Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование семейной гиперхолестеринемии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование семейной гиперхолестеринемии"

рг6 0д

- — РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

; п ДПР тост* . ------1—

, ^•НШНО-йССВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

МАНДЕЛЬШТАМ Михаил Юрьевич

МОЛЕШЯРНО-ГЕНЕШЧЕСКОЕ ИССВДОВАЖЕ СЕМЕЙНОЙ МПЕРХОШЯЕНШЕМИИ

Специальность: 03.00.04 - Биохимия

А ВТ О Р Е Ф Е Р А Т -диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург • 1993

Раскга выполнена в отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН / директор - академик РАМН Б.И.ТКАЧЕНКО /.

Наутай руководитель: доктор медицинских наук,

профессор В.С.ГАЙЦКОКИ

Официальные оппоненты: доктор биологических неук

Н.Г.НИКУ1НЕВА •

доктор медицинских наук, профессор В.С.БАРАНОВ

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский

государственный университет

Завита диссертации состоится " " 199 г.

» чесов на заседания Специализированного Ученого оовета / К 001,23.01 / по присуждении ученой степени кандидата наук о}» Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться р библиотеке ШИЗЫ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ух. акад. И.П.Павлова, ]£.

Автореферат равослан " " 199 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат беологических наук

0. Г.Куликова

онгля харашшсппа. работы

Актуальность проблемы. Семейная гиперхолеотерянешя /СГ/ -моногенное заболевание человека с аутосомно-дотанантнкм типом наследования. СГ фенотипически вь.пзляется у больных как тяжелая форма гиперлипопротеинемии тппа Па. При гетерозиготной фо-• рме СГ происходит повышение уровня холестерина-в крови-до ¿00600 мг/1О0 мл; "при гомозиготной форме это повышение еще более значительно - до 600 - 1200 мг/100 мл. У больных часто наблюдаются ксан.эш на сухожилиях, липоиднне дуги роговицы. Однако, наиболее тяжелым проявлением СГ является развитие коронарной недостаточности в относительно раннем возрасте. Итемичес- • кая болезнь сердца развивается у гетере игот по'СУ в возрасте до 40 лет, гомозиготы по СГ часто погибают от инфаркта миокарда, не достигая возраста 20 лет / Goldstelre,Brown, 19Ril/»Гетерозиготная ifopMa СГ в большинстве популяций людей белой tacu встречается с частотой 1:50.0, более тяжелая гомозиготная форма СГ наблюдается у одного человека на миллиой новорожденных. Доминантный тип наследования СГ делает ее одним из самых широко распространенных генетических заболеваний человека /coldatein, Brown, 1989/. .

■ Причиной данного заболевания является снижение скорости катаболизма липопротеинов низкой плотности /ЛНП/ вследствие количественной «едсетнточности или дисфункции-их-специфического рецептора /РЛНП/ / Brown, GaldHte.in, .1986/, В 1984 Г была охарактеризована мИЖ / Yamamafro et. а!., 1984/, а в I9&5 г был клонирован хромосомный ген рецептора ЛНП /.. SUdtaT.etа1,,19Я5/ что повлекло за" собой лавинообразное увеличение .числа работ , посвященных характеристике полиморфизма гена РЛНП ичприродных мутаций в этом локусе. Так, на I апреля 1990 г было охарактеризовано 42 различных мутантных аляеля РЛНП, что позволило понять механизмы функционирования РЛНП /НоЫис at- aJi., 1990/. Число новых идентифицированных генетических дефектов РЛНП продолжает расти. С накоплением фактического материала появилась... возмсетость проведения пршМ"й коовённой, основанной на изучении сегрегации ассоциированных с геном РЛНП полиморфизмов длин рестрикцйонных фрагментов /ПДРФ/, ДНК-диагностики СГ. Она в настоящее время проводится в ряде высокоразвитых стран /США,

Канаде, Великобритании, Финляндии, КАР и др./.

Классическим методом диагностики СГ является определение способности фибройластов больного в культуре клеток связывать к катаболизировать ТиШ /Goldstein. et еа., 1983/. Однако , всяедстые дороговизны .подобных исследований они мог:"1 производиться лишь в небольшом числе вксокоспециализированннх центров /iamakawa et al.t 1^88/, таких как КНЦ РАМН в Москве. Вместе с т-ем, ютоды ДНК-дкагностика :*меют свои ..реимущества.. перед названным методом. Оки нз требуют взятия биопсии фибро-блаотов кожи больного, а могуч производиться на материале, получаемом из лейкоцитов. Кроме того, методы ДНК-диагностики характеризуются большой скоростью и надежностью получаемых результатов; при необходимости, как при подозрении на гомозиготную <*орму СГ, он" могут производиться пренатально.

На территории бывшего СССР работ по ДНК-диагностике СГ не производилось.

Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение молекулярных основ СГ в Российской популяции и разработка методов прямой и косвенной ДНК-диагностики СГ. Задачи исследований. В задачи исследования входило:

- получить ДНК-зонда на различные сегменты гена РЛНП;

- изучить Санкт-Петербургскую популяцию больных с типом Па гиперлипопротеинемии на наличие геномных перестроек в локусе РЛНП, выявляемых с помощью .гибридизации по Саузетату;

- оценить частоты встречаемости редких аллелей Щ№2>, выявивши С ПОМОЩЬЮ ре^триктаз I,, Bs.tEII,, Pro и и иео lt и

сравнить их с таковыми, описанными для друг'х популяций Европы и Северной Америки;

- изучить сцегГлзкие ПДРФ гена РЛНП с гиперлипог .ютеинемией типа Па с целью диагностики СГ.

Научная новизна работы. Научная новизна работы определяйся тем обстоятельством, что впервые в популяции кителей СНГ r-. именены метода, ДНК-диагност хи в генетическом анализе ПГ. Описана неизвестная из, литературы делеция, элиминируют экэоны 4-6 ~ена РЛНП. Впервые показана .лолекуллрнач гетеро-ге!шость СГ в популяции кителей Санкт-Петербурга и испо.гьэо еан анализ наследования ПДРФ, ассоцлярованкых с геном РЛНП

для генетического консультирования в семьях с СТ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретический интерес представляет.то.обстоятельство, что CP в популяции жителей Санкт-Петербурга ягляется гетерогенным заболеванием, а также описание новой мутации в локуе PJIHJI, которая, как было показано, ведет к развитию заболевания в двух поколениях. Практическая ценность работы определяется тем, что получении е при анализе наследования ЩРФ i отдельных семьях данные непосредственно применимы для генетического консультирования. Так, в ходе анализа для четырех детей был установлен диагноз ' СГ, для четырех - отвергнут.

Положения, выносимые на защиту.

1. ПГ в популяции .жителей Санкт-Петербурга - гетерогенное по своей молекулярной природе заболевание. По меньшей мере четыге ■ типа мутаций ведут к развитию фенотипа СТ..в.исследованной популяции.

2. В семье больной А.Д. заболевание вызвано пр.гяженной деле-цией размером 5 т.п.н., элиминирующей экзоны 4-6 гена РЛЩ1.

р . Л двух семьях к развитию фенотипа СГ ведут точкопые мутации; заболевание в какдой из семей сегрегирует с определенными гап-лотипами ПДРФ гена РЛНП, что позволяет пост .вить или отвергнуть диагноз.СГ у детей пробанда.

4. Частоты встреча ' гости редкого аллеля ППРФ для рестриктаэ ' Saq i,. Betjui,..Jeo -I- в ■ популяции■ жителей Санкт-Петербурга не отличаются значимо от.частот, наблюдаемых у людей белой раса Европы и Северной Америки. Частота редкого аллеля Рта и ПДРФ в популяции жителей Санкт-Петербурга существенно, ниже /на уровне значимости 0,01/ частоты этого аллеля в итальянской популяции. . '

Апробация работы. Работа докладывалась на Всесоюзных конференциях "Биохимия - медицине" /29 ноября - Т декабря 1ЭДЯ г, г. Ленинград/ и "Современные•направления создания, медициноких даагностикумов" /13-14 декабря ТЭД8 г, г. Москва/; на Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" /12-1В мая 1990 г, г. Ленинград/. Тезисы работы были опубликованы в Трудах Второго Всесоюзного съезда медицинских генетиков /4-6 декабря 1990 г, г. Алма-Ата/, работа также была представлена в

виде стендового сообщения на I и П Всесоюзных конференциях по генотерапш /Киев, июнь 1989т и июнь 1990 г/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописною текста и включает раздели: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов" и "Выводы". Диссертация содержит 27 р;:сунког и 8 таблиц,- Список литературы включает ЦЗ источников, из них 6 работ принадлежат отечественным авторам и 107 - зарубежным.

1. ПОЛУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЗОНДОВ К 'ГЕНУ РЛНП

Исходным материалом для получения ДНК-зондов для гибридизации с геномной ДНК больных послужила плазшда p¡LDLR-3 * ' содержа' 1я полноразмерную кДНК РЛНП человека. Эта плазшда была получена для популяционных исследований от профессора Д. йассела /Университет штата Техас, США/ и передана нам академиком А.Н.Климовым. Плазмида рхшл-з не мог.ет быть непосредственно использована,в опытах по гибридизации, так как мРНК РЛНП в своей 3' нетранслируемой области содержит три копии умеренно повторяющихся в геноме последовательностей семейства Alu. Кроме того, гибридизация полнодлинной кДНК с -рестрикционными фрагментами тотальной геномной ДНК для большинства рестриктаз дает слишком трудно интерпретируемую картину ввиду того, что из-за большой длины гена РЛНП образуется много гибридизующихся фрагментов разной молекулярной .,.ассы. Поэтому в i лчестве проб на 5' и 3' концы г.ена РЛНП были использованы суб£рагменты плазшда pLDLR-3

Для поиска геномных перестроек в 5' концевой и центральной частях гена плазмиду рцэьв-з обраб- ткваля рестпи^тазами Eind XIX и, Bgí, ХТ. При этом плазмида распадается на два фрагмента. Для гибридизации с геномной ДНК использовали меньшей ц-рагмент размером 1,7 тысяч пар нуклеотидов /т.п.н./, который «одержит последовательности экзонов I - II гена РЛНП /нуклеотиды .-Ш+Г70Я последовательности "^ДНК", здесь и далее нумера'чя ну..леотидов кДНК по Xamamo-to et al'.., , 1984/. Пои гидролизе шшрчиды pLDLK-з рестркктазой ЗанШ образуется чотгре впдпмкх' после электрофореза в агарозе фрагмента

АИК;" к'.'.ейглх размеры I, Г т.п.н., 1,7 т.п.и. ,.1,3 т.п.н. и 2,Я т.л.я. Для кде>'тк']икпдай я»» I: ' полиморфизма использовала ф-ратенг''размером Г, С т.п.н., содержащий последовательности •• экзоиов 1-8 гена Ы1Ш /нуклеот..дн -13"+ 1081 кДНК/. Для иден-та4«ка/{.,д.полиморфизмов дяяи реерккдвояккх «-атштов /ЩР- •/ . „ "и поиска гьп.о! их перестроек в 3' концевой-части гена' РЛШ выделяли БшяШ фрагмент размером 1,9 т.н.н., вклотаюязЯ после. дователыюсти экзо-ов 10 - Тв.гсна Г- 1П /нуклеотидн +157Ь+34?6 кДПК/. О цель» его "дополнительной очистки от фрагмента размером 1,7 т.п.н., несущего последовательности семейства АЗц , клонировали интересующий нас фрагмент в векторе - ВаиН1 фрагменте рхлзьн-з. размером 2,5 т.п.н. 'Рекг-чбшгантов отбирали гибридизацией колоний с меченный о6-[°2р]-дезоксицитядинтрйфос-Датом с помощью статистического праймера Вв-^ш фрагментом

рШЬй-З размером 1,9 т.п.н. Из полученной рекомбинантной пла—.....

змидн, названной рВшпКГ > производили препаративное выделение ВашНХ- Фрагмента размером '1,9 т.п.н.' для гибридизации с геномной ДНК.

2. поиск шкмих перестроек в локусе рлнп новая делешя в гене рлнп •

Поиск геномны:: перестроек в локусе РЛНП производили у больных с гиперяипопрогепкешей-тапа Па, отобранных таким образом, чтобк он удовлетворяли хотя бы одно:^у из двух кгдаеря- • ев: I/ в семье больного в двух поколениях должны быть родственники,' страдающе атеросклерозом коронарных Сосудов; 2/ у больного имеются подкожные ксаит'оми ил;: ясак:омы сугояатй в сочо- . таяки с гирерлипопротеннемией типа Па.. Кровь от больных с'гп-перяипопротганемией типа Па била предоставлена нам профессором Б.М.Липовецким /клиника'центра "Мозг"/.

Анализы по определению содержания лнппдов плазмы ктчта бкли виполнетм на аппарате Техников АА-2 сотрудичкамл отдела биохида* ИЗМ РАМН.

ДПК от 20 неродственных пшр.еятов с гиперллпопу-огоннттеч типа Па для поиска делений и инсерцяй в 5'-положив гена Ш1П обрабатывали рсстркктпзой.ВяйН! " к гг.бркдизовплн с ДШ£-г>ондо?\ . опецнйичмкм для экзоиов I — Т1 этого гена. Гибридизация гена:*-

ной ДНК, полностью гидролхзованной рестриктазой ВалП с пробой на б'-половину гена обнаруживает три фрагмента, хорошо разделяющихся при гель-электрофорезе, а именно: 16 т.п.н,, 5,5 т.п.н., 2,2 т.п.н. У больной А.Д., однако, в дополнение к названным Фрагмента? присутствовал .фрагмент раздором ii т.п.н., кч обнаруженный ни у кого из IS остальных пациентов и у здоровых доноров /см. рис. I/. Б 5'-области гена РЛШ не било описано полиморфных са!_;ов дл: рестриктазы ВаюШ . у здорово!! дочери больной А.Д. данный фрагмент такие отсутствовал. Чтобы исключить возможность часто встречающихся артефактов гибридизации, мы воспроизвели данный результат в пяти гибридазациопнкх опытах на двух независимо выделенных препаратах геномной ДИК. Кроме того, ДНК бол: 'ой А.Д. обрабатывали другими ферментами рестрикции для исключения небольшой вероятности того, что ВагМ - фрагмент размером I¿ т.~.н. является все ке редким полиморфным вариантом. Результаты гибридизации суммированы на рис. 2. Использование любого кз перечисленных на рис. 2 ферментов приводят к обнаружению при блот-гибридизации дополнительных фрагменто1" необычной. молекулярной массы, несущих последовательности гена IV.НИ. При гидролизе ДНК больной А.Д. ферментом Kpnl , наряду с присутствующим у друг"х бо; ьных и здоровых «"wob их cene'; едкнетвен-нш Фра^-ментом размером ¿I т.п.н., наблюдается фрагмент размером .16 т.п.н. На основании рассмотренных наблюден V. мо;?.но сделать вквод, что, по всей видимости, у бо-ьной А.Д. имеется деления в центрально:" части гена РЛ1Ш протяженностью сголо 5 тли. н. К.рп I сайт в интроне 2, очевидно, сохранен, в то время как Bglu И - с-лЧт в интроне 3 в мутантном гене определенно утрачен. Этим обстоятельством и определяется воз'нкновение рестрикцяон-Horoagi и-фрагмента размером 16,5 - 17 т.п.н. в .езультате "слияния" двух Bg.Hl- Фрагментов размером и 8,5 т.п.и., не' поспедственн"1 прилежащих друг к другу в структуре гена, за вычетом ; элецви про- икенностыо .5 т.п.н. Вся совокупность данных, nf .¿ден"'1Х на рис. 2, совместима то ко с "редставле!!'-^.< о наличия делеция в центрально" части гена РЛНП. Левая граница др-лецпл лежит мегпу к.рп Г сайтом в 'интроне и Bgi ti -сайтом в интроне Г, а правая - между сайтом для рестриктазы stu I в . t~ .rroue 5 и Ее о КС -сайтом в интроне 6. Гибридизацией с экро:' -

BamHI

Рис. Т. Гибридизация по Саузерну геномной ЛПК, обработанной 'рестракта-. ЗОЙ BaraHI .

ДНК гкбмдизовали с зондом на эк-зоны I - II гена РЛНП /ВДдЛ III-Sgl II фрагментом размером I,7 т.п.н. плазми-ды t>LMä-3 /. Семья больной А.Д.: I -ДШ< здоровой дочери; 2 - ДНК больной А.Д. На дооожке 2 видно присутствие необычного фрагмента размером II т.п.н., не встречающегося у здосовы'х доноров. Лпары слева указывают длину маркерных ... рестрикциокнк;: фрагментов в"т':п."н. В • гтчестве марке га использована дмк tiara Л, гидгюлизованная реетшктазой Hind III » '

23

- ы

9,4 —'

6.7

4,4 —

' a«r if - t

4- '

2,? —

в» «я»

1 2

специй"чнь:ми 'пробами мг показали, что экзон 3 сохранен в составе мутантного гена, а экзо:- 6 удален делецией. Сходная с об-, нарушенной наг® деления описана в канадской популяции. В му-тантном аллеле, названном РН Vancouver-6 отсутствуют экзо-ни 4 - 6 гена РЛНП, однако, канадская делеция захватывает - и ЕоойТ-сайт в интроне б, и находящейся в 3* направлении от £сой1 сайта Xhol-сайт в том же интроне и,.таким образом, имеет. отличную от описываемой нами новой делеция, по крайней мере правую границу. Делеция больной А.Д. не затрагивает EcoRI сайта в интроне 6.

Описанная мутация, удаляющая_экзонн 4 ~ б гена РЛНП, как мк мокем предполокить, исходя из структуры, этого гена, должна приводить к образованию аялеля, кодирующего правильно сплайск-руемую мРНК без сдвига рамки считывания, так кок кодирующие последовательности- прерваны -нитронами после первого нуклеотиде

Ъ '5 6 7 6 $ ю тг

I

i

3

тг

л1_и

* у

I I 1<

-5-1

<В1.П.К.

Дл-на рестрикнйовнах фрагментов в т.п.в.

Здоровые доноры

£еоК1 3.5 4,8 Ват Н1 16

ВеНI £.5

Л Крп1 ¿1

5рИ1 9,5+М 5Ьи1 &,Ь

А. Д. У

И

16 9

ю,5

Рис.2. Новая делецпя в гене РЛНП.

На физической карте част:: гэкз РЛНП экзояк показаны чернт".'., а нитроны - белым цветом. Цифры 2-12 - номера экзонов. • Волнистая, лпяея обозначает границы делец...:. Размер фрагментов гет., образ\гэдг.хся под действием различных ферментов рестрикции у здоровы:' доноров и у больной А.И., несущей;мутантный аллель, указана в правой частя рисунка в т.п.!.. Звездочками отмечены*сайты для рестриктаз, находящиеся в кодирующей последовательности.

I

со I

кодонов аминокислот. Поэтому удаление трех экзонов не должно нарушить трансляции и мутантная мШК, по-видимому, способна направлять синтез укороченного белкового продукта, не содержащего большей части лиганд-связыващего домена. Нарушения структуры в этой области белка'могут приводить к нарушению его созревания и транспорта на клеточную-мембрану /многие точковые мутации/,.или, - не влияя на процесскнг и- транспорт .белка, вызывать сникение способности РЛГО к связыванию лиган-да /некоторые протяженные делецки/.

Идентификация молекулярной природы наследственного дефекта в семье больной А.Д. дает возможность дНК-дяагностики у ее детей. Как видно из табл. I, у дочери больной А.Д. гипер-холестеринемки нет, в то. не время она не унаследовала мутант-ного аллеля /см. рис. I/. Особое значение имеет проведение диагностики для сына больной А.Д., так как у муячин рзссматри- • ваемое заболевание протекает тякелее,-чем у'женщин. Диагностика, основанная-только на анализе содержания липидов в плазме крови, у детей иногда не позволяет однозначно судить о перспективах развития у них гяперякпидешя. Своевременно поставленный диагноз предоставит возможность принять меры превентивного характера, направленные на предотвращение развития заболевания у ребенка, в первую очередь, путем корректировки даеты.

Лечение, больной А.Д. препаратом МетаСог /ловастатином,-мевиножном/ не приводит к значительному снижению холестерина плазмы крови. Обращает на.себя внимание еще одно интересное-обстоятельство." ИГ," отец больной А.Д. , и её бабушка по отцовской линии /см. рис. З А, табл. V имел:! не только, гкперхоле-стерянешю, но и страдали облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей, выражающимся у больного К. з тяжелой перемежающейся хромоте, и йшемическоЯ болезнью сердца. У больной А.Д. в возрасте 30 лет нет типичных проявлений ишемичес-кой болезни сердца, а велоэргометрическая проба не выявляет -'характерных проявлений коронарной недостаточности, несмотря на то, что переносимость пробы низкая. В то же время больная А.Д. имеет типичную гхперллпопсотеинемяю. типа-Пая кёантомы сухожилий. Причину.данного несоответствия между клиническим и биохимическим фенотипами мк, усматриваем не только в. возрасте боль-

;1ипада плазмы крови членов семьи больной А.Д. / се;..¿я I /. Соответствующая родословная приведена на рис. За.

Таблица I

Пациент Возраст - Хрлестернн Триглице- Холестерин Холестерин . Примечание

лет мг/100 мл РИДЫ . ЛВП ДНП

мг/100 мл кг/100 мл мг/100 мл

I. И., 42 421 84 .36 10,7 368 Страдал тяжелой пере-

отец 46 512 " 90 48 9,7 446 межающейся хромотой,

больной облитерируюцим атеро-

А. Д. склерозом артерий нижних конечностей Умер в возрасте 46 лет от инсульта

2. АД. 31 388 66 6? 4.8 308 . Имеет ксантомы на сухожилиях

3. А., 5 148 37 . 96 0,5 45

дочь 8 158 44 96 0.6 . 53

А. .Д.

Холестерин ДНП / мг/ЮО мл / определяли по формуле Холестерин ШШ = Общий холестерин - триглицериды Коэффициент атерогенности / Ка / определяли: Ка

- холестерин ЛВП _ Общий холестерин - холестерин ЛВП

Холестерин ЛВП

0-

О

-ОС 5.И.

-О

л. и.

г. А.д.

О ^

г.—

ШЪь.А.

Б

Та цТ

Ь^ЕН

А/соГ

- Рис.3, Родословные больных гиперлипопротеинемиёй типа Па. :

В родословных крузками показаны лвда женского пола, квадратами - мужского. Символы, обозначающие пациентов .с гиперлипопротеинемией типа Па. наполовину затушеваны. Символы, обозначающие умерших.членов семей, перечеркнуты косой линией. Д.. Семья больной А.,Д. / семья I /. *

ДНК сына больной А!.Д. не была исследована по решению матери, и неизвестно, унаследовал. он делещш в гене РЛНП или нет. ■

Б. Семья больного В.Ш. / семья 2 /.- '

Около, символов, обозначающих членов семьи, указаны ЩРФ гаплотипы для . ресгриктаз Тао1 ,ЬзСЕД иИео1 сверху вшэ соответственно. Знак "+!' обозначает присутствие полиморфного сайта узнавания для соответствующей рестриктазы, знак "-" - отсутствие полиморфного сайта. Видйо, что дочери больного В.Ш. ¿-наследовали от отца разные аллели гена РЛНП, В. Семья больного Э.К. / семья 4 /.

. Обозначения те же, что и на рис. ЗЬ. Видно, что дети больного Э.К. унаследовали от отца разные аллели гена РЛНП. -

и

Ь-1

ной, но и в в!,-соком уровне холестерина ЛВП, препятствующем развитию атеросклеротического поражения сосудов. Коэффициент

• атерогенности у отца больной А.Л. много выше нормы, у больной Л.Л. - приближен к норме, а у дочери он значительно ниже /см. табл. I/, Следует предположить наличие неал'лельного по отношению к гену РЛНП гена или генов-модиаиккторов, присутствие которых- может в значительной мере способствовать более Ыягкому протеканию заболевания. Роль индивидуальных особенностей в развитии атеросклероза показана даже в случаях гомозиготной СГ, когда ишемическая болезнь сердца может не раз-виватьс г даже до зрелого возраста /lamaehita et al., 1986/.

3. ИЗУЧЕНИЕ П0ЛИМ0РШЗИ0В ДЛИН РЕСТРИКЩОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА РЛНП

ДНК 20 пациентов с гиперлипопротеинемией типа Па переваривали. рестриктазами, имеющими полиморфные сайты в 3»-части гена РЛНП, а именно: Еса9>1 I (efiatE II)/BamH2., Рте II, Ысо I и рестриктазой laq. I , имеющей полиморфный сайт в 5' половине гена РЛНП. Для выявления ПДРФ в Зг части гена РЛНП фрагменты ДНК гибридазовалй на нейлоновых мембранах с клонированным BamHJ фрагментом плазмзды pLDLR-з /рНашШ / размером 1,9 т.п.н. / - зондом на экзоны 10 - 18 гена РЛНЦ/. Гибридизация с зондом на 3» часть гена РЛНП при использовании любой из трех -рестриктаз, имеющих полиморфные сайты в этой части гена, выявляет полиморфные и инвариантные фрагменты днк, но не обнаруживает кзких-либо фрагментов днк необычного молекулярного веса, которые могли бы возникнуть в результате геномных перестроек в локусе'РЙШ. Таким образом, инсерций и делеций в 3» части гена найдено не было.

Наследование гаплотипов ЦДРФ гена РЛНП, определенных с . помощью трех рестриктаз, lag I, BetE II, Ысо I , было изучено в тр^.х родословных с гиперляпопротеинемией типа Па. В семь больного В.Ш. /семья 2/ младшая из двух дочерей имеет признаки гиперлипопротеинемии типа Па /см* рис. 3 Б, табл. 2/,Кроме

• того, у нее обнаруживаются пястно-фаланговые сухожильные ксан ТОТ.1Ы. Как можно видеть из рис.ЗБ, она унаследовала от отца хромосому с редким аллельнкм вариантом полиморфизма для рес-

Таблица 2

Лигшды плазмы крови членов семьи больного В.Ш. / семья 2 /. Соответствующая родословная приведена на рис. 36. .

'Пациент Возраст Холестерин Триглице- Холестерин Ка Холестерин • Примечание лет мг/100 мл риды ЛВП / ЛНП . '

. . мг/100 мл мг/100 мл мг/100 мл

I. В.Ш. 58 . : 285 127 37 ; 6,7 222 На фоне длительно-

го лечения препара- 1 .том МеваКор

. . ' 40 кг/день

2, * 53 /192 129 38 ; 4.0 128

3. 31 !187 . 64 60 2,1 114

4. 15 - 306 67 49 : 5,2 244 Имеет пястно-фа'

19 272 39 51 : 4,3 213 ланговые сухо-

жильные ксантомы

\ Холестерин ЛНП и коэффициент атерогенности мечанш к таблице I. ■

/ \ / определяли как описано в при-

триктазы Ысо1; здоровая дочь унаследовала другую хромосому с часто встречающимся аллельным вариантом для той же рестрикта-. зы. Таким образом, на основании совместного наследования ги-перлипопротеинемии и сцепленного с геном РЛНП маркера, можно' сделать предположение о наличии в данной семье не просто нас- , ледственной формы гиперлипопротеинемии, а именно семейной ги- . перхолестеринемии.

Больше информации дают разветвленные родословные. В семье 3 два родных брата умерли в 33 и 37 лет от инфаркта миокарда /см, рис. 4, табл. 3/. Кроме того, у кивой сестры отца двух умерших братьев присутствуют все признаки тяжелой формы гиперлипопротеинемии типа Па. Анализ наследования маркеров в гене РЛНП показывает, что "изучение наследования з&я 1 и Ысо I ЦП РФ не информативно, в то же время признаки гиперлипопротеинемии сегрегируют совместно с редкг" аллелем для рестриктазы и. Все трое больных детей и сестра умерших братьев имеют хромосому с редко встречающимся аллельным вариантом для рестриктазы Вв-йЕ II. Анализ ПЙРФ вместе с клиническими данными в этой' семье позволяет поставить безошибочный диагноз семейной гипер-холестеринемии.

В семье больного Э.К. /семья 4;-см. рис. 3 В, табл. 4/ , . анализ Наследования Яад I полиморфизма указывает на то, что оба ребенка получили от матери один и тот. же аллель гена РЛНП. Следовательно при отсутствии кроссинговера внутри гена РЛНП оба ребенка должны унаследовать от матери один и тот же' аллель вайв'и и. Кссс Iполиморфизмов. Действительно, один и тот'же часто встречающийся аллель Вз-ке и полиморфизма и- сын,' и дочь . наследуют от-матери. В этом'случае они наследуют от матери и • часто встречающийся аллель Пса I ПДРФ. Таким образом, можно заключить, что дети унаследовали от больного отца разные ал-.лелныс® хПДРФ, а именно: дочь унаследовала часто встречающийся, а сын - редко встречающийся■аллельный вариант. Наряду с тем, дети не проявляют признаков гиперлипопротеинемии. В данной семье анализ сцепленного с геном РЛНП нейтрального маркера-по-. зволяет отвергнуть диагноз СГ., Возмогло, что в этой семье мы имеем дело с вариантом аполипо'протеина.В-ЮО, дефектным по связыванию с рецептором, что мокет приводить к имитации фено-

'0-

r-+

i—

о

5+| + +1*

а

а ~ - f

V

' 3

о

6 -

3 -

Тле I Ncol

3"

H-1-

Рис,4. Наследование гаплотипов 1шрф в семье 3.

Все обозначения'такие же, как и на рис.ЗБ, Генотипы умерших членов семьи выведены из генотипов их детей! я заключены в квадратные скобки. Видно, что в данной семье заболевание наследуется совместно с редким аллелем ЩРФ для рестриктазы BstEfi /batEU + гашхотипом /.

Таблица 3

. 1йазш крови членов семьи 3.

^ШШЯЯЗрЩай родословная приведена на рис. 4.

Паци&нт 1 Ж ' ь Ш&тъш Ш/100т Триглице-рдда мг/ юОмл Холестерин ЛВП мг/100 мл Холестерин Примечание ЛНП ■мг/100 мл

I. 53 454 94 60 ' 6,6 375

2. • 32 471 ■ 123 33 33,3 413 Умер в 33 года от

- V повторного инфарк-

та миокарда

3. 31 572 .286 . 34 15,8 481 Умер от инфаркта

• • миокарда в 37 лет

4. 31 362' ' 150 • 38 8,5 . 294

5. 36 152 50 58. Х.6 84

6. 41 • 216 ' 86 62 2,5 137

7. 10 270 62 42 5,4 216 На строгой диете

8. 8 174 77 48 2,6 III

9. II 225 47 69- 2,3 147

Ю. 10 285 67 44 5,5 228

II. 10 ¡254 134 • 23 10,0 204

Холестерин ЛНП и коэффициент атерогенности / Ка /. определяли как описано в примечании к таблице I. . •

: ' Таблица 4.

:Л;цц1ДЫ плазма крови членов семьи больного Э.К. /!оеыъя 4 /; Соответствуздая родословная приведена на рис. Зь, !

Пациент Возсаст Холестерин, Триглпце- Холестерин Холестерин Лрлмечакле •

лет . щ/ЮО мл : Риды лвп

мг/100 мл мг/100 мл мг/100 мл

т. 71- 216 ? 108 56 : 2,9 138

2. Э.К, \ 48 . 346 ; 1 . 113 26 ; 12,3 297 1йеег погкокные

) гсантомы

3. 48 199 5 ■ 53 66 . 2,0 .122

4. ; 14 ' ; 192 73 38 4,0 139

' 18 178 ; 79 38 ; 3,7 124

5. Ю \ . 225 : 74 59 ; 2,8 151 '

14 • 204 ■ 89 42 3,9 144

Холестерин ЛНЛ и коэффициент атерогенноети / Ка / определяли как описано в прдае-чан.-Л к таблице I.

типа СТ.

В процессе исследования членов семь ¡i больных СГ определили частоты аллелей четырех Ш1РФ для рестриктаз Taq I, SatE II, tro ii, Коо i в небольшой выборке, включающей как здоровых, так и больных СГ пациентов. Сравнивали частоты редких аллелей этих ДДРФ в популяции жителей Санкт-Петербурга с таковыми , указанными для популяций, в которых данный полиморфизм бил ранее описан /см. табл. 5/.

Сравнивали выборочные параметры hj = ^i/nj и h2 = k2/n2 , где Hj и п^ соответственно число изученных хромосом в популяции кителей Санкт-Петербурга и в популяции, с которой проводили сравнение, кх и кг число хромосом с редким аллелем Щ.РО в тех же популяциях, bj и ь2 - частоты редко встречающегося ал-леля ПЕР®. Проверяли нулевую гипотезу о равенстве параметров даух биномиальных распределений. В предположении правильности нулевой гипотезы объединяли данные обеих выборок: п^ + n2» п и kj + kg » к. и вычисляли ь = k/n-. Использовали аппроксимацию биномиального распределения нормальным /Глотов и др., 1982/:

, ~ /bL-íL/ - Х/2а

U - -Г1............. ...... _---~ Ы, (О; I)

V hCI - íó ^/a-j. ■» I/n2).

Формула применима при условии, что. 5 и r^Ci-h»5, где i= I, 2. Это приближение позволяет, вычисляя иэкеп по приведенной формуле, построить критерий значимости, основанный на нормальном распределении, так называемый и-критерий /Глотов, и др., 1982/. Если/иэксп/< ц*/2 - нулевая гипотеза принимается, если/иэксп/> и„у2 - отвергается на уровне значимости*. Так как иэксп Для b«te Пи кто i полиморфизмов /см. табл. 5/ ' меньше 1,64 = uq 05' т0 следУет принять нулевую гипотезу и констатировать, что' частоты аллелей названных ПДРФ не отличаются от наблюдаемых в европейской и североамериканской популяциях и в популяции белого населения ЮАР. Для Taq I полиморфизма U = 2,820 больше табличного значения для и 0 00п = =2,58 , поэтому нулевая гипотеза отвергается на,Г* уровне значимости. Таким образ; м, частота редко встречающегося алле-ля 2aq I полиморфизма достоверно значимо меньше таковой, определенной в Японии. Меньшая частота встречаемости редкого алле-

Таблица

Сравнение частот встречаемости редклх аллелей ВДРО гена РЛНД в Санкт-Петербургской других популяциях

Поли-; - Санк?- -Петербургская 1 Популяцуя, с которой проводил:: Ц

корфизм ПОПуТЯЩИ! сравпенле

' "ч V ; Популяция пг ■

- 40 оде Белые ЮАР Т°0 0,08 _ X

'Японская 134 0,33 2,820. ;

bstE.il ' Белые СЛА 20 0,13 -

44 0,23 .Белые ЮАР 120 •0,20 0,377

Белые 40 .0,25 0.151',

"уцЦ . 40 0,125 Белые ЮАР 120 :о,31 2,265 ' '

Английская 150 0,25 1,644 ,

■ Белые США 123 0,24 1,497 ; ;

. Исо! Итальянок 5 256 0,37 3,025 ;',

59 ,32 ; Белые ВАР 120 0,33 0,059 *

■ Английская 117 0,26 0,799 1

' Белые США 123 0,28 0,518 -

.:рдуечание: п1 и пг - число изученных хромосом в Санкт-Петербургской популяции популяции, с которой проводили сравнение соответствию; Я, и 1г2 - частоты встречаемости редкого аллеля ЩРФ в те" же попуг

ляциях соответственно; - значения

условие п^Н^З

не могут быть вычислены,так как не выполнено

ля Eaqi ПЯРФ, нежели описанная в японской популяции, наблюдается у американцев Северной Америки /0и у белого населения Ш.Р /0,("»8/, Очевидно, что при сравнении нашей выборки с _ данными популяциями достоверных различий не будет выявлено, однако, формула для сравнения частот аллелышх вариантов будет неприменима, так как не будет выполнено условие nth } 5 и ni;''1 ~ Частота редкого аллеля Fvuir тшщк&ша в по-

пуляции зрителей Санкт—Петербурга достоверно /на уровне значимости 102/ не от яг. .ается от таковой для популяции кителей США и на уровне значимости / % Q2ñ ~ í»9®/ не отличается от частоты, определенной в популяг-и Англии /и зксп = T,644<I,S6 - табличного значения для уровня значимости/. Частота редкого аллеля ívull П2РФ достоверно /на Г/ уровне значимости/ в Санкт-Петербургской популяции меньше таковой, определенной в популяции жителей Италии. Наконец, не мокет быть сделано заключение об отсутствии отличий в частоте редкого, аллеля Pvull ГШ.РФ между популяцией белых жителей ЮАР и Санкт-Петербургской популяцией, так как и0<П25 = 1,96 < «эксп = 2,265 <«0>005= = 2,58 и результат считается неопределенным.

Итак, нами изучена структура гена РЛНП у 20 пациентов с гиперлипонротеинемиеЛ типа Па. Бала выявлена одна деления, не описанная ранее в литературе. С определенной долей осторожности моено заключ: :ь, что, по-видимому, доля крупных геномных перестроек составляет не более всех случаев СГ в популяции

телеГ. Санкт-Петербурга. Это наблюдение, согласуется с .данными, жузучечт?© для популяций Англия /Horathcmke. et alr, 19 У/ и апг.лолзичнаг канадцев /banglois et al., ISñí/. Только в отни-Heciai изошрошшшх популяциях тгжкх, как понулшгая франкоязычных канадцев / Jiobba et al., 198?/ и популяция цнннов Финляндии /Aalte-Setaia et al., 1988/, в силу г.-ТГекта основателя ЪгюеДеяеикнЯ ш делепяй обуслаплпаст соответственно и й'.у£ всех случаен СГ. Далее, нами бкло показано, что в семьях 2 и 3, как «окно видеть из рпс. 3 Б и 4, заболевание сегрегировало с разными гаплоткпагди ríJU'S, а именно с BsfcEri~HcoI~ к Bí)tElif'KcoI+ гаплотипг .га. -Кроме Toroj в изученной выборке больных готерлипоггротеиненпей гипа Па имелись гомозиготы по

часто встречающимся аллелям ва*вп и Ксо1 полиморфизмов, то есть пациенты со следующим генотипом ВДРФг Вв£ЕГГ"* Ыс-оГ"1'/

Ысо1? Таким образом, по меньшей мере три гаплотипа едрф определяют СГ в популяции кителей Санкт-Петербурга,' то есть по меньшей мере три точповые мутации в гене РЛНП являются причиной СГ. По-видимому, в основе СГ у жителей Санкт-Петербурга лежит тожество различных мутаций в гена РЛНП. В семьяс 2 и 3 с помощью изучения трех ЦДРФ для реетрикгаэ 1ащ1 Ветх и ы^оГ ' оказалось возможном проследить косегрегацию заболевания и определенного гаплотипа ЦЩРФ и подтвердить диагноз СГ, основанный на результатах анализа липидов крови.

ВЫВОДЫ

I. На основе ллазмидн ризы?-?, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП, получены ДНК-зонды на отдельные группы экзонов гена РЛНП человека, которые были использованы для выявления крупномасштабных терестрор.'с гена-РЛНП у больных"гиперлипопротеияеш-ей типа Па - кителей г. Санкт-Петербурга п для определения ЦДРФ гена РЛНП..

'2. При анализе структуры гена РЛНП в группе из 20 больных гиперлипопротеинемией типа Па обнаружена одна делешя протяженность» 5 т. п. н., элиминир, щая акзонн 4-6 гена РЛНП, которые кодируют часть ЛНП-связываищего домена РЛНП. Эта деления по протяженности и внутригенной топографии отличается от всех описанных ранее делений гена РЛНП у больных СГ. В семье о СГ прослежено наслегование делении гена! РЛНП.

. 3. По данным анализа гаплотипов' ПДРФ, сцепленных с мутант-ними аллелями гена РЛНП, семейная гиперхолестеринемия в популя- ' ции Санкт-Пе* ер^урга ассоциирована, по меньшей «ере, с тремя . гаплотипами гена РЛНП: ЕяйЕ11~;(то1+„ Вв^1"11со1~, Ва1;Е1Х+НсоГ+, Эти результаты свидетельствуют о наличии группы мутаций /по-видимому, точковнх нуклеотидных замен/ в гене РЛНП, вызывающих СГ в данной популяции. . •• .....

4. В репрезентативных семьях проанализирована косегрега-ция полиморфных маркеров гена РЛНП и биохимических и клинических проявлений СГ. ........ - ""' .

5. Частоты аллелей 13ДРФ гена РЛНП, выявляема* с помощью

нескольких рестриктаз, в изученной популяции Санкт-Петербурга не обнаруживает статистически значимых отличий от величин, полученных для популяций Европы и Северной Америки, Частота редкого аллеля Haql ЦДРФ в популяции Санкт-Петербурга существенно ниже /на уровне значимости 0,01/ частоты этого пллеля в японской популяции. Частота редкого аллеля Brail -ЩРФ в популяции Санкт-Петербурга существенно ниже /на уровне значимости 0,01/ частоты этого аллеля в итальянской популяции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маяделыиам М.Ю., Сасина Л.К., Липовецкий Б.М. Исследование семейной гиперхолестеринемии с помощью молекулярных ДНК-зондов // Биохимъя - медицине: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. 29 ноября - I декабря 1988 г. - Л., 1988. - C.I30-I3I.

2. Мандельштам М.В., Сасина Л.К., Гайцхоки B.C. Конструирование молекулярных зондов для диагностики семейной гиперхолестеринемии // Современные направления создания медицинских диагностикумов: Тез. докл. Бсесовз. науч. кон$. 13-14 декабря 1988 г. - М., 1988. С. 102..

3. Мандельштам М.Ю., Сасина Л.К., Шварцман А.Л. ДНК-да-агностика семейной гиперхолестеринемии // Биополимеры и клетка. - 1990. - ¡i I. -' С.56-63. ' .

4. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л. Изучение семейной гиперхолестеринемии с помощью ДНК-npoö // Труды Второго Всесоюзного съезда медицинских генетиков, Алма-Ата, 4-6 декабря 1990 г. - М., 1990. - С. 283.

5. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Идентификация новой делении в гене рецептора липо-протеинов низкой плотности человека у- пациента с семейной та- ' перхолестеринемией // Биополимеры и клетка. - 1991. - Я 3. -

С.38-45.

6. И. J«., Lipovetskyí H,M.¿. Schwärt zroan ¿.I.., ffiaitekhoki V,.a* A, navel deletion in the low density lipoprotein receptor gene in a patient witlt familial hypercholesteroleT mía. from ¿ateraburg //> Human Mutation. - 19Ш* -'Vol. 2,12 ,

/принята к печати/. •