Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние липопротеидов на сигнальные и транскрипционные системы клеток крови и сосудистой стенки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бочков, Валерий Николаевич

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

• Липопротеиды плазмы крови и нарушения липидного обмена.

• Механизмы атерогенеза.

• Окисленные фосфолипиды.

• Влияние липопротеидов на системы передачи регуляторных сигналов в тромбоцитах и клетках сосудистой стенки.

МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. АКТИВИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ НА СИСТЕМЫ ВТОРИЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ В ТРОМБОЦИТАХ И ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ (ГМК) СОСУДОВ

1.1. Влияние ЛНП на внутриклеточные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека.

1.2. Влияние ЛНП на внутриклеточные сигнальные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в ГМК сосудов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние липопротеидов на сигнальные и транскрипционные системы клеток крови и сосудистой стенки"

Взаимосвязь между уровнем липопротеидов плазмы крови и развитием атеросклероза была установлена достаточно давно, однако механизмы влияния липопротеидов на атерогенез не ясны до конца и по сей день. Согласно классическим представлениям, атеросклероз является следствием накопления в стенке сосуда атерогенных липопротеидов, которые создают механическое препятствие току крови [Климов, 2002]. Однако за последние годы накопилось множество данных, показывающих, что атерогенез представляет собой не пассивное отложение липидов, но является активным процессом, в который одновременно вовлечены несколько типов резидентных и пришедших из крови клеток, связанных между собой паракринной стимуляцией [Ross, 1999]. Вопрос о том, какую роль в этом процессе играют липопротеиды, остается в значительной степени открытым.

В настоящее время представляется очевидным, что роль липопротеидов в атерогенезе не ограничивается каким-либо одним механизмом. Наиболее изученным является вклад липопротеидов в образование пенистых клеток, играющих ключевую роль в накоплении липидных масс в атероме. Пенистые клетки образуются за счет неконтролируемого захвата окисленных атерогенных липопротеидов макрофагами и гладкомышечными клетками (ГМК) при посредстве хорошо исследованных клеточных рецепторов [Herz, 2004]. Гораздо менее изученным является действие липопротеидов на другие клеточные процессы, приводящие к ремоделированию сосудистой стенки, характерному для атеросклероза. Такими процессами являются синтез цито- и хемокинов, накопление -в интиме сосуда моноцитов и их дифференцировка в факрофаги, миграция и пролиферация ГМК, синтез белков матрикса и расщепляющих их протеаз, процессы кальцификации атеромы, образование vasa vasorum и целый ряд других процессов, приводящих к развитию атеромы и острых тромботических осложнений атеросклероза [Libby, 2002].

Участие дислипидемий в патологии человека не ограничивается развитием атеросклероза. Параллельно с атерогенезом дислипидемии вызывают нарушение регуляции тонуса сосудов и повышение агрегационной способности тромбоцитов [Williams, 1988; Aviram, 1987]. Эти процессы вносят вклад в развитие атеромы, но также могут проявляться как отдельные патологические симптомы, выражающиеся в повышенной склонности сосудов к сокращению и приводящие к развитию гипертензии и тромбофилии. Следует подчеркнуть, что имеются данные о том, что дислипидемия служит причиной развития некоторых форм гипертензии, а не является сопутствующим симптомом, вызванным более общими патологическими изменениями. Особенно тяжелые клинические последствия вызванных дислипидемией нарушений регуляции тонуса сосудов и активности тромбоцитов развиваются при остром коронарном синдроме, механизмы которого включают в себя тромбоз и вазоспазм, развивающиеся на фоне атеросклеротических изменений [Явелов, 2004].

Многообразие элементов атерогенеза, на которые оказывают влияние дислипидемии, позволяет предположить, что липопротеиды воздействуют на ключевые метаболические или. регуляторные системы клетки. Все клеточные процессы в сосудистой стенке находятся под контролем систем вторичных посредников [Чазов, 2000]. Так, фосфоинозитидный обмен играет центральную роль в регуляции таких ключевых процессов атерогенеза как пролиферация и миграция ГМК, продукция цитокинов и т.д. Кроме того, под контролем вторичных посредников находятся процессы, потенциально связанные с развитием осложнений атеросклероза. Например, ионы Са играют ключевую роль в регуляции сосудистого тонуса путем стимуляции сократительной активности ГМК, а также продукции эндотелием вазорелаксанта NO [Berridge, 1990]. Кроме того, ионы Са являются основным внутриклеточным медиатором активации тромбоцитов.

В начале этого исследования мы предположили, что многообразные эффекты липопротеидов плазмы крови на клетки крови и сосудистой стенки могут быть связарш с их способностью воздействовать на системы 8 вторичных посредников в этих клетках. В связи с этим, одной из задач работы являлось изучение эффектов липопротеидов на системы вторичных посредников в клетках крови и сосудистой стенки. Поскольку активация систем вторичных посредников обычно происходит при участии рецепторов, расположенных на поверхности клеток, в работе также исследовались липопротеид-связывающие белки клеточных мембран.

Атеросклероз в настоящее время рассматривается как один из видов хронического воспаления рМауаЬ, 2004]. Характерной особенностью атерогенеза является преимущественное накопление в стенке сосуда моноцитов и лимфоцитов, но не нейтрофилов. Изучение механизмов такой избирательности и поиск веществ, стимулирующих экстравазацию моноцитов, представляет значительный интерес для понимания путей инициации атерогенеза и его особенностей по сравнению с другими видами воспаления. Особое внимание в качестве потенциальных инициаторов атерогенеза привлекают продукты окисления липопротеидов, которые обладают рядом проатерогенных свойств [ЬеШг^ег, 2003]. Оказалось, что биологические эффекты окЛНП во многом связаны с действием содержащихся в них окисленных липидов. В последние годы проводится активное изучение атерогенных эффектов различных классов содержащихся в окЛНП окисленных липидов.

В контексте рассматриваемой проблемы - связи липопротеидов и атерогенеза, обращает на себя внимание биологическая активность изопростанов - продуктов неферментативного окисления арахидоновой кислоты, которые в силу их структурного сходства с простагландинами могут взаимодействовать с рецепторами простаноидов [Ргайсо, 1999]. Наиболее изученной активностью этих веществ является способность стимулировать сокращение сосудов. Неизвестно однако, принимают ли они участие в таком ключевом процессе атерогенеза как инициация связывания моноцитов с эндотелием. Одной из задач настоящей работы являлось исследование этого вопроса.

Окисленные фосфолипиды (окФЛ) представляют собой недавно обнаруженный класс биологически активных окисленных липидов, в которых продукты окисления арахидоновой кислоты остаются связанными с фосфолипидной молекулой посредством сложноэфирной связи [Watson, 1997]. В последние годы для этих веществ описан целый ряд эффектов на клетки, участвующие в атерогенезе. В частности, был обнаружен стимулирующий эффект окФЛ на способность эндотелия связывать моноциты. Эти эффекты потенциально могут участвовать в инициации и прогрессии атеромы. В данной работе было продолжено изучение биологической активности окФЛ, в частности их способность активировать тесно связанные с атеросклерозом процессы свертывания крови за счет повышения тромбогенности эндотелия. Кроме того, нами были исследованы сигнальные и транскрипционные механизмы оказываемых окФЛ эффектов. Хотя окФЛ являются индукторами воспалительных реакций, оказываемые ими эффекты отличаются от действия известных медиаторов воспаления. Можно предположить, что окФЛ активируют специфичный набор сигнально-транскрипционных механизмов. Одной из задач данного исследования являлось исследование сигнальных и транскрипционных эффектов, вызываемых окФЛ в эндотелии.

Таким образом, накопленная информация позволила нам сформулировать гипотезу о том, что одним из механизмов, связывающих уровень липопротеидов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, является способность липопротеидных частиц влиять на функциональную активность клеток крови и сосудистой стенки. Настоящее исследование было посвящено изучению активирующего влияния липопротеидов на системы вторичных посредников, регулирующие сосудистый тонус, активность тромбоцитов, тромбогенность эндотелия и воспалительные реакции в сосудистой стенке, то есть процессы, участвующие в развитии атеросклероза и его осложнений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ЛИПОПРОТЕИДЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ И НАРУШЕНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА

Структура липопротеидных частиц

Основными классами липидов, присутствующими в организме человека, являются свободные 'жирные кислоты, триглицериды, фосфолипиды, а также холестерин и его эфиры. Характерным физико-химическим свойством липидов является низкая растворимость в воде, в связи с чем их непосредственный транспорт плазмой крови невозможен. Липиды в организме переносятся в виде липид-белковых комплексов. Специализированной формой липид-переносящих комплексов являются так называемые липопротеиды (ЛП), представляющие собой липид-белковую микроэмульсию [Havel, 1995]. В составе ЛП более гидрофильные липиды (фосфолипиды, свободный холестерин), а также белки, локализованы преимуществено на поверхности частицы, в то время как триглицериды, эфиры холестерина и другие гидрофобные липиды изолированы от водной фазы и располагаются внутри ЛП [Havel, 1995].

В организме человека существует несколько классов ЛП, разделяемых по плавучей плотности на пять классов: хиломикроны (ХМ), ЛП очень низкой плотности (ЛОНП), ЛП промежуточной плотности (ЛПП), ЛП низкой плотности (ЛНП) и ЛП высокой плотности (ЛВП) [Genest, 2003]. Помимо состава и физико-химических свойств, классы ЛП различаются по функциям, которые они выполняют в организме. Основной функцией ХМ является транспорт поступающих с пищей триглицеридов, которые составляют до 90% от веса частиц ХМ. ЛОНП вырабатываются в печени и переносят секретируемые печенью эндогенные липиды, в основном триглицериды, а также холестерин и фосфолипиды. В результате гидролиза ТГ в кровотоке плавучая плотность ЛОНП возрастает и они превращаются сперва в ЛПП, а затем в ЛНП, которые у человека являются основным классом ЛП, доставляющих холестерин из печени к периферическим тканям для формирования мембран и синтеза стероидных гормонов [Ridker, 2000]. ЛВП синтезируются печенью и кишечником, а также образуются в процессе липолиза ТГ-богатых ЛП. В составе ЛВП мало ТГ, и в основном липиды ЛВП состоят из холестерина и фосфолипидов. Основной функцией ЛВП является захват холестерина в тканях и его перенос в печень, где происходит его поглощение, превращение в желчные кислоты и выведение из организма с желчыо - так называемый процесс обратного транспорта холестерина [Genest, 1999].

Важным компонентом липопротеидов являются белки, называемые аполипопротеидами. Они выполняют разнообразные функции, в том числе стабилизируют липиды в водной фазе и направляют их метаболизм, выступая в качестве лигандов для липопротеидных рецепторов, а также активируя или ингибируя процессы липолиза [Genest 2003]. Некоторые апобелки в составе липопротеидов выполняют преимущественно структурную функцию. К их числу относятся ano В-100 и ano В-48, формирующие ХМ, ЛОНП, ЛППП и ЛНП, а также ano A-I и ano A-II, являющиеся главным компонентом ЛВП. Характерной чертой таких апобелков является то, что они не могут покинуть формируемую ими частицу. Вторая группа апобелков - «обмениваемые» -могут переноситься с одного класса липопротеидов на другой. К таким апобелкам относятся ano Е и ano С. Их функция связана главным образом с регуляцией метаболических превращений липопротеидов в кровотоке, а также с контролем захвата липопротеидов клетками.

Гиперлипидемии

В настоящее время считается доказанным, что повышение уровня липидов, и прежде всего холестерина, в крови является важным фактором риска атеросклероза. Гиперлипидемии по своему генезу могут быть первичными, то есть наследственными, и вторичными, возникающими в результате других заболеваний, например диабета, других гормональных нарушений, а также патологии почек и печени.

В основе первичных гиперлипидемий лежат наследственные факторы [Davignon 1998]. Нарушения липидного обмена возникают у больных, унаследовавших один или, чаще, несколько вариантов генов, предрасполагающих к повышению уровня липидов в крови. Наиболее охарактеризованными формами наследственных гиперлипидемий являются семейная гиперхолестеринемия, семейная комбинированная гиперлипидемия, полигенная гиперхолестеринемия, и семейная гипертриглицеридемия [Havel, 1995]. Для каждого типа первичных ГЛП характерны особые изменения состава липопротеидов крови. Классификация этих изменений основывается на измерении уровней холестерина и триглицеридов, а также соотношении основных липопротеидных фракций, определяемого с помощью электрофореза. По этим параметрам различные первичные и вторичные гиперлипидемии согласно классификации ВОЗ разделяются на пять классов (Табл. 1).

Таблица 1. Классификация гиперлипопротеинемий.

Тип ХМ лонп ЛНП XC ТГ Характер нарушений

I t N N N n tXM

IIa N n n N Тлнп

IIb t t t t Тлнп

III Флотирующие ß-ЛП t t t T ремнантов ХМ и ЛПП

IV t N N(T) t Тлонп

V t t N N(t) n tXM И лонп

Семейная гиперхолестеринемия

Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) является, по-видимому, наиболее частым аутосомно-доминантным заболеванием человека [Г)ау1§поп, 1998]. Частота СГХС в большинстве популяций - 1 на 500. В популяциях с эффектом основателя гетерозиготные формы встречаются гораздо чаще: 1 на 70 у африканеров в Южной Африке и 1 на 200 у канадцев французского

13 происхождения. По той же причине повышена частота СГХС у финов, друзов и ливанцев.

Далеко не все случаи СГХС диагностируются клинически. Например, в России менее чем одному проценту пациентов с СГХС ставится клинический диагноз, а наиболее эффективная диагностика (свыше 40% идентифицированных носителей) проводится в Исландии благодаря небольшому размеру популяции с выраженным эффектом основателя и небольшой вариабельностью мутаций.

Основными диагностическими признаками СГ являются повышенный уровень холестерина в крови, наличие сухожильных ксантом у больного или родственников первой степени родства и доминантный характер наследования повышенного холестерина или ишемической болезни сердца [Goldstein, 2001].

Клинически СГХС проявляется повышением риска развития атеросклероза и его осложнений [Малышев, 2002]. Механизмы, связывающие повышение уровня холестерина с развитием ишемической болезни сердца до конца не изучены. Предполагается, что высокий уровень богатых холестерином липопротеидов низкой плотности (ЛНП) способствует их проникновению в стенку сосуда, где они окисляются и запускают цепь клеточных реакций, приводящих к накоплению липидов и локальной перестройке стенки сосуда, в результате чего образуется атеросклеротическая бляшка. При СГХС особенно повышается риск смерти от инфаркта миокарда в молодом возрасте - до 40 лет - в 100 раз. У не получающих лечения мужчин с СГХС к 60 годам вероятность ИБС составляет около 75%. По некоторым оценкам, лишь половина мужчин с СГХС доживает до 60 лет. Средний возраст начала ИБС составляет 40-45 лет у мужчин; у женщин он на 10 лет больше. Таким образом, ИБС у больных с СГХС развивается на 10-20 лет раньше, чем в среднем по популяции [Goldstein, 2001].

Для снижения уровня липопротеидов плазмы при СГХС эффективно используются статины и другие липид-снижающие препараты. Наиболее

14 тяжелых больных, как правило это гомозиготные случаи, лечат удаляя избыток липопротеидов низкой плотности плазмаферезом. Иногда применяют пересадку печени.

Биохимические и генетические механизмы СГХС

При СГХС уровень холестерина повышен за счет увеличения содержания в плазме ЛНП [Goldstein, 2001]. Это метаболическое нарушение связано с уменьшением клиренса ЛНП печенью в результате снижения экспрессии или активности клеточных рецепторов, опосредующих захват частиц ЛНП (ЛНП-рецепторы). Активность ЛНП-рецептора при СГХС снижается на всех клетках, экспрессируюгцих данный рецептор, однако функциональные последствия связаны, главным образом, с дефектом рецептора в печени, поскольку нарушение превращения холестерина в желчные кислоты приводит к снижению его выведения через кишечник. Аналогичные биохимические нарушения наблюдаются при мутационном изменении белка апоВ-100, который является лигандом для ЛНП-рецептора. В результате такой мутации частицы ЛНП перестают узнаваться ЛНП-рецептором и накапливаются в плазме [Hansen, 1997].

Ген ЛНП-рецептора содержит 18 экзонов, которые кодируют шесть функциональных доменов этого белка: сигнальный пептид, лиганд-связывающий домен, домен, гомологичный предшественнику эпидермального фактора роста, участок О-гликозилирования, трансмембранный и цитоплазматический домены.

Все известные мутации в гене LDLR собраны в базе данных UMD-LDLR, которая доступна через Интернет [Wilson, 1998]. Количество записей в ней превысило 800 и продолжает расти. По данным базы UMD-LDLR, однонуклеотидные замены составляют 90% всех мутаций в гене LDLR, из них большинство - миссенс- и нонсенс-мутации. Остальные 10% - в основном макроперестройки, вызванные неравной рекомбинацией с более чем 30 копиями ^/w-последовательностей, присутствующими в данном гене. В промотере обнаружено менее 10 мутаций.

Выделяют пять 'функциональных классов мутаций в гене ЛНП-рецептора [Goldstein, 2001]. Мутации первого класса приводят к полному прекращению синтеза ЛНП-рецептора в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Мутации, относящиеся ко второму классу, блокируют транспорт вновь синтезированного рецептора из ЭР в комплекс Гольджи, где происходит его гликозилирование. В результате таких мутаций ЛНП-рецептор не транспортируется на поверхность клетки. Мутации третьего класса приводят к тому, что рецептор экспрессируется на поверхности клетки, но не способен эффективно связывать ЛНП. Мутации четвертого класса затрагивают цитоплазматический и трансмембранный домены ЛНП-рецептора. При этом рецептор связывает липопротеиды нормально, но не может их интернализовать. В результате мутаций пятого класса нарушается диссоциация ЛНП-рецептора и частицы ЛНП внутри эндосомы. Это приводит к тому, что рецептор подвергается протеолитической деградации вместе с липопротеидом, что приводит к снижению количества рецепторов на клетках. Таким образом, снижение или потеря функции ЛНП-рецептора может вызываться самыми разнообразными биохимическими механизмами.

Хотя СГХС считается моногенным заболеванием, фенотипическая экспрессия, а именно возраст начала и тяжесть ИБС, сильно варьируют даже среди пациентов, несущих одинаковые мутации [Austin, 2004]. Некоторые пациенты доживают до 80 и более лет, в то время как другие умирают от инфаркта в 20 лет. Факторы, влияющие на клинические проявления, могут быть внешними, метаболическими и генетическими.

Из факторов внешней среды особенную роль играет курение и диетические привычки. Курение является одним из сильнейших предикторов смертности от ИБС у больных с СГХС. Роль диеты в развитии СГХС была продемонстрирована путем сравнения пациентов китайского происхождения, проживающих в Канаде, с носителями тех же мутаций, но живущими в Китае. У канадских китайцев уровень холестерина ЛНП был на 70% выше, чем в Китае. Кроме того, шесть из 16 гетерозигот, живущих в Канаде, имели ксантомы, а у четырех была ИБС. В отличие от этого, ни один из 18

16 обследованных, проживающих в Китае, не имел ксантом или ИБС [Pimstone, 1998]. По-видимому, такие различия в клинических проявлениях связаны с разным потреблением ненасыщенных жиров. Этот пример ярко иллюстрирует модифицирующее влияние внешних факторов, таких как диета, на фенотип гетерозиготной СГХС.

Течение заболевания сильно зависит от типа мутации, вызывающей гиперлипидемию [Goldstein, 2001]. Наиболее тяжелая гиперхолестеринемия развивается при наличии нуль-мутаций, приводящих к полному отсутствию активного рецептора, в то время как мутации с сохранением частичного синтеза или активности ЛНП-рецептора обычно вызывают более мягкое заболевание.

Известен ряд биохимических параметров, модифицирующих развитие ЖС у пациентов с СГХС [Austin 2004]. Такими метаболическими факторами являются: уровень ЛВП-холестерина, липопротеида Лп(а), С-реактивного белка и фибриногена. Некоторые из этих факторов, например уровень ЛВП-холестерина и липопротеида Лп(а) имеют выраженную генетическую основу. Другие доказанные или предполагаемые генетические факторы включают мутации в гене липопротеинлипазы, изоформы аполипопротеина Е, варианты белка, переносящего эфиры холестерина, полиморфизм параоксоназы (фермента, ращепляющего липидные перекиси), ТТ-генотип метилентетрагидрофолатредуктазы (связанный с повышенным уровнем гомоцистеина), полиморфизмы в генах ренин-ангиотензиновой системы, а также микросомального триглицеридпереносящего белка, влияющего на секрецию ЛОНП.

Таким образом, в генетическом плане мутации ЛНП-рецептора являются главным фактором, определяющим развитие СГХС. Вклад других генов несомненен [Мешков, 2005], однако вследствие относительной немногочисленности больных с идентифицированными мутациями ЛНП-рецептора требуются дальнейшие исследования генов-модификаторов. В идеале определение генотипа пациента по этим дополнительным генам позволит определять степень риска ИБС и других осложнений у носителей той или иной мутации в гене ЛНП-рецептора или апо В-100.

Семейная комбинированная гиперлипидемия

Семейная комбинированная гиперлипидемия (СКГЛ) - наследственное нарушение липидного обмена, при котором у пациента и его ближайших родственников имеются различные типы ГЛП, в том числе IIA, IIB, IV [Genest, 2003]. Заболевание наследуется по аутосомно-доминантному типу, а его пенетрантность определяется целым рядом факторов, таких как пол, ожирение, гиподинамия и т.д. Частота СКГЛ в популяции достигает 1-2%. Это атерогенная ГЛП, поскольку частота этого заболевания у больных моложе 60 лет с ИБС достигает 20%, а у больных с инфарктом миокарда -5%. Биохимические и генетические механизмы возникновения СКГЛ пока неизвестны. По-видимому, важный вклад в формирование СКГЛ вносит гиперпродукция апо B-содержащих липопротеидов печенью, замедленный постпрандиальный клиренс ремнантных липопротеидов, а также повышенный приток в печень свободных жирных кислот за счет уменьшения их захвата и утилизации на периферии [Murray, 1999].

Полигенная гиперхолестеринемия

Полигенная гиперхолестеринемия (ПГ) - по-видимому, наиболее распространенный тип наследственных ГЛП. Предполагается, что механизм возникновения ПГ заключается в чисто случайной кластеризации нескольких генетических аномалий в одной семье. Каждый из аллелей, участвующих в формировании ПГ по отдельности вызывает очень незначительное повышение уровня липидов, однако сочетание нескольких таких генов приводит к возрастанию уровня холестерина и триглицеридов до патологических значений. В отличие от семейной гиперхолестеринемии и других моногенных форм ГЛП, наследуемость ПГ ниже, а модифицирующая роль внешних факторов - гораздо выше.

Семейная гипертриглицеридемия

Семейная гипертриглицеридемия (СТГ) - наследственная форма ГЛП, характеризующаяся повышением уровня триглицеридов при наличии нормальной концентрации холестерина ЛНП [Genest, 2003]. Это заболевание, наследуемое по аутосомно-доминантному типу, фенотипически проявляется как ГЛП IV или V типов и развивается обычно после 30 лет. СТГ встречается у 1% населения; среди больных с ранней ИБС ее частота повышена в 5 и более раз, что свидетельствует об атерогенности СТГ. Механизмы возникновения СТГ и лежащие в ее основе генетические дефекты недостаточно ясны. По-видимому, это заболевание может вызываться мутациями в нескольких генах, а его развитие сильно зависит от факторов внешней среды. Метаболический дефект при СТГ заключается в гиперпродукции ЛОНП печенью, при этом катаболизм этих частиц может быть как нормальным, так и сниженным.

МЕХАНИЗМЫ АТЕРОГЕНЕЗА

Согласно современным представлениям, атеросклероз является формой хронического воспаления, являющегося результатом взаимодействия между модифицированными липопротеидами, макрофагами, образующимися из моноцитов, Т-клетками и нормальными клеточными элементами артериальной стенки [Navab, 2004]. Этот воспалительный процесс приводит к образованию повреждений, называемых атеросклеротическими бляшками, которые выступают в просвет сосуда. Разрыв бляшки и тромбоз приводят к таким острым клиническим осложнениям атеросклероза как инфаркт миокарда и инсульт. Известен целый ряд факторов риска атеросклероза как врожденного, так и приобретенного характера, однако только повышенный уровень холестерина сыворотки является достаточным для индукции атеросклероза в отсутствие других факторов риска. У человека большинство холестерина сыворотки переносится частицами ЛНП. Хотя ЛНП играют важную физиологическую роль в доставке холестерина в периферические ткани, повышенный уровень ЛНП связан с повышенным риском сердечно

19 сосудистых заболеваний. ЛНП захватывается клетками с помощью ЛНП-рецепторов, узнающих амино-терминальный домен апоВ-100. Уровень ЛНП в кровотоке в значительной степени определяется скоростью его захвата печенью через ЛНП-рецепторы [Goldstein, 2001]. Экспрессия ЛНП-рецепторов регулируется по принципу отрицательной обратной связи внутриклеточным уровнем холестерина. Низкий уровень холестерина внутри клетки ведет к активации транскрипционного фактора SREBP, который стимулирует транскрипцию гена ЛНП-рецептора и других генов, участвующих в биосинтезе холестерина [Brown, 1997].

Целенаправленное разрушение генов ano Е или ЛНП-рецептора, так же как гиперэкспрессия гена человеческого ano В-100 у мышей, приводит к заметному повышению уровней холестерина, содержащегося в ЛОНП и/или ЛНП [Zhang, 1992]. Если такие животные получают диету с высоким содержанием холестерина, уровень холестерина в их плазме достигает исключительно высоких значений и превышает 1500-2000 мг/дл. Хотя мыши обычно очень устойчивы к развитию атеросклероза, комбинация этих генетических и алиментарных факторов приводит к выраженному атеросклеротическому поражению аорты, которое во многом сходно с атеросклеротическими участками артерий человека. Скрещивание «гиперхолестеринемических» мышей с линиями мышей, нокаутированных или гиперэкспрессирующих различные гены дает возможность изучать роль отдельных белков в атерогенезе, что позволило идентифицировать многочисленные белки, повышающие или снижающие скорость развития атеросклероза.

Инициация, атерогенеза

Атеросклеротические поражения начинают развиваться как липидные полосы под эндотелием больших артерий. Основными клеточными событиями в развитии липидных полос являются накопление в стенке макрофагов и захват ими ЛНП. Многочисленные данные показывают, что окислительная модификация липидов и ano В-100 являются пусковыми

20 факторами в образовании липидных полос. Об этом, в частности, свидетельствуют иммунологические доказательства присутствия окисленных ЛНП в стенках фетальных артерий человека до появления макрофагов [Napoli, 1997]. Свойства окисленных ЛНП (окЛНП), которые обычно изучают после окисления нативных ЛНП in vitro, зависят от ' степени модификации, которая может изменяться от «минимальной» (ммЛНП), при которой частица ЛНП все еще узнается ЛНП-рецептором, до выраженного окисления, при котором ano В фрагментируется, а остатки лизина ковалентно модифицируются активными продуктами окисления липидов. Такие частицы не связываются с ЛНП-рецептором, но способны взаимодействовать с • несколькими типами так называемых скевенджер-рецепторов, экспрессируемых на макрофагах и гладкомышечных клетках. Предполагается, что в плазме ЛНП защищены от окисления, но при связывании с белками внеклеточного матрикса в стенке сосуда частицы подвергаются ферментативным и неферментативным модификациям [Williams, 1998]. МмЛНП и окЛНП и их компоненты обладают целым рядом провоспалительных и проатерогенных свойств, а их присутствие in vivo было показано на ряде животных моделей и у человека (см. ниже).

Накопление моног^итов/макрофагов

Хотя выход моноцитов в артериальную стенку и их последующая дифференцировка в макрофаги первоначально может играть защитную роль и служить для удаления цитотоксичных и провоспалительных частиц окЛНП или апоптозных клеток, прогрессирующее накопление макрофагов и захват ими окЛНП постепенно приводит к развитию атеромы. У мышей линии ор, имеющих спонтанно возникшую мутацию в гене, кодирующем макрофагальный колониестимулирующий фактор и у которых почти полностью отсутствуют макрофаги, наблюдается высокая устойчивость к развитию атеросклероза при скрещивании с ano E-дефицитными мышами, несмотря на повышеный уровень холестерина плазмы [Smith, 1995].

Выход моноцитов в .подверженные развитию атеросклероза участки артерий регулируется молекулами клеточной адгезии, экспрессируемыми на поверхности эндотелиальных клеток в ответ на действие воспалительных стимулов. Важно отметить, что участки повышенной экспрессии молекул адгезии перекрываются с теми участками артериального дерева, в которых наиболее часто развивается атеросклероз. По-видимому, в участках ветвления артерий в результате изменений динамики кровотока нарушаются эндогенные атеропротективные механизмы. Например, отсутствие нормального напряжения сдвига под действием ламинарного пристеночного течения может снижать продукцию эндотелием оксида азота (N0), обладающего не только вазодилататорными, но и противовоспалительными свойствами. Помимо эндотелиальной NO-синтазы, еще целый ряд генов, обладающих потенциально «атеропротективными» свойствами, содержат в промотерных районах участки, чувствительные к напряжению сдвига. Например, супероксиддисмутаза экспрессируется на более высоком уровне в участках ламинарного тока, где она нейтрализует окислительный стресс и таким образом ограничивает экспрессию VCAM-1 и другие воспалительные механизмы [Topper, 1999].

Первичным процессом в экстравазации лейкоцитов является активация эндотелия, о чем свидетельствуют данные, полученные на животных, получающих диету с высоким содержанием холестерина. Нормальный эндотелий обычно не связывает лейкоциты. Однако вскоре после начала атерогенной диеты группы эндотелиальных клеток начинают экспрессировать на своей поверности определеные молекулы адгезии, связывающие различные классы лейкоцитов. В частности, VCAM-1 связывает именно те типы лейкоцитов, которые обнаруживаются в ранних атеромах человека и животных, а именно моноциты и Т-лимфоциты.

Выход моноцитов регулируется несколькими типами молекул клеточной адгезии. Одной из таких молекул, по-видимому, является VCAM-1, которая экспрессируется на эндотелиальных клетках в участках, подверженных развитию атеросклероза. Определенный вклад вносят Е

22 селектин и Р-селектин, о чем свидетельствует 40-60% снижение атеросклероза у мышей с тройным нокаутом по ano Е, Е- и Р-селектину. Подобным образом, нокаут по ICAM-1 приводит к небольшому, но достоверному снижению выхода моноцитов в атеросклеротические сосуды у ano Е-нокаутированных мышей. Хроническое введение пептидомиметика, соответствующего CS-1-домену фибронектина 1, который блокирует функцию адгезионной молекулы VLA-4 на поверхности лейкоцитов, снижало накопление липидов в сосудах мышей, получавших атерогенную диету [Shih, 1999]. Суммарно приведенные данные показывают, что выход моноцитов и Т-клеток в атеросклеротические участки сосудов опосредуется целым рядом молекул клеточной адгезии. Нейтрофилы, обычно присутствующие при большинстве типов воспаления, в атеромах отсутствуют. Механизмы исключения нейтрофилов пока неизвестны.

Одним ■ из главных хемокинов, опосредующих экстравазацию лейкоцитов является МСР-1. Нокаут генов МСР-1 или его рецептора CCR-2 заметно снижает развитие атеросклероза у мышей с гиперхолестеринемией [Gu, 1998; Boring, 1998]. По-видимому, определенную роль играет также IL-8 и его рецептор CXCR2. В атероме также повышена экспрессия других хемокинов, которые могут иметь отношение к рекрутированию лимфоцитов, в том числе СХС хемокины, индуцируемые IFN-y [Mach, 1999].

Миграция моноцитов в артериальную стенку, по-видимому, частично стимулируется окЛНП, который обладает способностью непосредственно привлекать моноциты, а также способен индуцировать экспрессию таких хемокинов как MCP-1.

Одним из цитокинов, стимулирующих превращение моноцитов в макрофаги, является макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-CSF). M-CSF усиливает экспрессию скевенджер-рецептора А, повышает производство цитокинов и факторов роста макрофагами, а также выступает в роли антиапоптозного и ко-митогенного стимула. Экспрессия M-CSF повышена в атеросклеротических бляшках человека и животных [Clinton, 1992]. Нокаутирование гена M-CSF у гиперхолестеринемических мышей

23 приводит к замедлению развития поражений и заметно сниженному накоплению макрофагов [Smith, 1995]. Гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) также может вносить вклад в воспалительную реакцию в атероме. GM-GSF способствует выживанию популяции мононуклеарных фагоцитов, содержащих миелопероксидазу, фермент,, образующий гипохлорную кислоту, потенциальный источник окислительного стресса и воспаления в атероме человека [Sugiyama, 2001].

Образование пенистых клеток

Образование из макрофагов «пенистых клеток» является характерной чертой ранних и поздних стадий атеросклероза. Накопление холестерина в этих клетках опосредуется главным образом захватом модифицированных форм ЛНП с помощью так называемых скевенджер-рецепторов. Распознавание окЛНП скевенджер-рецепторами опосредуется, по крайней мере отчасти, окисленными фосфолипидами как в липидной фазе, так и в виде ковалентных аддуктов на ano В-100 [Horkko, 2000]. Хотя в суммарный процесс вносят вклад несколько рецепторных белков, скевенджер рецепторы A (SR-A) и CD36 играют основную роль. Об этом свидетельствует значительное уменьшение размера бляшек у ano E-дефицитных мышей, скрещенных с нокаутами по SR-A и CD36 [Suzuki, 1997; Febraio, 2000].

Холестерин, входящий в состав окЛНП и попадающий в макрофаги с помощью скевенджер-рецепторов, состоит из свободного холестерина и эфиров холестерина, которые гидролизуются в лизосомах. В дальнейшем свободный ' холестерин может эстерифицироваться ацил-СоА холестеринацилтрансферазой и храниться в виде липидных капель, характерных для пенистых клеток. Эфиры холестерина в этих каплях, в свою очередь, могут гидролизоваться гормон-чувствительной липазой с образованием свободного холестерина, который включается в мембраны или транспортируется из клетки. Включение в состав мембран избытка холестерина ингибирует протеолитическую активацию транскрипционных факторов SREBP, необходимых для биосинтеза холестерина и экспрессии

24

ЛНП-рецептора. Хотя, это . предотвращает дальнейшее накопление холестерина через эти механизмы, захват холестерина через скевенджер-рецепторы или фагоцитозные механизмы не изменяется. Таким образом, ключевыми для поддержания гомеостаза холестерина в макрофаге становятся механизмы выброса холестерина.

В макрофаге существуют два потенциальных механизма удаления избытка холестерина: ферментативное превращение в более растворимые формы и выброс с помощью мембранных переносчиков. Фермент холестерин 27-гидролаза экспрессируется в макрофагах в достаточно больших количествах и потенциально может играть роль в экскреции холестерина путем его превращения в более растворимый 27-ОН-холестерин. Однако главным механизмом удаления из клетки холестерина является его выброс с участием мембранных переносчиков, а первичным внеклеточным акцептором служит ЛВП. Эта роль ЛВП крайне важна для физиологического «обратного транспорта холестерина» и объясняет, почему риск атеросклероза обратно пропорционален уровню холестерина ЛВП. Хотя делеции гена ano AI, являющегося главным белковым компонентом ЛВП, недостаточно, чтобы вызвать атеросклероз у мышей, при скрещивании с гиперхолестеринемическими мышами дефицит ano AI приводит к более выраженному атеросклерозу, в то время как гиперэкспрессия ano AI является защитной. Имеются также данные, что макрофаги способны вносить непосредственный вклад в доступность внеклеточных акцепторов холестерина путем синтеза и секреции ano Е, который участвует в формировании частиц ЛВП.

Выброс холестерина из клеток опосредуется мембранным белком АВСА1, который транспортирует холестерин из клетки на ЛВП. После захвата холестерина частицами ЛВП он эстерифицируется в эфиры холестерина ферментом лецитин-холестерин ацилтрансферазой (ЛХАТ). В дальнейшем ЛВП может обменивать эфиры холестерина на триглицериды других липопротеидов с помощью белка, переносящего эфиры холестерина, либо доставлять эфиры холестерина в печень для экскреции путем

25 связывания с ЛВП-рецептором БЛ-В1. Важность этого рецептора иллюстрируется тем, что у гиперхолестеринемических мышей, гомозиготных по неактивным аллелям 811-В1, развивается более выраженный атеросклероз, в то время как гиперэкспрессия 811-В1 приводит к уменьшению выраженности атеросклероза.

Прогрессия пораэюения и иммунологический ответ

Переход от относительно простой липидной полосы к более сложному поражению характеризуется иммиграцией гладкомышечных клеток из медиального слоя артерии через внутреннюю эластическую мембрану в интимальное (субэндотелиалы-юе) пространство. Интимальные гладкомышечные клетки могут пролиферировать и захватывать модифицированные липопротеиды, внося. вклад в образование пенистых клеток, а также синтезировать белки внеклеточного матрикса, что приводит к образованию фиброзной покрышки. Эта фаза развития повреждения включает взаимодействие между моноцитами/макрофагами и Т-клетками, приводящее к разнообразным клеточным и гуморальным ответам и развитию многих характерных черт хронического воспаления. Между клеточными элементами развивающегося повреждения существуют многочисленные паракринные связи. Активированные Т-клетки в участке повреждения экспрессируют как ТЫ, так и ТЪ2 цитокины. Макрофаги, эндотелиальные и гладкомышечные клетки также находятся в активированном состоянии, о чем свидетельствует экспрессия молекул МЫС II и таких провоспалительных белков, как ЮТа, 1Ь-6 и МСР-1.

Лимфоциты, по-видимому, не играют ключевой роли в развитии атеросклероза. Скрещивание апо Е-дефицитных мышей с мышами, нокаутированными по рекомбиназе 11АО-1, вследствие чего у них отсутствуют как Т-, так и В-лимфоциты, не влияет на формирование атеросклеротических поражений при получении холестериновой диеты, но частично снижает их развитие на нормальной диете. Таким образом, иммунные ответы могут модулировать течение атерогенеза. Эффекты,

26 вызываемые иммуномодуляторными цитокинами, могут быть как про-, так и антиатеросклеротическими. Например, активный Thl-цитокин интерферону уменьшает экспрессию скевенджер-рецептора на макрофагах, снижает синтез коллагена и ингибирует пролиферацию гладкомышечных клеток, то есть оказывает потенциально антиатеросклеротические эффекты. С другой стороны, IFNy активирует продукцию воспалительных цитокинов макрофагами и снижает экспрессию молекул МНС II класса. Эти эффекты могут повышать накопление макрофагов в повреждениях и увеличивать их способность презентировать антиген Т-клеткам. Суммарный эффект IFNy у мышей является атерогенным, поскольку у двойных нокаутов по ano Е и рецептору IFNy атеросклероз развивался в меньшей степени, чем у контрольных ano E-дефицитных мышей [Gupta, 1997]. Другой Thl-цитокин, лиганд CD40, стимулирует экспрессию разнообразных атерогенных молекул макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками, включая' цитокины, матриксные металлопротеиназы, молекулы адгезии и тканевой фактор. Ингибирование СБ40-зависимой сигнализации с помощью генетических или иммунологических подходов снижало развитие атеросклероза и приводило к развитию более стабильной бляшки.

Th.2 цитокины также оказывают сложный эффект на развитие атеросклеротических повреждений. Интерлейкин-4 оказывает ряд эффектов, предположительно являющихся антиатерогенными, включая антагонизм активности IFNy в макрофагах и ингибирование функции Thl-клеток. Однако, IL-4 является также активным индуктором 15-липоксигеназы, которая способствует окислению ЛНП и развитию атеросклероза у мышей. Интерлейкин-10, который регулирует Thl-клетки, обладает способностью снижать активность макрофагов и модулировать ряд других клеточных процессов, потенциально связанных с развитием и стабильностью атеросклеротической бляшки. У мышей, дефицитных по IL-10, накапливается в 3 раза больше липидов, что свидетельствует о преимущественно антиатерогенном действии IL-10.

Эти наблюдения показывают, что в атеросклеротических повреждениях происходит постоянная иммунная активация. Какие именно антигены играют роль в этой активации, достоверно не установлено. Предполагается, что это могут быть бактериальные или вирусные антигены, белки теплового шока, и неоэпитопы, например антигенные эпитопы, возникшие в результате образования аддуктов между окисленными липидами и белками. По-видимому, окЛНП играют важную роль в качестве доминантных иммуногенов. Об этом, в частности, свидетельствуют данные о сильной корреляции между титрами антител против эпитопов окЛНП и степенью атеросклероза [Ногкко, 2000]. Неизвестно, однако, являются ли подобные аутоантитела простыми маркерами заболевания, либо они играют какую-либо физиологическую или патологическую роль.

Стабильность бляшки

Хотя выраженные атеросклеротические бляшки могут вызывать ишемические симптомы в результате прогрессирующего сужения просвета сосуда, принято считать, что инфаркт миокарда и инсульт обычно являются результатом разрыва бляшки и тромбоза. При разрыве бляшки находящиеся внутри нее липиды и тканевой фактор вступают в контакт с компонентами крови, инициируя коагуляционный каскад, адгезию тромбоцитов и тромбоз. Разрывы бляшек, приводящие к инфаркту миокарда, обычно происходят в области плеча бляшки, и чаще всего развиваются в повреждениях с тонкой фиброзной покрышкой, высоким содержанием пенистых клеток в районе плеча и большим некротическим ядром. Формирование некротического ядра связано с апоптозной гибелью макрофагов и гладкомышечных клеток, а также со сниженным удалением таких клеток. Выделение окисленных и нерастворимых липидов из некротических клеток приводит к накоплению детрита, характерному для поздних стадий развития атеромы.

Матриксные металлопротеиназы, секретируемые макрофагами, обнаруживаются в участках разрыва бляшек и, как предполагается, влияют на стабильность бляшки путем разрушения белков внеклеточного матрикса

28

Carmeliet, 2000]. К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют надежные животные модели, позволяющие изучать острые тромботические осложнения атеросклероза. Хотя высокий уровень некоторых факторов свертывания, таких как фибриноген и фактор VII ассоциирован с риском сердечнососудистых заболеваний, тем не менее генетическая модуляция процессов свертывания и фибринолиза, заключающаяся в нокаутировании генов фибриногена или ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1), не уменьшает размер атеросклеротического поражения артерий у мыши.

Еще одним процессом, влияющим на стабильность бляшки, является неоваскуляризация. Ангиогенез связан с ремоделированием ткани и активацией протеаз, в связи с чем представляется вероятным, что этот процесс может вносить вклад в развитие нестабильности и разрыв бляшек. Было показано, что у ano Е-нокаутированных мышей развивается неоваскуляризация атеросклеротических участков сосудов, а ингибиторы ангиогенеза существенно снижают размер повреждений у этих животных [Moulton, 1999].

Острые тромботические осложнения атеросклероза

Процессы воспаления в сосуде не только способствуют инициации и прогрессии атеромы, но и вносят существенный вклад в индукцию острых тромботических осложнений. Большинство коронарных артериальных тромбов, вызывающих острый инфаркт миокарда, возникает в результате физического разрыва атеромы. Активированные макрофаги секретируют протеазы, которые разрушают коллаген, придающий прочность фиброзной покрышке. В то же время интерферон-у, производимый активированными Т-лимфоцитами, подавляет синтез коллагена гладкомышечными клетками. Макрофаги также синтезируют тканевой фактор свертывания, являющийся главным прокоагулянтом, присутствующим в бляшке. Воспалительные цитокины стимулируют экспрессию тканевого фактора макрофагами, что является еще одним механизмом, связывающим артериальное воспаление и тромбоз.

Клинические наблюдения, в частности серийные ангиографические исследования, показывают, что повреждения коронарных артерий у человека развиваются не постепенно, а время от времени этот процесс ускоряется. Патологоанатомические данные позволяют предположить, что в основе этих ускорений может быть физическое разрушение и микротромбоз бляшки. Выделяют три типа повреждений бляшки. Поверхностные эрозии -микроскопические участки слущиваиия эндотелиальных клеток, образующих монослой, покрывающий интиму, часто встречаются у человека и животных с экспериментально индуцированным атеросклерозом. Такие ограниченные по размеру участки деэндотелизации часто создают основу для образования тромба, поскольку они оголяют субэндотелиальный коллаген и фактор фон Виллебранда, способствующие адгезии и активации тромбоцитов. Хотя чаще всего поверхностные эрозии проходят бессимптомно, они могут являться причиной примерно одной четверти всех фатальных коронарных тромбозов.

Еще один вариант быстрого прогрессирования бляшки связан с разрушением микрососудов, образовавшихся в бляшке в результате неоангиогенеза. Подобно сосудам, образующимся в диабетической сетчатке, новые кровеносные сосуды в бляшке характеризуются хрупкостью и склонностью к микроскопическим кровоизлияниям. Ряд данных показывает, что внутри бляшек человека может развиваться тромбоз. В частности, в бляшках обнаруживается фибрин, продукты его расщепления и гемосидерин. Тромбоз in situ ведет к образованию тромбина, который, помимо расщепления фибриногена, активно стимулирует миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток. Тромбин стимулирует секрецию тромбоцитами тромбоцитарного фактора роста (PDGF), который дополнительно стимулирует миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток. Активированные тромбоциты также вырабатывают трансформирующий фактор бета (TGF-p), который является наиболее активным стимулятором синтеза интерстициалы-юго коллагена гладкомышечными клетками. Таким образом, микроскопическое кровоизлияние внутри бляшки может дать толчок развитию атеромы.

Третий и наиболее частый механизм повреждения бляшки заключается в разрыве фиброзной покрышки, которая защищает богатую липидами тромбогенную сердцевину атеромы от контакта с кровотоком и факторами коагуляции. Повреждение покрышки приводит к контакту факторов свертывания с тканевым фактором, основным тромбогенным стимулом в липидном ядре. Хотя разрывы фиброзной покрышки вызывают примерно три четверти острых инфарктов миокарда, большинство таких событий, по-видимому, протекают бессимптомно. Если фибринолиз перевешивает прокоагулянтные механизмы, то развивается не окклюзирующий тромб, но ограниченный по размерам внутристеночный тромб. Дальнейшая резорбция тромба и выделение PDGF и TGF-J3 стимулируют образование фиброзной ткани и накопление гладкомышечных клеток, что приводит к быстрой прогрессии атеромы.

Суммируя приведенные данные можно сказать, что эволюция бляшки тесно связана с тромбозом.

Окислеиие липопротеидов

Согласно современным представлениям большую роль в атерогенёзе, особенно на ранних стадиях играют окисленные ЛНП. По-видимому, различные формы гиперлипидемий проявляют атерогенное действие не только вследствие повышения уровня ЛНП, но и в результате повышенной склонности липопротеидных частиц к окислению (Ланкин, 2003). В 1979 г. Chisolm и соавт. показали, что окисленные ЛНП токсичны для клеток стенки артерии и предположили, что окисление ЛНП может играть важную роль в атерогенезе [Hessler, 1979]. В дальнейшем в составе окисленных ЛНП был обнаружен целый ряд токсичных компонентов, в том числе гидроперекиси холестерина [Colles, 2001]. Второе открытие, ключевое для современного понимания механизмов атерогенеза было сделано в том же 1979 г. Brown и Goldstein, которые показали, что скевенджер-рецепторы взаимодействовали с ацетилированными, но не с нативными ЛНП, а захват ацетилированных ЛНП макрофагами приводил к образованию клеток с характерной морфологией

31 пенистых клеток [Goldstein, 1979]. Поскольку ацетилирование ЛНП in vivo не происходит, были начаты активные поиски физиологического лиганда для скевенджер-рецептора. Fogelman и соавт. показали, что скевенджер-рецептор макрофагов узнает ЛНП, модифицированные малоновым диальдегидом, который образуется при окислении арахидоновой кислоты в липоксигеназном пути [Fogelman, 1980]. Годом позднее Steinberg и соавторы показали, что под действием эндотелиальных клеток, культивируемых в среде, содержащей высокую концентрацию ионов металлов, ЛНП могут становиться лигандами для скевенджер-рецептора [Henriclcsen, 1981]. Механизмы этой модификации были расшифрованы позднее [Morel, 1984; Steinbrecher, 1984; Heinecke, 1984]. Очень важным было доказательство того, что окисленные ЛНП действительно присутствуют в стенках пораженных атеросклерозом артерий животных и человека [Haberland, 1988; Palinski, 1989; Yla-herttuala, 1989]. Witztum, Steinberg, Parthasarathy [Witztum, 1991; Witztum 1994] и Chisolm [Chisolm, 1991] показали, что клетки артериальной стенки производят молекулы, обладающие окислительным потенциалом, и секретируют их в субэндотелиальное пространство. Navab и соавт. показали, что при совместном культивировании разных типов сосудистых клеток они способны образовывать изолированные микрополости, куда и происходит секреция продуктов окислительных реакций клетки. В этих микрополостях отсутствуют водорастворимые антиоксиданты, что приводит к мягкому окислению ЛНП [Navab, 1991].

Индукция входа моноцитов в стенку артерии

Napoli и соавт. показали, что накопление и окисление ЛНП предшествуют входу моноцитов в стенку сосуда [Cushing, 1990]. Изучая 1 артерии плодов человека, они обнаружили, что ЛНП присутствовали и подвергались окислению до начала входа моноцитов, и что вход моноцитов начинался в участках накопления окисленных ЛНП. Эти данные позволили предположить, что окисление ЛНП является причиной входа моноцитов, но не результатом их метаболизма моноцитами [Cushing, 1990]. Berliner и соавт.

32 показали, что минимально окисленные (модифицированные) ЛНП (ммЛНП), еще не потерявшие в результате окисления способности связываться с апоВ,Е-рецептором, стимулировали способность эндотелиальных клеток аорты связывать моноциты, но не нейтрофилы, и вызывали синтез моноцитарного хемоатрактанта МСР-1 и дифференцировочного фактора М-CSF [Rajavashisth, 1990; Vora, 1997; Liao, 1991]. В последующем было показано, что биологическая активность ммЛНП была связана с действием окисленных фосфолипидов (окФЛ), содержащих в .w-2-положении окисленную арахидоиовую кислоту [Watson, 1997; Subbanagounder, 2000; Subbanagounder, 2002; Marathe, 2002]. Измерение концентрации окФЛ в атеросклеротических участках сосудов животных показало, что in vivo они присутствуют в концентрациях, достаточных для развития биологических эффектов [Subbanagounder, 2002]. Кроме того, было показано, что окФЛ образуются в мембранах клеток, подверженных окислительному стрессу в результате действия воспалительных цитокинов [Poliakov, 2003] или в ходе апоптоза [Huber, 2002]. Механизмы образования окЛНП

В течение многих лет предполагалось, что окЛНП образуются под действием активных форм кислорода (АФК), продуцируемых клетками [Witztum, 1991; Witztum, 1994; Chisolm 1991]. Впервые это предположение было подтверждено в опытах in vivo, проведенных Funk и соавт., которые показали, что у мышей с двойным нокаутом по генам апоЕ и 12/15-липоксигеназы атеросклероз развивается значительно медленнее, чем у мышей с нокаутом только по апоЕ [Steinberg, 1999; Cyrus, 2001; George,

2001]. Аналогичные результаты были получены при инактивации гена 12/15-липоксигеназы у мышей, нокаутированных по гену ЛНП-рецептора [Zhao,

2002]. Напротив, гиперэкспрессия 12/15-липоксигеназы в эндотелии ЛНП-рецептор-нокаутированных мышей приводила к усилению атеросклеротического процесса [Reilly,. 2004]. Более того, умеренное повышение активности 12/15-липоксигеназы у трансгенных мышей, не имеющих дефектов в генах апоЕ или апоВ,Е-рецептора, приводило к

33 развитию липидных полос в аорте даже в том случае, когда мыши содержались на обычной диете со стандартным содержанием жиров [Reilly, 2004].

Миелопероксидаза является активным продуцентом АФК. Продукты миелопероксидазной активности были обнаружены в атеросклеротических участках сосудов человека [Thuldcani, 2003]. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о способности миелопероксидазы стимулировать образование провоспалительных окФЛ [Marathe, 2002; Carr, 2000].

Еще один механизм образования АФК в стенке сосудов, потенциально приводящий к образованию окФЛ - фермент NADPH-оксидаза [Sorescu, 2001]. Было показано, что гиперэкспрессия этого фермента в гладкомышечных клетках сосудов приводит к ускоренному развитию атеросклероза.

Окислеиные фосфолипиды - индукторы воспаления при атеросклерозе

Характерной чертой атеросклероза является накопление в стенке сосуда моноцитов, то есть асептическое моноцитарное воспаление. Накапливается все больше данных, показывающих, что продукты окисления липидов могут играть : ключевую роль в инициации и поддержании моноцитарного воспаления при атеросклерозе. В пользу этого предположения говорят факты о способности окисленных липидов имитировать в экспериментах in vitro все основные события атерогенеза.

Липопротеиды, подвергающиеся окислению в стенке сосуда, содержат несколько классов липидов [Белова, 2000]. Одними из первых окислению подвергаются фосфолипиды, содержащие основную массу полиненасыщенных жирных кислот в составе ЛНП. Окисленные фосфолипиды (окФЛ) вызывают целый ряд клеточных эффектов, потенциально стимулирующих атерогенез. Было показано, что окФЛ являются активным компонентом ммЛНП и способны стимулировать способность эндотелиальных клеток связывать моноциты, что является

34 первым этапом в трансэндотелиальной миграции этих клеток [Watson, 1997]. Наиболее изученными окФЛ являются продукты окисления фосфатидилхолина, несущего остаток пальмитиновой кислоты в sn-1-положении и арахидоновую кислоту в sn-2-положении. В результате окисления арахидоновой кислоты образуются оксигенированные или фрагментированиые производные арахидоната, остающиеся связанными с фосфолипидом через сложноэфирную связь. Первыми были идентифицированы фрагментированиые окФЛ, несущие во 2-м положении четырехуглеродный фрагмент, заканчивающийся карбоксильной или альдегидной группировкой [Watson, 1997]. Включение кислорода в арахидоновую кислоту приводит к образованию таких производных как эпоксиизопростан. Как фрагмеитированные, так и оксигенированные производные стимулируют адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам и экспрессию моноцитарных хемоаттрактантов [Watson, 1997; Subbanagounder, 1999].

Активность продуктов окисления фосфолипидов зависит от типа химической связи в sn-1 -положении. Фосфолипиды, содержащие простую эфирную связь в sn-1 -положении (алкил-ФЛ) после окислительной фрагментации полиненасыщенной жирной кислоты в ¿'и-2-положении становятся агонистами рецептора PAF [Mclntyre, 1999]. Такие окисленные алкил-фосфолипиды, часто называемые «PAF-подобными липидами», способны активировать полиморфноядерные лейкоциты, тромбоциты и моноциты через PAF-рецептор [Marathe, 2002].

Рецепторы, опосредующие действие окФЛ, пока неизвестны. Действие некоторых ацил-окФЛ ингибируется антагонистами рецептора PAF; с другой стороны, эти эффекты не воспроизводятся при добавлении PAF, в связи с чем было высказано предположение о существовании собственных рецепторов для ацил-окФЛ, обладающих структурной гомологией с рецептором PAF [Leitinger, 1997]. Более того, рецептор PAF преимущественно связывает фосфолипиды, содержащие фосфохолин, в то время как ацил-окФЛ оказывают свое действие независимо от типа полярной группы фосфолипида

35

Subbanagounder, 2000], в связи с чем механизм клеточной активации, не связанный с PAF-рецептором, представляется более вероятным. Существуют данные, позволяющие предположить, что эффекты некоторых окФЛ опосредуются неидентифицированными рецепторами, сопряженными с G-белками [Parhami, 1995]. Нельзя также исключить, что окФЛ влияют на клеточную мембрану и таким образом стимулируют сигнализацию, либо проникают через мембраны и связываются с внутриклеточными мембранами. В целом, проблема механизмов клеточной рецепции окФЛ является одной из наиболее актуальных и малоизученных в области трансдукции регуляторных сигналов.

Образование окФЛ

Было показано, что окФЛ накапливаются в участках атеросклероза в стенках сосудов [Berliner, 2001; Podrez, 20026]. Однако атеросклеротические бляшки являются не единственным местом, где накапливаются окФЛ. Воспаление всегда сопровождается окислительным стрессом. В частности, при остром бактериальном воспалении АФК, продуцируемые лейкоцитами, убивают бактерии, но также повреждают молекулы макроорганизма. Было У показано, что миелопероксидаза способствует перекисному окислению липидов путем образования тирозильных радикалов [Podrez, 2000]. Участие миелопероксидазы в перекисном окислении липидов дополнительно иллюстрируется данными, показывающими, что в лейкоцитах пациентов с врожденным отсутствием этого фермента окисление липидов значительно снижено по сравнению с лейкоцитами здоровых доноров [Zhang, 2002]. ОкФЛ образуются в легких под действием озона, который окисляет липиды сурфактанта, на 90% состоящего из фосфолипидов [Nakamura, 1998], а также при ишемии [Matot, 2003]. Эти и другие данные показывают, что образование окФЛ характерно не только для атеросклероза, но и для других типов острого и хронического воспаления, где окФЛ могут оказывать свое провоспалительное действие.

Помимо воспаления, еще одним типом клеточных процессов, при которых образуются окФЛ, является апоптоз. Известно, что апоптоз сопровождается окислением всех классов фосфолипидов под действием АФК, производимых NADPH-оксидазой [Arroyo, 2002]. Было показано, что перенос окФЛ на внешнюю поверхность клетки необходим для удаления апоптировавших клеток [Kagan, 2002], и что окисленные эпитопы на апоптозных клетках узнаются антителами [Chang, 1999] и С-реактивным белком [Chang, 2002]. Кроме того, было обнаружено, что участки мембран, «сброшенные» адоптирующими клетками (мембранные микровезикулы) содержат окФЛ, ловышающие способность эндотелиальных клеток связывать моноциты [Huber, 2002]. Такие микровезикулы были обнаружены в ряде органов при различных патологических состояниях. Таким образом, апоптозные клетки и образующиеся из них микровезикулы являются еще одним источником окФЛ. Сигнальные эффекты окФЛ

ОкФЛ способны активировать несколько внутриклеточных сигнальных путей, в том числе повышение cAMP [Parhami, 1993], повышение уровня цитоплазматического кальция [Bochkov, 2002 Blood], активацию МАР-киназного каскада [Bochkov, 2002 Blood], а также ингибирование фосфатазы МАР-киназ [Reddy, 2001]. Эти эффекты приводят к активации транскрипции, опосредуемой транскрипционными факторами Egr-1 и NFAT [Bochkov, 2002 Blood], CREB [Kronke, 2003], PPARa [Lee, 2000] и PPARy [Davies, 2001]. Было показано, что PPARa в эндотелиальных клетках активируется под действием окисленного фосфатидилхолина, содержащего в яи-2-положении такие оксигенированные производные арахидоновой кислоты как эпоксиизопростаны и эпоксициклопентеноны [Subbanagounder, 2002]. В отличие от этого, окФЛ не активируют в эндотелиальных клетках такой важный сигнальный путь icaicNFicB [Bochkov, 2002 Blood; Gimbrone, 1995].

Было показано, что ОкФЛ стимулируют экспрессию в эндотелиальных клетках аорты человека таких важных цитокинов как МСР-1, IL-8 и GRO-a, а также других генов, играющих важную роль в атерогенезе, ангиогенезе и

37 воспалении [van Lenten, 2001]. В частности, под действием окФЛ повышается экспрессия транскрипционных факторов Egr-1 и FosB [Bochkov, 2002 Blood; van Lenten, 2001], которые в свою очередь участвуют в регуляции большого числа генов. Под действием окФЛ повышается уровень экпрессии на эндотелиальных клетках тканевого фактора свертывания [Bochkov, 2002]. Механизм этого повышения включает активацию протеинкиназы С, ERK-киназ и повышение уровня Egr-1, а также Са2+-зависимую активацию транскрипционного фактора NFAT [Bochkov, 2002 Blood], Совместное действие Egr-1 и NFAT приводит к активации транскрипции гена тканевого фактора. Дополнительный вклад в развитие прокоагулянтного состояния эндотелиальных клеток вносит снижение экспрессии антикоагулянтного глшсопротеина тромбомодулина, уровень транскрипции которого снижается после обработки культивируемых эндотелиальных клеток окисленными ЛНП [Ishii, 2003]. Данный эффект вызывался окФЛ, но не другими липидными компонентами окЛНП и был связан с ингибированием связывания гетеродимеров рецептора ретиноевой кислоты и ретиноидного Х-рецептора, а также транскрипционных факторов Spl и Sp3 с их участками связывания в промотере тромбомодулина [Ishii, 2003]. Таким образом, можно предположить, что окФЛ являются стимулом для развития прокоагулянтного состояния эндотелия.

Еще один транскрипционный ' эффект окФ Л, заслуживающий упоминания - это индукция циклооксигеназы-2 (СОХ-2). Было показано, что образующиеся при окислении PAF-подобные (алкил-) фосфолипиды повышают экспрессию СОХ-2 в моноцитах, что приводило к повышению продукции простагландина Е2 [Pontsler, 2002]. По-видимому, в основе этого эффекта лежала активация PPARy, который, как было показано, активируется под действием синтетических PAF-подобных фосфолипидов [Davies, 2001]. В пользу этого предположения свидетельствовала также способность селективного агониста PPARy розиглитазона индуцировать экспресию СОХ

2 и увеличивать производство простагландина Е2. Таким образом, ацил-окФЛ способны участвовать в воспалительных процессах путем усиления

38 транскрипции СОХ-2 и повышения концентрации про стагл ан д ино в, оказывающих целый ряд эффектов на течение воспалительной реакции.

Противовоспалительные и цитопротективные эффекты окФЛ

Хотя хорошо известно, что высокие концентрации окФЛ цитотоксичны и вызывают гибель клеток, было также показано, что низкие уровни окФЛ вызывают различные противовоспалительные и цитопротективные эффекты.

Глютатион является одним из главных веществ, участвующих в защите клеток от окисляющих агентов. Было показано, что ОхРАРС повышает уровень экспрессии и активность регуляторной субъединицы глютамат-цистеин-лигазы [Moellering, 2002]. При этом развивалась повышенная устойчивость клеток к окислительному стрессу. Липидные гидроперекиси не вызывали подобного эффекта, так же как лизофосфатидилхолин. Таким образом, окФЛ активируют в эндотелиальных клетках механизмы адаптации к окислительному стрессу, однако действие окФЛ не зависит от окисляющих липидов типа гидроперекисей.

Гемоксигеназа-1 (ГО-1) - фермент, обладающий защитным действием по отношению к различным повреждающим клетку воздействиям. Этот фермент катализирует катаболизм гема с образованием биливердина, свободного железа и окиси углерода. Биливердин обладает антиоксидантным действием. Кроме этого, было показано, что ГО-1 обладает противовоспалительными свойствами [Otterbein, 2003; Lee, 2002]. ГО-1 индуцируется в гладкомышечных и эндотелиальных клетках под действием ммЛНП и окФЛ [Li, 2000; Ishikawa, 1997]. Кроме того, ГО-1 индуцируется в тканях мышей после внутривенного введения ОхРАРС [Kadl, 2002]. Принимая во внимание антиоксидантные и противовоспалительные свойства ГО-1, можно предположить, что индукция этого фермента под действием окФЛ может играть защитную роль в ходе воспаления и ускорять завершение воспалительного процесса [Wagener, 2003].

Еще один хорошо известный противовоспалительный эффект окФЛ заключается в ингибировании действия бактериального липополисахарида

39

ЛПС, эндотоксин) на различные клетки, в том числе на эндотелиальные, на которых окФЛ ингибируют ЛПС-индуцированное повышение экспрессии молекул клеточной адгезии [Parhami, 1993; Leitinger, 1999]. Антиэндотоксиновой активностью обладают разные виды окФЛ, включая POVPC и гидроксиалкенал-фосфатидилхолин [Subbanagounder, 2002; Leitinger, 1999]. Было показано, что окФЛ ингибируют ЛПС-индуцированное воспаление не только in vitro, но и на нескольких моделях воспаления in vivo [Bochkov, 2002 Nature]. ОкФЛ ингибировали действие ЛПС, но не воспалительных цитокинов, что указывает на ингибирование узнавания ЛПС клетками, но не внутриклеточной сигнализации. Было показано, что ОхРАРС ингибирует связывание ЛПС с белками LBP и CD 14, активность которых необходима для узнавания ЛПС клеточным рецептором, носящим название толл-подобного рецептора 4. Таким образом, образование окФЛ в ходе воспаления может приводить к ингибированию взаимодействия ЛПС с клеточными рецепторами, то есть окФЛ могут выступать в качестве механизма отрицательной обратной связи, препятствующего чрезмерной активации механизмов антибактериальной защиты.

Суммируя приведенные выше данные о биологической активности окФЛ, можно сказать, что эти вещества могут оказывать как про-, так и анти-воспалителы-юе действие в зависимости от конкретной биологической ситуации. Антивоспалительные эффекты окФЛ по крайней мере частично опосредуются ингибированием транскрипционного NFKB-пути, который играет ключевую роль в развитии острого воспаления. В связи с этим можно предположить, что антивоспалительные свойства окФЛ играют роль главным образом во время острого бактериального воспаления. По мере затухания воспалительной реакции или при хроническом воспалении провоспалительная активность окФЛ может становиться более значимой. При этом происходит активация транскрипционных механизмов, отличающихся от NFicB-пути, например транскрипционных факторов Egr-1, NFAT, CREB, PPARs, в результате чего развивается хроническое воспаление.

ВЛИЯНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ НА СИСТЕМЫ ПЕРЕДАЧИ РЕГУЛЯТОРНЫХ СИГНАЛОВ В ТРОМБОЦИТАХ И КЛЕТКАХ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ

Исследования последнего десятилетия показали, что физиологическая роль липопротеидов гораздо сложнее, чем предполагалось раньше и не ограничивается их участием в транспорте липидов. Накапливается все больше данных о том, что патологические эффекты липопротеидов в сердечно-сосудистой системе в значительной степени связаны с их способностью вмешиваться в процессы передачи сигналов, необходимые для нормальной регуляции сосудистого гомеостаза. ' Имеются данные о способности липопротеидов воздействовать на тонус сосудов, коагуляционный баланс и процессы воспаления в сосудистой стенке. Эти эффекты липопротеидов реализуются путем активации сигнальных систем клеток крови и сосудистой стенки и могут ускорять развитие атеросклероза, а также способствовать развитию гипертензии и артериальной тромбофилии.

Влияние липопротеидов на тонус сосудов

Дислипидемия и артериальная гипертензия

Нарушения липидного обмена часто сопровождаются развитием гипертензии. Эпидемиологические исследования показывают, что гипертензия и дислипидемия встречаются у больных одновременно в 1,5 раза чаще, чем следовало ожидать, если бы два этих заболевания развивались независимо [Eaton, 1994]. Часто сочетание дислипидемии и гипертензии наследуется и встречается у нескольких членов одной семьи, в связи с чем выделяют особую форму гипертонической болезни - семейную дислипидемическую гипертензию, которая составляет 1% от всех случаев гипертонической болезни [Williams, 1988]. При такой распространенной форме нарушений липидного обмена как семейная комбинированная гиперлипидемия в одной трети семей одновременно наблюдается наследование липидных аномалий и гипертензии [Keulen, 2001].

Приведенные данные убедительно доказывают существование положительной ассоциации между повышенным уровнем липидов крови и гипертензией, однако вопрос о том, является ли гипертензия следствием дислипидемии или независимым клиническим проявлением более общего патологического состояния остается открытым. Скорее всего имеет место и тот, и другой механизм. Общей патогенетической причиной дислипидемии и гипертензии может служить инсулинрезистентность [Ferrannini, 1991]. Однако есть основания предполагать, что по крайней мере частично артериальная гипертензия у больных с СДГ является следствием повышенного уровня липидов. Возможность развития гипертензии независимо от эндокринных нарушений, связанных с метаболическим синдромом, подтверждается данными о повышененном уровне триглицеридов и ano B-100-содержащих липопротеидов у больных с эссенциальной гипертензией, не имеющих ни диабета, ни ожирения [Ryomoto, 2000]. Дислипидемия, вызванная генетическими дефектами обмена липопротеидов и не связанная с инсулинрезистентностью, также часто сопровождается гипертензией. Так, у гетерозиготных носителей дефектной липопротеинлипазы повышен не только уровень триглицеридов, но и величина систолического давления [Sprecher, 1996].

Дислипидемия и эндотелиальная дисфункция

Наиболее охарактеризованным проявлением нарушений регуляции сосудистого тонуса при дислипидемиях является дисфункция эндотелия (ДЭ), характеризующаяся аномальным ответом на вазорелаксанты, развитием прокоагулянтного состояния и воспалением сосудистой стенки [Harrison, 1997; Laroia, 2003]. ДЭ часто развивается при гиперхолестеринемии, причем ее первые проявления появляются уже при наличии уровней ХС, соответствующих верхней границе нормального распределения концентрации ХС плазмы в популяции [Steinberg, 1997]. Основным вазомоторным проявлением ДЭ является нарушение эндотелий-зависимого расслабления крупных сосудов. Помимо этого, при гиперхолестеринемии

42 нарушаются и параметры микроциркуляции, что проявляется в снижении ответа артериол на гормоны-вазорелаксанты, повышении их контрактильных ответов и нарушении перфузии ткани [ОПН§ап, 1994; ТакаЬаэЫ, 1999].

Нарушение эндотелий-зависимого расслабления сосудов можно наблюдать в эксперименте у животных, получающих диету с высоким содержанием холестерина, что свидетельствует о том, что действие липопротеидов на тонус сосудов является прямым и не опосредовано другими метаболическими аномалиями. Об этом же говорит то, что ДЭ развивается у животных, у которых уровень холестерина повышен в результате врожденного нарушения функции рецептора ЛНП. Было показано, что у кроликов линии ^^апаЬе нарушается расслабление сосудов и сопутствующее снижение давления в ответ на введение ацетилхолина или брадикинина [Уатаёа, 2002]. В то же время ответ на введение нитропруссида не отличался у мутантных кроликов и животных дикого типа, что говорит о полной сохранности способности медии сосудов к эндотелий-независимой релаксации. Аналогичные результаты были получены на мышах, нокаутированных по ЛНП-рецептору [11аЬе1о, 2003]. Эти результаты, полученные на генетически модифицированных животных, свидетельствуют о прямой связи повышенного уровня ЛНП с нарушением способности сосудов расслабляться в ответ на действие гормонов. В пользу этого вывода говорят и клинические данные о нормализации функции эндотелия у пациентов после снижения уровня холестерина под действием гиполипидемических препаратов [1л, 2003].

Липопротеиды и регуляция активности МО-синтазы

Одним из основных гуморальных паракринных регуляторов сосудистого тонуса, производимых эндотелием, является оксид азота (N0). ДЭ у пациентов и животных с экспериментальной гиперхолестеринемией в значительной степени связана с уменьшением образования или ускоренной инактивацией N0. В эндотелии N0 синтезируется Са /кальмодулин-зависимым ферментом, получившим название эндотелиальной ИО-синтазы

43 eNOS). Принято считать, что в обычных условиях образующийся в эндотелии NO поддерживает сосудистый гомеостаз, выступая в качестве активного вазодилататора, одновременно блокирующего адгезию лейкоцитов на эндотелии и ингибирующего агрегацию тромбоцитов. Все эти благоприятные эффекты утрачиваются при гиперхолестеринемии, что является следствием параллельного снижения синтеза NO и ускорения его инактивации. Нарушение синтеза N0 происходит главным образом в результате частичной инактивации eNOS. Одним из механизмов снижения образования N0 под действием липопротеидов может быть воздействие на внутриклеточные сигнальные механизмы, регулирующие активность eNOS. Было показано, что обработка эндотелиальных клеток ЛНП усиливает связывание eNOS с кавеолином-1, в результате чего снижается базальное и ионофор-стимулированное образование NO [Zhu, 2003]. Эти эффекты были опосредованы ЛНП-индуцированной активацией RiioA и образованием стресс-фибрилл, разрушение которых с помощью цитохалазина D предотвращало негативную регуляцию eNOS. Таким образом, снижение производства N0 в эндотелиальных клетках под действием ЛНП является результатом активации внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих взаимодействие eNOS с белками-партнерами в мембране.

Еще более выраженная инактивация eNOS развивается под действием окисленных ЛНП (окЛНП), хотя механизм, по-видимому, отличается от действия нативных ЛНП. Было показано, что окЛНП способны изменять распределение холестерина в клеточных мембранах и за счет этого вызывать переход eNOS из кавеол в другие мембранные фракции. В результате синтез N0 в ответ на ацетилхолин снижается в 100 раз [Blair, 1999].

В отличие от нативных и окисленных ЛНП, липопротеиды высокой плотности (ЛВП) обладают стимулирующим действием на eNOS. Было показано, что ЛВП вызывают выраженную активацию этого фермента в культивируемых эндотелиальных клетках, которая развивается в течение первых минут инкубации [Yuhanna, 2001]. Более того, ЛВП стимулируют расслабление сосудов, которое наблюдается только в присутствии

44 интактного эндотелия и блокируется ингибиторами eNOS. Расслабление сосудов под действием ЛВП не развивается на сосудах мышей, нокаутированных по гену SR-BI [Yuharma, 2001]. Таким образом, ЛВП вызывают классическое эндотелий- и NO-зависимое расслабление сосудов, опосредованное скевенджер-рецептором SR-BI.

Липопротеиды и образование активных форм кислорода

Хорошо известно, что в артериях гиперхолестеринемических животных повышена выработка супероксиданиона и что коррекция диеты снижает образование супероксиданиона до нормальных значений [Ohara, 1995]. Кроме того, показано, что добавление ЛИП к культивируемым эндотелиальным клеткам человека приводит к образованию активных форм кислорода (АФК), основным источником которых является NADPH-оксидаза [Ohara, 1993; Holland, 1996]. Активация этого фермента является результатом прямого стимулирующего действия свободной арахидоновой кислоты, накапливающейся в цитоплазме клеток, обработанных ЛИП [Holland, 1997]. Одним из механизмов этого повышения, по-видимому, является активирующее действие ЛЫП на цитозольную фосфолипазу Аг через системы вторичных посредников. Использование фармакологических ингибиторов показывает, что активация NADPH-оксидазы под действием ЛНП развивается при участии таких сигнал-передающих ферментов как Src-тирозинкиназа, фосфолипаза С, ERK1/2 МАР-киназы, р38 МАР-киназа, протеинкиназа С и цитозольная фосфолипаза А2 [О'Donneil, 2003].

Способностью активировать NADPH-оксидазу обладают не только ЛНП, но и другие классы липопротеидов. Показано, что ремнантные липопротеиды, взаимодействуя с мембранным рецептором LOX-1, повышают в эндотелиальных клетках экспрессию NADPH-оксидазы и вызывают транслокацию Rac-1, что является основным внутриклеточным механизмом активации этого фермента [Shin, 2004].

Помимо активации NADPH-оксидазы, ЛНП активируют и другие механизмы образования АФК. Было показано, что ЛНП вызывают

45 разобщение eNOS, ' что приводит к нарушению нормального ферментативного механизма и выработке супероксиданиона, а также активируют еще один источник АФК - ксантиноксидазу [Stepp, 2002].

Основным механизмом влияния АФК на процесс расслабления сосудов является химическое взаимодействие с N0, приводящее к его инактивации [Gryglewski, 1986]. Кроме того, образующийся при взаимодействии NO и супероксиданиона пероксинитрит является активным окислителем, вызывающим апоптоз эндотелиальных клеток [Galle, 2001]. Известно также, что АФК. стимулируют в гладкомышечных клетках сосудов синтез белка [Zafarí, 1998]. В целом, АФК инактивируют NO, усугубляют ДЭ и одновременно способствуют гипертрофии мышечного слоя стенки сосуда, что в сумме может приводить к сдвигу равновесия в сторону вазоконстрикции.

Таким образом, нарушение нормальной функции эндотелия и гладкомышечных клеток сосудов при гиперхолестеринемии приводит к дисбалансу образования NO и супероксиданиона. В норме этот баланс сдвинут в сторону N0, что определяет нормальные противовоспалительные и вазорелаксантные свойства эндотелия. При гиперхолестеринемии происходит повышение образования супероксиданиона, а также снижение выработки и ускорение инактивации N0, что приводит к сдвигу равновесия в сторону воспаления, нарушения вазодилатации и гипертензии.

Липопротеиды и ренин-ангиотензиновая система

Одним из главных гуморальных регуляторов тонуса сосудов является ангиотензин. Большинство известных функций ангиотензина, и в частности его вазоконстрикторное действие, опосредуется рецепторами ATj. Экспрессия АТ[ регулируется целым рядом веществ, включая сам ангиотензин, факторы роста, гормоны и свободные радикалы [Nickenig, 2002]. Было показано, что обработка гладкомышечных клеток сосудов ЛНП приводит к повышению экспрессии АТ[ и усилению клеточных ответов на ангиотензин [Nickenig, 1997]. В опытах in vivo было обнаружено, что у

46 кроликов с наследственной или диетической гиперхолестеринемией уровень AT] рецепторов в аорте повышен в 2 раза [Nickenig, 1997; Warnholtz, 1999]. Одновременно у этих животных наблюдалась повышенная вазоконстрикторная реакция на ангиотензин. Аналогичное повышение экспрессии AT 1-рецепторов наблюдается и у пациентов с гиперхолестеринемией, у которых инфузия ангиотензина вызывает более сильное повышение давления, чем у лиц с нормальным уровнем холестерина [Nickenig, 1999]. В основе повышения уровня ATi под действием ЛНП, по-видимому, лежит цепь внутриклеточных сигналов, приводящих к увеличению стабильности мРНК, кодирующей ATi [Nickenig, 1997].

Помимо ангиотензиновых рецепторов, при гиперхолестеринемии и атеросклерозе наблюдается также повышение уровня ангиотензинпревращающего фермента в стенке сосуда [Diet, 1996]. Более того, известно, что ЛНП способны стимулировать образование ангиотензиногена в культуре клеток [Park, 2003]. Таким образом, под действием ЛНП происходит одновременное повышение уровня ангиотензина и его рецепторов, способное привести к усиленной локальной активации ренин-ангиотензиновой системы в стенке сосуда и повышению давления крови. Кроме того, активация рецепторов AT! является одним из главных стимулов для выработки в стенке сосуда АФК, которые, как указывалось выше, обладают вазоконстрикторным и гипертрофическим действием [Rajagopalan, 1996].

Одним из доказательств важной роли ангиотензина и ATj-рецепторов в формировании ДЭ при гиперхолестеринемии является способность антагонистов ангиотензиновых рецепторов предотвращать нарушение эндотелий-зависимого расслабления сосудов. На группе пациентов с гиперхолестеринемией было показано, что лечение AT \-антагонистом приводит к возрастанию индуцированной ишемией реактивной гиперемии, что свидетельствует о восстановлении эндотелий-зависимой вазорелаксации [Wassmann, 2002]. Эти клинические данные убедительно подтвердили важную роль ренин-ангиотензиновой системы в развитии ДЭ и показали

47 возможность ее коррекции с помощью антагонистов ангиотензина. Таким образом, одним из механизмов вазоконстрикторного действия ЛНП является увеличение локальной концентрации компонентов ренин-ангиотензиновой системы в сосудистой стенке и одновременное повышение чувствительности клеток к ангиотензину за счет увеличенной экспрессии ангиотензиновых рецепторов.

Другие механизмы нарушения регуляции сосудистого тонуса при дислипидемиях

Помимо перечисленных выше негативных эффектов липопротеидов, способствующих развитию ДЭ, предполагается существование других, менее охарактеризованных механизмов, посредством которых нарушения липидного обмена связаны с повышением склонности 'сосудов к вазоспазму. Одним из таких механизмов является вызываемое липопротеидами изменение физико-химических свойств клеточных мембран. Было показано, что гиперхолестеринемия вызывает нарушения в сердечно-сосудистой системе благодаря прямому действию на жидкостные свойства мембран, а также активность ферментов и ионных транспортеров в эндотелиальных и гладкомышечных клетках и кардиомиоцитах. В частности, изменение уровня холестерина в мембранах влияет на процессы сокращения, возбуждения и проводимости в миокарде [Бани, 2004]. Эти изменения являются следствием нарушения активности таких мембранных ферментов и каналов, как Иа+-К+-АТРаза, Са2+-АТРаза, Са2+-активируемые К+ каналы и На+-Са2+-обменник. По-видимому, сходные нарушения могут развиваться и в клетках эндотелия, где ■ перечисленные типы переносчиков и каналов играют важную роль в поддержании базального и гормон-стимулированного образования N0. Кроме того, в эндотелии активность калиевых каналов может регулироваться липопротеидами и через рецептор-опосредованные механизмы, о чем г свидетельствуют данные об активации Са -зависимых калиевых каналов в эндотелиальных клетках человека под действием окЛНП, которая специфически блокировалась антителами против липопротеидного рецептора

48

LOX-1 [Kuhlman, 2003]. Таким образом, еще одним механизмом нарушения регуляции сосудистого тонуса при дислипидемиях может быть аномальное функционирование мембраносвязанных ферментов и ионных транспортеров, вызванное изменением концентрации холестерина в клеточных мембранах, либо модулирующим действием липопротеидных рецепторов.

Липопротеиды и внутриклеточные сигнальные системы

Основным внутриклеточным механизмом, запускающим сокращение ГМК сосудов, является повышение концентрации цитоплазматического Са2+ в сочетании с активацией фосфоинозитидного обмена и стимуляцией протеинкиназы С. За последние 15 лет накопились данные о способности липопротеидов плазмы крови активировать эти внутриклеточные сигнальные системы. Было обнаружено, что добавление ЛНП к культивируемым ГМК и эндотелиальным клеткам вызывает повышение уровня свободного

21 цитоплазматического Са " и активацию фосфоинозитидного обмена [Block, 1988]. Данные об активирующем действии липопротеидов на системы вторичных посредников в ГМК получили подтверждение в целом ряде работ. В настоящее время имеются убедительные данные о способности ЛНП и ЛВП повышать уровень цитозольного Са [Block, 1988], а также запускать активацию фосфатидилинозитол- и фосфатидилхолин-специфичных фосфолипаз С и D [Walter, 1996], протеинкиназы С, митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), тирозиновых киназ и гетеротримерных G-белков [Nofer, 2002; Cockerill, 1999], а также образование сАМР и церамида [Li, 2002]. Липопротеиды способны активировать все основные виды МАР-киназ: ERIC 1/2, р38 и SAP/JNK [Gouni-Berthold, 2001] при посредстве G-белков и дальнейшей активации Raf-1 и МЕК-1 [Deeg, 1997; Nofer, 2001; Garver, 1997]. Кроме того, показано, что связывание ЛВП с рецептором SR-BI приводит к активации белка Ras, который запускает дальнейшую сигнализацию через МАР-киназы [Grewal, 2003].

Липопротеиды способны повышать уровень цитозольного Са и активировать фосфоинозитидный обмен не только в ГМК, но и в

49 эндотелиальных клетках [Smirnov, 1990; Negre-Salvaryre, 1992; Allen, 1997]. В отличие от ГМК,, повышение Са2+ в эндотелии способствует вазорелаксации, поскольку повышение Са2+ в цитоплазме эндотелиальных клеток активирует образование N0. Было показано, что ЛВП способны активировать нерецепторную тирозинкиназу Src, которая, в свою очередь, активирует в эндотелии PI-3-киназный/Akt путь и параллельно ERK1/2-киназы, что ведет к активации eNOS [Mineo, 2003]. Существуют данные о том, что активным началом ЛВП, вызывающим активацию NO-синтазы, служат лизосфинголипиды, которые стимулируют лизофосфолипидный рецептор S1Р3 [Nofer, 2004].

Таким образом, вызванная ЛНП и ЛВП активация систем вторичных посредников в ГМК носит вазоконстрикторный характер, а в эндотелии -потенциально способствует релаксации через образование N0. По-видимому, суммарный эффект липопротеидов определяется балансом этих двух противоположных эффектов и связан со способностью эндотелия производить N0, соотношением концентраций липопротеидов в плазме и сосудистой стенке и другими дополнительными факторами.

Липопротеиды и прогресс гипертрофии медии сосуда

Одним из морфологических признаков и патогенетических механизмов развития артериальной гипертензии является гипертрофия медии сосудов. Как известно, многие Са2+-мобилизующие гормоны обладают трофическими свойствами, то есть способны стимулировать пролиферативную и синтетическую активность клеток. Оказалось, что липопротеиды обладают сходными свойствами. ЛНП стимулируют клеточную пролиферацию в комбинации с сывороткой, делипидированной сывороткой и такими факторами роста, как PDGF, инсулин, EGF, FGF, IGF и тромбин [Gonzalez-Timon, 2004; Seewald, 1997]. Вопрос о том, обладают ли липопротеиды собственными митогенными свойствами, либо их активность ограничивается стимуляцией пролиферативных эффектов факторов роста путем доставки делящимся клеткам холестерина и других липидов, является ключевым в понимании роли липопротеидов в развитии гипертрофии стенки сосуда. Механизмы пролиферативных эффектов липопротеидов, по-видимому, связаны с их активирующим действием на системы внутриклеточной сигнализации. Было показано, что ремнантные липопротеиды стимулируют синтез ДНК и деление гладкомышечных клеток путем активации О-белок-связанных рецепторов и протеинкиназы С, что, в свою очередь, ведет к трансактивации рецептора эпидермального фактора роста и пролиферативному ответу [Кашакагш, 2003].

Таким образом, липопротеиды могут стимулировать гипертрофию ГМК, причем это действие не ограничено доставкой липидов делящимся клеткам. Можно предположить, что усиление липопротеидами гипертрофических процессов в ГМК медии сосудов может служить еще одним механизмом, посредством которого липопротеиды способствуют развитию гипертензии.

Роль липопротеидов в формировании артериальной гипертензии

Имеющаяся на сегодняшний день информация убедительно указывает на существование связи между нарушениями липидного обмена и гипертонической болезнью. В основе этой ассоциации могут лежать общие механизмы, способствующие развитию как гипертензии, так и дислипидемии, например инсулинрезистентность. Однако возможность вызывать эндотелиальную дисфункцию манипулируя уровнем липидов генетическими или диетическими способами свидетельствует о прямой связи нарушений липидного обмена и сосудистого тонуса. Можно предположить, что в ряде случаев дислипидемия является не независимым сопутствующим фактором, но причиной развития гипертензии.

Экспериментальные данные позволяют предположить, что дислипидемии и гипертензия могут быть связаны несколькими патогенетическими механизмами, такими как • нарушение эндотелий-зависимого расслабления сосудов, непосредственное вазоконстрикторное действие липопротеидов на ГМК сосудов за счет активации обмена Са2+ и

51 фосфоинозитидов, проявление гипертрофического действия липопротеидов, а также нарушение локальных эндокринных механизмов регуляции сосудистого тонуса. В основе этих эффектов лежит вызванное липопротеидами нарушение нормальной передачи сигналов, участвующих в регуляции сосудистого тонуса, либо аномальная стимуляция сигнальных процессов в стенке сосуда самими липопротеидами. Таким образом, патологическая роль липопротеидов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний определяется не только их ролью в транспорте липидов, но и способностью вмешиваться в процессы регуляции сосудистого тонуса.

Влияние липопротеидов на функциональную активность тромбоцитов

Липопротеиды и активность тромбоцитов

Одним из патологических проявлений дислипидемии является изменение реактивности тромбоцитов, которое, в зависимости от характера липидных сдвигов, может приводить как к артериальной тромбофилии, так и к снижению активности тромбоцитов. Повышение уровня холестерина в крови является важным фактором риска, увеличивающим вероятность образования тромба на поврежденных атеросклеротических бляшках и развития острого коронарного синдрома. Возрастание реактивности тромбоцитов может быть результатом повышения уровня ЛНП и ЛОНП, либо снижения ЛВП. Чаще всего повышенная реактивность тромбоцитов наблюдается у пациентов с гиперлипопротеидемией На типа и при умеренной гипертриглицеридемии: [Aviram, 1987; Schror, 1990]. При выраженной гипертриглицеридемии, вызванной накоплением хиломикронов, функция тромбоцитов напротив, снижена [Aviram, 1987]. Повышение реактивности тромбоцитов при дислипидемии обычно проявляется в усилении секреции гранул, адгезии и агрегации тромбоцитов под действием низких концентраций разнообразных. индукторов, таких как аденозиндифосфат (ADP), коллаген, серотонин, тромбин [Fetkovska, 1992; Tremoli, 1993]. Для гиперхолестеринемии характерен сдвиг кривых доза. 52 эффект в сторону более низких концентраций этих агонистов. Повышенная активность . тромбоцитов при дислипидемиях нормализуется после возвращения липидиого профиля к норме под действием диеты, лекарств или плазмафереза [Aviram, 1987].

Повышенная реактивность тромбоцитов наблюдается и у экспериментальных животных с гиперлипопротеидемией, вызванной генетическим нарушением липопротеидных рецепторов или диетой с высоким содержанием холестерина [Baclimon, 1991]. Кроме того, тромбофилические. эффекты дислипидемии можно воспроизвести in vitro, обрабатывая цельную кровь [Tornvall, 1999] или выделенные тромбоциты липопротеидами [Власова, 1998]. Обработка тромбоцитов ЛНП и ЛОНП приводит к повышению агрегационной способности, а ЛВП и хиломикронами - к ее снижению [Aviram, 1987; Fetkovska, 1992]. Эффект ЛВП двухфазен: при низких физиологических концентрациях ЛВП вызывают активацию ФЛС и ПКС, что способствует процессу агрегации [Nazih, 1990; Nazih, 1992]. В то же время при более высоких концентрациях ЛВП действуют как антиагрегационные агенты, подавляющие индуцированную тромбином агрегацию [Nofer, 1998].

Окисление влияет на активность липопротеидов в отношении тромбоцитов, но не является определяющим фактором. Нативные липопротеиды, выделенные со всеми известными предосторожностями, направленными на предотвращение окисления, являются агонистами, стимулируя в тромбоцитах сигнальные процессы, агрегацию и секрецию [Hackeng, 1999; van Willingen, 1994]. В то же время, в большинстве работ, в которых проводилось сравнение действия окисленных и нативных ЛНП, была отмечена повышенная активность окисленных липопротеидов. Прослеживается общая закономерность: нативные ЛНП и низкие дозы окисленных ЛНП потенциируют действие индукторов агрегации, в то время как высокие дозы окисленных ЛНП сами вызывают необратимую агрегацию. Окисление каких компонентов ЛНП приводит к усилению их проагрегантных свойств, неизвестно. Скорее всего это окисление липидов, но

53 есть данные, что окислительная модификация белковой части ЛНП - апоВ-100 под действием гипохлорита, образующегося лейкоцитами при воспалении, также приводит к резкому усилению проагрегантных свойств ЛП частиц [Volf, 2000; Coleman, 2004].

Механизмы активирующего действия липопротеидов на тромбоциты

Хотя механизмы сенситизации тромбоцитов под действием липопротеидов изучены лишь частично, можно с уверенностью сказать, что таких механизмов несколько и что липопротеиды изменяют функцию тромбоцитов через широкий спектр взаимодействий с этими клетками [Relou, 2003]. Условно эти механизмы можно разделить на два класса: рецепторнезависимые и рецепторопосредованные.

Рецепторнезависимое действие липопротеидов, по-видимому, связано с изменением липидного состава клеточных мембран, что приводит к изменению активности рецепторов, ионных каналов и других передающих сигналы белков [Stuart, 1980; Shastri, 1980]. Примером такого рода эффектов может служить ингибирующее действие ЛНП на активность Na+/H+-обменника, что приводит к закислению цитоплазмы, способному усиливать секреторный ответ тромбоцитов на агонисты [Nofer, 1997]. Характерным признаком рецепторнезависимых эффектов липопротеидов является необходимость продолжительной инкубации тромбоцитов с липопротеидами для переноса существенного количества липидов, способного изменить свойства клеточных мембран.

Второй класс эффектов липопротеидов на тромбоциты опосредуется рецепторами и развивается быстро, иногда в первые секунды после добавления липопротеидов. Рецепторопосредованные эффекты связаны с активацией внутриклеточных сигнальных систем под действием липопротеидных частиц, либо их отдельных компонентов, взаимодействующих со специфическими рецепторами на поверхности клеток. Примером липидных компонентов липопротеидов, обладающих гормоноподобной активностью, может служить лизофосфатидная кислота,

54 являющаяся индуктором агрегации. Однако наибольший интерес представляют эффекты липопротеидов, опосредованные связыванием целой частицы с рецепторами, расположенными на поверхности тромбоцитов. В пользу существования такого рода эффектов говорят данные о наличии на поверхности тромбоцитов участков специфического связывания липопротеидов.

Липопротеидные реъ^епторы тромбоцитов

На тромбоцитах описано существование участков специфического и насыщаемого связывания для липопротеидов разных классов [Aviram, 1981; Mazurov, 1982; Koller, 1982; Pedreno, 1992]. Эти рецепторы не являются классическими ano В,Е (ЛНП)-рецепторами, поскольку связывание ЛНП с тромбоцитами не иигибируется антителами, блокирующими классический ЛНП-рецептор, а также не изменяется у пациентов с семейной гиперхолестеринемией, у которых эти рецепторы отсутствуют [Pedreno, 1992]. Кроме того, в отличие от взаимодействия с . эндоцитозными рецепторами из семейства ЛНП-рецептора, связавшиеся с тромбоцитами липопротеиды не подвергаются интернализации [Pedreno, 1994]. Природа липопротеидных рецепторов на тромбоцитах неизвестна. Высказывались предположения о том, что тромбоциты связывают липопротеиды при посредстве гликопротеина Ilb/IIIa [Koller, 1989], однако позднее участие этого интегрина в связывании липопротеидов с тромбоцитами было подвергнуто сомнению [Pedreno, 1997]. Связывание окисленных и нативных ЛНП с тромбоцитами происходит с близкой афинностью [Pedreno, 1994], в связи с чем важным кандидатом на роль липопротеидного-рецептора тромбоцитов является скевенджер-рецептор CD36, способный связывать как окисленные, так и нативные ЛНП [Pedreno, 1997].

Какие компоненты липопротеидов узнаются рецепторами тромбоцитов? По-видимому, разные рецепторы взаимодействуют с разными частями липопротеидов. С CD36 связываются, в частности, такие биологически активные компоненты окЛНП как окисленный

55 фосфатидилхолин, который усиливает экспрессию Р-селектииа, хотя и не вызывает агрегацию тромбоцитов [Hartwich, 2002]. С другой стороны, имеются убедительные данные о важности белковой части ЛНП для взаимодействия с рецепторами тромбоцитов. Было показано, что синтетический пептид из 11 аминокислот, соответствующий по последовательности рецептор-связывающему участку ano В-100 и несущий несколько положительно заряженных аминокислот, имитирует проагрегантное действие ЛНП, вызывая быструю активацию р38МАРК [Relou, 2002].

Сигнальные механизмы, активируемые липопротеидами в тромбоцитах

Накоплено большое количество данных, показывающих, что липопротеиды активируют внутриклеточные системы передачи сигналов, связанные с активацией тромбоцитов и опосредующие адгезию, секрецию тромбоцитарных гранул и агрегацию. К сигнальным механизмам, активируемым в тромбоцитах липопротеидами, относятся: мобилизация Ca [Block, 1988, Nofer, 1997], активация фосфоинозитидного обмена [Nofer, 1997; Andrews, 1987; Block, 1988] и протеинкиназы С [Andrews, 1987]. Попытки идентифицировать предполагаемый «сигнальный» рецептор липопротеидов в тромбоцитах пока не увенчались успехом. Имеются указания на то, что активация сигнальных процессов липопротеидами происходит при участии рецепторов, сопряженных с G-белками. В пользу этого говорят данные об ингибировании передачи сигналов под действием токсина В.pertussis, который ингибирует активацию фосфолипазы С под действием ЛВП [Nazih, 1992], а также подавляет ЛНП-индуцированное повышние уровня цитоплазматического кальция, образование инозитолтрисфосфата и транслокацию протеинкиназы С [Pedreno, 2001]. Эти данные указывают на возможность того, что предполагаемые рецепторы, подобно семидоменным трансмембранным рецепторам гормонов сопрягаются с внутриклеточными сигнальными системами при посредстве белков Go или Gi.

В последние годы было обнаружено еще несколько «сигнальных» эффектов липопротеидов на тромбоциты. В частности, была показана важная роль протеинкиназы р38МАРК, способной, в свою очередь, активировать цитозольную фосфолипазу А2, что приводит к образованию свободной арахидоновой кислоты, доступность которой является лимитирующим фактором в синтезе такого активного индуктора агрегации как тромбоксан [Hackeng, 1999]. Еще одна мишень ЛНП - это FAK (focal adhesion kinase), которая играет ключевую роль в регуляции адгезии и агрегации тромбоцитов и активируется в тромбоцитах под действием ЛНП; эта активация опосредуется киназой Fgr из семейства Src-киназ [Relou, 2003]. Есть основания предполагать, что действие липопротеидов, подобно большинству гормонов, является самоограничивающим: липопротеиды не только активируют сигнальные каскады, но и одновременно запускают процессы их выключения. Было показано, что ЛНП или синтетический пептидный фрагмент апо В-100 активирует РЕСАМ-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1), что приводит к образованию комплекса с c-Src и фосфатазами РР1/РР2А, что в свою очередь приводит к дефосфорилированию р38МАРК и выключению этого проагрегационного сигнального пути [Relou, 2003].

В целом имеющиеся данные показывают, что липопротеиды способны оказывать влияние на самые различные системы передачи сигналов в тромбоцитах. Большинство этих эффектов потенциально связано с активацией тромбоцитов и индукцией агрегации, что позволяет предположить, что гормоноподобные эффекты липопротеидов могут быть одним из механизмов формирования гиперреактивности тромбоцитов при гиперхолестеринемии.

МЕТОДЫ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ОКИСЛЕННЫХ ЛИПИДОВ

Синтетический пальмитоил-арахидоыоил-фосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids) (РАРС) окисляли инкубируя пробирки с высушенным липидом на воздухе. Степень окисления контролировали с помощью тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем в положительном режиме [Watson, 1997].

Пальмитоил-2-(5-оксовалероил)-фосфатидилхолин (POVPC) и пальмитоил-глютароил-фосфатидилхолин (PGPC) получали обработкой РАРС озоном с последующим восстановлением озонидов трифенилфосфином и хроматографической очисткой как описано ранее [Leitinger, 1999]. Очистку проводили на нормальнофазовой колонке Hypersil, 3 мкм, 4 х 150 мм) с параллельной масс-спектрометрической детекцией.

Обработка ОхРАРС фософолипазой А2

5 мг ОхРАРС высушивали, ресуспендировали на вортексе в 1 мл PBS, содержащего 5 мМ СаС12 и разделяли на 2 порции. В одну пробирку добавляли 0,1 мл PBS/Ca2+, содержащего 300 ед. фосфолипазы А2 из Naja mossambica, а в другую - буфер без фермента. После инкубации в течение 1 часа при 36°С с периодическим перемешивании на вортексе, липиды экстрагировали 7 объемами смеси хлороформ/метанол, содержащей 0,01% бутилированиого гидрокситолуола. После перемешивания и центрифугирования, нижние фазы отбирали, а верхние промывали 5 объемами хлороформа и органические фазы из двух экстракций объединяли. Высушенные органические фазы объединяли, растворяли в 250 мкл хлороформа и хранили при -20°С до анализа активности или разделения липидов ТСХ.

Липиды разделяли на классы фосфолипидов, нейтральных липидов и жирных кислот с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем Whatman 60К, которые проявляли смесью гексан/этиловый эфир/уксусная кислота (70:30:1).

58

Липидные стандарты окрашивали парами иода, после чего участки пластинки, содержащие фосфолипиды или жирные кислоты соскребали и элюировали смесью хлороформ/метанол/вода (25:50:20). Липиды упаривали и хранили при -70°С.

ВЫДЕЛЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ЛИПОПРОТЕИДОВ Выделение липопротеидов из плазмы крови человека

Выделение липопротеидов низкой (ЛНП) и высокой (ЛВП) плотности проводили с помощью препаративного ультрацентрифугирования посредством последовательной флотации в растворах бромида натрия различной плотности [Нш, 1980]. Выделяли следующие фракции: ЛНП (1,019 - 1,063 г/мл), ЛВП2 (1,063 - 1,125 г/мл) и ЛВП3 (1,125 - 1,21 г/мл). ЛНП и ЛВП3 дополнительно центрифугировали при максимальной для данной фракции плотности. На всех стадиях выделения липопротеидов растворы содержали 1 мМ ЭДТА и 1 мкМ бутилированиый гидрокситолуол. Полученные липопротеиды стерилизовали пропусканием через 0,45 мкм-фильтры и хранили при 4°С.

Химическая модификация липопротеидов

Ацетилированные ЛНП получали по методу [Кпогг, 1988]. К раствору ЛНП (2 мг/мл в 0,15 М №01, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0) добавляли равный объем насыщенного ацетата натрия при перемешивании на ледяной бане. Затем добавляли уксусный ангидрид (объем в мкл, равный количеству белка в мг х 1,5) шестью равными аликвотами с интервалами в 10 мин. После внесения последней порции ангидрида смесь перемешивали еще 30 мин и диализовали против раствора, содержащего 0,15 М ИаС1 и 1 мМ ЭДТА, при 4°С. Карбамоилирование ЛНП проводили по ранее описанному методу [Ке11еу, 1988]. К раствору ЛНП (2 мг/мл в 0,15 М ИаС1, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0) добавляли половинный объем раствора цианата калия в 0,3 М натрий-боратном буфере, рН 8,0 (из расчета 20 мг цианата калия на 1 мг белка) и перемешивали. После инкубации в течение 2 ч при 37°С модифицированные

59

ЛНП диализовали против раствора, содержащего 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, при 4°С. Обработку ЛНП циклогександионом проводили как описано ранее [Yoyno-Yasenetskaya, 1993]. К раствору ЛНП (5 мг/мл в 0,15 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0) добавляли два объема 0,15 М 1,2-циклогександиона в 0,2 М натрий-боратном буфере, рН 8,1 и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Контрольный образец инкубировали в буфере без циклогександиона. Модифицированные ЛНП диализовали против раствора, содержащего 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА при 4°С. Процесс модификации ЛНП контролировали с помощью нативного электрофореза, а также по способности модифицированных липопротеидов конкурировать с иодированным ЛНП за связывание с высокоафинным рецептором фибробластов.

АНАЛИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

Измерение уровня свободного ионизированного кальция в цитоплазме тромбоъ^итов

Тромбоциты человека выделяли с помощью дифференциального центрифугирования свежей крови, собранной, с цитрат-декстрозным антикоагулянтом. Для . осаждения эритроцитов и лейкоцитов кровь центрифугировали 15 мин при 200 х g при комнатной температуре. Богатую тромбоцитами плазму инкубировали с 5 мкМ ацетоксиметильным эфиром Са -чувствительного индикатора indo-1 в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего тромбоциты осаждали центрифугированием при. 1200 х g в течение 10 мин. Тромбоциты ресуспендировали в модифицированном растворе Тироде: 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2,7 мМ КС1, 0,37 мМ NaH2P04, 1 мМ СаС12, 5 мМ D-глюкоза, 10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,05 мг/мл апиразы), содержащем 100 мкг/мл V фракции БСА. Конечная суспензия содержала 2 х 108 тромбоцитов/мл. Для измерения флуоресценции тромбоциты разбавляли в 10 раз раствором Тироде с кальцием, но без апиразы. Измерение флуоресценции indo-1 проводили в однолучевом режиме при длинах волн возбуждения и эмиссии 330 и 400 нм, соответственно, на

60 флуориметре Jasco FP-770. Пересчет величин флуоресценции в концентрацию свободного цитоплазматического кальция проводили как описано ранее [Conrad, 1986].

Измерение захвата 45Са2+ тромбоцитами

Вход кальция в тромбоциты оценивали путем измерения захвата 45Са2+ тромбоцитами, нагруженными индикатором quin2. 1 мл суспензии тромбоцитов (2,5 х 108 клеток), преинкубированных 30 мин с 10 мкМ quin2/AM, уравновешивали в растворе Тироде, pH 7,4, содержащем 0,1 мМ СаС1г в течение 2 мин при 30°С с 0,15 мкКи 45Са2+. После добавления ЛНП и/или адреналина инкубацию продолжали еще 5 мин.Тромбоциты отделяли от среды инкубации путем фильтрования и промывки раствором Тироде. Связанную с клетками радиоактивность определяли методом жидкостной сцинтилляции.

Измерение уровня свободного ионизированного кальция в цитоплазме гладкомыилечных клеток

Измерения [Ca ]¡ проводили на субконфлюентных культурах ГМК из аорты человека, выращенных на круглых покровных стеклах диаметром 22 мм. Для измерений использовали проникающий в клетки ацетоксиметильный эфир Са2+-чувствительного индикатора fura-2. После промывки клеточных монослоев раствором, содержащим 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1,8 мМ СаС12, 1,0 мМ MgCl2, 1,0 мМ Na2HP04, 5 мМ D-глюкозу, 0,1 мг/мл БСА, 25 мМ HEPES, pH 7,4, ГМК нагружали fura-2/AM (1 мкМ) в течение 15 мин при 37°С. Культуры промывали тем же буфером для удаления невключенного fura-2/ AM и инкубировали еще 5 мин при 37°С для выхода негидролизованного эфира из клеток. После этого покровные стекла с клетками помещали на термостатируемый столик инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Diaphot, соединенного с анализатором PhoCal (Joyce Loebl). Клетки'облучали попеременно при 340 и 380 нм с помощью вращающегося колеса с фильтрами (6,25 Гц). Эмиссию света

61 одиночными клетками или монослоем регистрировали при 500 нм. Данные анализировали с помощью программы PhoCal. Калибровку сигналов прводили путем пермеабилизации клеток дигитонином (50 мкМ) для определения Fmax, после чего добавляли 10 мМ Tris-ЭГГА для определения • 2+

Fmin. [Са рассчитывали как описано ранее [Ambler 1988].

Измерение фосфоинозитидного обмена в тромбоцитах

Тромбоциты, полученные центрифугированием богатой тромбоцитами плазмы, суспендировали до концентрации 109 клеток/мл в буфере, содержащем .150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2,7 мМ КС1, 0,37 мМ NaH2P04, 1 мМ СаС12, 5 мМ D-глюкоза, 10 мМ HEPES, рН 6,55, ОД мг/мл апиразы, 350 мкг/мл V фракции БСА и 50 ед/мл гепарина, а также 100 мкКи/мл мйо-инозитол (20 Ки/ммоль, Amersham). После инкубации в течение 3 часов при о 8

37 С клетки осаждали и ресуспендировали (2x10 кл./мл) в буфере 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2,7 мМ КС1, 0,37 мМ NaH2P04, 1 мМ СаС12, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,1 мг/мл апиразы и 0,1 мг/мл V фракции БСА. К раствору добавляли хлорид лития (10 мМ) и инкубировали клетки 20 мин при 37°С. 1 мл клеточной суспензии смешивали с 10 мкл раствора агониста (100 мкг/мл ЛНП или 10 мкМ адреналин). Анализ фосфатов инозитола проводили как описано для культивируемых ГМК.

Анализ изомеров фосфатов инозитола методом ВЭЖХ

Конфлюентные культуры ГМК выдерживали 48 часов в среде без сыворотки и инозитола, содержащей 5 мкКи мио-[2- Н]-инозитола для мечения инозитол-содержащих фосфолипидов. После удаления среды и промывки, ГМК преинкубировали 30 мин с 15 мМ LiCl, после чего добавляли агонисты. Инкубацию останавливали удалением среды и добавлением 1 мл смеси хлороформ/метанол/НС1 (1:3:0,04), содержащей гидролизат фитина (5 мкг фосфора на мл). Гидролизат фитина готовили как описано [Wregget, 1987]. После экстракции липидов и разделения органической и водной фаз, 1 мл верхней водной фазы переносили в

62 эппендорфовские пробирки, добавляли 25 мкл 50 мМ D-маннита и высушивали под вакуумом в центрифуге SpeedVac, после чего образцы хранили до анализа при -20°С. Для контроля разброса между образцами 100 мкл верхней водной фазы наносили на анионообменную колонку с Dowex-AG 1-Х8, и водорастворимые фосфаты инозитола разделяли последовательной элюцией возрастающими концентрациями формиата аммония в 0,1 М муравьиной кислоте [Scott-Burden, 1989]. Для анализа с помощью ВЭЖХ брали только те образцы, отклонение в содержании фосфатов инозитола в которых по результатам хроматографии на Dowex-1 было меньше 10% от средней величины. Отобранные образцы объединяли последовательно растворяя их в 200 мкл воды, после чего добавляли 5 мкл раствора, содержащего 1 мМ каждого нуклеотида: cAMP, GMP, ADP, GDP, АТР и GTP, и наносили на ВЭЖХ-колонку по 100 мкл. Разделение фосфатов инозитола проводили на колонке с сильным анионообменником Partisil 10 SAX, оснащенной встроенным фильтром и предколонкой. Колонку элюировали со скоростью 1,25 мл/мин возрастающим градиентом дифосфата аммония по следующей схеме: от 0 до 0,15 М за 15 мин, от 0,15 до 1,0 М за 15 мин и 1,0 М еще 15 мин. Собирали фракции объемом 0,25 мл (5 - 15 мин), 0,4 мл (19 - 32 мин) или 0,8 мл (32 - 45 мин), в которые добавляли сцинтилляционную жидкость и просчитывали радиоактивность. Между элюциями колонку уравновешивали 20 мин водой. Инозитол-1-монофосфат, инозитол~1,4~бисфосфат, инозитол-1,4,5-трисфосфат и инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфат идентифицировали по ко-элюции с радиоактивными стандартами (Amersham).

Анализ фосфорилирования белков

Тромбоциты, полученные центрифугированием богатой тромбоцитами плазмы, суспендировали до концентрации 109 клеток/мл в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2,7 мМ KCl, 1 мМ СаС12, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, pH 6,55, 0,1 мг/мл апиразы, 350 мкг/мл V фракции БСА и 50 ед/мл гепарина, а также 0,5 мКи/мл [32Р]Н3Р04. Через 2 часа

63 добавляли 4 объема того же буфера, тромбоциты осаждали центрифугированием и ресуспендировали до концентрации 2 х 108 клеток в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2,7 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,1 мг/мл апиразы и 0,1 мг/мл V фракции БСА. Инкубацию с агонистами запускали смешивая суспензию клеток с активатором при 37°С. Для определения кинетики фосфорилирования отбирали аликвоты по 50 мкл, которые смешивали с 50 мкл буфера для образцов, содержащего 2% SDS и 10% 2-меркаптоэтанол и немедленно замораживали в жидком азоте. Перед проведением электрофореза образць1 прогревали 2 мин на кипящей бане. Электрофорез проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Гели окрашивали Кумасси R-250, высушивали и проводили авторадиографию. Количественные оценки фосфорилирования получали на сканирующем денситометре Beckman CDS-200 при 600 нм.

Двумерный электрофорез белков тромбоцитов

Двумерный электрофорез белков проводили по методу O'Farrell [1975] с некоторыми модификациями. Белки тромбоцитов, растворенные в буфере с SDS как описано выше, наносили на трубочки для изофокусирования (4 х 130 мм), содержащие 5% полиакриламидный гель, 9 М мочевину, 2% CHAPS, 1,6% Ampholine 5-8 и 0,4% Bio-Lyte 3/10. Изофокусировку проводили на приборе Pharmacia GE-2/4LS. Верхняя камера содержала 20 мМ NaOH, а нижняя - 6 мМ Н3Р04. Фокусировку проводили в течение ночи до достижения 4000 вольт X часов. После этого трубочки окрашивали, инкубировали в воде, затем в 63 мМ Tris-HCl, рН 6,8, а затем в том же буфере с 2,3% SDS. Гель помещали на верхнюю часть градиентного геля, фиксировали 1% агарозой в растворе 63 мМ Tris-HCl, рН 6,8 и 2,3% SDS, и дальше обрабатывали как описано для одномерного электрофореза.

Анализ синтеза ДНК и белка

ГМК высевали в 24-луночные плашки по 2 х 104 клеток, культивировали в полной среде роста, после чего выдерживали в бессывороточной среде 48 часов для остановки полиферации. Для измерения синтеза ДНК, покоящиеся ГМК культивировали в МЕМ/БСА в присутствии л агонистов в течение 24 часов, с добавлением через 18 часов [ Н]-тимидина (0,5 мкКи/мл). После удаления радиоактивной среды клетки трижды промывали PBS и добавляли 2 мл 0,4 N перхлорной кислоты. Плашки выдерживали 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды 0,2 N перхлорной кислотой, после чего добавляли 1 мл 0,2 N NaOH. Для измерения синтеза белка, покоящиеся ГМК инкубировали с агонистами 24 часа в среде, л содержащей 1 мкКи/мл [ Н]-лейцина. Клетки трижды промывали PBS и фиксировали 2 мл 20% трихлоруксусной кислоты 30 мин при 4°С. Далее лунки дважды промывали 10% ТХУ и добавляли по 1 мл 0,2 N NaOH. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Вестерн-блоттинг

HUVEC выращивали в 6-луночных плашках и стимулировали агонистами. После промывки PBS клетки соскребали в электрофоретический буфер для образцов и подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию, вслед за чем прогревали образцы 5 мин при 95°С. 10-30 мкг белка разделяли в SDS-ПААГ и переносили электроблоттингом на PVDF-мембраны. Блоты блокировали в 3% растворе обезжиренного молока и 0,1% Tween-20 в PBS в течение 1 часа. Блоты инкубировали с первыми антителами (обычно 1:1000) 1 час при комнатной температуре и промывали PBS/Tween. Вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой, также добавляли на 1 час. После промывки блоты обрабатывали реагентом для хемилюминесценции (LumiGLO, New England Biolabs) и экспонировали с рентгеновской пленкой.

КЛЕТКИ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ

Культуры клеток

Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (HUVEC) культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% СОг в среде 199, содержащей 20% фетальной сыворотки, 1 ед/мл гепарина, 50 мкг/мл bovine endothelial cell growth supplement (Technoclone), 2 мМ глютамин, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Эксперименты проводили на клетках не позднее 5 пассажа. ГМК из аорты и микрососудов человека и животных выделяли и культивировали согласно стандартным методам.

Выделение клеточных мембран из ткани аорты и культивируемых ГМК

Грудные аорты получали во время аутопсии, проводимой через 1-5 часов после смерти от несчастных случаев. Выделение мембран сарколеммы проводилось по описанному ранее методу [Matlib, 1984] с незначительными модификациями. Сосуды вскрывали и удаляли клетки крови и эндотелий. Медиальный слой соскребали с адвентициального слоя и гомогенизировали с помощью гомогенизатора Polytron на льду в буфере, содержащем 250 мМ сахарозу, 0,05% БСА, 1 мМ PMSF/20 мМ MOPS (pH 7,4 при 4°С) и центрифугировали при 1000 х g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант фильтровали через марлю и центрифугировали при 10000 х g в течение 10 мин. Полученный супернатант центрифугировали 30 мин при 112000 х g, а осадок ресуспендировали в том же буфере без БСА. Конфлюентные культуры ГМК промывали ФСБ и соскребали в буфер для лизиса, содержащий 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl (pH 7,4), по 2 мкг/мл лейпептина и апротинииа и 1 мМ PMSF. После озвучивания лизаты центрифугировали при 100000 х g в течение 30 мин при 4°С. Полученный осадок суспендировали в 250 мМ сахарозе/20 мМ MOPS (pH 7,4 при 4°С). Препараты мембран разделяли на аликвоты и хранили в жидком азоте. Концентрацию белка определяли по методу Лоури используя в качестве стандарта БСА.

Выделение кавеолярной фракции клеточных мембран

Нерастворимую в Тритоне фракцию клеточных мембран, имеющую низкую плавучую плотность, выделяли из ГМК крысы или человека, а также из ткани медии аорты человека ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы как описано ранее [Lisanti, 1995]. Конфлюентные монослои ГМК промывали PB S и соскребали в MES-буфере, содержащем 25 мМ MES (рН 6,5 при 4°С), 0,15 M NaCl, по 2 мкг/мл лейцептина и апротинина, 1 мМ PMSF, а также 1% Тритона Х-100. Мембраны из медии аорты человека выделяли из грудных отделов аорты через 5-8 часов после смерти от случайных причин и солюбилизировали в MES/Тритон Х-100. После гомогенизации 10-15 движениями пестика в гомогенизаторе стекло-тефлон, в экстракты добавляли сахарозу до 40% (в/о) и помещали их на дно центрифужных пробирок. Сверху наслаивали 30% и 5% растворы сахарозы в MES-буфере без Тритона Х-100. Пробирки центрифугировали при 35000 об/мин в течение 18 часов при 4°С в роторе SW40 (Beckman Instruments). На границе 30% и 5% сахарозы образовывалась опалесцирующая полоса, которую собирали, разбавляли 5 объемами MES-буфера без Тритона. Х-100 и центрифугировали при 35000 об/мин в течение 2 часов в том же роторе. Осадки замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Для исследования распределения белков по градиенту, содержимое пробирок (12 мл) после центрифугирования фракционировали по 1 мл и анализировали их на мутность (оптическая плотность при 560 нм), содержание белка (тест с бицинхониновой кислотой), а также анализировали их иммуно- и лигандным блоттингом.

Измерение кадгерин-зависимой агрегаг^ии клеток

Субконфлюентные культуры трансфецированных клеток НЕК293 снимали с подложки интенсивным пипетированием и промывали дважды PBS, содержащим 10 мМ HEPES-NaOH (рН 7,3), 1 мг/мл БСА и 1 мМ ЭГТА, после чего клетки ресуспендировали в том же буфере (5 х 10б кл/мл) и хранили при 4°С. Перед началом эксперимента клетки тщательно

67 ресуспендировали для получения суспензии одиночных клеток, после чего определяли жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего. Агрегацию запускали добавлением 50 мкл суспензии в 500 мкл PBS, содержащего 1 мг/мл БСА, 10 мМ HEPES-NaOH, pH 7,3 и 2 мМ СаС12 либо 2 мМ ЭГТА. Образцы помещали в Non-Tissue Culture Treated 24-луночные плашки (Falcon) и вращали со скоростью 70 об/мин при 37°С. Инкубацию останавливали добавлением 500 мкл 5% глютаральдегида в PBS, после чего количество частиц определяли на счетчике Coulter Counter Т4 устанавливая апертуру 100 мкм.

Анализ адгезии лейког^итов к эндотелиалъным клеткам

Измерение адгезии лейкоцитов проводили по ранее описанному методу [Berliner, 1990]. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови человека с помощью Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech) и или пробирок Leucosep (Greiner) по методике производителей. Конфлюентные HUVEC в 48-луночных плашках инкубировали с липидами или цитокинами 4 часа при 37°С. После инкубации клетки промывали для удаления агонистов и добавляли суспензию нестимулированиых моноцитоподобных клеток U937, нейтрофилоподобных клеток HL-60, или выделенные из крови мононуклеарные клетки или нейтрофилы (103 клеток/лунку). Инкубацию проводили в течение 15 мин, после чего иесвязавшиеся дейкоциты удаляли промыванием, а адгезированные к эндотелию моноциты подсчитывали под микроскопом. Для экспериментов по блокированию связывания, HUVEC обрабатывали 30 мин с 8 мкг/мл моноклонального IgM против CS-1-участка фибронектина или контрольного IgM. В других экспериментах использовали моноклональное антитело против VCAM-1 (7,5 мкг/мл), а контрольные культуры обрабатывали неиммунным IgG.

Иммуноферментный анализ поверхностных антигенов эндотелия

HUVEC выращивали в 96-луночных плашках и обрабатывали агонистами в течение 4 часов. После промывки клетки фиксировали 0,1%

68 глютарапьдегидом в PBS и блокировали 1% БСА в PBS. Антитела против Е-селектина, VCAM-1, Р-селектина или ICAM-1 добавляли на 1 час при 37°С. После отмывки PBS, клетки инкубировали с антителами против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой. Для окраски использовали ортофенилендиамин. Реакцию -останавливали добавлением равного объема 0,5 М серной кислоты, после чего определяли оптическую плотность при 490 нм.

Коагуляционный анализ тканевого фактора

Конфлюентные HUVEC, выращенные в 6-луночных плашках, инкубировали 4 часа в среде 199 с 1% сыворотки, после чего добавляли агонисты в той же среде. Через б часов клетки промывали и соскребали в 1 мл буфера, содержащего 10 мМ ацетат натрия, 7 мМ барбитурат натрия и 130 мМ NaCl, рН 7,4. Клетки осаждали на микроцентрифуге и ресуспендировали в 200 мкл того же буфера. Время свертывания определяли при 37°С после смешивания равных. объемов образца, плазмы свиньи и 20 мМ СаС1г-Активность ТФ определяли с помощью калибровочной кривой, полученной с использованием препарата тромбопластина из мозга кролика.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА СВЯЗЫВАНИЯ ЛИПОПРОТЕИДОВ С КЛЕТКАМИ И

БЕЛКАМИ

Лигандный блоттинг

ПААГ-электрофорез проводили в невосстанавливающих условиях. Препараты клеточных мембран солюбилизировали в буфере для образцов по Лэммли без меркаптоэтанола и нагревали 5 мин при 85°С. Белки (100 мкг на дорожку) разделяли в 8% ПААГ, содержащем SDS. После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану белки окрашивали с помощью Ponceau S, отмывали от краски в Трис-солевом буфере (ТСБ, 150 мМ хлорида натрия, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4) и блокировали участки неспецифического связывания на нитроцеллюлозе с помощью инкубации в течение 1 часа при

69 комнатной температуре в ТСБ, содержащем 5% (в/о) обезжиренного сухого молока (ТСБМ). Молоко (Rapilait, Швейцария) содержало 34 г белка, 0,5 г жира, 53 г углеводов и 8 г минеральных солей на 100 г сухого порошка. После забивки блоты инкубировали 2 часа с раствором липопротеидов в ТСБМ. После 5 промывок ТСБМ по 5 мин блоты инкубировали 2 часа с кроличьими антителами (сыворотка) против ano В-100 в разведении 1:200 в ТСБМ. После повторения процедуры отмывки связавшиеся антитела детектировали с помощью вторых антител, меченных пероксидазой хрена, либо, для количественных измерений, I-меченными антителами. После обнаружения радиоактивных полос с помощью авторадиографии, эти участки вырезали и просчитывали на счетчике у-излучения. Для учета неспецифического связывания из каждой полоски нитроцеллюлозы вырезали два участка того же размера с фоновой радиоактивностью. Средние значения из двух измерений фона вычитали из величины радиоактивности, связанной со 105 кДа-полосой. При использовании вторых антител конъюгированных с пероксидазой, в качестве субстрата брали диаминобензидин с усилением окраски ионами никеля.

Анализ связывания липопротеидов с клетками

ЛНП иодировали с использованием ICI как описано ранее [Goldstein, 1983]. Более 95% радиоактивности в препаратах осаждалось ТХУ и менее 2% экстрагировалось смесью хлороформ/метанол. Связывание [12э1]-ЛНП (0,5 -100 мкг/мл, 50 - 150 расп./мин/нг белка) с конфлюентными покоящимися ГМК или фибробластами проводили при 4°С в среде DMEM, содержащей 0,1% БСА. Для определения неспецифического связывания добавляли избыток (1 мг/мл) немеченых ЛНП. Через 4 часа клетки промывали 6 раз холодным раствором Хенкса с ОД % БСА. Клетки растворяли в ОД M NaOH, после чего просчитывали радиоактивность и определяли количество клеточного белка по методу Лоури. Равновесные константы диссоциации и максимальное связывание рассчитывали с помощью программы LIGAND. При проведении конкурентного связывания в лунки добавляли

70 фиксированное количество иодированного ЛНП (обычно 5 мкг/мл для фибробластов и 30 мкг/мл для ГМК) и возрастающие концентрации немеченого конкурирующего липопротеида. Для определения кинетики ассоциации клетки инкубировали с меченым липопротеидов в течение различного времени, после чего быстро промывали (6 раз в течение примерно 5 минут) и измеряли связавшуюся с клетками радиоактивность. Кинетику диссоциации определяли после преинкубации клеток с 50 мкг/мл иодированных ЛНП в течение 4 часов при 4°С. После промывки клетки инкубировали в течение различного времени, промывали как указано выше и солюбилизировали в NaOH для определения радиоактивности и белка. Параллельно инкубировались лунки, содержащие 1 мг/мл немеченых ЛНП для определения неспецифического связывания в соответствующее время. Кинетические константы рассчитывали как описано ранее [Hulme, 1992].

Очистка и секвестрование ЛНП-связываюгцих белков из аорты человека

Аорты людей в возрасте от 15 до 55 лет, извлеченные не позже чем через 12 ч после смерти от несчастного случая, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. В день эксперимента ткань размораживали и помещали в стакан с физтологическим раствором. Все дальнейшие процедуры выполнялись при 4°С. С аорт скальпелем соскребали эндотелий, отделяли интиму и адвентицию. Слой медии измельчали с помощью блендера в буфере для выделения, содержащем 20 мМ MOPS, 250 мМ сахарозу, 1 мМ PMSF (рН 7,4 при 4°С). Затем ткань обрабатывали гомогенизатором Polytron, добавляли в гомогенат буфер для выделения до 5 мл на 1 г ткани и центрифугировали 10 мин при 3000 х g. Осадок повторно гомогенизировали, центрифугировали при тех же условиях и объединенные супернатанты центрифугировали 10 мин при 10000 х g. Супернатант фильтровали через 2 слоя марли и центрифугировали 1 ч при 100000 х g. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для выделения, содержащем 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ CHAPS, 0,03% NaN3, 200 мкМ PMSF (рН 8,0 при 4°С).

Для солюбилизации белков в суспензию мембран добавляли сухой CHAPS и буфер для выделения так, чтобы концентрация детергента составляла 30 мМ, а соотношение белок:СНАР5 равнялось 1:10 по массе. Стакан с суспензией помещали в ледяную баню, инкубировали в течение 1 ч с перемешиванием на магнитной мешалке и центрифугировали 1 ч при 100000 х g. Супернатант (экстракт) сливали в чистую пробирку, а из осадка повторно экстрагировали белок при соотношении белок:СНАР8 равном 1:5 по массе, инкубировали 1 ч на льду и осаждали нерастворившиеся мембраны. Супернатант после второго центрифугирования объединяли с первым и измеряли в нем концентрацию белка.

Полученный экстракт белков наносили на колонку с анионообменником DEAE-Toyopeaii (5 мг белка/1 мл сорбента), уравновешенным 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ CHAPS, 0,03% NaN3, 200 мкМ PMSF (рН 8,0 при 4°С). Колонку промывали 2 объемами того же буфера и затем 1 объемом буфера, содержащего 20 мМ MOPS, 10 мМ CHAPS, 200 мкМ PMSF, рН 7,2. Белки элюировали градиентом NaCl (0 - 0,5 М) в буфере, содержащем 20 мМ MOPS, 10 мМ CHAPS, 200 мкМ PMSF, рН 7,2. В полученных фракциях определяли наличие липопротеид-связывающей активности методом лигандного блоттиига. Фракции, содержащие активность, концентрировали на ультрафильтрационной ячейке с мембраной, задерживающей белки с молекулярной массой выше 30 кДа и подвергали дальнейшей очистке методом металл-хелатной хроматографии.

Образец (фракцию после ионообменной хроматографии, содержащую активность) наносили на колонку Zn2+-HiTrap Chelating (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ MOPS, 500 мМ NaCl, 10 мМ CHAPS, 200 мкМ PMSF (рН 7,2) из расчета 2 мг белка на 1 мл сорбента и промывали тем же буфером. Белок элюировали буфером, содержащим 20 мМ MOPS, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 10 мМ CHAPS, 200 мкМ PMSF (рН 7,2). Собранные фракции тестировали на наличие липопротеид-связывающей активности методом лигандного блотинга. Фракцию, содержащую активность, очищали методом препаративного электрофореза.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили невосстанавливающих условиях в присутствии SDS по методу Laemmli. Фракцию после металл-хелатной хроматографии, содержащую активность, смешивали с буфером для образцов без 2-меркаптоэтанола и наносили на 8%-ный ПААГ толщиной 0,75 мм из расчета 3 - 3,5 мг белка на гель. После разделения белков гель промывали 3x10 мин дистиллированной водой и окрашивали 0,05%-ным раствором Кумасси R-250 в воде. Избыток красителя отмывали дистиллированной водой, вырезали скальпелем белковые полосы, ориентируясь на стандарты молекулярных масс, и элюировали белки из геля методом электроэлюции. Для этого кусочки геля помещали в диализные мешки, добавляли в них буфер для электроэлюции (50 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 100 мкМ PMSF, рН 8,1 при комнатной температуре), укладывали мешки в прибор для горизонтального электрофореза и элюировали белки в течение 3 ч при напряженности электрического поля 3 В/см. Полученный препарат подвергали дальнейшей очистке методом двумерного электрофореза.

Разделение белков в первом направлении проводили в трубках с 5% ПААГ диаметром 3 мм и длиной 9 см. Использовали смесь амфолинов с pl от 3,5 до 9,5. Препарат белка смешивали с буфером для образцов, наносили на гель, после чего проводили изоэлектрофокусирование в течение ночи при 400 В. Перед окончанием процесса напряжение увеличивали на 2 ч до 800 В. Столбики геля выдавливали из трубок, промывали водой и уравновешивали в течение 5 - 10 мин в буфере, содержащем 0,0625 М Tris и 2% SDS. Во втором направлении белки разделяли методом электрофореза по Laemmli в 8% ПААГ толщиной 0,75 мм. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 в воде как описано выше. Для определения местоположения липопротеид-связывающего белка проводили перенос белков из одного геля на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивали ее методом лигандного блоттинга.

После разделения во втором направлении белки переносили на PVDF-мембрану с помощью электроблоттинга. Полученный блот окрашивали в

73 растворе, содержащем 0,2% Кумасси R-250 и 50%-ный метанол, отмывали излишек красителя 50%-ным метанолом, вырезали белковое пятно и хранили его в пробирке при комнатной температуре. Ферментативный гидролиз белка проводили, обрабатывая мембрану трипсином. Полученные пептиды разделяли методом обращеннофазовой ВЭЖХ на С^-колонке и определяли их аминокислотную последовательность с помощью газофазного секвенатора. Эта работа выполнялась в Лаборатории химии белка Биоцентра г. Базеля, Швейцария под руководством проф. Paul Jeno.

Получение антител против пептидных фрагментов Т-кадгерина

Синтез пептидов проводился в Лаборатории химии белка под руководством Ж.Д. Беспаловой. Антигенная структура Т-кадгерина была проанализирована с помощью компьютерных методов для предсказания линейных эпитопов в белках: метода предсказания гидрофильных участков аминокислотной цепи [Норр .1993], метода оценки поверхностной доступности [Jahnin 1979] и статистического метода, учитывающего встречаемость различных сочетаний аминокислот в известных антигенных детерминантах [Welling, 1985]. Расчет проводился с помощью пакета программ "Peptide Companion". На основе проведенного анализа (рис. 4-16) для синтеза пептидов было выбрано 7 фрагментов Т-кадгерина, соответствующих аминокислотам 51-61, 140-160, 161-179, 260-271, 340-352, 350-362 и 370-385. Пептиды были приготовлены твердофазным синтезом на синтезаторе Applied Biosystems 431А с использованием Fmoc-аминоацилполимера и очищены методом ВЭЖХ.

Пептиды С-140 и С-161 конъюгировали с пероксидазой хрена, активированной периодатом натрия в соотношении 1 мг пептида на 4 мг пероксидазы. Для иммунизации были использованы мыши весом 18-20 г. Иммунизацию проводили внутрибрюшинно по 160 мкг конъюгата с интервалом 2 недели. Для первой инъекции использовали антиген, эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда, в дальнейшем применяли неполный адъювант. Забор крови для получения иммунных антисывороток и

74 проведения иммунохимических исследований проводили из хвостовой вены через неделю после 4-й инъекции.

Пептиды С-51, С-140, С-161, С-260, С-340,С-350 и С-370 конъюгировали с обработанной периодатом натрия пероксидазой хрена в соотношении 1 мг пептида на 4 мг белка-носителя. Для иммунизации были использованы молодые кролики весом 1,5-2 кг. Иммунизацию проводили подкожно в область паховых и подлопаточных лимфатических узлов по 1 мг конъюгата на иммунизацию с интервалом в 10 суток. 1 мг конъюгата, растворенного в 1 мл изотонического раствора, эмульгировали в равном объеме адъюванта Фрейнда. Для первой иммунизации использовали полный адъювант, а для трех последующих - неполный. Каждым пептидом было иммунизировано три животных. Забор крови для получения иммунных антисывороток проводили из ушной вены.

Экспрессия рекомбинантных доменов Т-кадгерина в Е.соН и получение политональных антител

Для экспрессии рекомбинантных доменов Т-кадгерина использовали клетки штамма ВЬ21(ВЕЗ)р/у^. После трансфекции с чашки отбирали 4-5 колоний, пересевали их в 10 мл среды ЬВ и выращивали на шейкере в течение ночи при 37°С. На следующий день вносили ночную культуру в 400 мл свежей среды ЬВ из расчета 1 мл ночной культуры на 50 мл среды и выращивали клетки при вышеописанных условиях до оптической плотности 0.8 - 1,0 единицы, измеренной на длине волны 600 нм. После достижения клетками заданной плотности экспрессию рекомбинантных белков стимулировали добавлением 1РТв до конечной концентрации 2,5 мМ. Стимулированную культуру выдерживали на шейкере 4 часа при 37°С, после чего клетки осаждали центрифугированием 15 мин при 3000 х£и 4°С, осадок дважды промывали, каждый раз тщательно ресуспендируя, в 200 мл холодного РВБ. После второй отмывки осадок ресуспендировали в 50 мл холодного РВБ и замораживали в жидком азоте. Затем суспензию размораживали и в течение 30 мин прогревали при 37°С для разрушения

75 клеточной стенки с помощью эндогенного лизоцима. Полученный раствор переносили в пластиковый стакан, разводили 10 объемами буфера для лизиса (50 мМ NaH2P04, 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазол и б М мочевина, pH 8,0) и трижды по 1 мин обрабатывали ультразвуком на приборе LabLine Ultratip Labsonic System (LabLine Instruments) при максимальной мощности с перерывами по 1 мин, охлаждая лизаты на льду. Полученные лизаты фильтровали сначала через фильтр из стекловолокна (Schleicher & Schull), а затем через нитроцеллюлозный фильтр с порами диаметром 0,45 мкм (Millipore).

Очистку рекомбинантных доменов Т-кадгерина из бактериальных лизатов осуществляли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA агарозой, что было возможным благодаря наличию на С-конце рекомбинантного белка полигистидилового хвоста, нуклеотидная последовательность которого кодировалась используемой для экспрессии плазмидой pET21d+. После заполнения сорбентом колонку уравновешивали 10 объемами лизисного буфера, описанного выше. После этого на колонку с помощью перистальтического насоса наносили приготовленный бактериальный лизат. Скорость нанесения лизата подбирали таким образом, чтобы не происходило деформации сорбента. По окончании нанесения лизата колонку промывали сначала 10 объемами лизис-буфера, а затем 20 объемами промывочного буфера (50 мМ NaH2P04, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 6 М мочевина, pH 8,0). Рекомбинантный белок элюировали с колонки с помощью буфера аналогичного состава,но содержащего имидазол в концентрации 250 мМ. Элюат диализовали против PBS и измеряли концентрацию белка. Очищенные таким образом рекомбинантные домены фасовали и хранили при -20°С.

Для получения поликлональных антител молодых кроликов весом 1,5-2 кг (по три на каждый домен Т-кадгерина) иммунизировали рекомбинантными доменами Т-кадгерина, смешанными с адъювантом Фрейнда (полным при первой иммунизации и неполным при последующих) в соответствиисо стандартной процедурой [Harlow, 1988]. Забор крови для

76 определения титра антител и получения иммунных антисывороток проводили из ушной вены. Для усиления иммунного ответа рекомбинантные белки были конъюгированы с пероксидазой хрена (ПХ) согласно следующей методике. ПХ (4 мг) растворяли в 0,2 мл раствора, содержащего 0,05 М ацетат натрия и 0,1 M.NaCl (рН 5,3). В раствор добавляли сухой периодат натрия до конечной концентрации 0,1 М и инкубировали смесь в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем окисленную ПХ отделяли от низкомолекулярных компонентов гель-фильтрацией (центрифугированием на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М карбонат-бикарбонатным буфером (рН 9,5) и к полученному раствору добавляли рекомбинантный домен Т-кадгерина, .растворенный в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, содержащем 6 М мочевину, при этом соблюдали молярное соотношение пероксидаза:антиген =1:3. После 2 часов инкубации в темноте при комнатной температуре к смеси добавляли 0,1 мл раствора боргидрида натрия (4 мг/мл) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Затем конъюгат диализовали в темноте против PBS и использовали для иммунизации кроликов.

Суммарную иммуноглобулиновую фракцию очищали методом аффинной хроматографии на колонке с белком G, иммобилизованном на сефарозе 4В. Разбавленную в 10 раз PBS антисыворотку наносили на колонку, промывали 10 объемами PBS и элюировали специфически связанные антитела раствором 0,1 М глицина (рН 2,5), после чего немедленно доводили рИ раствора до нейтрального добавлением 1/10 объема 1 М Tris-HCl (pIT 9,0). Очищенные антитела диализовали против PBS, измеряли концентрацию белка, фасовали и хранили при -20°С.

Иммуногистохилшческое окрашивание срезов аорты человека

Образцы аорт собирали в процессе аутопсии не позднее 6-8 часов после наступления смерти. Сосуды были разрезаны вдоль вентральной поверхности и промыты PBS. Здоровые и пораженные атеросклерозом области были идентифицированы сначала визуально, а затем и микроскопически после

77 окраски гематоксилином и жировым красным О. Для иммуногистохимической идентификаций различных клеточных антигенов на одном срезе использовали метод двойного иммунного окрашивания. В качестве первых антител были использованы антитела, представленные в таблице.

Антигены Тип антител Клон Окрашиваемые Клетки

ЕС1 домен Т-кадгерина Поликлональные Различные типы клеток

СО 163 Моноклональные Вег-МАСЗ Моноциты/макрофаги

Гладкомышечный Альфа-актин Моноклональные 1А4 Гладкомышечные клетки

Общий лейкоцитарный антиген Моноклональные 2В11+ РБ7/26 Клетки крови

Фактор фон Виллебрандта Поликлональные 044Н-4822 Эндотелиальные клетки

0- ацетилированный дисиалоганглиозид Моноклональные ЗС5 Перициты

Для всех процедур по промывке, блокированию неспецифического связывания и инкубации в качестве основного буфера использовали РВБ (рН

7,4). Всю работу проводили при комнатной температуре. Перед окраской антителами срезы преинкубировали в течение 30 мин с 3% раствором перекиси водорода для уменьшения эндогенной пероксидазной активности и проводили блокировку мест неспецифического связывания 1% раствором

БСА с добавлением 10% неиммунной сыворотки козы. Инкубацию срезов с первыми антителами проводили в растворе 1% БСА в течение 1 часа. После отмывки срезы инкубировали 15 мин с соответствующими

78 биотинилированными вторыми антителами в присутствии 1% БСА. Затем срезы промывали и инкубировали 10 мин с комплексом авидин-пероксидаза. Визуализацию реакции проводили с использованием субстрата на основе 3,3-диаминобензидина и в присутствии ионов никеля. В качестве негативного контроля использовали срезы, при окраске которых в качестве первых антител применяли иммуноглобулиновую фракцию неиммунной кроличьей сыворотки. После визуализации первого антигена срезы тщательно промывали и проводили второй этап окрашивания с антителами к другому антигену. Все инкубации осуществляли так же, как описано выше. После этого срезы инкубировали 10 мин с комплексом авидин-щелочная фосфатаза, промывали в течение 20 мин Tris-HCl буфером (рН 8,2) и визуализировали реакцию с субстратом для щелочной фосфатазы (Alkaline Phosphatase Substrat Kit I, Vector Laboratories).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Стабильная трансфекция клеток НЕК293 Т-кадгерином

Эмбриональные почечные клетки человека НЕК293 стабильно экспрессирующие ГФИ-заякоренный пре-про-Т-кадгерин человека были получены клоналы-юй селекцией на генетицине (800 мкг/мл) после трансфекции вектором pCINeo (Promega), содержащим кДНК Т-кадгерина, соответствующую нуклеотидам 445-2586 (EMBL номер L34058). Клон, трансфецированиый пустым вектором и отобранный селекцией на антибиотике служил в качестве одного из контролей.

Стабильная трансфекция клеток L929 Т-кадгерином

Мышиные клетки линии L929 были трансфецированы плазмидой для эукариотической экспрессии pcDNA 3.1, несущей полноразмерную кДНК Т-кадгерина. Контрольные клетки были получены трансфекцией клеток плазмидой с фрагментом кДНК люциферазы в антисмысловой ориентации. Плазмиды (по 5 мкг) смешивали со 100 мкл среды OptiMEM, после чего к ним добавляли по 20 мкл липофектина, разведенного предварительно в 100

79 мкл OptiMEM. Полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Для трансфекции L-клетки выращивали в 35-мм чашках до плотности 40-50% от монослоя, трижды промывали PBS и переводили на среду OptiMEM без сыворотки и антибиотиков. После этого к клеткам добавляли смесь плазмиды с липофектином и инкубировали их в течение ночи. На следующий день меняли среду на DMEM с 10% фетальной сыворотки и оставляли клетки еще на сутки. Затем клетки снимали трипсином, в серии разведений высевали в 96-луночные культуральные планшеты и инкубировали в среде DMEM с 10% сывороткой и 200 мкг/мл антибиотика G418 для селекции клонов, несущих вставку. После отбора клонов, клетки наращивали в 100-мм чашках и анализировали с помощью иммуноблоттинга на наличие Т-кадгерина.

Анализ связывания NFicB с ДНК

Количественная оценка связывания р65 с его консенсусным олигонуклеотидом проводилась с помощью набора, основанного на методе иммуноферментного анализа (Trans-AM NF-кВ р65 Kit, Active Motif, Rixensart, Бельгия). Специфичность связывания определяли путем инкубации клеточных лизатов с иммобилизованной NFicB-пробой в присутствии избытка нормального или мутантного олигонуклеотида в растворе.

Измерение NFkB-завЫсимой траискритцш

HUVEC, выращенные в 6-луночных плашках, ко-трансфецировали плазмидами pNF-icB-Luc (0,5 мкг/лунку, Stratagene) и pCMV-(3 (0,3 мкг/лунку, Clontech) с помощью реагента Lipofectamine Plus (Life

Technologies) согласно инструкциям производителя. Через 48 часов клетки стимулировали агонистами. Через б часов клетки промывали PB S и соскребали в буфере, содержащем 0,1 M фосфат натрия, рН 7,8. После 3 циклов замораживания-оттаивания люциферазную активность определяли, используя в качестве субстратов аденозинтрифосфат и D-люциферин. Бетагалактозидазную активность определяли с использованием chlorophenol red

80 j-D-galactopyranosicle в качестве субстрата, считывая оптическую плотность при 570 нм.

Трансфекция и флуоресцентная микроскопия

EUYEC трансфецировали химерой NFAT-GFP (зеленый флуоресцентный белок) [Kehlenbach, 1998] с использованием реагента Lipofectamine (Life Technologies). ITa следующий день после трансфекции, клетки анализировали на флуоресцентном микроскопе Nikon Diaphot TMD. Для индукции ядерного импорта GFP-NFAT, кальциевый ионофор А23187 (4 мкм) или ОхРАРС (125 мкг/мл) добавляли к клеткам за 30 мин до измерения.

Анализ сдвига электрофоретической подвилсности (EMSA)

Приготовление ядерных экстрактов и EMSA-анализ проводили как описано раньше [Armesilla, 1999], за исключением того, что в буферы для экстракции . и связывания не добавляли спермин/спермидин и поливинилэтанол, соответственно. Синтетические двухцепочечные

32 , нуклеотиды метили с использованием Кленовского фрагмента и [a- P]dATP. Меченые пробы очищали гель-электрофорезом. Использовали следующие олигонуклеотиды: 5' -aattATAAAATTTTCC AATGTAAAC-3' последовательность NFATp-связывающего участка мышиного промотера IL-4 от -60 до -80), 5 '-aattCCGGAGTTTCCTACC-З' (нуклеотиды от -183 до -197 промотера тканевого фактора человека) и 5'-aattGGAGGCGGGGCAGGGGTGTGGAACTCG-3' (Spl участок из промотера тканевого фактора человека). На реакцию брали по 3 мкг белка из экстракта ядер. Для контроля специфичности связывания добавляли 50-кратный избыток немеченой пробы или неродственную последовательность (Spl олигонуклеотид). Для получения supershift 4 мкг антитела добавляли за 15 мин до внесения меченого нуклеотида. Разделение ДНК-белковых комплексов проводили в 5% неденатурирующем полиакриламидном геле в 0,5 х Tris-борат-ЭДГА буфере.

Аденовирусная трансдукция клеток

Аденовирусы, кодирующие NAB2 и 1кВа были получены от Е. Hofer и R. de Martin. HUVEC, выращенные в 6-луночной плашке, дважды промывали PBS и инкубировали с рекомбинантными или контрольными аденовирусами. Через 30 мин клетки промывали PBS и далее культивировали в- нормальной среде. Через 24 часа после инфекции, клетки переводили на 1 % сыворотку на 4 часа, с последующей обработкой ОхРАРС в течение 6 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бочков, Валерий Николаевич

выводы

1. Обнаружено, что лнпопротенды плазмы крови способны активировать системы внутриклеточной сигнализации. Липопротеиды высокой и низкой плотности активируют фосфоинозитидный обмен, повышают уровень цитоплазматического кальция и стимулируют фосфорилирование белков в тромбоцитах и ГМК сосудов человека и животных. "Сигнальные" эффекты липопротеидов развиваются быстро и обратимо, а их кинетические характеристики и фармакологическая регуляция полностью совпадают с действием кальций-мобилизующих гормонов. Таким образом, «сигнальные» эффекты липопротеидов обладают характерными признаками рецептор-опосредованных процессов.

2. Липопротеиды являются частичными агонистами - их максимальное влияние на ФИ-обмен и мобилизацию Са слабее, чем действие большинства гормонов, а длительная преинкубация клеток с липопротеидами не приводит к десенситизации «сигнальных» эффектов. Липопротеиды потенциируют действие индукторов агрегации и вазоконстрикторных гормонов на системы вторичных посредников в тромбоцитах и ГМК.

3. Липопротеиды крови активируют в ГМК сосудов синтез ДНК и белка, а также стимулируют деление клеток. Липопротеиды высокой и низкой плотности оказывают одинаковое действие на пролиферацию ГМК, что свидетельствует об отсутствии прямой связи между митогенными эффектами липопротеидов и их холестерин-переносящими свойствами. Липопротеиды потенциируют пролиферацию ГМК под действием классических факторов роста PDGF-BB, bFGF, EGF и IGF.

4. Липопротеиды вызывают «сигнальные» эффекты на клетках животных и человека с генетическими дефектами ano В,Е-рецептора. Таким образом, действие липопротеидов на системы вторичных посредников не связано с классическим механизмом клеточного захвата ЛНП. На ГМК сосудов человека выявлены участки специфического связывания ЛНП, концентрационные характеристики которых, кинетика ассоциации и диссоциации, липопротеидная селективность, а также чувствительность связывания к ингибиторам отличаются от характеристик ano В,Е-рецептора, но близки к свойствам предполагаемого «сигнального» липопротеидного рецептора.

5. ГМК сосудов человека и животных экспрессируют белки с молекулярными весами 105 и 130 кДа, специфически связывающие ЛНП на лигандных (Вестерн-) блотах. Характеристики связывания липопротеидов с этими белками близки к свойствам участков связывания ЛНП, обнаруженных нами на ГМК. Проведена очистка 105- и 130 кДа белков из клеточных мембран медии аорты человека до гомогенного состояния и аминокислотное секвенирование 105- и 130-кДа белков. Показано, что белок pi05 является молекулой межклеточной адгезии Т-кадгерином, ар 130 - его частично процессированным предшественником. Т-кадгерин максимально экспрессирован в сосудах и сердечной ткани. Увеличение экспрессии Т-кадгерина в трансфецированных клетках приводит не только к усилению межклеточных взаимодействий, но и к возрастанию связывания ЛНП с клетками. ЛНП ингибируют межклеточную адгезию, опосредованную Т-кадгерином. Таким образом, ЛНП являются гетерофильным лигандом Т-кадгерина. Т-кадгерин со-локализуется в кавеоляриой фракции клеточных мембран ГМК с G-белками и протеишсиназами, что указывает на возможный механизм его сопряжения с системами вторичных посредников.

6. Показано, что окислительная модификация ряда липидов, входящих в состав липопротеидов, приводит к появлению у них способности активировать сигнальные системы эндотелиальных клеток, связанные с развитием воспаления и повышением тромбогенности. Обработка ЭК окисленными эфирами холестерина и изопростанами, образующимися путем неферментативного окисления арахидоновой кислоты, избирательно стимулирует адгезию моноцитов, но не нейтрофилов, что характерно для атеросклеротического процесса. Эффект окисленных липидов на ЭК опосредуется активацией МАР-киназ, но не зависит от основного транскрипционного механизма воспаления - №кВ-пути.

7. Окисленные фосфолипиды индуцируют экспрессию на эндотелиальных клетках тканевого фактора свертывания. Данный эффект опосредуется активацией МАР-киназ, повышением уровня цитоплазматического кальция и активацией транскрипционных факторов №АТ и Е011-1.

8. Сделано заключение, что «сигнальные» эффекты липопротеидов могут вызываться как целыми липопротеидными частицами, взаимодействующими с поверхностными сигнал-передающими рецепторами, так и образующимися- в липопротеидах окисленными липидами. Липопротеиды и их окисленные компоненты активируют внутриклеточные сигнальные системы, сопряженные с агрегацией тромбоцитов, вазоконстрикцией, активацией коагуляционного каскада и развитием мононуклеарного воспаления. Все эти процессы могут вносить вклад в развитие атеросклероза и других нарушений, характерных для дислипидемий.

5.4. Заключение

Представленные в главе 5 результаты показывают, что окисленные эфиры холестерина индуцируют адгезию моноцитов, но не нейтрофилов, к эндотелиальным клеткам. Эффект окисленных ЭХ не связан с активацией NFicB-пути и опосредуется активацией МАР-киназ. Изопростаны, образующиеся путем неферментативного окисления арахидоновой кислоты, избирательно стимулируют адгезию моноцитов, не влияя на адгезию нейтрофилов. Изопростаны стимулируют активность МАР-киназ, но не влияют на активность NFicB-пути. Окисленные фосфолипиды (окФЛ) индуцируют экспрессию на эндотелиальных клетках тканевого фактора свертывания. ОкФЛ не влияют на активность транскрипционного фактора NFkB в эндотелиальных клетках, но активируют MAP киназы, вызывают повышение уровня цитоплазматического кальция, активируют транскрипционный фактор NFAT и стимулируют экспрессию транскрипционного фактора Egr-1 в эндотелиальных клетках. Все эти процессы необходимы для индукции ТФ под действием окисленных ФЛ, поскольку вещества, ингибирующие перечисленные пути, подавляют экспрессию ТФ, вызванную окисленными ФЛ. Полученные данные свидетельствуют о том, что ряд «сигнальных» эффектов липопротеидов может вызываться образующимися в них окисленными липидами, такими как окисленные эфиры холестерина, изопростаны и окисленные фосфолипиды. Эти вещества стимулируют моноцитарное воспаление и повышают тромбогенность эндотелия. Действие окисленных липидов опосредуется активацией протеинкиназ А, МАР-киназ и протеинкиназы С, но не зависит от основного транскрипционного механизма воспаления - NFicB-пути.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гормоноподобные эффекты липопротеидов

Традиционно ЛП изучались в качестве переносчиков липидов. Одними из первых нам удалось показать, что ЛП способны активировать системы вторичных посредников в клетках крови и сосудистой стенки, действуя подобно Са -мобилизующим гормонам (рис. 1-1, 1-6). Интересно, что ЛНП и ЛВП оказывают сходные эффекты на ГМК, что свидетельствует о том, что гормоноподобное действие ' ЛП не связано напрямую с транспортом холестерина (рис. 1-6, 1-8, 1-9, 1-10). Полученные нами данные об активирующем действии ЛП на системы вторичных посредников в ГМК и тромбоцитах получили подтверждение в целом ряде работ. В настоящее время имеются убедительные данные о способности ЛНП и ЛВП повышать уровень цитозольного Са [Block, 1988], а также запускать активацию фосфатидилинозитол- и фосфатидилхолин-специфичных фосфолипаз С и D, протеинкиназы С [Bochkov, 1991 Biochim Biophys Acta], митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), тирозиновых киназ, гетеротримерных G-белков [Nofer, 2002; Cockerill, 1999], образование сАМР и церамида [Li, 2002]. ЛП способны активировать все основные виды МАР-киназ: ERK1/2, р38 и SAP/INK [Gouni-Berthold, 2001]. Активация МАР-киназного пути под действием ЛП осуществляется при посредстве G-белков и дальнейшей активации Raf-1 и МЕК-1 [Deeg, 1997; Nofer, 2001;.Garver, 1997]. Кроме того, показано, что связывание ЛВП с рецептором SR-BI приводит к активации белка Ras, который запускает дальнейшую сигнализацию через МАР-киназы [Grewal, 2003]. Аналогичные гормоноподобные эффекты ЛП оказывают и на тромбоциты. Накоплено большое количество данных, показывающих, что липопротеиды активируют внутриклеточные системы передачи сигналов, связанные с активацией тромбоцитов и опосредующие адгезию, секрецию тромбоцитарных гранул и агрегацию. К сигнальным механизмам, активируемым в тромбоцитах липопротеидами, относятся: мобилизация Са [Nofer, 1997], активация фосфоинозитидного обмена [Nofer, 1997; Andrews,

191

1987; Block, 1988] и протеинкиназы С [Andrews, 1987], а также повышение активности Ыа+/Н+-обменника [Block, 1988].

Наиболее простым объяснением активации систем вторичных посредников под действием ЛП могло бы служить изменение липидного состава клеточных мембран, приводящее к изменению активности ферментов, участвующих в синтезе или распаде вторичных посредников. Большинство таких ферментов связано с . мембраной, поэтому изменение ее физико-химических свойств потенциально может приводить к изменению уровней вторичных посредников. В связи с этим, важно подчеркнуть, что обнаруженное нами «сигнальное» действие ЛП обладает рядом признаков рецептор-опосредованного процесса и вряд ли может полностью объясняться простым изменением состава или структуры клеточной мембраны. ЛП вызывают весь спектр эффектов, характерных для действия Са -мобилизующих гормонов, в том числе повышение Са2+Ь активацию фосфоинозитидного обмена и фосфорилирование белков (рис. 1-1, 1-4, 1-5, 16, 1-10, 1-11). Подобно действию гормонов, кинетика липопротеидных эффектов быстрая и обратимая (рис. 1-1, 1-5, 1-6). Под действием липопротеидов Ca2+j повышается как за счет входа ионов Са2+ снаружи, так и в результате их мобилизации из внутриклеточных депо (рис. 1-3, 1-7).

2+

Липопротеиды индуцируют в ГМК осцилляции Са ¡, что также характерно для действия гормонов (рис. 1-9). Полученные нами данные по ингибированию действия липопротеидов токсином В pertussis (табл. 1-3) позволяют предположить, что «сигнальные» эффекты реализуются при участии гетеротримерных GTP-связывающих белков. Наконец, ингибирование «сигнальных» эффектов липопротеидов под действием факторов, имитирующих действие вторичных посредников (рис. 1-12), также указывает на сходство в действии липопротеидов и классических Са2+-мобилизующих гормонов. Таким образом, существующее сходство в действии ЛП и гормонов позволяет предположить и наличие общих механизмов, индуцирующих передачу сигналов в клетках.

Характерным признаком действия ЛП на системы внутриклеточной сигнализации является то, что их эффекты даже в насыщающих концентрациях слабее действия многих известных гормонов. Поскольку сильная активация систем вторичных посредников могла бы привести к развитию вазоспазма и тромбоза, способность ЛП выступать в качестве слабых агонистов объясняет отсутствие постоянной активации ГМК и тромбоцитов в сосудах in vivo. В то же время, наши данные показывают, что «сигнальные» эффекты липопротеидов не подвержены десенситизации при долговременной обработке клеток липопротеидами (табл. 1-5). На основании этих данных можно предположить, что in vivo клетки сохраняют чувствительность к слабому активирующему действию ЛП и находятся под их постоянным тоническим воздействием несмотря на длительность контакта. По-видимому, концентрация ЛП в плазме крови и сосудистой стенке является одним из факторов, определяющих базальный тонус сосудов и активность тромбоцитов.

Одним из механизмов, регулирующих действие ЛП на клетки, расположенные внутри стенки сосуда, является барьерная функция эндотелия. В норме существует 10-кратный градиент концентрации белков и липопротеидов между кровью и лимфой, примерно соответствующей межклеточной жидкости. Таким образом, в норме концентрация липопротеидов в медии составляет порядка десятков микрограммов на миллилитр, что ниже, чем насьщающая концентрация для активации систем вторичных посредников в ГМК. Эндотелиальная дисфункция, одним из проявлений которой является нарушение эндотелиального барьера, может способствовать контакту липопротеидов с ГМК и усилению их вазоконстрикторного и гипертрофического действия.

Для гормоноподобных эффектов ЛП характерно усиление активности под действием некоторых биологически активных веществ. ЛП могут усиливать сигнальные эффекты вазоактивных гормонов. Согласно нашим данным, ЛП и ангиотензин II могут действовать не только аддитивно, но и синергически (рис. 1-13, 1-14, 1-15, табл. 1-4). Кроме того, адреналин оказывает

193 потенциирующее действие на эффекты ЛП на тромбоциты (рис. 1-1, 1-2, 1-4, 1-5, табл. 1-1, 1-2). Принимая во внимание, что сами ЛП являются слабыми агонистами, эти данные позволяют предположить, что «сигнальная» активность ЛП проявляется главным образом в модуляции' эффектов гормонов, регулирующих активность тромбоцитов и сократительную способность ГМК сосудов. Этот эффект может лежать в основе таких известных фактов как усиление агрегационной способности тромбоцитов и склонность к вазоконстрикции при гиперлипидемиях. В отличие от этого, активирующее действие липопротеидов на сигнальные системы клетки подавляется факторами роста (табл. 1-6). Эти данные свидетельствуют о том, что «сигнальные» эффекты липопротеидов могут как усиливаться, так и ослабляться под действием других групп биологически активных веществ. Таким образом, для проявления эффектов ЛП in vivo важны не только концентрация ЛП в плазме и стенке сосуда, но и концентрация других веществ, регулирующих гомеостаз в сосудах, в частности вазоактивных гормонов и факторов роста.

Какую роль могут играть гормоноподобные эффекты в патологическом действии ЛП? «Сигнальные» эффекты, липопротеидов наблюдаются на различных типах клеток крови и сосудистой стенки: эндотелии, ГМК, тромбоцитах и др. Характерно, что все перечисленные типы клеток принимают непосредственное участие в развитии . атеротромбоза. Представляется вероятным, что способность ЛП повышать реактивность тромбоцитов и ГМК, а также усиливать действие гормонов, может вносить свой модулирующий вклад в развитие атеросклероза и особенно его осложнений, таких как вазоспазм и тромбоз. Одновременно эти же эффекты могут принимать участие в формировании параллельных патологических изменений, часто встречающихся при дислипидемиях, таких как гипертензия и повышение реактивности тромбоцитов.

Влияние липопротеидов на пролиферацию клеток и синтез белка

Многочисленные свидетельства существования связи между нарушениями обмена холестерина и таким важным механизмом развития атеромы как миграция и пролиферация ГМК, послужили основой для целого ряда исследований по влиянию липопротеидов на пролиферативную активность клеток сосудистой стенки. Ранее было показано, что ЛНП стимулируют клеточную пролиферацию в комбинации с сывороткой [Fischer-dzoga, 1976], делипидированной сывороткой и различными факторами роста, такими как PDGF, инсулин, EGF и FGF [Chen, 1986; Bjorkerud, 1994]. Литературные данные не позволяют ответить на вопрос о том, обладают ли липопротеиды собственными митогенными свойствами, либо их активность ограничивается стимуляцией пролиферативных эффектов факторов роста.

В ряде работ был сделан вывод о том, что основным механизмом про-митогенного действия липопротеидов является транспорт холестерина и жирных кислот, необходимых для роста и деления клеток. Мы обнаружили, что кратковременной обработки клеток липопротеидами в течение 6-8 часов достаточно для развития пролиферативного эффекта даже после удаления липопротеидов. ' Таким образом, хотя лимитированное поступление экзогенного холестерина может ограничивать мембраногенез и таким образом нарушать деление клеток [Libby, 1985], наши данные свидетельствуют о том, что пролиферативные эффекты липопротеидов не могут ограничиваться простой доставкой питательных веществ клеткам. Кроме того, наши данные показывают, что что ЛНП и ЛВП способны стимулировать синтез ДНК и белка при полном отсутствии добавленных митогенов (рис. 2-1, 2-2, 2-3). Помимо синтеза ДНК и белка, липопротеиды стимулируют деление клеток (рис. 2-2), что свидетельствует о наличии у них полноценных митогенных свойств.

Характерная кривая «доза-эффект» с насыщением в области физиологических концентраций липопротеидов (рис. 2-3, 2-8) позволяет предположить, что в реализации описанных эффектов участвуют мембранные рецепторы. В предыдущих работах не раз поднимался вопрос о природе мембранных рецепторов, опосредующих пролиферативные эффекты

195 липопротеидов. Действие нативных и окисленных липопротеидов приписывалось ano В,Е- и скевенджер рецепторам, соответственно [Ozer, 1993]. Наши данные позволяют усомниться в этом выводе. Отсутствие специфичности для определенного класса липопротеидов (рис. 2-1, 2-2, 2-3), нечувствительность к химической модификации апобелков, антиоксидантам и ингибиторам скевенджер-рецепторов (рис. 2-5) позволяют предположить, что на ГМК экспрессируется особый тип неселективных липопротеид-связывающих рецепторов.

Согласно нашим данным, липопротеиды являются более слабыми индукторами пролиферации, чем факторы роста (рис. 2-6). Кроме того, липопротеиды присутствуют в- стенке сосуда в концентрациях (10-100 мкг/мл), которые, как мы показали, не являются насыщающими в отношении пролиферативных эффектов (рис. 2-3). Таким образом, можно предположить, что в естественных условиях митогенные эффекты липопротеидов выражены слабо. Однако в присутствии факторов роста суммарный эффект превышает сумму эффектов липопротеидов и фактора роста, действующих по отдельности (рис. 2-6, 2-7, 2-8). Эти данные позволяют предположить, что липопротеиды не являются стимулом для начала деления клеток в стенке сосуда, а их пролиферативное действие реализуется главным образом в потенциировании эффектов факторов роста.

Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что липопротеиды плазмы крови являются стимулами для развития гипертрофических и гиперпластических изменений в стенке сосуда. Эта активность липопротеидов может служить одним из механизмов, посредством которых атерогенные формы дислипидемии стимулируют развитие атеромы.

Рецепторные механизмы гормоноподобных эффектов липопротеидов

По ряду характеристик гормоноподобные эффекты липопротеидов подобны рецепторопосредованным процессам. Наши данные показывают, что предполагаемые «сигнальные» липопротеидные рецепторы отличаются от классического ano В,Е (ЛИП)-рецептора (рис. 3-1, 3-2, 3-3). Таким образом, гормоноподобные эффекты липопротеидов могут проявляться в более выраженной форме у больных с дефектом этого рецептора, у которых наблюдается повышенная концентрация ЛНП при сохранении нормальной чувствительности к ним, что может вносить вклад в ускоренное развитие атерогенеза у таких пациентов. Более того, мы обнаружили, что активация систем вторичных посредников в тромбоцитах происходит без участия гликопротеина Ilb/IIIa, который, как было показано в ряде исследований, способен связывать липопротеиды, а также активировать системы внутриклеточной сигнализации (рис. 3-7, 3-8). Мы также показали, что поликатионная структура ano В-100 не играет существенной роли в активации систем вторичных посредников (рис. 2-5, 3-5), на основании чего можно сделать вывод о том, что активирующее действие липопротеидов не опосредуется гликозаминогликанами или другими поверхностными молекулами, несущими сильный отрицательный заряд.

Еще одним необычным свойством индуцированных липопротеидами сигнальных процессов является необычная способность ЛНП и ЛВП в одинаковой степени активировать сигнальные системы клетки, несмотря на их противоположную роль в транспорте липидов и развитии сосудистой патологии (рис. 1-6, 1-8, 1-10). Кроме того, необычной является относительная нечувствительность гормоноподобных эффектов к модификациям липопротеидов, изменяющим их селективность по отношению к рецепторам, а именно уменьшающим связывание с ano В,Е (ЛНП)-рецептором и усиливающим взаимодействие со скевенджер-рецепторами (рис. 2-5). Таким образом, гормоноподобное действие не может объясняться взаимодействием ЛНП и ЛВП ни с одним известным липопротеидным рецептором, на основании чего мы постулировали существование дополнительных липопротеидных рецепторов, сопряженных с системами вторичных посредников.

Для проверки гипотезы о существовании нового типа липопротеидсвязывающих белков на поверхности ГМК мы применили

197 радиолигандный анализ с использованием иод-меченных липопротеидов. Наши данные свидетельствуют о существовании по крайней мере двух типов участков специфического связывания ЛНП на ГМК сосудов (рис. 3-9). Высокоафинный участок по своим свойствам близок к ano В,Е рецептору, в то время как природа низкоафинного участка пока не установлена. Низкоафинные рецепторы вносят основной вклад в специфическое связывание ЛНП с ГМК, но практически отсутствуют на фибробластах, которые послужили основным объектом для проведения классических исследований ano В,Е (ЛНП)-рецептора (рис. 3-10). Именно этим, на наш взгляд, и объясняется малоизученность участков связывания ЛНП на ГМК.

ЛНП и другие липопротеиды, содержащие апоВ-100, способны связываться с сульфатированными протеогликанами. Такие протеогликаны являются обычными компонентами матрикса, синтезируемого ГМК в культуре, и могли бы объяснить низкоафиниое связывание ЛНП. Гепарин структурно подобен гликозаминогликановым группам, присутствующим в сульфатированных протеогликаиах (хондроитин- и дерматансульфатам) и поэтому конкурентно ингибирует связывание ЛНП с протеогликанами [Camejo, 1988]. Наши данные о неспособности гепарина ингибировать связывание ЛНП с ГМК (рис. 3-13, 3-14) свидетельствуют против возможного участия ЛНП-протеогликановых взаимодействий в формировании низкоафинного связывания.

В отличие от ano В,Е-рецептора фибробластов, участок связывания на ГМК характеризуется более низкой афинностыо при 4°С (но почти одинаковой при 37°С, рис. 3-16), лишь частично ингибируется ЭДТА (рис. 315), способен связывать химически модифицированные ЛНП (рис. 3-12) и не сопряжен с интернализацией и деградацией липопротеидов (рис. 3-16). Кроме того, участок связывания, присутствующий на ГМК, менее специфичен для ЛНП по сравнению с ano В,Е (ЛНП)-рецептором, поскольку высокие концентрации ЛВП3 частично вытесняют связывание меченых ЛНП (рис. 3-12). Все эти свойства совпадают с параметрами липопротеид-индуцированной активации систем вторичных посредников, что делает

198 описанный нами атипичный участок связывания кандидатом на роль «сигнального» липопротеидного рецептора.

Т-кадгерин — новый ЛНП-связывающий рецептор в клетках сосудистой стенки

Описанные в данной главе результаты продемонстрировали существование в ГМК сосудов двух белков, способных связывать ЛНП на лигандных блотах (рис. 4-1, 4-2). Разработанная нами процедура очистки позволила выделить эти бедки в гомогенном состоянии и определить их частичную аминокислотную последовательность (рис. 4-10, 4-12). Согласно данным аминокислотного секвестрования и ряда дополнительных экспериментов, белки с молекулярными весами 105 и 130 кДа являются Т-кадгерином и его частично процессированным предшественником (рис. 4-12, 4-14, 4-15).

Ряд свойств связывания липопротеидов указывает на специфический характер взаимодействия Т-кадгерина с ЛНП. Ингибирование связывания антителами против апоВ-100 и Т-кадгерина свидетельствует о важности белок-белковых, а не белок-липидных взаимодействий (рис. 4-9, 4-13). Подавление связывания при восстановлении дисульфидных связей в Т-кадгерине свидетельствует о необходимости интактной третичной структуры Т-кадгерина (рис. 4-4). В пользу специфического характера этих взаимодействий свидетельствует и необходимость присутствия двухвалентных катионов (рис. 4-5). Липопротеид-связывающие свойства Т-кадгерина характеризуются значительной лигандной специфичностью: избирательное связывание ЛНП с Т-кадгерином происходит в присутствии избытка ЛВП (рис. 4-3), ряда полианионов и поликатионов (рис. 4-7, 4-8), высоких концентраций БСА, а также белков и липидов молока, используемого для забивки участков неспецифического связывания белков на блотах. Кроме того, уже при низких концентрациях ЛНП наблюдается насыщение связывания этих липопротеидов (рис. 4-2), что также свидетельствует в пользу образования специфических комплексов между молекулами Т-кадгерииа и ЛНП.

Наши данные показывают, что рецепторами ЛНП могут быть белки, структурно отличные от рецепторов ЛНП-семейства или скэвенджер-рецепторов. Механизм связывания ЛНП с Т-кадгерином, по-видимому, сложный, поскольку перечисленные выше свойства показывают, что ионные или гидрофобные взаимодействия не играют определяющей роли в связывании. По-видимому, так же как в других парах лиганд/рецептор, ключевую роль играет пространственное совпадение комплементарных участков ЛНП и Т-кадгерина.

Важно отметить, что характеристики связывания ЛНП с Т-кадгерином во многом совпадают со свойствами сигнальных эффектов ЛНП. Принимая во внимание, что в плазматической мембране Т-кадгерин со-локализуется не с молекулами клеточной адгезии, но с целым рядом сигнал-передающих молекул, расположенных в кавеоляриой фракции (рис. 4-21), нам кажется оправданной гипотеза о том, что именно Т-кадгерин выступает в роли «сигнального» липопротеидного рецептора и опосредует активацию сигнальных систем клетки под действием ЛНП. Естественно, что это предположение не исключает возможности существования других липопротеид-связывающих рецепторов, сопряженных с системами вторичных посредников.

Раньше считалосьз что Т-кадгерин экспрессируется преимущественно в нервных клетках, где он направляет миграцию аксонов [КашсМ, 1991]. Мы показали, что кадгерин максимально экспрессирован в клетках сердечнососудистой системы, и особенно в ткани крупных сосудов (рис. 4-20). Высокий уровень экспрессии показывает, что этот белок выполняет какие-то важные функции во взрослом организме. Поскольку Т-кадгерин напрямую не взаимодействует с цитоскелетом и не может опосредовать надежное связывание клеток друг с другом, можно предположить, что его функции несколько иные. Представляется вероятным, что Т-кадгерин сигнализирует о наличии контакта с соседними клетками, также несущими этот белок.

200

Другими словами, Т-кадгерин может быть сенсором клеточного микроокружения. Поскольку он присутствует во всех резидентных типах сосудистых клеток, он может служить сигналом, показывающим клетке, что она находится внутри сосуда, что может влиять на процессы клеточной миграции и дифференцировки.

Один из неожиданных результатов наших исследований заключается в том, что для Т-кадгерина характерны не только гомофильные взаимодействия, как считалось раньше, но и гетерофильные, то есть связывание с ЛИП. На основании этих данных молено предположить, что за счет гетерофильного взаимодействия с Т-кадгерином ЛНП могут вмешиваться в процессы межклеточного узнавания, опосредуемые этим белком (рис. 4-19). Нарушение гомофильного взаимодействия за счет конкуренции с ЛНП может быть одним из механизмов, способствующих изменению структуры сосуда при гиперхолестеринемии и атеросклерозе. Поскольку, согласно нашим данным, Т-кадгерин способен связывать химически анионизированные ЛНП, напоминающие по своим свойствам окисленные ЛНП, можно предположить, что Т-кадгерин способен связывать и окисленные ЛНП, накапливающиеся в атероме. В местах отложения окисленных ЛНП их локальная концентрация становится очень высокой и может нарушать Т-кадгерин-опосредованные процессы. Возможно, что такое нарушение вносит вклад в ремоделирование сосуда в районе атеромы. Для проверки этой гипотезы требуются дальнейшие исследования роли Т-кадгерина и ЛНП во взаимодействии клеток сосудистой ткани.

Проатерогенная активность окисленных липидных компонентов липопротеидов

Описанные в главе 5 результаты показыват, что окисленные липиды могут быть активным компонентом липопротеидов, вызывающим моноцитарное воспаление и повышающим тромбогенность эндотелия. Таким образом, патогенное действие липопротеидов опосредуется не только взаимодействием целых липопротеидных частиц с клеточными рецепторами, но и действием отдельных липидных компонентов. Поскольку исследованные нами окисленные липиды активны при добавлении к клеткам в виде мицелл/липосом, очевидно, что их действие не регулируется апобелками, которые играют центральную роль во взаимодействии липопротеидов с клеточными рецепторами. Вместе с тем, вполне вероятно, что некоторые из этих эффектов опосредуются специфичными рецепторами, узнающими лиганды липидной природы.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что атеротромбогенные эффекты вызываются окисленными липидами разных классов (рис. 5-1, 5-6, 5-13) и, по-видимому, могут опосредоваться различными рецепторными и нерецепторными механизмами. Некоторые липиды, например изопростаны, активируют рецепторы простагландинов, но также, как предполагается, связываются с собственными специфичными мембранными рецепторами, родственными рецепторам простагландинов [Pratico, 1996]. Часть эффектов окисленных фосфолипидов может опосредоваться рецепторами фактора активации тромбоцитов, с которыми определенные формы окисленных фосфолипидов связываются с низкой афинностью [Marathe, 2002]. Вместе с тем, фактор активации тромбоцитов не влияет на способность эндотелиальных клеток связывать лейкоциты, в связи с чем было высказано предположение о существовании особых G-белок-сопряженных рецепторов, распознающих окисленные фосфолипиды [Parhami, 1995]. Имеются также данные о том, что эффекты некоторых окисленных фосфолипидов могут быть опосредованы ядерными рецепторами (транскрипционными факторами) PPAR [Subbanagounder, 2002]. В отличие от изопростанов и окисленных фосфолипидов, для окисленных эфиров холестерина пока не показано существование специфических рецепторов. Возможно, что взаимодействие окисленных эфиров холестерина с клетками и активация сигнальных путей происходит по нерецепторному механизму, например путем изменения липидного состава и физико-химических свойств клеточных мембран, например, подобно тому, как холестерин регулирует активность транскрипционного фактора SREBP.

Полученные нами результаты, а также данные литературы свидетельствуют, что для проявления воспалительной активности фосфолипидов недостаточно простого окисления ненасыщенной жирной кислоты. Важным условием является также ее связь с глицерофосфолипидной молекулой. Об этом свидетельствует полная потеря активности окисленных фосфолипидов после обработки фосфолипазами (рис. 5-22). Таким образом, основной структурной детерминантой окисленных фосфолипидов при индукции атеротромботических реакций, по-видимому, является окисленный остаток жирной кислоты, эстерифицированный в яп-2 положении фосфолипида. Важно отметить, что воспалительные реакции индуцируются не только «окисляющими», но и «окисленными» липидами (например, РвРС), то есть не содержащими неокисленных двойных связей, перекисных и других группировок, способных поддерживать классическую цепную реакцию перекисиого окисления липидов (рис. 5-22). Более того, многие клеточные эффекты окисленных липидов не подавляются антиоксид антами. Суммарно, имеющиеся данные показывают, что эффекты окисленных фосфолипидов не являются результатом действия образующихся при их окислении свободных радикалов, но требуют наличия определенной пространственной структуры. Возможно, что эта структура необходима для взаимодействия с мембранными рецепторами, но также нельзя исключить, что такое строение позволяет окисленным молекулам с большей эффективностью встраиваться в клеточные мембраны, изменять их свойства и в конечном итоге стимулировать сигнальные процессы, ведущие к воспалительным изменениям. Выяснение роли пространственной структуры окисленных липидов для проявления их биологической активности является перспективным направлением для будущих исследований.

Как нам удалось показать, общим в действии окисленных липидов разных классов является то, что клетки реагируют на них активируя различные сигнальные пути ведущие к воспалению, но не основной воспалительный механизм - №кВ (рис. 5-3, 5-10, 5-14). Биологическая целесообразность

203 этого, по-видимому, связана с тем, чтобы избежать активации нейтрофилов, поскольку их защитные реакции, оправданные при борьбе с бактериями, в случае асептического воспаления неизбежно приведут к неоправданному повреждению собственных тканей. Нейтрофильное воспаление, сопровождающееся интенсивным образованием активных форм кислорода и протеолитических ферментов, по-видимому, особенно нецелесообразно в стенке сосуда, находящейся под давлением крови, поскольку разрыв стенки неизбежно приводит к фатальным последствиям для организма. Как же развиваются защитные воспалительные реакции, индуцированные окисленными липидами? Нами впервые продемонстрирована роль альтернативного пути индукции воспалительных и тромбогенных факторов под действием окисленных фосфолипидов, заключающегося в активации

2*1

Egr-1 -зависимой транскрипции (рис. 5-16, 5-17, 5-18) и Ca /NFAT пути (рис. 5-19, 5-20, 5-21). Индуцируемые этими факторами гены часто совпадают с теми, которые индуцируются через NFicB-путь, однако принципиальным отличием является тот факт, что эти транскрипционные факторы не стимулируют транскрипцию молекул адгезии, связывающих нейтрофилы (рис. 5-1, 5-7).

Каков биологический смысл воспалительных реакций, индуцируемых разными классами окисленных липидов? Возможно, что окисленные липиды воспринимаются клеткой как сигнал опасности, что вызывает стресс-ответ: активацию MAP киназ (рис. 5-4, 5-11, 5-15), повышение кальция (рис. 5-19), активацию определенных транскрипционных факторов (рис. 5-16, 5-19) и в конечном итоге появление на мембране молекул адгезии для моноцитов (рис. 5-1, 5-6), что служит сигналом неблагополучия и ведет к началу моноцитарного асептического воспаления.

Заключение: липопротеиды и регуляторные системы клеток крови и сосудистой стенки в норме и патологии

Нарушения липидного обмена часто сопровождаются системным нарушением регуляции тонуса сосудов и повышением . активности тромбоцитов. Эти умеренные по клинической выраженности симптомы привлекают меньше внимания исследователей в связи с повышенным интересом к механизмам локального развития атеросклеротической бляшки, с клинической точки зрения являющегося доминирующим последствием дислипидемии. Нарушение функциональной активности сосудистой стенки и тромбоцитов не связано со структурно-морфологическими изменениями, подобными развитию суживающей просвет сосуда атеромы. В отличие от этого, патологическое действие липопротеидов опосредуется их способностью вмешиваться в нормальные процессы регуляции сосудистого тонуса и активности тромбоцитов. Важно подчеркнуть, что патологические проявления гиперреактивности тромбоцитов и дисфункции эндотелия неотъемлемо связаны с атерогенезом и являются важными патогенетическими звеньями в развитии как ранних стадий атеросклероза, так и его острых тромботических осложнений.

Имеющаяся на сегодняшний день информация убедительно указывает на существование ассоциации между нарушениями липидного обмена и гипертонической болезнью. В основе этой ассоциации могут лежать общие механизмы, способствующие развитию как гипертензии, так и дислипидемии, например инсулинрезистентность. Однако возможность вызывать изменения уровня давления или эндотелиальную дисфункцию манипулируя уровнем липидов генетическими или диетическими способами свидетельствует о прямой связи нарушений липидного обмена и сосудистого тонуса. Можно предположить, что в ряде случаев дислипидемия является не независимым сопутствующим фактором, но причиной развития эндотелиальной дисфункции и гипертензии.

Анализ имеющихся данных позволяет предположить, что в основе вызванного ЛП нарушения функциональной активности клеток лежат два основных механизма. Первый механизм заключается в нарушении нормальных процессов регуляции за счет изменения липидного состава мембран, токсического действия продуктов окисления ЛП и аналогичных рецепторнезависимых эффектов, приводящих к инактивации сигнал

205 передающих каскадов, ферментов или вторичных посредников. Примером такого рода эффектов может служить инактивация N0 под действием образующихся при окислении ЛП активных форм кислорода. Вторая группа эффектов, напротив, связана с активацией сигнальных процессов за счет непосредственного стимулирующего действия ЛП. В частности, наши данные указывают на активирующее действие ЛП в отношении тромбоцитов и ГМК. Активация тромбоцитов и ГМК под действием ЛП обладает многими признаками рецептор-опосредованного процесса: она развивается быстро и

94обратимо, по кинетике напоминает эффекты Са -мобилизующих гормонов и регулируется различными фармакологическими препаратами так же, как действие гормонов. По-видимому, в основе этих эффектов лежит взаимодействие ЛП с рецепторами, расположенными на поверхности клеток, в связи с чем их можно охарактеризовать как «сигнальные» или «гормоноподобные». Избыточная активация таких рецепторов повышенными концентрациями ЛП приводит к накоплению вторичных мессенджеров, усилению экспрессии рецепторов для других агонистов и, в конечном итоге, к стимуляции функциональных ответов тромбоцитов и клеток сосудистой стенки.

Разнообразие типов клеток, подверженных гормоноподобному действию ЛП, а также многообразие эффектов ЛП позволяет предположить, что они опосредуются несколькими типами липопротеидных рецепторов, взаимодействующих с разными компонентами ЛП частиц, что находит убедительное экспериментальное подтверждение. Нам удалось исключить участие классического ano В,Е (ЛНП)-рецептора и некоторых других липопротеидных рецепторов, присутствующих на тромбоцитах и ГМК, однако мы обнаружили новые участки связывания ЛНП, экспрессированные в больших количествах на ГМК, которые по своим характеристикам соответствуют предполагаемым «сигнальным» рецепторами ЛП. Более того, мы идентифицировали один из ЛНП-связывающих белков ГМК как Т-кадгерин - атипичный член семейства молекул межклеточной адгезии, функция которого, по-видимому, заключается не в образовании прочных

206 межклеточных связей, но в передаче информации об окружающей клетку среде. Таким образом, отдельные сигнальные эфекты ЛП могут опосредоваться рецепторами клеточной адгезии, что не исключает участия классических эндоцитозных рецепторов, а также семидоменных рецепторов гормонального типа. Спектр рецепторов, опосредующих сигнальные эффекты ЛП, по-видимому, может расширяться при их окислении. При этом происходит как взаимодействие целых частиц с дополнительными скевенджер-рецепторами, так и образование биологически активных окисленных липидов, таких как лизофосфатидная кислота и липиды, подобные фактору активации тромбоцитов, которые, в свою очередь, взаимодействуют с индивидуальными в белок-связанными рецепторами.

Литературные данные и представленные в настоящей работе результаты указывают на существование дополнительного механизма, посредством которого ЛП могут воздействовать на сигнальные системы клетки. Этот механизм заключается в активирующем действии липидных компонентов ЛП, и в частности продуктов окисления разных классов липидов. Возможно, что эти вещества взаимодействуют с рецепторами, продолжая оставаться в составе ЛП-частицы, подобно тому, как окисленные фосфолипиды направляют взаимодействие окЛНП со скевенджер-рецептором СБ36 [Рос1гег, 2002а]. С другой стороны, представляется вероятным, что некоторые липиды выходят за пределы ЛП частицы, диффундируют в водной среде и связываются с определенными рецепторами, подобно действию простагландинов, фактора активации тромбоцитов и других медиаторов липидной природы.

Помимо общей клеточной активации, окЛНП и их липидные компоненты способны вызывать воспалительные реакции. Мы обнаружили, что такие разные по строению классы неферментативно окисленных липидов как изопростаны, окисленные эфиры холестерина и окисленные фосфолипиды - способны вызывать сходный эффект - стимулировать адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам, что является инициирующим звеном в запуске моноцитарного воспаления, характерного для атеросклероза. Ряд данных показывает, что это действие не связано с образованием свободных радикалов, поскольку аналогичным провоспалительным действием характеризуются определенные виды окисленных фосфолипидов, такие как PGPC, которые не содержат свободных радикалов или других группировок, способных поддерживать классическую цепную реакцию перекисного окисления липидов.

Каков биологический смысл воспалительных реакций, индуцируемых разными классами окисленных липидов? Возможно, что окисленные липиды воспринимаются клеткой как сигнал опасности, что вызывает стресс-ответ: активацию MAP киназ, повышение кальция, активацию определенных транскрипционных факторов и в конечном итоге появление на мембране молекул адгезии для лейкоцитов, что служит сигналом неблагополучия и ведет к адгезии моноцитов и началу моноцитарного асептического воспаления.

Более того, еще одним сигналом неблагополучия в ответ на действие окисленных фосфолипидов является индукция тканевого фактора свертывания. Этот эффект иллюстрирует тесную связь между воспалением и тромбозом, а также то, что в их основе лежат сходные внутриклеточные сигнально-транскрипционные механизмы. Хотя основным механизмом индукции воспалительных молекул адгезии и тканевого фактора на эндотелии служит NFicB-путь, наши данные ясно показывают, что вызванные окисленными липидами эффекты не связаны с этим транскрипционным механизмом. Вместо этого действие окисленных липидов опосредуется другими транскрипционными механизмами, в частности, транскрипционными факторами Egr-1 и NFAT. Очевидна биологическая целесообразность такого транскрипционного механизма: мобилизовать тканевые защитные системы, но сдержать развитие нейтрофильного острого воспаления, которое в условиях асептической реакции приведет к неоправданному повреждению ткани активными формами кислорода и протеолитическими ферментами, секретируемыми нейтрофилами.

По-видимому, гормоноподобные эффекты ЛП не являются патологическими в своей основе. Эксперименты, проведенные на изолированных сосудах, тромбоцитах и культуре клеток сосудистой стенки позволяют предположить, что сигнальные эффекты ЛП постоянно проявляются в норме, при нормальном уровне липидов и отсутствии атеросклероза. Таким образом, гормоноподобиое действие ЛП принципиально отличается от эффектов тех гормонов, концентрация которых подвержена постоянным вариациям, но сходно с действием других, постоянно присутствующих в тканях-мишенях и оказывающих свое биологическое действие. Другими словами, сигнальные системы клеток крови и сосудистой стенки находятся под постоянным воздействием ЛП, которые, по-видимому, участвуют в формировании базального тонуса сосудов и активности тромбоцитов.

На отсутствие однозначной связи между сигнальными эффектами ЛП и развитием патологии указывает и тот факт, что ЛНП и ЛВП часто оказывают сходное действие на системы вторичных посредников, несмотря на характерную для них противоположную роль в развитии сосудистых заболеваний. Таким образом, подобно действию подавляющего большинства эндогенных биологически активных веществ, способность ЛП активировать внутриклеточные сигнальные системы с точки зрения патологии не является однозначно положительной или негативной. Суммарный эффект определяется функциональным состоянием сосуда. Подобное действие характерно, например, для ацетилхолина: в присутствии здорового эндотелия этот гормон вызывает расслабление сосудов, а при поврежденном эндотелии - сокращение сосудов и вазоспазм. Кроме того, несомненно, что патогенность того или иного класса ЛП определяется не только их способностью вызывать сигнальные эффекты, но и ролью в транспорте липидов, наличием антиоксидантных ферментов и другими факторами.

В заключение можно сказать, что одним из механизмов развития патологических процессов, наблюдаемых при дислипидемии, является вмешательство ЛП в нормальные процессы регуляции сосудистого

209 гомеостаза. При дислипидемиях в результате нарушения количественного или качественного состава ЛП эти частицы выступают в качестве «молекулярных саботажников», выводя из строя отдельные сигнал-передающие системы в клетках крови и сосудистой стенки. Одновременно ЛП проводят «дезинформацию», вызывая активацию систем вторичных посредников там и тогда, где и когда эта активация в норме отсутствует или вредна, что в целом приводит к развитию дисбаланса регуляторных систем и сбою нормального функционирования клеток и тканей. За последние годы достигнут значительный прогресс в понимании механизмов этих эффектов, что позволяет надеяться на создание подходов для их фармакологической модуляции и открывает новые перспективы для профилактики и лечения артериальной гипертензии, тромбозов и атеросклероза.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бочков, Валерий Николаевич, Москва

1. Белова ЛА, Оглоблина ОГ, Белов АА, Кухарчук ВВ.

2. Процессы модификации липопротеидов. Физиологическая и патогенетическая роль модифицированных липопротеидов. Вопр. Мед. Химии 2000. 46:8-21.

3. Вызова ТВ, Власик ТН, Мазуров АВ. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1994 10, 402-405

4. Власова ИИ, Вахрушева ТВ, Азизова ОА, Лопухин ЮМ.

5. Эффект окисленных липопротеидов низкой плотности на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в плазме. Вопр. Мед. Химии 1998 44, 43-54

6. Ланкин ВЗ, Коновалова ГГ, Тихазе АК, Нежданова ИБ, Олферьев АМ, Кухарчук ВВ.

7. Окисление липопротеидов низкой плотности у пациентов с различными формами гиперхолестеринемии. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2003 136, 42-45.

8. Мешков АН, Стамбольский ДВ, Никитина ЛА, Абдуллаев СМ, Бочков ВН, Ткачук ВА, Кухарчук ВВ, Малышев ПП.

9. Генетические факторы риска развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией. Кардиология 2005 45:10-14.

10. Малышев ПП, Шаклунова ОА, Кухарчук ВВ.

11. Клинические проявления гомозиготной семейнойгиперхолестеринемии.1. Кардиология2002 42:30-33.

12. Чазов ЕИ, Меньшиков МЮ, Ткачук ВА.

13. Нарушение рецепции гормонов и внутриклеточной сигнализации при гипертензии.

14. Усп. Физиол. Наук 2000 31:3-17.8. Чазов ЕИ, Панченко ЕП.

15. Антитромботическая терапия при остром коронарном синдроме. Тер. Архив 2000 72:65-75.

16. Явелов ИС, Грацианский НА.

17. Регистр острых коронарных синдромов в России. Кардиология 2004 44:4-13.

18. Ambler SIC, Poenie M, Tsien RY, Taylor P.

19. Agonist-stimulated oscillations and cycling of intracellular free calcium in individual cultured muscle cells. J Biol Chem. 1988 Feb 5;263(4):1952-9.

20. Armesilla AL, Lorenzo E, Gomez DA, Martinez-Martinez S, Alfranca A, Redondo JM.

21. Vascular endothelial growth factor activates nuclear factor of activated T cells in human endothelial cells: a role for tissue factor expression. Mol Cell Biol 1999 19, 2032-2043.12. Anderson RG.

22. Dissecting clathrin-coated pits. Trends Cell Biol. 1993 Jun;3(6): 177-9.

23. Andrews HE, Aitken JW, Hassall DG, Skinner VO, Bruckdorfer KR.1.tracellular mechanisms in the activation of human platelets by low-density lipoproteins.

24. Biochem J. 1987 Mar l;242(2):559-64.

25. Armesilla AL, Lorenzo E, Gomez del Arco P, Martinez-Martinez S, Alfranca A, Redondo JM.

26. Vascular endothelial growth factor activates nuclear factor of activated T cells in human endothelial cells: a role for tissue factor gene expression. Mol Cell Biol. 1999 Mar; 19(3):2032-43.

27. Arroyo A, Modriansky M, Serinkan FB, Bello RI, Matsura T, Jiang J, Tyurin VA, Tyurina YY, Fadeel B, Kagan VE.

28. NADPH oxidase-dependent oxidation and externalization of phosphatidylserine during apoptosis in Me2SO-differentiated HL-60 cells. Role in phagocytic clearance. J Biol Chem. 2002 Dec 20;277(51):49965-75.

29. Austin MA, Flutter CM, Zimmern RL, Humphries SE.

30. Familial hypercholesterolemia and coronary heart disease: a HuGE association review.

31. Am J Epidemiol. 2004 Sep l;160(5):421-9.

32. Avdonin PV, Cheglakov IB, Tkachuk VA.

33. Stimulation of non-selective cation channels providing Ca2+ influx into platelets by platelet-activating factor and other aggregation inducers. Eur J Biochem. 1991 May 23; 198(1 ):267-73.18.Aviram M, Brook JG.

34. Platelet activation by plasma lipoproteins. Prog Cardiovasc Dis. 1987 Jul-Aug;30(l):61-72

35. Aviram M, Brook JG, Lees AM, Lees RS.1.w density lipoprotein binding to human platelets: role of charge and of specific amino acids.

36. Biochem Biophys Res Commun. 1981 Mar 16;99(1):308-18.

37. Badimon JJ, Badimon L, Turitto VT, Fuster V.

38. Platelet deposition at high shear rates is enhanced by high plasma cholesterol levels. In vivo study in the rabbit model. Arterioscler Thromb. 1991 Mar-Apr; 11(2):395-402.

39. Battey FD, Gafvels ME, FitzGerald DJ, Argraves WS, Chappell DA, Strauss JF 3rd, Strickland DK.

40. The 39-kDa receptor-associated protein regulates ligand binding by the very low density lipoprotein receptor. J Biol Chem. 1994 Sep 16;269(37):23268-73.

41. Berliner JA, Subbanagounder G, Leitinger N, Watson AD, Vora D. Evidence for a role of phospholipid oxidation products in atherogenesis. Trends Cardiovasc Med. 2001 Apr-May; 11(3-4): 142-7.

42. Berliner JA, Territo MC, Sevanian A, Ramin S, Kim JA Bamshad B, Esterson M, Fogelman AM. Minimally modified low density lipoprotein stimulates monocyte endothelial interaction.

43. J Clin Invest 1990 85, 1260-1266

44. Berridge MJ. Calcium oscillations.

45. J Biol Chem. 1990 Jun 15;265(17):9583-6.165, 9583-9586

46. Billah MM, Lapetina EG, Cuatrecasas P.

47. Phosphatidylinositol-specific phospholipase-C of platelets: association with 1,2-diacyglycerol-kinase and inhibition by cyclic-AMP. Biochem Biophys Res Commun. 1979 Sep 12;90(l):92-8.

48. Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM. Receptor-effector coupling by G proteins.

49. Blair A, Shaul PW, Yuhanna IS, Conrad PA, Smart EJ.

50. Oxidized low density lipoprotein displaces endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) from plasmalemmal caveolae and impairs eNOS activation. J Biol Chem. 1999 Nov 5;274(45):32512-9.

51. Bochkov VN, Kuzmenko ES, Rezink T, Tkachuk VA.

52. Hormone-like action of blood plasma lipoproteins on human platelets and smooth vascular muscle cells. Biokhimiia. 1994 Jul;59(7):958-66.3 l.Bochkov VN, Matchin YG, Fuki IV, Lyakishev AA, Tkachuk VA.

53. Platelets in patients with homozygous familial hypercholesterolemia are sensitive to Ca(2+)-mobilizing activity of low density lipoproteins. Atherosclerosis. 1992 Oct;96(2-3):l 19-24.

54. Bochkov VN, Mechtcheriakova D, Lucerna M, Huber J, Malli R, Graier WF, Plofer E, Binder BR, Leitinger N.

55. Oxidized phospholipids stimulate tissue factor expression in human endothelial cells via activation of ERK/EGR-1 and Ca(++)/NFAT. Blood. 2002 Jan 1;99(1): 199-206.

56. Bochkov VN, Rozhlcova TA, Matchin YuG, Lyakishev AA, Bochkova NA, Borisova YuL, Kukharchuk VV, Tlcachuk VA.

57. L- and agonist-induced Ca(2+)-mobilization in platelets of healthy subjects and in patients with familial hyperlipoproteinemia type II. ThrombRes. 1991 Feb 15;61(4):403-9.

58. Bochkov VN, Sorokin EV, Byzova TV, Mazurov AV, Little P, Bobik A, Tkachuk VA.

59. Do glycoproteins Ilb/IIIa participate in activation of human platelet s by lowdensity lipoproteins?

60. Biokhimiia. 1995 Aug;60(8):l 187-94.

61. Bochkov V, Tkachuk V, Buhler F, Resink T.

62. Phosphoinositide and calcium signalling responses in smooth muscle cells: comparison between lipoproteins, Ang II, and PDGF. Biochem Biophys Res Commun. 1992 Nov 16; 188(3): 1295-304.

63. Bochkov VN, Tkachuk VA, Halin AW, Bernhardt J, Buhler FR, Resink TJ. Concerted effects of lipoproteins and angiotensin II on signal transduction processes in vascular smooth muscle cells.

64. Arterioscler Thromb. 1993 Sep;13(9):1261-9.

65. Bochkov VN, Tkachuk VA, ICuzmenko YS, Borisova YL, Buhler FR, Resink TJ.

66. Characteristics of low and high density lipoprotein binding and lipoprotein-induced signaling in quiescent human vascular smooth muscle cells. Mol Pharmacol. 1994 Feb;45(2):262-70.

67. Bochkov VN, Voino-Yasenetskaya TA, Tkachuk VA.

68. Epinephrine potentiates activation of human platelets by low density lipoproteins.

69. Biochim Biophys Acta. 1991 Sep 23;1097(2):123-7.

70. Bohuslav J, Horejsi V, Hansmann C, Stockl J, Weidle UH, Majdic O, Bartke 1,- Knapp W, Stockinger FI.

71. Urokinase plasminogen activator receptor, beta 2-integrins, and Src-kinases within a single receptor complex of human monocytes. J Exp Med. 1995 Apr l;181(4):1381-90.

72. Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF.

73. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 1998 Aug 27;394(6696):894-7.

74. Brown MS, Basu SIC, Falck JR, Ho YIC, Goldstein JL.

75. The scavenger cell pathway for lipoprotein degradation: specificity of the binding site that mediates the uptake of negatively-charged LDL by macrophages.

76. J Supramol Struct. 1980; 13(l):67-81.42.Brown MS, Goldstein JL.

77. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 1997 May 2;89(3):331-40.

78. Camejo G, Olofsson SO, Lopez F, Carlsson P, Bondjers G. Identification of Apo B-100 segments mediating the interaction of low density lipoproteins with arterial proteoglycans.

79. Arteriosclerosis. 1988 Jul-Aug;8(4):368-77.

80. Carlos TM, Harlan JM. Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood. 1994 Oct 1;84(7):2068-101.45.Carmeliet P.

81. Proteinases in cardiovascular aneurysms and rupture: targets for therapy? J Clin Invest. 2000 Jun; 105(11): 1519-20.

82. Carr AC, McCall MR, Frei B.

83. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000 Jul;20(7): 1716-23.

84. Chang MK, Bergmark C, Laurila A, Horkko S, Han KH, Friedman P, Dennis EA, Witztum JL.

85. Chang MK, Binder CJ, Torzewski M, Witztum JL.

86. C-reactive protein binds to both oxidized LDL and apoptotic cells through recognition of a common ligand: Phosphorylcholine of oxidized phospholipids.

87. Proc Natl Acad Sei USA. 2002 Oct 1 ;99(20): 13043-8.

88. Chappell DA, Fry GL, Waknitz MA, Iverius PH, Williams SE, Strickland DK.

89. The low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor binds and mediates catabolism of bovine milk lipoprotein lipase. J Biol Chem. 1992 Dec 25;267(36):25764-7.

90. Chen JK, Hoshi Ii, McClure DB, McKeehan WL.

91. Role of lipoproteins in growth of human adult arterial endothelial and smooth muscle cells in low lipoprotein-deficient serum. J Cell Physiol. 1986 Nov; 129(2):207-14.51 .Chisolm GM 3rd.

92. Antioxidants and atherosclerosis: a current assessment. Clin Cardiol. 1991 Feb; 14(2 Suppl l):I25-30.

93. Clinton SK, Underwood R, Hayes L, Sherman ML, Kufe DW, Libby P. Macrophage colony-stimulating factor gene expression in vascular cells and in experimental and human atherosclerosis.

94. Am J Pathol. 1992 Feb;140(2):301-16.53.CockerillGW, ReedS.

95. High-density lipoprotein: multipotent effects on cells of the vasculature. IntRev Cytol. 1999;188:257-97.

96. Coleman LG Jr, Polanowska-Grabowska RK, Marcinkiewicz M, Gear AR.

97. L oxidized by hypochlorous acid causes irreversible platelet aggregation when combined with low levels of ADP, thrombin, epinephrine, or macrophage-derived chemolcine (CCL22). Blood. 2004 Jul 15;104(2):380-9.

98. Colles SM, Maxson JM, Carlson SG, Chisolm GM.

99. Oxidized LDL-induced injury and apoptosis in atherosclerosis. Potential roles for oxysterols.

100. Trends Cardiovasc Med. 2001 Apr-May; 11(3-4): 131-8.56.Conrad GW, Rink TJ.

101. Platelet activating factor rises intracellular calcium ion concentration in macrophages.

102. J Cell Biol (1986) 103, 439-450

103. Cushing SD, Berliner JA, Yalente AJ, Territo MC, Navab M, Parhami F, Gerrity R, Schwartz CJ, Fogelman AM.

104. Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sei USA. 1990 Jul;87(13):5134-8.

105. Cyrus T, Pratico D, Zhao L, Witztum JL, Rader DJ, Rolcach J, FitzGerald GA, Funk CD.

106. Absence of 12/15-lipoxygenase expression decreases lipid peroxidation and atherogenesis in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 2001 May 8;103(18):2277-82.

107. Daniel TO, Schneider WJ, Goldstein JL, Brown MS. Visualization of lipoprotein receptors by ligand blotting. J Biol Chem. 1983 Apr 10;258(7):4606-11.

108. Genetics of lipoprotein disorders.

109. Endocrinol Metab Clin North Am. 1998 Sep;27(3):521-50.

110. Deeg MA, Bowen RF, Oram JF, Bierman EL.

111. High density lipoproteins stimulate mitogen-activated protein kinases in human skin fibroblasts.

112. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997 Sep; 17(9): 1667-74.63 .De Martin R, Iioeth M, Hofer-Warbinek R, Schmid JA.

113. The transcription factor NF-kappa B and the regulation of vascular cell function.

114. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000 Nov;20(l l):E83-8.

115. Diet F, Pratt RE, Berry GJ, Momose N, Gibbons GH, Dzau VJ. Increased accumulation of tissue ACE in human atherosclerotic coronary artery disease.

116. Circulation. 1996 Dec 1;94(11):2756-67.

117. Eaton CB, Feldman HA, Assaf AR, McPhillips JB, Hume AL, Lasater TM, Levinson P, Carleton RA.

118. Prevalence of hypertension, dyslipidemia, and dyslipidemic hypertension. J Fam Pract. 1994 Jan;38(l): 17-23.66.Exton JH.

119. Mechanisms of action of calcium-mobilizing agonists: some variations on a young theme.

120. FASEB J. 1988 Aug;2(l l):2670-6.

121. Febbraio M, Poclrez EA, Smith JD, Iiajjar DP, Hazen SL, Hoff HF, Sharma K, Silverstein RL.

122. Targeted disruption of the class B scavenger receptor CD36 protects against atherosclerotic lesion development in mice. J Clin Invest. 2000 Apr; 105(8): 1049-56.68.FetkovskaN.

123. Platelet activation by low-density lipoprotein and serotonin: effects of calcium antagonists.

124. J Cardiovasc Pharmacol. 1992;19 Suppl 3:S25-8.

125. Fischer-Dzoga K, Fraser R, Wissler RW.

126. Stimulation of proliferation in stationary primary cultures of monkey and rabbit aortic smooth muscle cells. I. Effects of lipoprotein fractions of hyperlipemic serum and lymph.

127. Flanagan WM, Corthesy B, Bram RJ, Crabtree GR.

128. Nuclear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and cyclosporin A.

129. Nature. 1991 Aug 29;352(6338):803-7.

130. Fogelman AM, Shechter I, Seager J, Hokom M, Child JS, Edwards PA. Malondialdehyde alteration of low density lipoproteins leads to cholesteryl ester accumulation in human monocyte-macrophages.

131. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Apr;77(4):2214-8.

132. Fukunaga M, Yura T, Grygorczyk R, Badr KF.

133. Evidence for the distinct nature of F2~isoprostane receptors from those of thromboxane A2.

134. Am J Physiol. 1997 Apr;272(4 Pt 2):F477-83.

135. Galle J, Heinloth A, Wanner C, Heermeier K.

136. Dual effect of oxidized LDL on cell cycle in human endothelial cellsthrough oxidative stress.

137. Kidney Int Suppl. 2001 Feb;78:S120-3.74.Genest J.1.poprotein disorders and cardiovascular risk. J Inherit Metab Dis. 2003;26(2-3):267-87.

138. Genest J Jr, Marcil M, Denis M, Yu L.

139. High density lipoproteins in health and in disease. J Investig Med. 1999 Jan;47(l):31-42.

140. George J, Afek A, Shaish A, Levkovitz PI, Bloom N, Cyrus T, Zhao L, Funic CD, Sigal E, I-Iarats D.12/15-Lipoxygenase gene disruption attenuates atherogenesis in LDLreceptor-deficient mice.

141. Circulation. 2001 Oct 2;104(14):1646-50.

142. Gilligan DM, Guetta V, Panza JA, Garcia CE, Quyyumi AA, Cannon RO 3rd.

143. Selective loss of microvascular endothelial function in humanhypercholesterolemia.

144. Circulation. 1994 Jul;90(l):35-41.

145. Gimbrone MA Jr, Cybulsky MI, Kume N, Collins T, Resnick N.

146. Vascular endothelium. An integrator of pathophysiological stimuli in atherogenesis.

147. Ann N Y Acad Sei. 1995 Jan 17;748:122-31; discussion 131-2.

148. Gniwotta C, Morrow JD, Roberts LJ 2nd, Kuhn H.

149. Prostaglandin F2-like compounds, F2-isoprostanes, are present in increasedamounts in human atherosclerotic lesions.

150. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997 Nov;17(l 1):3236-41.

151. Goldstein JL, Basu SIC, Brown MS.

152. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol. 1983;98:241-60.81 .Goldstein JL, Basu SIC, Brunschede GY, Brown MS.

153. Release of low density lipoprotein from its cell surface receptor by sulphatedglycosaminoglycans.

154. Cell. 1976 Jan;7(l):85-95.82.Goldstein JL, Brown MS.

155. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis. Annu Rev Biochem. 1977;46:897-930.

156. Goldstein JL, Ho YK, Basu SIC, Brown MS.

157. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.

158. Proc Natl Acad Sei U S A. 1979 Jan;76(l):333-7.

159. Goldstein JL, Hobbs ITH, Brown MS.

160. Familial hypercholesterolemia. In: Scriver CR, Sly WS, Childs B, et al, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. New York, NY: McGraw-Hill Companies, Inc, 2001:2863-914.

161. Gonzalez-Timon B, Gonzalez-Munoz M, Zaragoza C, Lamas S, Melian EM. Native and oxidized low density lipoproteins oppositely modulate the effects of insulin-like growth factor I on VSMC.

162. Cardiovasc Res. 2004 Feb l;61(2):247-55.

163. Gouni-Berthold I, Berthold IiK, Weber AA, Ko Y, Seul C, Vetter H, Sachinidis A.

164. Troglitazone and rosiglitazone induce apoptosis of vascular smooth muscle cells through an extracellular signal-regulated kinase-independent pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2001 Feb;363(2):215-21.

165. Grewal T, de Diego I, Kirchhoff MF, Tebar F, Heeren J, Rinninger F, Enrich C.

166. High density lipoprotein-induced signaling of the MAPK pathway involves scavenger receptor type Bl-mediated activation of Ras. J Biol Chem. 2003 May 9;278(19): 16478-81.

167. Gryglewski RJ, Palmer RM, Moncada S.

168. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelium-derivedvascular relaxing factor.

169. Nature. 1986 Apr 3-9;320(6061):454-6.

170. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY.

171. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.

172. J Biol Chem. 1985 Mar 25;260(6):3440-50.

173. Gu L, Okada Y, Clinton SIC, Gerard C, Sukhova GIC, Libby P, Rollins BJ. Absence of monocyte chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-deficient mice.

174. Mol Cell. 1998 Aug;2(2):275-81.

175. Gupta S, Pablo AM, Jiang X, Wang N, Tall AR, Schindler C. IFN-gamma potentiates atherosclerosis in ApoE knock-out mice. J Clin Invest-1997 Jun 1;99(11):2752-61.92.Gutkind JS.

176. Cell growth control by G protein-coupled receptors: from signaltransduction to signal integration.

177. Oncogene. 1998 Sep 17;17(11 Reviews): 1331-42.

178. Haberland ME, Fong D, Cheng L.

179. Malondialdehyde-altered protein occurs in atheroma of Watanabe heritablehyperlipidemic rabbits.

180. Science. 1988 Jul 8;241(4862):215-8.;

181. Hackeng CM, Huigsloot M, Pladet MW, Nieuwenhuis HK, van Rijn HJ, Akkerman JW.1.w-density lipoprotein enhances platelet secretion via integrinalphallbbeta3-mediated signaling.

182. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999 Feb; 19(2):239-47.

183. ITackeng CM, Relou IA, Pladet MW, Gorter G, van Rijn HJ, Akkerman JW. 96.Early platelet activation by low density lipoprotein via p38MAP kinase. Thromb Haemost. 1999 Dec;82(6):l749-56.

184. Hansen PS, Defesche JC, ICastelein JJ, Gerdes LU, Fraza L, Gerdes C, Tato F, Jensen HK, Jensen LG, Klausen IC, Faergeman O, Schuster H.

185. Phenotypic variation in patients heterozygous for familial defective apolipoprotein B (FDB) in three European countries. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997 Apr; 17(4):741-7.98.Harlow Lane Antibodies99.Harrison DG.

186. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. J Clin Invest. 1997 Nov l;100(9):2153-7.

187. Harrison SC, Kirchhausen T. Clathrin, cages, and coated vesicles. Cell. 1983 Jul;33(3):650-2.

188. Hartwich J, Dembinska-Kiec A, Gruca A, Motyka M, Partyka L, Skrzeczynska J, Bzowska M, Pryjma J, Huber J, Leitinger N, Schmitz G. Regulation of platelet adhesion by oxidized lipoproteins and oxidized phospholipids.

189. Platelets. 2002 May;13(3):141-51.102. Havel RJ, Kane JP.

190. Structure and metabolism of plasma lipoproteins. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Bases of inherited Disease, 7th edn. (1995) New York; McGraw-Hill, 1841-1851. '

191. Heinecke JW, Rosen LI, Chait A.1.on and copper promote modification of low density lipoprotein by human arterial smooth muscle cells in culture. J Clin Invest. 1984 Nov;74(5): 1890-4.

192. Henriksen T, Mahoney EM, Steinberg D.

193. Hess P, Lansman JB, Tsien RW.

194. Different modes of Ca channel gating behaviour favoured by dihydropyridine Ca agonists and antagonists. Nature. 1984 Oct 11-17;311(5986):538-44.

195. Hessler JR, Robertson AL Jr, Chisolm GM 3rd.

196. L-induced cytotoxicity and its inhibition by HDL in human • vascular smooth muscle and endothelial cells in culture. Atherosclerosis. 1979 Mar;32(3):213-29.

197. Flolland JA, Ziegler LM, Meyer JW.

198. Atherogenic levels of low-density lipoprotein increase hydrogen peroxide generation in cultured human endothelial cells: possible mechanism of heightened endocytosis. J Cell Physiol. 1996 Jan; 166(1): 144-51.110. HoppTP.

199. Retrospective: 12 years of antigenic determinant predictions, and more. PeptRes. 1993 Jul-Aug;6(4): 183-90.

200. Hoppe G, Ravandi A, HerreraD, Kuksis A, HoffHF.

201. Oxidation products of cholesteryl linoleate are resistant to hydrolysis in macrophages, form complexes with proteins, and are present in human atherosclerotic lesions. J Lipid Res. 1997 Jul;38(7): 1347-60.

202. Horkko S, Binder CJ, Shaw PX, Chang MIC, Silverman G, Palinski W, Witztum JL.1.munological responses to oxidized LDL. Free Radic Biol Med. 2000 Jun 15;28(12):1771-9.

203. Huber J, Vales A, Mitulovic G, Blumer M, Schmid R, Witztum JL, Binder BR, Leitinger N.

204. Oxidized membrane vesicles and blebs from apoptotic cells contain biologically active oxidized phospholipids that induce monocyte-endothelial interactions.

205. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002 Jan;22(l):101-7.

206. Hui DY, Harmony JA, Innerarity TL, Mahley RW. Immunoregulatory plasma lipoproteins. Role of apoprotein E and apoprotein B.

207. J Biol Chem. 1980 Dec 25;255(24):11775-81.115.1-Iulme EC, ed.

208. Receptor-Ligand Interactions. A practical Approach. IRL Press, Oxford, UK (1992)

209. Innerarity TL, Pitas RE, Mahley RW. Lipoprotein-receptor interactions. Methods Enzymol. 1986;129:542-65.

210. Ishii Ii, Tezuka T, Ishikawa H, Takada K, Oida K, Horie S.

211. Ishikawa K, Navab M, Leitinger N, Fogelman AM, Lusis AJ. Induction of heme oxygenase-1 inhibits the monocyte transmigration induced by mildly oxidized LDL.

212. J Clin Invest. 1997 Sep 1; 100(5): 1209-16.

213. Ishizuka T, Kawakami M, Hidaka T, Matsuki Y, Takamizawa M, Suzuki K, Kurita A, Nakamura EI.

214. Stimulation with thromboxane A2 (TXA2) receptor agonist enhances ICAM-1, VCAM-1 or ELAM-1 expression by human vascular endothelial cells.

215. Clin Exp Immunol. 1998 Jun;l 12(3):464-70.

216. Kadi A, Huber J, Gruber F, Bochkov VN, Binder BR, Leitinger N. Analysis of inflammatory gene induction by oxidized phospholipids in vivo by quantitative real-time RT-PCR in comparison with effects of LPS. Vascul Pharmacol. 2002 Apr;38(4):219-27.

217. Kagan VE, Gleiss B, Tyurina YY, Tyurin VA, Elenstrom-Magnusson C, Liu SX, Serinkan FB, Arroyo A, Chandra J, Orrenius S, Fadeel B.

218. A role for oxidative stress in apoptosis: oxidation and externalization of phosphatidylserine is required for macrophage clearance of cells undergoing Fas-mediated apoptosis. J Immunol. 2002 Jul l;169(l):487-99.

219. Kamido FI, Kuksis A, Marai L, Myher J J.1.pid ester-bound aldehydes among copper-catalyzed peroxidation products of human plasma lipoproteins. J Lipid Res. 1995 Sep;36(9): 1876-86.

220. Kawakami A, Tanaka A, Chiba T, Nakajima IC, Shimokado IC, Yoshida M. Remnant lipoprotein-induced smooth muscle cell proliferation involves epidermal growth factor receptor transactivation.

221. Circulation. 2003 Nov 25;108(21):2679-88.

222. ICehlenbach RPI, Dickmanns A, Gerace L.

223. Nucleocytoplasmic shuttling factors including Ran and CRM1 mediate nuclear export of NFAT in vitro. J Cell Biol 1998 141,863-874

224. Kelley JL, Rozek MM, Suenram CA, Schwartz CJ. Activation of human peripheral blood monocytes by lipoproteins. Am J Pathol. 1988 Feb; 130(2):223-31.

225. ICeulen ET, Voors-Pette C, de Bruin TW.

226. Familial dyslipidemic hypertension syndrome: familial combined hyperlipidemia, and the role of abdominal fat mass. Am J Hypertens. 2001 Apr; 14(4 Pt l):357-63. '127. Klimov AN, Nagornev VA.

227. Evolution of cholesterol concept of atherogenesis from Anichlcov to our days.

228. Pediatr Pathol Mol Med. 2002 21:307-320.

229. Knorr M, Locher R, Vogt E, Vetter W, Block LH, Ferracin F, Lefkovits H, Pletscher A.

230. Rapid activation of human platelets by low concentrations of low-density lipoprotein via phosphatidylinositol cycle. Eur J Biochem. 1988 Mar 15;172(3):753-9.

231. Kodama T, Reddy P, Kishimoto C, Krieger M.

232. Purification and characterization of a bovine acetyl low density lipoprotein receptor.

233. Proc Natl Acad Sei USA. 1988 Dec;85(23):9238-42.

234. Koller E, Koller F, Binder BR.

235. Purification and identification of the lipoprotein-binding proteins from human blood platelet membrane.J Biol Chem. 1989 Jul 25;264(21):12412-8.131. Koller E, Koller F.

236. Binding characteristics of homologous plasma lipoproteins to human platelets.

237. Methods Enzymol. 1992;215:383-98.

238. Koller E, Koller F, Doleschel W.

239. Specific binding sites on human blood platelets for plasma lipoproteins. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1982 Apr;363(4):395-405.

240. ICounnas MZ, Argraves WS, Strickland DIC.

241. The 39-kDa receptor-associated protein interacts with two members of the low density lipoprotein receptor family, alpha 2-macroglobulin receptor and glycoprotein 330.

242. J Biol Chem. 1992 Oct 15;267(29):21162-6.

243. Kronke G, Bochkov VN, Huber J, Gruber F, Bluml S, Fumkranz A, Kadi A, Binder BR, Leitinger N.

244. Oxidized phospholipids induce expression of human heme oxygenase-1 involving activation of cAMP-responsive element-binding protein. J Biol Chem. 2003 Dec 19;278(51):51006-14.

245. Kuhlmann CR, Schafer M, Li F, Sawamura T, Tillmanns FI, Waldecker B, Wiecha J.

246. Modulation of endothelial Ca(2+)-activated K(+) channels by oxidized LDL and its contribution to endothelial proliferation. Cardiovasc Res. 2003 Dec l;60(3):626-34.

247. Kuzmenko YS, Bochkov VN, Philippova MP, Tkachuk VA, Resink TJ. Characterization of an atypical lipoprotein-binding protein in human aortic media membranes by ligand blotting.

248. BiochemJ. 1994 Oct 1;303 (Pt l):281-7.137. Laemmli UK.

249. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

250. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

251. Laroia ST, Ganti AK, Laroia AT, Tendulkar KK.

252. Endothelium and vthe lipid metabolism: the current understanding. Int J Cardiol. 2003 Mar;88(l):l-9.139. Lee TS, Chau LY.

253. Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of interleukin-10 in mice.

254. Nat Med. 2002 Mar;8(3):240-6.

255. Lee LI, Shi W, Tontonoz P, Wang S, Subbanagounder G, Hedrick CC, Llama S, Borromeo C, Evans RM, Berliner JA, Nagy L.

256. Role for peroxisome proliferator-activated receptor alpha in oxidized phospholipid-induced synthesis of monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-8 by endothelial cells. Circ Res. 2000 Sep. 15;87(6):516-21.

257. Leitinger N, Tyner TR, Oslund L, Rizza C, Subbanagounder G, Lee H, Shih PT, Mackman N, Tigyi G, Territo MC, Berliner JA, Vora DIC. Structurally. similar oxidized phospholipids differentially regulate endothelial binding of monocytes and neutrophils.

258. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Oct 12;96(21): 12010-5.142. Li D, MehtaJL.3.hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors protect against oxidized low-density lipoprotein-induced endothelial dysfunction. Endothelium. 2003; 10(1): 17-21.

259. Li XA, Titlow WB, Jackson BA, Giltiay N, Nikolova-Karakashian M, Uittenbogaard A, Smart EJ.

260. High density lipoprotein binding to scavenger receptor, Class B, type I activates endothelial nitric-oxide synthase in a ceramide-dependent manner.

261. J Biol Chem. 2002 Mar 29;277(13):11058-63.

262. Li N, Venkatesan MI, Miguel A, Kaplan R, Gujuluva C, Alam J, Nel A.1.duction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.

263. J Immunol. 2000 Sep 15;165(6):3393-401.

264. Liao F, Berliner JA, Mehrabian M, Navab M, Demer LL, Lusis AJ, Fogelman AM.

265. Minimally modified low density lipoprotein is biologically active in vivo in mice.

266. J Clin Invest. 1991 Jun;87(6):2253-7.146. Libby P.1.flammation in atherosclerosis. Nature. 2002 Dec 19-26;420(6917):868-74.

267. Libby P, Miao P, Ordovas JM, Schaefer EJ.1.poproteins increase growth of mitogen-stimulatecl arterial smooth muscle cells.

268. J Cell Physiol. 1985 Jul; 124(1): 1-8.148. Linden J, Delahunty TM.

269. Receptors that inhibit phosphoinositide breakdown. Trends Pharmacol Sci. 1989 Mar; 10(3): 114-20.

270. Lisanti MP, Tang Z, Scherer PE, Sargiacomo M.

271. Caveolae purification and glycosylphosphatidylinositol-linked protein sorting in polarized epithelia. Methods Enzymol. 1995;250:655-68.

272. Lund H, Takahashi IC, flamilton RL, Havel RJ.1.poprotein binding and endosomal itinerary of the low density lipoproteinreceptor-related protein in rat liver.

273. Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Dec;86(23):9318-22.

274. Mach F, Sauty A, Iarossi AS, Sukhova GK, Neote K, Libby P, Luster AD. Differential expression of three T lymphocyte-activating CXC chemokines by human atheroma-associated cells.

275. J Clin Invest. 1999 Oct; 104(8): 1041 -50.

276. Maclntyre DE, McNicol A, Drummond AH.

277. Tumour-promoting phorbol esters inhibit agonist-induced phosphatidate formation and Ca2+ flux in human platelets. FEBS Lett. 1985 Jan 28; 180(2): 160-4153. Mackman N.

278. Regulation of the tissue factor gene. FASEB J. 1995 Jul;9(10):883-9.154. Mackman N.

279. Regulation of the tissue factor gene. Thromb Haemost. 1997 Jul;78(l):747-54.

280. Mahley RW, Innerarity TL, Pitas RE, Weisgraber KH, Brown JH, Gross E. Inhibition of lipoprotein binding to cell surface receptors of fibroblasts following selective modification of arginyl residues in arginine-rich and B apoproteins.

281. J Biol Chem. 1977 Oct 25;252(20):7279-87.

282. Marathe GK, Zimmerman GA, Prescott SM, Mclntyre TM. Activation of vascular cells by PAF-like lipids in oxidized LDL. Vascul Pharmacol. 2002 Apr;38(4): 193-200.

283. Mashima R, Onodera K, Yamamoto Y.

284. Regioisomeric distribution of cholesteryl linoleate hydroperoxides and hydroxides in plasma from healthy humans provides evidence for free radical-mediated lipid peroxidation in vivo. J Lipid Res. 2000 Jan;41(l):109-15.;

285. Matlib MA (1984) Methods Pharmacol 5, 12-24

286. Matot I, Manevich Y, Al-Mehdi AB, Song C, Fisher AB. Fluorescence imaging of lipid peroxidation in isolated rat lungs during nonhypoxic lung ischemia.

287. Free Radic Biol Med. 2003 Mar 15;34(6):785-90.

288. Mazurov AY, Preobrazhensky SN, Leytin VL, Repin YS, Smirnov VN. Study of low density lipoprotein interaction with platelets by flow cytofluorimetry.

289. FEBSLett. 1982 Jan 25; 137(2):319-22.

290. Mechtcheriakova D, Wlachos A, Holzmuller H, Binder BR, Hofer E. Vascular endothelial cell growth factor-induced tissue factor expression in endothelial cells is mediated by EGR-1.

291. Blood. 1999 Jun 1;93(11):3811-23.162. Mercurio F, Manning AM.

292. Multiple signals converging on NF-kappaB. Curr Opin Cell Biol. 1999 Apr; 11 (2):226-32.163. Miano JM, Berk BC.

293. NAB2: a transcriptional brake for activated gene expression in the vessel wall?

294. Am J Pathol. 1999 Oct; 155(4): 1009-12.

295. Mineo C, Yuhanna IS, Quon MJ, Shaul PW.

296. High density lipoprotein-induced endothelial nitric-oxide synthase activation is mediated by Akt and MAP kinases. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):9142-9.

297. Morel DW, DiCorleto PE, Chisolm GM.

298. Endothelial and smooth muscle cells alter low density lipoprotein in vitroby free radical oxidation.

299. Arteriosclerosis. 1984 Jul-Aug;4(4):357-64.;167. Morrow JD, Roberts LJ.

300. The isoprostanes: unique bioactive products of lipid peroxidation. Prog Lipid Res. 1997 Mar;36(1): 1-21.

301. Moulton ICS, Heller E, IConerding MA, Flynn E, Palinski W, Folkman J. Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovascularization and plaque growth in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 1999 Apr 6;99(13): 1726-32.

302. Murray I, Kohl J, Cianflone K.

303. Acylation-stimulating protein (ASP): structure-function determinants of cell surface binding and triacylglycerol synthetic activity. Biochem J. 1999 Aug 15;342 ( Pt l):41-8.

304. Nakamura T, Henson PM, Murphy RC.

305. Biochem Biophys Res Commun. 1986 Mar 28;135(3):1099-104.

306. Napoli C, D'Armiento FP, Mancini FP, Postiglione A, Witztum JL, Palumbo G, Palinski W.

307. Navab M, Ananthramaiah GM, Reddy ST, Van Lenten BJ, Ansell BJ, Fonarow GC, Vahabzadeh K, Hama S, Plough G, Kamranpour N, Berliner JA, Lusis AJ, Fogelman AM.

308. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 2004 Jun;45(6):993-1007.

309. Navab M, Imes SS, Plama SY, Hough GP, Ross LA, Boric RW, Valente A J, Berliner J A, Drinkwater DC, Laks H.

310. Monocyte transmigration induced by modification of low density lipoprotein in cocultures of human aortic wall cells is due to induction of monocyte chemotactic protein 1 synthesis and is abolished by high density lipoprotein.

311. J Clin Invest. 1991 Dec;88(6):2039-46.

312. J Clin Invest. 1991 May;87(5): 1763-72.

313. Nazih H, Devred D, Martin-Nizard F, Fruchart JC, Delbart C. Phosphatidylcholine breakdown in HDL3 stimulated platelets. Thromb Res. 1990 Sep 15;59(6):913-20.

314. Nazih H, Devred D, Martin-Nizard F, Clavey V, Fruchart JC, Delbart C. Pertussis toxin sensitive G-protein coupling of FIDL receptor to phospholipase C in human platelets.

315. Thromb Res. 1992 Sep l;67(5):559-67

316. Negre-Salvayre A, Fitoussi G, Reaud V, Pieraggi MT, Thiers JC, Salvayre R.

317. A delayed and sustained rise of cytosolic calcium is elicited by oxidized LDL in cultured bovine aortic endothelial cells. FEBS Lett. 1992 Mar 24;299(l):60-5.

318. Nelson MT, Patlak JB, Worley JF, Standen NB.

319. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone.

320. Am J Physiol. 1990 Jul;259(l Pt 1):C3-18.

321. Nickenig G, Baumer AT, Temur Y, Kebben D, Jockenhovel F, Böhm M. Statin-sensitive dysregulated ATI receptor function and density in hypercholesterolemic men.

322. Circulation. 1999 Nov 23; 100(21):2131-4.182. Nickenig G, Harrison DG.

323. The AT(l)-type angiotensin receptor in oxidative stress and atherogenesis: Part II: AT(1) receptor regulation. Circulation. 2002 Jan 29;105(4):530-6.

324. Nickenig G, Jung O, Strehlow IC, Zolle O, Linz W, Scholkens BA, Böhm M.

325. Hypercholesterolemia is associated with enhanced angiotensin AT1-receptor expression.

326. Am J Physiol. 1997 Jun;272(6 Pt 2):H2701-7.

327. Nickenig G, Sachinidis A, Michaelsen F, Böhm M, Seewald S, Vetter H. Upregulation of vascular angiotensin II receptor gene expression by low-density lipoprotein in vascular smooth muscle cells. Circulation. 1997 Jan 21;95(2):473-8.

328. Nofer JR, Junker R, Pulawski E, Fobker M, Levkau B, von Eckardstein A, Seedorf U, Assmann G, Walter M.

329. High density lipoproteins induce cell cycle entry in vascular smooth muscle cells via mitogen activated protein kinase-dependent pathway. Thromb Haemost. 2001 Apr;85(4):730-5.

330. Nofer JR, Kehrel B, Fobker M, Levkau B, Assmann G, von Eckardstein A. HDL and arteriosclerosis: beyond reverse cholesterol transport. Atherosclerosis. 2002 Mar;161(l):l-16.

331. Nofer JR, van der Giet M, Tolle M, Wolinska I, von Wnuck Lipinski K, Baba HA, Tietge UJ, Godecke A, Ishii I, Kleuser B, Schafers M, Fobker M, Zidek W, Assmann G, Chun J, Levkau B.

332. HDL induces NO-dependent vasorelaxation via the lysophospholipid receptor SIP3.

333. J Clin Invest. 2004 Feb;113(4):569-81.

334. Nofer JR, Walter M, Kehrel B, Wierwille S, Tepel M, Seedorf U, Assmann G.

335. HDL3-mediated inhibition of thrombin-induced platelet aggregation and fibrinogen binding occurs via decreased production of phosphoinositide-derived second messengers 1,2-diacylglycerol and inositol 1,4,5-tris-phosphate.

336. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998 Jun;18(6):861-9.

337. Nose A, Tsuji K, Takeichi M.1.calization of specificity determining sites in Cadherin cell adhesion molecules.

338. Cell. 1990 Apr 6;61(l):147-55.191.0'Donnell RW, Johnson DK, Ziegler LM, DiMattina AJ, Stone RI, Holland JA.

339. Endothelial NADPH oxidase: mechanism of activation by low-density lipoprotein.

340. Endothelium. 2003; 10(6):291-7.192. O'Farrell PH.

341. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 1975 May 25;250(10):4007-21.

342. Ohara Y, Peterson TE, Harrison DG.

343. Hypercholesterolemia increases endothelial superoxide anion production. J Clin Invest. 1993 Jun;91(6):2546-51.

344. Ohara Y, Peterson TE, Sayegh HS, Subramanian RR., Wilcox JN, Harrison DG.

345. Dietary correction of hypercholesterolemia in the rabbit normalizes endothelial superoxide anion production. Circulation. 1995 Aug 15;92(4):898-903.

346. Nat Med. 2003 Feb;9(2): 183-90.

347. Ozer NIC, Palozza P, Boscoboinilc D, Azzi A.d-alpha-Tocopherol inhibits low density lipoprotein induced proliferation and protein kinase C activity in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 1993 May 17;322(3):307-10.

348. Palinski W, Rosenfeld ME, Yla-Herttuala S, Gurtner GC, Socher SS, Butler SW, Parthasarathy S, Carew TE, Steinberg D, Witztum JL.1.w density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Feb;86(4): 1372-6.;

349. Parhami F, Fang ZT, Fogelman AM, Andalibi A, Territo MC, Berliner JA. Minimally modified low density lipoprotein-induced inflammatory responses in endothelial cells are mediated by cyclic adenosine monophosphate.

350. J Clin Invest. 1993 Jul;92(l):471-8.

351. Parhami F, Fang ZT, Yang B, Fogelman AM, Berliner JA. Stimulation of Gs and inhibition of Gi protein functions by minimally oxidized LDL.

352. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995 Nov; 15(11):2019-24.

353. Park SY, Song CY, ICim BC, Hong HIC, Lee HS.

354. Angiotensin II mediates LDL-induced superoxide generation in mesangial cells.

355. Am J Physiol Renal Physiol. 2003 Nov;285(5):F909-15. Epub 2003 Jul 01

356. Pedreno J, de Castellarnau C, CuIIare C, Sanchez J, Gomez-Gerique J, Ordonez-Llanos J, Gonzalez-Sastre F.

357. L binding sites on platelets differ from the "classical" receptor of nucleated cells.

358. Arterioscler Thromb. 1992 Nov; 12(11): 1353-62.

359. Pedreno J, Fernandez R, Cullare C, Barcelo A, Elorza MA, de Castellarnau C.

360. Platelet integrin alpha lib beta 3 (GPIIb-IIIa) is not implicated in thebinding of LDL to intact resting platelets.

361. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997 Jan; 17(1): 156-63.

362. Atherosclerosis. 2001 Mar;155(l):99-112.

363. Philippova MP, Bochkov VN, Stambolsky DV, Tkachuk VA, Resink TJ. T-cadherin and signal-transducing molecules co-localize in caveolin-rich membrane domains of vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 1998 Jun 12;429(2):207~10.

364. Phillips DR, Charo IF, Scarborough RM. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 1991 May 3;65(3):359-62.

365. Pimstone SN, Sun XM, du Souich C, Frohlich JJ, Hayden MR, Soutar AK. Phenotypic variation in heterozygous familial hypercholesterolemia: a comparison of Chinese patients with the same or similar mutations in the LDL receptor gene in China or Canada.

366. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998 Feb;18(2):309-15.

367. Plevin R, Cook SJ, Palmer S, Wakelam MJ.

368. Multiple sources of sn-l,2-diacylglycerol in platelet-derived-growth-factor-stimulated Swiss 3T3 fibroblasts. Evidence for activation of phosphoinositidase C and phosphatidylcholine-specific phospholipase D. BiochemJ. 1991 Oct 15;279 (Pt 2):559-65.

369. Podrez EA, Poliakov E, Shen Z, Zhang R, Deng Y, Sun M, Finton PJ, Shan L, Febbraio M", Hajjar DP, Silverstein RL, Hoff HF, Salomon RG, Hazen SL.

370. A novel family of atherogenic oxidized phospholipids promotes macrophage foam cell formation via the scavenger receptor CD3 6 and is enriched in atherosclerotic lesions. JBiol Chem. 2002 Oct 11;277(41):38517-23.

371. Podrez EA, Abu-Soud HM, Iiazen SL. Myeloperoxidase-generated oxidants and atherosclerosis. Free Radic Biol Med. 2000 Jun 15;28(12):1717-25.

372. Poliakov E, Brennan ML, Macpherson J, Zhang R, Sha W, Narine L, Salomon RG, Hazen SL.1.olevuglandins, a novel class of isoprostenoid derivatives, function as integrated sensors of oxidant stress and are generated by myeloperoxidase in vivo.

373. FASEB J. 2003 Dec;17(15):2209-20

374. Pontsler AV, St Hilaire A, Marathe GIC, Zimmerman GA, Mclntyre TM. Cyclooxygenase-2 is induced in monocytes by peroxisome proliferator activated receptor gamma and oxidized alkyl phospholipids from oxidized low density lipoprotein.

375. J Biol Chem. 2002 Apr 12;277(15): 13029-36.212. PraticoD.

376. F(2)-isoprostanes: sensitive and specific non-invasive indices of lipid peroxidation in vivo.

377. Atherosclerosis. 1999 Nov 1 ; 147(1): 1-10.

378. Pratico D, Smyth EM, Violi F, FitzGerald GA.1.cal amplification of platelet function by 8-Epi prostaglandin F2alpha is not mediated by thromboxane receptor isoforms. J Biol Chem. 1996 Jun 21 ;271 (25): 14916-24.

379. Pratico D, Tangirala RK, Rader DJ, Rokach J, FitzGerald GA.

380. Vitamin E suppresses isoprostane generation in vivo and reduces atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Nat Med. 1998 0ct;4(10): 1189-92.

381. Rabelo LA, Cortes SF, Alvarez-Leite JI, Lemos VS.

382. Endothelium dysfunction in LDL receptor knockout mice: a role for H202. Br J Pharmacol. 2003 Apr; 138(7): 1215-20.

383. Rajagopalan S, Kurz S, Munzel T, Tarpey M, Freeman BA, Griendling KK, Flarrison DG.

384. Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest. 1996 Apr 15;97(8):1916-23.

385. Rajavashisth TB, Andalibi A, Territo MC, Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, Lusis AJ.1.duction of endothelial cell expression of granulocyte and macrophage colony-stimulating factors by modified low-density lipoproteins.

386. Nature. 1990 Mar 15;344(6263):254-7.0

387. Ranscht B, Dours-Zimmermann MT.

388. T-cadherin, a novel cadherin cell adhesion molecule in the nervous system lacks the conserved cytoplasmic region. Neuron. 1991 Sep;7(3):391-402.

389. Reddy S, liama S, Grijalva V, Hassan K, Mottahedeh R, Hough G, Wadleigh DJ, Navab M, Fogelman AM.

390. Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 activity is necessary for oxidized phospholipids to induce monocyte chemotactic activity in human aortic endothelial cells. J Biol Chem. 2001 May 18;276(20):17030-5.

391. Reilly MP, Pratico D, Delanty N, DiMinno G, Tremoli E, Rader D, Kapoor S, Rolcach J, Lawson J, FitzG.erald GA.1.creased formation of distinct F2 isoprostanes in hypercholesterolemia. Circulation. 1998 Dec 22-29;98(25):2822-8.

392. Reilly KB, Srinivasan S, Hatley ME, Patricia MIC, Lannigan J, Bolick DT, Vandenhoff G, Pei H, Natarajan R, Nadler JL, Iiedrick CC. 12/15-Lipoxygenase activity mediates inflammatory monocyte/endothelial interactions and atherosclerosis in vivo.

393. J Biol Chem. 2004 Mar 5;279(10):9440-50.

394. Relou IA, Bax LA, van Rijn HJ, Akkerman JW.

395. Site-specific phosphorylation of platelet focal adhesion kinase by low-density lipoprotein.

396. Biochem J. 2003 Jan 15;369(Pt 2):407-16.

397. Relou AM, Gorter G, van Rijn HJ, Akkerman JW.

398. Platelet activation by the apoB/E receptor-binding domain of LDL. Thromb Haemost. 2002 May;87(5):880-7.

399. Relou IA, Gorter G, Ferreira IA, van Rijn HJ, Aldcerman JW.

400. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) inhibits low density lipoprotein-induced signaling in platelets. J Biol Chem. 2003 Aug 29;278(35):32638-44.

401. Relou IA, Iiaclceng CM, Aldcerman JW, Malle E.1.w-density lipoprotein and its effect on human blood platelets. Cell Mol Life Sei. 2003 May;60(5):961-71.

402. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart J. 1999 Nov;138(5 Pt 2):S419-20.

403. Ryomoto IG, Suzuki M, Kanazawa A, Hasegawa M, Kimura Y, Yamamura T, Harano Y.

404. Hyperapobetalipoproteinemia with compositional abnormality of LDL and IDL, a characteristic lipoprotein alteration in essential hypertension. Am J Hypertens. 2000 Jun;13(6 Pt l):617-24.

405. Saini HK, Arneja AS, Dhalla NS.

406. Role of cholesterol in cardiovascular dysfunction.

407. Can J Cardiol. 2004 Mar l;20(3):333-46.

408. Savenkova ML, Mueller DM, Heinecke JW.

409. Tyrosyl radical generated by myeloperoxidase is a physiological catalyst for the initiation of lipid peroxidation in low density lipoprotein. J Biol Chem. 1994 Aug 12;269(32):20394-400.231. Schneider WJ.

410. The low density lipoprotein receptor.

411. Biochim Biophys Acta. 1989 May 9;988(2):303-17.232. Schneider WJ, Nimpf J.

412. L receptor relatives at the crossroad of endocytosis and signaling. Cell Mol Life Sei. 2003 May;60(5):892-903.233. Schror K.

413. Thromboxane A2 and platelets as mediators of coronary arterial vasoconstriction in myocardial ischaemia. Eur Heart J. 1990 Apr;l 1 Suppl B:27-34.

414. Scott-Burden T, Resink TJ, Hahn AW, Baur U, Box RJ, Buhler FR. Induction of growth-related metabolism in human vascular smooth muscle cells by low density lipoprotein.

415. J Biol Chem. 1989 Jul 25;264(21): 12582-9.235. Semeraro N, Colucci M.

416. Tissue factor in health and disease. Thromb Flaemost. 1997 Jul;78(l):759-64.

417. Seewald S, Nickenig G, Ko Y, Vetter IT, Sachinidis A.1.w density lipoprotein enhances the thrombin-induced growth of vascularsmooth muscle cells.

418. Cardiovasc Res. 1997 0ct;36(l):92-100.

419. Shastri KM, Carvalho AC, Lees RS.

420. Platelet function and platelet lipid composition in the dyslipoproteinemias. J Lipid Res. 1980 May;21(4):467-72

421. Shih PT, Brennan ML, Vora DK, Territo MC, Strahl D, Elices MJ, Lusis AJ, Berliner JA.

422. Blocking very late antigen-4 integrin decreases leukocyte entry and fatty streak formation in mice fed an atherogenic diet. CircRes. 1999 Feb 19;84(3):345-51.

423. Shih PT, Elices MJ, Fang ZT, Ugarova TP, Strahl D, Territo MC, Frank JS, Kovach NL, Cabanas C, Berliner JA, Vora DK.

424. Minimally modified low-density lipoprotein induces monocyte adhesion to endothelial connecting segment-1 by activating betal integrin. J Clin Invest. 1999 Mar;103(5):613-25.

425. Shin HK, Kim YIC, Kim ICY, Lee JFI, ITong ICW.

426. Sidorova MV, Molokoedov AS, Az'muko AA, Stambol'skii DV, Kashirina NM, Bochkov VN, Tkachuk VA, Bespalova ZhD.

427. Antibodies against synthetic peptide fragments of T-cadherin inhibit binding of low density proteins with T-cadherin.

428. Bioorg Khim. 1999 Mar;25(3): 171-8.242. Siess W.

429. Molecular mechanisms of platelet activation. Physiol Rev. 1989 Jan;69(l):58-178.243. Silverman ES, Collins T.

430. Pathways of Egr-1 -mediated gene transcription in vascular biology. Am J Pathol. 1999 Mar;154(3):665-70.

431. Sfcalen K, Gustafsson M, Rydberg EIC, Hulten LM, Wiklund O, Innerarity TL, Boren J.

432. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.

433. Nature. 2002 Jun 13;417(6890):750-4.

434. Smart EJ, Ying YS, Mineo C, Anderson RG.

435. A detergent-free method for purifying caveolae membrane from tissue culture cells.

436. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Oct 24;?2(22): 10104-8.

437. Smirnov VN, Voyno-Yasenetskaya TA, Antonov AS, Lukashev ME, Shirinsky VP, Tertov VV, Tkachuk VA.

438. Vascular signal transduction and atherosclerosis. Ann NY Acad Sci. 1990;598:167-81.247. Smith EB.

439. Transport, interactions and retention of plasma proteins in the intima: the barrier function of the internal elastic lamina. Eur Heart J 1990 11 (suppl E): 72-81

440. Smith JD, Trogan E, Ginsberg M, Grigaux C, Tian J, Miyata M. Decreased atherosclerosis in mice deficient in both macrophage colony-stimulating factor (op) and apolipoprotein E.

441. Proc Natl Acad Sei USA. 1995 Aug 29;92(18):8264-8.

442. Sorescu D, Szocs K, Griendling KK.

443. NAD(P)H oxidases and their relevance to atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 2001 Apr-May; 11 (3-4): 124-31.

444. At last, direct evidence that lipoxygenases play a role in atherogenesis. J Clin Invest. 1999 Jun; 103(11): 1487-8.

445. Steinberg HO, Bayazeed B, Hook Gr, Johnson A, Cronin J, Baron AD. Endothelial dysfunction is associated with cholesterol levels in the high normal range in humans.

446. Circulation. 1997 Nov 18;96(10):3287-93.

447. Stepp DW, Ou J, Ackerman AW, Welak S, Klick D, Pritchard KA Jr.

448. Native LDL and minimally oxidized LDL differentially regulatesuperoxide anion in vascular endothelium in situ.

449. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002 Aug;283(2):H750-9.

450. Stuart MJ, Gerrard JM, White JG.

451. Effect of cholesterol on production of thromboxane b2 by platelets in vitro. N Engl J Med. 1980 Jan 3;302(1):6-10.

452. Suarna C, Dean RT, May J, Stocker R.

453. Human atherosclerotic plaque contains both oxidized lipids and relatively large amounts of alpha-tocopherol and ascorbate. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995 Oct; 15(10): 1616-24.

454. Subbanagounder G, Deng Y, Borromeo C, Dooley AN, Berliner JA, Salomon RG.

455. Hydroxy alkenal phospholipids regulate inflammatory functions of endothelial cells.

456. Vascul Pharmacol. 2002 Apr;38(4):201-9.

457. Subbanagounder G, Leitinger N, Schwenke DC, Wong JW, Lee H, Rizza C, Watson AD, Faull KF, Fogelman AM, Berliner JA.

458. Determinants of bioactivity of oxidized phospholipids. Specific oxidizedfatty acyl groups at the sn-2 position.

459. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000 Oct;20(10):2248-54.

460. Subbanagounder G, Wong JW, Lee H, Faull KF, Miller E, Witztum JL, Berliner JA.

461. Epoxyisoprostane and epoxycyclopentenone phospholipids regulate monocyte.chemotactic protein-1 and interleukin-8 synthesis. Formation of these oxidized phospholipids in response to interleukin-lbeta. J Biol Chem. 2002 Mar 1;277(9):7271-81.

462. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis andsusceptibility to infection.

463. Nature. 1997 Mar 20;386(6622):29'2-6.

464. Takahashi K, Nammour TM, Fukunaga M, Ebert J, Morrow JD, Roberts LJ 2nd, Hoover RL, Badr KF.

465. Glomerular actions of a free radical-generated novel prostaglandin, 8-epi-prostaglandin F2 alpha, in the rat. Evidence for interaction with thromboxane A2 receptors. J Clin Invest. 1992 Jul;90(l): 136-41.

466. Takahashi K, Ohyanagi M, Ikeoka K, Iwasaki T.

467. Acetylcholine-Induced response of coronary resistance arterioles in cholesterol-fed rabbits. Jpn J Pharmacol. 1999 Oct;81(2): 156-62.

468. Tanihara H, Sano K, Heimark RL, St John T, Suzuki S.

469. Cloning of five human Cadherins clarifies characteristic features of Cadherin extracellular domain and provides further evidence for two structurally different types of Cadherin. Cell Adhes Commun. 1994 Apr;2(l): 15-26.

470. Thastrup O, Cullen PJ, Drobak BK, Hanley MR, Dawson AP. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase.

471. Proc Natl Acad Sei USA. 1990 Apr;87(7):2466-70.

472. Thuklcani AK, McHowat J, Hsu FF, Brennan ML, Flazen SL, Ford DA. Identification of alpha-chloro fatty aldehydes and unsaturated lysophosphatidylcholine molecular species in human atherosclerotic lesions.

473. Circulation. 2003 Dec 23;108(25):3128-33.

474. Tkachuk VA, Bochkov VN, Philippova MP, Stambolsky DV, Kuzmenko ES, Sidorova MV, Molokoedov AS, Spirov VG, Resink TJ. Identification of an atypical lipoprotein-binding protein from human aortic smooth muscle as T-cadherin.

475. FEBS Lett. 1998 Jan 16;421(3):208-12. '

476. Tkachuk VA, Kuzmenko YS, Resink TJ, Stambolsky DV, Bochkov VN. Atypical low density lipoprotein binding site that may mediate lipoprotein-inducecl signal transduction.

477. Mol Pharmacol. 1994 Dec;46(6):l 129-37.

478. Topper JN, Gimbrone MA Jr.

479. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. ' Mol Med Today. 1999 Jan;5(l):40-6.

480. Tornvall P, Chirkova L, Toverud ICD, Horowitz JD, Chirkov Y.

481. Native and oxidized low density lipoproteins enhance platelet aggregation in whole blood.

482. Thromb Res. 1999 Aug 15;95(4):177-83.

483. Tremoli E, Colli S, Maderna P, Baldassarre D, Di Minno G. Hypercholesterolemia and platelets.

484. Semin Thromb Hemost. 1993; 19(2): 115-21.271. Udenfriend S, Kodukula K.

485. Prediction of omega site in nascent precursor of glycosylphosphatidylinositol protein. Methods Enzymol. 1995;250:571-82.

486. Van Lenten BJ, Wagner AC, Navab M, Fogelman AM.

487. Oxidized phospholipids induce changes in hepatic paraoxonase and ApoJ but not monocyte chemoattractant protein-1 via interleukin-6. J Biol Chem. 2001 Jan 19;276(3): 1923-9.273. van Willigen G, Gorter G, Akkerman JW.

488. Ls increase the exposure of fibrinogen binding sites on platelets andsecretion of dense granules.

489. Arterioscler Thromb. 1994 Jan; 14(l):41-6.274. Vestal DJ, Ranscht B.

490. Glycosyl phosphatidylinositol—anchored ' T-cadherin mediates calcium-dependent, homophilic cell adhesion. J Cell Biol. 1992 Oct; 119(2):451-61

491. Voyno-Yasenetskaya TA, Dobbs LG, Erickson SK, Hamilton RL.1.w density lipoprotein- and high density lipoprotein-mediated signal transduction and exocytosis in alveolar type II cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 May l;90(9):4256-60.

492. Volfl, Roth A, Cooper J, Moeslinger T, IColler E.

493. Hypochlorite modified LDL are a stronger agonist for platelets than copper oxidized LDL.

494. FEBS Lett. 2000 Oct 20;483(2-3):155-9.

495. Vora DK, Fang ZT, Liva SM, Tyner TR, Parhami F, Watson AD, Drake TA, Territo MC, Berliner JA.1.duction of P-seleetin by oxidized lipoproteins. Separate effects on synthesis and surface expression. Circ Res. 1997 Jun;80(6):810-8.

496. Wagener FA, van Beurden HE, von den Hoff JW, Adema GJ, Figdor CG. The heme-heme oxygenase system: a molecular switch in wound healing. Blood. 2003 Jul 15; 102(2):521-8.

497. Walter M, Reinecke H, Gerdes U, Nofer JR, Iiobbel G, Seedorf U, Assmann G.

498. Defective regulation of phosphatidylcholine-specific phospholipases C and D in a kindred with Tangier disease. Evidence for the involvement of phosphatidylcholine breakdown in HDL-mediated cholesterol efflux mechanisms.

499. J Clin Invest. 1996 Nov 15;98(10):2315-23.'

500. Circulation. 1999 Apr 20;99(15):2027-33.

501. Wassmann S, Hilgers S, Laufs U, Böhm M, Nickenig G.

502. Angiotensin II type 1 receptor antagonism improves hypercholesterolemiaassociated endothelial dysfunction.

503. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002 Jul 1;22(7): 1208-12.

504. Watson AD, Leitinger N, Navab M, Faull KF, Horkko S, Witztum JL, Palinski W, Schwenke D, Salomon RG, Sha W, Subbanagounder G, Fogelman AM, Berliner JA.

505. Structural identification by mass spectrometry of oxidized phospholipids in minimally oxidized low density lipoprotein that induce monocyte/endothelial interactions and evidence for their presence in vivo. J Biol Chem. 1997 May 23;272(21):13597-607.

506. Weisgraber KH, Innerarity TL, Mahley RW.

507. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 1978 Dec 25;253(24):9053-62.

508. Weiss DL, Hural J, Tara D, Timmerman LA, Henkel G, Brown MA. Nuclear factor of activated T cells is associated with a mast cell interleukin 4 transcription complex.

509. Mol Cell Biol. 1996 Jan;16(l):228-35.

510. Welling GW, Weijer WJ, van der Zee R, Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. FEBS Lett. 1985 Sep 2;188(2):215-8.

511. Williams RR, Hunt SC, Hopkins PN, Stults BM, Wu LL, Hasstedt SJ, Barlow GK, Stephenson SH, Lalouel JM, Kuida H.

512. Familial dyslipidemic hypertension. Evidence from 58 Utah families for a syndrome present in approximately 12% of patients with essential hypertension.

513. JAMA. 1988 Jun 24;259(24):3579-86.287. Williams ICJ, Tabas I.

514. The response-to-retention hypothesis of atherogenesis reinforced. Cuit Öpin Lipidol. 1998 Oct;9(5):471-4.

515. Wilson DJ, Gahan M, Haddad L, Heath K, Whittall RA, Williams RR, Humphries SE, Day IN.

516. A World Wide Web site for low-density lipoprotein receptor gene mutations in familial hypercholesterolemia: sequence-based, tabular, and direct submission data handling. Am J Cardiol. 1998 Jun 15;81(12): 1509-11.290. Witztum JL.

517. The oxidation hypothesis of atherosclerosis. Lancet. 1994 Sep'17;344(8925):793-5.291. Witztum JL, Berliner JA.

518. Oxidized phospholipids and isoprostanes in atherosclerosis. Curr Opin Lipidol. 1998 Oct;9(5):441-8.

519. Witztum JL, Steinberg D. . Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis. J Clin Invest. 1991 Dec;88(6):1785-92.

520. Wreggett KA, Howe LR, Moore JP, Irvine RF. Extraction and recovery of inositol phosphates from tissues. BiochemJ. 1987 Aug l;245(3):933-4.

521. Yamada S, Ito T, Adachi J, Ueno Y, Shiomi M.

522. Decreased arterial responses in WHHL rabbits, an animal model of spontaneous hypercholesterolemia and atherosclerosis. Exp Anim. 2002 Oct;51(5):493-9.

523. Yla-Iierttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, Parthasarathy S, Carew TE, Butler S, Witztum JL, Steinberg D.

524. Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. J Clin Invest. 1989 Oct;84(4):1086-95.

525. Yuhanna IS, Zhu Y, Cox BE, Llahner LD, Osborne-Lawrence S, Lu P, Marcel YL, Anderson RG, Mendelsohn ME, Hobbs HH, Shaul PW. High-density lipoprotein binding to scavenger receptor-BI activates endothelial nitric oxide synthase.

526. Nat Med. 2001 Jul;7(7):853-7.

527. Zafari AM, Ushio-Fukai M, Akers M, Yin Q, Shah A, Harrison DG, Taylor WR, Griendling KK.

528. Role of NADIi/NADPH oxidase-derived H202 in angiotensin II-inducedvascular hypertrophy.

529. Hypertension. 1998 Sep;32(3):488-95.3 00. Zhang SH, Reddick RL, Piedrahita JA, Maeda N.

530. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.

531. Science. 1992 Oct 16;258(5081):468-71.

532. Zhang R, Shen Z, NauseefWM, Hazen SL.

533. Zhao L, Cuff CA, Moss E, Wille U, Cyrus T, Klein EA, Pratico D, Rader DJ,

534. Hunter CA, Pure E, Funic CD.