Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные особенности генов пендрина (SLC26A4) и престина (SLC26A5) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности генов пендрина (SLC26A4) и престина (SLC26A5) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой"

На правах рукописи

ЛОБОВ СЕМЕН ЛЕОНИДОВИЧ

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОВ ПЕНДРИНА (8ЬС26Л4) И ПРЕСТИНА (8ЬС26А5) У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ГЛУХОТОЙ

03.02.07 — генетика

13 МАЙ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2013 005060116

005060116

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: Джемилева Лиля Усеиновна

доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты: Викторова Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, профессор ГБОУ ВПО Башкирский Государственный Медицинский Университет, заведующая кафедрой биологии

Спицин Виктор Алексеевич

доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, заведующий лабораторией экологической генетики

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный

медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится «ЪО » мая 2013 г. в «W » часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71 и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН:

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «У » апреля 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По статистическим данным ВОЗ на сегодняшний день в мире насчитывается около 300 млн. человек, страдающих нарушением слуха различной этиологии (III-IV степени тугоухости) (www.genetests.org). В Российской Федерации эта цифра превышает 13 млн. человек, из которых более 1 млн. - это дети в возрасте до 18 лет. По прогнозам ВОЗ к 2020 году более 30% всей популяции земного шара будут иметь нарушения слуха (Загорянская и др., 2003). Наиболее частая форма наследственной глухоты - несиндромальная сенсоневральная тугоухость/глухота (НСНТ) (Nance, 2003; Cryns et. al., 2004; Morton et. al., 2006; Chalestori et. al., 2007; Batissoco et al., 2009; Bhalla et al., 2011). Среди всех идентифицированных генов, вовлеченных в функционирование системы звуковосприятия, наиболее значимыми являются гены белков-коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6), 31 (GJB3), и гены митохондриальной ДНК J2SrRNA и tRNASER<UCN), вклад которых в развитие несиндромальных и некоторых синдромальных форм, по данным различных авторов, достигает 20-80% в различных этнических группах (Friedman et al., 2000; Petit et al., 2001; Cryns et. al., 2004; Smith et al., 2005; Petersen et. al., 2006, Джемилева с соавт., 2009; Барашков с соавт., 2009; Dzhemileva et al., 2010; Barashkov et al., 2011). Однако y довольно большого числа семей, которые обращаются к врачу-генетику по поводу определения риска врожденных наследственных форм потери слуха у потомства, при проведении молекулярного исследования генов коннексинов и генов митохондриальной ДНК, не удается выявить генетический дефект, приводящий к потере слуха.

Поскольку наследственная несиндромальная сенсоневральная тугоухость и глухота относятся к. заболеваниям с выраженной генетической гетерогенностью (Cryns et. al., 2004; Smith et al., 2005; Petersen et. al., 2006), то можно предположить, что мутации, приводящие к нарушению процесса звуковосприятия у части пробандов из семей высокого риска, могут затрагивать и другие гены, вовлеченные в функционирование процесса звуковосприятия.

По имеющимся литературным данным известно, что вклад мутаций в генах пендрина (SLC26A4) и престина (SLC26A5) составляет от 5 до 12% всех несиндромальных наследственных форм глухоты и тугоухости в различных популяциях мира (Hutchin et al., 2005; Azaiez et al., 2007; Dai et al., 2008; Wu et al., 2008; Kahrizi et al., 2009; Yang et al., 2007, 2009).

Мутации в гене SLC26A4 являются причиной как синдромальной потери слуха (синдром Пендреда), дисплазии Мондини (дисплазия улитки в сочетании с

деформацией преддверия и системы полукружных каналов), EVA (расширенный водопровод преддверия), так и несиндромальной формой тугоухости и глухоты (DFNB4) (Takahashi et al., 2006; Pourova et al., 2010), тогда как мутации в гене SLC26A5 вызывают только несиндромальные формы потери слуха (DFNB61) (Liu et al., 2003).

Известно более 160 мутаций в гене SLC26A4 (Dai et al., 2008). Мутации p.Thr416Pro и с.1001+Ю>А - две наиболее частые мутации у глухих и тугоухих пациентов из популяций Северной Европы (Albert et al., 2006). У больных из Японии, Кореи и Китая преобладающими являются мутации p.His723Arg и c.919-2A>G, которые обнаруживаются у 45,5% пациентов с синдромом Пендреда и дисплазией Мондини (Park et al., 2003; Pourova et al., 2010). В гене SLC26A5 мажорной для большинства пациентов из евразийских популяций является мутация c.-53-2A>G (IVS2-2A>G), выявляемая у 4 % больных с нарушениями слуха (Tang et al., 2005).

Таким образом, учитывая существование выраженных межпопуляционных различий в частоте и спектре мутаций генов SLC26A4 и SLC26A5, анализ их генетической гетерогенности при несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоте и тугоухости в отдельных регионах и этнических группах является актуальной проблемой медицинской генетики, необходимым условием при разработке оптимальных для данного региона подходов ДНК-диагностики наследственных форм потери слуха.

Целью исследования является изучение структурных особенностей генов SLC26A4 (пендрина) и SLC26A5 (престина) у больных наследственной несиндромальной глухотой из Республики Башкортостан и оптимизация подходов ДНК-диагностики заболевания.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие

задачи:

1. Провести скрининг мажорной мутации p.H723R в гене SLC26A4 у пациентов с наследственными формами потери слуха из РБ.

2. Определить спектр и частоту мутаций в гене пендрина (SLC26A4') у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из РБ.

3. Определить спектр и частоту мутаций в гене престина (SLC26A J) у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из РБ.

4. Определить частоту мажорной для стран Западной Европы мутации с.-53-2A>G (IVS2-2A>G) в гене SLC26A5 в популяциях Евразии.

5. Оптимизировать подходы молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной глухоты и тугоухости у пациентов из РБ.

Научная новизна исследования. Анализ мутаций генов SLC26A4 (пендрина) и SLC26A5 (престина) у больных наследственной несиндромальной глухотой из Башкортостана позволил установить, что к мутациям, приводящим к глухоте, относятся: c.85G>C (p.Glu29Gln) (0,2%), c.l49T>G (p.Leu50Arg) (0,2%), g.919-2A>G (0,2%), g.29607delA (0,2%) в гене SLC26A4 (пендрина) и c.-53-2A>G (g.24586A>G, IVS2-2A>G) (1,42%), p.Asn330Ser (c.989A>G) (0,2%) в гене SLC26A5 (престина). Впервые изучена частота гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G (IVS2-2A>G) в гене SLC26A5 в 16 популяциях Евразии. Выявлена существенная гетерогенность по частоте гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G (IVS2-2A>G) в гене SLC26A5 между славянскими, финно-угорскими и тюркскими этносами. Впервые обнаружены две новые мутации в генах SLC26A4 (g.29607delA) и в SLC26A5 (p.Asn330Ser).

Научно-практнческая значимость работы. В рамках работ по государственному контракту № 16.512.11.2047 «Разработка постгеномных методов для молекулярно-генетической диагностики соматических заболеваний» (Федеральная целевая научно-техническая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2009-2013 годы») создана уникальная патентно-чистая тест-система экспресс-ДНК-диагностики НСНТ на основе определения мажорной мутации c.-53-2A>G (g.24586A>G, IVS2-2A>G) в гене SLC26A5.

Полученные данные о частоте и спектре мутаций и полиморфных вариантах в генах SLC26A4 (пендрина) и SLC26A5 (престина) вносят определенный вклад в познание фундаментальных механизмов функционирования процесса звуковосприятия, являясь необходимым условием для повышения эффективности работы медико-генетического консультирования в РБ.

Публикации и апробация работы: по теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из которых 4 в журналах из Перечня ВАК.

Результаты исследования были представлены на международных и российских конференциях: Human Genome Meeting (Dubai, UAE, 2011); European Human Genetics Conference (Amsterdam, the Netherlands, 2011); Вторая и Третья школа-конференция по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012); European Human Genetics Conference 2012 (Nürnberg, Germany, 2012); International Polar Year 2012 (Montréal, Canada, 2012);

Congress of the European Academy of Paediatric Societies (Istanbul, 2012); V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 319 источников.

***

Автор данной работы выражают глубочайшую благодарность заведующей отделом Геномикы Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктору биологических наук, профессору Эльзе Камилевне Хуснутдиновой за выбор направления исследования и постоянную помощь при обсуждении и интерпретации полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Критерием включения в исследование был диагноз «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» (HCHT) (G11 по МКБ-10), установленный на основании клинических и лабораторно-инструментальных методов исследований в соответствии с современными диагностическими критериями, предлагаемыми Институтом глухоты и коммуникативных расстройств (г. Омаха, США) и рекомендованных в 2003 г. Европейской рабочей группой по наследственным нарушениям слуха GENDEAF (Stephens et al., 2001; Mazzoli et al., 2003). В ходе исследования уточнялись данные об этнической принадлежности больных путем опроса и выяснения национальной принадлежности родителей до третьего поколения. Особое внимание уделялось установлению места рождения пробандов, их родителей и прародителей; выявлению кровнородственных браков в семьях обследованных пациентов. Согласно первичному анализу данных, и, исходя из диагностических критериев НСНТ, из общего числа случаев изолированной тугоухости/глухоты, были выделены несиндромальные сенсоневральные нарушения слуха с отягощенным по нарушенному звуковосприятию семейным анамнезом. Таким образом, в исследование вошли 246 семей пациентов с НСНТ из РБ.

Популяционная выборка включает 1310 образцов ДНК, полученных от здоровых неродственных индивидов - представителей 16 различных этнических

групп, проживающих на территории России и стран бывшего Советского Союза, у которых проводился скрининг частоты гетерозиготного носительства мутации с.-53-2A>G в гене SLC26A5.

Для настоящего исследования все образцы ДНК были анонимизированы. Забор крови производили после медицинского осмотра у взрослых жителей, принадлежащих к разным семьям, что позволяет рассматривать выборки случайными для популяций. Данная научно-исследовательская работа была одобрена локальным этическим комитетом по биомедицинской этике при ИБГ УНЦ РАН. Образцы крови были взяты с информированного письменного согласия пациентов и их родителей.

Молекулярно-генетические исследования проведены с использованием стандартных методов: выделения ДНК; полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР); анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), гибридизации на чипах (APEX) фирмы Asper Biothech; конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) и ресеквенирования.

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием стандартных для популяционно-генетических и медицинских исследований методов и соответствующего программного обеспечения (Statistica 5.5, GenePop 3.3, Genetic Data Analysis 1.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Для проведения молекулярно-генетического анализа мы сформировали выборку из 246 семей с 424 больными с наследственной формами тугоухости и глухоты. Рецессивный тип наследования предположительно определен в 220 семьях (385 больных), доминантный - 26 семьях (39 больных). Х-сцепленный тип наследования не был обнаружен ни в одной семье с наследственными формами тугоухости и глухоты из Республики Башкортостан (РБ).

Скрининг мутации p.H723R в гене SLC26A4у пациентов с наследственными формами потери слухи из РБ Учитывая высокую частоту встречаемости мутации p.H723R не только у пациентов из азиатских популяций, но и в других этносах Европы и Сев. Америки (Pera et al., 2008; Dossena et al., 2009), был проведен скрининг мутации в выборке больных из РБ. Для детекции мутации p.H723R был использован метод идентификации данной аминокислотной замены с помощью ПЦР с последующим ПДРФ-анализом (Scott et al., 2000). При использовании данного метода теряется 1 из

двух сайтов рестрикции для эндонуклеазы Fail (Рис. 1), что позволяет выявлять гомозиготных и гетерозиготных носителей этой мутации.

Результаты скрининга показали, что мутация p.H723R, выявленная ранее в некоторых популяциях в ассоциации (или без) с мутациями в гене GJB2 (Tsukamoto, et al., 2003; Choi et al., 2009), не была зарегистрирована ни у одного пациента из РБ.

__187 п.н.

112 п.н.

__38 п.н.

-— 37 п.н.

1 2345 б 7 89 10 11

Рис. 1. Идентификация мутации p.H723R в гене SLC26A4 с помощью ПДРФ-анализа (Fatl)\ электрофореграмма 1-5 и 7-11 - образцы, не содержащие мутацию, 6 -контрольный образец.

Таким образом, данная мутация не является причиной потери слуха среди пациентов с несиндромальной сенсоневральной глухотой в РБ. Следовательно, можно предполагать, что причиной тугоухости и глухоты у пациентов из РБ, наравне с мутацией c.35delG в гене GJB2 (Джемилева, 2011), являются мутации в других генах, участвующих в процессе звуковосприятия, тем более что спектр и частота мутаций гена SLC26A4 во многих азиатских и европейских популяциях достаточно скудны (Coyle et al., 1998; Campbell et al., 2001; Pryor et al., 2005; Albert et al., 2006).

Анализ мутаций c.85G>C (p.Glu29Gln) и C.149T>G (p.LeuSOArg) в гене пендрина

(SLC26A4)

Мутация c.85G>C (p.E29Q) была идентифицирована с помощью глубокого ресеквенирования в компаунд гетерозиготном состоянии с мутацией c,149T>G (p.L50R) у пробанда с НСНТ (глухота) в семье башкирской этнической принадлежности (Рис. 2).

КТ-визуализация пирамиды височной кости обследованного пациента представлена на рисунке 2Б (1 и 2). На серии томограмм (1, 2) визуализируется наружный слуховой проход, размеры и форма которого не изменены. На КТ-снимках цепь слуховых косточек не изменена. Также у пациента не выявлено изменений со стороны сосцевидного отростка, однако при этом видны выраженные изменения со стороны улитки - ее дисплазия и резко расширенный водопровод преддверия.

Мутация c.85G>C (p.E29Q) в гетерозиготном состоянии была впервые описана в 2001 году в семье с мальформацией Мондини у пробанда из Айовы (США) (Campebell et al., 2001). Позднее, в 2003 году при исследовании 55 пациентов с

синдромом Пендреда из Англии и Бельгии, частота c.85G>C в выборке больных составила 0,9% (Prasad et al., 2004).

Я -

Рис. 2. Фрагмент родословной семьи Д башкирской этнической принадлежности с НСНТ из РБ. Пробанд III-1 - пациент с генотипом c.85G>C / c,149T>G (А). Анализ пирамиды височной кости. Фотографии 1 и 2 - мальформация Мондини, фотография 3 - норма. (Б). Последовательность участка 2 экзона гена SLC26A4, содержащего мутации c.85G>C / c.149T>G в компаунд-гетерозиготном состоянии (В).

В 2004 году мутация c.85G>C была также выявлена в семье французов в гетерозиготном состоянии у пробанда и одного сибса (Blons et al., 2004). При анализе 8 образцов ДНК из 2-х семей с наследственной формой несиндромальной сенсоневральной глухоты из Англии, мутация c.85G>C была обнаружена в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с.2Т>С (p.MIT) (Shears et. al., 2004), вызывающей синдром Пендреда в гомозиготном состоянии (Prasad et al., 2004; Shears et. al., 2004).

Мутация с. 149T>G (p.L50R) в гене SLC26A4 была описана у пробанда с глухотой, француза по этнической принадлежности, как патологическая мутация, вызывающая замену лейцина на аргинин в пендрине и приводящая к синдрому Пендреда (Prasad et al., 2004). Известно, что лейцин в 50~°м положении аминокислотной последовательности пендрина является абсолютно консервативным как среди всех видов белков - сульфатных транспортеров у человека, так и среди таковых у различных видов организмов (Romero et al. 2009), и обладает способностью образовывать прочные ковалентные связи с другими аминокислотами, благодаря чему может участвовать как в образовании локальной структуры, так и в доменной укладке белковой молекулы (Wangemann et al., 2009; Sun et al., 2009). Считается, что второй, третий и четвертый трансмембранные домены пендрина участвуют в обмене ионов, при этом наибольший вклад вносит третий трансмембранный домен (Romero et al., 2009). Мутантный пендрин, по-видимому, теряет способность к осуществлению ионного транспорта, что выражается в повреждении мембранного и костного

лабиринтов органа Корти, что, в свою очередь, приводит к стойкому повреждению процесса звуковосприятия (Grimaldi et al., 2007; Hughey et al., 2007; Sindic et al., 2007; Wall et al., 2008; Kopp et al., 2008; Dossena et al., 2009; Ito et al., 2011).

Таким образом, частота мутации c.85G>C составила 0,2%, как и частота мутации с. 149T>G в общей выборке неродственных больных НСНТ, а в выборке больных НСНТ башкирской этнической принадлежности - по 1,35 % для обеих мутаций.

Анализ мутации c.919-2A>G в гене пендрина (SLC26A4)

В татарской семье у пробанда с глухотой мутация c.l67delT в гене GJB2 выявлена в сочетании с мутацией c.919-2A>G, расположенной в 7 интроне в сайте сплайсинга 8 экзона в гене SLC26A4. У пробанда четверо детей с глухотой, родители пробанда слышащие. К сожалению, образцы ДНК детей, жены и родителей пробанда оказались недоступны для исследования (родители пробанда, а также его жена и дети отказались от генетического тестирования по религиозным причинам). Подобное сочетание мутаций g.-3179G>A и c.35delG в гене GJB2 и g.2-2A>G в гене SLC26A4 обнаружено в двух эстонских семьях с нарушением слуха (Teek et al., 2009). У пробанда, китайца по этнической принадлежности, мутация c.919-2A>G была выявлена в гомозиготном состоянии, тогда как у его жены и двух дочерей, имеющих тугоухость IV степени, данная мутация выявлялась в компаунд-гетерозиготном состоянии с другой мутацией p.H723R (Yong et al., 2001; Prasad et al., 2004), наиболее частой для пациентов с синдромом Пендреда и синдромом расширенного водопровода преддверия (EVA) из Китая, Монголии, Японии и Кореи (Iwasaki et al., 2006; Cho et al., 2006; Dai et al., 2008; Guo et al., 2010; Wang et al., 2011). Анализ варианта нуклеотидной последовательности g.29607deIA (IVS9+43delA) в

гене пендрина (SLC26A4)

При молекулярном анализе 9 экзона и протяженного участка 9 интрона гена SLC26A4 у пробанда с тугоухостью IV степени башкирской этнической принадлежности было обнаружено ранее неописанное в литературе изменение нуклеотидной последовательности g.29607delA (IVS9+43delA) (Рис. 3). Из всей выборки больных (N=246) данная делеция в гетерозиготном состоянии была выявлена только у 1 пациента (0,2%). В связи с этим мы провели поиск данного изменения в контрольной выборке (150 неродственных индивидов с нормальным слухом), представленной тремя наиболее многочисленными этническими группами региона (русскими, татарами и башкирами). Делеция g.29607delA (IVS9+43delA) в контрольной выборке не обнаружена. Сделать какое-либо предположение о

ео 76 <0 »0

to it«6TCi*«crr<t*TTTT* к t *cco:cA*(.OTTC<iTttT*

А) Б)

Рис. 4. Последовательность участка 19 экзона гена SLC26A4, содержащего полиморфный вариант rsl7154353 (p.Gly740Ser, c.49548G>A) в гетерозиготном состоянии (А), и нормальная последовательность участка 19 экзона гена SLC26A4 (Б).

Таким образом, частота полиморфного варианта rsl7154353 (p.Gly740Ser, c.49548G>A) составила 0,2% в выборке больных с наследственной глухотой и тугоухостью из РБ.

Анализ мутации c.-53-2A>G (g.24586A>G, IVS2-2A>G) в гене престина (SLC26A5)

При оценке географического ареала распространения c.-53-2A>G у пациентов с НСНТ из различных популяций мира, следует отметить, что данная мутация является достаточно частой и в большинстве случаев повреждений слуха регистрируется только в сочетании с мутациями в генах GJB2 (Tang et al., 2005; Yuan et al., 2009) и SLC26A4 (Rodriguez-Paris et al., 2010). Единичные случаи гомозигот по этой мутации были обнаружены в США у переселенцев европейского происхождения (Liu et al., 2003). Трансверсия c.-53-2A>G повреждает сайт сплайсинга 3 экзона гена SLC26A5 (Liberman et al., 2002). При изучении уровня экспрессии престина с аберрантным сплайсингом в 3 экзоне и функционировании ионного транспорта в клетке Кортиева органа мыши было показано, что мутация c.-53-2A>G выражено нарушает ионный транспорт через мембрану волосковой клетки по сравнению с клетками с нормальным уровнем престина (Toth et al., 2007; Schaechinger et al., 2007; Rybalchenko et al., 2008 Romero et al., 2009; Wangemann et al., 2010). Таким образом, функциональная значимость данной замены на сегодняшний день спорна — ряд исследователей считает, что c.-53-2A>G - полиморфный вариант (Tang et al. 2005; Minor et al., 2009), a другие же придерживаются мнения, что c.-53-2A>G - мутация с аутосомно-рецессивным типом наследования (Liberman et al., 2002; Teek et al, 2009; Rodriguez-Paris et al., 2010).

На первом этапе исследований был проведен скрининг мутации c.-53-2A>G в гене престина (SLC26A5) у 246 неродственных пациентов из Республики Башкортостан. У 8 пациентов (7 неродственных) данная мутация была выявлена в гетерозиготном состоянии, что составляет 3,25% всех обследованных семей с НСНТ (Рис. 5).

разработки стратегии молекулярной диагностики наследственных нарушений слуха в различных этнических группах, проживающих как в Республике Башкортостан, так и, в целом, на территории Российской Федерации, а также могут послужить в решении вопроса о возможной роли эффекта основателя в происхождении данной трансверсии.

При исследовании индивидов с нормальным слухом, было показано, что средняя частота гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G среди нормальнослышащих индивидов составляет 2,6 % (1/37), с вариацией от 1,3% у испанцев до 4% у венгров, французов и метисов европейского происхождения из США (Tangetal., 2005).

Нами была изучена частота гетерозиготного носительства c.-53-2A>G среди различных популяций коренного населения Волго-Уральского региона (башкиры, татары, чуваши, мордва, удмурты, коми-пермяки), а также в выборке русских из города Екатеринбурга и Пинежского района Архангельской области. В тюркоязычных популяциях Волго-Уральского региона мутация c.-53-2A>G обнаружена с частотами 2,5% и 2,6%, у татар, и чувашей, соответственно.

Скрининг частоты гетерозиготного носительства c.-53-2A>G, выполненный нами в двух восточно-европейских популяциях (украинцы и белорусы), выявил достаточно высокие частоты c.-53-2A>G - 2.5% у украинцев (1/40) и 1.3% у белорусов (1/80), соответственно.

Среди финно-угорских популяций Волго-Уральского региона мутация c.-53-2A>G была выявлена с высокой частотой 6% у коми (1/16), с частотой 5,4% у мордвы (1/19) и отсутствует у удмуртов. Ранее, высокая частота c.-53-2A>G (4.1%) была обнаружена у выходцев из Европы, живущих в США (венгров, испанцев и французов) (Tang et al., 2005). Частота гетерозиготного носительства c.-53-2A>G, выявленная нами в смешанной выборке русских - 2,3%. Таким образом, частота гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G, выявленная в популяциях мордвы и коми, близка к частоте носительства этой мутации в популяции Эстонии (Teek et al., 2009), где на сегодняшний день наиболее высока частота гетерозиготного носительства c.-53-2A>G.

В среднем же, распространенность гетерозигот по мутации c.-53-2A>G в популяциях Волго-Уральского региона составляет 0,0275, что несколько ниже частоты гетерозиготного носительства c.-53-2A>G в популяциях Северной Европы, и белых представителей Америки европейского происхождения (4%) (Tang et al., 2005). Частота гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G в исследованных нами популяциях Восточной Европы составила 0,011. Отсутствие мутации в популяциях

башкир, объединяющих четыре этногеографические группы, вероятнее всего, объясняется преобладанием в структуре их генофонда монголоидного компонента, являющегося основой генофондов популяций Азии, где частота мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5 крайне низка (0/230), а среди больных с несиндромальной аутосомно-рецессивной глухотой из-за повреждения гена SLC26A4 преобладают мутации p.H723R (c.2168A>G) и c.766-2A>G (IVS7-2A>G) (Dai et al., 2008; Yuan et al., 2009; Guo et al., 2010; Wang et al., 2011).

В исследованных тюркоязычных популяциях Центральной Азии (казахи, узбеки) мутация c.-53-2A>G с достаточно высокой частотой обнаружена у казахов (2,5%) и не выявлена у узбеков. В тюркоязычных популяциях Сибири (якуты, алтайцы) мутация c.-53-2A>G с относительно низкой частотой (1,3%) была выявлена нами только в популяции алтайцев и не обнаружена в популяции якутов.

Мутация c.-53-2A>G была выявлена у абхазов с частотой 1,3% (1/80).

Таким образом, ареал распространения мутации c.-53-2A>G демонстрирует наибольшую частоту в популяциях Северной и Восточной Европы с постепенным снижением градиента частоты с севера на юг и с запада на восток. Характер распространения мутации c.-53-2A>G в изученных нами этнических группах соответствует их географическому расположению и вписывается в географический градиент снижения частоты с запада на восток, что дает основание предполагать, что она распространилась по Евразии в результате смешения с европейцами, мигрировавшими из Северной Европы.

Полученные данные о распространенности мутации c.-53-2A>G среди различных популяций, располагающихся на обширных территориях Евразии, позволят, до некоторой степени, уточнить или, возможно, пересмотреть современные представления о центре происхождения, возрасте, и механизмах распространенности мутации c.-53-2A>G. Таким образом, полученные нами данные показали градиент снижения частоты гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G с запада на восток: высокая частота c.-53-2A>G в популяциях Восточной Европы (белорусы, украинцы) и в финно-угорских популяциях (коми и мордва), промежуточные частоты c.-53-2A>G - в некоторых популяциях Волго-Уральского региона. Средней Азии и Северного Кавказа, и минимальная частота c.-53-2A>G у алтайцев в Восточной Сибири.

Характер распространенности мутации c.-53-2A>G в изученных этнических группах может служить свидетельством предполагаемой роли эффекта основателя в происхождении и распространенности этой мутации в популяциях мира.

В отношении некоторых рецессивных мутаций в гене GJB2 были предложены оригинальные гипотезы о возможных механизмах поддержания высокой частоты их гетерозиготного носительства (Common et al., 2004) в контексте их возможной повышенной резистентности носителей к инфекциям. Вполне вероятно, что гетерозиготные носители мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5 также имеют определенное адаптивное преимущество, поскольку в ряде работ обсуждается роль престина как белка-модификатора, влияющего на ионный гомеостаз в клетке и взаимодействующего с CFTR-белком (Rybalchenko et al., 2008; Dallos et al., 2008; Sun et al., 2009; Homma et al., 2010).

В заключение необходимо отметить важность проводимых исследований в разработке стратегий скрининга мутаций в гене SLC26A5 и SLC26A4 в различных этнических группах для более раннего выявления и профилактики наследственных форм тугоухости и глухоты, учитывая высокую распространенность данного заболевания.

Оптимизация подходов ДНК-диагностики наследственных форм тугоухости и глухоты у пациентов из Республики Башкортостан

У пациентов с НСНТ из Республики Башкортостан было выявлено 4 мутации -c.85G>C (p.Glu29Gln), c.149T>G (p.Leu50Arg), g.919-2A>G, g.29607delA и 1 полиморфный вариант rsl7154353 (p.Gly740Ser, c.49548G>A) в гене SLC26A4 и 2 мутации - c.-53-2A>G (g.24586A>G, IVS2-2A>G), p.Asn330Ser (c.989A>G) и 2 полиморфных варианта rs7779997 (c.403+14T>C, IVS5+14T>C, g.38190T>C), rs72655380 (c,1302A>G, g.60740A>G, p.Ser434Ser) в гене SLC26A5.

В изученной выборке больных наследственной глухотой из Республики Башкортостан наиболее распространенной мутацией в гене SLC26A5 оказалась мутация c.-53-2A>G (1,42%), остальные мутации генов SLC26A5 и SLC26A4, в общей сложности, составили менее 1 %.

Следует отметить, что мутации c.85G>C (p.Glu29Gln) и c.l49T>G (p.Leu50Arg) в компаунд-гетерозиготном состоянии в гене SLC26A4 были выявлены у пациента с несиндромальной формой тугоухости и рентгенологической картиной мальформации Мондини, что позволило верифицировать диагноз и провести проспективное медико-генетическое консультирование для членов данной семьи.

Относительно высокая частота сочетания мутаций c.-53-2A>G (g.24586A>G, 1VS2-2A>G) в гене SLC26A5 и c.35delG в гене GJB2 у больных в РБ предполагает возможность проведения прямой ДНК-диагностики. Учитывая этнический состав населения РБ, в котором преобладающим является европеоидный компонент, можно

отметить, что молекулярно-генетическое тестирование на данные мутации является обоснованным и необходимым условием при проведении дифференциальной и пренатальной ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты в Республике Башкортостан.

На основании полученных результатов исследований о спектре и частоте мутаций в генах GJB2 (Джемилева, 2011), БЬС26А5 и 8ЬС2бА4 нами были оптимизированы подходы ДНК-диагностики наследственных несиндромальных форм тугоухости/глухоты в Республике Башкортостан. Обследование следует начинать с прямой диагностики на наличие мажорной для популяций Башкортостана и Западной Европы мутации с.35с1еЮ гена С.1В2, а также с рецессивной мажорной для некоторых популяций из Европы и Азии мутации с.-53-2А>С в гене 8ЬС26А5. Наравне с прямой диагностикой мутаций, также обязательно проведение компьютерной томографии височной кости, на основании которой следует проводить прямое глубокое ресеквенирование всех экзонов гена 81С26А 4. В случае полной информативности семьи ДНК-диагностика ограничивается прямым методом. В случае частичной информативности или абсолютной неинформативности должен проводиться поиск мутаций в генах GJB2, GJBЗ, GJB6 и генах мтДНК 128гША и ¡ША^^, согласно алгоритму, предложенному ранее (Джемилева, 2011) (Рис. 9).

Гвмпш с5>4еЮс.35<МО с.5МА><*с..«МА>С

[¡нфордопияссть 100*»

N

Диагноз

установлен

Обнаружение мутапнй с.85С>С. с.149Т>С. 8.919-2А>в, ?.29607(1е1А

Информативность 100»«

Ресеквеннрованне гена Ы.С26Л4

Поиск мутапнй во 2-я жзоне СЛН

\ Мушшн не обнаружены

Обнаружение мутапнй с-35ЛфС, с. 167*11. с.235«1е1С, С^58.3«0а<ЮАС, C-.102.VG, С-290_29НкА.

С-299_306<ИАТ, СЗМ_334<ИАА, сЛ0_325ЛН4,сЛ4_327к1М,с.10!Т>С, с.109ё>А, С-13К5>Т, С-38(Ю>А, сЛ2«РА, с.95С>А, С-55Ю>С, С25МРС, с.790>А+сЛ1А>С Информативность 100%

Диагноз установлен

Обнаружение

мушшн 8.-3179С>А

Информативность КК№»

При неннформативности снквенс 1 экзова гена СШ2

Прнненвформатвввоств оокк ДСДВбШЗЯМОн Д«В«-Ш3518<4

в гене ОЛ6

При неннформатнБности понск мутапнй т.961т*С(п) и т.961с!е1Т1п'.С(п) в гене 12А.\А н ш.7444С>А в гене ОХА^сх) мтднк

Рис. 9. Алгоритм ДНК-диагностики наследственных форм тугоухости и глухоты в РБ (желтым обозначены новые позиции, которые не применялись в ранее предложенном алгоритме (Джемилева, 2011)).

ВЫВОДЫ

1. Мутация р.Н723Я в гене пендрина (8ЬС26А4) у больных наследственной несиндромапьной сенсоневральной глухотой из Республики Башкортостан не обнаружена.

2. В гене пендрина (8ЬС26А4) у больных наследственной несиндромапьной сенсоневральной глухотой из Республики Башкортостан выявлены 4 мутации -с.850С (р.аи2901п) (0,2%), с.149ТМ} (р.Ьеи50Агя) (0,2%), я.919-2А>С (0,2%), ^29607ёе1А (0,2%) и 1 полиморфный вариант Ы7154353 (р.С1у7408ег, с.495480А) (0,2%). Мутации с.850С (р.аи29С1п), с.149ТХ} (р.Ьеи50А^), g.919-2A>G, §.29607ёе1А в гене пендрина {БЪС26А4) выявлены только у больных - башкир и татар по этнической принадлежности. Мутация g.29607delA обнаружена впервые.

3. В гене престина (ЗЬС26А5) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Башкортостан обнаружены 2 мутации -с.-53-2А>6 (я.24586А>0,1У82-2А>0 (1,42%), рАэпЗЗОЗег (с.989А>0 (0,2%) и 2 полиморфных варианта ге7779997 (с.403+14Т>С, 1У85+14Т>С, g.38190T>C) (43%), ге72655380 (с.1302А>0, я.60740А>0, р.8ег4348ег) (0,8%). Мутации с.-53-2А>в (^24586А>0, 1У82-2А>0), р.АэпЗЗОЗег (с.989А>С) в гене престина (8ЬС26А5) - преимущественно у пациентов, русских по этнической принадлежности. Мутация р.АБпЗЗОЗег (с.989А>0) выявлена впервые.

4. Мутация с.-53-2А>0 ^.24586А>С, 1У82-2А>0) в гене престина {8ЬС26А5) выявлена в популяциях финно-угорского происхождения с частотой 2,95%, в популяциях славянской группы - в 2,0%, у тюркских народов в 1,3% случаев, соответственно. Обнаружен градиент снижения частоты мутации с.-53-2А>С с запада на восток и севера на юг, что дает основание предполагать о ее распространенности в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы.

5. Оптимизирован алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты для Республики Башкортостан.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Dzhemileva, L.U. Carrier frequency of GJB2 gene mutations c.35delG, c.235delC and c.l67delT among the populations of Eurasia / L.U. Dzhemileva, N.A. Barashkov, O.L. Posukh, R.I. Khusainova, V.L. Akhmetova, I.A. Kutuev, I.R. Gilyazova, V.N. Tadinova, S.A. Fedorova, I.M. Khidiyatova, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova // Journal of human genetics - 2010.- V.55. - P.749-754.

2. Barashkov, N.A. Autosomal recessive deafness 1A (DFNB1A) in Yakut population isolate in Eastern Siberia: extensive accumulation of the splice site mutation IVS1+1G>A in GJB2 gene as a result of founder effect / N.A. Barashkov, L.U. Dzhemileva, S.A. Fedorova, F.M. Teryutin, O.L. Posukh, E.E. Fedotova, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova. // Journal of Human Genetics. - 2011. - V.56(9). - P.631-639.

3. Джемилева, Л.У. Оценка гаплотипического разнообразия и реконструкция предкового гаплотипа хромосом с мутацией c.35delG гена GJB2 (сх26) в популяциях Волго-Уральского региона / Л.У. Джемилева, О.Л. Посух, Н.А. Барашков, С.А. Федорова, Ф.М. Терютин, В.Л. Ахметова, И.М. Хидиятова, Р.И. Хусаинова, С.Л. Лобов, Э.К. Хуснутдинова // Acta Naturae (русскоязычная версия). - 2011. - Т.З. - №3. - С. 17-27.

4. Лобов, С.Л. Молекулярно-генетический анализ генов GJB2, SLC26A4 и SLC26A5 у больных с наследственными нарушениями слуха из Республики Башкортостан / С.Л. Лобов, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2011. - Т.13 -№5(3).-С.251-255.

5. Barashkov, N.A. Molecular, audiological and population features of autosomal recessive deafness 1A (DFNB1A) in Yakut population isolate from Eastern Siberia/ N.A. Barashkov, L.U. Dzhemileva, S.A. Fedorova, F.M. Teryutin, O.L. Posukh, E.E. Fedotova, S.L. Lobov, and E.K. Khusnutdinova // HUGO Human Genome Meeting 2011. Dubai.-P.218.

6. Barashkov, N. Molecular, audiological and population features of autosomal recessive deafness 1 A (DFNB1A) in Yakut population isolate from Eastern Siberia / N. Barashkov, L. Dzhemileva, S. Fedorova, F. Teryutin, O. Posukh, E. Fedotova, S. Lobov, E. Khusnutdinova // European Journal of human genetics. - Amsterdam, the Netherlands 2011. -P.342

7. Dzhemileva, L.U. Spectrums and frequences of GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer<UCN> SLC26A4, SLC26A5 и MY07A mutations among patients with non-syndromic hearing loss from Bashkortostan (Russia) / L.U. Dzhemileva, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova // European Journal of human genetics. - Amsterdam, the Netherlands 2011.-P.312.

8. Лобов, С.Л. Анализ генов SLC26A4, SLC26A5 и GJB2 у больных с наследственной несиндромальной тугоухостью/глухотой из Республики Башкортостан / С.Л. Лобов, Л.У. Джемилева, Р.З. Муртазина, P.P. Хасанова,

Л.Р. Шафикова, A.A. Султанова, Э.К. Хуснутдинова // Биомика. - 2011. - Т.1 -№2 - С.72-73.

9. Dzhemileva, L.U. Haplotype diversity and reconstruction of ancestral haplotype associated with the c.35delG mutation in the GJB2 (Cx26) gene among the Volgo-Ural populations of Russia / L.U. Dzhemileva, O.L. Posukh, N.A. Barashkov, S. Lobov, E.K. Khusnutdinova // European Journal of human genetics. - Nürnberg, Germany 2012.-P.254.

10. Barashkov, N.A. Autosomal Recessive Deafness in Yakut Population Isolate in Eastern Siberia: Extensive Accumulation of the Splice Site Mutation IVS1+1G>A in GJB2 Gene as a Result of Founder Effect / N.A. Barashkov, L.U. Dzhemileva, S.A. Fedorova, F.M. Teryutin, O.L. Posukh, A.V. Soloviev, E.E. Fedotova, S.L. Lobov, L.S. Zamorshikova, O.A. Melnitchuk, E.K. Khusnutdinova and E.I. Mikhailova // International Polar Year. - Montréal, Canada, 2012.

11. Lobov, S.L. Spectrums and frequencies of SLC26A4 and SLC26A5 genes mutation among patients with inherited hearing loss from different regions of Russia / S.L. Lobov, L.U. Dzhemileva, E.K. Khusnutdinova // European Journal of human genetics. - Nürnberg, Germany 2012. - P.333.

12. Dzhemileva, L.U. Frequencies of SLC26A4 and SLC26A5 genes mutation among patients with inherited hearing loss from different regions of Russia / L.U. Dzhemileva, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova // Congress of the European Academy of Paediatric Societies (EAPS 2012) - 2012. - Istanbul, Turkey- P. 345.

13. Джемилева, JI.У. Молекулярно-генетический анализ наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости в различных регионах России / Л.У. Джемилева, С.Л. Лобов, A.C. Мукминов, Э.К. Хуснутдинова // V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий»: Материалы конференции. - Санкт-Петербург. — 2012. -С.40.

14. Лобов, С.Л. Анализ спектра и частоты мутаций и полиморфных вариантов в генах SLC26A4 и SLC26A5 у больных с наследственными нарушениями слуха из республики Башкортостан / С.Л. Лобов, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Актуальные проблемы генетики человека, животных растений и микроорганизмов: Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых. - Уфа. - 2012. - С.89.

15. Лобов, С.Л. Анализ частоты гетерозиготного носительства мутации с.-53-2A>G в гене SLC26A5 в популяциях Евразии / С.Л. Лобов, Л.У. Джемилева, А.Н. Барашков, О.Л. Посух, Э.К. Хуснутдинова // Биомика. -2012. - Т.З - №1. -С.69-71.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ТЕКСТЕ

12SrRNA Ген 12 S субъединицы рРНК

EVA Enlarged vestibular aqueduct (расширенный водопровод преддверия)

GJB2 Gap junction ß2 (ген коннексина 26)

GJB6 Gap junction B6 (ген коннексина 30)

mtDNA Митохондриальная ДНК

MY07A Ген миозина VIIA

PS Синдром Пендреда

SLC26A4 Solute carrier family 26, member 4 (ген пендрина)

SLC26A5 Solute carrier family 26, member 5 (ген престина)

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism (анализ конформационных полиморфизмов одноцепочечных фрагментов ДНК) Ген митохондриальной ДНК, кодирующий транспортную РНК серина

АД Аутосомно-доминантная форма заболевания

АР Аутосомно-рецессивная форма заболевания

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ВУР Волго-Уральский регион.

KT Компьютерная томография

МГК Медико-генетическая консультация

МРТ Магнитно-резонансная томография

НСНТ Несиндромальная сенсоневральная тугоухость/глухота

п.н. Пар нуклеотидов

ПААГ Полиакриамидный гель

ПДРФ Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РБ Республика Башкортостан

Подписано в печать 26.04.13 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 1457. Гарнитура «Тіте5№\¥Яотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600,27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобов, Семен Леонидович, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201358973

Лобов Семен Леонидович

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОВ ПЕНДРИНА (8ЬС26А4) И ПРЕСТИНА {БЬС26А5) У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ГЛУХОТОЙ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Джемилева Л.У.

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................3

1.1. Распространенность врожденной несиндромальной и синдромальной наследственной сенсоневральной тугоухости и некоторые медико-социальные аспекты........................................................................................................................11

1.2. Классификация аномалий развития внутреннего уха.....................................15

1.2.1. Синдромы расширенного водопровода преддверия и Пендреда............21

1.3. Участие генов пендрина (8ЬС26А4) и престина {8ЬС26А5) в процессах звуковосприятия.........................................................................................................24

1.3.1. Разнообразие белков семейства сульфатных переносчиков ЭЬС26.......24

1.3.2. Гены 81С26А4 и 8ЬС26А5...........................................................................29

1.3.3. Спектр мутаций в гене пендрина (8ЬС26А4).............................................33

1.3.4. Спектр мутаций в гене престина {8ЬС26А5).............................................34

1.4. Заключение..........................................................................................................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................37

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................37

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................................44

2.2.1. Молекулярно-генетические методы исследования..................................44

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ............................................................57

3.1 Скрининг мутации р.Н723Я в гене 8ЬС26А4 у пациентов с наследственными формами потери слуха из РБ....................................................................................57

3.2. Поиск мутаций в гене 8ЬС26А4 у пациентов с наследственными формами глухоты и тугоухости из Башкортостана................................................................59

3.3. Поиск мутаций в гене 8ЬС26А5 у пациентов с наследственными формами глухоты и тугоухости из Башкортостана................................................................68

3.4. Анализ частоты гетерозиготного носительства мутации с.-53-2А>С в гене 8ЬС26А5 в некоторых популяциях Евразии............................................................80

3.5. Оптимизация подходов ДНК-диагностики наследственных форм тугоухости и глухоты у пациентов из Республики Башкортостан...........................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................91

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ТЕКСТЕ..............................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................99

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

По статистическим данным ВОЗ на сегодняшний день в мире насчитывается около 300 млн человек, страдающих нарушением слуха различной этиологии (III-IV степени тугоухости) [314]. В Российской Федерации эта цифра превышает 13 млн. человек, из которых более 1 млн. - это дети в возрасте до 18 лет. Общепопуляционная частота врожденной тугоухости и глухоты составляет 1 на 650-1000 новорожденных детей [187; 65]. По прогнозам ВОЗ к 2020 году более 30% всей популяции земного шара будут иметь нарушения слуха [7]. Данный прогноз указывает на отсутствие в перспективе снижения числа инвалидов по слуху в абсолютном и долевом выражении, как в Российской Федерации, так и в других странах, свидетельствуя о масштабе медицинской проблемы и ее социальной значимости, обусловленой влиянием нарушений слуха у детей на их речевое развитие, формирование интеллекта и личности ребенка. В вопросах этиологии и патогенеза заболевания остается много неясных аспектов, но считается, что примерно половина всех случаев врожденной глухоты имеет наследственное происхождение. Правильное консультирование семей таких пациентов практически невозможно без применения ДНК-диагностики. Большинство случаев генетически детерминированной потери слуха наследуется по аутосомно-рецессивному типу [86; 148; 206; 205; 280]. Однако выраженная генетическая гетерогенность заболевания, а также большая ассортативность браков между глухими и слабослышащими зачастую не позволяет точно выяснить механизм наследования дефекта звуковосприятия, а также приводит к повышению случаев болезни среди потомков пробанда. Наиболее частая форма наследственной глухоты - несиндромальная сенсоневральная тугоухость/глухота (НСНТ) [159; 148; 104; 206; 114; 88; 128; 161; 183, 190; 77; 187; 65; 44; 49]. Среди всех идентифицированных генов, вовлеченных в функционирование системы звуковосприятия, наиболее значимыми являются гены белков-коннексинов 26 (СЗВ2), 30 31 (вШ), и гены митохондриальной ДНК ПБгША и

вклад которых в развитие несиндромальных и некоторых синдромальных форм, по данным различных авторов, достигает 20-80% в

различных этнических группах [104; 206; 77; 247; 205, 4; 2; 94; 43]. Однако у довольно большого числа семей, которые обращаются к врачу-генетику по поводу определения риска врожденных наследственных форм потери слуха у потомства, при проведении молекулярного исследования генов коннексинов и генов митохондриальной ДНК, не удается выявить генетический дефект, приводящий к потере слуха. По данным различных авторов, процент семей с невыявленными генетическими дефектами, приводящими к наследственным формам потери слуха, в зависимости от этноса, составляет, в среднем, около 40 - 80% [15; 193; 2; 22; 3].

Поскольку наследственная несиндромальная сенсоневральная тугоухость и глухота относятся к заболеваниям с выраженной генетической гетерогенностью [77; 247; 205], то можно предположить, что мутации, приводящие к нарушению процесса звуковосприятия у части пробандов из семей высокого риска, могут затрагивать и другие гены, вовлеченные в функционирование процесса звуковосприятия.

По имеющимся литературным данным известно, что вклад мутаций в генах пендрина (SLC26A4) и престина (SLC26A5) составляет от 5 до 12% всех несиндромальных наследственных форм глухоты и тугоухости в различных популяциях мира [99; 200; 218; 134; 40; 78; 287; 154; 292, 290].

SLC26A4 и SLC26A5 являются членами семейства интегральных белков SLC (solute carrier protein 26), состоящих из 10-12 трансмембранных доменов и осуществляющих обмен анионов (СГ, I", S04", N03", ОН" и др.) между внеклеточным матриксом и внутриклеточным пространством. Мутации в гене SLC26A4 являются причиной как синдромальной потери слуха (синдром Пендреда), дисплазии Мондини (дисплазия улитки в сочетании с деформацией преддверия и системы полукружных каналов), EVA (расширенный водопровод преддверия), так и несиндромальной формой тугоухости и глухоты (DFNB4) [267; 212], тогда как мутации в гене SLC26A5 вызывают только несиндромальные формы потери слуха (DFNB61) [166].

Известно более 160 мутаций в гене SLC26A4 [79]. Мутации p.Thr416Pro и с.1001+Ю>А - две наиболее частых мутации у глухих и тугоухих пациентов из

популяций Северной Европы [30]. У больных из Японии, Кореи и Китая преобладающими являются мутации р.Н1з723А^ и с.919-2А>С, которые обнаруживаются у 45,5% пациентов с синдромом Пендреда и дисплазией Мондини [200; 212]. В гене 8ЬС26А5 мажорной для большинства пациентов из евразийских популяций является мутация с.-53-2А>С (1У82-2А>0), выявляемая у 4 % больных с нарушениями слуха [265].

Таким образом, учитывая существование выраженных межпопуляционных различий в частоте и спектре мутаций генов 8ЬС26А4 и 8ЬС26А5, анализ их генетической гетерогенности при несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоте и тугоухости в отдельных регионах и этнических группах является актуальной проблемой медицинской генетики, необходимым условием при разработке оптимальных для данного региона подходов ДНК-диагностики наследственных форм потери слуха.

Целью исследования является изучение структурных особенностей генов 8ЬС26А4 (пендрина) и 8ЬС26А5 (престина) у больных наследственной несиндромальной глухотой из Республики Башкортостан и оптимизация подходов ДНК-диагностики заболевания.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести скрининг мажорной мутации р.Н723Я в гене 8ЬС26А4 у пациентов с наследственными формами потери слуха из РБ.

2. Определить спектр и частоту мутаций в гене пендрина (8ЬС26А4') у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из РБ.

3. Определить спектр и частоту мутаций в гене престина (8ЬС26А5) у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из РБ.

4. Определить частоту мажорной для стран Западной Европы мутации с.-53-2А>С (ГУ82-2А>С) в гене 8ЬС26А5 в 16 евразийских популяциях.

5. Оптимизировать подходы молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной глухоты и тугоухости у пациентов из РБ.

Научная новизна:

Впервые изучена частота гетерозиготного носительства мутации с.-53-2А>6 (1У82-2А>С) в гене 8ЬС26А5 в 16 популяциях Евразии. Выявлена существенная гетерогенность по частоте гетерозиготного носительства мутации с.-53-2А>С (1У82-2А>0) в гене 8ЬС26А5 между славянскими, финно-угорскими и тюркскими этносами. Анализ мутаций генов 8ЬС26А4 (пендрина) и 8ЬС26А5 (престина) у больных наследственной несиндромальной глухотой из Башкортостана позволил установить, что к мутациям, приводящим к нарушению процесса звуковосприятия, относятся: - с.85С>С (р.С1и29С1п) (0,2%), с.149Т>С (р.Ьеи50А^) (0,2%), &919-2А>0 (0,2%), g.29607delA (0,2%) в гене 8ЬС26А4 (пендрина) и с.-53-2А>С (§.24586А>С, 1У82-2А>С) (1,42%), р.АзпЗЗОЭег (с.989А>С) (0,2%) в гене 8ЬС26А5 (престина). Впервые обнаружены две новые мутации в генах 8ЬС26А4 ^.29607ёе1А) и в 8ЬС26А5 (р.АзпЗЗОЗег). Научно - практическая значимость работы:

В рамках работ по государственному контракту № 16.512.11.2047 «Разработка постгеномных методов для молекулярно-генетической диагностики соматических заболеваний» (Федеральная целевая научно-техническая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2009-2013 годы») создана уникальная патентно-чистая тест-система экспресс-ДНК-диагностики НСНТ на основе определения мажорной мутации с.-53-2А>С ^.24586А>С, 1У82-2А>С) в гене 8ЬС26А5.

Материалы диссертации используются в работе медико-генетической консультации при ГБУЗ: «Республиканский перинатальный центр» РБ, а также включены в программу обучения студентов, ординаторов, интернов, врачей на кафедре оториноларингологии лечебного и педиатрического факультетов ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный Медицинский Университет».

Полученные данные о частоте и спектре мутаций и полиморфных вариантах в генах 8ЬС26А4 (пендрина) и 8ЬС26А5 (престина) вносят определенный вклад в познание фундаментальных механизмов функционирования процесса

звуковосприятия, являясь необходимым условием для повышения эффективности работы медико-генетического консультирования в РБ. Положения, выносимые на защиту

1. Спектр и частота мутаций c.85G>C (p.Glu29Gln), c.149T>G (p.Leu50Arg), g.919-2A>G, g.29607delA в гене пендрина (SLC26A4) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Башкортостан.

2. Спектр и частота мутаций c.-53-2A>G (g.24586A>G,IVS2-2A>G), p.Asn330Ser (c.989A>G) в гене престина (SLC26A5) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Башкортостан.

3. Неоднородность популяций финно-угорской, славянской и тюркской групп по частоте гетерозиготного носительства мутации c.-53-2A>G (g.24586A>G, IVS2-2A>G) в гене престина (,SLC26A5).

4. Оптимизирован подходов ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты для пациентов из Республики Башкортостан.

Публикации и апробация работы: по теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 2 статьи в зарубежной печати, 11 публикаций - в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций. Результаты исследования были представлены на международных и российских конференциях: Human Genome Meeting (Dubai, UAE, 2011); European Human Genetics Conference (Amsterdam, the Netherlands, 2011); Вторая школа-конференция по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011); European Journal of Human Genetics (Nierenberg, 2012); International Polar Year 2012 (Montréal, Canada, 2012); European Human Genetics Conference (Nürnberg, Germany, 2012); Congress of the European Academy of Paediatric Societies (Istanbul, 2012); V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школы-конференции

молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012); Третья школа-конференция по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 319 источников.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН в соответствии с научным направлением Института по бюджетным темам «Геногеография наследственной и многофакторной патологии и филогеографии народов Евразии» (№ Госрегистрации 012.0 801230) и «Структура генофонда, молекулярные основы формирования наследственных и многофакторных заболеваний в популяции народов Центральной Евразии» (№ Госрегистрации 012.0 1151168), а также в рамках грантов РФФИ «Молекулярно-генетические особенности наследственных повреждений слуха в различных этнических группах населения, проживающих на территории Российской Федерации и разработка алгоритмов дородовой ДНК-диагностики тугоухости и глухоты наследственной этиологии» (№09-04-01123-а), «Анализ клинико-генеалогических и молекулярно- генетических особенностей этноспецифических форм наследственной патологии слуха в различных регионах Российской Федерации» (№12-04-00342-а), «Изучение индивидуальных биоакустических возможностей индивидов, в зависимости от их ШВ2-генотипа и разработка тест систем рутинной ДНК-диагностики для профилактики и ранней коррекции наследственных нарушений слуха у коренного населения Республики Саха (Якутия) (№12-04-98520-р_восток_а).

* * *

Автор данной работы выражает благодарность заведующей отделом Геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктору биологических наук, профессору Эльзе Камилевне Хуснутдиновой за выбор направления исследования и постоянную помощь при обсуждении и интерпретации полученных результатов.

Автор признателен за возможность выполнения данного исследования директору Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктору биологических наук, профессору Венеру Абсатаровичу Вахитову и заместителю директора Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, доктору биологических наук, профессору, Алексею Викторовичу Чемерису.

Автор сердечно благодарит своих коллег Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук: доктора биологических наук, профессора, Ирину Михайловну Хидиятову, доктора биологичских наук, доцента, Баймиева Алексея Ханифовича, доктора биологических наук, доцента, Андрея Ханифовича Баймиева, кандидата биологических наук, доцента, Риту Игоревну Хусаинову, кандидата

биологических наук, Биту Леоновну Ахметоеу за помощь в проведении совместных исследований, за ценные комментарии и дополнения к данной работе.

Особую признательность и благодарность автор выражает кандидату биологических наук, Ольге Леонидовне Посух (Институт цитологии и генетики, Новосибирск) и кандидату биологических наук, Николаю Алексеевичу Барашкову (Якутский центр медицинских проблем, Якутск) за предоставленные образцы ДНК популяций алтайцев и якутов, а также помощь в проведении совместных исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространенность врожденной несиндромальной и синдромальной наследственной сенсоневральной тугоухости и некоторые медико-социальные

аспекты

Человеческое ухо способно воспринимать звуки от 20-20000 Гц и может различать разницу всего лишь на 0,2-0,5%. Такая чувствительность и точность, происходит от сложного взаимодействия кохлеарных волосковых клеток и текториальной мембраны в пределах к