Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование генетической коррекции наследственных заболеваний

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование генетической коррекции наследственных заболеваний"

•ТЗ 0:1

российская академия медицинских наук

¡¡Л/ЧШНЮСЛЕДОВЛТЕЛЬШШ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

на правах рукописи

ДОЛЖАНСКАЯ Наталья Борисовна

МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЛ КОРРЕКЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Специальность: 03.00.0'! - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-ПетерОург 1994

Рабата выполнена в отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАНН (Директор - академик РЛМН И.И.Ткаченко)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Н.С.Гайцхики

Официальные олпонентк: доктор биологических наук,

профессор 11. 11. Копии

кандидат биологических наук Л. II .Перевоз никои

иецуггл* учреждение: Научно-исследовательский институт

физиологииим им. акад. Л.Д.Ухтомского, Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита диссертации состоится "Я 'Ср^^МА 199'1г. и часов

на заседании специализированного Ученого совета К 001.23.01 при Научно исследовательском институте экспериментальной г.едмдиин РАИН но адресу: 1 7376, Санкт-Петербург, ул.акад. Павлова, И'..

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИУМ РЛМН по адресу: 197370, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан " " 19 9'1г.

Ученый секретарь Омециализнроваиного совета, кандидат апологических наук

0. Г. Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительный прогресс в области молекулярной биологии, вирусологии, технологии рекомбинантных ДНК и картировании генома человека определил основы для нового направлении Стомсдицииских исследований - соматической генной терапии. Этот подход имеет своей целью предупреждение и лечение наследственных и приобретенных заболеваний. Существует большое количество наследственных заболеваний человека, которые представляют собой потенциальные объекты для такого рода исследований. Более 4500 заболеваний человека классифицируются как генетические (McKusick, 1908).

Н настоящее время существуют два основных подхода к генной терапии заболеваний человека. Это прежде всего так называемая генная терапия ex vivo, представляющая собой многоступенчатый процесс, который включает трансплантацию генетически модифицированных аутологичных клеток. Menee разработанный, но теоретически более эффективный подход к генной терапии состоит в непосредственном кг,ano чаи необходимого генетического материала в клетки in vivo (Friedman, 1989). Генетическая терапия требует не только введения чужеродных последовательностей ДНК в эукариотические клетки, но также их стабильной и регулируемой экспрессии в новых условиях, а следовательно создания адекватных векторных систем переноса и экспрессии (Wilson, Grossman, 1992).

И настоящее время семейная гиперхолестеринемия (СГХ) и недостаточность альфа-1-антитрипсина (ААТ) являются относительно распространенными наследственными заболеваниями человека, молекулярные основы которых изучены достаточно хорошо.

СГХ - это моногенное наследственное заболевание человека, в основе которого лежит нарушение экспрессии и функционирования рецептора липопротеинов низкой плотности человека (рЛНП), что в свою очередь ведет к развитию коронарной недостаточности в относительно раннем возрасте (Goldstein, Brown, 1909). В большинстве популяций частота встречаемости гомозиготной формы составляет 1:1000000, а гетерозиготной 1:500.

Недостаточность ААТ - заболевание наследуемое по аутосомно-рецессшшому типу, его клинические проявления связаны с ранним

развитием эмфиземы легких или цирроза печени, преимущественно is детском возрасте. (J основе заболевания лежит нарушение секреции А основного ингибитора сернистых цротеаз, в кровоток, которое проявляется и резком снижении его концентрации в плазме кропи (Drantly el al., i908). Частота встречаемости данного заболевания варьирует от 1:1000 до 1:2Ь00 в различных популяциях Европы и Северной Америки (Crystal et al., 1909).

Представляется интересным дальнейшее развитие подходов к генш терапии СГХ и недостаточности АЛТ путем моделирования их генетической коррекции на различных клеточных системах и путем создания трзнсгешшх животных.

Дели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка подходов к созданию модельных систем генетичеа коррекции СГХ и недостаточности ЛАТ и моделирования этих заОолеваи на клеточном уровне. Б задачи исследования входило:

- создание реконбинантиых ДНК, содержащих нолноразмерные кДНК рЛ11 и АЛТ человека под контролем зукариотических промоторов и анализ v экспрессии в гетерологичных животных клетках.

- получение стабильно трансформированных клонов животных клеток, эксирессирующцх pJHIJI человека.

- изучение действия антисмыслових олигонуклеотидов на синтез эндогенного [ЛИИ человека и на синтез эндогенного ЛАТ человека.

Положения выносимые на защиту:

1. Показана временная экспрессия гена pJIHII человека в клеточной линии L9i!'j (фибробласты мыши).

2. Получены стабильно трансформированные клеточные клоны (исходная клеточная линия - СИОЬАЗ - клетки яичника китайского хомячка), эксирессирующие рЛПП человека.

3. Создана рекомОинантиая ДНК, содержащая полноразмерную кДНК ААТ человека, и проверена ее экспрессия в клетках СИОЬАЗ.

'1. Показано ингибирующие действие антисмысловых олигонуклеотидов и эндогенный синтез рЛНН и ААТ человека в клеточной линии НерОЗ (гепатоциты человека).

5. Создана антисмысловая конструкция кДНК рЛНН, использованная в экснерпнента:: но получению трансгенных животных. Показано, что полученные трансгепнне животные содержат в своем геноме

антиснысловые последовательности кДНК рЛНН.

Научная новизна работы. Выполненная работа посвящена разработка подходов к созданию модельных систем генетической коррекции сеиейнш 1'пигрхолестеринемии и недостаточности альфа-1-антитринсина, а также попытке сознания генетических моделей данных заболеваний.

Проблема переноса генов с целью генетической коррекции заболеваний находится на ранних этапах своего развития. Поэтому, представляется актуальным реализация первого этапа ее решения, зак.мшчаинцегося в создании модельных систем генетической коррекции н VI ' ГО 1< III vivo.

На у чно-лрактнческое значение полученных результатов: ). Полученные рекомбинантние ДНК могут быть использованы в качестве зондов при проведении диагностики наследственной недостаточности ДАТ.

<'. Создание векторных молекул, экснрессирующих рЛНН и ЛАТ человека г животных клетках дают возможность изучения терапевтического действия рекочбннпнтннх pJIHII и ЛАТ в экспериментах на лабораторных животных. .!. Изучение действия антисмысловых олигонуклеотидов на синтез эндогенных белков (pJIHH к ААТ) в клеточных культурах открывает пути создании генетических неделей СГХ и недостаточности ЛАТ,

Апробация. Результаты работы были доложены I и II Всесоюзных конференциях по гепотерапии (Киев, июнь 1989г. и июнь 1990г.); на Всесоюзной школе-семинаре " Молекулярная биология и медицина " ficta мая 1990г..р.Ленинград). Тезисы работы были опубликованы в трудах Пторсга Всесоюзного съезда медицинских генетиков ('!-& декабря 1990!'..г.Алма-Ата) и конференции " Молекулярная биология и нелиципп", (Москва, 1990). По теме диссертации опубликовано 7 работ и t находится в печати.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах и состой- из введения , обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 20 рисунками. Список литературы 1ЖЛ1ТПОТ НИ) источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Моделирование генетической коррекции семейной гиперхолестеринемии.

Одной из возможных моделей генной терапии СГХ может быть создание и экспрессия в клеточных культурах таких генноинженерных конструкций, которые синтезируют рЛНП независимо от концентрации холестерина в клетке, среде или кровотоке и активируются ионами металлов, гормонами либо другини физиологическими факторами (УШбоп.ШЭО, ОгоБтапп 1992). В данной работе нами была предприня' попытка разработки клеточной модели генетической коррекции СГХ с помощью генноинженерных конструкций, экспрессирующих функционалы! активный рЛН11 человека в клетках млекопитающих. С этой целью, созданная ранее в нашей Лаборатории и любезно предоставленная Н.Ю.Мандельштамом конструкция рМБУЬ, использовалась нами в экспериментах но трансформации животных клеток линии Ь-929 (Фибробласты мыши) методом кальций-фосфатной преципитации. Данная конструкция (рис.1) содержит полноразмерную кДНК рЛНИ под контрол< гибридного промотора, состоящего из 21-нуклеотидных (нт) повторов промотора обезьянего вируса '10 (БУЮ) и двух 72 нт повторов, представляющих собой энхансер из длинных концевых повторов (ЬТК) вируса саркомы Молони (ИЗУ). Анализ временной экспрессии проводил! через '(0 часов после трансформации методами дот- и блот-гибридизаи РНК из трансформированных клеток, а также методом иммунофлуоресценции с использованием ноликлоналышх моноспецифических анти-апоВ любезно предоставленных Л.С.Кузнецовым (отдел Биохимии, НИИЭМ РАМН). Дот- и Слот-гибридизацию РНК из трансформированных клеток проводили с мечешшк

32

по Р фрагментами кДНК рЛНП. Анализ РНК в проведенных эксперимента} показал наличие в трансформированных клетках мРНК рЛНП человека (рис.2). В нетрансформированных контрольных клетках мРНК рЛИН человека не обнаруживается. Это позваляет сделать вывод о том, чте трансформированных клетках имеет место транскрипция введенной кДНВ рЛНП человека и образование нолноразмерной мРНК рЛНП, размером 15.; т.н. Далее для определения функционально активного рЛ1111 на поверхности трансформированных клеток был проведен иммунофлуоресцептный анализ с использованием ноликлоналышх моноснсцифичсскнх анти-аиоВ полученных имнунизацией кроликов

ШМИ£Г1

,/НП кЗ)НК

Р

Ч лиь ТьДЩ МША]--

Рис.1 Структура генетической конструкции рМБУЬ

288— 183—

•5.3Т.Н.

12 3 4

Рис.г Влот-гиОридизация РНК трансформированных и контрольных клеток. РНК наносили в количестве 10 мкг. Источники: 1, I - трансформированные клетки; 3 - контроль трансформации; '1 - контроль на экспрессию эндогенного рецептора.

ЛИII человека, с последующей их очисткой на ЛНП-сефарозе и меченных флуоресцеинизотиоционатом (фИ'1'Ц). Для анализа иммунофлуоресценции ЛНП-рецепторы живых клеток связывали с Л НИ (конечная концентрация нкг/нл). Затем клетки фиксировали и инкубировали с анти-ано11 Параллельно с опытом осуществляли контроль на трансформацию (клетк обрабатывали кальций-преципитатом без ДНК); контроль на неспецифическое связывание антител (отсутствывала обработка клеток ЛИП); контроль на синтез эндогенного рецептора (клетки, не подвергшиеся трансформации, инкубировали с антителами). На рис.За видно наличие интенсивно флуоресцирующих клеток, подвергшихся трансформации рЛНП-кДНК. Интенсивность люминисценции отдельных клеток измеряли с помощью микрофлюориметра МЛ~4. Данные, получении с помощью иммунофлуоресцентного анализа просчитаны по критерию Стьдента-фниера. Мы получили статистически достоверное (1X0.01) возрастание интенсивности люминесценции после трансформации клето! Соответствующие неличины (условные единицы): н опыте Х=14.13±1.04; при контроле трансформации Х=10.4110.42; при контроле синтеза эндогенного рецептора Х=9.52+0.53.

Данные иммунофлуоресцентного анализа позволяют говорить о том, что в результате экспрессии экзогенной кДНК рЛНП человека в Ь-клетках мыши, образуется и интегрируется в наружную плазматическую мембрану функционально активный рЛНН, эффективно связывающий ЛН11 человека. При этом распределение интенсивности люминесценции отдельных клеток в опыте и в контроле трансформации позволяет говорить о том, что в популяции трансформированных клеток не тольк возрастает средний уровень люминесценции связанных с клетками фИТЦ антител, но и появляется субпопуляция клеток с очень высоким уровт люминесценции, которая, по-видимому, соответствует трансформированным клеткам, содержащим большое количество молекул рЛНН человека. Полученные результаты свидетельствуют о функциональной активности экспрессируемой плазмиды рМЭУЬ, содержат полноразмерную кДНК рЛНП, и о возможности ее полноценной экснресси) с синтезом белка рЛНП и его интеграцией в наружную иенбрану гетерологичных трансформированных клеток. Одним из радикальных пуп лечения СГХ могло бы быть введение нормального гена рЛ1Ш в клетки больных СГХ и обеспечение его стабильной и эффективной экспрессии 1 клетках-мишенях.

Рис 3. Иммунофлуоресцентннй анализ клеток: а -трансформированные клетки; б - контроль трансформации.

Т.П.Н

' - ■ ■■ -'; ^ " " * „ V * Г„ Г'1 "Г "Ял, Я", Гь- : к* С »

* <■>" - - 1 ■ : ; _ V * * | г . - » ■ . ■■ ■■ .

0.54

1 2 3 4 5

Рис.4 Электрофорез продуктов полинеразной цепной реакции. Источники ДНК: 1 - ДНК фагаДносле расщепления рестриктазой НпкШ!; 2,3 - С-ИО-резистентнне клоны; 4 -рИЗУЬ; 5 - нетрансфорнировашше клетки СНОЬАЗ.

а

Поэтому, дальнейшим шагом в нашей работе явилась попытка получения стабильных клеточных клонов, экспрессирующих рЛНИ человека. Такие клеточные клоны могли бы послужить основным критерием адекватности предложенной нами модели генетической коррекции СГХ. В экспериментах но получению стабильных клеточных клонов мы использовали генетическую конструкцию рМйУЬ, полученную ранее и проверенную на функциональную активность в опытах по временной трансформации.

Эта конструкция была введена методом кальций-фосфатной копреципитации с плазмидой рБУгпео, содержащей ген устойчивости к антибиотику С418, в культивируемые клетки яичника китайского хомяч (СНОЬАЗ). После отбора устойчивых к антибиотику клеточных клонов м; провели анализ ДИК, выделенной из полученных клопов на наличие в н нуклеотицных последовательностей, специфичных для кДНК рЛНИ. Метод нолимеразной ценной реакции (рис.4) мы обнаружили в отобранных клонах последовательности кДНК рЛНН человека.

При анализе экспрессии кДНК рЛНН методом блот-гибридизации РНК мы обнаружили наличие в тотальной РНК, выделенной из отобранных клонов, продукт транскрипции размером 5.3 т.н., соответствующий полноразмерной мРНК рЛНИ. Данные иммунофлуоресцентного анализа (рис.5), проведенного с использованием мышиных моноклоналышх антител 1е<5С7 (АтегБПат) к рЛНП человека, подтвердили наличие экспрессии рЛНП человека в стабильно трансформированных клетках яичника китайского хомяка (СНОЬАЗ). Полученные результаты говорят возможности получения гетерологичных систем, экспрессирующих белки необходимые для коррекции ряда наследственных заболеваний человека

2. Моделирование генетической коррекции недостаточности АА'Г.

Специфические методы терапии недостаточности ЛАТ должны быть основаны на заместительных введениях в организм нормального ЛАТ ил! радикальной генной коррекции первичного дефекта гена ААТ. Оба подхода требуют создания генноинженерных конструкций, обеспечивающ! адекватную и эффективную экспрессию гена ААТ в гетерологичных клетках.

В связи с этими соображениями мы сконструировали рекоибинантну! ДНК, содержащую иолноразмерную кДНК ААТ под контролем промоторных 1

Рис.Ь Иммунофлюоресцентннй анализ стабильно трансформированных клеток, экспрессирующих мРНК pJlHII человека.

F.coRI

EcoRI

Amp

Xba

Hind in

Hindui

Рис. Ь. Схема получения генетической конструкции pCMVAT

энхансерннх элементов цитомегаловируса и исследовали ее экспрессию гетерологичннх животных клетках - клетках яичника китайского хомяч: (СН01.АЗ). При получении генетической конструкции, названной нами рСМУАТ и использованной в экспериментах по трансформации мы изолировали ЕсоВ! - Шп(1Ш фрагмент, размером 1,3 т.н. плазмиды ро1АТЗ, любезно предоставленной А.Л.Шварцманом, содержащий полноразмерную кДНК ААТ. В процессе конструирования мы лигировали этот фрагмент с ЕсоЕ1 - ШпйШ фрагментом плазмиды рСИУсаг, содержащим промоторные и энхансерные последовательности цитоиигаловируса (рис.6).

Следующим этапом явилось выделение рекомбинаптной ДНК рСМУА'Г в препаративных количествах и трансформация ею клеток линии СНОЬАЗ, культивируемых на среде ПАМ'БПг с 10* эмбриональной сывороткой. Трансформацию осуществляли методом кальций-фосфатной преципитации : затем переводили клетки на бессывороточную среду. Временную экспрессию ЛАТ анализировали через 48 часов после трансформации методом нинупоблотинга на мембранах НуЬогк! фирмы

Рис. 7. Иммуноблотинг тотальных белков трансформированных клеток 1. - ААТ человека; 2. - трансформированные клетки; 3. - нетрансформированные клетки; 4. - культуральная среда трансформированных клеток

и

Лшег;!ыга с использованием поликлоналышх кроличьих антител к ЛАТ человека при последующей обработке антителами против кроличьих иммуноглобулинов, коньюгированных с пероксидазой. Гель-электрофорез белковых продуктов из трансформированных клеток и их бессывороточной культуральной среды проводили по методу ЬаепШ (ЬаепШ,1970). В качестве отрицательного контроля использовали ^трансформированные клетки, в качестве положительного - очищенный ААТ человека, любезно предоставленный М.М.Шавловским.

В результате проведенной трансформации СНОЬАЗ клеток и имнуноблотинга белковых продуктов удалось выявить наличие в трансформированных клетках и бессывороточной культуральной среде белковой зоны с молекулярной массой около 53 кД, которая соответствует молекулярной нассе природного гликозилированного ААТ (рис.7).

Эти результаты позволяют сделать вывод о наличии временной экспрессии ААТ человека в трансформированных гетерологичных клетках. При этом клетки СНОЬАЗ способны к синтезу реконбинантного ААТ, его носттраислпционному гликозилированию и секреции в среду культивирования.

Помимо изучения экспрессии ААТ в гетерологичной системе, мы провели ряд опытов по обнаружению экспрессии эндогенного ААТ в культуре синусоидальных эндотелиальных клеток печени человека (СЭК). В результате проведенных экспериментов, методом иммупоблотинга тотальных белков с использованием поликлоналышх кроличьих антител к ААТ человека, мы показали наличие белковой зоны с молекулярной массой около 53кД, которая соответствует молекулярной массе природного гликозилированного ААТ.

Это позволяет предположить, что СЭК, по-видимому, синтезирует эндогенной ААТ. Известно, что СЭК играют значительную роль в поддержании нормальной функции печени, обеспечивая секрецию белков и гормонов в кровоток (Ыагатига 1989).

Данине результаты позволяют предположить также возможное участие синусоидальных эндотелиальных клеток печени в поддержании нормального уровня ААТ в кровотоке.

3. Моделирование семейной гинерхолестеринемии и недостаточно альфа-1-антитрипсица

Одним из способов моделирования генетических заболеваний являются системы, в которых роль негативных регуляторов генной экспрессии выполняют антисмысловые нуклеотидные последовательно! Б качестве основного метода моделирования СГХ и дефицита ЛАТ мы использовали подавление эндогенного синтеза рЛНП и ЛАТ в клетках линии Нс-рОЗ (гепатоциты из генатоклеточной карциномы человека) антпсмыслосымн олигонуклеотидами.

Б целях изучения действия антисмысловых олигонуклеотидов на синтез эндогенного рЛШ1 человека в клеточную линию НерОЗ был вис антисмысловой олигонуклеотид: 5'-СССАТССТС-3', перекрывающий инициирующий кодон кДНК рЛНП.

Методом иммунонреципитации, с использованием мышиных моноклиналь антител ¡(¡СС7 к рЛ1111 человека (ЛтегзИат) было показано нрактичес

кР

160- ••<

I 2

Рис.0 Лвторадиография синтезированных de novo и меченни З53-метиопинон белков из культуры НерСЗ клеток: 1 -контрольные интактные клетки; 2 - клетки обработанные антисмысловым олигонуклеотидом к кДШ< рЛНП;

полное ннгибирование эндогенного синтеза рЛНИ в клетках, обработанных антисиысловын олигонуклеотидон по сравнению с контрольными интактннми клетками (рис.8). Гель-электрофорез белковых продуктов, синтезированных do novo и меченных 35-3-метионином проводили согласно Laemli (Laemli,1970).

!)тот факт открывает дальнейшие возможности для создания генетической модели СГХ у трансгенных животных путем введения в зиготу аптисмысловых генноинженерных конструкций, содержащих кДНК pJlllll.

На рис.!) представлена схема получения антисмысловой конструкции pBRLM к |)ЛШ1 человека. 1) качестве исходной плазмиды для получения антисмнсловых копий РНК рЛНН нами была выбрана плазмида pLDLR3, включающая полноразмерную кДНК рЛНП. Плазмида pLDLK3,содержащая все К) экзоноп гена рЛ1Ш человека, была любезно предоставлена докторами Л.Гольдштейном и И.С.Брауном (Центр здравоохранения Университета штата Техас, США) и передана в наше распоряжение академиком РЛНН А.Н.Климовым. Участок, ограниченный сайтами BamHl, содержал последовательность 5' нетранслируемой области и инициирующий кодом ATG. Этот участок мы использовали в качестве последовательности для создания антисмысловой конструкции. Предварительно фрагмент BamHl-ISamHl (1.18 тыс.п.н.) был клонирован в плазмиде рВК322. Полученная рекоибинантная плазмида была обозначена как pLKBll (рис.9). Среди промоторов активно функционирующих в клетках печени, мы выбрали промотор гена металлотионеина (МТ) (Hammer 1905) Генетические конструкции, включающие этот промотор, активно экспрессировались как в культуре клеток печени, так и в печени трансгенных животных даже без специфической индукции ионами кадмия (Kalmiter 1983). С другой стороны, выбор промотора гена ИТ продиктован тем обстоятельством, что он содержит акцепторный сайт Bglll, позволяющий клонировать в нем I) л in 111 1!лтН1 фрагмент 5' концевой области кДНК рЛНП (рис.9). Образование слитого сайта ВашШ-DglII и наличие ассимметричного сайта KuoKt позволили определить ориентацию вставки фрагмента кДНК ¡¡JillII по отношению к промотору методом рестрикционного гидролиза.

Полученная нами антисмысловая конструкция была использована для создания трансгенных животных. Б результате введения данной пллзмидм, истодом микроиньекции в оплодотворенные яйцеклетки кроликов, Ондн получены животные, содержащие в своем геноме

ХЬо

Рис. У. сгена получения антиснмеловой конструкции кДНК рЛНИ человек

последовательность кДНК рЛНН человека, что показано истодами полимеразпой цепной реакции ДИК (рис.10), выделенной из клеток крови.

Результаты дот-гибридизации ДНК трансгенных кроликов с 5* концевым фрагментом кДНК рЛПП (0,02 т.п.н.), в качестве зонда, так* свидетельствуют в пользу того, что полученные животные содержат в своем геноме введенную антисмысловую генетическую конструкцию.

1! рамках моделирования недостаточности ЛАТ мы провели изучение действия антиснислоиых олнгонуклеотидов на синтез эндогенного ЛАТ челопека. Для этого в клеточную линию НерйЗ были введены 5 различны антиг.мипловмх олигону клеотида (рис.11):

б^тслсслилслсссссстст-з1 - на декодирующую облясть, перекрывает сайт сплайсинга (позиции - -5/+И)

у-о/ ЛПАСОаСАТТитсстТССЛЛСАСЛ-З' - перекрывает сайт сплайсинга 1! АТС ко/юн (позиции 5361-6375) Ь'-СЛОЛЛСЛООССЛТТСТССЛ-З' - (позиции 5350-5377)

1 2345 6789 10

Puc.iO Электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции ДНК кроликов. Источники ДНК: 1-7,10 - ДИК кроликов, родившихся после тгьецнроиания плазниды pBHLM. 9 - ДНК контрольного кролика; 8 -ДНК плазниды ptiKLM

У -ATG0AC(jGCCTGGAGGGGAGA(j-3' - перекрывает сайт сплайсинга между

нитроном '1-экзоном 5 (позиции 9946-9967)

^'-САГОССТАЛАСССТТСЛТ-З' - перекрывает два АТС (позиции 7547-7564).

1) качестве дополнительного контроля был использован смысловой

контрольный олигонуклеотид (позиции 5358-5377)

Методом иммуноиреципитации с использованием поликлоналышх

кроличьих антител к ААТ человека с последующим гель-электрофорезом

белковых продуктов, синтезированных de novo и меченных'о-метионином

было показано, что наиболее сильное ингибирование эндогенного

синтеза АА'Г наблюдается в случае введения двух олигонуклеотидов

одновременно (рис.12, дорожка 7), один из которых перекрывает сайт

сплайсинга (позиции 5358-5377), а второй комплементарен участку,

включающему два ATG (позиции 75'17-756'1). Ингибирование в меньшей

степени наблюдается в случае антисмыслового олигонуклеотида на

границу нитрон 4-экзон 5 (позиции 9946-9967) (рис. 12, дорожка 8).

Смысловой олигонуклеотид, добавленный к клеткам в качестве контроля

не ингнбирует синтез ААТ.

А/п'пеннслосой олигонуклеотид в позиции 9946-9967 представлялся

нам наиболее интересным, поскольку ранее (Sctiwarzman, 1991) в семье

1>ис.19 Схена расположения антисмысловых олигонуклеотидо! к гену ЛАТ человека.

1 2 3 4 5 6 7 8

1>ис.12. Авторадиография синтезированных dc novo и неченны: S-метионином белков из культуры HepG3 клеток: 1-3, 6-0 -клетки, обработанные антисмысловыми олигонуклеотидами к гс ААТ человека; '1 - контрольные клетки; 5 - клетки, обработанные снысловим олигонуклеотидом.

о недостаточностью ЛЛТ, у одного из сибсов, не имеющего выраженных клинических проявлений, была обнаружена гетерозиготная замена в нитроне 'I, не найденная ни у его брата, ни у родителей, ни у 23 обследованных с различным генотипом, включая ММ, Ш, ЪЪ. Эта мутация была идентифицирована в позиции 9955 (ОТ). Поскольку эта замена находится в составе сигнала сплайсинга (3 нуклеотида от границы интрон 'I - экзон 5) гена ЛЛТ, можно было предположить, что она в конечном итоге детерминирует снижение в нечени стационарной концентрации ЛЛТ-м1'НК.

Нутация была определена у старшего из братьев, не страдающего печеночной формой недостаточности ЛЛТ. Вполне вероятно, что ее эффеич1 выражается в снижении содержания мутаитного белка в гешггодитах. Таким образом эта нутация является характерным примером природной генной терапии. Ее обнаружение предопределяет разработку конкретных подходов к генной терапии печеночной формы недостаточности ЛЛТ через механизмы подавления транскрипции гена ЛЛТ, синтеза, созревания или трансляции мутантпой ЛЛТ'-нРНК.

ВЫВОДЫ

1. I! результате трансформации животных клеток линии 1,929 (фибробллсты мыши) рекомбинантпой плазмидой рМЗУЬ, содержащей нолпоразиерную кДНК рЛНП человека, показана экспрессия экзогенной кДНК рЛПII с синтезом функционально активного рЛНП человека.

Получены стабильные клеточные клоны клеток яичника китайского хомяка (СНОЬАЗ), эксирсссирующие ген рЛНП человека.

3. Сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая полнорлзиерную кДНК ААТ человека под контролем промоторных и энхлнсприых элементов цитонегаловируса и продемонстрирована ее экспрессия в СНОЬАЗ клетках (синтез ЛАТ человека, его последующее гликозплирование и секреция).

'!. Получены предварительные данные, свидетельствующие об экспресс!!'.: эндогенного ЛАТ в культуре синусоидальных эндотелиальных клеток печени человека.

При изучении подавления эндогенного синтеза рЛПН и ЛАТ че:н:!;гч:л ¡1 культуре генлтоцитов человека (НерСЗ) соответствующими антпсннсловнми олигопуклеотидами, показано практически полное

ипгибнровашш эндогенного синтеза pJlllII и частичное ннгионрованш.' эндогенного синтеза ДАТ.

(>. ¡1 целях модели роиап и и семейной гилерхолестерппемии сконструирована антисмысловая конструкция кДНК pJiliIi человека, содержась О'-концевой фрагмент кДНК рЛНП и промотор гена металлотжшеипа мыши. Аптисмнсловая конструкция кДНК рЛНП использовалась в экспериментах но получению трансгенных животных путем введения ее в оплодотворенные яйцеклетки кролика. Полученные трансгеншде животные содержали в составе геномной ДНК антиемнелов* последовательности кДМК рЛНП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Доляанская II.Б., Нандельштам Н.Ю., Паткин Е.Л.,Кузнецов А. Экспрессия гена рецеитора липоиротеинов низкой плотности человека фиброблаетах мыши.// Труды Второго Всесоюзного съезда медицинских генетиков, Алма-Ата, 4-0 декабря 1990 г. - М., 1990 - с.132.

2. Долганская 11.Ь., Рунова О.Л., Шварцман А.Л., Гайцхоки II.С. Моделирование генетической коррекции недостаточности альфа-1-антитринеппа // Тез. докл. II Всесоюз. науч. конф. "Геном человек - 1991. - с.ОТ.

3. Должанская U.U., Виханская ф.Л., Крутилина IUI., Кузнецов A.C., Паткин Е.Л., Нандельштам М.Ю., Гайцхоки B.C. Моделирование генетической коррекции семейной гиперхолестеринемии. // Биополимер и клетка. - 1990. - N 2. - с.31-35.

'1. Должанская II.Ь., Тодорова И., Шварцман А.Л. Получение антисмысловой конструкции кДНК рецептора липоиротеинов низкой плотности человека. // Биополимеры и клетка. - 1991. - II 3 - с.35 30.

5. Должанская II.Б., Паткин Е.Л., Рунова О.Л., Шварцман А.Л., Гайцхоки Н.С. Моделирование генетической коррекции семейной гиперхолестеринемии путем создания клеточных клонов, стабильно экспрессирующих рецептор липоиротеинов низкой плотности человека. Бшлл. Эснер. Биол. и Нед. - 1993. - N 12 - с.Ы'1-610.