Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спектр мутационных повреждений гена рецептора липопротеидов низкой плотности в популяции больных семейной гиперхолестеринемией г. Санкт-Петербурга

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шакир Хамид, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Б. П. КОНСТАНТИНОВА

На правах рукописи

Жакир Халид

СПЕКТР МУТАЦИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ В ПОПУЛЯЦИИ БОЛЬНЫХ СЕМЕЙНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ Г. САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

ДИССЕРТАЦИЯ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК 03.00.15 ГЕНЕТИКА

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ДОКТОР МЕДИЦИНСКИХ НАУК, ПРОФЕССОР Е. И. ЩВАРЦ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ-------------------------------------------1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ------------------------------------2

ВВЕДЕНИЕ---------------------------------------------3

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР-------------------------- б

1.1. Семейная гиперхолестеринемия-----------6

1.2. Структура рецептора ЛПНП--------------11

1.3. Структура гена рецептора ЛПНП---------18

1.3.1. Соотношение ген-белок----------------19

1.3.2. Транскрипционная регуляция гена

рецептора ЛПНП----------------------2 0

1.3.3. Полиморфизмы рецептора ЛПНП---------22

1.4. Сцепление мутационных дефектов РЛПНП с

сг-------------------------------------23

1.5. Классификация мутации в рецепторе ЛПНП 27

1.6. Общая стратегия изучения СГ----------- 2 9

1.6.1. Идентификация крупных перестроек в гене РЛПНП-------------------------------31

1.6.2. Первичная идентификаций точечных мутаций-----------------------------31

1.6.3. Молекулярный скрининг охарактеризованных мутаций в популяции-----------35

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ-------------------------37

II. 1. Материалы-----------------------------37

II.2. Характеристика обследованных групп----37

II. 3. Молекулярно-генетические методы-------39

11.3.1. Выделение- ДНК из периферической крови-------------------------------39

11.3.2. Полимеразная цепная реакция(ПЦР)----40

11.3.3. Анализ конформационного полиморфизма

однонитевых фрагментов ДНК-------- 42

11.3.4. Очистка ПЦР-фрагментов для секвенирования--------------------44

11.3.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК по Сенгеру- 45

11.3.6. Секвенирование с помощью специального набора (AmpliCycle™ sequencing kit)4 6

II. 3.7. Рестрикционный анализ--------------47

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ-------------------49

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ---------------------61

ЗАКЛЮЧЕНИЕ--------:------------------------------------68

вквОДЫ----4"------'------------------------------------- 7 0

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ------------------------------------- 71

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ак

Апо В Апо С апо Е АХАТ

ГМГ-КоА-редуктаза

ИБС

ИГ

ЛП

КДНК

ЛПВП

ЛПНП

ЛПОНП

ПДРФ

ПЦР РЛПНП

сг тг хм хс

ХС ЛПВП ХС ЛПНП ХС ЛПОНП

эхе

ЭФР М-СБР

БЫР БИЕВР

ББСР

аминокислота аполипопротеин В аполипопротеин С аполипопротеин Е

ацил-коА-холестерин-ацилтрансфераза Р-гидрокси, Р -метилглутарил-коэнзим а редуктаза

ишемическая болезнь сердца индекс гетерогенности липопротеины комплементарная ДНК липопротеины высокой плотности липопротеины низкой плотности

■ липопротеины очень низкой плотности полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

полимеразная цепная реакция рецептор липопротеидов низкой плотности семейная гиперхолестеринемия • триглицериды

■ хиломикроны

- холестерин

- холестерин липопротеидов высокой плотности

- холестерин липопротеидов низкой плотности

- холестерин липопротеидов очень низкой плотности

- эфиры холестерина

- эпидермальный фактор роста

- макрофагальный колоний-стимулирующий фактор

- однонуклеотидный полиморфизм

- белок, связывающий стероидный регуляторный элемент

- конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК

ВВЕДЕНИЕ

Атеросклероз является основной причиной развития ишемической болезни сердца (ИБС) и других сердечно-сосудистых заболеваний, приводящих к инвалидности и ранней смертности в большинстве популяций[1].

Атеросклероз - прогрессирующая болезнь крупных артерий, которая реализуется при взаимодействии генетических и средовых факторов.

Методы классической генетики, и, прежде всего, генеалогический анализ, позволили прийти к заключению о важной роли наследственных факторов в генезе атеросклеротического поражения сосудов. Однако механизмы наследственной предрасположенности к развитию атеросклероза остаются недостаточно изученными.

Холестериновая концепция атеросклероза была предложена H.H. Аничковым более 80 лет тому назад [2]. В 1939 г. Карл Мюллер, продолжая работу Аничкова, выдвинул теорию о том, что в основе увеличенного уровня холестерина в крови, появления ксантом и ряда сердечных заболеваний лежат генетические дефекты.

В течение последних двух десятилетий благодаря эпидемиологическим исследованиям накопилось большое количество информации об ассоциации уровня липопротеидов плазмы с развитием атеросклероза у человека.

! Первоначально было подтверждено, что атеросклероз тесно связан с высокими концентрациями холестерина, особенно

холестерина, входящего в состав липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), и менее связан с холестерином липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеином (а). Последние работы показали также связь между развитием атеросклероза и низким уровнем в крови холестерина липопротеидов высокой плотности[3].

Доказательства того, что генетические факторы могут быть ведущей причиной ускоренного развития атеросклероза, получены в классической серии работ по изучению семейной гиперхолестеринемии М. Brown и J.L. Goldstein [4].

В этих работах был изучен гомеостаз холестерина в организме человека и было показано, чт-о мут-ацжшные повреждения в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (РЛПНП) могут приводить к развитию тяжелой гиперхолестеринемии и инфаркта миокарда уже в раннем возрасте. С этого момента в изучении атеросклеротического процесса наступила новая, молекулярно-генетическая, эра.

В результате интенсивной работы многих исследователей были клонированы, секвенированы и картированы более двадцати генов, участвующих в транспортировке и метаболизме липидов.

Генетическое изучение атеросклероза направлено, в основном, на выявление ассоциации структурных полиморфизмов ряда генов, оперирующих в системе липидного гомеостаза, коагуляционного и ренин-ангиотензинного каскадов, с развитием инфаркта миокарда и инсульта.

При таком подходе выясняется также возможное ген-генное взаимодействие в формировании наследственной предрасположенности к вышеуказанным заболеваниям.

Знание природы молекулярных дефектов является необходимым условием для создания эффективных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистой патологии. Такой подход позволяет прогнозировать частоты наследственной патологии для будущих поколений, а также планировать объем специализированных видов помощи в соответствии с предполагаемым распространением болезни.

В данной работе проводилось исследование некоторых генетических аспектов предрасположенности к атеросклерозу и инфаркту миокарда, в частности, мы занимались определением спектра молекулярных мутационных повреждений в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (РЛПНП), приводящих к развитию семейной гиперхолестеринемии (СГ).

Целью настоящей работы является изучение связи между структурной организацией гена рецептора ЛПНП и проявлениями болезни семейной гиперхолестеринемии.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Семейная гиперхолестеринемия

Семейная гиперхолестеринемия является одним из основных факторов риска развития раннего атеросклероза и инфаркта миокарда. Это моногенное заболевание человека с аутосомно-доминантным типом наследования, соответствует Па типу гиперлипидемии по классификации В. Ргедпскзоп и экспертов ВОЗ [5]. Частота ее встречаемости в популяциях составляет 1 на 500 человек.

Это наиболее серьезная патология в системе метаболизма липопротеидов (ЛП), о чем свидетельствует тот факт, что степень риска развития ИБС у пациентов с этим типом нарушения обмена холестерина возрастает в 10-20 раз по сравнению со здоровыми лицами. В основе данного заболевания лежит снижение скорости катаболизма липопротеидов низкой плотности вследствие количественной недостаточности или дисфункции их специфического рецептора - рецептора липопротеидов низкой плотности (РЛПНП)[6,7,8].

АШе и соав. в 1981 г. доказали, что захват ЛПНП из сыворотки крови при гомозиготной форме СГ осуществляется рецептором-мусорщиком, который экспрессируется в клетках моноцитарно-макрофагальной линии [9,10]. Это приводит к трансформации моноцитов в пенистые клетки. Следует отметить, что моноцитами, в основном, захватываются окисленные ЛПНП, обладающие высокой степенью атерогенности [11,12,13].

В настоящий момент установлено наличие двух типов скевенджер-рецепторов, которые являются результатом

альтернативного сплайсинга мРНК и представляют собой полипептидные тримеры с высокой степенью гликозилирования.

Ген, определяющий структуру этих рецепторов, клонирован и картирован на коротком плече 8 хромосомы [14,15].

Исследования in vitro и in vivo на экспериментальных животных показали, что нарушение метаболизма липопротеинов и их окисление модулируют экспрессию нескольких цитокинов и факторов роста в сосудистых стенках, чем вносят значительный вклад в развитие атеросклероза. Одним из факторов роста, причастным к процессу атеросклероза, является M-CSF- фактор стимулирования колонии макрофагов. M-CSF влияет на рост и функции моноцитов и макрофагов. Окисленные ЛПНП вызывают экспрессию M-CSF в эндотелиальных клетках артерий. M-CSF является также необходимым для жизнедеятельности макрофагов и их превращения в пенистые клетки, как в культуре клеток, так и in vivo, что делает возможным развитие атеросклеротических повреждений и кальцификации стенок артерии[17,18].

Кроме того, окисленные ЛПНП обладают иммуногенными свойствами и могут вызывать формирование аутоантител, роль которых в атеросклеротических повреждениях продемонстрирована у человека, кролика и мыши[16].

Таким образом, Ьовременное представление о холестериновой концепции атеросклероза можно сформулировать так:

модифицированные ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а) являются ответственными за развитие этого патологического процесса, а ЛПВП играют антиатерогенную роль.

Атеросклеротический процесс особенно резко выражен у гомозигот СГ, для которых характерно полное отсутствие функционирующих рецепторов ЛПНП. Содержание ХС обычно превышает 700 мг/дл (>18 ммоль/л), в наиболее тяжелых случаях может достигать 1000 мг/дл (>25 ммоль/л). Гетерозиготы, у которых имеется только половина нормально функционирующих рецепторов, имеют более низкую концентрацию ХС, которая может колебаться в пределах 300-500 мг/дл (8-13 ммоль/л). При этом уровень ТГ остается нормальным или слегка повышенным [19].

Семейная гиперхолестеринемия клинически проявляется картиной ИБС и инфаркта миокарда в сравнительно молодом возрасте, а также появлением бугорчатых ксантом уже в детском возрасте.

У гомозиготных больных все проявления усилены и ускорены. Ранняя смерть от ИБС (в возрасте до 30 лет), как правило, связана с наличием гомозиготной формы СГ. При ангиографии в этом случае выявляются более тяжелые и обширные поражения коронарных сосудов, чем при других вариантах гиперхолестеринемии. Характерно проявление липоидной дуги роговицы в возрасте до 30 лет.

Диагноз ставится на основании анализа липидов и ЛП плазмы крови не только у пациента, но и у родственников первой степени родства. Уровень ХС', превышающий 300 мг/дл (7,8 ммоль/л), перенесенный инфаркт миокарда до 60 лет, а также типичные ксантомы

свидетельствуют о наличии СГ. Болезнь передается аутосомно-доминантно[ 19].

Brown М. и Goldstein J. впервые показали существование на поверхности клеток различного гистогенеза специфического рецептора, узнающего частицы ЛПНП.

В литературе опубликовано немало обзоров, вопросов функционирования ЛПНП-рецепторов в норме и человека и различных видов животных, в том числе рецепторов в развитии гиперхолестеринемий и атеросклероза [18,20,21,22].

Процесс взаимодействия ЛП-частицы с рецептором характеризуется высокой специфичностью.

Общее число рецепторов, приходящихся на одну клетку, колеблется от 15000 до 70000, при этом один рецептор связывает одну частицу ЛПНП. Взаимодействие ЛПНП с рецептором происходит в области специальных образований мембраны, получивших название окаймленных ямок и занимающих около 2% мембранной поверхности с участием мембранного белка клатрина [23].

После связывания частиц ЛПНП специфическими рецепторами окаймленные ямки внедряются внутрь клетки и отрываются, образуя окаймленные эндоцитозные везикулы. Первыми клеточными органеллами, с которыми вступают в контакт окаймленные везикулы, являются мелкие внутриклеточные гладкие везикулы. В результате их слияния происходят образование эндосом, а затем диссоциация комплекса ЛПНП-рецептор вследствие кислой реакции внутри эндосом

касающихся патологии у роли этих

(рН около 5). Освободившиеся рецепторы по неизвестному еще механизму возвращаются в плазматическую мембрану и вновь встраиваются в нее [11].

Эндосомы, поглотившие частицы ЛПНП и сохранившие их нетронутыми, сливаются с лизосомами, где и происходит атака ЛПНП лизосомальными энзимами. При этом белок ЛП расщепляется до аминокислот, а эфиры холестерина (ЭХ С)— до свободного ХС и жирных кислот. Подвергаются расщеплению также триглицериды (ТГ) и фосфолипиды.

Освободившийся ХС, покидая лизосомы, остается в клетке и оказывает на нее многостороннее влияние. Прежде всего, ХС или продукты его окисления угнетают активность (или синтез) Р-гидрокси, р-метилглутарил-коэнзим а редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы) — ключевого энзима биосинтеза ХС, подавляя, следовательно, синтез собственного ХС в клетке. Одновременно при появлении избытка свободного ХС в клетке ингибируется синтез рецепторов ЛПНП, что ведет к уменьшению их количества на мембранах и к уменьшению связывания и захвата новых частиц ЛПНП клеткой. Наконец, свободный ХС активирует микросомальный энзим — ацил-коА-холестерин-ацилтрансферазу (АХАТ), эстерифицирующий ХС (ЭХС), тем самым, способствуя депонированию ЭХС в цитоплазме[23].

Таким сложным путем контролируются, с одной стороны, синтез ХС в клетке и, с другой — проникновение ЛПНП в клетку и доставка ими X С.

Образовавшиеся эфиры ХС в отличие от свободного ХС накапливаются исключительно в цитоплазме в виде мелких жировых капель. При необходимости клетка осуществляет гидролиз ЭХС, и освободившийся неэстер ифицированный ХС используется для построения мембран вновь образующихся клеток, синтеза гормонов.

Таким образом рецептор-опосредуемый захват ЛПНП обеспечивает поддержание уровня ХС и ЛПНП в крови в нормальных пределах, препятствуя тем самым развитию атеросклероза [11,23]. 1.2. Структура рецептора ЛПНП.

Рецептор-ЛПНП является мембранным белком, определяющим захват и транспортировку макромолекул через плазматическую мембрану путем эндоцитоза.

Он представляет собой одноцепочечный гликопротеин с ММ 164 кДа; его изоэлектрическая точка равна 4.6, что свидетельствует о большой концентрации отрицательно заряженных аминокислот в его структуре.

Он синтезируется первоначально как предшественник с ММ 120 КДа, состоящий из 860 аминокислот (ак). В последующем происходит его гликозилирование в аппарате Гольджи.

Рецептор состоит из 839 ак, не считая сигнального гидрофобного участка из 21 ак на аминотерминальном конце, отщепляющегося от основной цепи при встраивании рецептора в мембрану[24].

fi Л Л АПттЧ 1

Ц и п т? i! П п 1

Ц \\ и II и _j

C\\

г. П Г

NH

экзов 2-е

Цистемн

СООН

экзон

7-14

ЭКЭОН 15

Ц

5

экзон

16-17

ЭКЗОН 17-18

Риг 1 '

Схематическая модель ЛПНП-рецептора или апо В.Е-рецептора [no М. Brown, J. Goldstein, 1988].

1 — лигацдсвязывающий домен (292 ак); 2 — домен, гомологичный эпидермальному фактору роста 400 ак); 3 — домен, содержащий О-связанные углеводы (58 ак); 4 — мембранный домен (22 ак); 5 — цитоплазматический домен (50 ак).

На рис.1 представлена схематическая модель зрелого рецептора ЛПНП, состоящего из пяти доменов, осуществляющих следующие функции:

Первый домен является сайтом для связывания лиганда. Физиологическими лигандами рецептора являются все содержащие аполипопротеин В (Mr 513000) или аполипопротеин Е (Mr 34000) частицы (ЛПНП, ЛППП, (ЗЛОНП и ЛПВП апоЕ содержащие) и апоЕ

содержащие протеолипосомы. Поэтому рецептор и называется апоВ/Е-рецептор.

Этот домен белка, обогащенный цистеиновыми остатками, включает 292 И-концевые аминокислоты зрелого рецептора. Он состоит из 7 повторов по 40 аминокислот, каждый из которых содержит по 6 цистеиновых остатков, связанных между собой дисульфидными связями. Каждый повтор кодируется отдельным экзоном, за исключением повторов 4, 5 и 6, кодируемых экзоном 4, утратившим интроны в ходе эволюции. На С-конце каждого повтора имеется высоко консервативная последовательность, обогащенная отрицательно заряженными аминокислотами: А8р-Х-Су5-А5р-01у-8ег-Азр-01и, где X - неконсервативная аминокислота. Наибольшей консервативностью отличается триплет 8ег-Азр-01и.

Эта последовательность имеет ведущее значение для связывания лиганда, несущего на поверхности положительный заряд [8,25,26]. Этот домен характеризуется высокой стабильностью.

Каждые 10 мин. �