Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль липид-белковых взаимодействий в атерогенных перестройках плазменных липопротеидов низкой плотности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль липид-белковых взаимодействий в атерогенных перестройках плазменных липопротеидов низкой плотности"

II«-'' тт

На правых рукописи

5- Í » •« sr ." ">

h,fWI '

КУЗНЕЦОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

РОЛЬ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ В АТЕРОГЕННЫХ ПЕРЕСТРОЙКАХ ПЛАЗМЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург

1997

Работа выполнена в отделе биохимии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН ( директор-академик РАМН, профессор Б.И.Ткаченко )

Научный консультант - академик РАМН, профессор А.Н.Климов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т.Б.Казакова доктор медицинских наук О.А.Розенберг доктор медицинских наук, профессор И.Г.Щербак Ведущее учреждение: С-Петербургский НИИ кардиологии Защита состоится "2. ^ 04 1997 г в // часов на заседании специализированного Совета Д 001.23.01 при НИИ экспериментальной медицины РАМН ( 197 376, Санкт-Петербург, ул.акад.Павлова, д. 12 ) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН ( Санкт-Петербург, ул.акад.Павлова, 12 ) Автореферат разослан 1997 г

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук Л.В.Пучкова

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Отложения липидов в стенке магистральных артериальных сосудов приводят к нарушению кровоснабжения органов, которые питаются от этих сосудов. Клинически это проявляется как ишемическая болезнь сердца ( ИБС ), инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз сосудов нижних конечностей и т.п.

Смертность и инвалидизация, связанная с нарушениями функционирования сосудов в следствие их атеросклеротических поражений, занимает одно из первых мест среди других причин смертности и заболеваемости во многих странах мира, в том числе и в России.

Общепризнано, что субстратом атеросклеротического очага являются плазменные липопротеиды низкой плотности ( ЛПНП).

В организме на поверхности ряда клеток имеются рецепторы, распознающие химически модифицированные in vitro различные белки. Ацетилированные ЛПНП не захватываются фибробластами и гепатоцитами, однако активно распознаются макрофагами ( Brown, Goldstein, 1979, 1980 ). Поскольку нагруженные холестерином клетки атеросклеротического очага в основном имеют макрофагальное происхождение (Нагорнев, 1980,Angel 1985), то поиск механизмов повреждения ЛПНП in vivo, аналогичных ацетилированию частиц этого класса in vitro, является первостепенной задачей изучения клеточно-молекулярных механизмов атерогенеза.

При сопоставлении свойств аортальных ЛПНП и липопротеидов ( ЛП ) этого же класса плазмы крови человека нами еще в 1983 г были выявлены существенные различия между этими частицами. Они касаются увеличения отрицательного заряда, обогащения продуктами перекисного окисления липидов ( ПОЛ ), вытеснения белка из липидного окружения в водное и его более плотную упаковку в аортальных ЛПНП по сравнению с плазменными (Добрецов и соавт., 1983).

Исходя из этих данных, полученных с помощью оригинальных биофизических подходов, характеризующих липид-белковые взаимодействия в частице ЛПНП, мы пришли к заключению, что плазменные ЛПНП после поступления в стенку сосуда фиксируются на ее матриксе и далее подвергаются

пероксидации, становясь в конечном итоге лигандом для макрофагальных рецепторов клеток сосудистой стенки.

К средине 80-х годов ряд исследователей установили возможность модификации ЛПНП продуктами пероксидации, секретируемыми фибробластами, гладко-мышечными клетками, эндотелиальными клетками и макрофагами , то есть клеточными элементами сосудистой стенки. Исходя из этих данных основным местом перекисного повреждения ЛПНП можно считать именно стенку сосуда.

Однако данные ОкаЬе е£ а/.( 1981 ) о прямой зависимости между тяжестью коронарного атеросклероза и содержанием продуктов окисления липидов в составе именно плазменных ЛПНП, дали основание для более детального изучения глубины перекисного повреждения ЛПНП плазмы крови у больных ИБС и оценки степени изменений липид-белковых взаимодействий в ЛП-частицах этого класса.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель работы состояла в изучении особенностей липид-белковых взаимодействий в частицах ЛПНП как у здоровых людей, так и у больных ИБС. Конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Разработать критерии модификаций липопротеидных частиц;

2. Выявить взаимосвязи между изменениями липид-белковых и белок-белковых взаимодействий в ЛПНП и их пероксидацией;

3. Сравнить глубину пероксидации ЛПНП здоровых людей и больных ИБС, в том числе в составе аутоиммунных комплексов ЛПНП-антитело;

4. Изучить влияние гиполипидемической терапии на структурную организацию ЛПНП и их пероксидацию.

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА. На основании полученных данных сформулированы представления о ведущей роли структурно-измененных, а также предмодифицированными продуктами ПОЛ плазменных ЛПНП в атерогенезе.

Сопоставлены различные критерии модификации ЛПНП продуктами пероксидации липидов. Выявлено, что у больных ИБС в плазменных частицах блокировано менее 16 % остатков лизина апоВ ( меньше той критической величины, при которой катаболизм ЛПНП переключается с В,Е-рецепторного на скевенджер-рецепторный ), а в составе аутоиммунного комплекса - более 20 %.

Перекисное повреждение плазменных ЛПНП инициируется снижением их в размерах и как следствием изменением упаковки белка в частицах, то есть нарушением липид-белковых взаимодействий в них.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Работа является теоретическим исследованием. Вместе с тем отдельные ее положения имеют прямое отношение к клинической практике. Разработанные подходы позволяют выявлять пациентов,имеющих модифицированные по физико-химическим свойствам ЛПНП. Модификация частиц зависит от их перекисного повреждения и изменения в размерах. Нормализация этих двух параметров путем приема препаратов ЛИПОСТАБИЛ или НИКОТИНОВАЯ КИСЛОТА, а так же путем хирургической коррекции ( операция частичного шунтирования тонкой кишки ) является одним из путей профилактики и лечении больных ИБС.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты, представленные к защите, опубликованы в 45 печатных работах в отечественных и международных научных журналах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Представленные в диссертации результаты в основном получены в отделе биохимии ИЭМ, где неоднократно докладывались на научных семинарах отдела, заседаниях Ученого Совета института. Кроме того, основные положения работы были представлены на ряде конференций, съездов и симпозиумов:

I. Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Киев, 1983

2. Конференция "Направленный транспорт и иммобилизация биологически активных препаратов для клинической практики", Киев, 1983

3. Всесоюзное совещание "Люминисцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение ", Рига, 1985

4. Симпозиум " Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетке", Пущино, 1985

5. Всесоюзный съезд кардиологов, Москва, 5 985

6. заседание Всесоюзного семинара " Молекулярная физика и биофизика водных систем ", Ленинград, 1986

7. заседание секции биофизики ЛОЕ, Ленинград, 1987

8. Международный симпозиум "Новые методы в лечении атеросклероза ", Дагомыс, 1988

9. Научная конференция " Биохимия - медицине", Ленинград, 1988

10.6-ой Дрезденский липидный симпозиум, Дрезден, 1988

11.Симпозиум " Проблемы клинической энзимологии ", Ужгород,1989

12.заседание секции биофизики ЛОЕ, Ленинград, 1989

13.конгресс Венгерского атеросклеротического общества, Шопрон, 1990

14.заседание Ленинградского отделения ВБО, Ленинград, 1990

15.заседание Европейского атеросклеротического общества, Лиссабон, 1991

16.Совещание экспертов по проблемам атеросклероза, Иваново, 1991

17.международный симпозиум по атеросклерозу, Чикаго, 1991

18.совещание " Люминисцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение ", Москва, 1992

19.конгресс Европейского кардиологического общества, Барселона, 1992

20.Научное совещание по изучению препарата "Липостабил", Москва, 1992

21.7-ой Дрезденский липидный симпозиум, Дрезден, 1994

22.6-ой симпозиум по биохимии лнпндов, С-Петербург, 1994

23.международный симпозиум по атеросклерозу, Монреаль, 1994

24.Российская научая конференция " Антигипоксангы и ангиопротекторы", С-Петербург, 1994

25.IV конференция нефрологов " Проблемы ХПН ", Иматра, 1995

26.Симпозиум, посвященный 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аничкова, С-Петербург, 1995

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНЕСЕННЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В плазме крови больных ИБС и пациентов с повышенниым риском развития этого заболевания, в отличие от здоровых людей, присутствуют ЛПНП, имеющие ослабленные липид-белковые взаимодействия.

2. Изменения в характере упаковки белка в частицах ЛПНП у больных ИБС обуславливают их повышенную склонность к пероксидации и агрегации.

3. Глубина перекисиой модификации апоВ-100 в составе плазменных ЛПНП у лиц с ИБС не является критической для переключения катаболизма ЛПНП с В,Е-рецепторного на скевенджер-рецепторнкй.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 223 страницах машинописного текста, диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 25 рисунками, включает 499 библиографических источников.

Работа содержит: список сокращений, оглавление, 3 главы (' обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования ), заключение, выводы и список литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили плазменные и аортальные ЛПНП человека, а также рекомбинанты апоВ с липидами.

Липопротеиды низкой плотности получали путем ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте бромистого натрия (Chapman et а!., 1981; Лозовский и соавт., 1987), в самогенерирующемся градиенте плотности NaCl-NaBr ( Chung et al., 1980 ). Кроме того применяли различные варианты флотации липопротеидов в разных условиях и в разных роторах (ультрацентрифуги "Beckman" моделей L-2, L-8 и ротора 50 Ti, 70 Ti, SW 40, VTi 50).

В ряде случаев липопротеиды получали путем иммуноаффинной хроматографии с использованием в качестве лиганда сшитых с сефарозой антител против нативного апоВ, модифицированного малоновым диальдегидом апоВ, а также против апоЕ.

Антитела против модифицированного апоВ и против апоЕ были любезно предоставлены И.Н.Трахтом ( Кардиологический научный центр, Москва ).

Антитела против нативных ЛПНП получали путем иммунизации кроликов дважды флотированными ЛПНП , имеющими плотность в диапазоне 1,0301,045 г/мл, и последующей хроматографией на ЛПНП-сефарозе. Дня связывания ЛПНП или антител использовали сефарозу 4В, активированную CNBr. В ряде случаев в качестве матрицы применяли аминогексилсефарозу и лиганды пришивали с помощью водорастворимого карбодиимида.

Критериями того, что изолированные частицы являются именно ЛПНП были:

1. р-подвижность при электрофорезе на ацетат-целлюлозе при окраске как на белок, так и на липид;

2. Скорость флотации в диапазоне Sf 0-12 при аналитическом ультрацентрифугировании в растворе NaBr, имеющем плотность 1,063 г/мл;

3. Элюция с колонки, заполненной сефарозой 4В , при Ve /V0 = 1,5 ( в качестве элюента использовался раствор 0,15 М NaCl, содержащий 0,05 М трис-НС1, pH 7,4 );

4. Взаимодействие с коммерческими антителами против апоВ ( фирма "Boehring Mannheim mbH", Австрия ).

Липопротеиды высокой и очень низкой плотности получали путем ультрацентрифунирования по способу Havel et al. ( 1955 ).

Присутствие в образцах липопротеидов низкой плотности ЛП(а) детектировалось по наличию липопротеидных частиц, имеющих плотность около 1, 07-1,08 г/мл при ультрацентрифугировании в ступенчатом градиенте плотности NaBr в бакетном роторе. Для визуализации липопротеидов использовали гидрофобный краситель судан IV.

ЛПНП разделяли на легкие и тяжелые путем ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности NaBr в бакетном роторе ( 4,5 мл ЛП в плотности 1,07 г/мл; сверху 4 мл раствора с плотностью 1,04 и на самом верху 4,0 мл с плотностью 1,02 г/мл ) при 35 000 об/мин, 20 час; 18°С, ротор SW-40.

АпоВ-100 изолировали из ЛПНП, разрушенных детергентами с помощью гель-фильтрации на сефарозе 4 В ( Helenius, Simons,1971). Его молекулярная масса составляла около 500 кД.

Протеолипосомы готовили путем смешивания липидов ( сухая липидная пленка фосфолипидов, содержащая и несодержащая холестерин ) с апоВ-100 в 1 % растворе дезоксихолата натрия и последующей гель-фильтрацией на сефарозе 4 В.

АНАЛИЗ ЛДНП И ПРОТЕОЛИПОСОМ ВКЛЮЧАЛ:

1. Оценку гидродинамических характеристик частиц с помощью аналитического ультрацентрифугирования, корреляционной лазерной спектроскопии ( Лозовский и соавт.,1985 ), светорассеивания ( Безрукова, Розенберг, 1981 ).

2. Определение электрических параметров липопротеидных частиц с помощью электрофореза без поддерживающей среды. электрофореза на ацетат-целлюлозе, изоэлектрического фокусирования в агарозе, связывания зонда АНС в среде с высокой и низкой ионной силой раствора - способ "солевого удара" ( Добрецов, 1989 ).

3. Определение доли различных вторичных структур белка по данным спектров кругового дихроизма ( Болотина и соавт., 1980 )

4. Детектирование продуктов перекисного окисления липидов по интенсивности их флуоресценции при возбуждении 365 нм и испускании 430440 нм ( Добрецов и соавт., 1983 ), а также по определению гидроперекисей липидов в реакции с йодным реактивом ( El-Saadani et а!., 1989).

5. Определение доли остатков триптофана, гистидина и лизина, локализованных в липидной или в водной фазах липопротеидной частицы (Добрецов и соавт., 1983,1984; Ригегти,1986; ЭльКарадачи и соавт., 1983, Udenfried et al., 1972 ).

6. Оценку взаимодействия ЛПНП с культурой клеток фибробластов легкого человека и мышиных перитонеальных макрофагов по скорости переэстерификации |4С-олеиновой кислоты (Brown, Goldsteinetal., 1979).

7. Определение скорости выведения из кровотока кролика 1251-меченых липопротеидых частиц ( Shepherd et al., 1976 ).

Флуоресцентные измерения проводились на спектрофлуориметрах Hitachi 650-30, MPF-4, Aminco SPF-500, Perkin-Eimer 500, фазовом флуориметре разработки ГОИ им.акад.С.И.Вавилова. Использовались как стандартные

флуоресцентные зонды или тушители флуоресценции ( 1-аншшнонафталин-8-сульфонат или АНС, акриламид, пирен фирмы "Sigma" ), так и синтезированные в нашем отделе дифенилгексатриен, 5,7,9 (11)-холестатриен-Зр-ол, дибромхолестерин) и любезно предоставленные нам Ю.Д.Холодовой (астрофлоксин ) и Г.Е.Добрецовым ( диметиламинохалкон ).

Другие дополнительные методы включали ЯМР на ядрах *Н как в обычном, так и импульсном вариантах (Безруков и соавт.,1985 ), электронную микроскопию ( Бобрышев, Кузнецов, 1989), изучение взаимодействия липопротеидов с бислойными липидными мембранами ( Марценюк и соавт.,1987; Гринфельд и соавт.,1995 ).

Общий холестерин, триглицериды и а-холестерин в плазме крови определяли на автоанализаторе " Technicon АА-2" ( В.Ф.Трюфанов, Л.Е.Васильева, Е.Я.Маграчова ).

В работе использовали плазму крови практически здоровых людей, больных ишемической болезнью сердца, документированной коронарогра-фически, лиц с различными типами дислипидемий (И.В.Криворученко, Б.М.Липовецкий, В.О.Константинов, Т.И. Макеева, .В. Смирнов ).

Математическое моделирование и статистические расчеты проводили на компьютерах Hewlett-Parkard и IBM с использованием как оригинальных (В.Т.Лозовский, Б.В.Миссюль, С.Л.Плавинский) так и коммерческих программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. ЛПНП здорового человека

В ходе работы были получены данные о ряде физико-химических характеристик ЛПНП здоровых людей ( Табл. 1 ).

Суммируя их необходимо подчеркнуть, что ЛПНП представляют собой сферические частицы с радиусом от 6 до 15 нм, покрытые водной оболочкой, толщина которой составляет примерно 2 нм. Последнее указывает на то, что гидратная оболочка частицы является многослойной в отличие от глобулярных белков. Это может быть обусловлено тем, что места гидратации у липопротеидной частицы различны по своей природе и разнесены друг от друга на значительное расстояние.

Табл. 1 .Физико-химические свойства ЛПНП здоровых людей.

ПАРАМЕТРЫ ИХ ЗНАЧЕНИЯ

1. Оптические характеристики

относительный показатель светопреломления 1,12 ±0,02

инкремент показателя преломления 1,49 ±0,03

2. Гидродинамические свойства

коэффициент диффузии (см/см2) 2,47 х 10"*

средне-числовой радиус (нм) 9,85 ± 0,24

скорость флотации (см/сек 10"в, 1,063 г/мл) 6,00 ±0,10

средне-весовая молекулярнаямасса (кД х 103) 2,58 ± 0,23

3. Свойства поверхности частицы

толщина гидратной оболочки ( нм) 2 ±1

гидратация ( г Н20/ г ЛП ) 1,30 ±0,05

подвижность липидов поверхности 0,36 ± 0,04

глубина погружения В-кольца ХС в поверхностный липидный монослой (нм) 1,0 ±0,1

среднее расстояние между остатками триптофана и холестерином (нм) 3,0

подвижность остатков триптофана белка 0,15 ±0,03

точка излома графика интенсивность триптофано-вой флуоресценции - температуря (°С) 30 ±3

4. Электрические параметры

изоэлектрическая точка 5,8 ±0,2

поверхностный потенциал ( тУ ) 7±3

5. Вторичная структура белка ( % )

а-спираль 39 ± 6

Р-изтибы 15 ± 2

(3-параллельная структура 12 ± 1

Р-антипараллельная структура 15 ± 2

неупорядоченная конформ^ция 19 ± 10

6. Подвижность липидов ядра частицы 0,16 ±0,02

7. Подвижность продуктов ПОЛ 0,24 ± 0,03

8. Катаболитические характеристики

Т1/2 элиминации 1251-ЛПНП из кровотока кролика (час) 5,7 ± 0,3

Подвижность флуорофоров определялась по поляризации флуоресценции диметиламинохалкона, остатков триптофана апоВ, перилена и продуктов ПОЛ, имеющих Х„»-=365 и Хка.=430 им.

Полученные данные о средних размерах ЛПНП полностью совпадают с результатами других исследователей, использовавших в своей работе электронную микроскопию, малоугловое рассеивание нейтронов, рентгеновских лучей, аналитическое ультрацентрифугирование, корреляционную лазерную спектроскопию и композиционный анализ частиц (Forte, Nichols,1972; Matea et a!.,1972; DeBlois et al., 1973; Laggner et al., 1981; Oeswein, Chen, 1973).

По нашим данным около 40 % поверхности частицы покрыто белком. Доля белка, имеющего конформацию ß-структур, является постоянной, а а-спиралей и неупорядоченных структур варьирует у различных людей. Около 80 % остатков лизина апоВ экспонировано в водное окружение, а около 20 % - в липидное. Остатки гистидина апоВ-100 в составе ЛПНП имеют рК 6,10, а также 6,25 и их соотношение близко к единице. Сегменты апоВ-100, содержащие остатки триптофана, окружены фосфолипидами и в пограничный липидный слой практически не входит холестерин.

2. Стабильность липопротеидных частиц in vitro и факторы ее определяющие

Важнейшей характеристикой коллоидно-дисперсионных систем, к которым относятся и липопротеиды, является их устойчивость во времени.

Вопрос о механизмах коагуляции ЛПНП представляется важным и по той причине, что в стенке аорты часть липопротеидов этого класса находится в агрегированном виде ( Smith, 1973 ).

Было установлено, что изолированные путем ультрацентрифугирования ЛПНП в процессе хранения при 4°С в 0,15 М растворе NaCl, имеющем рН 7,4, приобретают способность к увеличению способности рассеивать свет. Анализ спектров мутности согласно теории Кленина ( Кленин и соавт., 1977 ) позволил сделать заключение о том, что частицы слипаются по идеализированной схеме: 1 + 1, 2 + 1, 3 + 1 и т.п. Полувремя быстрой фазы составляет 3 х 103 сек, средний диаметр агрегатов равен 1000 ± 300 нм и их доля достигает 20-30 % через 20 дней после получения ЛПНП.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что после проникновения в сосудистую стенку частицы из-за своей физической нестабильности могут формировать агрегаты, которые активно захватываются клетками ( Попов и соав.,1983; Tertov et al.,1992 ), то есть инициировать формирование атеросклеротического очага.

Кроме размеров изучали и другое характеристики ЛПНП в зависимости от времени их хранения. Из данных, представленных в таблице 2 видно, что старение частиц проявляется в том, что в них:

1.Исчезают каротиноиды, эндогенные антиоксиданты, поскольку снижается оптическая плотность в их максимуме поглощения ( 500 нм ).

2. Накапливаются продукты ЛОЛ: малоновый диальдегид, гидроперекиси липидов, флуоресцирующие хромофоры ( Хта.х 365 и 440 нм для возбуждения и испускания, соответственно ).

3. Модифицируется белок, поскольку снижается содержание аминогрупп и возрастает отрицательный заряд ЛП ( увеличивается подвижность при электрофорезе на ацетат-целлюлозе и снижается эффективная изоэлектрическая точка при хроматофокусировании).

Происходит смещение белка из липидного окружения в водное (возрастает доля остатков триптофана, доступных для акриламида), "слущивание" его на поверхности частицы ( падает доля поверхности, покрытая белком ) и снижается доля упорядоченных структур (а-спирали и Р-структуры ).

5. Снижается квантовый выход флуоресценции триптофана и зонда АНС из-за тушения продуктами ПОЛ.

Табл.2. Биофизические характеристики изолированных ЛПНП донора в процессе их хранения при 4°С в 0,15 М ЫаС1, рН 7 ( п=2-5 ).

Измеряемые параметры время, дни

0 7 12 21

оптическая плотности при 500 нм 0,34 0,22 0,19 0,09

гидроперекиси липндов нмоль/мг белка 5,6 7,5 12,8 22,4

малоновый диальдегид нмоль/мг белка 0,8 2,0 3,8 5,3

флуоресцирующие продукты пероксидации, % 100 . 137 519 998

аминогруппы, % 100 91 76 59

эффективная изоэлектрическая точка 5,7 5,6 4,2

число остатков триптофана, доступных для акриламвда 16 21 24 27

площадь поверхности частицы, покрытая белком, % 44 32 25

вторичная структура ( % )

а-спираль 33 31 29 19

Р-структуры 40 40 25 17

относительный квантовый выход триптофановой флуоресценции 0,13 0,11 0,09

относительная площадь спектра флуоресценции зонда АНС, % 100 63 23

Таким образом установлено, что предкоагуляционные изменения ЛПНП обусловлены изменением характера липид-белковых взаимодействий в

частицах из-за спонтанной та пероксидации. Это инициирует гидрофобные взаимодействия между частицами и их агрегацию.

З.Повреждение липопротендов в организме человека продуктами пероксидации липидов

Было установлено, что изолированные путем ультрацентрифугирования ЛПНП пациентов с ИБС содержат в своем составе больше флуоресцирующих продуктов ПОЛ по сравнению с частицами этого же класса здоровых людей. Отмечалась прямая взаимосвязь между способность ЛПНП рассеивать свет и содержанием в них продуктов ПОЛ ( Табл.3 ). Поскольку выделение ЛПНП путем ультрацентрифугирования является длительной процедурой, в течение которой возможно окисление частиц, то использовался более быстрый иммуноаффинный способ их получения.

Было выявлено, что содержание гидроперекисей липидов выше в апоВ-липопротеидах пациентов с ИБС, хронической почечной недостаточностью (ХПН) и диабетом по сравнению с липопротеидами этого класса здоровых людей (Табл.4).

Еще один способ быстрого выделения липопротендов состоял в их осаждении гепарином в присутствии ионов марганца ( Вигаеш, БсЬоЫск, 1973).

Было установлено, что резкое повышение гидроперекисей липидов в составе апоВ-липопротеидов характерно только для пациентов с IV типом гиперлипопротеинемии. С другой стороны, около 70 % обследованных пациентов в каждой группе имели или среднее или повышенное значение фактора пероксидации ( Табл.5 ), что можно расценивать как состояние оксидативного стресса и необходимости лечения антиоксидантами.

В опытах на крысах, кормленных холестерином, было показано, что пробукол снижал содержание гидроперекисей липидов апоВ липопротендов, изолированных из 1 мл плазмы крови, с 13 до 7 нмоль/мл. Аналогичным эффектом у людей обладал и препарат липостабил: гидроперекиси апоВ-липопротеидов снижались с7±2доЗ±2 нмоль/мл спустя 2 недели после

приема препарата ( n = 11, р < 0,01 ). Никотиновая кислота такого действия не проявляла.

Если в составе ЛПНП продукты ПОЛ поровну распределены между липидами и белком ( Koller et al., 1986 ), то это может означать, что в ЛПНП здоровых людей с апоВ связано 7-8, а в ЛПНП пациентов с IV типом дислипопротеинемии 14-16 молекул гидроперекисей липидов. Средняя глубина модификации остатков лизина апоВ в первом случае составляет около 2 %, а во втором около 4 %. Поэтому нет ничего удивительного в том, что нам не удалось выявить достоверных различий в содержании аминогрупп белка ЛПНП у здоровых людей и больных ИБС (Табл.3 ).

Табл.З.Пероксидация ЛПНП плазмы крови здоровых людей и больных ИБС

Название параметра липопротеиды

больных ИБС здоровых людей

Продукты ПОЛ, определяемые по интенсивности флуоресценции при >.,„6 =365 нм, А.„г„. =430 нм (отн.ед.) 198 ±56 100 ±23

интенсивность светорассеивания при 400 нм под углом 90" (отн.ед.) 234 ±21 100 ±35

аминогруппы, % 93 ±6 100 ±7

Липиды плазмы крови (мг/дл общий холестерин) 242 ± 15 228 ±6

триглицериды 188 ± 24 128 ± 16

а-холестерин 47 ±3 58 ±4

Число обследованных 19 11

Табл.4. Содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ ) в аффино-изолированных апоВ-липопротеидах

Объект получения ЛП п гидроперекиси (нмоль/мг белка)

Плазма здоровых И 4±4

Плазма больных ИБС:

а. Нормальное содержание ГПЛ 5 4±2

б. Высокое содержание ГПЛ 17 9±2

Плазма больных ХИН 3 14±3

Плазма больных диабетом 2 13±4

ХПН-хроническая почечная недостаточность

Для потери способности узнаваться В,Е-рецепторами и приобретения способности узнаваться скевенджер-рецепторами необходима блокада более 16 % остатков лизина апоВ в составе ЛГГНП ( Haberland et al., 1984; Lund-Katz et а!., 1989 ). Поэтому липопротеиды низкой плотности пациентов с ИБС были нами названы предмодифицированными продуктами ПОЛ (Кузнецов и соавт.1989). Синонимом этому термину является выражение "минимально-модифицированные" ЛПНП (Berliner et al., 1990).

Незначительную глубину модификации плазменного апоВ у лиц с ИБС продуктами ПОЛ вряд ли можно расценивать как инициирующую атерогенез, то есть накопление ЛПНП в клетках сосудистой стенки. С другой стороны, если слабо-окисленные ЛПНП в отличие от неокисленных и сильно-окисленных частиц, вызывают активную экспрессию так называемых адгезивных молекул на поверхности эндотелия ( Leake et al., 1991 ), то их роль в проникновении моноцитов из кровотока в сосудистую стенку может быть одной из определяющих начальные стадии формирования атеросклероти-ческого очага.

Табл.5. Липиды и гидроперекиси липидов у обследуемых пациентов.

Параметры тип дислипопротеинемии

N На ПЪ IV

число обследуемых 59 11 2 13

липиды плазмы крови ( мг/дл )

общий холестерин 213±б 338±28 421±70 230±14

триглицериды 119±б 117±16 244±6 282±15

а-холестерин 48±1 52±5 41±15 35±4

гидроперекиси (нмоль/мл плазмы крови ):

суммарные 25±1 33±5 35±2 42±7

апоВ-ЛП 9±1 16±4 17±2 17±4

гидроперекиси (моль/частица апоВ-ЛП): 7±1 7±2 6±1 17±7

значение фактора пероксидации (%):

низкое 31.0 20.0 0 25.0

среднее 55.2 20.0 50.0 33.3

высокое 13.8 60.0 50.0 41.7

* - фактор пероксидации получен методом главного фактора с вращением матрицы по методу Varimax и отражает сочетанные изменения концентрации различных показателей пероксидации, вызванных одной, но неизвестной причиной ( Jahn, Hale, 1970 ). Представлена доля пациентов с различным значением этого фактора в каждой группе.

Следует отметить, что у лиц с ИБС помимо ЛПНП отмечается повреждение продуктами перекисного окисления липидов и эритроцитарных белков ( Santos-Silva et al., 1995 ), что подтверждает наличие оксидативного стресса у таких больных, отмеченного еще в 70-х годах ( Ланкин и соавт., 1976,1980; Калмыкова и соавт., 1970, 1982; Воскресенский,Левицкий, 1970; Бурлакова, 1980).

В защите ЛПНП от окисления важную роль играют ЛПВП ( Климов и соавт., 1987 ). Нам удалось выявить обратную корреляционную зависимость между содержанием гидроперекисей липидов в апоВ-липопротеидах и уровнем a-холестерина плазмы крови ( г = - 0,42; р < 0,01; п = 116 ). Эти данные указывают на то, что in vivo уменьшение содержания в крови ЛПВП, помимо снижения обратного транспорта ХС из периферических клеток в печень, инициирует и повышенный уровень окисления ЛПНП.

4. Размеры частиц липопротеидов низкой плотности

К началу нашего исследования ( 1983 г ) было известно, что у лиц с гиперхолестеринемией диаметр частиц ЛПНП увеличен по сравнению с частицами этого же класса здоровых людей ( Mills et al., 1974 ).

При анализе изолированных плазменных ЛПНП людей с нормолипиде-мией, гипертриглицеридемией и комбинированной гиперлипидемией с помощью корреляционной лазерной спектроскопии было выявлено три типа распределения липопротеидных частиц по радиусу. Для первого ( тип А ) характерно преобладание частиц с радиусом 9,0-11,5 нм, для второго (тип В ) -7,0-9,0 нм, для третьего ( тип С ) - 7,0-9,0 и 11,5-15,0 нм. То есть в первом случае доминировали средние по размерам частицы, во втором - мелкие, а в третьем отмечалось уширение распределения за счет увеличения доли как мелких, так и крупных частиц и снижения средних по размерам ( Рис. 1 ). У лиц с гиперхолестеринемией преобладали частицы с радиусом 11,0-15,0 нм и их доля составляла 50 ± 11 % ( п =4 ).

Сопоставление уровня общего холестерина и триглицеридов плазмы крови с типом распределения ЛПНП по радиусу позволило сделать вывод о том, что распределение типа А характерено для здоровых людей с нормолипидемией, типа В - для больных ИБС на фоне нормолипидемии или гипер-триглицеридемии, типа С - для больных ИБС на фоне умеренной гиперлипидемии.

61 7. А

' 17 % 22 X •

' 50 7. 30 % В

20 %

24 7. ■ 60 7. С

26 X

7 9 II 13 15

Р А Д И У С ( ш )

Рис.1. Типы распределения частиц ЛПНП по радиусу.

Внутри каждого столбика гистограммы представлена доля частиц в процентах.

Рис.2. Распределение ЛПНП по скорости флотации до и после различных способов лечения. Злак (+ ) на разностной кривой между профилями флотации до и после лечения обозначает увеличение концентрации компонентов спектра, а знак ( - ) - уменьшение.

Отмечалось соответствие в величине среднего радиуса частиц и их средней скорости флотации. В случае первого типа распределения ЛПНП по радиусу преобладали частицы со скоростью флотации ( Sf ) около 6 ( здоровые люди без ИБС ), в случае второго - со скоростью флотации 2-3 ( пациенты с нормолипндемией и ИБС, а также с гипертриглицерцдемией и ИБС ), третьего -около 6 ( пациенты с комбинированной гиперлипидемией и ИБС ).

Если учесть данные о зависимости между окисляемостью ЛПНП in vitro, индуцированнной ионами меди, и их размерами ( DeGraaf et al., 1990 ), то полученные результаты могут свидетельствовать о том, что снижение радиуса ЛП-частиц у лиц с ИБС является фактором, определяющим перекисное повреждение апоВ. По нашим оценкам при одинаковом содержании продуктов ПОЛ на 1 частицу ЛПНП их концентрация на единицу объема ( на число доступных для модификации аминокислотных остатков ) будет в 4 раза выше в самых мелких по размерам частицах по сравнению с самыми крупными.

После лечения больных ИБС липостабилом и никотиновой кислотой отмечалось укрупнение ЛПНП. Такой же эффект наблюдался и после операции частичного шунтирования подвздошной кишки у пациентов с ожирением, которое является фактором риска ИБС ( рис.2 ).

Препаративное разделение ЛПНП здорового человека на легкие и тяжелые ( крупные и мелкие, соответственно) позволило установить, что первые менее склонны к агрегации, нежели вторые. У пациентов с ожирением выявлялись мелкие и склонные к агрегации ЛПНП, однако содержание продуктов ПОЛ в них не отличалось от такового в ЛПНП здоровых людей. Отсюда можно сделать вывод о том, что снижение размеров ЛПНП является самостоятельным фактором нестабильности липопротеидных частиц этого класса. Накопление в плазме крови мелких ЛПНП у больных ИБС на фоне нормолипидемии помимо предмодификации продуктами ПОЛ вносит дополнительный вклад в снижение агрегационной стабильности частиц.

5.Свойства апоВ-100 в протеолипипосомах.

Эффект холестерина.

В 1983 г нами были получены и охарактеризованы протеолипосомы, содержащие апоВ ( Климов и соавт., 1983 ). Изучались свойства белка в составе

лецитиновых и холестерин-лециткновых липосом. Было установлено, что конформация белка более упорядочена в фосфолипидных липосомах, нежели в холестерин-фосфолипидных. Кроме того в первых апоВ занимал большую площадь поверхности, чем во вторых.

В лецитиновых липосомах остатки триптофана белка были более подвижны и менее заглублены в липид по сравнению с холестеринлецитиновыми.

В целом конформационные свойства апоВ были более сходны в ЛПНП и холестерин-лецитиковым липосомах по сравнению с лецитиновыми липосомами ( табл. 6 ). Это можно объяснить тем, что, конденсируя фосфолипидный монослой частицы, холестерин сжимает молекулу белка и тем самым задает ей определенную вторичную структуру. Эта структура белка существенна для узнавания протеолипосом В,Е-рецептором. Как видно из данных, представленных в таблице, апоВ-лецитиновые липосомы элиминировались из кровотока кролика медленнее, чем апоВ-холестерин-лецитиновые ( при одинаковых размерах липосом ). Вместе с тем сорбция липид-белковых рекомбинантов на бислое не зависела от присутствия холестерина в протеолипосомах.

В лецитиновых липосомах по сравнению с холестеринлецитиновыми перенос энергии с остатков триптофана на меченые дансилхлоридом аминогруппы апоВ был ниже. Это опять же свидетельствует о важнейшей роли холестерина в структурной упаковке белка ЛПНП.

Поскольку доля граничащих с апоВ фосфолипидов в составе ЛПНП составляет около 20 % ( Уеа§1е е1 а1., 1982 ), а для ХС остается неопределенной, то вводя в протеолипосомы бромированные фосфолипиды (ФЛ) и ХС, мы попытались установить число контактирующих с белком липидов этих классов, используя методический подход, апробированный для АТФ-азы (БИушв е1 а1., 1984 ).

Оказалось, что бромированный холестерин менее эффективно тушил флуоресценцию остатков триптофана апоВ по сравнению с бромированными фосфолипидами. Число контактирующих липидов с остатками триптофана белка ЛПНП в среднем составляло 3 и 12 для ХС и ФЛ, соответственно.

Отсюда следует, что остатки триптофана апоВ находятся в окружении фосфолипидов, а холестерин, если и входит в зону контактирующих с белком фосфолипидов, то в количестве, намного меньшим, чем в зону свободных от белков ФЛ. В рамках представлений о липид-белковых взаимодействиях в мембранах,как короткоживущих комплексах, полученные данные означают то, что ФЛ образуют более прочные комплексы с апоВ, чем ХС. Вместе с тем свободный от белка поверхностный фосфолипидный слой, в зависимости от доли ХС в нем, детерминирует характер взаимодействий белок-граничный липид.

Концентрация добавленного к ЛП бромированного холестерина, вызывающая тушение триптофановой флуоресценции на 50 %, составляла 1-2 мкг/мл в случае ЛПНП здоровых людей и 2-4 мкг/мл в случае ЛПНП больных ИБС (концентрация ЛП по белку 50 мкг/мл; п =4 в обоих случаях ).

Табл.6. Свойства апоВ-100 в зависимости от его липвдного

микроокружения ( п = 3-6)

параметры лецитиновые липосомы холестернин-лецитиновые липосомы ЛПНП

средний радиус, нм 10,5 П,2 9,8

вторичная структура, %

а-спираль 45 39 38

Р-структура 27 36 39

доля поверхности, покрытой белком 49 33 36

поляризация триптофановой флуоресценции 0,09 0,15 0,17

эффективность тушения триптофановой флуоресценции пиреном, % 55 69 73

время полувыведения из кровотока кролика, час 8,5 6,4 5,2

концентрация апоВ в среде, при 0,5 0,5 0,6

которой возрастает проводимость

мембраны из азолектина на 50 %

(мкг белка/мл )

Эти данные указывают на то, что структура поверхностного слоя ЛПНП больных ИБС качественно отличается от таковой ЛГШП здоровых людей. Отличия могут быть обусловлены как смещением остатков триптофана апоВ из липидной фазы в водную, так и более плотной упаковкой липидов поверхностного слоя частицы.

6. Влияние апоЕ на структурную организацию апоВ-100 в составе липопротеидных частиц

Изолированные с помощью аффинной хроматографии апоЕ содержащие ЛПНП имели такую же молярную эллиптичность как и ЛПНП без этого минорного белка. Вычитая из суммарной эллиптичности ЛПНП эллиптичность, обусловленную апоЕ входящего в состав частиц в различных соотношениях по отношению к апоВ, можно сделать заключение, что апоЕ оказывает дезупорядочивающий эффект на апоВ в составе липопротеидной частицы ( рис.3 ). Однако при обычном содержании 1-2 молекулы апоЕ в частице ЛПНП этот эффект выражен относительно слабо. Он скорее всего имеет заметное место в ЛПОНП и ЛППП, в которых доля минорных апо-ЛП велика. Поскольку спектры кругового дихроизма практически одинаковы для апоЕ и апоС, то можно допустить, что снижение эффективности узнавания фибробластами апоВ:апоС-ЛПНП по сравнению с апоВ-ЛПНП ( Bard et al., 1994 ) обусловлено чисто механическим сжатием молекулы апоВ в липопротеидной частице встроенным в нее дополнительным минорным апобелком.

7.Делокализация остатков триптофана, лизина и гистидина в плазменных липопротеидах низкой плотности

Расчетные методы выявления сегментов в молекуле белка, важных для проявления его функциональных и иммуно-химических свойств, к настоящему времени прочно вошли к практику исследований. Так для ряда вирусных белков только при использовании данных о гидрофобности аминокислотных остатков удалось предсказать участки, отвечающие за их антигенные свойства.

Для анализа баланса гидрофильность-гидрофобность сегментов, содержащих остатки триптофана в апобелках, мы использовали данные о гидрофильности аминокислотных остатков ( АКО ) по шкале Норр ( 1984 ) и гидрофобности по шкале Parker et al. ( 1986 ) с шагом в 11 АКО и остатком триптофана в центре.

VI 50

I

&

о, е« о

хя

0

1

«

а ^

ж 0) ж

о «

со

40 ■

30

20 -

10 •

0 ь-0

-ч 6

апоЕ / апоВ ( моль / моль )

Рис.3. Эффект апоЕ на вторичные структуры апоВ-100 в составе липопротеидных частиц.

А - а-спирали; В - ß-структуры; С - неупорядоченные струюуры.

2

4

Использовались литературные данные о первичной структуре апоА-1, апоВ-100, апоС-1, апоС-П и апоС-111 ( МаЫеу е1 а!.. 1984, Уапзе1а1., 1986).

Высокую гидрофобность и низкую гидрофильность имели следующие остатки триптофана апоВ: 370, 694, 1114,2468, 2526, 2527, 3567,3658,4369. 11-ти членные сегменты с остатком триптофана в центре, характеризующиеся высокой гидрофобностью и низкой гидрофильностью, не удалось идентифицировать а апоА-1, апоС-1, С-11 и С-111. Эти результаты еще раз подтверждают уникальность первичной структуры апоВ-100, которая проявляется в том, что остатки триптофана апоВ более глубоко погружены в липиды ЛПНП по сравнению с остатками триптофана апоА-1 и апоС в составе ЛПВП ( ВаШеу, 1975 ).

Эффективность переноса энергии с остатков триптофана апобелка ЛПНП больных ИБС на пирен оказалась ниже, чем в ЛПНП здоровых лиц . Расчеты, проведенные согласно теории Добрецова и соавт. ( 1982 ) дают основание считать, что в ЛПНП больных ИБС триптофанилы белка лежат на глубине 0,5+ 0,1 нм от поверхности раздела фаз вода-липид, а у здоровых 1,2±0,2 нм (п=5 в обоих случаях ).

Кроме особенностей локализации остатков триптофана апоВ в составе ЛПНП, исследовали и экспонирование в водную или липидную фазы и других АКО.

При изучении взаимодействия ЛПНП здоровых людей с флюрамом, было установлено, что около 23 % аминогрупп липопротеидов не реагирует с этим реагентом в случае нативных частиц по сравнению с разрушенными детергентом ( табл. 7 ). Эти данные находятся в полном соответствии с результатами других авторов о наличии в частице ЛПНП остатков лизина апоВ, которые недоступны для химических модификаций в ЛПНП, и доступны для них только после разрушения частицы ( Маг^оИв, Ьап£с1от, 1966).

Полученные данные скорее всего имеют не количественное, а качественное значение и свидетельствуют о том, что в ЛПНП пациентов с ИБС по сравнению с частицами этого же класса ЛП здоровых людей появляются модифицированные аминогруппы, возрастает доля доступных и снижается доля недоступных для флюрама аминогрупп. Иначе говоря, в частицах ЛПНП

больных ИБС помимо прямых химических модификаций МНг-групп происходит и изменение соотношения доступные/недоступные для флюрама аминогруппы. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что заболевание протекает на фоне измененений в упаковке белка в липопротеидной частице. Об этом же свидетельствуют и данные об изменении

Табл. 7.Взаимодействие ЛПНП с флюрамом и оценка доступности для метки

>Ш2 -групп

параметры флуоресценции и характеристика ЫН^ -групп липопротеиды

здоровых больных ИБС

Флуоресценция:

Рзсю 1,00±0,14 0,96±0,16

РлаС! 0,77±0,10 0,87±0,11

1,3 1,1

Аминогруппы:

общие, число 360 345

доля,% 100 95

модифицированные, число 0 15

доля 0 5

доступные для флюрама в составе ЛПНП

число 277 310

доля% 77 90

недоступные для флюрама в составе ЛПНП

число 83 35

доля% 23 10

Примечание к таблице 7. Б^а и - интенсивность флуоресценции флюрама (5 шМ ) в ЛПНП ( 20 мкг белка/мл ), находящихся в растворе 0,15 М ЫаС1, рН 9, и в том же растворе с добавлением додецилсульфата натрия ( конечная концентрация 1 % ).

числа остатков гистидина с различными рК апоВ в ЛПНГГ больных ИБС по сравнению с ЛПНП здоровых людей ( Табл.8 ).

Табл.8. Число остатков гистидина с различными рК в ЛПНП больных ИБС и

здоровых ( п = 2 в обоих случаях ).

Число остатков гистидина

рК ЛПНП здоровых ЛПНП больных

6,10 51 68

6,25 63 0

6,32 0 46

рК и число остатков гистидина рассчитано после дифференциирования кривой электрофоретическая подвижность-градиент pH, полученной по способу Ригетти ( 1985 ). Общее число остатков гистидина в апоВ-100 равно 114 (Yang et al„ 1986).

Из полученных данных видно, что в ЛПНП больных ИБС происходят микромасштабные перемещения сегментов молекулы апоВ относительно поверхности раздела фаз вода-липид по сравнению с частицами здоровых людей.

Поскольку суммарный эффект всех модифицирующих воздействий на частицу может отражаться на ее электрических характеристиках, то следующий этап исследования состоял в оценке заряда частиц у здоровых людей и больных ИБС.

8.3аряд липопротеидов низкой плотности

Путем расчетов было установлено, что изоэлекгрическая точка апоВ-100 равна 6,28. По данным изоэлектрического фокусирования pl ЛПНП составляет 5,7 ± 0,2. Эти данные свидетельствуют о том, что в составе ЛПНП за счет белок-липидных взаимодействий апоВ-100 имеет меньшее число несущих положительный заряд групп, чем изолированный белок. Этот вывод согласуется с представлеными выше данными о том, что после разрушения

ЛПНП додецилсульфатом натрия в них определяется на 20 % больше МН2 -групп, чем до добавления детергента.

При использовании электрофореза на ацетат-целлюлозе и изоэлектрического фокусирования в агарозе ЛПНП здоровых людей были относительно гомогенны как по электрофоретичсской подвижности, так и по изоэлектрической точке.

В случае электрофореза без поддерживающей среды профиль подвижности частиц состоял из 2-3 компонентов. При изотахофорезе в полиакриламидном геле ЛПНП разделялись на 4 дискретные зоны примерно в равном соотношении.

Все эти результаты свидетельствуют о гетерогенности частиц по плотности поверхностного заряда, обусловленной в большей степени гетерогенностью ЛПНП по размерам, чем другими причинами. Так согласно нашим оценкам при одном и том же общем заряде, составляющем 60 элементарных единиц заряда ( эез ), плотность поверхностного заряда у частиц с радиусом 7 и 15 нм ( самых мелких и самых крупных ) будет равна 11 х 10"2 и 2 х 10"2 эез/нм2 , соответственно.

При определении заряда ЛПНП с помощью зонда АНС поверхностный потенциал частиц здоровых людей и больных ИБС составлял -7,5±3,3 и -14,8+2,3 мВ ( п = 11 и 19 ), а плотность поверхностного заряда была равна в среднем 3 х 10"2 и 9 х 10"2 эез/нм2, соответственно.

Поскольку зонд АНС связывается в основном с ФЛ ( Омельяненко и соавт., 1989 ), а ЛПНП как здоровых, так и больных ИБС имеют (3-подвижность при электрофорезе на ацетат-целлюлозе, и не различаются по р1, то увеличение отрицательного заряда ЛПНП у больных ИБС, регистрируемое с помощью зонда АНС, правомочно связать с переходом холиновых групп ФЛ из гош- в трансконформацию. Этот эффект может быть обусловлен более плотной упаковкой поверхностного слоя частицы в мелких ЛПНП по сравнению с более крупными, то есть изменениями в них липид-белковых взаимодействий из-за изменения в размерах. Соотношение коротко- и длинноволнового компонентов в спектре флуоресценции зонда диметиламинохалкона ( ) составляло 1,13+0,04 для ЛПНП здоровых

людей ( п = 8 ) и было равно 1,34±0,11 для ЛПНП больных ИБС ( п = 7 ). Эти данные свидетельствуют и о снижении гидратации области глицериновых групп фосфолипидов в ЛПНП больных ИБС ( Владимиров, Добрецов, 1974 ).

Рис.4.Разделение ЛПНП на ЛПНП* ( основная фракция) и ЛПНП" (минорная фракция ) с помощью хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Элюция линейным градиентом раствора Г^СЬ . А - ЛП здорового человека; В - ЛП пациента с ИБС.

С помощью хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе нам удалось установить присутствие в ЛПНП субфракции, имеющей увеличенный отрицательный заряд ( Рис.4 ). Эта минорная субфракция обогащена продуктами ПОЛ, однако эффективность ее взаимодействия с фибробласгами и макрофагами не отличается от таковой основной массы частиц ЛПНП, имеющих не пре-р, а Р-

подвижность ( Табл. 10 ). Дополнительный компьютерный анализ показал, что снижение изоэлектрической точки апов-100 на 0,4 единицы с увеличением суммарного заряда в 2 раза возможно при модификации около 11 % остатков лизина этого белка. Именно эту субфракцию следует считать предмодифицированной продуктами ПОЛ и ее доля у больных ИБС в среднем в 2 раза выше, чем у здоровых людей.

9.Модификацин частиц, несвязанные с их пероксидацией

Фракционирование ЛПНП на гепарин-сефарозе позволило выявить субфракцию частиц, имеющих увеличенное сродство к гепарину. Эта субфракция характеризуется более мелкими размерами, меньшим отрицательным зарядом, повышенной склонностью к агрегации и более активно захватывается макрофагами по сравнению с основной по массе фракцией ЛПНП, имеющей более низкое сродство к гепарину ( Табл.11 ). То есть в отношении эффективности захвата клетками сосудистой стенки она более значима по сравнению с ЛПНП".

У пациентов с хронической почечной недостаточностью, леченных гемодиализом и имеющих ускоренное развитие коронарного атеросклероза, субфракция ЛПНП* имела большие размеры, связывала больше зонда АНС, характеризовалась вымещением остатков триптофана белка из липидного окружения в водное и увеличенным отрицательным зарядом по сравнению с ЛПНП здоровых людей ( табл. 12 ). То есть у этих пациентов нарушения структурной организации частиц обусловлены увеличением их в размерах.

Табл.10. Характеристика субфракций ЛПНП, различающихся по заряду

(п = 3-12 )

параметры частиц лнпопротеиды

ЛПНП* ЛПНП

концентрация МаС1, необходимая для элюции ( М ) 0,13 0,50

доля субфракции(% ) 96-82 4-20

изоэлектрическая точка 5,6 5,2

элекгрофоретическая подвижность в агарозе Р пре-Р

флуоресцирующие продукты ПОЛ (отн.ед./мг белка) 1,0 4,0

скорость накопления продуктов ПОЛ при добавлении ионов Си" (отн.ед.) 1,0 1,9

захват клетками ( отн.ед.):

фибробласты 1,0 0,8

макрофаги 1,0 0,7

липиды плазмы крови:

обший ХС 196±29

суммарные ТГ 97±27

сс-ХС 37+11

Примечание: - ЛПНП* - основная субфракция ЛПНП по белковой массе, элюируемая при низкой ионной силе раствора с колонки ДЕАЕ-сефррозы ЛПНП - минорная субфракция ЛПНД элюируемая при более высокой концентрации соли.

Новые данные об изменениях структуры ЛПНП у больных ИБС по сравнению со здоровыми людьми были получены при изучении взаимодействия частиц с липидными мембранами (Табл.13 ). Из представленных данных видно, что по влиянию на интегральную проводимость бислоя, проводимость одиночных ионных каналов и длительность открытого состояния одиночного ионного канала эффект ЛПНП больных ИБС близок к таковому для окисленных ЛПНП.

Однако очевидно, что 20 % ЛПНП, присутствующих в образцах ЛПНП больных, не могут оказать на бислой эффект, тождественный 100 % окисленных частиц. По влиянию на катион-анионную селективность мембраны ЛПНП больных ИБС сильно отличаются как от ЛПНП здоровых людей, так и окисленных in vitro ЛПНП.

Табл. 11 .Свойства субфракции ЛПНП с различным сродством к гепарину у

пациентов,имеющим коронарный атеросклероз (п = 3 ).

Параметры субфракции

I II

Ь'аС1, необх. для элюции, М 0.25 0.50

доля субфракции, % 70-90 10-30

средний радиус, нм 8.0 7.3

доля агрегатов,% 2 10

поверхностный потенциал, мВ -6.1 -5.5

Тзб5/43о * ( отн.ед. ) 1.0 1.2

интенсивность светорассеивания под углом 90° при 400 нм, % 100 197

захват макрофагами "( % ) 100 145

I и II - субфракции ЛПНП с низким и высоким сродством к гепарину,

соответственнно.

*- интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 365 и испускания 430 нм, соответственно.

**- захват частиц клетками оценивали по пераэстерификации 14С-

олеиновой кислоты при концентрации белка липопротеидов в среде 30 мкг/мл.

Табл. 12. Физико-химические свойства ЛПНП здоровых людей и

имеющих хроническую почечную недостаточность ( п = 2-5 )

параметры липопротеиды

здоровых больных

скорость флотации, Эг 6±1 8±1

число мест связывания зонда АНС (отн.ед.) 100 176

доля потушенной акриламидом триптофановой флуоресценции ( % ) 55 69

поверхностный потенциал, мВ -7 -13

Табл.13. Влияние липопротеидов на электрические свойства бислойной липидной мембраны

Параметр липопротеиды

здоровых больных ИБС ок-ЛПНП

интегральная проводимость бислоя (пСм )* 4 50 30

проводимость одиночных ионных каналов ( пСм )* 12 4 4

катион-анионная избирательность (отн.ед. ) 0.68 0.90 0.62

длительность открытого состояния одиночного канала (сек ) <10 <50 <100

ок-ЛПНП - липопротеиды здорового человека, инкубированные в присутствии Си" в течение 3 часов. * пСм - пикосименсы

В целом полученные данные указывают на то, что у больных ИБС фактором риска развития коронарного атеросклероза является накопление в кровотоке структурно-измененных липопротеидных частиц. Они легко превращаются в перекисно-предмодифицированные ЛПНП, а из них в сосудистой стенке образуются сильномодифицированные ЛПНП.

Ю.Степснь модификации апоВ в составе аутоиммунного комплекса ЛП-^С

Изучение аутоантигенности апоВ-липопротеидов, проводимое в нашей лаборатории, привело к разработке способа выделения липопротеидов в составе аутоиммунного комплекса ( КГппоу е1 а!., 1985 ).

Из всего арсенала методов анализа продуктов ПОЛ в аутоиммунном комплексе ( АИК ) наиболее пригодным оказался флуоресцентный из-за своей высокой чувствительности при малом количестве получаемого комплекса (содержание белка в пробе около 30 мкг/мл).

Установлено, что продукты пероксидации содержатся в АИК плазмы крови и стенки аорты в значительно больших количествах, чем в составе липопротеидов вне АИК ( табл.14). Используя зависимость между интенсивностью флуоресценции продуктов ПОЛ и содержанием аминогрупп в процессе окисления ЛПНП ионами меди была оценена степень перекисного повреждения белка ЛП вне и в составе АИК ( табл.14 ). Аортальные апоВ-ЛП были более сильно модифицированы продуктами ПОЛ, чем плазменные ЛП умерших людей с атеросклеротическими поражениями стенки аорты. В случае плазменного АИК блокировано около 24 % остатков лизина, а в случае аортального - около 60 %. То есть причиной аутоантигенности ЛП является выраженная пероксидация белковой части частицы. То, что АИК плазмы крови модифицирован продуктами ПОЛ в меньшей степени, чем аортальный не вызывает удивления. Первый быстро выводится из циркуляции, а второй, вероятнее всего, фиксирован на компонентах соединительного матрикса и может представляить собой "состарившийся" плазменный АИК, проникший в сосудистую стенку или образовавшийся в ней in situ. При сравнении спектров возбуждения флуоресценции продуктов ПОЛ плазменного и аортального АИК было установлено ( Рис.5 ), что спектр первого состоит из трех компонентов (Хви 335, 360 и 380 нм), а второго из одного (к^ 335 нм ). Поскольку спектр возбуждения флуоресценции есть не что иное как спектр поглощения хромофоров, входящих в состав частицы, то можно сделать вывод о том, что плазменный АИК содержит в своем составе как минимум три различных вида продуктов ПОЛ, а аортальный только один вид этих продуктов.

Плазменный АИК вряд ли является предшественником аортального из-за несовпадения спектральных характеристик. Поэтому можно полагать, что плазменный АИК образуется на повреждение ЛПНП одними продуктами ПОЛ, а аортальный - другими. Не исключен и другой механизм формирования аортального АИК: в кровотоке на сильно-модифицированные ЛПНП вырабатываются аутоантигела, образовавшийся комплекс быстро элиминирует из кровотока, а свободные аутоантитела проникая в сосудистую стенку, взаимодействуют с фиксированными на матриксе "состарившимися" липопротеидами. Нельзя исключить также образование антител на сосудистые

ЛПНП в периартериаль-ных лимфатических узлах, а также в проникших в интиму плазматических клетках ( КПшоу, 1993 ).

Содержание гидроперекисей в апоВ-липопротеидах плазмы крови прямо коррелировало с концентрацией АИК в плазме крови (г = 0,47; р < 0,05; п = 1 В).

В полученные результаты прямо указывают на то, что ЛПНП плазмы крови являются предшественниками комплекса апоВ-липопротеиды - плазмы крови, но не сосудистой стенки.

Табл. 14,Содержание продуктов ПОЛ и аминогрупп в апоВ-

липопротеидах, входящих и не входящих в АИК (п = 11 )

Название образца интенсивность флуореценции продуктов ПОЛ ( %) МН2 -группы (%)

плазменные ЛП 2,7+0,7 93

аортальные ЛП 5,4+2,1 84

плазменный АИК 8,6+5,4 76

аортальный АИК 16,2+7,6 40

Примечания:

1.Интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ в ЛПНП здорового человека принята за 1.0, а содержание аминогрупп в этих липопротеидах за 100 %.

2.Свободные аминогруппы вычислялись из зависимости Рпол - Рфлюра», полученной при окислении ЛПНП в присутствии ионов меди.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе получены новые данные о структурной организации и физико-химических свойствах ЛПНП, имеющие определенное значение для понимания молекулярных механизмов атерогенеза. Эти данные касаются как свойств апоВ-100, так и ЛП-частиц в целом.

В молекуле апоВ-ЮО идентифицированы сегменты с триптофаном в центре, имеющие низкую, среднюю и высокую гидрофобность. Последний тип сегментов отсутствует в апоА-1 и апоС. В частицах ЛПНП больных ИБС отмечается перемещение остатков триптофана апобелка из липидного окружения в сторону водной фазы.

В составе липопротеидной частицы апоВ окружен преимущественно фосфолипидами. Холестерин практически не входит в приграничный с белком фосфолипидный слой, однако сжимая его, оказывает а-деспирализующее влияние на этот граничащий с белком липидный слой. Аналогичным действием

на апоВ обладают и минорные апобелки в составе ЛПНП, а особенно в ЛПОНП, блокируя узнавание частиц В,Е-рецепторами.

Установлено, что изолированные ЛПНП являются нестабильными частицами. Впервые изучены как кинетика, так и механизмы агрегации изолированных ЛПНП. Показано, что после выделения из плазмы крови происходит перекис-ное окисление ЛПНП, инициирующее ослабление липид-белковых взаимодействий и агрегацию частиц. Если пероксидация ЛПНП, вызванная ионами меди, развивается в течении нескольких часов, то выраженное спонтанное окисление ЛПНП отмечается только через несколько суток. Поэтому неудивительно то, что находящиеся в сосудистой стенке ЛПНП являются относительно слабо-окисленными, слабо-атерогенными по такому критерию как узнавание макрофагами из-за более "мягкого" окисления, нежели поврежденые в присутствии ионов меди.

Использование способов, исключающих дополнительное окисление ЛПНП в процессе их выделения, позволило установить, что апоВ в составе частиц является слабо-модифицированным продуктами ПОЛ. Глубина модификации остатков лизина не достагает критического значения ( 16 % ) как в суммарных ЛПНП, так и субфракции ЛПНП".

Продукты ПОЛ входят преимущественно в состав минорной субфракции частиц, модифицируют их заряд и целый ряд других физико-химических свойств. Доля ЛПНГГ в 2 раза выше у больных ИБС, нежели у здоровых людей.

Содержание продуктов ПОЛ в ЛПНП находится в обратной зависимости от уровня ЛПВП плазмы крови. Поскольку пациенты с ИБС как правило имеют сниженный уровень ЛПВП, то полученные данные подчеркивают значимость этого класса ЛП в ингибировании образования перекисно-предмодифицированных ЛПНП в плазме крови.

Содержание продуктов ПОЛ в составе ЛПНП удается снизить путем приема такого препарата, как липостабил, но не никотиновой кислоты.

Отмечалась положительная корреляция между содержанием гидроперекисей в апоВ-липопротеидах и содержанием в плазме крови аутоиммунных комплексов апоВ-1,дО. Эти данные указывают на возможность того, что

ЛПНГГ являются предшественниками сильномодифицированных продуктами перекисного окисления липидов ЛПНП, на которые образуются аугоантитела.

Анализ АИК показал присутствие в них значительных количеств продуктов ПОЛ и модификацию этими продуктами 24 и 60 % остатков лизина апоВ в комплексах плазмы крови и сосудистой стенки, соответственно. При сопоставлении спектров возбуждения флуоресценции продуктов ПОЛ было выявлено их качественное различие для АИК плазмы крови и стенки аорты.

В работе установлено, что у больных ИБС размеры ЛПНП снижены по сравнению с ЛП этого класса здоровых людей. Этот факт находится в соответствии с результатами длительных исследований группы КгаиБЭ ( Маек е1 а1., 1996).

С формальной точки зрения уменьшение ЛПНП в размерах должно сопровождаться более плотной упаковкой апоВ в составе частиц и вымещением его из холестерин-фосфолипидного монослоя в водное окружение. Полученные в работе данные об ослаблении липид-белковых взаимодействии в ЛПНП больных ИБС по сравнению с ЛПНП здоровых людей в целом объясняются уменьшением в размерах ЛП-частиц у больных ИБС..

Способность мелких го размерам частиц к повышенной агрегации и окислению может проявляться внутри сосудистой стенки как фактор, способствующий накоплению ЛПНП во внеклеточном матриксе и повышенному захвату ЛПНП клетками. Определенный интерес заслуживает и то, что ЛПНП больных ИБС могут повреждать клеточные мембраны снимая их катион-анионную селективность, а отсюда приводить к нарушению функционирования клеток крови и сосудистой стенки. Изменения физико-химических свойств , особенно из-за снижения размеров ЛПНП является необходимым, но не единственным условием развития атеросклеротических поражений артериальных сосудов. Вместе с тем, нормализация структурной организации частицы ЛПНП путем приема препаратов ЛИПОСТАБИЛ или НИКОТИНОВАЯ КИСЛОТА или путем операции частичного шунтирования тонкой кишки способствует снижению проатерогенности этих частиц.

ВЫВОДЫ

1. В молекуле апоВ-100 выявлены триптофан-содержащие сайты, имеющие очень высокую гидрофобность и нехарактерные для низкомолекулярных апобелков (апоА-1, апоС).

2. Холестерин и минорные апобелки оказывают а-деспирализующее влияние на вторичную структуру апоВ в составе липопротеидных частиц.

3. Изолированные плазменные ЛПНП при длительном хранении ( 0,15 М раствор NaCl, рН 7,0, 4 "С ) формируют агрегаты. Агрегация протекает в две фазы: быстрая и медленная.

4. Агрегация частиц ЛПНП обусловлена накоплением в них продуктов перекисного окисления липидов, что инициирует модификацию апоВ-100 этими продуктами, изменение его упаковки и усиление гидрофобных взаимодействий между частицами.

5. Биофизические характеристики "состарившихся" in vitro ЛПНП совпадают с таковыми аортальных ЛПНП ( увеличение отрицательного заряда, накопление продуктов ПОЛ, смещение остатков триптофана апоВ из липидной в водную фазу ).

6. В ЛПНП плазмы крови больных ИБС модифицировано продуктами ПОЛ около 7 % остатков лизина апоВ, тогда как в ЛПНП здоровых лиц около 3 % в аутоиммунных комплексах липопротеид-антитело плазмы крови и стенки аорты число модифицированных остатков лизина апоВ-ЮО достигает 24 и 60 %, соответственно.

7. АпоВ-100 ЛПНП больных ИБС модифицированы по размерам, заряду, перемещениям остатков триптофана, лизина и тистидина между водной и липидной фазами по сравнению с ЛПНП здоровых людей.

8. Нарушение липид-белковых взаимодействий в ЛПНП больных ИБС в той или иной степени нивелируется терапевтическими воздействиями (никотиновая кислота, липостабил, частичное шунтирование подвздошной кишки) вследствие нормолизации размеров частиц или снижения их пероксидации.

Список публикаций по теме диссертации

1. Кузнецов А.С.,Ховратович В.И.,Иоффе ДВ.,Попов А.В. Взаимодействие липопротеидов низкой плотности с заряженными лигандами:исследование с помощью флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната. Вопр.мед.химии, 1983,т.29, N4, 61-65

2. Добрецов Г.Е.,Спирин М.М.Кузнецов А.С.,Попов А.В. Структурная организация липопротеидов низкой плотности аорты человека:исследование с помощью флуоресцентных зондов. Бюлл.эксп.биол.мед., 1983, т 96, N 3, 45-47

3. Нагорнев В.А., Бобрышев Ю.В., Ивановский Ю.В., Кузнецов А.С. Роль моноцитов крови и IgG в развитии атеросклеротических поражений аорты у хролика. Арх.патол., 1983, т 45, N 6, 19-26

4. Климов А.Н., Коровкин Б.Ф., Кузнецов А.С., Попов И.Н. Аполипопротеин В плазменных липопротеидов низкой плотности, встроенный ' в липосому: иммунологические свойства и распределение между органами при введении кролику, Бюлл.эксп.биол.мед., 1983, т 96,N 3,47-50

5. Попов А.В., Рамзаев В.П., Плесков В.М., Андреева Л.И., Кузнецов А.С. Изменение размеров и свойств липопротеидных частиц во внеклеточной среде при инкубации липопротеидов низкой плотности с фибробластами человека, Бюлл.эксп.биол.мед., 1983, т 96, N 1,41-43

6. Добрецов Г.,Лапшин Е.Н.,Кузнецов А.С., Определение размеров,объема и площади поверхности плазменных липопротеидов с помощью флуоресцентных зондов,Укр.биохим.ж.,1984,т.56, N 2, 167-171

7. Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Иоффе Д.В., Кузнецов А.С. Флуоресцентный зонд - аналог холестерина: локализация в лилопротевдах плазмы крови и в модельных липопротеидных частицах, Биофизика, 1984, т.29, N 6, 989-992

8. Klimov A.N.,Denisenko A.D.,Popov A.V.,Nagornev V.A.,Pleskov V.M.,Vinogradov A.G.,Denisenko T.V.,Magracheva E.Ya.,Kheifes G.M., Kuznetsov A.S. Lipoprotein-antibody immune complexes.Their catabolism and rôle in foam cell formation, Atherosclerosis, 1985, v.58, N 1,1-15

9. Иоффе Д.В., Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Кузнецов А.С. Синтез, оптические свойства и поведение в липидном бислое [З-холестатриен-Зр-ола -флуоресцентного аналога холестерина, Биол.мембраны, 1985, т.2, N 2, 944949

Ю.Беседин И.И.,Кузнецов А.С.,Дамбинова С.А.Молекулярная организация глютамат-чувствительных хемовозбудимьгх мембран нервных клеток. Изучение функции глютамат-связывющих белков центральной нервной системы методом встраивания в липосомы, Биохимия, 1985, т.50, N 3, 363368

П.Лозовский В.Т., Шмелев Г.Е., Носкин В.А., Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Кузнецов А.С., Климов А.Н. Распределение плазменных липопротеидов по размерам, Биофизика, 1987, т.32, N 2, 28-291

12.Марценюк О.В., Перова Н.В., Мишарин А.Ю., Антонов В.И., Кузнецов А.С., Твердислов В.А., Эль-Карадачи С. Изучение взаимодействия липопротеидов плазмы крови и аполипопротеидов с бислойными липмидными мембранами, Биофизика, 1987, т.32, N 2, 280-284

13.Klimov A.N.,Denisenko A.D.,Kuznetzov A.S.ln vivo formation of modified lipoproteins with increased affinity for macrophage receptors,"Advance in lipoprotein and atherosclerosis research,diagnostics and treatment", Proc.6-th Int.Dresden Lipid Symp., Dresden, 1988, v.l., 81-86

14.Klimov A.N.,Parfenova N.S.,Kuznetsov A.S.,Tryufanov V.F.,Ioffe D.V.,Alksnis E.G.,Noskin V.A., Ivanova M.A., Krivoruchenko I.V. Loss of cholesterol acceptor ability of high density lipoproteins in patients with coronary heart disease, "Phosphathydilcholine ( polyenephosphatidylcholine ):effects on cell membrane and transport of cholesterol", PPC Workeshop, Cologne, May 2-3, 1988, Eds.A.I.ArchakovandK-J.Gundermann, wbn-Verlag, Binder/Rhein, 1988, 45-54

15.Климов А Н.,Парфенова Н.С.,Петрова-Маслакова Л.Г.,Кузнецов A.C.,Иоффе Д.В.,Алкснис Е.Г.,Носкин В.А.,Иванова М.А.,Криворученко И.В. Нарушение холестерин-акцепторной функции липопротеидов высокой плотности у пациентов с ишемической болезнью сердца, Вопр.мед.химии, 1988, т. 51, N 2,42-46

16.Кузнецов A.C., Миссюль Б.В., Парфенова Н.С. Модификация липопротеидов плазмы крови продуктом перекисного окисления липидов - гексаналем, Бюлл.эксп.биол.мед., 1989, т. 107, N3, 294-296

17.Клюбин В.В., Брагинская Т.Г., Кузнецов A.C., Безрукова А.Г., Коликов В.М., Агрегация биодисперсий липопротеидов по данным метода оптического смешения, Коллойдн.ж., 1989, т.51, N 2,376-378

18.Бобрышев Ю.В., Кузнецов A.C. Структурный анализ взаимодействия липопротеидов низкой плотности с клетками интимы артерий при атеросклерозе, Арх.патол., 1989, т.51, N 9, 20-26

19.Кузнецов A.C., Парфенова Н.С., Денисенко А.Д., Сунгуров А.Ю., Пивоварова Ю.И., Виноградов А.Г., Криворученко И.В., Лозовский В.Т., Трюфанов В.Ф. Перекисная модификация липопротеидов низкой плотности при ишемической болезни сердца, Укр.биохим.ж., 1989, т.61, N 3,111-114

20.Брагинская Т.Г., Кузнецов A.C., Бузрукова А.Г., Коликов В.М., Мищенко Б.С., Пыллумая Л.Р., Агрегация дисперсии липопротеидов по данным светорассеивая, "Молекулярная физика и биофизика водных систем", Изд.ЛГУ.,Л., 1989, вып.7, 196-203

21.Ваврин Р.З.,Кузнецов A.C.,Парфенова Н.С.,Носкин В.А.,Олейникова Л.В.,Криворученко И.В.,Сунгуров А.Ю.,Коган Е.И.,Маграчева Е.Я.,Пивоварова Ю.И.Размеры липопротеидов низкой плотности у пациентов с ишемической болезнью сердцаи нормолипидемией, Биополимеры и клетка, 1989, т.5, N 6, 68-72

22.Кузнецов A.C..Парфенова Н.С.,Сунгуров А.Ю.,Олейникова Л.В., Омельяненко В.Г., Криворученко И.В., Маграчева Е.Я. Конформация и локализация белка в липопротеидах низкой плотности в норме и при ишемической болезни сердца, Укр.биохим.ж., 1989, т.61, N 3, 47-52

23.Кузнецов A.C., Парфенова Н.С., Плавинский С.Л. Хроматофокусирование плазменных липопротеидов низкой плотности, Бюлл.эксп.биол.мед., 1990, t.108,N 9,271-274

24.Кузнецов A.C.,Парфенова Н.С., Лозовский В.Т.,Ваврин Р.З.,Носкин А.В.,Омельяненко В.Г.,Оленнокова Л.В.,Олейник И.А.,Виноградов А.Г., Криворученко И.В., Маграчова ЕЯ. Свойства плазменных липопротеидов

низкой плотности у пациентов с гипертриглицеридемией и ишемической болезнью сердца, Укр.биохим.ж., 1990, т.62, N 3, 48-53

25.Должанская Н.Б., Мандельштам М.Ю., Паккин Е.Л., Кузнецов A.C., Виханская Ф.Л., Крутилина Р.И., Гайцхоки B.C. Моделирование генетической коррекции семейной гиперхолестеринемии, Биополимеры и клетка, 1990, т.б, N 2, 31-35

26.Безруков О.Ф., Каргер И., Кузнецов A.C. Исследование самодиффузии липопротеидов методами спинового эха, "Молекулярная физика и биофизика водных систем", изд.ЛГУ, 1991, вып.8, 131-141

27.Безруков О.Ф., Каргер К., Колосов И.А., Кузнецов A.C. Изучение самодиффузии липопротеидов методами ЯМР "Исследование воды и водных систем физическимии методами" Санкт-Петербург, изд.С-Петербург.ун-та, 1992, вып.9, 221-226

28.Kuznetsov A S., Missyul B.V. The charge and atherogenecity of low density lipoproteins, Укр.биохим.ж., 1992, т.64, N 4,3-19

29.Миссюль Б.В., Лозовской В.Т., Кузнецов A.C. Математическое моделирование зарядовых свойств молекул белков, Укр.биохим.ж., 1992, т. 64, N2, 16-21

30.Кузнецов A.C. Аффино-флуоресцентный способ оценки перекисной модификации апоВ-содержащих липопротеидов, Флуоресцентные методы исследования в клинической диагностике, 1992, N 4, часть 2, 11

31.Denisenko A.D.,Kuznetzov A.S.,Vinogradov A.G.,Parfenova N.S.,Magracheva E.Ya.,Dizhe E.B.,Pivovarova Yu.I.,Sitnikova OD., Noskin V.A., Vavrin R.Z., Voziyan P.A., Omeiyanenko V.G., Sungurov A.Yu., Krivoruchenko I.V., Klimov A.N. Low density lipoproteins of patients with ischemic heart disease. Certein physico-chemical and biological priperties, Phys.Chem.Biol.Med., 1993, v.l, N 1, 37-44

32.Денисенко А.Д., Виноградов А.Г., Пивоварова Ю.И., Кузнецов A.C., Климов АН. Влияние блокады ретикуло-эндотелиальной системы на метаболизм липопротеидов низкой плотности у кролика, Вопр.мед.химии, 1983, т.39, N 3,6-8

33.Липовецкий Б.М., Константинов В.О., Васильева Л.Е., Кузнецов A.C., Олейник И.А., Михайлова И.А. О результатах курсового и длительного

лечения ловостатином больных с первичной гиперлипидемией 11а типа Кардиология, 1994, т. 10, N 9,21-24

34.Ремезова О.В.,Окуневич И.В.,Кузнецов A.C., Давыдов В.В., Рыженков В.В. Использование настойки женьшеня при нарушениях липидного обмена в эксперименте, "Антигипоксанты и актопротекгоры", Материалы Росс.научн.конф., Санкт-Петербург, 1994, вып.- 4., 276

35.PIavinsky S.L., Kuznetsov AS., Acception of cholesterol by high density lipoproteins estimation by simple test and factor analisis, Phys.Cmem.Biol.Med., 1994, v.l,N2, 111-117

36.Klimov A.N., Gurevich V.S., Nikiforova A.A., Denisenko A.D., Kuznetsov A.S., Shatilina L.V., Plavinsky S.L. High density lipoproteins have antioxidative activity in vivo Atherosclerosis, 1994, v.109, N 1-2, 37-38

37.Denisenko A.D.,Kuznetsov A.S.,Makovejchuk E.G.,Vinogradov A.G.,Klimov A.N.Oxidized LDL and immunolidy of atherosclerosis, "Advances in lipoprotein and atherosclerosis research,diagnostics and treatment",Proc.8-th Int.Dresden Lipid Symposium 1994, Eds.W.Jaross et al., Gustav Fisher Verlag, Jena, Stuttgard, New York, 1995, 52-56

38.Денисенко А.Д., Седлецкий Ю.И., Мирчук K.K., Кузнецов A.C., Олейник И.А., Лозовский В.Т., Климов А.Н. Влияние частичного илеошунтирования на показатели атерогенности плазмы крови у больных атеросклерозом, Кардиология, 1995,T.U,N 1,35-38

39.Klimov A.N., Konstantinov V.O., Lipovetsky B.M., Kuznetsov A.S.,Lozovsky V.T., Trufanov V.T., Plavinsky S.L., Gundermann K-J., Shumacher R. "Essential"phospholipids versus nicotinic acid in treatment of patients with IIb hyperlipoproteinemia and ischemic heart disease, Cardiovas.Drung.Ther., 1995, v.9, 779-794

40.Гринфельд А.Э., Готлиб B.A., Кузнецов A.C., Ростовцева Т.К., Щагина Л.В., Лев A.A., Климов А.Н. Каналоформеная активность липопротеидов низкой плотности, Биол.мембраны., 1995, т.12, N 6, 629-638

41.Готлиб В.А., Кузнецов A.C., Соколова А.Е., Лев A.A., Климов А.Н., Изменение холестерин-транспортитующей системы липопротеидов низкой плотности при ишемической болезни сердца, Цитология, 1995, т.37, N 4, 366