Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями

Кумскова, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями"

005015375

Кумскова Елена Михайловна

МЕХАНИЗМЫ АТЕРОГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

03.01.04 - биохимия

1 2 МД? Ж

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва- 2012

005015375

Работа выполнена в лаборатории биохимии свободнорадикальных процессов НИИ клинической кардиологии им.А.Л.Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор Ланкин Вадим Зиновьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

академик РАН и РАМН, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

доктор биологических наук профессор Панасенко Олег Михайлович

Ведущая организация: Институт биохимической физики

им. Н.М. Эммануэля РАН

Защита состоится «21» марта 2012 г. в 13.30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в ФГБУ «Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс» Минздравсоцразвития РФ (121552 Москва, ул.З-я Черепковская, Д.15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан_2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца - одни из наиболее частых причин смертности в развитых странах, причём основные осложнения этих заболеваний вызваны повреждением стенки сосудов. В настоящий момент не вызывает сомнений тот факт, что модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), значительно отличающиеся от нативных частиц по физико-химическим свойствам, играют важную роль в атерогенном повреждении сосудов. Несмотря на то, что агенты, способные принимать участие в модификации ЛНП, достаточно разнообразны, наибольшую роль в этом процессе, как полагают, играют низкомолекулярные природные дикарбонилы [Меныцикова и соавт., 2008].

В процессе окислительного стресса низкомолекулярные карбонилы могут накапливаться в качестве вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов, при этом образуется малоновый диальдегид (МДА) и др. альдегиды [Ланкин и соавт., 2000-2004]. В последние годы в качестве возможных модификаторов ЛНП рассматриваются также альдегиды, образующиеся при карбонильном стрессе в реакциях автоокисления глюкозы, сопровождающих развитие сахарного диабета, причём основными карбонильными продуктами являются глиоксаль, метилглиоксаль и др. [Меныцикова и соавт., 2008]. Структуры альдегидов, генерируемых в процессе свободнорадикального окисления липидов и в процессе автоокисления глюкозы и триозофосфатов, весьма схожи, более того, метилглиоксаль и МДА являются структурными изомерами.

Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную склонность к развитию атеросклероза, причём при этом заболевании выявлена прямая корреляция между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений [Виса1а, 1997]. При этом соединения, способные связывать накапливающиеся в кровотоке дикарбонилы, могут рассматриваться как наиболее перспективные лекарственные препараты для лечения сахарного диабета. Таким образом, исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием различных природных альдегидов, представляется весьма актуальным. Настоящее исследование посвящено изучению сравнительного биологического действия природных альдегидов различного происхождения и его возможных патогенетических последствий.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является выяснение особенностей механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием низкомолекулярных природных альдегидов, образующихся при свободнорадикальном окислении липидов (на примере МДА) и автоокислении глюкозы и триозофосфатов (на примере метилглиоксаля), а также определение патогенетического значения карбонильной модификации ЛНП.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование роли первичных (липогидропероксиды) и вторичных (низкомолекулярные дикарбонилы) продуктов

свободнорадикального окисления липидов в увеличении атерогенности ЛНП (усилении захвата частиц ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда).

2. Сравнить изменение физико-химических свойств ЛНП (по изменению суммарного поверхностного заряда частиц, накоплению флуорофоров в ЛНП и окисляемости ЛНП) при модификации ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля.

3. Изучить особенности агрегации ЛНП после их модификации природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

4. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) исследовать возможность образования активных форм кислорода и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда (реакции аминогруппы апобелка с альдегидной группой).

5. С помощью иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) исследовать антигенные свойства эпитопов, образующихся в апопротеине В-100 при его взаимодействии с природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

Научная новизна

Впервые показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-100, но не при накоплении ацилгидропероксидов в наружном фосфолипидном слое частиц. При сравнительном исследовании физико-химических свойств ЛНП установлено, что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-100 и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП и значительное усиление агрегации частиц. Впервые с помощью различных методов (хемилюминесценция, спектрометрия) обнаружено генерирование активных форм кислорода при реакциях аминогруппы апобелка с метилглиоксалем. На основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов, регистрируемых методом ЭПР, предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-100 при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля. Установлено, что атерогенные (обогащенные холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными.

Практическая значимость

Полученные результаты уточняют молекулярные механизмы взаимодействия лизиновых остатков белков с МДА и метилглиоксалем и позволяют связать выявленные различия в молекулярных механизмах со степенью атерогенности ЛНП. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза. Выявленные в работе различия в антигенной

специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на нескольких научных конференциях: IV - VII Международные крымские конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 20082011), IV Конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 12-я Международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), Научно-практический симпозиум с международным участием «Свободнорадикальная медицина и Антиоксидантная терапия» (Волгоград, Россия, 2008), Всероссийская конференция молодых учёных «Окисление, Окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, Россия, 2008), 6-tli National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health" (Smolensk, Russia, 2009), Российский . национальный конгресс кардиологов (Москва, 2009), VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, Россия, 2010), а также на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ 19 января 2012 г.

Публикации

По результатам работы опубликовано б статей и 18 тезисов, ещё 2 статьи находятся в печати.

Структура работы

Диссертация имеет стандартную структуру и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы, заключение и список литературы, содержащий 158 ссылок. Работа содержит 25 рисунков и 2 таблицы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы

Для выделения ЛНП использовали сыворотку крови доноров из центра переливания крови РКНПК. Также в работе использовались образцы сыворотки крови участников клинических исследований CINDI (Таллинн. Эстония, 2009-2010 гг.) и программы ЗАО (Москва, Россия, 2010-2011 гг.). Для получения культуры моноцитов-макрофагов человека использовали цельную кровь здоровых доноров.

При проведении экспериментов применяли биохимические реактивы фирмы Sigma Aldrich (США). При проведении иммуноферментного анализа использовали моноклональные антитела к апоВ-100, полученные методом гибридизации, любезно предоставленные лабораторией клеточной инженерии РКНПК МЗ РФ (рук.Т. Н.Власик). Моноклональные антитела к метилглиоксаль-модифицированному апо-В100 были получены тем же методом совместно с лабораторией клеточной инженерии. Антитела козы к иммуноглобулинам мыши, коъюгированные с

пероксидазой хрена, фирмы ИМТЕК (РФ) или же реактивы, посталяемые фирмой Mercodia (Швеция) в составе набора для определения окисленных ЛНП.

Биохимические методы

Выделение ЛНП. К сыворотке добавляли NaBr (0,5 г на 1 мл), разливали в поликарбоновые центрифужные пробирки Beckman и наслаивали сверху раствор NaBr-PBS (16,33 г NaBr на 1 л PBS рН 7,4). Пробы центрифугировали 2ч при 41000 об/мин на ультрацентрифуге L8-M (ротор 50 Ti, Beckman), затем отбирали слой с ЛНП. На образцы повторно наслаивали раствор NaBr-PBS и центрифугировали в тех же условиях. Слой с ЛНП отбирали и диализовали при 4 °С в течение ночи против 2000 объёмов PBS рН 7,4. После диализа ЛНП стерилизовали фильтрацией (диаметр пор — 0,45 мкм). Концентрацию белка в препаратах ЛНП определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Модификация и анализ препаратов ЛНП. К препарату ЛНП (1 мг/мл) добавляли метилглиоксаль (10 мкмоль/мг белка) и инкубировали Зч в темноте при 37 °С. Затем ЛНП диализовали при 4 °С в течение ночи против 2000 объёмов PBS рН 7,4. Для модификации ЛНП с МДА использовали свежеприготовленный МДА, получаемый методом кислотного гидролиза из 1,1,3,3-тетраэтоксипропана (Requena et al., 1997). Концентрацию МДА определяли по оптической плотности при 267 нм на спектрофотометре Hitachi 220А (k,,xt З^ООМ^см'". Модификацию ЛНП МДА проводили в тех же условиях.

Определение конформационного состояния апоВ в препаратах ЛНП определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), используя буферную систему Лэммли (Laemmli et al., 1970), 4% концентрирующий и 6% разделяющий гели. Разделение проводили при силе тока 10 мА для концентрирующего геля и 20 мА для разделяющего геля. Денситометрия элекрофореграмм, окрашенных Coumassie R-250, проводилась с помощью программы OneDScan.

Суммарный поверхностный заряд частиц ЛНП оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле [Schalkwijk С. G. et al., 1998]. Для анализа использовали 1% агарозный гель. Разделение проводили в течение 1,5 часов при напряжении 90 В.

Накопление флуоресцирующих продуктов взаимодействия ЛНП с дикарбопилами регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции в пробах на спектрофлуориметре F-3000 2500201-04 (Hitachi Inc., Япония). Предварительно регистрировали спектры флуоресценции метилглиоксаль- и МДА-модифицированных ЛНП для определения длин волн экстинкции и эмиссии. Нативные ЛНП (0,8 мг/мл) инкубировали с дикарбонилами (10 мМ) в темноте при +37°С в PBS. Т.к. МДА приводит к тушению флуоресценции, определение интенсивности флуоресценции в пробах проводили после диализа (против 100 объемов PBS в течение 30 мин). Интенсивность флуоресценции измеряли относительно твёрдого флуорофора-стандарта.

Для определения накопления гидроперекисей ЛНП (50 мкг/мл) инкубировали при 37°С с 50 мкМ CUSO4. Измеряли увеличение оптической плотности при 220нм на спектрофотометре Hitachi 220А относительно начального значения. В качестве контроля использовали образец ЛНП в тех же условиях без добавления меди.

Определение продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). К образцу ЛНП (50 мкг/мл) объёмом 1 мл добавляли 0,5 мл 10% трихлоруксуснои кислоты и 1 мл 0,67% ТБК, перемешивали и инкубировали при 100°С 50 мин, затем образцы охлаждали, добавляли к пробам по 2 мл н-бутанола и интенсивно перемешивали. Пробы оставляли до расслоения фаз, оптическую плотность определяли в верхней бутанольной фазе при 532 нм на спектрофотометре Hitachi 557. Накопление вторичных продуктов выражали в пересчете наМДА (kex, 1,56x10s М"'см"').

Выделение С-15 липоксигеназы из ретикулоцитов кролика. Ретикулоцитоз у кроликов вызывали путём подкожного введения гемолитика фенилгидразина (6,25 мг/кг) в течение 4-х суток. С-15 липоксигеназу из лизата обогащенном ретикулоцитами клеточной массы крови выделяли высаливанием 55%-ным (NH4)2S04, [Ланкин и соавт., 1983], а затем подвергали последовательной очистке до гомогенного состояния (по данным электрофореза в ПААГ) [Ланкин и соавт., 1983]. Очистка грубого препарата С-15 липоксигеназы ретикулоцитов кролика до гомогенного состояния была проведена в Институте биохимии медицинского факультета Университета А.Гумбольдта (Берлин, Германия).

Ферментативное окисление ЛНП животной С-15 линоксигеназой в связи с самоинактивацией фермента инициировали при 37°С многократным внесением порций (1 ед/мл) С-15 липоксигеназы в среду, содержащую ЛНП (0,5 мг/мл), 0,154 М NaCl и 20 мМ трис-HCl рН 7,4. Накопление первичных продуктов окисления -липогидропероксидов определяли по увеличению оптической плотности при 233 нм (kcxt 25000 М"'см"') [Yagi, 1984], накопление вторичных продуктов - по образованию веществ, реагирующих с ТБК (см.выше).

Кинетические параметры образования супероксидного анион-радикала при реакции L-лизина с дикарбонилами определяли по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) до формазана. Реакцию инициировали добавлением 10 мМ метилглиоксаля или МДА к среде, содержащей 100 мкМ НСТ и 10 мМ L-лизина в 100 мМ карбонатном буфере рН 9,5. Накопление формазана определяли по увеличению поглощения при 560 нм.

Биофизические методы

Регистрацию спектров ЭПР проводили при комнатной температуре на спектрометре Е-109Е фирмы Varían (США), используя СВЧ-мощность 20 мВт, СВ-частоту 9,15 ГГц, амплитуду высокочастотной модуляции - 0,2 мТл. Запись ЭПР-спектров начинали через 1 мин после смешивания реакционных компонентов. Реакционную смесь (120 мкл) вводили в газопроницаемые тефлоновые капилляры PTFE 22 (Zeus Industrial Products, Inc., США). Капилляры помещали в кварцевую трубку; в ходе измерения через неё постоянно продували азот или воздух. Симуляцию спектров ЭПР проводили с использованием программы Simplionia (Brucker). В качестве стандарта использовали сигнал ЭПР дифенилпикрилгидразина [Thornalley, 1985].

Генерирование супероксидного анион-радикала (02') определяли на хемилюминометре Lum 5773 (Россия) в инкубационной смеси, содержащей 20 мкМ люцигенина, 15 мМ L-лизина; 15 мМ метилглиоксаля или 15 мМ МДА вЮО мМ К,Ыа-фосфатном буфере рН 7,8 по индуцированной 02" хемилюминесценции.

Инкубацию проводили в течение 10 мин при 37 °С и постоянном перемешивании среды.

Степень ассоциации ЛНП оценивали по флуктуации светопропускания луча лазерного света (длина волны 780 нм) на двухканальном агрегометре LA220 (НПФ БИОЛА, Россия) (Tertov et al, 1992). Для изучения степени агрегации образцы ЛНП (0,5 мг/мл) инкубировали при 37°С в PBS pH 7,4 при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (100 об/мин) в присутствии дикарбонилов (2мМ). Инкубацию ЛНП проводили в отсутствии супероксиддисмутазы (СОД) или с добавлением фермента (200 ед/мл).

Иммунологические методы

Определение окисленных ЛНП проводили с помощью тест-наборов Mercodia Oxidized LDL ELISA (Швеция) в строгом соответствии с протоколом производителя.

Изучение структуры модифицированных ЛНП методом твердофазного иммуноферменптого анализа. В лунки 96-луночного планшета вносили антиген (апоВ-100 ЛНП) по 10 мкг или с варьирующей концентрацией в 200 мкл PBS pH 7,4 и инкубировали при +4°С в течение ночи. Затем лунки трижды промывали раствором Tween-20 в PBS (500мкл/л). Далее вносили моноклональные антитела (б мкг в лунку или с варьирующей концентрацией) в PBS-Tween и инкубировали 1 час при постоянном перемешивании. После инкубации лунки промывали, затем вносили по 100 мкл меченых пероксидазой антител козы к иммуноглобулинам мыши (1 мкг/мл) и инкубировали 1 час при перемешивании. Планшет промывали, для проявления окраски вносили свежеприготовленный раствор 0,5 мг/мл ортофенилендиамина и 30% Н202 в 0,2 M цитратном буфере pH 5,0. Планшет инкубировали 15 мин, реакцию останавливали добавлением 25 мкл 50% H2SO4. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре Е1808 (ВЮТЕК Instruments, США) при длине волны 490 нм.

Методы клеточной биологии

Для получения культуры макрофагов человека производили забор крови доноров в стерильных условиях и выделяли моноцитарно-лимфоцитарную фракцию в градиенте фиколла-хипака [Биленко и соавт., 2003]. Подсчёт полученного количества клеток производили в счётной камере (Hemacytometer). Клетки помещали в пластиковую стерильную 24-луночную плашку для тканевых культур (Nuclon, Дания) по 5х105 клеток в мл и культивировали в С02-инкубаторе (95% воздуха/5% С02) при 37°С в течение 14 суток со сменой инкубационной среды на свежую через каждые 48 часов.

Для изучения поглощения ЛНП макрофагами культуральную среду заменяли на свежую среду 199, содержащую 10% липопротеид-дефицитной сыворотки, полученную ультрацентрифугированием (d>l,215 г/мл) [Tertov et al., 1992], а также по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 2 мМ L-глутамина, после чего вносили исследуемые образцы ЛНП. Через 7 часов инкубирования в С02-инкубаторе при 37°С удаляли среду инкубации с ЛНП, затем липиды из прикреплённых к субстрату макрофагов трижды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (3:2, по объему) [Нага, Radin., 1978]. Экстракт липидов выпаривали в вакууме и определяли содержание общего холестерина с помощью

тест-наборов Boehringer-Mannheim GmbH (Германия) на химическом анализаторе Multiscan МСС Labsystems Oy (Финляндия) при 492 нм.

Для статистического анализа данных, оценки достоверности различий с использованием t-критерия Стьюдента, определения корреляции между параметрами и пр. в работе использовалась программа Statictica 6.0 (StatSoft Inc., США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поглощение макрофагами ЛНП, модифицированных первичными и вторичными продуктами свободиорадикапыюго окисления полиеповых липидов

Изменение свойств частиц ЛНП под действием различных агентов, в т.ч. при окислении, приводит к увеличению атерогенности частиц ЛНП, т.е. усилению их захвата моноцитами-макрофагами стенки сосуда и другими типами клеток. В большинстве случаев при окислении ЛНП первичные продукты окисления -липогидропероксиды ацилов фосфолипидов и вторичные продукты их окислительной деструкции, в т.ч. МДА, накапливаются практически одновременно [Ланкин и соавт, 2007]. Очевидно, что in vivo в кровотоке циркулируют ЛНП различной степени окисленности с разным соотношением первичных и вторичных продуктов окисления, что заметно усложняет оценку роли различных продуктов свободнорадикального окисления в увеличении атерогенности ЛНП.

В соответствии с этим, следует различать собственно «окисленные» (ацилгидропероксид-содержащие) ЛНП и ЛНП, «модифицированные» природными дикарбонилами. Тем не менее, разделить «окисленные» и «модифицированные» ЛНП при использовании широко употребимых модельных систем окисления ЛНП невозможно [см. выше]. Использование животной С-15 липоксигеназы [Lankin, 2003] позволяет получить «окисленные» (ацилгидропероксид-содержащие) ЛНП без существенной примеси вторичных продуктов. Таким образом, существует метод получения из одного и того же образца как «окисленных» ЛНП - путём мягкого ферментативного окисления, так и «модифицированных» ЛНП - при помощи химической реакции с дикарбонилами. Такой подход позволил нам изучить различия в поглощении ферментативно окисленных ЛНП и МДА-модифицированных ЛНП культивируемыми моноцитами-макрофагами человека.

По данным анализа, исходный препарат ЛНП содержал 0,2 нмоль липогидропероксидов (LOOH) и 0,1 нмоль МДА на 1 мг белка (молярное отношение ЮОН/МДА= 2/1). После окисления ЛНП С-15 липоксигеназой ретикулоцитов содержание липогидропероксидов в препарате возросло до 48,1 нмоль/мг белка, а содержание МДА составило 0,6 нмоль/мг белка (молярное отношение ЮОН/МДА= 80/1). «Старение» окисленных липоксигеназой ЛНП (инкубация в 0,154 М NaCl и 20 мМ трис-HCl pH 7,4 в течение 3-х часов) приводило к небольшому снижению содержания липогидропероксидов (47,2 нмоль/мг белка), тогда как уровень МДА в среде инкубации увеличивался более чем в 15 раз (9,4 нмоль МДА/мг белка, молярное отношение LООН/МДА =5/1). Содержание липогидропероксидов в препарате МДА-модифицированных ЛНП после диализа практически не отличалось от их содержания в препарате

неокисленных ЛНП (0,3 нмоль/мг белка), тогда как содержание МДА возросло до 100,3 нмоль/мг белка (молярное отношение МДА/ LOOH = 1/334).

Окисленные животной С-15 липоксигеназой ЛНП захватывались культивируемыми моноцитами-макрофагами человека с такой же низкой эффективностью, что и нативные частицы (р>0,05; рис.2). МДА-модифицированные ЛНП, напротив, весьма активно поглощались культивируемыми моноцитами-макрофагами человека (рис.1). Накопление МДА в среде при «старении» ферментативно окисленных ЛНП сопровождалось резким увеличением захвата частиц ЛНП культивируемыми моноцитами-макрофагами человека (рис.1).

Следовательно, увеличение содержания липогидропероксидов в ЛНП не влияет на их захват культивируемыми макрофагами, тогда как поглощение макрофагами МДА-модифицированных ЛНП происходит весьма активно. Важная роль карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе подтверждается также полученными ранее данными о том, что метилглиоксаль-модифицированные ЛНП захватываются культивируемыми макрофагами человека даже с большей эффективностью, чем МДА-модифицированные частицы [Ланкин и соавт., 2007]. Таким образом, необходимо чётко различать понятия «окисленные» и «модифицированные» ЛНП, характеризуя эти частицы по содержанию конкретных продуктов свободнорадикального окисления.

Характеристика препаратов нашивных ЛНП и ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем

Изменение суммарного поверхностного заряда модифицированных ЛНП можно оценить по изменению электрофоретической подвижности частиц ЛНП в агарозном геле по сравнению с нативными частицами. Увеличение электрофоретической подвижности ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем, в агарозном геле (рис. 2) свидетельствует о том, что взаимодействие с альдегидами приводит к уменьшению суммарного поверхностного заряда частиц, вероятно, вследствие

Рисунок 1. Поглощение макрофагами человека ЛНП с различным содержанием первичных и вторичных продуктов свободнорадикального окисления: 1 — неокисленные ЛНП, 2 -ЛНП, окисленные С-15

липоксигеназой ретикулоцитов кролика, 3 - те же ЛНП после трехчасовой аэробной инкубации, 4 -МДА-модифицированные ЛНП.

окисленные

С-15

•5 15 35 55 75 95

8ПОВ-100, МКГ/МЛ

модификации положительно заряженных аминогрупп под действием дикарбонилов. Взаимодействие с МДА приводит к наибольшему изменению суммарного поверхностного заряда частиц, тогда как инкубация ЛНП с метилглиоксалем оказывает менее выраженное влияние на поверхностный заряд частиц ЛНП.

Использование 808-электрофореза в ПААГ позволяет оценить изменения в структуре апоВ-100 под действием МДА и метилглиоксаля. Модификация ЛНП дикарбонилъными соединениями может вызывать значительные изменения белковой компоненты частиц, приводя к тому, что не все молекулы апоВ-100 входят в относительно плотный разделяющий гель, очевидно, вследствие образования сшивок, значительно меняющих конформацию молекулы апоВ-100. В результате взаимодействия с исследованными дикарбонильными соединениями лишь около половины модифицированных метилглиоксалем частиц (50,3 ± 6,7% относительно нативных ЛНП) входят в разделяющий гель, тогда как после модификации под действием МДА практически все частицы ЛНП остаются на границе концентрирующего и разделяющего гелей (рис.3)

Данные, полученные при определении скорости накопления флуоресцирующих продуктов при модификации ЛНП дикарбонилами, также подтверждают тезис о более глубоких изменениях в частицах, происходящих под действием МДА. Увеличение интенсивности флуоресценции при модификации ЛНП дикарбонилами происходит после продолжительной лаг-фазы (рис.4), причём наибольшее увеличение флуоресценции наблюдается при инкубации частиц ЛНП с МДА, тогда как модификация частиц под действием метилглиоксаля приводит лишь к незначительному увеличению содержания флуорофоров в частицах ЛНП.

чМпяН

Рисунок 2.

Элеюпрофореграмма нативных и модифицированных ЛНП в 1 % агарозном геле. (1) - нашивные ЛНП, (2)-ЛНП, модифицированные метилглиоксалем, (З)-ЛНП, модифицированные МДА.

100% 50,3 ±6,7% 0%

Рисунок 3. Электрофореграмма нативных и модифицированных ЛНП ('Ж-электрофорез по Лэммли, 4% концентрирующий и 6% разделяющий гель). (1)- нашивные ЛНП, (2) - ЛНП, модифицированные метилглиоксалем, (3) -ЛНП, модифицированные МДА. Снизу представлены результаты денситометрии, показывающие, какой процент апоВ-100 относительно нативных частиц (контроль) вошёл в разделяющий гель

При образовании флуоресцирующих продуктов в ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля нами выявлены не только количественные, но и качественные различия. Спектры флуоресценции частиц ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем, существенно различаются: (рис. 5). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в химической структуре образующихся флуорофоров также существуют различия. На основании представленных данных можно сделать заключение, что физико-химические свойства ЛНП, определяемые в использованных моделях, в наибольшей степени меняются при взаимодействии частиц с МДА, тогда как метилглиоксаль оказывает менее выраженное влияние на исследованные свойства модифицированных ЛНП.

зо

25 -&20 J

1 15

| Ю

2А

Рисунок 4. Изменение интенсивности флуоресценции нативных ЛНП без добавления альдегидов (1), ЛНП с метилглиоксалем(2), ЛНП с МДА (3). Флуоресценцию нативных ЛНП и продуктов модификации ЛНП метилглиоксалем регистрировали при испускании 430 нм (возбуждение флуоресценции 350 нм). Флуоресценцию продуктов модификации ЛНП МДА регистрировали при испускании 470 нм (возбуждение флуоресг/енции 425 нм)

длина колны, мм

Рисунок 5 Спектры испускания флуоресценцг ЛНП. (1) - нашивные ЛНП, (2) -ЛНП, модифицированные метилглиоксалем, (3) -ЛНП, модифш^ированные МДА. Модификаци; ЛНП альдегидами проводили в темноте при 37"С в PBSрН 7,2. Интенсивность флуоресценции нативных ЛНП, а также ЛИ модифицированных метилглиоксалем, регистрировали при возбуждении флуоресценции Хтах = 350 нм. Интенсивноеt> флуоресценции продуктов взаимодействия ЛНП и МДА регистрировали при возбужденц срлуоресценции Хтах = 425 нм

Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что модификация частиц ЛНП дикарбонильными соединениями оказывает существенное влияние на их дальнейшее окисление. Как видно на рис.6, после модификации ЛНП метилглиоксалем наблюдается более интенсивное окисление липидной компоненты частиц ЛНП: наблюдается уменьшение продолжительности лаг-фазы по сравнению с контролем, возрастает максимальная скорость окисления и суммарная степень окисленности частиц. Модификация ЛНП в присутствии МДА, напротив, несколько снижает окисляемость частиц (рис.6). Таким образом, модификация под действием МДА, оказывающая более существенное влияние на структурные изменения в апоВ-100 по сравнению с метилглиоксалем, приводит к замедлению процессов свободнорадикального окисления липидов наружного слоя

ЛНП. В то же время, метилглиоксаль, в меньшей степени модифицирующий апоВ-100, наоборот, вызывает значительное ускорение свободнорадикальных реакции в ненасыщенных липидах модифицированных ЛНП (рис.б). Можно сделать предположение, что увеличение «жёсткости» белковой структуры ЛНП под действием МДА создаёт большие структурные препятствия дальнейшему окислению частиц, тогда как частичное «сшивание» молекул белка под действием метилглиоксаля облегчает перекисное окисление ненасыщенных липидов наружного слоя ЛНП.

Взаимодействие ЛНП с исследованными дикарбонилами приводит к усилению агрегации частиц ЛНП (рис. 7). Присутствие МДА в среде инкубации оказывало меньшее влияние на скорость агрегации частиц, тогда как присутствие метилглиоксаля ускоряло агрегацию в большей степени (рис. 7). Эти результаты хорошо согласуются с вышеприведёнными данными о влиянии этих дикарбонилов на окисляемость частиц ЛНП (рис. 6). Действительно, при образовании агрегатов ЛНП важную роль играют структурные изменения наружного липидного слоя частицы, в то время как модификация белковой части ЛНП имеет меньшее значение [Öörni et al., 2000]. В результате окисления ненасыщенных липидов наружного слоя может происходить потеря целостности частицы ЛНП, в результате чего происходит ускорение агрегации частиц [Hoffet al., 1992, Öörni et al., 2000].

0,9

§ 0,8..

1 0,7

| °-6

1 °.5-

| 0.4-h-

§ 0,3.

£ 0,2.

% 0,1, s

•-*-•-» 2

/„ —,—

„/ / /У

// /

60 80 100 время, мин

Рисунок 6. Накопление диеновых конъюгатов в процессе медь-иницгшрованного окисления нашивных ЛНП и ЛНП, модифицированных днкарбонилами. I — нашивные ЛНП, 2 — МДА-модифицированные ЛНП, 3 -метилглиоксаль-модифицированные ЛНП. На рисунке представлен характерный график, отражающий форму кривых, получаемых в серии экспериментов

_г 400

300-

I 200

=г со

# 100

120 140

1 2 3

Рисунок 7. Агрегация ЛНП в присутствии и отсутствии альдегидов после 6-часовой инкубации: 1 -нашивные ЛНП, 2-ЛНП + МДА, 3 -ЛНП + метилглиоксаль. За 100% принято значение флуктуации светопропускания нашивных ЛНП в начальный момент времени. * -достоверность отличия от контроля (р<0,05)

Следовательно, окислительные изменения в наружном липидном слое ЛНП и альдегид-зависимая модификация белковой компоненты частиц тесно взаимосвязаны. Более того, модификация белка под действием дикарбонилов способна инициировать дальнейшие окислительные превращения частиц ЛНП. Этот процесс может быть особенно значим при сахарном диабете, т.к. образующиеся при автоокислении глюкозы дикарбонилы, такие как метилглиоксаль, являются более мощными модифицирующими агентами, которые ускоряют дальнейшее окисление частиц и вызывают агрегацию ЛНП.

Генерирование супероксидного анион-радикала при взаимодействии карбонильных соединений с лизином (Генерирование АФК при карбонил-зависимой модификации аминогрупп)

Активные формы кислорода и карбонильные соединения способны вызывать модификацию аминокислотных остатков белковых молекул [Thorpe, Baynes, 2003], в том числе апоВ-100, входящего в состав частиц ЛНП. В литературе встречаются данные о генерировании свободных радикалов при взаимодействии метилглиоксаля с L-аланином [Yim et al., 1995], тем не менее, механизм этой реакции выяснен не до конца. Исходя из этого, мы исследовали процессы образования свободнорадикальных продуктов при взаимодействии аминокислот с МДА и метилглиоксалем. В качестве модельного объекта был выбран L-лизин, т.к. данная аминокислота является одной из основных мишеней действия активных карбонильных соединений в белковых молекулах [Suji, Sivakami, 2007].

На рис. 8 приведены результаты ЭПР-спектроскопии продуктов реакций L-лизина с метилглиоскалем и МДА. Видно, что при инкубации в анаэробных условиях свободнорадикальные интермедиаты удаётся зарегистрировать в реакции L-лизина с метилглиоксалем, но не с МДА. Спектры ЭПР свободнорадикальных интермедиатов, образующихся в ходе реакции L-лизина с метилглиоксалем, имеют многокомпонентную сверхтонкую структуру и, как предполагают авторы работы [Yim et al., 1995], могут являться суперпозицией спектров анион-радикала метилглиоксаля (МГл—) и катион-радикала диалкилимина. Стоит отметить, что в присутствии кислорода нами были зарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов (рис.8, спектр 2).

Замена газовой среды на азот при инкубации смеси метилглиоксаля с L-лизином приводит к значительному росту уровня свободнорадикальных интермедиатов, предположительно, диалкилимина и семидиона метилглиоксаля (рис. 9). Важно отметить, что при добавлении СОД к реакционной смеси содержание свободнорадикальных интермедиатов возрастало (рис. 9, кривая 2). Вызываемый добавлением СОД эффект может быть связан с тем, что этот фермент способен удалять супероксидный анион-радикал (02'~), генерируемый в исследуемой модельной системе.

В исследованной нами модельной системе обнаружено также, что 02" интенсивно генерируется при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем. Образование 02'~ оценивали по накоплению формазана при восстановлении НСТ в карбонатном буфере рН 9,5. Добавление СОД приводило к значительному (более чем в 4 раза) подавлению образования формазана в описанных условиях. В то же время, при взаимодействии L-лизина с МДА мы наблюдали лишь незначительное накопление формазана. Использование супероксид-зависимой хемилюминесценции

люцигенина в качестве более чувствительного метода позволило зарегистрировать образование 02' в смеси меткпглиоксаля с Ь-лизином при рН 7,8 (рис. 10), т.е. в условиях, близких к физиологическим. Добавление в среду инкубации СОД практически полностью ингибирует хемилюминесценцию люцигенина в этих условиях (рис. 10, кривая 2).

о 400-

а с о

ж О

учч 2

2,0

Ео.е

322 324 326 328 330

Магнитное поле, мТл Рисунок 8. Спектры ЭПР свободнорадикальных интермедиатов реакции Ь-лизина и дикарбонильных соединений. 1- Ь-лизин + метилглиоксаль, продувка азотом, 2- Ь-лизин + метилглиоксаль,аэрация 3- Ь-лизин + МДА. поодувка азотом

а В

о п 1 _I»,

Рисунок 9. Влияние аэрации и СОД (тёмные столбцы) на кинетику накопления свободнорадикальных интермедиатов 1 -аэробные условия 2 - анаэробные условия.

Рисунок 10. Влияние СОД на супероксид-зависимую хемилюминесценг/ию люцигенина. I Ь-лизин + метилглиоксаль; 2 - то же что и (1) + СОД (120 ед/мл).

Время, мин

Полученные нами результаты позволяют пересмотреть предложенный ранее в литературе механизм генерирования супероксидного анион-радикала при модификации аминокислот под действием метилглиоксапя [Уип е1 а!., 1995]. В соответствии с нашими предположениями (рис. 11), продукция супероксида происходит при окислении кислородом свободных радикалов шиффовых оснований лизина и метилглиоксапя. При этом 02'~ может не только образовываться, но и

расходоваться в реакциях с участием МГ'~ (рис.11). Таким образом, весьма вероятно, что окислительная модификация белков и других биомолекул может быть следствием локального генерирования супероксида при взаимодействии остатков Ь-лизина (и, по-видимому, других аминокислот) с а-кетоальдегидами.

О-

анион-радикал метилглиоксаля Н,С. ,Н

О о

Н3С н о о

метилглиоксаль

катион-радикал диалкилимина метилглиоксаля

^з^ч_/Н

-ООС(Р5)НгСЫ ЫСН2(й)СОО-

Рисунок 11.

Предполагаемая схема генерирования супероксида при взаимодействии молекулярного кислорода с МГ'- и катион-радикалом диалкилимина метилглиоксапя с Ь лизином.

МзС>-чн

-ООС(Р)Н3СЫ \ +МСНг(Р)СОО-дикатион диалкилимина

гидрокси ацетон

Важно отметить, что феномен неферментативного генерирования супероксида может влиять на физико-химические свойства частиц ЛНП, связанные с их атерогенностью, в частности, на скорость агрегации ЛНП. На рис.12 приведены результаты экспериментов, указывающие на влияние СОД на скорость агрегации ЛНП в присутствии МГл, но не МДА. Добавление СОД, которая дисмутирует 02", в среду инкубации ЛНП не оказывало достоверного влияния на скорость агрегации ЛНП в присутствии МДА (рис.12А), однако существенно снижало скорость агрегации ЛНП в присутствии метилглиоксаля (рис.12Б).

Таким образом, вторичное образование супероксидного радикала в процессе модификации белка под действием метилглиоксаля может инициировать продолжение цепного свободнорадикального окисления ненасыщенных липидов ЛНП, приводя к дальнейшему накоплению МДА и других карбонильных соединений. Удаление супероксида из среды инкубации снимает некоторые негативные эффекты, возникающие при модификации апоВ-100 метилглиоксалем: важно отметить, что при добавлении СОД в среду инкубации скорость агрегации частиц ЛНП под влиянием метилглиоксаля оказывается ниже уровня агрегации под действием МДА (рис. 12).

36 48 60 72 бремя, имя

Рисунок12 Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания ЛНП под воздействием МДА (А) и метилглиоксаля (Б) в отсутствии (1) и присутствии супероксиддисмутазы (200 ед/мл) (2). Флуктуация светопропускания в начальный момент времени принята за 100%.

Использование иммуноферментного анализа для определения антигенной специфичности антител к модифицированным ЛНП и уровня окисленных ЛНП в популяции

В процессе окислительной модификации ЛНП под действием дикарбонилов в молекуле апоВ-100 происходит образование новых эпитопов, что оказывает влияние на антигенные свойства частиц и их способность связываться с антителами различной специфичности. Для изучения антигенной структуры модифицированных ЛНП мы использовали моноклональные антитела к нативным и МДА-модифицированным ЛНП, любезно предоставленные лабораторией клеточной инженерии ФГУ РКНПК (руководитель Т.Н.Власик); кроме того, совместно с этой лабораторией нами были получены моноклональные антитела к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП. Также в ходе работы мы использовали коммерческие тест-наборы к окисленным ЛНП фирмы МегсосПа (Швеция).

Результаты взаимодействия нативных и модифицированных ЛНП различной концентрации с панелью использованных антител представлены на рис.13. Как видно на рис. 13А, антитела 4С11, специфичные к нативным ЛНП, реагируют со всеми исследованными образцами с одинаковой эффективностью. В то же время, антитела специфичные к ЛНП, модифицированным метилглиоксалем,

взаимодействуют только с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП и не реагируют с нативными и МДА-модифицированными ЛНП, а антитела 201, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, взаимодействуют только с ними, не реагируя с метилглиоксаль-модифицированными и нативными частицами (рис 13, Б и В, соответственно).

Таким образом, нами были выявлены существенные антигенные отличия частиц ЛНП после модификации МДА и метилглиоксалем. Полученные результаты

хорошо согласуются с полученными нами данными (см. выше) о существовании различий в молекулярных механизмах реакций взаимодействия метилглиоксаля и МДА с лизиновыми остатками белков и влиянии этих альдегидов на физико-химические свойства ЛНП, несмотря на сходство химических структур данных дикарбонильных соединений.

. антитела к нативным ЛНП

антитела к МГл- ЛНП

. антитела к МДА ЛНП.. В

-<►— нЛНП

МГл-ЛНП

ф.1 »\г м о.з лл М

яга ¿мл

—МДА-ЛНП

тест-наборы МегсосНа

1»1—................- -..... . —

Рисунок 13. Взаимодействие нашивных и карбонил-модифицнрованных ЛНП с различными моноклональными антителами (зависимость оптической плотности от концентрации исследуемых ЛНП). А - антитела 4С11, специфичные к нашивным ЛНП; Б - антитела 608, специфичные к метилглиоксалъ-модифицированным ЛНП; В - антитела 2СУ, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, Г - антитела 4Е6, специфичные к окисленным и МДА-модифицированным ЛНП.

Кроме того, при изучении взаимодействия нативных и модифицированных ЛНП с тест-наборами МегсосМа, нами было показано, что антитела, используемые при в наборах, наиболее эффективно связываются с МДА-модифицированными ЛНП (рис. 13Г). В то же время, при использовании высоких концентраций нативных и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП наблюдается рост оптической плотности, свидетельствующий о связывании данных образцов ЛНП с антителами. Антитела 4Е6, используемые в тест-наборах МегсосНа, специфичны как к МДА-модифицированным, так и к окисленным ЛНП (для 50% ингибирования связывания

антител в ИФА необходимо 0,025 мг/дл окисленных либо МДА-модифицированных ЛНП, в которых как минимум 60 лизиновых остатков замещены альдегидами) [Holvoet, 1999]. ЛНП, выделяемые из крови доноров, содержат небольшие количества окисленных частиц, которые, по всей вероятности, и определяются при использовании высоких концентраций нативных и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в иммуноферментном анализе.

Исходя из различий в связывании нативных и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП антителами 2G1, полученными в лаборатории клеточной инженерии ФГУ РКНПК к МДА-модифицированным ЛНП, и антителами 4Е6, используемыми в тест-наборах фирмы Mercodia, можно заключить, что, несмотря на высокую аффинность к МДА-модифицированным ЛНП, антитела 2G1 и 4Еб связываются с различными антигенами на поверхности апоВ-100, тем не менее, ни один из этих антигенов не образуется при взаимодействии частиц ЛНП с метилглиоксалем, о чём свидетельствует примерно одинаковая эффективность связывания указанных антител с нативными и метилглиоксаль-модифицированными частицами (рис. 13, В и Г)

Тест-наборы Mercodia были использованы нами для определения содержания окисленных ЛНП в сыворотке крови людей, принимавших участие в клинических исследованиях в Эстонии (г.Таллинн) и России (г.Москва). Перед включением в исследование все участники подписывали информированное согласие; в ходе обследования для каждого участника регистрировались пол, возраст, наличие вредных привычек (курение), рост, вес, артериальное давление, наличие заболеваний (сахарный диабет, артериальная гипертония, инфаркт миокарда в анамнезе и т.п.). Образцы крови участников отбирались натощак, в сыворотке крови определялись такие биохимические показатели, как общий холестерин, холестерин ЛНП и ЛВП и некоторые другие.

Результаты измерения биохимических параметров крови и определения содержания окисленных ЛНП в обеих популяциях (эстонской и российской) представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, значения биохимических параметров в обеих популяциях сопоставимы друг с другом. Уровени общего ХС и ХС ЛНП в исследованных популяциях близки к норме и сравнимы с опубликованными данными об уровне этих показателей у пациентов с ИБС [Johnston et al., 2006].

Статистический анализ полученных данных позволил нам обнаружить ряд зависимостей. Прежде всего, как и следовало ожидать, в обеих популяциях нами выявлена сильная положительная корреляция между уровнем общего ХС и ХС ЛНП (О, 87 и 0,90 для Москвы и Таллина, соответственно). Кроме того, нами обнаружена положительная корреляция между уровнем ХС ЛНП и уровнем окисленных ЛНП в образцах сыворотки крови как в таллиннской (г=0,б1; р<0,05), так и в московской (г=0,5б, р<0,05) популяциях (рис. 14). Следует отметить, что среднее значение содержания окисленных ЛНП одинаково в обеих группах (табл.1).

Можно заключить, что ЛНП, обогащенные холестерином, одновременно являются более окисленными. Таким образом, можно предположить, что окисленные ЛНП играют существенную роль в развитии атеросклероза. Кроме того, несмотря на присутствие выраженной корреляционной связи между содержанием ХС ЛНП и уровнем окисленных ЛНП, её невысокое значение (около 0,6) по

сравнению с корреляцией между уровнями общего ХС и ХС ЛНП (приблизительно 0,9) позволяет рассматривать содержание окисленных ЛНП в сыворотке крови как возможный независимый фактор риска развития атеросклероза.

Таблица 1. Результаты измерения биохимических параметров (среднее ± стандартное отклонение) в сыворотке крови пробандов._

Параметры Эстонская популяция (г.Таллинн) (п=782) Российская популяция (г.Москва) (п=1433)

Общий ХС, мМ 5.6±1.1 6.1±1.3*

ХС ЛНП, мМ 3.6±1.0 3.7±1.1*

Окисленные ЛНП, ед./л 70,6±22.0 72.4±22.7*

ХС ЛВП, мМ 1,6±0,5 1,4±0,4**

ХС ЛНП (отн.единицы) ХС ЛНП (отн.единицы)

Рисунок 14. Корреляция между уровнем окисленных ЛНП и содержанием ХС ЛНП в сыворотке крови пробандов. Средние значения уровней окисленных ЛНП и ХС ЛНП приняты за единицу. А - Московская популяция, Б - Таллиннская популяция

В исследовании московской популяции все пробанды были разделены на 3 группы в соответствии со шкалой риска развития атеросклеротических повреждений сосудов SCORE. В первой группе оказались пробанды с низким или умеренным рисом развития сердечно-сосудистых заболеваний, во второй -пациенты со средним или высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, но без клинических проявлений ИБС. В третью группу были включены пациенты с клиническими проявлениями ИБС (стенокардия, инфаркт миокарда в анамнезе).

Показано, что уровни общего ХС и ХС ЛНП были значительно выше во второй группе по сранению с первой и третьей. В то же время, значение уровня окисленных ЛНП к уровню ЛВП (окЛНП/ЛВП) оказалось существенно ниже в первой группе, в то время как во второй и третьей группах оно приблизительно одинаково.

По всей видимости, уменьшение уровня общего ХС и ХС ЛНП в третьей группе может быть объяснено применяемой медикаментозной терапией атеросклероза, преимущественно приёмом статинов. В то же время, значение уровня окисленныеЛНП/ЛВП в третьей группе было повышено, что может быть связано с тем, что статины, снижающие уровень ХС в крови, одновременно с этим интенсифицируют ПОЛ in vivo [Lankin et al., 2007].

Таким образом, определение соотношения окисленных ЛНП к ЛВП можно рассматривать в качестве значимого показателя при диагностике и определении риска развития ИБС.

Исходя из представленных данных, можно заключить, что иммуноферментное определение окисленных и альдегид-модифицированных ЛНП может быть весьма перспективным направлением при диагностике сахарного диабета и атеросклероза, а также при оценке эффективности проводимой медикаментозной терапии этих заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Атеросклероз и сахарный диабет в настоящее время занимают первое место в развитых странах среди неинфекционных заболеваний, причём около 80% больных сахарным диабетом погибают от сердечно-сосудистых осложнений. Важную роль в атерогенезе, как установлено, играет окислительный стресс и сопряжённые с ним процессы модификации ЛНП. В связи с этим, чрезвычайно важными являются исследования, направленные на понимание молекулярных механизмов первичного поражения стенки сосуда и на разработку методов ранней диагностики этих заболеваний. Исходя из этого, в настоящей работе было проведено сравнительное исследование физико-химических особенностей карбонильной модификации ЛНП, что может быть важным для понимания молекулярных механизмов первичного повреждения стенки сосуда.

Нами показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-100, но не при ферментативном окислении (накоплении ацилгидропероксидов) наружного фосфолипидного слоя частиц. Сравнительное исследование физико-химических свойств ЛНП (изменение суммарного поверхностного заряда частиц, накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, окисляемость частиц ЛНП) выявило, что МДА способствуют большему образованию флуорофоров, а также в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-100 и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП. С помощью различных физико-химических методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) мы впервые обнаружили возможность генерирования активных форм кислорода в ходе реакции Мэйларда (реакция аминогруппы апобелка с альдегидной группой). На основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов нами был предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) нами были

выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-100 при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля.

При анализе образцов сыворотки крови, полученных при проведении эпидемиологических обследований населения г. Таллинна и г.Москвы мы установили, что атерогенные (обогащенные холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза. Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.

выводы

1. Установлено, что усиление захвата частиц культивируемыми моноцитами макрофагами происходит в результате накопления вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (карбонил-зависимая модификация апоВ-100 ЛНП), в то время как увеличение содержания первичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (липогидропероксидов ацилов фосфолипидов) в ходе ферментативного окисления ЛНП не влияет на увеличение атерогенности частиц.

2. При сравнительном исследовании влияния низкомолекулярных дикарбонилов на физико-химические свойства ЛНП выявлено, что модификация под действием МДА в большей степени, чем метилглиоксаль-зависимая модификация, изменяет суммарный поверхностный заряд частиц, вызывает образование внутри- и межмолекулярных сшивок и накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, в то время как модификация под действием метилглиоксапя усиливает дальнейшую окисляемость частиц ЛНП и значительно увеличивает скорость их агрегации.

3. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) обнаружено неферментативное генерирование супероксидного анион-радикала и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда при взаимодействии аминогруппы лизина с метилглиоксалем, но не с МДА.

4. Показано, что добавление в среду инкубации СОД, дисмутирующей супероксидный анион-радикал, значительно снижает скорость метилглиоксаль-зависимой агрегации частиц ЛНП, но не оказывает влияния на скорость агрегации ЛНП под действием МДА.

5. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, не взаимодействуют с метилглиоксаль-модифицированными частицами, а моноклональные антитела, специфичные к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП не взаимодействуют с частицами, модифицированными МДА что свидетельствует о различной антигенной структуре эпитопов, образующихся при реакции апоВ-100 с данными дикарбонилами.

6. Установлено, что атерогенные (обогащенные холестерином) частицы ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными, причём отношение уровня окисленных ЛНП к содержанию ЛВП повышено в группах с высоким риском развития атеросклероза и с клиническими проявлениями ИБС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. В.З.Ланкин, А.К.Тихазе, Е.М.Кумскова. Особенности модификации липопротеидов низкой плотности в развитии атеросклероза и сахарного диабета типа 2. Кардиологический вестник, 2008, том III (XV), №1: 60-67

2. К.Б. Шумаев, С.А. Губкина, Е.М. Кумскова, Г.С. Шепелькова,Э.К. Рууге, В.З. Ланкин. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонильными соединениями. Биохимия, 2009, 74: 568-574

3. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Кумскова Е.М., Коновалова Г.Г., Власик Т.Н., Виигимаа М. Карбонильный стресс и модификация липопротеидов низкой плотности: патофизиологическое и диагностическое значение. Здоровье. Медицинская экология. Наука, 2009,4-5(39-40): 99-101.

4. М. Viigimaa, J. Abina, G.Zemtsovskaya, A. Tikhaze, G. Konovalova, E. Kumskova, V. Lankin. Malonyldialdehyde-modified low density lipoproteins as biomarker for atherosclerosis. Blood pressure, 2010, 19(3): 164-168

5. Тихазе A.K., Вийгимаа M., КоноваловаГ.Г. Кумскова Е.М., Абина Е., Земцовская Г., Янушевская Е.В., Власик Т.Н., Ланкин В.З. Взаимосвязь между наличием малонилдиальдегидзависимой модификации и содержанием холестерина в липопротеидах низкой плотности. Бюлл.Эксп.Биол.Мед., 2010, 149(2): 143-145

6. V. Lankin, M.Viigimaa, A.Tikhaze, E.Kumskova,G.Konovalova, J.Abina, G.Zemtsovskaya, T.Kotkina,E.Yanushevskaya, T.VIasik Cholesterol-rich low density lipoproteins are also more oxidized. Mol.Cell.Biochem., 2011,355:187-191

Тезисы

1. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Шумаев К.Б., Кумскова Е.М. Автокаталитический механизм модификации белков при карбонильном стрессе: возможная роль в прогрессировании атерогенеза при сахарном диабете. Тезисы IV Конгресса биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008 года, с.471

2. Кумскова Е.М., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Роль неферментативной генерации супероксида при взаимодействии ЛНП с карбонильными соединениями в механизме развития сахарного диабета. Тезисы. Волгоград, 23-25 апреля 2008 года. Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации волгоградской области. Приложение 1(2008), с. 16.

3. Кумскова Е.М., Матвеева Е.А., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Механизм образования супероксидного анион-радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонилами и его возможная роль в развитии сахарного диабета. Тезисы

12-й Международной пущинекой школы-конференции молодых учёных. Пущино, 10-14 ноября 2008 года, стр 137-138.

4. Панкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Беленков Ю.Н. Роль липопротеидов низкой плотности в этиологии и патогенезе атеросклероза и сахарного диабета. Тезисы IV Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикапьные патологии». Судак, Крым. Украина, 1-8 июня 2008 года, с.28

5. Ланкин В.З.,Тихазе А.К., Шумаев К.Б., Кумскова Е.М., Панасенко О.М.,Коновалова Г.Г., Беленков Ю.Н. Окислительная модификация липопротеидов низкой плотности при окислительном и карбонильном стрессах. Доклады и тезисы Всероссиёской конференции молодых ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты», Москва, 1-3 октября 2008 года, сс. 80-98

6. Кумскова Е.М. Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Механизм образования супероксидного анион-радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонилами. Доклады и тезисы Всероссиёской конференции молодых ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты», Москва, 1-3 октября 2008 года, сс.253-254

7. Коновалова Г.Г., Недосугова Л.В., Кумскова Е.М., Тихазе А.К., Ланкин В.З. Эффекты природных дикарбонилов на ктивность антиоксидантных ферментов. Тезисы V Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикапьные патологии». Судак, Крым. Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.31

8. Кумскова Е.М., Аксёнов Д.В., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Супероксид-зависимая агрегация ЛНП под действием природных дикарбонилов. Тезисы V Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикапьные патологии». Судак, Крым. Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.38

9. Тихазе А.К., Виигимаа М. Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Ланкин В.З. МДА-модифицированные ЛНП как биомаркер атеросклероза. Тезисы V Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Крым. Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.63

10. Lankin VZ, Tikhaze АК, Konovalova GG, Kumskova EM, Viigimaa M. Low density lipoproteins modification under oxidative and carbonyl stress. Thesis. 6-th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health" Smolensk, September 14-18,2009, p. 90.

11. Shumaev KB, Kumskova EM, Lankin VZ. The mechanism of superoxide generation under carbonyl stress. Thesis. 6-th National Scientific Practical

Conference with International Participation "Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health" Smolensk, September 14-18,2009, pp. 91-92.

12. Кумскова E.M. Атерогенность природных дикарбонильных соединений. Материалы Российского национального конгресса кардиологов. Москва, 6-8 октября 2009 года, с.203

13. Кумскова Е.М. Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Ефремов Е.Е. Ланкин В.З. Карбонил-модифицированные ЛНП: перспективы для диагностики. Тезисы VI Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Крым. Украина, 20-29 сентября 2010 года, с.35

14. Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Тихазе А.К., Кумскова Е.М. Гипергликемия провоцирует свободнорадикальное окисление ЛНП. Тезисы VI Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Крым. Украина, 20-29 сентября

2010 года, с. 39

15. Кумскова Е.М., Ланкин В.З., Аксёнов Д.В. Природа атерогенности дикарбонилов. Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 4-6 октября 2010 г., сс.235-237

16. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Шумаев К.Б., Аксёнов Д.В., Власик Т.Н., Ефремов Е.Е., Недосугова Л.В. Карбонил-зависимая модификация липопротеидов: патофизиологические последствия. Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 4-6 октября 2010 г., сс.247-249

17. Кумскова Е.М., Тихазе А.К., Ланкин В.З. Роль окислительных процессов в увеличении атерогенности частиц липопротеидов низкой плотности. Тезисы VII Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Крым. Украина, 22-30 сентября

2011 года, с. 22

18. Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Ланкин В.З. Модификация липопротеидов низкой плотности как фактор атерогенности. Тезисы VII Международной Крымской Конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Крым. Украина, 22-30 сентября 2011 года, с. 33

Подписано в печать:

16.02.2012

Заказ № 6668 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кумскова, Елена Михайловна, Москва

61 12-3/575

Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения и социального развития РФ

На правах рукописи

КУМСКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

МЕХАНИЗМЫ АТЕРОГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В. 3. Ланкин

Москва - 2012

Содержание

Содержание...........................................................................................2

Список сокращений..............................................................................4

Введение................................................................................................6

1. Обзор литературы. Окислительная модификация ЛНП при атеросклерозе и сахарном диабете......................................................и

2. Экспериментальная часть...............................................................42

Материалы и методы исследования...................................................42

Материалы..........................................................................................42

Биохимические методы......................................................................42

Биофизические методы......................................................................48

Иммунологические методы................................................................50

Методы клеточной биологии.................................................................52

Компьютерная обработка данных......................................................53

3. Результаты и их обсуждение...........................................................54

3.1.Поглощение макрофагами ЛНП, модифицированных первичными и вторичными продуктами свободнорадикального окисления полиеновых липидов...............................................................................................54

3.2 Характеристика препаратов нативныхЛНП и ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем...................................61

3.3. Генерирование супероксидного анион-радикала при взаимодействии карбонильных соединений с лизином...............................................74

3.4. Использование иммуноферментного анализа для определения антигенной специфичности антител к модифицированным ЛНП и уровня окисленных ЛНП в популяции..............................................89

Выводы............................................................................................юоо

Заключение......................................................................................1022

Список литературы.........................................................................1044

Список сокращений

АА - акриламид

АР - альдозоредуктаза

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

апоВ - апопротеин В

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГАФД - глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназа

ДАГ - диацилглицерол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИФА - иммуноферментный анализ

КПНГ - конечные продукты неферментативного гликозилирования ЛВП - липопротеиды высокой плотности ЛНП - липопротеиды низкой плотности Лп(а) - липопротеид (а)

ЛП-ФЛА2 - липопротеид ассоциированная фосфолипаза А2 МДА - малоновый диальдегид

модЛНП - модифицированные липопротеиды низкой плотности

МПО-миелопероксидаза

НСТ - нитросиний тетразолий

ПААГ - полиакриламидный гель ПАРП - поли-АДФ-рибозополимераза ПКС - протеинкиназа С

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭГ - полиэтиленгликоль

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ФЛА2 - фосфолипаза А2

ХС - холестерин

ALDH - алдегиддегидрогеназа

ELISA - иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay)

МТР - микросомный триглицерид-переносящий белок (microsomal triglyceride-transfer protein)

NAD+ - никотинамиддинуклеотид

NADPH - никотинамиддинуклеотидфосфат

NFkB - ядерный фактор кВ (nuclear factor кВ)

PAF - фактор, активирующий тромбоциты

PBS - изотонический фосфатный буфер (potassium buffer solution) SDS - додецилсульфат натрия (Sodium dodecylsulfate)

SREBP - sterol regulatory element-binding protein (белок, связывающийся со стерол-регулируемым элементом)

Введение

Актуальность проблемы

Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца - одни из наиболее частых причин смертности в развитых странах, причём основные осложнения этих заболеваний вызваны повреждением стенки сосудов. Несмотря на определённый прогресс в изучении механизмов атерогенеза, ключевые вопросы первичного поражения сосудистой стенки по-прежнему остаются далёкими от окончательного разрешения. В настоящий момент не вызывает сомнений тот факт, что липопротеиды низкой плотности (ЛНП) играют важную роль в атерогенном повреждении сосудов, являясь источником липидов, накапливающихся в стенке сосуда при атеросклерозе. На сегодняшний день одна из основных гипотез, объясняющих развитие атеросклероза, связывает начало атеросклеротического процесса с появлением в кровотоке модифицированных ЛНП, значительно отличающихся от нативных частиц по физико-химическим свойствам, причём модификация может затрагивать как белковую часть ЛНП (апопротеин В-юо), так и фосфолипидный монослой. Известно, что модифицированные ЛНП активно захватываются с помощью скэвенджер-рецепторов макрофами стенки сосуда, которые трансформируются в пенистые клетки, образуя зоны липоидоза - первичного предатерогенного повреждения сосудистой стенки [Климов, Никульчева, 1999]. Несмотря на то, что агенты, способные принимать участие в модификации апобелка ЛНП, достаточно разнообразны, наибольшую роль в этом процессе, как полагают, играют карбонильные соединения, преимущественно, низкомолекулярные альдегиды различного происхождения [Меньщикова и соавт., 2008].

В процессе окислительного стресса низкомолекулярные альдегиды могут накапливаться в качестве вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов. При этом образуются малоновый диальдегид (МДА), 4-гидроксиноненаль и другие алкенали [Ланкин и соавт., 2000-2004]. В

последние годы в качестве возможных модификаторов ЛНП рассматриваются также альдегиды, образующиеся при карбонильном стрессе в реакциях автоокисления глюкозы, сопровождающих развитие сахарного диабета. Основными карбонильными продуктами автоокисления глюкозы и триозофосфатов являются глиоксаль, метилглиоксаль, з-дезоксиглюкозон и др. [Меныцикова и соавт., 2008]. Структуры альдегидов, генерируемых в процессе свободнорадикального окисления липидов и в процессе автоокисления глюкозы и триозофосфатов, весьма схожи, такие дикарбонилы, как глиоксаль и МДА, являются гомологами, а метилглиоксаль и МДА - изомерами. Тем не менее, сравнительного исследования влияния назкомолекулярных природных дикарбонилов на свойства ЛНП, связанные с их атерогенностью, до сих пор не проводилось.

Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную склонность к развитию атеросклероза, причём при этом заболевании выявлена прямая корреляция между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений [Bucala, 1997]. При этом соединения, способные связывать накапливающиеся в кровотоке дикарбонилы, могут рассматриваться как наиболее перспективные на данный момент лекарственные препараты для лечения сахарного диабета [Gallagher, LeRoith, 2011], что свидетельствует в пользу важной роли низкомолекулярных карбонильных соединений в прогрессировании сахарного диабета и связанных с ним осложнений. Таким образом, исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием различных природных дикарбонилов, представляется весьма актуальным. Настоящее исследование посвящено изучению сравнительного биологического действия природных альдегидов различного происхождения и его возможных патогенетических последствий.

Цель и задачи исследования

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование роли первичных (липогидропероксиды) и вторичных (низкомолекулярные дикарбонилы) продуктов свободнорадикального окисления липидов в увеличении атерогенности ЛНП (усилении захвата частиц ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда).

2. Сравнить изменение физико-химических свойств ЛНП (по изменению суммарного поверхностного заряда частиц, образованию внутри- и межмолекулярных сшивок, накоплению флуоресцирующих шиффовых оснований, а также их окисляемости) при модификации ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля.

4. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) исследовать возможность образования активных форм кислорода и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда (при реакциях аминогруппы апобелка с альдегидной группой).

5. С помощью иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) исследовать антигенные свойства эпитопов, образующихся в апопротеине В-юо при его взаимодействии с природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-юо, но не при ферментативном окислении (накоплении ацилгидропероксидов) наружного фосфолипидного слоя частиц. При сравнительном исследовании физико-химических свойств ЛНП (изменение суммарного поверхностного заряда частиц, образование поперечных сшивок, накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, окисляемость частиц ЛНП) установлено, что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-юо и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП. Впервые с помощью различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) обнаружено генерирование активных форм кислорода в ходе реакции Мэйларда (при реакциях аминогруппы апобелка с альдегидной

группой), а также на основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-юо при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля. Установлено, что атерогенные (обогащённые холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными.

Практическая значимость исследования

Полученные результаты уточняют молекулярные механизмы взаимодействия лизиновых остатков белков с МДА и метилглиоксалем и позволяют связать выявленные различия в молекулярных механизмах со степенью атерогенности ЛНП, образующихся при реакциях с альдегидами, накапливающимися при свободнорадикальном окислении липидов в процессе развития атеросклероза (МДА) и при автоокислении глюкозы и триозофосфатов в процессе развития сахарного диабета (метилглиоксаль). Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза, возможно, более перспективного, чем традиционно измеряемые биохимические показатели (содержание общего холестерина и холестерина ЛНП в сыворотке крови). Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.

1. Обзор литературы. Окислительная модификация ЛНП при атеросклерозе и сахарном диабете.

Атеросклероз и связанные с ним болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из основных причин смертности населения в развитых странах, опережая рак и другие неинфекционные заболевания (Stocker, Keaney, 2004). Причиной развития атеросклеротических повреждений сосудов является нарушение липидного обмена, при котором происходит внутриклеточное и внеклеточное отложение липидов в интиме сосудов. Развитие атеросклероза связывают с увеличением общего количества липидов, циркулирующих в кровотоке: избыток липидов (преимущественно холестерина (ХС), входящего в состав липопротеидов низкой плотности (ЛНП)), откладывается в атеросклеротических бляшках, способствуя, таким образом, прогрессированию атеросклеротических повреждений сосудов [Климов, Никульчева, 1999]-

В развитии атеросклероза важную роль играют 2 класса липопротеидов плазмы крови, выполняющие различные функции - ЛНП и липопротеиды высокой плотности (ЛВП). ЛНП представляют собой сферические частицы диаметром 180-250 Â, плотностью 1,019-1,06 г/мл и относительной молекулярной массой 1800-2800 кДа (рис.1.1) [Климов, Никульчева, 1999> Меныцикова и соавт., 2001, Segrest et al., 2001]. В среднем на 1 частицу ЛНП приходится 1600 молекул эфиров ХС, 700 молекул фосфолипидов, 600 молекул свободного ХС, 170 молекул триглицеридов и единственная копия основного белка ЛНП - апопротеина В-юо (апоВ-юо) [Ôôrni et al., 2000]. Гидрофобное ядро ЛНП, состоящее из нейтральных липидов (преимущественно эфиров ХС и триглицеридов), окружено монослоем из фосфолипидов и свободного ХС.

монослой фосфолипидов

эфиры холестерина

смектическая фаза под (В-складкой апоВ-100

свободный холестерин

триглицериды

апоВ-100

неполярное липидное ядро

амфип аттические р-складки

. > Ч'. <Г ^ 4 "

амфипатические а-спирали

Рис. 1.1. Схема строения частицы ЛНП. Верхняя часть рисунка иллюстрирует организацию лииидной компоненты частиц, нижняя часть - предполагаемую организацию белковой цепи апоВ-юо на поверхности частицы (а-спирали и Р-складки, находящиеся с тыльной стороны частицы, изображены более светлыми)

Аполипопротеин В-юо - один из самых крупных мономерных белков, он состоит из 453б аминокислот и подвергается О-гликозилированию в 15 положениях [Segrest et al., 2001]. АпоВ-юо относится к необмениваемым аполипопротеинам, он практически не растворим в водной фазе и сохраняется в составе частицы в течение всей её жизни. Апо В-юо покрывает около половины поверхности частицы ЛНП и, в отличие от обмениваемых аполипопротеинов, имеет в своём составе (3-складчатые структуры, которые отличаются высокой гидрофобностью и составляют 40-50% от всей аминокислотной последовательности (рис. 1.1) [Segrest et al., 2001]. АпоВ-юо стабилизирует частицу, обеспечивает её рецепторное связывание с клетками и, возможно, участвует в регуляции размеров частиц ЛНП [Климов, Никульчева, 1999, Segrest et al., 2001]. Специфическое распределение молекул поверхностного слоя обеспечивает формирование отдельных кластеров (доменов) на поверхности частицы: апоВ-юо прочно связан с фракцией поверхностных фосфолипидов, и, по всей вероятности, контактирует с эфирами ХС в гидрофобном ядре через (3-складчатые структуры [Segrest et al., 2001], тогда как свободный ХС взаимодействует преимущественно со сфингомиелином [Oorni et al., 2000].

ЛНП образуются в кровотоке из секретируемых печенью липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП) путём гидролиза триацилглицеридов гидрофобного ядра липопротеидлипазой, удаления апобелков С и Е и части лецитина поверхностного слоя [Климов, Никульчева, 19991- Важно отметить, что одним из источников окисленных липидов в ЛНП могут быть окисленные липиды экзогенного происхождения (образующиеся в пищевых продуктах животного происхождения при кулинарной обработке), которые после всасывания в желудочно-кишечном тракте включаются в хиломикроны и транспортируются в печень, где, также как эндогенно генерируемые продукты ПОЛ, могут встраиваться в секретируемые в кровоток ЛОНП [Ланкин и соавт., 2001]. Формирование апоВ-содержащих частиц ЛОНП происходит в печени при участии микросомного триглицерид-переносящего белка (microsomal triglyceride-transfer protein, МТР) [Segrest et al., 2001]. В процессе синтеза апоВ-юо его N-концевой участок, имеющий гомологичные МТР

последовательности, формирует «липидный карман», который взаимодействует с МТР, в результате чего образуется «липидное гнездо», в котором аккумулируются липиды в процессе роста частицы [Segrest et al., 2001]. Ингибирование МТР приводит к подавлению секреции апоВ-содержащих частиц [Segrest et al., 2001].

ЛНП осуществляют транспорт эндогенных липидов, в частности холестерина, через кровяное русло в периферические ткани. В кровотоке, в присутствии кислорода и гемового железа, окисленные липиды, входящие в состав ЛОНП, могут подвергаться окислительной деструкции с обра�

Информация о работе

Кумскова, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы