о влиянии разреженной атмосферы на интенсивность газообмена (Gale, 1972, 1973; Musgrave et al., 1986) и отдельные реакции дыхательного метаболизма (Андреев и др., 1996), структуру и функциональную активность митохондрий (Costes, Vartapetian, 1978; Вартапетян, 1985; Musgrave et al., 1988), формирование пигментного фонда хлоропластов (Воробьева и др., 1977, 1981) и ростовые реакции растении (Walkinshaw, 1971; Andre, Richaud, 1986). Однако авторы цитируемых работ используют различные экспериментальные условия, методические подходы и объекты исследования, что затрудняет обобщение результатов и требует дополнительного изучения перечисленных вопросов. В отличие от других типов гипо- и аноксии (затопление, вытеснение воздуха инертными газами и т.д.), влияние которых преимущественно исследовано па корневой системе, тпобарическую гипоксию важно изучать и на автотрофных органах, которые в условиях разреженной атмосферы непосредственно взаимодействуют с воздухом, обедненным кислородом. Решение этой проблемы осложняется тем, что до конца не ясно, как функционируют различные этапы темпового дыхания в фотосинтезирующих листьях растений. Отсутствуют данные и о состоянии

ассимилирующего аппарата при изменении газового состава среды. Не выяснена временная и дозовая зависимость различных реакций при действии высотной гипоксии. Недостаточно фактов о наличии компенсаторных эффектов в клетке в условиях разреженной атмосферы. Не исследованы особенности акклиматизации и репарационных процессов, а также видовая и метаболическая специфика растений. Поиск новых подходов в изучении этих вопросов, усовершенствование методик и технических возможностей аппаратуры, использование разных объектов исследования позволят расширить и уточнить представления о механизмах адаптации растений в условиях стресса.

Цель и задачи исследования. Целыо настоящей работы являлось исследование структурно-функциональных изменений фотосинтетического аппарата и особенностей дыхательного метаболизма в листьях растений, определяющих адаптацию организма к условиям гипобарической гипоксии. Для этого изучалось влияние различного по времени и силе данного воздействия на:

-интенсивность дыхательного С02-газообмеиа;

- активность ферментов дыхательного и фотосинтетического метаболизма;

- содержание основных продуктов обмена;

- структурную организацию фотосинтетического аппарата растений;

- состояние пигментного фонда;

- функционирование первичных фотохимических реакций фотосинтеза.

Для выяснения специфики приспособительных реакций исследования проводили на растениях различных систематических групп, а также на модельных объектах с измененным фотосинтетическим аппаратом - постэтиолированных проростках и хлорофилльных мутантах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.В фотосинтезирующих листьях растений при действии гипо барической гипоксии происходит трансформация дыхательных путей - усиливается функционирование гликолиза, ОПФП и брожения. Цикл Кребса сначала угнетается, а затем активность его восстанавливается.

2. В условиях гипо барической гипоксии осуществляются

структурно-функциональные перестройки фотосинтетического аппарата.

3. В листьях растений в условиях гипоксического стресса включаются адаптивные реакции компенсаторного типа, основанные па взаимосвязи фотосинтеза и дыхания.

4. Характер приспособительных реакций в автотрофных органах

растений зависит от силы и продолжительности действующего фактора, видовых особенностей . объектов, организации и степени сформированности фото синтетического аппарата.

Научная новизна. Впервые на растительных объектах комплексно изучен новый тип гипоксического состояния, связанный с разрежением атмосферного воздуха в барокамере. Проведено многоплановое исследование различных сторон дыхательного и фотосиптетического метаболизма растений в условиях гппобарической гипоксии, позволяющее одновременно оценить характер изменений основных энергетических процессов в ассимилирующих клетках листа, а также выяснить механизмы их регуляции и взаимосвязи. Для измерения дыхательного

газообмена растений использован высокочувствительный метод лазерной оптико-акустической спектроскопии, ранее не применявшийся для исследования биологических объектов в этих условиях. Новым является также изучение мезоструктуры фотосинтетнческого аппарата растений в условиях разреженной атмосферы. Обнаружена периодичность структурно-

функциональных изменений в автотрофных тканях листа, связанная с активацией анаэробных этапов дыхательного метаболизма. Выявлена временная и дозовая зависимость, а также период репарации различных реакций, обратимость которых зависит от силы и продолжительности предшествующего воздействия. Обнаружена способность к акклимации растений при повторных и нарастающих, нагрузках стрессового фактора. Выяснены особенности формирования фотосинтетического аппарата растений в условиях гппобарической гипоксии и зависимость этого процесса от интенсивности дыхательного обмена. На основании сравнительных исследований зеленых, этиолированных проростков и хлорофилльных мутантов впервые установлено, что адаптация к гипобарической гипоксии осуществляется по-разному у растений, различающихся по степешх организации и сформированности фотосинтетического аппарата. В работе обоснована концепция о компенсаторном взаимовлиянии фотосинтеза и дыхания в процессе адаптации растений к гипоксическому воздействию и представлена схема структурно-функциональных изменений в листьях растений в условиях гппобарической гипоксии.

Практическая значимость работы. Полученные результаты о характере структурно-функциональных перестроек фотосинтетического аппарата и дыхательного метаболизма в тканях растений могут быть использованы в селекционной практике для разработки методов оценки и прогнозирования устойчивости растений к гипо-и аноксии. Активация анаэробного метаболизма в листьях может являться индикатором существенного дефицита кислорода, возникающего в ассимилирующих тканях растений при ухудшении экологической ситуации. Результаты о временной и дозовой зависимости, о действии сопутствующих факторов при разрежении воздуха могут найти применение в инженерно-конструкторских проектах при создании искусственных систем жизнеобеспечения. Данные о скорости репарационных процессов и эффектах акклимации позволят при помощи барокамеры разработать способы адаптации растений к условиям гипо- и аноксии с учетом видовых, возрастных и метаболических особенностей объектов.

Материалы диссертации и методики проведения экспериментов могут быть использованы в лекционных курсах и практических занятиях по физиологии и биохимии растений, при выполнении кандидатских диссертаций, курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Исследования проводились по плану научно-исследовательских работ лаборатории фотосинтеза НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, и были поддержаны грантами Головного Совета по биологии Госкомвуза (г. СгПетербург) - №2-101-23-38 (1992-1993); №95-010.072 (1996-1997), междисциплинарной программы "Фундаментальные проблемы охраны окружающей среды и экологии человека" №93-4-3 (1994-1995) и специальным фондом СО РАН №Д 1.40 (1993).

Основные результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на ежегодных научных семинарах отдела молекулярной биологии и лаборатории фотосинтеза НИИ биологии и биофизики Томского госуниверситета (1977 - 1996), на конференциях научной молодежи Центрального Сибирского Ботанического сада СО АН СССР (Новосибирск, 1977; 1978), на IV объединенном симпозиуме Биохимических обществ СССР и ГДР "Цикл трикарбоновых кислот и механизмы его регуляции" (Киев, 1977), на V, VI и VII Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Алма-Ата, 1978; Львов, 1980; 1984), на Всесоюзном совещании "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" (Пущино, 1981), на Международном симпозиуме

"Регуляция метаболизма первичных п вторичных продуктов фотосинтеза" (Пущино, 1983), на Всесоюзной конференции "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1985), на VIII Всесоюзном ботаническом съезде (Алма-Ата, 1986), на Всесоюзной конференции "Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания" (Томск, 1986), на I Всесоюзном совещании "Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспериментах" (Новосибирск, 1990), на II Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), на Международном совещании "Метаболизм углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1991), на Всесоюзной конференции "Клеточные механизмы адаптации растений" (Чернигов, 1991), на III съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на Республиканском совещании "Изогенные линии и генетические коллекции" (Новосибирск, 1993), на заседании Томского отделения Всероссийского общества физиологов растений (Томск, 1993; 1997), на Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), на Международной конференции "Стресс растений" (Мюнхен, 1996), на заседают Томского отделения Всероссийского Ботанического общества (Томск, 1997), на научном семинаре кафедры физиолопш и биохимии растений Санкт-Петербургского госуниверситета (Санкт-Петербург, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 работ, 2 статьи находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (5 глав), обсуждения результатов, заключения, выводов, библиографии, включающей 555 наименовании, из них 269 на иностранных языках, и приложения, работа изложена на 265 страницах машинописного текста, содержит 63 таблицы и 28 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования служили 8-суточные проростки гороха (Pisum sativum L) сорта Торсдаг. В отдельной серии экспериментов анализировали хлорофилльные мутанты гороха из коллекции К.К.Сидоровой (ИЦиГ РАН, г. Новосибирск). В некоторых опытах использовали 5-суточные проростки ячменя (Hordeum vulgare L) сорта Скороход и пшеницы (Triticum aestivum L) сорта Скала, а также 14-дневные проростки кукурузы (Zea

mays L) сорта Буковинский. При исследовании кинетики дыхательного СОг-газообмена растений, кроме перечисленных объектов, использовали листья взрослых деревьев березы (Betula verucosa L) и осипы (Populus tremula L), а также хвою четырехлетних саженцев кедра сибирского (Pinus sibirica Dur. Tour.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica L).

Растения выращивали в условиях почвенной культуры при температуре воздуха 22-24°С под люминесцентными лампами, интенсивностью 40 Вт м-2 ФАР с 12-часовым фотопериодом. Этиолированные проростки находились в полной темноте. В зависимости от постановки опыта работай! с интактными растениями, либо с отделенной надземной частью, а также с изолированными листьями, плавающими па воде или растворах экзогенных субстратов. Подготовленные для эксперимента контрольные и опытные группы растений одновременно помещали в экспозиционные камеры в условия измененной газовой среды и освещения.

Гипобарическую гипоксию создавали в термобарокамере ТГ-50.4. VEB фирмы "Hochvakuum" (Гермапия), которая состояла из экспериментального отсека объемом 1 мЗ и аппаратной части, в которой смонтированы вентилятор, устройство термостатирования и парогенератор для регулирования температуры в диапазоне от -40° до 80°С и влажности от 0 до 95%, а также создания необходимой циркуляции воздуха. Установка оборудована линией вакуумирования, основу которой составляет двухступенчатый пластинчато-роторный вакуумный насос производительностью 60 м3/г, позволяющий создавать рабочее разрежение от 1,3x10-2 до 1,3x10-7 кПа. Источник освещения - лампы ЛДЦ-40 смонтированы непосредственно в экспериментальном отсеке.

При длительных экспозициях в камеры помещали открытые сосуды с водой и приемники с поглотителем СО2 - аскаритом или 20% КОН. В ряде опытов использовали систему периодического прокачивания воздуха, что,однако,не вносило заметных изменений в результаты. Влажность почвы контролировали весовым методом. Измерение температуры и относительной влажности воздуха проводили с помощью стандартного термопсихрометра. Степень разрежения воздуха контролировали по показаниям дифманометра ДТ-50 и высотометра. Интенсивность света измеряли пиранометром Янишевского, термоток которого регистрировали гальванометром переносного теша М-195. Обслуживание установки и контроль за ходом эксперимента

осуществляли с общего пульта управления. Два смотровых окошка на двери камеры служили для дополнительного визуального наблюдения за объектами исследования. Опыты проводили по схеме, разработанной дом животных (Рябчук и др., 1987; Сафронова, Лопухова, 1990) и модифицированной нами применительно к растительным объектам (Астафурова и др., 1990). Парциальное давление кислорода при разрежении воздуха соответствовало интервалу от 11 до 2 кПа. Скорость откачивания воздуха и запуска его перед окончанием эксперимента составляла 16 м/с. В зависимости от цели эксперимента растения находились в темноте или на свету, интенсивностью от 15 до 60 Вт м-2. Время экспозиции варьировало от 2 до 48 часов. После завершения эксперимента растительный материал сразу же использовали для комплексного анализа. В листьях растений определяли содержание продуктов обмена, активность ферментов фотосинтетического и дыхательного метаболизма. Измеряли размеры клеток и органоидов. На выделенных хлоропластах изучали

фотохимическую активность и целый ряд других показателей.

Содержание хлорофиллов и сумму каротиноидов определяли спектрофотометрически (Шлык, 1971). Разделение и

количественный анализ индивидуальных каротиноидов проводили методом бумажной хроматографии (Сапожников и др., 1955). Содержание пирувата (Csok, Lamprecht, 1970), малата и лактата (Hohorst, 1970) определяли энзиматически. Количество редуцирующих Сахаров и сахарозы измеряли микрометодом, основанным на восстановлении феррицианида калия до ферро цианида в щелочной среде (Ермаков, 1972). Водорастворимый белок анализировали по Лоури (Lowry et al., 1951) и Брэдфорду (Bradford, 1976), крахмал - сульфосалициловым методом (Ястрембович, 1960). Содержание свободных аминокислот регистрировали на автоматическом анализаторе "Т-339" (Чехия) в стандартном режиме дня гидролизатов с Na-цитратшдми буферами, экстрагируя аминокислоты 5%-ной сульфосалициловой кислотой (Moore, Stain, 1954).

Скорость циклического фотофосфорилирования (ЦФФ) определяли потенциомегрически (Nishimura et al., 1962), используя в качестве кофактора пиоциашш, который получали при освещении раствора феназинметасульфата белым светом (Врублевская и др., 1978). Измерение скорости реакции Хилла и сопряженного с ней нециклического фотофосфорилирования (НЦФФ) проводили методом Заботпна (Заботин, 1970) по количеству восстановленного феррицианида, который

использовали в качестве акцептора электронов. Интенсивность темпового дыхания оценивали по скорости выделения СО2 в замкнутом объеме экспозиционных камер на установке, состоящей из оптико-акустического спектрометра на базе С02-лазера и вакуумной системы (Агеев и др., 1994).

Структурную организацию листа изучала путем мацерации ткани по методике, разработанной для однодольных (Мокроносов, Борзенкова, 1978) и модифицированной нами для листьев гороха (Астафурова и др., 1994).

Морфометрическую оценку клеток, устьиц, ядер и вакуолей проводили микропроекциошшм способом после фиксации листьев 70% этанолом с последующей зарисовкой на бумаге поперечных срезов клеток и органелл при 400-кратном увеличении. Измерение проводили штангенциркулем и по формуле рассчитывали площадь поперечного сечения объекта (Хеши, 1967).

Клеточные структуры выделяли из свежих листьев (3-5 г) при +5°С методом дифференциального центрифугирования (Rathman, Edwards, 1975) в среде, содержащей 0,35 М сахарозу. Чистоту выделенных фракций контролировали цитологическим методом в фазово-контрастном микроскопе МББАУ-42. Подсчет органелл проводили в камере Горяева по 30 малых клеток для каждой фракции, окрашивая митохондрии 1% янусом зеленым, ядра -0,04% метиловым зеленым, приготовленным на 6% уксусной кислоте с добавлением 0,002 М СаС12 (Астафурова и др., 1981).

Активность алкогольдегидрогеназы (АДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) (Гавриленко и др., 1975), рибулоз о бисфо сфат- карбоксилазы (РуБФК)/ шгруваткиназы (ПК) (Романова, 1980), глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы - НАД(Ф) (ГАФД) (Мажуль, 1980), малатдегадрогеназы - НАД(Ф) (МДГ), малик-энзима (МЭ) (Юзбеков, 1990), изоцитратдегадрогеназы -НАД(Ф) (ИДГ) (Chapman, Osmond, 1974) и фосфоенолпируваткарбоксилазы (ФЕП) (Moller et al, 1977) определяли спектрофогометрически по стандартным методикам, модифицированным нами применительно к объектам исследования (Астафурова, 1982; Верхотурова, Астафурова, 1983). Расчет полученных данных производили на 1 г сырой или сухой массы, а также на 1 мг белка.

В работе использовали реактивы фирмы "Reanal" (Венгрия), "Serva" (Германия), "Calbiochem" (США) и минеральные соли (х.ч.) отечественного производства.

Было проведено от 3 до 5 серий аналогичных опытов в 2-3 кратной биологической повторности. Результаты обработаны статистически (Кузнецов, 1973) с использованием критерия Стыодента. Средние арифметические значения и их стандартные ошибки рассчитаны по объединенным данным всех опытов. Достоверными приняты различия по величине Р, iíe превышающие 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние пшобарической гипоксии на реакщщ дыхательного метаболизма в листьях растений

Перестройка окислительного метаболизма при дефиците кислорода на анаэробный путь обмена в гетеротрофных тканях растений главным образом связана с активацией ключевых ферментов гликолиза, окислительного пентозофосфатного пути и брожения, а также снижением энзиматической активности цикла Кребса.

Исследования, проведенные с 8-дневными проростками гороха, выращенными в нормальных условиях аэрации показали, что для листьев интактных растеши! характерна высокая активность ряда ферментов дыхательного метаболизма, сопоставимая с их функционированием в гетеротрофных и фотосинтезирующих тканях у других видов. Внезапное 6-часовое разрежение атмосферного воздуха активировало АДГ, Г-6-ФДГ, НАДФ-специфичную ИДГ и снижало функционирование НАД-зависимых ИДГ и МДГ в освещенных листьях гороха (табл. 1). Угнетение окислительных процессов, протекающих через ЦТК,и усиление восстановительных реакций, переключающих гликолиз в брожение, свидетельствовало о дефиците кислорода в тканях растений, возникающем при разрежении атмосферного воздуха. Следовательно, в автотрофных клетках листа в условиях гипобарической гипоксия первоначальное переключение дыхательного метаболизма на анаэробный путь обмена осуществлялось по обычной схеме, описанной для гетеротрофных тканей при гипоксических воздействиях.

Таблица 1.

Активность ферментов дыхательного метаболизма в листьях гороха при нормальной аэрации (контроль) и в условиях гипобарической гипоксии на свету (опыт). Р = 8 кПа, Ро2 ~ 2 кПа.

Освещенность 40 Вт-м-2. Время экспозиции 6 ч

Активность ферментов, мЕ-мг белка-1 Варианты

контроль опыт % к контролю*

АДГ 46,3 ±3,2 240,7 ±8,9 519

Г-6-ФДГ 25,5 ±1,9 42,1 ± 2,4 165

ИДГ-НАД 9,5 ±0,3 3,4 + 0,2 35

ИДГ-НАДФ 38,7 ±2,4 81,2 ± 3,6 209

МДГ-НАД 220,1 ±7,8 165,1 ±6,4 75

ПК 28,6 ± 1,4 27,2 ±1,6 95

* контроль - 100% •

Изучение энзиматических реакций в зависимости от продолжительности гипобарической гипоксии на свету показало, что активация АДГ в листьях гороха происходила уже в первые часы воздействия, достигая уровня насыщения после 6-часовой экспозиции (рис. 1). При более продолжительных экспериментах активность фермента хотя и снижалась, но оставалась значительно выше контроля. В то же время активность НАД-зависимой из оцтр атдегндр о гена зы изменялась иначе. При разрежении атмосферного воздуха вначале наблюдалось ингабирование фермента, но после 12-часового воздействия отмечалась тенденция к постепенному возвращению ИДГ-НАД на исходный уровень. Необходимо отметить, что функционирование НАДФ-специфичной ИДГ отличалось отсутствием первоначальной инактивации фермента. В условиях гипобарической гипоксии активность ИДГ-НАДФ постепенно возрастала по мере продолжительности эксперимента и при 18-часовой экспозиции в 2 раза превышала контрольное значение.

Время, ч

Рис.1. Относительная активность АДГ (1), ИДГ-НАД (2), ИДГ-НАДФ (5), Г-6-ФДГ(Д ГАФД-НАД (5), ПК (б), МДГ-НАД (7), МДГ-НАДН (8), "МЭ" (9), в листьях гороха при действии гипобарической гипоксии. Р ~ 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещенность

40 Вт-м-2.

Подобная зависимость была обнаружена и для малик-энзима. В тех же условиях активность МДГ-НАД на протяжении суточного эксперимента была ниже контрольного уровня, что, в некоторой степени, могло ограничивать пропускную способность цикла Кребса на завершающем этапе. МДГ-НАДН в условиях гипобарической гипоксии функционировала стабильно.

Активность цитоплазматических ферментов - ГАФД-НАД, ПК и Г-6-ФДГ изменялась одновременно по мере разрежения воздуха и становилась максимальной при 18-часовой экспозиции. Однако активация Г-6-ФДГ была выражена сильнее, чем ГАФД-НАД и ПК. Полученные результаты показывают, что в листьях гороха при разрежении воздуха в большей степени усиливалась утилизация дыхательных субстратов через ОПФП, который является наиболее быстрым и экономичным путем катаболизма, идущим с образованием НАДФН.

24 48 72 96 120 Время, ч

Рис. 2. Репарация активности алкогольдегидрогеназы в листьях гороха в зависимости от времени гипоксического воздействия: а -после 2-часовой, б-после 6-часовой, е-после 18-часовой

экспозиции. Р ~ 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещенность 40 Вт м -2.

В зависимости от продолжительности воздействия оказался не только уровень активации или ингибирования ферментов, но и возвращение их к исходному функционированию (рис. 2). При сравнении скорости репарации нескольких ферментов после одной

и той же экспозиции выяснилось, что наиболее быстро восстанавливалась активность Г-6-ФДГ, затем ПК, а для АДГ этот период оказался самым продолжительным.

Интересным является то, что при повторном действии гипобарпческой гипоксии, которое следовало после предшествующей 6-часовой прединкубащш растений в условиях разреженной атмосферы, наблюдалась не только стабилизация, но и активация митохондриальной изоцитратдегидрогеназы, в то время как активность ферментов анаэробного метаболизма -АДГ и Г-6-ФДГ снижалась (рис. 3).

Рис. 3. Влияние повторной гипобарпческой гипоксии на активность алкогольдегидрогеназы (1), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (2) и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (3) в листьях гороха. Р <= 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещенность 40 Вт-м*2.

ЕШ - контроль (100%), - опыт 6 ч, ^ - опыт 20 ч, ^ - опыт повторный 20 ч*.

* Растения после предшествующей 6-часовой гипобарпческой гипоксии п последующей 18-часовой репарации вновь помещали в барокамеру в условия разреженной атмосферы на 20 часов.

Стимуляция окислительного метаболизма при повторных воздействиях в барокамере ранее была обнаружена у животных и человека, что свидетельствует о повышении общей резистентности организма при нарастающих нагрузках. Таким образом, предобработка растении в условиях гипобарпческой гипоксии

повышает их выживаемость при дефиците кислорода. Это согласуется с данными других исследователей, использовавших для той же цели иные гииоксические воздействия (Saglio et al., 1988; Johnson et al., 1989; Xia, Saglio, 1992; Rivoal, Hanson, 1993; Ricard et al., 1994; Xia, Roberts, 1994).

Для выяснения дозовой зависимости необходимо учитывать не только продолжительность и повторяемость действующего фактора, но и силу воздействия. Сравнение активности АДГ в листьях гороха при одной и той же экспозиции показало увеличение активности фермента при нарастающей гипобарической гипоксии (табл. 2).

Таблица 2.

Активность алкогольдегидрогеназы в листьях гороха при нарастающей гипобарической гипоксии. Время экспозиции 24 ч

Варианты Давление воздуха, кПа Парциальное давление кислорода, кПа . АДГ

мЕ-мг белка-1 %

контроль 101 21 51,2 ±3,2 100

опыт 54 11 92,6 ±5,4 181

29 6 166,9 ±9,6 326

8 2 477,1 ± 18,8 932

Изменение активности ферментов оказало влияние на качественный и количественный состав продуктов обмена. Переключение окислительного метаболизма на анаэробный путь обмена сопровождалось усиленным выделением СО2 (рис. 4), снижением уровня крахмала, увеличением содержания редуцирующих Сахаров и сахарозы, пирувата, лактата, малата, а также серина, глутамата, аланина и аспартата (табл. 3).

о

63

а

о

Растворимый белок* Крахмал* Редуцирующие сахара* Сахароза* Пируват Малат Серии Глутамат Аспартат Алании Показатель

25,8+0,2 34,6 ±2,0 6,1 ±0,34 4,4 ±0,26 I,24 ± 0,11 0,71 ±0,04 II,9 ±0,95 4,9 ±0,20 4,7 ± 0,22 0,7 ±0,01 Контроль

26,0 ±0,1 19,7 ± 1,3 8.0 ± 0,27 5.1 ±0,30 2,08 ±0,17 0,91 ±0,06 19,1 ±0,20 8,1+0,38 7.2 ±0,30 2,1 ±0,03 Опыт

®и>Сл»— и VI о* и ^м % к контролю

Фотоакустический сигнал, отн. ед.

К> VO

о to

Фотоакустический сигнал, отн. ед.

При более длительной гипобаричеекой гипоксии содержание органических кислот возрастало, а углеводов - уменьшалось. Количество свободных аминокислот хотя и снижалось относительно предшествующей активации, но по-прежнему оставалось выше, чем в контроле. Повышенное содержание иирувата при гипоксии обычно объясняют усилением гликолиза либо карбоксилированием ФЕП с последующей активацией ферментов малатной системы - МДГ-НАДН и малик-энзима (Crawford, 1978; Чиркова 1988). Образование многих аминокислот связывают с анаболическими реакциями цикла Кребса (Землянухин, Иванов, 1988; Брамбилла и др., 1996). Однако в листьях растений эти метаболиты могут синтезироваться и в альтернативных путях фотосинтеза, которые обычно активируются в экстремальных условиях (Тарчевский,1964; Воскресенская, 1965;). Что касается сахаров, то пути их образования в листьях также многообразны. Одни авторы объясняют их накопление в тканях растений при гипоксии торможением утилизации, другие - ускоренным гидролизом запасных углеводов или новообразованием в реакциях фотосинтеза. Обнаруженные особешюсти дыхательного обмена в листьях растений на свету свидетельствуют о необходимости одновременного изучения структурно-функциональной активности фотосинтетического аппарата растений в условиях гипобаричеекой гипоксии.

Структурное состояние и функциональная активность фотосинтетического аппарата растений в условиях гипобаричеекой

гипоксии

Как показали наши исследования, гипобарическая гипоксия вызвала существенные изменения не только в реакциях дыхательного обмена, но оказала заметное влияние и на перестройку фотосинтетического аппарата растений. Анализ мезоструктуры листа выявил четкую гипертрофию клеток палисадной и губчатой паренхимы при 8-часовой экспозиции в условиях разреженной атмосферы на свету, связанную с увеличением размеров центральной вакуоли, ядра, устьичной щели верхнего и нижнего эпидермиса (рис. 5).

Укрупнение клеток вакуолей и ядер согласуется с активацией происходящих в них метаболических процессов и является характерной адаптивной реакцией на действие стрессовых факторов. В условиях разреженной атмосферы подобный аффект отмечался в клетках животных (Сафронова, Лопухова, 1990;

Абдулла н др., 1991), но механизм этого действия до конца не изучен. Предполагают, что скорее всего он основан на изменении осмотических свойств клетки, хотя не исключают и влияние физического фактора, связанного с различием внутриклеточного давления при внешней гипобарии.

Рис. 5. Влияние гнпобарической гипоксии на площади проекций клеток (2), устьичной щели нижнего (3), верхнего (4) эпидермиса, ядра (5) и вакуоли (6) в % относительно контроля (1). Р = 8 кПа, Р02 ~ 2 кПа. Освещенность 40 Вт-м-2. Время экспозиции 8 ч.

Важно отметить, что в этих условиях наблюдалось изменение объема хлоропластов в клетках палисадной и губчатой паренхимы листа (табл. 4).

Считается, что меньшие по объему, сжатые хлоропласты в сформированных листьях функционируют более активно (Ellis, Leech, 1985). Обнаруженные изменения мезоструктуры листа оказались легко обратимыми. Однако репарация происходила не сразу, а через 6-8 часов после завершения эксперимента. Это свидетельствует о том, что структурные изменения в автотрофных клетках листа вызваны не простым механическим растяжением, связанным с перепадом барометрического давления, а в большей степени зависят от функциональной активности растений в условиях гнпобарической гипоксии. При длительном 20-часовом воздействии различий по морфометрическим показателям клетки между контрольными и опытными вариантами не наблюдалось.

Таблица 4.

Влияние гипобарической гипоксии на объем клеток и хлоропластов в тканях листа гороха. Р = 8 кПа, Ро2 ~ 2 кПа. Освещенность

40 Вт-М"2. Время экспозиции 8 ч

Вариашы Палисадная паренхима Губчатая паренхима

Объем клетки, мкм3- ЮЗ Объем хлоропласта, мкм3 Объем клетки, мкм3-103 Объем хлоропласта, мкм3

Контроль Опыт 21,2 + 2,1 36,3 ±3,4 49,5 ±3,9 27,2 ± 2,7 16,6 ±1,7 23,9 ±3,9 32,5 ±3,1 22,8 ± 2,4

Структурная перестройка фотосинтетического аппарата растений в условиях гипобарической гипоксии сопровождалась изменением его функциональной активности на уровне первичных фотохимических реакций. Изучение их на хлоропластах, выделенных из листьев гороха, показало, что в течение 6-часового разрежения воздуха при неизменном содержании пигментов наблюдалось повышение активности первичных реакций фотосинтеза, затем, при стабильном ЦФФ, скорость НЦФФ и реакции Хилла угнеталась, а после 12-часового воздействия вновь возрастала, достигая уровня контроля (рис. 6). Позднее наблюдалось вторичное ингибирование фотосистемы II.

Таким образом, в течешге 6-часовой гипобарической гипоксии, характеризующейся снижением окислительной способности клеток листа, происходила активация первичных реакций фотосинтеза, связанных с образованием АТФ и продуцированием эндогенного кислорода. Однако при более продолжительном воздействии компенсаторные возможности хлоропласта ограничивались и наблюдалось уменьшение скорости фотофосфорилирования. Причем инактивация ФС II наступала раньше, чем угнеталась функциональная активность ФС I. Такая же последовательность изменений отмечалась при действии как других неблагоприятных факторов (Тарчевский, 1993), так и в условиях аноксии (Чиркова и др., 1995). Подобная перестройка энергетических систем хлоропласта должна отразиться и на активности ферментов фотосинтетического метаболизма углерода.

Рис. 6. Влияние гипобарической гипоксии на скорость первичных реакций фотосинтеза. А - циклическое фютофосфорилирование, В - реакция Хилла, С - нециклическое фотофосфорилирование.

В листьях гороха, сформированных в нормальных условиях аэрации в течение 6-часового разрежения атмосферного воздуха в барокамере на свету наблюдалось первоначальное снижение относительной активпости РуБФК (рис. 7), после чего происходила резкая активация фермента, которая сохранялась в дальнейшем на протяжении 18-часовой экспозиции, а затем выходила на уровень, близкий к контролю. Изучение активности ФЕПК в листьях гороха показало, что кинетика изменений фермента носила характер, противоположный функционированию РуБФК в ходе эксперимента. Полученные результаты соответствуют

представлению о смене карбоксилирующих систем в фотосинтезирующих тканях листа при изменении факторов среды (Мокроносов, 1983).

Важным ферментом цикла Кальвина является ГАФД-НАДФН, который в большей степепи, чем другие ферменты, зависит от функционирования первичных реакций фотосинтеза. При 6-часовой гипобарической гипоксии происходило увеличение относительной активности ГАФД-НАДФН, после чего наблюдалась ее инактивация, достигающая максимальных значений при 12-часовой экспозиции. Вторичное повышение активности фермента происходило при 18-часовом воздействии и сохранялось на уровне, близком к контрольному значению.

Полученные результаты сопоставимы с данными о скорости первичных реакций фотосинтеза в условиях гипобарической гипоксии и свидетельствуют о периодическом характере сопряженных процессов.

250г

6 12 18 24

Время, ч

Рис. 7. Относительная активность РуБФК (7), ФЕПК (2) и ГАФД-НАДФН (3) в листьях гороха при действии гипобарической гипоксии. Р ~ 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещенность 40 Вт-м-2.

Таким образом, действие гипобарической гипоксии на фотосинтетический аппарат растений, выращенных в нормальных условиях аэрации, является комплексным, включающим как структурные, так и функциональные перестройки, согласованные с изменениями различных звеньев дыхательного метаболизма по типу своеобразной кооперации, основанной на периодической взаимозаменяемости процессов. Это способствует рациональному использованию энергетических и метаболических ресурсов автотрофной метки, повышает эффективность ее

функционирования в экстремальных условиях и ускоряет адаптацию растений к гипобарической гипоксии. Роль фотосинтеза в приспособительных реакциях растений к дефициту кислорода заслуживает особого внимания и наиболее четко может быть выявлена при изучении растений, различающихся по степени организации фотосинтетического аппарата.

Особенности метаболизма растений при формировании фотосинтетического аппарата в условиях гипобарической

гипоксии

Для уточнения вклада фотосинтетических реакций в процесс адаптации растений к гипобарической гипоксии были использованы этиолированные проростки, фотосинтетический аппарат которых постепенно формировался в процессе зеленения в различных условиях аэрации. Выращенные в полной темноте, 5-дневные проростки ячменя при последующем их освещении в барокамере в условиях разреженной атмосферы даже визуально отличались от растений контрольного варианта наименее развернутой листовой пластинкой и менее интенсивной зеленой окраской. Подробное изучите мезоструктуры фотосинтетического аппарата на мацерированных тканях выявило, что в условиях гипобарической гипоксии происходило формирование более мелких клеток и хлоропластов (табл. 5).

Анализ пигментного фонда проростков ячменя показал, что в условиях гипобарической гипоксии существенно замедлялся процесс накопления зеленых и желтых пигментов (рис. 8). У опытных проростков уже в начальный период зеленения образование хлорофилла а было снижено почти в 2 раза. С увеличением продолжительности воздействия различия в содержании хлорофилла а между контролем и опытом возрастали. Наиболее сильное влияние гипобарическая гипоксия оказала на образование хлорофилла в, содержание которого резко отличалось от контроля как в первые часы разрежения воздуха, так и в конце эксперимента.

В отличие от зеленых пигментов, некоторая часть каротиноидов уже была образована в э тио лир о в аиных листьях в темноте, и гипобарическая гипоксия оказала па их содержание меньшее влияние, чем на зеленые пигменты.

Изучение индивидуальных каротиноидов показало, что в первую очередь происходило уменьшение содержания каротина, в то время как уровень ксантофиллов еще пе изменялся. Более заметное торможение образования желтых пигментов проявлялось

при 24-часовом воздействии, когда содержание ксантофиллов снижалось на 20%, а каротина - почти в 2 раза.

Таблица 5.

Влияние гипобарической гипоксии на формирование клеток и хлоропластов в постэтиолированных листьях ячменя. Р ~ 8 кПа, Р02 ~ 2 кПа. Освещенность 40 Вт м"^

Варианты Время экспозиции, ч Число хлоропластов Объем хлоропластов^ , мкм3 Объем клетки, мкм3103

контроль опыт 6 28 ±2 31 ±2 12,7 ± 1,2 7,8 ± 0,8 11,7 ±0,9 8,0 ±0,4

контроль опыт 12 33 ±3 32 ± 3 18,1 ±1,6 11,9 ±1,0 10,2 ± 0,7 8,7 ± 0,4

контроль опыт 24 32 ± 2 29 ±3 36,7 ±3,4 17,9 ±1,6 9,6 ±0,5 7,8+0,3

§ 2

-Ь

Я

ш ^

Ё о

Хпорофшшы (а + 6)

Карагиноиды

О б 12 18 24

Время освещения, ч Рис. 8. Влияние гипобарической гипоксии на динамику накопления пигментов в зеленеющих проростках ячменя. Р - 8 кПа, Р02 ~ ^ кПа. Освещенность 40 Вт м-2. 1 - контроль, 2 - опыт*

Установлено, что в процессе формирования фотосинтетического аппарата фотохимическая активность хлоропластов в значительной степени связана с развитием структуры пластид и с количеством образующегося хлорофилла. В условиях гипобарнческой гипоксии при 6-часовом освещении проростков ячменя скорость реакции Хилла не отличалась от контрольных вариантов и возрастала в равной степени по мере продолжительности воздействия (табл. 6). Снижение скорости нециклического фотофосфорилирования, обнаруженное при 6-часовом эксперименте, также не достигало уровня контроля при 12-часовой и суточной экспозициях. Низким оставалось и значение отношения P/2 е в течение всех опытов в условиях гипобарнческой гипоксии.

Таблица 6.

Развитие реакции Хилла и нециклического фотофосфорилирования хлоропластов, изолированных го этиолированных проростков ячменя, зеленеющих при действии гипобарнческой гипоксии.

Р = 8 кПа, Pq2 ~ 2кПа. Освещенность 40 Вт м"2

Варианты Время экспозиции, ч Реакция Хилла Нециклическое фото ф о сфорили-рование Р/2е

мкмоль Ф % мкмоль Фтт %

ц_МГХЛЧ мг-хл-ч

Контроль 48,5 ± 2,3 100 25,6 ± 0,8 100 0,52

Опыт 6 47,8 ± 2,3 99 12,6 + 1,9 49 0,26

Контроль 151,1 ± 15, 100 80,7 ±7,8 100 0,53

Опыт 12 8 91 50,6 ±8,0 63 0,37

137,2 ± 13, 7

Контроль 264,3 ± 14,2 100 186,1 ±9,4 100 0,70

Опыт 24 235,5 ± 13,4 89 86,6 + 14,1 47 0,36

Полученные результаты согласуются с данными по мезоструктуре и состоянию пигментного фонда в этиолированных проростках ячменя, зеленеющих в барокамере на свету при разрежении воздуха. Они дополняют имеющиеся в литературе

данные о снижении уровня АТФ и НАДФН при освещении этиолированных проростков овса в условиях аноксии, обусловленной атмосферой N2 (Walter et al., 1990). Замедление развития пластид и накопления пигментов в условиях гипо барической гипоксии, способствовавшее снижению фотохимической активности хлоропластов, повлияло и на работу ферментов фотосинтетического метаболизма в формирующихся проростках ячменя.

Проведенные исследования показали, что на всех этапах формирования фотосинтетического аппарата большая часть СО2 фиксировалась преимущественно при участии ФЕПК, а не РуБФК-системы (табл. 7), причем у растений опытного варианта различия в функционировании карбоксилирующих ферментов были выражены в большей степени за счет снижения относительной активности именно рибулозобисфосфаткарбоксилазы.

В условиях 6-часовой гипо барической гипоксии активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы не изменялась, а при 12-часовой экспозиции даже возрастала. И только после суточного эксперимента в условиях разреженной атмосферы функционирование ГАФД-НАДФН незначительно снижалось относительно контрольных значений.

Таблица 7.

Влияние гипобарнчсской гипоксии на активность ферментов фотосинтетического метаболизма в развивающихся листьях ячменя. Р = 8 кПа, Pq2 ~ 2 кПа. Освещенность 40 Вт м"2

Активность Время Варианты

фермента экспозиции, Контроль Опыт %к

ч мЕ мг белка"1 контролю

6 27,3 ± 1,6 16,0 ± 1,5 58

РуБФК 12 36,5 ±3,0 18,3 ± 1,6 50

24 42,0 ± 2,6 21,2 ± 1,5 50

6 51,8 ±2,1 37,2 ± 1,6 71

ФЕПК 12 103,1 ±6,2 83,5 + 4,7 80

24 248,7 ±8,6 234,0 ± 6,0 94

6 10,5 ±0,9 10,3 ±0,7 99

ГАФД- 12 20,2 ± 1,4 44,6 ±1,6 220

НАДФН 24 34,1 ±2,0 38,4 ±1,6 71

Что касается ферментов дыхания и брожения в листьях этиолированных проростков ячменя, то изучение их работы выявило первоначальную актнвацшо митохондриальнон малатдегидрогеназы и последующее ее ингнбирование (табл. 8). Активность НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы была выше контроля при всех экспозициях. При функционировании же алкогольдегидрогеназы обнаруживалась 6-часовая и суточная активация работы фермента, в то время как при 12-часовой гипобарической гипоксии подобного явления не наблюдалось.

Таблица 8.

Влияние гипобарической гипоксии на активность ферментов дыхательного метаболизма в развивающихся листьях ячменя.

Р ~ 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещепиосгь 40 Вт м"2

Активность Время Варианты

фермента экспозиции, Контроль Опыт % к

ч мЕ-мг белка"' контролю

6 103 ±5 206 + 14 200

АДГ 12 245 ± 16 233 ± 18 95

24 402 ± 26 1018+60 253

МДГ-НАД 6 12 838 ± 48 850 ± 52 2095 ±67 723 ±36 250 85

ИДГ-НАДФ 6 12 508 ± 25 553 ± 34 1294 ±54 1304 ±60 254 235

Таким образом, в листьях растений, фотосинтетический аппарат которых постепенно формировался в условиях разреженной атмосферы, происходили компенсаторные изменения активности ферментных систем. В течение первых часов воздействия активировались ферменты всех звеньев дыхательного метаболизма, функционирование которых обеспечивало образование АТФ и восстановителя, необходимых для развития ассимилирующей системы растений. По мере формирования фотосннтетического аппарата в условиях гипобарической гипоксии роль окислительных реакций цикла Кребса снижалась, но возрастала активность процесса брожения. Интенсивность функционирования карбокенлирующих ферментов в

развивающихся листьях ячменя в условиях разреженной атмосферы отставало от контрольных растений. Причем в большей степени замедлялась активность РуБФК при относительной стабильности ФЕПК. Как известно, меньшее повреждение ФЕП-карбоксилазной системы по сравнению с РуБФК было показано и при других неблагоприятных воздействиях - засолении (Шумилова, Магомедов; 1989) и засухе (Юзбеков; 1993).

Итак, пониженная эффективность фотосинтеза в процессе формирования ассимилирующего аппарата способствовала включению иных путей адаптации к гипобарической гипоксии, основанных не на кооперации, а на поэтапном доминировании различных звеньев дыхательного метаболизма.

Влияние гипобарической гипоксии на функциональную активность растений с измененным фотосинтетическим аппаратом

Другим подходом для изучения роли фотосинтеза и дыхания в адаптации растений К гипобарической гипоксии является использование мутантов, у которых недостаточное развитие фотосинтетического аппарата было определено на генетическом уровне.

Исследования проводили с пигментными мутантами гороха (М-2014) зернового сорта Торсдаг, полученными в результате действия этиленимина. При выборе объекта мы учитывали литературные данные (Сидорова и др., 1968, 1977; Соколов и др., 1983; 1988; Шумный и др., 1982; Полшцук, 1989) и предварительные результаты собственных исследований (Астафуроваи др. 1990; 1993; Вайшля, 1992).

Фенотипическое проявление мутации выражалось в изменении окраски листьев, которая у М-2014 имела салатный оттенок. Несмотря на выраженную пигментную недостаточность, коррелирующую с количественным уменьшением хлоропластов в ассимилирующей ткани листа, замедлением скорости циклического фотофосфорилирования и с другими особенностями фотосинтетического аппарата, активность основных ферментов цикла Кальвина у М-2014 поддерживалась на высоком уровне.

Тем не менее, у исходной формы растений после 12-часовой гипобарической гипоксии наблюдалось снижение скорости первичных реакций фотосинтеза. Наиболее чувствительным к дефициту кислорода оказалось НЦФФ, которое по сравнению с контролем уменьшилось в 8 раз. У мутанта при той же экспозиции

скорость нециклического потока электронов и отношение Р/2е также снижалось, но в меньшей степени. В то время как у обычных растений активность реакщш Хилла и ЦФФ в условиях 12-часовой гипобарической гипоксии замедлялись, у М-2014 эти показатели несколько превышали уровень контроля (рис. 9).

300-1

о &

§

а и й *

200-

й &

. с

- 100-

I

г-1

О* р

5 4 1 2 3

Рис. 9. Влияние гипобарпческой гипоксии на скорость реакции Хилла (1), циклического (2) н нециклического (3) фотофосфорили-рования в листьях нормальных (| | ) и мутантных ( растений

гороха относительно контроля (О!)- Р^ВкПа, Ро2~2кПа. Освещенность 40 Вт-м"2. Время экспозищш 12 ч.

Наибольшей стабильностью отличалась и ферментная система мутантов. Так, функционирование РуБФК у исходной формы в условиях разреженной атмосферы возрастало в 2 раза, у М-2014 - всего на 30% (табл. 9). Активность фотосинтетической ГАФД у нормальных растений снижалась в 2 раза, у мутанта оставалась почти без изменения. Следовательно, фотосинтетический аппарат мутантов в меньшей степени реагировал на изменение газового состава среды при одних и тех же дозовых нагрузках.

Подобная закономерность была обнаружена и при исследовании реакций дыхательного обмена. Причем у М-2014 в условиях гипобарпческой гипоксии активность различных ферментов окислительного метаболизма при одинаковой экспозищш изменялась медленнее, чем у исходной формы (табл. 10).

Таблица 9.

Влияние гипобарической гипоксии на активность ферментов фотосинтетического метаболизма в листьях нормальных и мутантных растений гороха. Р = 8 кПа, Ро2 ~ 2 кПа. Освещенность

40 Вт-м"2. Время экспозиции 8 ч

Объект Варианты РуБФК мЕ-мг белка"1 % ГАФД-НАДФН мЕ-мг белка"1 %

Исходная контроль 154,4± 12,1 100 102,3 ±5,7 100

форма опыт 312,6 ±20,0 203 54,2 ±3,0 53

Мутант-2014 контроль 247,1 ± 18,0 100 41,2 ±2,9 100

опыт 321,2 ±20,4 130 39,9 ±2,6 97

Таблица 10.

Влияние гнпо барической гипоксии на активность ферментов дыхательного метаболизма в листьях нормальных и мутантных растений гороха. Р = 8 кПа, Ро2 = 2 кПа. Освещенность 40 Вт-м"2. Время экспозиции 6 ч

Активность

фермента, Контроль Опыт %к

мЕ-мг белка"1 контролю

Исходная форма

ГФДГ-НАДФ 15,5 ±0,9 27,9 ± 1,3 180

ИДГ-НАД 14,3 ±1,0 5,6 ± 0,4 39

МДГ-НАД 190,3 ±11,4 81,8 ±3,8 43

Мутант-2014

ГФДГ-НАДФ 55,8 ±3,2 61,3 ±3,0 110

ИДГ-НАД 9,0 ±0,6 7,8 ±0,5 86

МДГ-НАД 76,1 ±4,6 71,5 ±4,6 94

Анализ продуктов обмена, образующихся на ключевых этапах дыхательного метаболизма, показал, что содержание их совпадало с изменением ферментативной активности у нормальных и мутантных растений. Пониженная интенсивность исходного

аэробного дыхания и повышенный анаэробный обмен у М-2014, вероятно, способствовали более экономному потреблешпо О2, что позволило им стабшпшгровать окислительный метаболизм, сохраняя его почти без изменения в условиях кислородного стресса.

Сходные результаты были получеиы ранее при сравиетш устойчивых и неустойчивых видов растений в условиях корневого и общего анаэробиоза (Чиркова и др., 1974; Lambers, 1976; Чиркова, Астафурова, 1977; Monk, Brandie, 1982; Чиркова и др., 1995). Они согласуются с теорией метаболической адаптации растеши! (Ч1гркова, 1988) и показывают, что для выживания в условиях гипоксии большое значение имеют как эффективное использование резервов кислорода, или снижение интенсивности его потребления, так и изменение скорости и направленности метаболизма.

Таким образом, генетически детерминированное лимитирование активности фотосинтетического аппарата и ограниченная активность окислительного метаболизма у мутантов не позволяют им использовать кооперативный путь адаптации к гипобарической гипоксии, основанный на взаимозаменяемости фотосинтеза и дыхания, который четко проявлялся у исходной формы растений. Приспособление мутантов к условиям разреженной атмосферы основано на компенсаторном усилении анаэробного обмена, снижающего чувствительность их к дефициту кислорода.

Заключение

Результаты сравнительных исследований фотосинтетического и дыхательного метаболизма у растений при действии гипобарической гипоксии выявили принципиальные различия в их функционировании в зависимости от особенностей организации фотосинтетического аппарата.

В зеленых листьях растений с развитой ассимилирующей системой при разрежении воздуха в барокамере, так же как и в гетеротрофных тканях при других гипоксических состояниях, происходило первоначальное переключение окислительного метаболизма на анаэробный тип обмена: активировались гликолиз и брожение, снижалась окислительная способность цикла трикарбоновых кислот, но возрастала доля окислительного пентозофосфатного пути (рис. 10). В это же время осуществлялась функциональная перестройка фотосинтетического аппарата, сопровождающаяся структурными изменениями клеток листа: увеличивалась скорость первичных фотохимических реакций,

происходила смена карбоксилирукяцих систем и включались альтернативные пути фотосинтеза, что, вероятно, приводило к развитию адаптационного синдрома, при котором сила действия стрессора не превышала компенсаторные возможности клетки. В дальнейшем наступал период резистентности, характеризующийся стабилизацией метаболических процессов на качественно новом уровне. На этом этапе, на фоне возрастающего брожения, включались дополнительные реакции, восполняющие дефицит промежуточных субстратов дыхания и окисленных коферментов, что способствовало восстановлению активности реакций цикла Кребса.

Усиление дыхательного метаболизма в клетках листа при нарастающем воздействии, возможно, компенсировало дефицит СО2, НАДФН, АТФ и продуктов обмена при временной инактивации фотосинтетической активности и приводило, в дальнейшем, к стабилизации первичных фотохимических реакций, локализованных в хлоропластах, а также стимулировало карбоксилирующую активность РуБФК. В свою очередь, активация альтернативных путей фотосинтеза ускоряла образование мобильных продуктов обмена - ОАА, малата, пирувата, обеспечивающих "короткое замыкание" между фотосинтезом и дыханием. Использование промежуточных, а не конечных продуктов фотосинтеза в процессе дыхания при действии гипобарической гипоксии является более эффективным путем пластического обмена. Ранее он был обнаружен у растений и при других экстремальных воздействиях (Тарчевский, 1993). Можно предположить, что при разрежении атмосферного воздуха в барокамере в автотрофных тканях растений обмен веществ осуществляется по типу своеобразной замкнутой системы, функционирующей за счет молекулярного кислорода, образующегося в клетках в процессе фотосинтеза и СО2, выделяющегося при дыхании. Подобные механизмы адаптации широко распространены у суккулентов, в зеленеюпщх плодах, в тканях растешш,куда доступ воздуха затруднен, и свидетельствуют о тесной метаболической взаимосвязи фотосинтеза и дыхания в экстремальных условиях.

Иначе происходила адаптация к гипобарической гипоксии у этиолированных растений, фото синтетический аппарат которых формировался на свету в условиях разреженной атмосферы.

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ ПРИ ГИПОБАРПЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

Структурные изменения в клетках листа

Гипертрофия клеток палисадной и губчатой паренхимы Увеличение размеров вакуолей устьичной щели и ядер Уменьшение размеров хлоропласте®

/

II

/

/ 1 \

1 \

1

Трансформация

дыхательного метаболизма

Активация Снижение

гликолиза, окислитель-

ОПФПи ной актив-

брожения ности цикла

Кребса

Сохранение размеров клеток и органоидов

Усиление Включение Восстановле-

активации анаплероти- ние окисли-

тельной

гликолиза, ческих

ОПФП и реакций активности

брожения цикла Кребса

Функциональные перестройки фотосинтетического аппарата

Повышение активности первичных фотохимических реакций Снижение карбоксилиру-ющей активности РуБФК и активация ФЕПК Включение альтернативных путей фотосинтетического метаболизма

\

\

Активация Восстановление Усиление

РуБФК и первичных альтернатив-

стабилиза- фотохимичес ных путей

ция ФЕПК ких реакций фотосинтеза

Рис 10. Динамика структурно-функциональных изменений в листьях растений при гипобарической гипоксии.

Время экспозиции 6-8 ч (Г); 18-20 ч (II),

Они отличались замедленным ростом и развитием листовой пластинки в ходе эксперимента, пониженным содержанием зеленых и желтых пигментов, а также характеризовались более мелкими клетками и хлоропластами, ограниченной фотохимической и РуБФК-активностыо. В условиях гипобарической гипоксии в зеленеющих проростках ячменя, в начальный период воздействия, брожение развивалось медленнее, чем у одновозрастных зеленых растений и возрастало одновременно с реакциями цикла Кребса. В процессе формирования фотосинтетического аппарата происходила смена активности ферментных систем дыхания: снижалась интенсивность функционирования МДГ-НАД при увеличении активности НАДФ-зависимой ИДГ, которая сохранялась на высоком уровне и при усилении анаэробного обмена. Следовательно, при разрежении атмосферного воздуха, несмотря на угнетающее действие гипоксии, реакции дыхательного метаболизма обеспечивали формирование фотосинтетического аппарата необходимыми для этого процесса продуктами обмена. В отличие от зеленых растений в развивающихся проростках ячменя эффективность фотосинтеза при адаптации к гипобарической гипоксии выражена незначительно.

Подобная тенденция еще в большей степени проявилась у мутантных растений с генетическими изменениями фотосинтетического аппарата, которые исходно ограничивали его функциональную активность и приводили к трансформации дыхательного метаболизма. Повышенный уровень анаэробного обмена и пониженная окислительная способность у мутанта в нормальных условиях аэрации способствовали более экономному потреблению кислорода, что позволило ему стабилизировать обмен веществ, сохраняя его почти без изменений в условиях кислородного стресса. Подобная закономерность была обнаружена ранее у растений, устойчивых к недостатку кислорода (Чиркова, 1988).

Таким образом, в листьях растений, выращенных в нормальных условиях аэрации, адаптация к гипобарической гипоксии осуществлялась по типу согласованной кооперации, основанной на периодической взаимозаменяемости фотосинтеза и дыхания. У растений, фотосинтетический аппарат которых формировался в условиях разреженной атмосферы, преобладали приспособительные реакции, связанные с поэтапной активацией различных звеньев дыхательного метаболизма. У хлорофилльных мутантов исходное угнетение фотосинтетической активности и пониженная интенсивность окислительных реакций цикла Кребса

компенсировались усилепием анаэробного обмена, снижающего чувствительность этих объектов к дефициту кислорода.

Полученные результаты дополгопот и уточняют представления о роли фотосинтеза и дыхания в процессе адаптации растений к экстремальным воздействиям. Они могут быть использованы при создании общебиологической теории стресса и разработке практических рекомендаций, используемых в космической биологии, биотехнологии и селекции.

Выводы

1. Разрежение атмосферного воздуха в замкнутом объеме барокамеры индуцировало развитие гипоксического состояния в клетках листа, которое усиливалось по мере увеличения силы и продолжительности действующего фактора и наблюдалось не только в темноте, но и на свету. Об этом свидетельствовала активация ключевых фермептов - гликолиза (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы-НАД; пируваткиназы), окислительного пентозофосфатного пути (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) и брожения (алкогольдегидрогеназы-НАДН), а также угнетение окислительных реакций цикла Кребса (малатдегидрогеназы -НАД; изоцитратдегидрогеназы -НАД).

2. В условиях гипобарической гипоксии усиливалось выделение СО2 листьями растений. Увеличение интенсивности дыхательного СОг-газообмена сопровождалось активацией анаэробных дегадрогеназ, декарбоксилиругощпх субстраты не только в основных, но и анаплеротических реакциях ("малик-эизима"-НАДФ, изоцитратдегидрогеназы-НАДФ).

3. Переключение окислительного метаболизма на анаэробный путь обмена сопровождалось снижением содержания крахмала, увеличением количества растворимых Сахаров, свободных органических кислот и аминокислот (пирувата, малата, лактата, алашпга, серина, аспартата, глутамата).

4. Признаки углекислотной недостаточности при разрежении атмосферного воздуха, о которых судили по инактивации рибулозобисфосфаткарбоксилазы, проявлялись лишь в первые часы воздействия. Кар б оксидирующая способность листа в этот период поддерживалась за счет стимуляции фосфоенолпируват-карбоксилазной системы. При возрастании силы воздействия

дефицита СО2 в тканях растений не наблюдалось благодаря включению реакций, связанных с образованием эндогенной углекислоты.

5. В зеленых листьях растений с развитым фотосинтетическим аппаратом в условиях гипобарической гипоксии при отсутствии изменения пигментов выявлена цикличность функционирования первичных фотохимических реакций: первоначальная активация фотосистем I и II сменялась снижением скорости нециклического фотофосфорилирования и реакции Хилла при неизменном функционировании циклического фотофосфорилирования. В дальнейшем скорость нециклического фотофосфорилирования вновь возрастала, достигая уровня контроля, после чего имело место уже вторичное ингибирование фотосистемы II.

6. В начальный период воздействия гипобарической гипоксии наблюдалась гипертрофия клеток палисадной и губчатой паренхимы листа, коррелирующая с увеличением размеров вакуолей, ядер и устьиц. При пролонгированном разрежении воздуха изменений морфометрических параметров клетки и ее органоидов не обнаружено.

7. Предобработка растений в условиях гипобарической гипоксии способствовала их закалке к повторному воздействию, что выражалось в снижении интенсивности анаэробного обмена, усилении активности окислительных реакций никла Кребса, увеличении размеров клеток и повышении уровня карбоксилирования при фотосинтезе.

8. Фенотипические изменения фотосинтетического аппарата, возникающие у постэтиолированных проростков в условиях разреженной атмосферы, проявились в замедленном образовании зеленых и желтых пигментов, низкой фотохимической и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности, а также в формировании более мелких клеток и хлоропластов.

Пониженная эффективность фотосинтеза в развивающихся проростках усиливала доминирующую роль дыхания при адаптации растений к гипобарической гипоксии.

9. У хлорофилльных мутантов генетически детерминированное ограничение фотосинтетической активности и пониженная интенсивность окислительных реакций цикла Кребса в нормальных условиях аэрации восполнялись активацией гликолиза, окислительного пентозофосфатного пути и брожения.

В условиях гипобарической гипоксии адаптация мутантов выражалась в усилении анаэробного обмена, снижающего чувствительность их к дефициту кислорода.

10. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что включение компенсаторных реакций, основанных на взаимосвязи фотосинтеза и дыхания, является тем механизмом, который поддерживает содержание кислорода, углекислого газа, коферментов и субстратов на необходимом уровне и обеспечивает адаптацию растений к гипобарической гипоксии.

При нарушении функциональной активности фотосинтетического аппарата доминирующее значение в условиях гипоксического стресса приобретают метаболические трансформации различных звеньев дыхательного обмена.

Сшгсок основных работ, опубликованных по теме диссертапии:

1. Чиркова Т.В., Хазова И.В., Астафурова Т.П. К вопросу о метаболической регуляции приспособления растений к условиям временного анаэробиоза // Физиология растений. 1974. Т. 21. № 1.С. 102-107.

2. Чиркова Т.В., Астафурова Т.П. Некоторые особенности метаболического приспособления растений различных экологических групп к временному анаэробиозу // Сб. «Биология». Томск: Изд-во ТГУ. 1977. Т. 8. С. 150-154.

3. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. Регуляция светом некоторых реакций ЦТК в листьях фасоли // Сб. «Цикл трикарбоновых кислот и механизмы его регуляции». Тр. 4. Об. Сими. Биох. общ, СССР и ГДР. М.: Наука, 1977. С. 29-31.

4. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. Изучение функциошхрования гликолитического пути дыхания на свету в листьях фасоли И Сб. «Вопросы биологии». Томск: Изд-во ТГУ. № 9. 1978. С. 83-88.

5. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Скобеева Т.Е. Метаболизм пирувата и некоторых кислот ди-и трикарбонового цикла в листьях фасоли // Сб. «Вопросы биологии». Томск: Изд-во ТГУ. 1978. С. 83-88.

6. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. Активность некоторых дегидрогеназ в листьях гороха па свету различного спектрального состава // Оперативные информационные материалы АН СССР СО. Иркутск, 1979. С. 16-17.

7. Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С. Действие света различного спектрального состава на некоторые реакщш дыхательного метаболизма в зеленых листьях // Сб. «Физиологические механизмы адаптации животных и растений». Томск: Изд-во ТГУ, 1979. С. 66-73.

8. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Шрагер JI.H. Светозависимые изменения активности некоторых дегидрогеназ и содержания пирувата в клеточных структурах листьев гороха // Тезисы докл. У1 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений. Львов. 1980. С. 56-57.

9. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Фролова Н.М., Магомедов И.М. Изменение активности НАДФ-изоцитратдегндрогеназы в зеленых листьях на свету, индуцнрованное экзогенным цитратом // Физиология и биохимия культурных растений. 1981. Т. 13. №3. С. 251-256.

10. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Шрагер Л.Н. Влияние света на активность некоторых ферментов и содержание пирувата в различных клеточных структурах в зеленых листьях гороха // Оперативные информационные материалы СО АН СССР. Иркутск, 1981. С. 21-24.

11.Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. О взаимосвязи некоторых метаболических путей фотосинтеза и темпового дыхания в зеленых листьях гороха // Тезисы докл. Всесоюзного совещания «Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе». Пущино, 1981. С. 12.

12.Астафурова Т.П. Действие интенсивности и времени освещения на активность НАДФ-изоцитратдегидрогеназы в зеленых листьях гороха // Сб .^Механизмы регуляции функций организма при экстремальных воздействиях! Томск: Изд-во ТГУ, 1981. С. 120-124.

13.Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С. Сравнительное изучение активности НАД-и НАДФ изоцитратдегидрогеназ в листьях гороха // Оперативные информационные материалы СО АН СССР. Иркутск, 1982. С. 35-37.

14. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. О направленности некоторых реакщш цикла Кребса в зеленых листьях на свету // Физиология растений. 1983. Т. 30. Вып. 3. С. 580-586.

15.Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. Функционирование цикла Кребса на свету и взаимосвязь его с процессом фотосинтеза // Тезисы докл. Международного симп. «Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза». Пущпно, 1983. С. 44-45.

16. Астафурова Т.П., Лаптева Т.А., Верхотурова Г.С. Особенности метаболизма аминокислот па свету в зеленых листьях гороха при введении экзогенного субстрата // Сб. «Физиологическое действие экстремальных факторов на организм животных и растений». Томск: Изд-во ТГУ, 1984. С. 100-106.

17. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Дудина Е.В. Изучите содержания пирувата в зеленых листьях гороха на свету // Сб. «Фотосинтез и продуктивность растений». Калининград: Изд-во КГУ, 1987. С. 39-44.

18.Астафурова Т.П., Кудинова Л.И., Верхотурова Г.С. Активность изоцитрат- и глутаматдегидрогеназ в проростках гороха и хвойных // Тезисы докл. конф. «Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе». Пущино, 1985. С. 93.

19. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П.. Кудинова Л.И., Лаптева Т.А. Взаимоотношения фотосинтеза и дыхания в процессе роста листа ячменя // Тезисы докл. У Всесоюзного биохимического съезда. Москва, 1986. Т. 3, С. 73-74.

20. Верхотурова Г.С., Кудинова Л.И., Астафурова Т.П. Изучение функциональной связи фотосинтеза и дыхания на разновозрастных участках листа ячменя // Физиология растений. 1987. Т. 34. Выи. 2. С. 261-265.

21.Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С., Волкова О.В., Боровая O.A. К вопросу о функционировании гликолиза в зеленых листьях растений на свету // Сб. «Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания». Томск: Изд-во ТГУ, 1988. С. 30-36.

22. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Кудинова Л.И. Работа цикла Кребса на свету и некоторые механизмы его регуляции // Сб. «Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания». Томск: Изд-во ТГУ, 1988. С. 19-29

23. Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Ладыгин В.Г., Соколов В.А. Физиологические особенности мутантов гороха, различающихся по продуктивности // Материалы 1 Совещания «Использование изогенных линий в селекциопно-генетических экспериментах? Новосибирск. 1990. С. 121-123.

24. Вайшля О.Б., Астафурова Т.П., Зайцева Т.А., Соколов В.А. Метаболические изменения в листьях нормальных и мутантных растений гороха при действии экстремальных факторов //

Материалы 1 Совещания «Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспериментах». Новосибирск, 1990. С. 118-120.

25.Аетафурова Т.П., Вайшля О.Б., Верхотурова Г.С., Зайцева Т.А., Чиркова Т.В. Влияние гипобарической гипоксии на фотосинтетический и дыхательный метаболизм растений // Физиология растений. 1990. Т. 37. Вып. 4. С. 69-73.

26.Астафурова Т.П., Вайшля О.Б. Влияние гипоксического стресса на метаболизм хлорофнлльных мутантов гороха // Тезисы докл. Международной конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", Пущино. 1991. С. 87-88.

27. Калашников Ю.Е., Вайшля О.Б., Балахнина Т.И., Астафурова Т.П., Закржевский Д.А. Фотосинтетические реакции и ферменты защиты у пигментных мутантов гороха при аэрации и гипоксии // Цитология. 1991. Т. 33. № 5. С. 104.

28. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Кудинова Л.И., Постовалова В.М. Онтогенетические изменения активности ф ото синтетических и дыхательных ферментов в первом листе растений огурца // Известия СО РАН. Сибирский биол. Журнал. 1993. №3. С. 24-29.

29. Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Зайцева Т.А., Лаптева Т.А., Чиркова Т.В. Особенности дыхательного метаболизма в листьях гороха при гипобарической гипоксии // Физиология растений. 1993. Т. 40. №4. С. 656-661.

30.Астафурова Т.П., Вайшля О.Б. Реакция растений с разным типом метаболизма на гипоксическое воздействие // Материалы 11 совещания «Изогенные линии и генетические коллекции». Новосибирск, 1993. С. 143-145.

31.Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Лапина Г.В., Ракитин A.B. Исследование механизмов адаптации растений к высотной гипоксии // Тезисы докл. Третьего съезда ВОФР. Санкт-Петербург, 1993. Т. 5. С. 476.

32. Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Миллер М.А., Джанкуланов Д.Ш. Изменение метаболизма в листьях гороха при нарастающей гипобарической гипоксии и в период репарации // Тезисы докл. Третьего съезда ВОФР. Санкт-Петербург, 1993.Т. 1.С. 59.

33.Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Лапина Г.В., Ракитин A.B., Магомедов И.М. Активность анаэробных дегидрогеназ и кар б оксидирующих ферментов в листьях гороха при комплексном воздействии факторов среды II Вестник G-

Петербургского университета. 1994. Сер. 3. Вып. 3. (№ 17). С. 7378.

34.Астафурова Т.П., Вайшля О.Б., Зайцева Т.А., Лапина Г.В., Ракитин A.B. Активность фото синтетического аппарата листьев гороха в условиях разреженной атмосферы // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. Т. 26. № 5. С. 350-355.

35. Агеев Б.Г., Астафурова Т.П., Пономарев Ю.Н., Сапожникова В.А., Косицин К.П. Применение оптико-акустического спектрометра с СС^-лазером для исследования газообмена

растений // Оптика атмосферы и океана. 1994. Т. 7. № 7. С. 986990.

36. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. Изучение активности малатдегидрогеназ с различной коферментной специфичностью в листьях гороха на свету // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. Т. 26. № 2.С. 350-355.

37.Астафурова Т.П., Агеев Б.Г., Пономарев Ю.Н., Сапожникова

B.А., Зайцева Т.А., Зотикова А.П. Интенсивность дыхания проростков гороха и кукурузы в условиях высотной гипоксии // Авиакосмическая и экологическая медицина. 1996. Т. С. 35-39.

38. Astafurova Т.Р., Ponomarev Yu.N., Ageev B.G., Sapozhnikova V.A., Zaitseva T.A., Zotikova A.P. Dynamics of CO 2 evolution by plants at low pressure H Biologia plantarum. 1996. V. 38. N 2. P. 215-221.

39. Астафурова Т.П., Войцековская C.A., Зайцева T.A. Исследование механизмов адаптащш растений к дефициту кислорода // Материалы научной конф. "Механизмы адаптации организма", Томск. 1996. С. 6-7.

40.Ageev B.G., Astafurova Т.Р., Ponomarev Yu.N., Sapozhnikova V.A., Zaitseva T.A., Zotikova A.P.' Dark respiration under low pressure and increased ethylene // J. Plant Physiol. 1996. V. 148. P. 237-242.

41. Зотикова А.П., Зайцева T.A., Астафурова Т.П., Рябчук Ю.А. Формирование пигментного аппарата проростков ячменя в условиях гипобарической гипоксии // Физиология растений. 1996. Т. 43. № 6. С. 900-905.

42. Астафурова Т.П., Зайцева Т.А., Ковальчук-Коваль В.И. Структурно-функциональная адаптация в клетках растений при пониженном парциальном давлешш кислорода // Материалы научной конф. "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва. 1996.

C. 6.

43. Агеев Б.Г., Астафурова Т.П., Воробьева Н.А., Пономарев Ю.Н., Сапожншсова В.А. Измерения вьщелений С02 лпстовым

аппаратом древесных растений при гипобарии оптико-акустическим методом // Оптика атмосферы и океана. 1997. Т. 10. № 1. С. 38-43.

44.AgeevB.G., Astafurova Т.Р., Ponomarev Yu.N., Sapozhnikova V.A. Photo acoustic method and techniques for study of gases emitted by plants under environmental stressing // Abstracts of International congress "Stress of Life. Stress and Adaptation from molecules to man" . Budapest. P 50. p. 25.

45. Агеев Б.Г., Астафурова Т.П., Пономарев Ю.Н., Сапожникова В.А. Кинетика выделения С02 земной растительностью при

стрессовых воздействиях И Оптика атмосферы и океана. 1997. Т. 10. №4-5. С. 437-448.

46. Астафурова Т.П., Зайцева Т.А., Верхотурова Г.С., Баранова Е.Н. Формирование фотосинтетического аппарата проростков ячменя в условиях гипобарической гипоксии II Тезисы докл. Третьего ежегодного симп. "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология". Москва. 1997. С. 46.