Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярной природы семейной гиперхолестеринемии среди жителей Петрозаводска и Санкт-Петербурга

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярной природы семейной гиперхолестеринемии среди жителей Петрозаводска и Санкт-Петербурга"

005059386

На правах рукописи

КОМАРОВА Татьяна Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПРИРОДЫ СЕМЕЙНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ СРЕДИ ЖИТЕЛЕЙ ПЕТРОЗАВОДСКА И САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

03.01.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

1 р ¿013

005059386

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент

Мандельштам Михаил Юрьевич

Официальные оппоненты:

Денисенко Александр Дорофеевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, руководитель отдела биохимии.

Сироткина Ольга Васильевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова», ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

^ Защита состоится «¿У» ^СССЫ^ 2013 г. в часов на заседании

Г у«-'диссертационного совета Д 001.022.03 при Федеральном государственном \ бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12) по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменностровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «26 » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор биологических наук Хныченко Людмила Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семейная гиперхолестеринемия (СГ) - наследственная патология, приводящая к раннему развитию и тяжелому течению сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). Сегодня ССЗ являются основной причиной смертности населения в большинстве развитых стран мира. В России показатели смертности от ССЗ среди людей трудоспособного возраста являются самыми высокими в Европе (Шальнова и др., 2012). В Северо-Западном Федеральном округе смертность мужчин трудоспособного возраста от ССЗ одна из самых высоких по стране и по последним опубликованным данным составляет 47% от общей смертности мужчин (Шальнова и др., 2012).

Дополнительными факторами риска ССЗ при гиперхолестеринемии являются: артериальная гипертония, ожирение, нарушение углеводного и липидного обмена, а также курение, чрезмерное употребление алкоголя и низкая физическая активность (Ford, Capewell, 2011). Некоторые из них можно скорректировать, изменив образ жизни, но не генетическую предрасположенность. Наиболее частой наследственной причиной ишемической болезни сердца является СГ, обуславливающая, по некоторым данным, 5 - 7% всех случаев инфаркта миокарда у пациентов моложе 60 лет (Кухарчук и др., 2009; Koivisto et al., 1993).

СГ - это аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся повышенным уровнем общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности в крови. У пациентов с СГ развивается ранний атеросклероз и его основные осложнения в виде ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда или мозговых инсультов. Чаще всего причиной СГ является снижение скорости катаболизма ЛНП вследствие количественной недостаточности или дисфункции их рецептора (OMIM *606945), вызванных мутациями в одноименном гене.

Значительная доля случаев аутосомно-доминантной гиперхолестеринемии может быть обусловлена мутациями в гене АРОВ, приводящими к развитию другого наследственного заболевания - семейного дефекта аполипо протеина В-100 (FDB) (Мандельштам, Васильев, 2008). Клинически отличить эти два заболевания достаточно трудно, несмотря на то, что общее течение FDB более мягкое. Частота СГ в большинстве популяций составляет 1:500, а частота FDB в некоторых популяциях Средней Европы - 1:500 - 1:700 (Мандельштам, Васильев, 2008). На сегодняшний день в мире описано более 1000 мутаций гена рецептора ЛНП (Dedoussis et al., 2004), причем спектр мутаций сильно отличается в различных популяциях и этнических группах. В гене АРОВ у людей белой расы удалось идентифицировать лишь одну широко распространенную мутацию R3500Q (CGG>CAG, g.10708 G>A).

Эффективная терапия при этих заболеваниях существует и позволяет значительно снизить риск развития атеросклероза и его тяжелых последствий. Но эффективность лечения во многом зависит от того, насколько рано оно было начато, а все основные клинические проявления СГ и РБВ развиваются с возрастом (Кухарчук и др., 2009). У детей они могут отсутствовать, и даже уровень общего холестерина может быть в пределах нормы. Ранняя диагностика возможна только с помощью анализа ДНК, который позволяет определить носителей мутаций в генах рецептора ЛНП и АРОВ и провести консультирование среди родственников пациентов.

Степень разработанности темы. Важным фактором, который влияет на эффективность ДНК-диагностики любого заболевания, является наличие информации о типах мутаций, которые встречаются в изучаемой популяции (Мандельштам и др., 2004). Несмотря на то, что за рубежом накоплена огромная информация о мутациях в гене рецептора ЛНП (Рес1ош515 с! а1., 2004), в нашей стране такие исследования проведены в недостаточном объеме. Многие найденные в России мутации гена рецептора ЛНП являются новыми и за рубежом не обнаружены (Захарова и др., 2007; Мешков и др., 2004; Воевода и др., 2008), а исследования молекулярной природы СГ проводили только в крупных городах - Санкт-Петербурге, Москве и Новосибирске и не проводили в республиках с этнически своеобразным составом населения. Эти данные свидетельствует в пользу генетических особенностей российского населения и необходимости изучения генетической структуры СГ в разных регионах России.

Цель исследования. Сравнительное изучение спектра и частоты встречаемости мутаций генов, обуславливающих развитие наследственной гиперхолестеринемии, в двух крупных городах Северо-Запада России: Санкт-Петербурге и Петрозаводске.

Задачи работы:

1. С помощью автоматизированного флуоресцентного анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК и прямого секвенирования отдельных экзонов идентифицировать мутации в группе из 110 пациентов с клиническим диагнозом СГ из числа жителей Петрозаводска.

2. Оценить диагностическую значимость обнаруженных мутаций и полиморфизмов в гене рецептора ЛНП.

3. Определить частоту встречаемости мутации Ю500(2 в гене аполипопротеина В-100 у пациентов с СГ из Петрозаводска.

4. Провести сравнение спектра и частоты встречаемости мутаций гена рецептора ЛНП среди пациентов с диагнозом СГ в Санкт-Петербурге и в Петрозаводске.

5. Разработать быстрые методы выявления мутаций с помощью рестрикционного анализа для скрининга мутаций в расширенных выборках пациентов с СГ из Санкт-Петербурга, Ленинградской области и из Карелии, а также у родственников пробандов.

Научная новизна полученных результатов. Впервые в России было проведено исследование молекулярной природы наследственной гиперхолестеринемии среди жителей Петрозаводска. В результате исследования в изученной группе из 110 пациентов было обнаружено 12 мутаций и 6 полиморфизмов в гене рецептора ЛНП. Семь мутаций охарактеризованы впервые в мире. Показано, что мутация 113500(3 в гене АРОВ не характерна для населения Петрозаводска. Разнообразие мутаций и уникальность их спектра указывает на отсутствие выраженного эффекта основателя при СГ у жителей Петрозаводска.

Научно-практическая и теоретическая значимость работы. Теоретический интерес представляет своеобразие спектра мутаций гена рецептора ЛНП, охарактеризованного впервые для жителей Петрозаводска, а также наличие лишь одной общей мутации гена среди пациентов с СГ Петрозаводска, Санкт-Петербурга и Финляндии. Среди описанных мутаций и полиморфизмов ДНК пять приводят к сдвигу рамки считывания, шесть - к аминокислотным заменам, один - к нарушению сайта сплайсинга и шесть были признаны нейтральными заменами. Описана частота встречаемости вариантов полиморфных маркеров среди жителей Петрозаводска и проведено сравнение полученных результатов с данными по Санкт-Петербургу.

Практическая значимость работы заключается в разработке быстрых методов выявления генетических вариантов с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции и гетеродуплексного анализа, которые могут быть применены при диагностике заболевания среди родственников пациентов. Своевременное выявление мутаций позволяет начать лечение на ранних стадиях заболевания и избежать атеросклероза и его осложнений.

Методология и методы исследования. Работа опирается на современную методологию анализа генома человека в норме и при патологии и использует такие общепринятые методы исследования ДНК как полимеразная цепная реакция, конформационно-чувствительный гель электрофорез, клонирование и секвенирование ДНК, рестрикционный анализ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП у пациентов с СГ из Петрозаводска отличается от спектра мутаций этого гена в Санкт-Петербурге и других регионах России.

2. У пациентов с СГ из Петрозаводска мутация FsE287:V348X (FH-North Karelia), характерная для восточной Финляндии, встречается редко, а мутация FH-Helsinki, типичная для южной и центральной Финляндии у обследованных пациентов не встречается вовсе.

3. Частоты встречаемости вариантов полиморфных маркеров, характерных как для жителей Санкт-Петербурга, так и для жителей Петрозаводска, существенно отличаются в этих двух городах.

4. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП при СГ в Петрозаводске, как и в Санкт-Петербурге, достаточно широкий, мажорные мутации отсутствуют, а эффект основателя в отношении СГ на Северо-Западе России выражен слабо.

5. Мутация R3500Q в гене АРОВ не обнаружена у жителей Петрозаводска.

6. Предпочтительным способом ДНК-диагностики пациентов с СГ на Северо-Западе России является не скрининг экзонов с помощью метода анализа конформационного полиморфизма ДНК, а прямое секвенирование всех кодирующих участков гена рецептора ЛНП и его экзон-интронных границ.

Достоверность и надежность результатов. Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными. Это определяется точностью и специфичностью методов секвенирования ДНК и рестрикционного анализа. Результаты, полученные с использованием различных методов генетического анализа (гетеродуплексный анализ, ПДРФ-анализ, SSCP-анализ и секвенирование), согласуются между собой. Количественные данные отражающие различия в частоте встречаемости вариантов полиморфных маркеров у жителей Петрозаводска и Санкт-Петербурга обработаны статистически с общепринятым уровнем достоверности 5%.

Личный вклад автора. Личный вклад автора в выполненную работу включал получение большинства экспериментальных результатов, обработку и анализ полученных данных, а также участие в написании статей.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на 13 международных, всероссийских и региональных конференциях и опубликованы в тезисах материалов 13 конференций. Наиболее важные из них: VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (14 - 18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону); Российский Конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященный памяти профессора Евгения Иосифовича Шварца (июнь 2010 г., июнь 2012 г., Санкт-Петербург); Российский национальный конгресс кардиологов - 2010 (5-7 октября 2010 г., Москва); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным

участием «Молекулярная диагностика - 2010» (24 - 26 ноября 2010 г., Москва); The 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: advances and perspectives" (14 - 17 сентября 2011 г., Киев, Украина); European Human Genetics Conference 2011 (28 -31 мая 2011 г., Амстердам, Нидерланды); V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий»; Московский международный форум кардиологов (14 - 15 июня 2012 г., Москва); Первый международный образовательный форум «Российские дни сердца» (4-6 апреля 2013 г., Москва.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в российских научных журналах, рекомендуемых ВАК. Исследование проводилось при поддержке грантов РФФИ № 10-04-00563 и № 13-04-00902, а также грантов администрации Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит из 17 таблиц и 49 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Заключение». Список цитируемой литературы включает 166 источников, из них 13 на русском языке и 153 - на иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении к работе обоснована актуальность изучаемой темы, степень ее разработанности, сформулированы цели и задачи работы, отражена научная новизна полученных результатов, а также их практическая и теоретическая значимость, сформулированы положения, выносимые на защиту.

Обзор литературы. В данной главе работы на основании литературных данных рассмотрены основные виды моногенных гиперхолестеринемий, обусловленных мутациями в генах LDLR, АРОВ, PCSK9, ARH, а также их встречаемость в разных популяциях. В главе подробно описано строение рецептора ЛНП, его клеточный цикл, ген, кодирующий рецептор ЛНП, виды мутаций в этом гене и спектры мутаций в разных популяциях в мире. Также в обзоре литературы приведены принятые в России рекомендации по диагностике и лечению СГ.

Материалы и методы. В данной главе подробно описаны критерии отбора пациентов для исследования, все молекулярно-генетические методы, использованные в работе, а также критерии анализа полученных данных и методы их статистической обработки.

В данной работе использовались образцы периферической венозной крови пациентов с клиническими признаками СГ (94 человека) и родственников некоторых из них (16 человек), проживающих на территории Петрозаводска. В работе для обозначения этой группы пациентов используется термин пациенты с СГ или больные СГ. Отбор пациентов и забор крови был осуществлен к.м.н. В. А. Корневой (Кафедра факультетской терапии, инфекционных болезней и эпидемиологии, Петрозаводский государственный университет). Пациенты вовлекались в исследование лишь после получения информированного согласия на его проведение.

Всем обследованным пациентам проводился анализ показателей липидного спектра, глюкозы и ЭКГ. Клинический диагноз СГ ставился на основании следующих критериев: уровень общего холестерина более 8 мМ/л (в исследование включали пациентов с гиперлипидемией типа Па и Пб), наличие сухожильных ксантом у обследуемого или родственников первой степени родства и отсутствие заболеваний, приводящих к развитию вторичной гиперлипопротеинемии, таких как сахарный диабет, гипотиреоз, нефротический синдром (Корнева и др., 2013). После обнаружения мутаций у пробандов исследование на наличие генетических дефектов предлагалось пройти и их родственникам.

Для поиска мутаций были использованы стандартные методы анализа ДНК. Выделение ДНК проводилось из замороженной крови по методу Кюнкеля (Kunkel et al, 1977) в модификации Белла (Bell et al., 1981) для небольших количеств крови. Для амплификации отдельных экзонов гена рецептора ЛНП использовали олигонуклеотидные праймеры, синтезированные по опубликованным последовательностям (Hobbs et al., 1992). Для детекции мутации R3500Q (с. 10658 G>A; CGG>CAG) в гене АРОВ был использован метод искусственного создания рестрикционого сайта для эндонуклеазы Msp I в процессе ПЦР в случае нормального, но не мутантного аллеля (Hansen et al., 1991). Для детекции мутации FH-Helsinki использовали мультиплексную ПЦР по схеме, предложенной финскими исследователями (Kontula et al., 1992).

SSCP-анализ проводили на автоматическом секвенаторе ALFexpress II (Amersham Biosciences, Великобритания) с использованием флуоресцентных Су5 -меченных праймеров («Синтол», Москва). Обработку и последующий анализ полученных пиков осуществляли с использованием прилагаемого программного обеспечения ALFwin Fragment Analyzer.

Идентификацию мутаций осуществляли с помощью секвенирования ДНК по методу Сэнгера, осуществленного в компании «Евроген» (Москва). Образцы с делециями клонировали перед секвенированием в плазмиде pBlueScript II.

Анализ полученных после секвенирования последовательностей проводился с использованием компьютерной программы АрЕ-А plasmid editor v.2.0.39 by M. Wayne Davis. Мутации в гене рецептора ЛНП считали новыми, если они отсутствовали в базах данных (URL: http://www.ucl.ac.uk/ldlr, URL: http://www.umd.be/LDLR). Для предсказания эффекта новых миссенс-мутаций в последовательности гена рецептора ЛНП на его функцию использовали программу SiftBlink (URL: http://sift.jcvi.org/www/SIFT_BLink_subrnit.htrnl). Все обнаруженные варианты последовательности, приводящие к изменению рестрикционной карты, подтверждали рестрикционным анализом. В работе были использованы ферменты, поставляемые фирмой «СибЭнизм» (Новосибирск).

Результаты. В результате проведенного исследования было идентифицировано 12 различных мутаций гена рецептора ЛНП у пациентов с СГ из Петрозаводска. Все мутации встречались в гетерозиготном состоянии. Результаты поиска мутаций в гене рецептора ЛНП, а также методы их быстрого тестирования представлены в таблицах 1 и 2. Также у обследованных пациентов было выявлено 6 полиморфных маркеров гена рецептора ЛНП, была оценена частота встречаемости вариантов полиморфных маркеров для жителей Петрозаводска и проведено сравнение полученных данных с имеющимися данными по пациентам с СГ и по контрольной группе из Санкт-Петербурга. Все результаты исследования по полиморфизмам, частоты их встречаемости, а также ферменты для их быстрого тестирования представлены в таблицах 3 и 4. Все полученные данные в работе подтверждены соответствующими иллюстрациями (результаты SSCP-анализа, секвенирования, и ПДРФ-анализа), примеры которых представлены на рисунках 1-3. Мутация R3500Q в гене аполипопротеина В-100 и мутация FH-Helsinki в гене рецептора ЛНП не были выявлены ни у одного из обследованных пациентов.

Обсуждение результатов. В результате проведенного исследования у пациентов с СГ из Петрозаводска было обнаружено 12 мутаций и 6 полиморфизмов в гене рецептора ЛНП Причем семь мутаций (c.l95-196insT, c.192dell0/ins8, с.618 T>G, С.1340 C>G, c,1686del8/insT, c.1936 C>A, c.2191delG) были охарактеризованы впервые в мире, а другие пять (с.58 G>A, c.925-931del7, c.l 194 С>Т, с.1532 Т>С, с.1920 ОТ) описывались ранее в других странах.

Изначально предполагалось, что у жителей Петрозаводска будет выявлено большое количество мутаций, описанных ранее в Санкт-Петербурге, а также, из-за близости финской границы, ожидалось обнаружить мутации FH-Helsinki и FH-North Karelia, специфические для населения восточной Финляндии. Однако единственной общей мутацией, как с Санкт-Петербургом (Zakharova et al., 2005), так и с

Таблица 1 — Мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с диагнозом СГ из Петрозаводска

Экзон гена Название мутации по кДНК Название мутации по белку по старой номенклатуре Название мутации по белку по новой номенклатуре Число семей (число пациентов)

Экзон 1 с.58 G>A G(-2)R G20R KD

Экзон 3 с. 195-196 insT FsV45:D108X FsV66:D129X Ц1)

с.192 dell0/ins8 Fs S44:D108X Fs S65:D129X 1(2)

Экзон 4 c.618T>G S185R S206R 1(1)

Экзон 6 c.925-931del7 FsE287:V348X FsE308:V369X 1(2)

Экзон 9 с. 1340 OG S426C S447C 1(2)

c.1194 ОТ I377I I398I 4(4)

Экзон 10 с. 1532 Т>С L490S L511S KD

Экзон 11 c.l686del8/insT FsW541:L547X FsW562:L568X 1(2)

Экзон 13 с. 1936 OA L625I L646I 2(2)

с. 1920 ОТ N619N N640N 1(2)

Экзон 15 c.2191delG FsV710:V715X FsV731:V736X 1(2)

Финляндией (Koivisto et al., 1192), оказалась мутация FH-North Karelia, выявленная лишь в одной семье (у двух человек) из Петрозаводска. Делеция FH-North Karelia (c.925-931del7, FsE308:V369X [Fs E287:V348X]), нарушает рамку считывания при трансляции и приводит к синтезу укороченного и нефункционального рецептора ЛНП. У обоих пациентов с данной мутацией наблюдались сильно повышенные уровни ХС, что согласуется с накопленными богатыми эпидемиологическими данными в пользу вовлеченности этой мутации в развитие атеросклероза. Примечательно, что среди больных СГ из числа жителей Петрозаводска мы не нашли носителей мутаций G218del, C160G и с.313+Ю>А, которые повторно встречались у больных СГ - жителей Санкт-Петербурга (Захарова и др., 2007; Zakharova et al, 2005).

Мутация с.58 G>A (G20R [G(-2)R]) в данной работе была выявлена у одной пациентки из Петрозаводска. Данная мутация выявлялась ранее у пациентов из Франции (Amsellem et al., 2002), Новой Зеландии (Laurie et al., 2004), Нидерландов (Fouchier et al., 2005), Турции (Sozen et al., 2005) и Австрии (Widhalm et al., 2007) и описывалась как значимая для развития заболевания. Причем аминокислотный остаток глицина в сигнальной последовательности белка сохраняется у многих видов животных, таких как шимпанзе, мыши, крысы, кролики и хомячки. Однако в

Таблица 2 - Быстрые методы тестирования мутаций, выявленных у пациентов с СГ из Петрозаводска

Экзон гена Название мутации по кДНК Быстрый метод тестирования Использованный изошизо-мер ПДРФ варианты

Аллель Размеры фрагментов

Экзон 1 с.58 G>A Утрата сайта для Fau I Fau I G 59+132+44 п.н.

A 59+176 п.н.

Экзон 3 с. 195-196 insT Нет - - -

с.192 dell0/ins8 Утрата сайта для HphI AsuHPI Нормальный 160+36 п.н.

Мутантный 196 п.н.

Гетеродуплексный анализ - - -

Экзон 4 c.618T>G Новый сайт для Sau I Bsell I Т 268 п.н.

G 130+138 п.н.

Экзон 6 c.925-931del7 Утрата сайта для Вес I Beel Нормальный 142+31 п.н.

Мутантный 173 п.н.

Гетеродуплекс-ный анализ - - -

Экзон 9 с. 1340 OG Утрата сайта для Fin I BsIFI С 192+81 п.н.

G 273 п.н.

с. 1194 С>Т Новый сайт для BsrDI Bse3D I С 273 п.н.

Т 210+63 п.н.

Экзон 10 с. 1532 Т>С Утрата сайта для Ас11 Acll т 80+83 п.н.

с 163 п.н.

Экзон 11 dell686del8/insT Утрата сайта для Нае III Нае III Нормальный 76+49+44 п.н.

Мутантный 76+86 п.н.

Гетеродуплекс-ный анализ - - -

Экзон 13 С.1936 0А Нет - - -

с. 1920 С>Т Новый сайт для Tsp5091 Sse91 С 218 п.н.

т 101+117 п.н.

Экзон 15 c.2191delG Нет - - -

Таблица 3 - Полиморфизмы, выявленные в группе из 110 пациентов из Петрозаводска

Экзон гена Название полиморфизма покДНК Название полиморфизма по белку по старой номенклатуре Название полиморфизм по белку по новой номенклатуре Аллель Число аллелей/ общее число хромосом

Экзон 8 с.1171 G>A А370Т А391Т G 207/220

А 13/220

Экзон 10 с.1413 G>A R450R R471R G 145/220

А 75/220

Экзон 11 С.1617 ОТ Р518Р Р539Р С 208/220

Т 12/220

Экзон 12 с. 1773 ОТ N570N N591N с 187/220

Т 33/220

Экзон 13 с. 1959 ОТ V632V V653V с 111/220

т 109/220

Экзон 15 с.2232 G>A R723R R744R G 174/220

А 46/220

Таблица 4 - Методы быстрого тестирования полиморфизмов, выявленных у пациентов с СГ из Петрозаводска, с помощью ПДРФ-анализа

Экзон гена Название полиморфизма покДНК Фермент быстрого тестирования Использованный изошизомер Аллель ПДРФ варианты

Экзон 8 с.1171 G>A Утрата сайта для Stu I StuI G 136+40 п.н.

A 176 п.н.

Экзон 10 с.1413 G>A Утрата сайта для Fin I BslFI G 113+89 п.н.

A 202 п.н.

Экзон 11 с.1617 ОТ Утрата сайта для Act I BspACI С 115+54 п.н.

T 169 п.н.

Экзон 12 с. 1773 Т>С Новый сайт для Hind II HindII T 64+146 п.н.

С 64+36+110 п.н.

Экзон 13 с.1959 ОТ Утрата сайта для Sau961 AspS91 С 136+82 п.н.

Т 218 п.н.

Экзон 15 с.2232 G>A Утрата сайта для Msp I Msp I G 140+21+86 п.н.

А 161+86 п.н.

150:00

180 Ю0

210Ю0

240:00

Рисунок 1 - Выявление образцов с мутацией с.19211е110/т58 (Ре 365:Ш 29Х

544:1}108Х]) в экзоне 3 гена рецептора ЛНП методом 88СР-анализа Стрелками на дорожках 2 и 3 показаны гетеродуплексы и дополнительные однонитевые конформеры в образцах с мутацией с.192с1е110/т58. ЗЭСР-анализ проводился в 10% полиакриамидном геле при температуре 10°С.

Норма СССТААОГООССАСТОСАТС Мутация ОССТААОСОСССАОТОСАТС

Рисунок 2 - Идентификация мутации с.618 Т>С (520611 [518511]) методом секвенирования

Показан результат секвенирования смысловой нити экзона 4 образца ДНК пациента -гетерозиготы по мутации. Под рисунком выписаны нормальная и мутантная последовательности гена рецептора ЛНП, место их несовпадения при наложении на хроматограмме указано стрелкой.

14

12 3 4 5 6 M

»

273 — is Шт bmmi

210 — s WW —200

».: —100

Рисунок 3 - Идентификация мутации с. 1194 С>Т (I398I, [I377I]) методом ПДРФ-анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Bse3D I

В норме сайт узнавания для Bse3D I отсутствует, а при мутации продукты амплификации размером 273 п.н. расщепляются на два фрагмента: 210 и 63 п.н. Дорожки: 1 и 4 - образцы без мутации, 2 и 3 - образцы с мутацией с. 1194 С>Т, 5 -результат ферментативного гидролиза ДНК фага X, эндонуклеазой рестрикции Bse3D I, 6 - образец амплифицированной ДНК, не обработанный рестриктазой, М -маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н. Слева и справа подписаны размеры фрагментов, представленных на электрофореграмме. Электрофорез проводили в 8% ПААГ, окрашивание бромистым этидием.

последних публикациях (Pecin et al., 2013) эта нуклеотидная замена рассматривается как полиморфизм. У нашей пациентки, помимо мутации с.58 G>A, была выявлена мутация FH-North Karelia, связь которой с заболеванием установлена давно. Отец пациентки является носителем мутации FH-North Karelia, но не мутации с.58 G>A, а биохимические показатели атеросклероза у отца выражены значительно сильнее, чем у дочери. Вероятно, мутация с.58 G>A была унаследована от матери, которая по имеющимся у нас данным от гиперхолестеринемии не страдает. Однако ДНК матери для исследования не была доступна. Скорее всего, мутация с.58 G>A является нейтральным, непатогенным генетическим вариантом.

Нуклеотидная замена с. 1194 ОТ (I398I [I377I]) не приводит к изменению аминокислотной последовательности белка и является молчащей мутацией. Причем у жителей Петрозаводска она была охарактеризована у четырех неродственных пациентов, таким образом, встречалась чаще, чем остальные мутации. Ранее эта мутация описывалась также в популяции Австрии (Widhalm et al., 2007).

Мутация с.1532 Т>С (L511S [L490S]) ранее была охарактеризована в Италии и получила название FH-Rome-4 (Cantafora et al.,2006). Данный дефект приводит к замене аминокислотного остатка лейцина на остаток пролина и по данным SiftBlink

является патогенным. Мутация локализована в экзоне 10 гена рецептора ЛНП и нарушает аминокислотную последовательность структуры бета-пропеллера домена, гомологичного предшественнику эпидермального фактора роста. Таким образом, мутация может способствовать нарушению связывания рецептора с лигандом. Данная нуклеотидная замена была выявлена у 56-летней пациентки с сильно повышенными липидами плазмы крови, что также свидетельствует в пользу значимости данной мутации. Однако, для однозначного подтверждения этого предположения необходимо исследование влияния данной мутации на функциональную активность белка.

Мутация с.1920 ОТ (N640N [N619N]), выявленная у брата с сестрой из Петрозаводска, является молчащей заменой. Данная мутация была описана в Испании (Mozas et al., 2004) и Австрии (Widhalm et al., 2007). Интересно, что соответствующая аминокислотная последовательность белка консервативна и у разных видов животных: шимпанзе, макак резус, собак, мышей, крыс и хомячков.

Среди семи новых мутаций, выявленных в гене рецептора ЛНП у жителей Петрозаводска, четыре мутации (c,195-196insT, c.l92dell0/ins8, c.l686del8/insT, c.2191delG) приводят к изменению кодирующей последовательности рецептора ЛНП на число нуклеотидов, некратное трем. Таким образом, происходит сдвиг рамки считывания при трансляции. Как предсказывает анализ нуклеотидной последовательности рецептора ЛНП, при каждой из этих мутаций происходит преждевременная терминация трансляции и образование рецептора без трансмембранного и цитоплазматического доменов, то есть белка, неспособного связать и интернализовать лиганд - апоВ и апоЕ содержащие липопротеины. У всех пациентов - носителей мутаций сдвига рамки считывания были зафиксированы высокие показатели ХС и ХС ЛНП. Можно утверждать, что именно эти мутации явились причиной развития СГ у пациентов. Все мутации были выявлены в разных семьях. Однако три из перечисленных мутаций (c,192dell0/ins8, c,1686del8/insT, c.2191delG) встречались каждая в своей семье повторно. Мутация c.l95-196insT была выявлена у одного пациента, родственники которого в исследовании не участвовали.

Однонуклеотидная замена c.618T>G, приводящая к замене кодона для серина на кодон для аргинина в З'части экзона 4 (S206R [S185R]), была описана у одного пациента с тяжелыми проявлениями СГ. Любые замены в этом чрезвычайно консервативном участке, кодирующем лиганд-связывающий домен рецептора, как правило, приводят к развитию тяжелой гиперхолестеринемии. В норме лигандсвязывающие повторы цистеин-богатого домена рецептора ЛНП несут кластеры отрицательно заряженных аминокислот, необходимых для координации ионов кальция и удержания лиганда. Можно предположить, что замена серина,

аминокислоты с небольшим полярным радикалом, на аргинин с объемной положительно заряженной боковой цепью в этой области рецептора ЛНП будет вызывать мисфолдинг и дисфункцию рецептора.

Мутации c.13400G (S447C [S426C]) и c.l936C>G (L646I [L625I]), также описанные впервые в мире, по данным SiftBlink не являются значимыми. Скорее всего, это справедливо относительно мутации c.1936C>G (L646I [L625I]), приводящей к замене аминокислотного остатка лейцина на остаток изолейцина, в связи со сходством этих остатков. Однако мутация c.1340C>G (S447C [S426C]) приводит к образованию нового остатка цистеина, способного образовывать дополнительные дисульфидные связи в домене, гомологичном предшественнику эпидермального фактора роста, и таким способом влиять на функциональность белка.

Полиморфный сайт c.l 171G>A (А391Т [А370Т]), выявленный в у пациентов из Петрозаводска, также известен как Stu I ПДРФ (Захарова и др., 2007; Vieira et al., 2006). Вариант А данного полиморфного маркера был найден в разных городах в России (Захарова и др., 2007) и во многих странах мира (Южная Африка (Kotze et al., 1989), Канада (Wang et al., 2001), Марокко (Messal et al., 2003), Дания (Brusgaard et al., 2006)). Несмотря на замену аминокислотного остатка при данном полиморфизме, в разных исследованиях было показано, что он не оказывает влияния на уровень липопротеинов крови (Vieira et al., 2006).

Все остальные полиморфизмы, встречающиеся у жителей Петрозаводска, не приводят к замене аминокислотного остатка в белке. Так полиморфизм с. 1413 G>A (R471R [R450R]), являющийся довольно частым вариантом для жителей Петрозаводска, был ранее охарактеризован как BsmA I ПДРФ и встречался в разных странах, в том числе Южной Африке (Warnich et al., 1992), Норвегии (Leren et al., 1993) и России. Другая молчащая замена с. 1959 С>Т (V653V [V632V]), характерная для жителей Петрозаводска, описана в литературе как Ava II ПДРФ и встречается как в европейских популяциях, так и в популяции Китая (Мак et al., 1998).

Полиморфный маркер с.1617 С>Т (Р539Р [Р518Р]) ранее описывался у жителей Санкт-Петербурга как молчащая мутация, так как был выявлен лишь у одного пациента с СГ. В обследованной группе пациентов из Петрозаводска этот вариант генетической замены встречается значительно чаще.

Особый интерес представляет установление молекулярной природы Msp I ПДРФ в 15-ом экзоне гена рецептора ЛНП. В базах данных он упоминается как замена с.2231 G>A (R744Q [R723Q]). Однако, как показало секвенирование образцов ДНК пациентов из Санкт-Петербурга и Петрозаводска, исчезновение Msp I сайта было связано с заменой с. 2232G>A (R744R [R723R]). Эта замена выявлялась в Санкт-

Петербурге со статистически достоверно не отличавшейся частотой, что и в Петрозаводске в данном исследовании.

Полиморфизм С.17730Т (N591N [N570N]), характерный для жителей Петрозаводска, также не меняет аминокислотный остаток белка, однако в литературе есть данные, свидетельствующие о его роли в альтернативном сплайсинге мРНК, приводящей к увеличению нонсенс-опосредованной деградации мРНК. Кроме того, при наличии данной замены было продемонстрировано 25% снижение связывания ЛНП, меченных флуоресцентной меткой. Этот полиморфизм был описан как значимая для развития СГ нуклеотидная замена в разных популяциях (Gao et al., 2013). Интересно, что в группе пациентов из Петрозаводска для этого полиморфизма не выполняется равновесие Харди-Вайнберга. Высокая частота встречаемости редкого аллеля Т данного полиморфного маркера среди больных СГ в Петрозаводске, среди больных СГ и особенно в группе контроля в Санкт-Петербурге все же указывает на нейтральный характер этой замены.

Данные по встречаемости в разных странах мира всех генетических вариантов, описанных у жителей Петрозаводска, представлены в таблице 5.

По результатам данной работы у пациентов с СГ из Петрозаводска было выявлено 18 различных генетических дефектов гена рецептора ЛНП, пять из которых являются миссенс-мутациями, пять сдвигают рамку считывания и приводят к образованию стоп-кодона в белке, одна мутация нарушает сплайсинг, одна является нейтральной аминокислотной заменой и шесть мутаций являются молчащими. Девять мутаций были оценены как патогенные варианты: c.618T>G, c,1340C>G, с. 1532 G>A, c.192dell0/ins8, c.l95_196insT, c.925-931del7, с. 1686del8/insT, c.2191delG и с. 1773 C>T.

Подобранные в данной работе методы быстрого тестирования этих мутаций позволяют провести поиск соответствующих генетических дефектов в гене рецептора ЛНП среди родственников обследованных пациентов с целью ранней диагностики болезни и своевременной профилактики осложнений атеросклероза. Однако большое разнообразие встречающихся мутаций и отсутствие в обследованной группе пациентов мажорных вариантов не позволяет применять эти методы для диагностики всего населения Петрозаводска.

Почти полное отсутствие «финских» мутаций у пациентов с СГ из Петрозаводска согласуется с преобладанием славянского, а не карело-финского населения в этом крупном городе. Только одна мутация оказалась общей для пациентов с СГ из Петрозаводска и из Санкт-Петербурга. Частоты встречаемости вариантов двух из шести выявленных полиморфных маркеров (с.1617 ОТ, с. 1959 ОТ) также отличаются в этих двух группах.

Таблица 5 - Встречаемость найденных в Петрозаводске генетических дефектов гена рецептора ЛНП в других популяциях мира

Название мутации Экзон Встречаемость в других странах

Миссенс-мутации

с.58 ОА (02011 [0(-2)11]) экзон 1 Франция, Австрия, Нидерланды, Новая Зеландия, Турция, Хорватия

с.618Т>0 (820611 [318511]) экзон 4 Новая мутация

с. 1340 Ой (8447С [8426С)] экзон 9 Новая мутация

с. 1532 ОА (Ь511Б [Ь4905]) экзон 10 Италия

с. 1936 С>А (Ь6461 [1,6251]) экзон 13 Новая мутация

Мутации сдвига рамки считывания

с.192с1е110/т88 (Р8Э65: Э129Х [Р5844:Ш08Х]) экзон 3 Новая мутация

с.195_196тзТ (РвУбб: Э129Х [РзУ45:Э108Х]) экзон 3 Новая мутация

с.925-93Ые17 (Р5Е308:У369Х [р5Е287:У348Х]), РН-ЫойЬ КагеНа экзон 6 Финляндия, Швеция, США, Россия

с. 1686ёе18/т&Т (Рэ\У562:Ь568Х |Р8>У541:Ь547Х]) экзон 11 Новая мутация

с.2191 с1еЮ (№731: У736Х [Р8У710:У715Х]) экзон 15 Новая мутация

Мутации, нарушающие сплайсинг

с. 1773 С>Т (N59 Ш [Ы570ТЧ]) экзон 12 США, Китай, Марокко

Нейтральные мутации/полиморфизмы

с. 117Ю>А (А391Т [А370Т]) экзон 8 Южная Африка, Англия, Франция

Молчащие мутации/полиморфизмы

с.11940Т (13981 [13771]) экзон 9 Австрия

с.1413 С>А (Я47т [Я450Я]) экзон 10 Южная Африка, Норвегия, Россия

с.1617 ОТ (Р539Р [Р518Р]) экзон 11 Марокко, Китай, Россия.

р. 1920 ОТ (Ы640Ы [Ы619Ы]) экзон 13 Испания, Австрия

с. 1959 ОТ (У653У [У632У]) экзон 13 Нидерланды, США, Россия

с.2232 ОА (Я744Я [Я723Я]) экзон 15 Россия

В целом спектр мутаций гена рецептора ЛНП у пациентов с СГ из Петрозаводска характеризуется большим разнообразием и уникальностью по отношению к спектру мутаций этого гена у пациентов из Санкт-Петербурга и других городов России.

ВЫВОДЫ

1. Впервые было проведено исследование молекулярной природы семейной гиперхолестеринемии у жителей Петрозаводска. Всего у пациентов с СГ из этого города описано 12 мутаций и 6 полиморфизмов в гене рецептора ЛНП. Семь мутаций охарактеризованы впервые в мире.

2. Мутационный спектр гена рецептора ЛНП у пациентов с СГ из Петрозаводска и из Санкт-Петербурга существенно отличается: на сегодняшний день выявлена только одна мутация, общая для этих двух городов.

3. Все полиморфные сайты, выявленные среди больных СГ из Петрозаводска, встречались также и в Санкт-Петербурге, однако частоты вариантов полиморфных маркеров отличаются в изученных группах.

4. У пациентов с СГ из Петрозаводска практически отсутствуют мутации, характерные для популяции Финляндии, что согласуется с преобладанием славянского, а не карело-финского населения в Петрозаводске.

5. Мутация {<.35000 в гене АРОВ не характерна для населения Петрозаводска, также как и для населения Санкт-Петербурга.

6. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП при СГ в Петрозаводске, как и в Санкт-Петербурге, достаточно широкий, мажорные мутации отсутствуют, а эффект основателя в отношении СГ на Северо-Западе России выражен слабо.

7. Наиболее эффективным способом ДНК-диагностики пациентов с СГ на Северо-Западе России является прямое секвенирование всех кодирующих участков гена рецептора ЛНП и его экзон-интронных границ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как следует из основной части данной диссертационной работы, впервые была обследована группа больных с СГ, проживающих в городе Петрозаводске (Республика Карелия). Работа позволяет сделать два наиболее важных практических заключения. Первое состоит в том, что мутация 113500(2 в гене АРОВ, характерная для стран Средней Европы, чрезвычайно редка или вовсе не встречается у пациентов с СГ в Карелии. Это означает, что при поиске генетических дефектов при СГ в Карелии, также как и в Петербурге, следует сосредоточиться на поиске мутаций в гене рецептора ЛНП, а не в гене АРОВ. Второе практически важное заключение состоит в том, что в Петрозаводске - городе со смешанным населением, не

обнаруживается мажорных мутаций в гене рецептора ЛНП или мутаций, привязанных к отдельным экзонам гена. Следовательно, лучшим методом для ДНК-диагностики СГ в Карелии является прямое секвенирование всех экзонов гена рецептора ЛНП и экзон-интронных стыков, а не сканирование отдельных экзонов этого гена. Чрезвычайно интересным представляется осуществить поиск мутаций в гене рецептора ЛНП в малых городах и поселках Карелии с сохранившимся этническим составом населения. Логическим продолжением исследований станет изучение спектра мутаций рецептора ЛНП в неизученных районах Северо-Запада России: Мурманской, Новгородской и Псковской областях.

Работы, опубликованные по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК:

1 "Финские" мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности - редкая причина семейной гиперхолестеринемии в Санкт-Петербурге и в Петрозаводске / Т. Ю. Комарова, А. С. Головина, Н. А. Грудинина [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 3. - С. 359 - 362.

2 Новые мутации гена рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией из Петрозаводска / Т. Ю. Комарова,

A. С. Головина, Н. А. Грудинина [и др.] // Генетика (Москва). - 2013. - Т. 49, №6.-С. 772-776.

3 Случай семейной гиперхолестеринемии, вызванный новой мутацией Р-Гб 865:0129Х в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека /

B. А. Корнева, Т. Ю. Кузнецова, Т. Ю. Комарова [и др.] // Кардиология. - 2013. -Т. 53, № 5 - С.

Прочие работы, опубликованные по теме диссертации

1. Комплексное исследование семейной гиперхолестеринемии на Северо-Западе России / М. Ю. Мандельштам, Т. Ю. Комарова, А. С. Головина [и др.] // Медицинская генетика: материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14 - 18 мая 2010 г.). - 2010. - С. 109 -110.

2. Сравнительное изучение генетики семейной гиперхолестеринемии в Санкт-Петербурге и Петрозаводске / М. Ю. Мандельштам, А. С. Головина, Т. Ю. Комарова [и др.] // Клинико-лабораторный консилиум. Специальный выпуск: материалы Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященного памяти профессора Евгения Иосифовича Шварца. -2010. -Т. 2-3, №33 -34.-С. 177.

3. Сравнительное исследование семейной гиперхолестеринемии у жителей Санкт-Петербурга и Петрозаводска / М. Ю. Мандельштам, Т. Ю. Комарова [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика: материалы Российского национального конгресса кардиологов (Москва, 5-7 октября 2010 г.). - 2010. -Т.9, № 6, Приложение 1. - С. 202 - 203.

4. Первое исследование молекулярно-генетических основ семейной гиперхолестеринемии у жителей Петрозаводска: перспективы для молекулярной диагностики / М. Ю. Мандельштам, Т. Ю. Комарова, А. С. Головина [и др.] // VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». Сборник трудов / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. - Москва, 2010. - Т.З. - С. 87 - 89.

5. Комарова, Т. Ю. Поиск мутаций у больных семейной гиперхолестеринемией -жителей Санкт-Петербурга и Петрозаводска / Т. Ю. Комарова, А. С. Головина // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10, № 5 - С. 123.

6. Golovina, A. S. Study of mutation spectra in patients with familial hypercholesterolemia from two major cities in North-West Russia: St. Petersburg and Petrozavodsk / A. S. Golovina, T. Y. Komarova I I Eur. J. Hum. Genet.: abstracts of European Human Genetics Conference (Amsterdam, The Netherlands May 28 - May 31, 2011)-Vol. 19, Suppl.2. - P. 453.

7. Golovina, A. S. Comparative study of mutation spectra in North-West Russia familial hypercholesterolemia: St.Petersburg versus Petrozavodsk / A. S. Golovina, T. Y. Komarova // Abstract book of the 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: advances and perspectives" (September, 14-17, 2011, Kyiv, Ukraine). - 2011,- P. 94.

8. Разнообразие мутаций в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией - жителей Карелии / М. Ю. Мандельштам, Т. Ю. Комарова, А. С. Головина [и др.] // Материалы Всероссийского научно-образовательного форума «Кардиология-2012» (28 февраля- 1 марта 2012 года, Москва).- Москва, 2012. - С. 99 - 100.

9. Спектр мутаций в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией - жителей Карелии / Т. Ю. Комарова, А. С. Головина, В. А. Корнева [и др.] // Материалы V Всероссийской конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» / под ред. чл.-корр. РАМН В. С. Баранова. - Новосибирск: «НСК Регион», 2012. - С. 51.

10. Финляндия и Карелия: смежные территории, разные мутации при семейной гиперхолестеринемии / М. Ю. Мандельштам, Т. Ю. Комарова, А. С. Головина [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика Специальный выпуск: материалы Московского международного форума кардиологов (14-15 июня 2012 г., Москва). - 2012 - Т.11 - С. 71.

11. Новые и известные мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперолестеринемией - жителей Карелии / Т. Ю. Комарова, А. С. Головина, В. А. Корнева [и др.] // Материалы Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященного памяти профессора Е.И. Шварца (18-20 июня 2012 г., Санкт-Петербург). - 2012 - С. 110.

12. Комарова, Т. Ю, Сравнительная характеристика спектров мутаций гена рецептора липопротеинов низкой плотности в Санкт-Петербурге и Петрозаводске / Т. Ю. Комарова // Сборник тезисов XVII Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов,- Санкт-Петербург, 2012. - С. 207 -208.

13. Семейная гиперхолестеринемия у жителей Карелии / В. А. Корнева, Т. Ю. Кузнецова, Т. Ю. Комарова [и др.] // Российский кардиологический журнал: материалы Первого международного образовательного форума «Российские дни сердца» (4-6 апреля 2013 г., Москва). - 2013. - №2, Приложение 2. - С. 68 - 69.

Список принятых сокращений

ЛНП - липопротеины низкой плотности;

ПДРФ-анализ - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов;

п.н. — пар нуклеотидов;

СГ - семейная гиперхолестеринемия;

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания;

ХС - холестерин;

ARH - autosomal-recessive hypercholesterolemia;

АРОВ - apolipoprotein В;

LDLR - low density lipoprotein receptor;

FDB - familial defective apolipoprotein B-100;

PCSK9 - proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9;

SSCP-анализ - анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов

ДНК (single-strand conformation polymorphism analysis).

Подписано в печать 18.04.13 Формат 60х841/16 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 19/04 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комарова, Татьяна Юрьевна, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

042013581 99

Комарова Татьяна Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПРИРОДЫ СЕМЕЙНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ СРЕДИ ЖИТЕЛЕЙ ПЕТРОЗАВОДСКА И

САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

д.б.н., доцент М. Ю. Мандельштам

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................12

1.1 Семейная гиперхолестеринемия. Клиническая характеристика заболевания.............................................................................................................12

1.2 Классификация моногенных гиперхолестеринемий...................................15

1.2.1 Рецептор ЛНП........................................................................................15

1.2.2 Аполипопротеин В-100 (Аро В-100).....................................................18

1.2.3 PCSK9.....................................................................................................19

1.2.4 ARH.........................................................................................................20

1.2.5 NPC1L1...................................................................................................21

1.3 Рецептор ЛНП и ген рецептора ЛНП..........................................................22

1.3.1 Клеточный цикл рецептора ЛНП..........................................................22

1.3.2 Структура гена рецептора ЛНП и кодируемого им белка...................25

1.3.3 Регуляция транскрипции гена рецептора ЛНП....................................28

1.3.4 Мутации в гене рецептора ЛНП............................................................30

1.4 Спектры мутаций в гене рецептора ЛНП в разных популяциях................33

1.5 Лечение пациентов с гиперхолестеринемией.............................................43

1.5.1 Ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы (статины).......................................44

1.5.2 Эзетимиб.................................................................................................45

1.5.3 Секвестранты желчных кислот.............................................................45

1.5.4 Новые направления в медикаментозной терапии................................46

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................47

2.1 Пациенты.......................................................................................................47

2.2 Выделение ДНК из замороженной крови....................................................48

2.3 Молекулярное клонирование.......................................................................49

2.3.1 Лигирование...........................................................................................50

2.3.2 Трансформация Е. coli...........................................................................51

2.3.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.....................................53

2.4 Амплификация и анализ ДНК......................................................................55

2.4.1 Полимеразная цепная реакция..............................................................55

2.4.2 Мультиплексная ПЦР............................................................................58

2.4.3 Метод искусственного создания сайта рестрикции с помощью ПЦР. 59

2.4.4 Электрофорез продуктов амплификации ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ).........................................................................................................60

2.4.5 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях..........................61

2.4.6 Электрофорез ДНК в агарозном геле....................................................62

2.4.7 Окрашивание образцов ДНК.................................................................63

2.4.8 Гетеродуплексный анализ.....................................................................64

2.4.9 БЗСР-анализ...........................................................................................64

2.4.10 ПДРФ-анализ..........................................................................................65

2.4.11 Очистка ДНК из агарозного геля..........................................................67

2.4.12 Анализ последовательностей ДНК.......................................................67

2.5 Статистическая обработка данных..............................................................67

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................................71

3.1 Общая стратегия исследования....................................................................71

3.2 Обнаруженные мутации в гене рецептора ЛНП.........................................73

3.2.1 Мутация с. 5 8 О А..................................................................................73

3.2.2 Мутация с.195-196тзТ...........................................................................75

3.2.3 Мутация с. 192 с1е110Лш8.......................................................................76

3.2.4 Мутация с.618 Т>С................................................................................78

3.2.5 Мутация с.925-931ёе17...........................................................................80

3.2.6 Мутация с. 1194 С>Т...............................................................................81

3.2.7 Мутация с. 1340 С>в..............................................................................82

3.2.8 Мутация с. 1532 Т>С...............................................................................83

3.2.9 Мутация с.1686ёе18/тзТ........................................................................85

3.2.10 Мутация с. 1936 С>А..............................................................................86

3.2.11 Мутация с. 1920 С>Т...............................................................................87

3.2.12 Мутация с.2191 с1еЮ...............................................................................88

3.3 Обнаруженные полиморфизмы в гене рецептора ЛНП..............................94

3.3.1 Полиморфизм с.1171 в>А.....................................................................94

3.3.2 Полиморфизм с. 1413 й>А.....................................................................96

3.3.3 Полиморфизм с. 1617 ОТ......................................................................98

3.3.4 Полиморфизм с. 1773 С>Т....................................................................100

3.3.5 Полиморфизм с. 1959 ОТ....................................................................102

3.3.6 Полиморфизм с.2232 в>А...................................................................104

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................109

ВЫВОДЫ.................................................................................................................116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................117

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ...............................................................118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................119

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Семейная гиперхолестеринемня (СГ) - наследственная патология, приводящая к раннему развитию и тяжелому течению сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Сегодня сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности населения в большинстве развитых стран мира, в том числе и в России. Однако показатели смертности от ССЗ среди людей трудоспособного возраста в России являются самыми высокими в Европе и составляют более трети всех смертей [1], причем смертность мужского населения преобладает над смертностью женского населения. В Северо-Западном Федеральном округе смертность мужчин трудоспособного возраста от ССЗ одна из самых высоких по стране и по последним опубликованным данным составляет 47% от общей смертности мужчин за год [1].

Дополнительными факторами риска ССЗ при гиперхолестеринемии являются: артериальная гипертония, ожирение, нарушение углеводного и липидного обмена, а также курение, чрезмерное употребление алкоголя и низкая физическая активность [2]. Некоторые из них можно скорректировать, изменив образ жизни, но не генетическую предрасположенность.

Наиболее частой наследственной причиной ишемической болезни сердца является семейная гиперхолестеринемия, обуславливающая по некоторым данным 5 - 7% всех случаев инфаркта миокарда у пациентов моложе 60 лет [3, 4]. Семейная гиперхолестеринемия - это аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся повышенным уровнем общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности в крови. У пациентов с СГ развивается ранний атеросклероз и его основные осложнения в виде ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда или мозговых инсультов. Чаще всего причиной СГ является снижение скорости катаболизма ЛНП вследствие количественной

недостаточности или дисфункции их специфического рецептора (OMIM *606945), вызванных мутациями в кодирующем его гене.

Небольшая доля случаев аутосомно-доминантной гиперхолестеринемии обусловлена мутациями в гене АРОВ, приводящими к развитию другого наследственного заболевания - семейного дефекта аполипопротеина В-100 (FDB) [5]. Клинически отличить эти два заболевания достаточно трудно, несмотря на то, что общее течение FDB более мягкое. Частота СГ в большинстве популяций составляет 1:500, а частота FDB в некоторых популяциях Средней Европы- 1:500- 1:700 [5].

На сегодняшний день в мире описано более 1000 мутаций гена рецептора ЛНП [6], причем спектр мутаций сильно отличается в различных популяциях и этнических группах. В гене АРОВ у людей белой расы удалось идентифицировать лишь одну широко распространенную мутацию R3500Q (CGG>CAG, g. 10708 G>A).

Эффективная терапия при этих заболеваниях существует и позволяет значительно снизить риск развития атеросклероза и его тяжелых последствий. Но эффективность лечения во многом зависит от того, насколько рано оно было начато, а все основные клинические проявления СГ и FDB развиваются с возрастом [3]. У детей они могут отсутствовать, и даже уровень общего холестерина может быть в пределах нормы. Наиболее ранняя диагностика возможна только с помощью анализа ДНК, который позволяет определить носителей мутаций в генах рецептора ЛНП и АРОВ и провести консультирование среди родственников пациентов.

Степень разработанности темы

Важным фактором, который влияет на эффективность ДНК-диагностики любого заболевания, является наличие информации о типах мутаций, которые встречаются в изучаемой популяции [7]. Несмотря на то, что за рубежом накоплена огромная информация о мутациях в гене рецептора ЛНП [6], в нашей стране такие исследования проведены в недостаточном объеме. Многие

найденные в России мутации гена рецептора ЛНП являются новыми и за рубежом не обнаружены [8, 9, 10], а исследования молекулярной природы СГ проводили только в крупных городах - Санкт-Петербурге, Москве и Новосибирске и не проводили в республиках с этнически своеобразным составом населения. Эти данные свидетельствует в пользу генетических особенностей российского населения и необходимости изучения генетической структуры СГ в разных регионах России.

Цель исследования:

Сравнительное изучение спектра и частоты встречаемости мутаций генов, обуславливающих развитие наследственной гиперхолестеринемии, в двух крупных городах Северо-Запада России: Санкт-Петербурге и Петрозаводске.

Задачи работы:

1. С помощью автоматизированного флуоресцентного анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК и прямого секвенирования отдельных экзонов идентифицировать мутации в группе из 110 пациентов с клиническим диагнозом СГ из числа жителей Петрозаводска.

2. Оценить диагностическую значимость обнаруженных мутаций и полиморфизмов в гене рецептора ЛНП.

3. Определить частоту встречаемости мутации 113500(3 в гене аполипопротеина В-100 у пациентов с СГ из Петрозаводска.

4. Провести сравнение спектра и частоты встречаемости мутаций гена рецептора ЛНП среди пациентов с диагнозом СГ в Санкт-Петербурге и в Петрозаводске.

5. Разработать быстрые методы выявления мутаций с помощью рестрикционного анализа для скрининга мутаций в расширенных выборках пациентов с СГ из Санкт-Петербурга, Ленинградской области и из Карелии, а также у родственников пробандов.

Научная новизна полученных результатов

Впервые в России было проведено исследование молекулярной природы наследственной гиперхолестеринемии среди жителей Петрозаводска. В результате исследования в изученной группе из 110 пациентов было обнаружено 12 мутаций и 6 полиморфизмов в гене рецептора ЛНП. Семь мутаций охарактеризованы впервые в мире. Показано, что ¡угутация 113500(3 в гене АРОВ не характерна для населения Петрозаводска. Разнообразие мутаций и уникальность их спектра указывает на отсутствие выраженного эффекта основателя при СГ у жителей Петрозаводска.

Научно-практическая и теоретическая значимость работы

Теоретический интерес представляет своеобразие спектра мутаций гена рецептора ЛНП, охарактеризованного впервые для жителей Петрозаводска, а также наличие лишь одной общей мутации гена среди пациентов с СГ Петрозаводска, Санкт-Петербурга и Финляндии. Среди описанных мутаций и полиморфизмов ДНК пять приводят к сдвигу рамки считывания, шесть - к аминокислотным заменам, один - к нарушению сайта сплайсинга и шесть были признаны нейтральными заменами. Описана частота встречаемости вариантов полиморфных маркеров среди жителей Петрозаводска и проведено сравнение полученных данных с данными по Санкт-Петербургу.

Практическая значимость работы заключается в разработке быстрых методов выявления генетических вариантов с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции и гетеродуплексного анализа, которые могут быть применены при диагностике заболевания среди родственников пациентов. Своевременное выявление мутаций позволяет начать лечение на ранних стадиях заболевания и избежать атеросклероза и его осложнений.

Методология и методы исследования

Работа опирается на современную методологию анализа генома человека в норме и при патологии и использует такие общепринятые методы исследования

ДНК как полимеразная цепная реакция, конформационно-чувствительный гель электрофорез, клонирование и секвенирование ДНК, рестрикционный анализ.

Положения, выносимые на защиту

1. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП у пациентов с СГ из Петрозаводска отличается от спектра мутаций этого гена в Санкт-Петербурге и других регионах России.

2. У пациентов с СГ из Петрозаводска мутация FsE287:V348X (FH-North Karelia), характерная для восточной Финляндии, встречается редко, а мутация FH-Helsinki, типичная для южной и центральной Финляндии у обследованных пациентов не встречается вовсе.

3. Частоты встречаемости вариантов полиморфных маркеров, характерных как для жителей Санкт-Петербурга, так и для жителей Петрозаводска, существенно отличаются в этих двух городах.

4. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП при СГ в Петрозаводске, как и в Санкт-Петербурге, достаточно широкий, мажорные мутации отсутствуют, а эффект основателя в отношении СГ на Северо-Западе России выражен слабо.

5. Мутация R3500Q в гене АРОВ не обнаружена у жителей Петрозаводска.

6. Предпочтительным способом ДНК-диагностики пациентов с СГ на Северо-Западе России является не скрининг экзонов с помощью метода анализа конформационного полиморфизма ДНК, а прямое секвенирование всех кодирующих участков гена рецептора ЛНП и его экзон-интронных границ.

Достоверность и надежность результатов

Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными. Это определяется точностью и специфичностью методов секвенирования ДНК и рестрикционного анализа. Результаты, полученные с использованием различных методов генетического анализа (гетеродуплексный анализ, ПДРФ-анализ, SSCP-анализ и секвенирование), согласуются между собой.

Количественные данные отражающие различия в частоте встречаемости вариантов полиморфных маркеров у жителей Петрозаводска и Санкт-Петербурга, обработаны статистически с общепринятым уровнем достоверности 5%.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на 13 международных, всероссийских и региональных конференциях и опубликованы в тезисах материалов 13 конференций. Наиболее важные из них:

• VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (14 - 18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону.),

• Российский Конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященный памяти профессора Евгения Иосифовича Шварца (июнь 2010 г., июнь 2012 г., Санкт-Петербург),

• Российский национальный конгресс кардиологов - 2010 (5-7 октября 2010 г., Москва),

• VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (24 - 26 ноября 2010 г., Москва),

• The 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: advances and perspectives" ( September, 14 - 17, 2011, Kyiv, Ukraine),

• European Human Genetics Conference 2011 (May, 28- 31, 2011, Amsterdam, Netherlands),

• Всероссийский научно-образовательный форум "Кардиология-2012" (28 февраля - 1 марта 2012 года, Москва),

• V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий»,

• Московский международный форум кардиологов (14-15 июня 2012 г., Москва),

• XVI и XVII Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов,

• Первый международный образовательный форум "Российские дни сердца" (4-6 апреля 2013 г., Москва.).

По теме диссертации, помимо тезисов конференций, опубликовано 3 статьи в российских научных журналах, рекомендуемых ВАК. Исследование проводилось при поддержке грантов РФФИ № 10-04-00563 и № 13-04-00902, а также грантов администрации Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Семейная гиперхолестеринемия. Клиническая характеристика заболевания

Семейная гиперхолестеринемия (СГ) (ОМ1М #143890) - тяжелое аутосомно-доминантное заболевание, приводящее к развитию атеросклероза коронарных и мозговых сосудов и, как следствие, к ишемической болезни сердца (ИБС), инфарктам миокарда и мозговым инсультам. Биохимически СГ характеризуется повышенным уровнем общего холестерина (ХС) в крови и ХС липоротеинов низкой плотности (ЛНП), и по классификации Фредриксона относится к гиперлипидемиям типа На и, реже, типа Пб [11]. При этом у больных с СГ нередко отмечается нормальный уровень триглицеридов, а уровень липопротеинов высокой плотности (ЛВП