Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая и структурная характеристика миокарда крыс при гиперхолестеринемии и введении верапамила

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая и структурная характеристика миокарда крыс при гиперхолестеринемии и введении верапамила"

На правах рукописи

Южик Екатерина Игоревна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИОКАРДА КРЫС ПРИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ВВЕДЕНИИ ВЕРАПАМИЛА

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2013

005544929

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт региональной патологии и па-томорфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Селятицкая Вера Георгиевна

заведующая лабораторией эндокринологии ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН

Сорокина Ирина Васильевна

ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологических исследований ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н.Ворожцова» СО РАН

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Зашита диссертации состоится « /3 » ¿рфг&р^с/ 2013 г. в ас. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел. 334-84-38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « ¿'б&С&Ё^/' 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций-^ Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 /' М. доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является распространенной причиной сердечно-сосудистых патологий в человеческой популяции (Климов А.Н., 1977; Сох R.A., Garcia-Palmieri M.R., 1990; Mann D.L., 2002; Cole J.E. et al., 2010). Изучение проблемы гиперхолестеринемии и атеросклеротического процесса имеет длительную историю (Ignatowskï

A.С., 1908; Anitschkow N.,Chalatow S., 1913; Duguid J.B., 1946; Zilversmit

B.A., 1973; Kunitomo M. et al., 1986), однако по-прежнему остается актуальным. Гиперхолестеринемия приводит к структурно-функциональным перестройкам в сердце и развитию сердечной недостаточности (Семенова JI.A. и др., 1985; Непомнящих Л.М., 1991). Морфогенез и механизмы холестеринового повреждения миокарда, в отличие от повреждений сосудов (Лысова Н.Л. и др., 2007; Соловьева Н.А. и др., 2008; Рагино Ю.И. и др., 2008, 2011; Соловьева Н.А., Лысенко А.И., 2010; Shah Р.К., 2002, 2003), мало изучены. Понимание процессов формирования компенсаторно-приспособительного ответа на тканевом и клеточном уровнях помогает выяснению закономерностей развития общих патологических процессов и позволяет решать частные задачи восстановления функции поврежденного миокарда.

Анализ литературы дает представление о комплексной природе холестериновых повреждений сосудов и сердца, затрагивающих различные функциональные системы организма, в том числе и иммунную систему (Климов А.Н. и др., 2003; Нагорнев В.А. и др., 2007; Cole J.E. et al., 2010; Santos M.J., Fonseca J.E., 2010; Luczak M. et al., 2011), что создает дополнительные сложности при исследовании данной патологии. Особенности липидного обмена у крыс (Cullen P. et al., 2003; Xiangdong L. et al., 2011) позволяют изучать токсическое воздействие избыточного содержания холестерина в крови на миокард в отсутствие ишемии и вызванных ею метаболических нарушений в кардиомиоцитах.

В выяснении причин сократительной недостаточности сердца большую роль играют методы молекулярной биологии и морфологии. Повышенный уровень холестерина в крови влияет на Са2+-сигналинг в кардиомиоцитах через изменение экспрессии белков, вовлеченных в транспорт кальция (Alvarez Е. et al., 2010; Luo T.Y. et al., 2004), а также изменяя функциональность ионных каналов, модулируя мембранный потенциал и активность ионных обменников (Luo T.Y. et al., 2004; D'Aranzo N. et al., 2011; Deng W. et al., 2012). Нарушение Са2+-сигналинга меняет электрофизиологические характеристики кардиомиоцитов — потенциал действия, плато потенциала действия, появляются осцилляции в работе Na+- и К+-ионных каналов (Noble D., Noble P.J., 2006; Ceylan-Isik A.F. et al., 2011; Liang S. et al., 2012; Rozanski G.J., 2012), что обусловливает формирование аритмогенной активности и снижение сократительной функции сердца.

В свою очередь, изменения сократительной функции кардиомио-цитов в результате модификации кальциевого обмена обусловливают развитие комплекса структурных перестроек мышечных клеток сердца, отражающих их функционирование в измененных условиях регуляции сократительной активности. Анализ морфофункциональных изменений миокарда при развитии гиперхолестеринемии должен включать не только характеристику структурной реорганизации кардиомиоцитов, выяснение типов их повреждения и форм гибели, но также и возможные изменения их пролиферативной активности и потенциал развития компенсаторно-приспособительных реакций. В конечном итоге интенсивность процессов гибели и регенераторной (в том числе, и пролиферативной) активности кардиомиоцитов в условиях гиперхолестеринемии определяет особенности ремоделирования миокарда, оценка которых имеет непосредственное отношение к прогнозу состояния, обратимости структурных перестроек и выбору способов коррекции атерогенных повреждений миокарда.

Одним из основных подходов к коррекции атеросклеротических повреждений органов и тканей в настоящее время является применение препаратов и биоактивных соединений (статинов, фибратов, секвестран-тов желчных кислот, юЗ-жирных кислот и т.п.), снижающих уровень холестерина в крови. Применение препаратов и химических соединений, модулирующих активность ионных каналов, потенциал действия сарколеммы и сопряжение процесса сокращения — расслабления, определяется симптомами нарушений сердечной деятельности и связано, как правило, с лечением осложнений атеросклеротического процесса, когда структурная реорганизация миокарда может носить необратимый характер.

Верапамил - блокатор кальциевых каналов, широко используемый при лечении гипертонии, коронарной болезни сердца и аритмии (Кулешова Э.В., 1999; Ргоштеуег а й а1., 2012; МПЬе^ Р. е1 а1.5 2012). В последнее время появляются данные и о целесообразности использования верапами-ла для коррекции атерогенных повреждений сердца (Уегеал Б. е1 а!., 2009; 8а1аЬе11.К. е1 а1., 2012). Однако эти данные основаны преимущественно на статистическом анализе клинических данных, в то время как механизмы действия верапамила изучены недостаточно, что сужает область его применения и не позволяет предупредить нежелательные побочные эффекты. Использование верапамила в экспериментальной модели позволит изучить вклад внутриклеточных токов Са2+ в повреждение кардиомиоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии.

Цель исследования — изучить характер структурной реорганизации миокарда и изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер структурной реорганизации миокарда крыс при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

2. Изучить динамику изменений общей численности кардиомиоцитов в сердце и субпопуляций кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

3. С помощью иммуногистохимических методов изучить пролифе-ративную активность кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

4. Изучить характер изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

Научная новизна. Впервые с помощью комплексного морфологического, биохимического и молекулярно-биологического анализа проведено изучение характера структурной реорганизации миокарда, пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменений их общей численности в сердце крыс, а также изменений экспрессии мРНК КуЯ2 и 8ЕЯСА2а в миокарде при моделировании хронической гиперхолестеринемии (в течение 64 сут) и введении верапамила. Показано, что морфологические изменения миокарда при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом носят сходный характер (преобладание кардиомиоцитов с литическими изменениями, выраженное полнокровие вен и капилляров, интерстициальный отек, диффузный фиброз, гипертрофия и гиперплазия гладкомышечных клеток в интрамуральных артериях) и усиливаются по мере увеличения сроков цитопатического воздействия.

Впервые установлено, что введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов и фибропластических реакций стромы с сохранением более выраженного диффузного фиброзирования стромы у крыс, получавших с кормом экзогенный холестерин.

Впервые показано, что морфофункциональные изменения миокарда при развитии гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии сопровождаются усилением пролиферативной активности кардиомиоцитов (индекс мечения ядер кардиомиоцитов Кл-67 повышен в 14 - 17 раз по сравнению с контролем через 30 сут эксперимента). Впервые установлено, что введение верапамила способствует более выраженному повышению пролиферативной активности кардиомиоцитов.

Впервые установлено, что содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином первоначально приводит к уменьшению (на 17%) доли одноядерных и увеличению (на 35%) доли многоядерных кардиомиоцитов с инверсией этих показателей в более поздние сроки. Введение верапамила приводит к нормализации доли многоядерных клеток за счет уменьшения доли двуядерных кардиомиоцитов. Содержание крыс на атерогенной диете с мерказолилом не меняет соотношение субпопуляций кардиомиоцитов, при этом общая численность кардиомиоцитов через 64 сут уменьшается на 10%. Введение верапамила приводит к увеличению

доли многоядерных кардиомиоцитов при сохранении уменьшенной общей численности кардиомиоцитов.

Впервые показано, что при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказсшилом в миокарде значительно уменьшается количество \iPHKRyR2 (в среднем на 70%) имРНК БЕКСА2а (в среднем на 80%). Введение верапамила способствует нормализации количества мРНК ИуЯ2 и 8ЕЯСА2а только при атерогенной диете с экзогенным холестерином.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о характере структурной реорганизации миокарда, молекулярных механизмах нарушения сократительной функции кардиомиоцитов и их регенераторных стратегиях при развитии гиперхолестеринемии и введении верапамила, которые расширяют существующие представления о вариантах ремоделирования и репаративной регенерации миокарда.

Установленное влияние верапамила на пролиферативную активность кардиомиоцитов, изменения общей численности клеток, соотношений одно- и многоядерных кардиомиоцитов, снижение выраженности литиче-ских повреждений клеток (цитопротекторный эффект), нормализация под его влиянием количества мРНК ЙуЯ2 и 8ЕИ.СА2а в миокарде открывают новые перспективы использования данного препарата для оптимизации репаративных процессов миокарда при атерогенных кардиомиопатиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Атерогенная диета с введением экзогенного холестерина или мер-казолила обусловливает развитие гиперхолестеринемии и гипертриглице-ридемии у крыс, которые сопровождаются структурной реорганизацией миокарда, повышением пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменениями общей численности кардиомиоцитов в сердце и пулов одно-, дву- и многоядерных клеток.

2. Введение верапамила существенно не влияет на уровень холестерина, но сопровождается достоверным увеличением уровня триглицеридов в сыворотке крови. Введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов без выраженных изменений фибропластических реакций стромы, усилению пролиферативной активности кардиомиоцитов и увеличению доли многоядерных клеток.

3. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом приводит к уменьшению в миокарде крыс Вистар количества мРНК Ку!12 и 5ЕЯСА2а. Введение верапамила приводит к исчезновению статистических различий по количеству мРНК ЯуЯ2 и 5ЕКСА2а только при содержании на атерогенной диете с экзогенным холестерином.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на 1-й Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012),

IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012), Научно-образовательном форуме «Кардиология 2012» (Москва, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии» (Томск, 2013), 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в журналах по списку ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста, иллюстрирована микрофотографиями и графиками, содержит 13 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы включает 257 источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика животных и экспериментальных моделей гиперхолестеринемии. В эксперименте использованы крысы-самцы линии Вистар (п=44) в возрасте 2 мес, которые были разделены на опытные и контрольные группы. Животных содержали в стандартных условиях по 5-6 особей в клетке при свободном доступе к воде. Крыс контрольных групп (n= 10) содержали на стандартном лабораторном рационе и выводили из опыта через 30 и 64 сут. Крыс 1-й экспериментальной группы (п=17) содержали на атерогенной диете с повышенным содержанием холестерина: 1 % холестерина (из расчета 100 мг/100 г массы тела), 0,5% холата натрия, 15% сливочного масла, 0,01% мерказолила. Крыс 2-й экспериментальной группы (п=17) содержали на атерогенной диете, включающей 0,5% холата натрия, 15% сливочного масла, 0,01% мерказолила (из расчета 1 мг/100 г массы тела).

Через 30 сут после начала эксперимента из 1-й и 2-й экспериментальных групп выделили по подгруппе. Животным этих подгрупп дополнительно к атерогенной диете вводили per os блокатор Са2+-каналов верапамил в дозе 3 мг/100 г массы тела в течение 34 сут. Длительность эксперимента всего составила 64 сут.

Использование мерказолила для моделирования гиперхолестеринемии в экспериментах основывалось на выявлениях дислипидемий у людей с недостаточностью функции щитовидной железы (Duntas L.H., Brenta G.,

2012; Kota S.K. et al., 2012). Появляется все больше данных об ассоциации гипотиреоидизма с сердечной недостаточностью и атеросклерозом (Bamashmoos S.A. et al., 2013; Klose M. et al., 2013; Sunita et al., 2013; Wane W.Y. et al., 2013).

Еженедельно всех животных взвешивали для контроля динамики массы тела. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работе использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.

Животных выводили из опыта декапитацией. В день забора материала животных взвешивали. После вскрытия грудной клетки сердце быстро отделяли от окружающих тканей и помещали в холодную камеру; после полной остановки его взвешивали. После декапитации определяли массу внутренних органов (сердце, легкие, печень, селезенка, почки, надпочечники). Относительную массу органов считали по формуле: [масса органа, г]/[масса тела, г] х 100%.

Небольшие образцы миокарда замораживали в жидком азоте для дальнейшего выделения РНК. Из левого желудочка сердца образцы размерами не более 1 мм^ фиксировали в параформальдегиде для получения полутонких срезов.

Оставшиеся фрагменты сердца фиксировали в 10% нейтральном формалине для дальнейшего исследования методами световой микроскопии, иммуногистохимии и щелочной диссоциации клеток.

Биохимические показатели крови. Кровь собирали в пробирки после декапитации и отбирали сыворотку для определения биохимических показателей. В сыворотке крови определяли содержание общего холестерина, триглицеридов и фракций ЛПВП и ЛПНП с помощью прямых ферментативных колориметрических тестов (Fluitest, Analyticon, Германия).

Методы морфологического анализа. Образцы миокарда, фиксированные в 10% нейтральном формалине, после проводки в гистологическом комплексе STP 120 заливали в парафин (HISTOMIX®, Био-Витрум, Россия). Срезы толщиной 2 — 3 мкм получали на санном микротоме НМ430, окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica Milano SPA, Италия). Для выявления элементов соединительной ткани использовали специфическую окраску на коллагеновые волокна по ван Гизону с окрашиванием эластических волокон по Вейгерту (Bio-Optica Milano SPA, Италия).

Иммуиогистохимия. Для оценки пролиферативной активности клеток миокарда проводили иммуногистохимическое исследование с использованием маркера Ki-67. Ki-67 описан J.Gerdes и соавт. (1991) как ядерный негистоновый белок, ассоциированный с транскрипцией рРНК и экспрессирующийся во всех активных фазах клеточного цикла (Gl, S, G2 и М), но отсутствующий в покоящихся клетках (в фазе G0), что делает его надежным маркером клеточной пролиферации.

После блокирования эндогенной пероксидазы, для чего на каждый срез капелыю наносили 3% раствор перекиси водорода (Hydrogenperoxide block) и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, срезы промывали в 2 порциях TBS по 5 мин. Демаскировку проводили кипячением стекол в микроволновой печи LG 1744U при мощности 420W в течение 20 мин в нитратном буфере (pH 6.0). Капельно наносили казеинсодержащий раствор (Protein Block) для блокировки неспецифических сайтов связывания с антителами и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем промывали в 2 порциях TBS по 5 мин.

Инкубацию с первичными антителами (Spring Bioscience, Pleasanton, CA, USA) проводили во влажной камере при температуре 25°С в течение 60 мин в разведении 1:300, после инкубации промывали в 2 порциях TBS по 5 мин. Далее капельным способом наносили Complement (Spring Bioscience, Pleasanton, CA, USA) для усиления сигнала на 10 мин при комнатной температуре, после чего срезы осушали и наносили вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (HRP Conugate; Spring Bioscience, Pleasanton, CA, USA), которые оставляли при комнатной температуре на 15 мин, затем препараты промывали в 4 порциях TBS по 5 мин.

Хромоген 3,3 '-диаминобензидин (DAB) наносили на срез на 5 мин при комнатной температуре, после чего срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали гематоксилином (2 мин) и для завершения реакции помещали в проточную воду на 10 мин с последующим заключением в полистирол. Ядра с маркером Ki-67 окрашиваются в коричневый цвет, ядра без маркера - синие при обзорной окраске гематоксилином.

Подсчет ядер с меткой Ki-67 осуществляли в универсальном микроскопе «Leica DM 4000В» (Германия) при увеличении хЮОО (цифровая фотокамера «Leica DFC 320», компьютерная программа «Leica QWin V3 », Германия). Общее количество подсчитываемых ядер составляло не менее 1000 на одно стекло. Относительную долю выражали как отношение числа ядер с маркером Ki-67 к общему числу ядер кардиомиоцитов в поле зрения.

Морфометрический и стереологический анализ. Для определения структурной реорганизации миокарда, обусловленной функциональными, адаптационными и патологическими процессами, применяли морфометрический и стереологический анализ (Непомнящих JI.M. и др., 1984). Использование стереологических методов исследования тканевых компонентов мышцы сердца позволяет объективно оценить качественные изменения, происходящие в миокарде при различных воздействиях и в условиях патологии. С помощью стереологических методов по двумерным изображениям структур оценивают их объем, площадь поверхности, численность структур в единице объема или площади.

Морфометрический анализ включал оценку диаметров кардиомиоцитов, которые измеряли на продольных срезах кардиомиоцитов, содержавших ядра. Для каждого животного проводили по 100 измерений. Калибровку микроскопа проводили с помощью объект-микрометра. Полу-

ченные данные использовали для построения размерного распределения.

Стереологический анализ миокарда крыс включал определение объемной плотности основных структурных компонентов - кардиомиоцитов, капилляров, клеток, волокон и основного вещества соединительной ткани (суммарно). Для этого на полутонких срезах при увеличении в 1000 раз измеряли площадь сечения анализируемых объектов и относили ее к общей площади среза. Для каждого животного анализировали по 30 неперекрывающихся полей зрения. Используя объемные плотности основных струюур миокарда, вычисляли их объемные отношения.

Метод щелочной диссоциации предварительно фиксированной в формалине ткани. Абсолютную численность кардиомиоцитов сердца определяли, используя метод щелочной диссоциации предварительно фиксированной ткани (Бродский В.Я. и др., 1983). Материал фиксировали в 10% формалине на 0,1 М фосфатном буфере в течение 10 сут (длительность фиксации ткани до года и более не влияет на результаты диссоциации). Сердце взвешивали до фиксации и после нее. После фиксации из стенок желудочков вырезали пластинку ткани толщиной около 1 мм, из которой брали навеску 10-20 мг. Взвешивание производили на торсионных весах, предварительно осушив кусочек фильтровальной бумагой. Навеску пинцетом погружали в пробирку с 4 мл 40% КОН на 20 - 21 ч при температуре 18 - 20° С. Затем щелочь сливали, кусочек промывали в трех сменах холодной дистиллированной воды по 8 - 10 мл каждая.

После промывки в пробирку наливали 10 мл дистиллированной воды, в которой кусочек набухал в течение 1 сут при комнатной температуре. Затем лишнюю воду сливали, пробирку энергично встряхивали до полного распада кусочка на отдельные клетки. Полученную суспензию окрашивали азур-эозином по Романовскому. Окрашивание суспензии завершали через 30 мин, после чего ее разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/л. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Дня каждого животного брали по 3 навески, для каждой навески проводили подсчет в 10 повторах.

Оценка экспрессии генов RyR2 и SERCA2a в миокарде крыс методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Суммарную клеточную РНК миокарда крыс выделяли с помощью тризола. Образец миокарда гомогенизировали в 1 мл тризола (Trizol, Медиген, Новосибирск). Добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали, охлаждали и центрифугировали 15 мин при 13400 об./мин (микроцентрифуга MicroSpin, Eppendorf). Переносили водную фазу в новую пробирку, добавляли равный объем изопро-панола, перемешивали, охлаждали 1 ч при -20°С, затем центрифугировали в течение 15 мин при 13400 об./мин. Осадок промывали 75% этанолом, осушали и растворяли в воде. Во избежание примесей геномной ДНК, которые могут влиять на результат ПЦР (Bustin S., 2002), все образцы обрабатывали ДНКазой (Promega, Madison, WI, США) с последующей экстракцией фенол-хлороформом. Полученную РНК растворяли в 25 мкл

раствора для сохранения РНК (RNAsecure Reagent, Ambion, Houston, TX, США). Качественный контроль и определение количества выделенной РНК каждого образца (2 мкл) проводили на спектрофотометре (UV-Vis спектрофотометр Agilent 8453, Agilent Technologies).

Обратную транскрипцию проводили ревертазой вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV RT, Promega, Madison, WT, США) в течение 1,5 ч при 37°С. В реакцию брали 2 мкг РНК, добавляли 200 нг random-гексапраймера (Медиген, Новосибирск). Для сохранности РНК в реакционную смесь добавляли ингибитор РНКаз (RNasin, Promega, Madison, WI, США). Общий объем реакционной смеси 25 мкл.

ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США) с помощью набора для амплификации (Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ, Синтол, Москва), содержавшего 2,5х буфер (KCl, ТрисНС1 (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2), Taq ДНК-полимеразу, деоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20. В реакционную смесь добавляли смесь праймеров (30 пМ), флуоресцентный зонд (15 пМ) и образец кДНК (1,5 мкл). Нуклеотидные последовательности зондов и проб TaqMan: RyR2 (F) 5'-TGCTGCGAGCCGGG-3\ RyR2 (R) 5'-TGGCGGTGGCGTAGGA-3\ RyR2 проба 5'-ACTATGA CCTGCTGATTGACATCCACCTCA-3'; SERCA2a (F) 5'-CAGCCA-TGGAGAACGCTCA-3SERCA2a (R) 5'-TCGTTGACCCCGAAGTGG-3', SERCA2a проба 5'-ACAAAGACCGTGGAGGAGGTGCTGG-3'; 18S rRNA (F) 5'-TGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAG-3', 18S rRNA (R) 5'-AGTCAAATTAAGCCGCAGGC-3', 18S rRNA проба 5 '-CCTGGTGGTGCCCTTCCGTCA-3 ' (Sallinen P. et al., 2007).

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; после этого следовали 45 циклов: денатурация при 95°С - 15 сек, отжиг, элонгация при 60°С - 40 сек, сбор данных по флуоресценции. После окончания ПЦР снимали кривые плавления для контроля специфичности реакции. Из полученных образцов кДНК делали «усредненный» раствор кДНК, объединяющий образцы животных всех групп. Его использовали для построения калибровочных кривых, по которым определяли относительный уровень кДНК для целевых генов и гена сравнения в образцах. Реакцию ставили в трех повторах для каждого гена.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы MicrosoftOfficeExcel 2007. Все данные представлены в виде среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Межгрупповые различия оценивали с помощью t-критерия при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При моделировании гиперхолестеринемии у всех животных не выявлены нарушения пищеварения и дефекации в течение всего экспериментального срока. Поведение животных и их внешний вид в опытных

Таблица 1. Масса тела, абсолютные массы сердца и печени крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила (М±т)

Группы животных Масса тела, г Масса сердца, г Масса печени, г

Через 30 сут эксперимента

Контроль (п=5) 295,8±7,8 1,12±0,05 9,80 ± 0,72

1-я группа (п=5) 333,8±20,8 1,04±0,07 15,80 ± 1,62"

2-я группа (п=5) 332,8±10,4* 1,12±0,08 15,68 ±0,94"*

Через 64 сут эксперимента

Контроль (п=5) 366,8±22,5 1,24±0,07 12,37±0,83

1-я группа (п=6) 315,8±18,7 0,96±0,05" 12,73±0,91

1-я группа + верапамил (п=6) 339,0±15,9 1,03±0,05* 14,00±1,45

2-я группа (п=6) 328,8±7,9 1,04±0,02" 11,32±0,41

2-я группа + верапамил (п=6) 365,9±14,3 1,09±0,04 13,29±0,761

Примечание. * - р<0,05; " - р<0,01; *" - р<0,001, по сравпеншо с контролем; t- р<0,05, по сравнению со 2-й группой (t-тест).

группах не отличалось от контроля, не было случаев проявления чрезмерной агрессии или апатии. Падеж животных отсутствовал на протяжении всего эксперимента

Через 30 сут после начала эксперимента масса тела животных 1-й группы достоверно не отличалась от контроля, в то время как масса тела животных 2-й группы была выше на 11% (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 1). При вскрытии у них отмечали некоторое увеличение жировой прослойки, однако выраженных признаков ожирения не было. Абсолютная масса сердца у животных обеих опытных групп практически не отличалась от таковой в контрольной группе. Абсолютная масса печени возросла в 1-й группе на 38% (р<0,01), во 2-й - на 37,5% (р<0,001) по сравнению с контролем.

Через 64 сут после начала эксперимента существенных различий в массе тела животных разных групп не выявлено (см. табл. 1). Абсолютная масса сердца была уменьшена в 1-й группе на 23% (р<0,01), в 1-й группе с введением верапамила - на 17% (р<0,05), во 2-й группе - на 16% (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. Во 2-й группе с введением верапамила абсолютная масса сердца статистически не отличалась от контрольной группы. Абсолютная масса печени у животных во всех опытных группах практически не отличалась от таковой в контроле. Во 2-й группе с введением верапамила масса печени была на 15% больше (р<0,05), чем у крыс 2-й группы без введения верапамила.

Учитывая индивидуальную вариабельность массы тела животных, не связанную с изменением размера жировых депо, для дальнейшей характеристики модели целесообразно использовать не абсолютные, а относительные массы органов, которые представляют больше информации об изменении функционального состояния.

Таблица 2. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс Вистар при моделировании гиперхолсетерииемии и введении верапамила (М±т)

Группы животных ХС, мМ/л ТГ, мМ/л ЛПВП, мг/дл ЛПНП, мг/дл ЛПНП/ ЛПВП

Через 30 сут эксперимента

Контроль 1,79±0,20 1,00±0,44 74,86±12,36 21,50±4,46 0,77±0,31

1-я группа 2,53±0,24* 1,24±0,18 105,12±13,41 33,80±9,79 0,95±0,38

2-я группа 2,12±0,23 1,64±0,53 67,12±10,65 П,90±3,65 0,22±0,09

Через 64 сут эксперимента

Контроль 2,28±0,13 0,99±0,19 81,70±7,30 12,48±2,16 0,24±0,06

1-я группа 2,41±0,16 0,69±0,20 62,72± 10,66 6,52±1,66* 0,08±0,02

1-я группа + верапамил 2,47±0,23 1,40±0,16 67,18±11,35 5,50±2,33 0,07±0,02

2-я группа 2,58±0,19 0,82±0,13 75,63±7,44 6,40±2,17 0,08±0,03

2-я группа + верапамил 2,21±0,22 1,47±0,31 55,13±8,42* 7,98±1,9б 0,13±0,03

Примечание. ХС - холестерин, ТГ - триглицериды, ЛПВП - липопротеиды высокой плотности, ЛПНП - липопротеиды низкой плотности. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

Относительная масса сердца через 30 сут после начала эксперимента была снижена в 1 -й группе на 18% (р<0,01), во 2-й группе - на 11 % (р<0,05) по сравнению с контролем. Относительная масса сердца через 64 мес после начала эксперимента в 1-й группе была снижена на 11% (р<0,05), в 1-й группе с введением верапамила снижение составило 10% (р<0,05) по сравнению с контролем. Во 2-й группе относительная масса сердца не отличалась от контрольной группы, во 2-й группе с введением верапамила снижение составило 10% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой.

Снижение относительной массы сердца во всех экспериментальных группах свидетельствует о кардиодепрессивном действии атерогенной диеты. Обратная корреляция относительной массы сердца с уровнем общего холестерина в сыворотке крови (г=-0,32) подтверждает роль холестерина в повреждении миокарда. Развитие кардиомиопатии может быть обусловлено повышенным клеточным захватом липидов в сердце (Cole L.K. et al., 2011).

Биохимические показатели сыворотки крови крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила. Через 30 сут после начала эксперимента в 1-й группе общий уровень холестерина был на 41% (р<0,05) выше по сравнению с контролем, во 2-й группе - на 18% (табл. 2). Через 64 сут после начала эксперимента общий уровень холестерина в сыворотке крови значимо не различался во всех группах, но был повышен на 6 - 23% (см. табл. 2). Отмечена умеренная отрицательная корреляция уровня общего холестерина в сыворотке крови с относительной массой сердца (г=-0,32).

Аналогичное повышение уровня общего холестерина было отмечено и другими авторами при содержании животных в течение 1 мес на диете с высоким содержанием жира (Vergnes L. et al., 2003; Verdeguer F. et al., 2007; Neyrinck A.M. et al., 2012). Менее выраженное повышение уровня общего холестерина в сыворотке крови крыс через 64 сут может быть обусловлено большими видовыми адаптивными возможностями крыс с возможным усилением метаболизма липопротеинов в печени.

Увеличение относительной массы печени через 30 сут после начала эксперимента (см. табл. 1) отражает возросшую функциональную активность органа при изменении рациона животных. Усиление детоксикационной функции печени, связанное с выведением избыточного холестерина, сопровождается менее выраженными изменениями липидного спектра плазмы крови (Сох R.A., Garcia-Palmieri M.R., 1990), которое мы обнаружили у животных через 64 сут.

Уровень триглицеридов через 30 сут после начала эксперимента достоверно не отличался во всех группах, хотя следует отметить увеличение этого показателя на 24 и 64% соответственно в 1-й и 2-й группах (см. табл. 2). Через 64 сут после начала эксперимента уровень триглицеридов в 1-й группе был ниже на 30% по сравнению с контролем. При воздействии верапамила уровень триглицеридов был увеличен как в 1-й, так во 2-й группах почти в одинаковой степени (соответственно на 41 и 48%). Обнаружена умеренная корреляция уровня триглицеридов в сыворотке крови с относительной массой печени (г=0,37).

Через 30 сут после начала эксперимента уровень ЛПВП в 1 -й экспериментальной группе был выше соответственно на 40 и 36% по сравнению с контрольной и со 2-й группами. Через 64 сут уровень ЛПВП в 1 -й и 2-й группах был ниже соответственно на 23 и 7% по сравнению с контрольной группой. Наиболее значительное уменьшение уровня ЛПВП по сравнению с контролем было выявлено через 64 сут во 2-й группе с введением верапамила — на 33% (р<0,05).

Через 30 сут после начала эксперимента уровень ЛПНП в 1-й экспериментальной группе был выше контрольных значений и значений во 2-й группе соответственно на 57 и 65%. Через 64 сут уровень ЛПНП в 1-й и 2-й группах был ниже соответственно на 48 и 49% (р<0,05) по сравнению с контролем. Введение верапамила вызывало уменьшение этого показателя в разной степени: в 1-й группе - на 56%, во 2-й группе - на 36%.

Морфологические изменения миокарда крыс при моделировании гнперхолестеринемии и введении верапамила. Через 30 сут после начала эксперимента у крыс 1 -й и 2-й экспериментальных групп отмечались сходные морфологические изменения миокарда: очаговое разволокнение в результате отека и мозаичность окрашивания кардиомиоцитов. Встречались кардиомиоциты с диффузными литическими изменениями саркоплазмы, деструкцией и просветлением околоядерных зон и кардиомиоциты с резко эозинофильной саркоплазмой. Преобладали кардиомиоциты с

просветленной разреженной саркоплазмой. В субэпикардиальных зонах миокарда вблизи основания сердца регистрировались скопления «малых» кардиомиоцитов.

Отмечалась диффузная коллагенизация соединительнотканной стро-мы. Сосуды (преимущественно вены) были полнокровными, в просвете сосудов часто встречались липидные капли, наблюдался сладок эритроцитов. В интрамуральных артериях с выраженным мышечным слоем отмечалась гипертрофия и гиперплазия гладкомышечных клеток. В отдельных участках миокарда наблюдались свежие кровоизлияния и плазморрагии. Периваскулярно регистрировались единичные моноциты, встречались тучные клетки; наблюдался умеренный периваскулярный фиброз. В интерстиции вблизи сосудов наблюдались скопления липидных капель, размеры которых варьировали.

Через 64 сут после начала эксперимента у крыс обеих основных группы (без введения верапамила) сохранялись отмеченные ранее морфологические изменения миокарда, но они были более выраженными. В миокарде преобладали кардиомиоциты с литическими изменениями. В этот срок эксперимента в миокарде также регистрировались кластеры «малых» кардиомиоцитов. Отмечался выраженный отек миокарда, его разволокнение. Манифестировали выраженные нарушения кровообращения: полнокровие сосудов (преимущественно вен и капилляров), свежие гемо- и плазмора-гии. Обращали на себя внимание выраженные изменения тинкгориальных свойств и формы эритроцитов, они часто имели звездчатую форму, были увеличены в размерах, часто наблюдался сладж эритроцитов. В этот срок эксперимента наблюдалось усиление диффузного фиброзирования миокарда, появление небольших очагов кардиосклероза. В интерстиции также наблюдались небольшие липидные капли, преимущественно вблизи сосудов.

В подгруппах животных с введением верапамила через 64 сут после начала эксперимента общий характер изменений миокарда был таким же, как и в группах без введения препарата. При этом литические изменения кардиомиоцитов были менее выраженными, в то время как полнокровие сосудов было таким же выраженным, как и в группах без введения верапамила. Наблюдалось диффузное фиброзирование стромы миокарда, которое было более выраженным у крыс 1-й группы.

В отличие от человека и экспериментальных моделей на кроликах, экспериментальная гиперхолестеринемия у крыс не вызывает гемоцир-куляторных нарушений в миокарде, обусловленных выраженным ате-росклеротическим процессом. В нашем исследовании у крыс также не происходило значительных изменений липопротсинового профиля сыворотки крови, сопоставимых с таковыми у людей или кроликов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии. Однако при гистологическом исследовании мы обнаружили у крыс диффузный кардиосклероз, наряду с мелкими фокусами кардиосклероза, что также наблюдается при исследовании атеросклеротического сердца людей и в экспериментальных

Таблица 3. Тканевый стереологический анализ миокарда крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила (М±ш)

Группы животных Объемная плотность, % Объемное отношение

КМЦ капилляров соединительной ткани капилляров к КМЦ соединительной ткани к КМЦ

Через 30 сут эксперимента

Контроль 81,76±1,96 6,14±0,14 12,10±1,88 0,075±0,003 0Д49±0,026

1-я группа 74,46±1,19 6,20±0,47 19,34±0,78* 0,083±0,007 0,260±0,014"

2-я группа 73,85±1,65 7,01 ±0,23* 19,14±1,52* 0,095±0,005* 0Д60±0,026**

Через 64 сут эксперимента

Коетроль 80,35±0,70 7,50±0,27 12,14±0,97 0,093±0,003 0,151±0,013

1-я группа 74,99±0,68 6,70±0,77 18,31±0,10" 0,090±0,011 0,244±0,00Г*

1-я группан-верапамил 76,22±0,75 5,70±0,31* 18,09±1,02" 0,075±0,004* 0,238±0,016"

2-я группа 78,45±2,08 5,61 ±0,16* 15,94±1,96 0,072±0,004 0,206±0,032

2-я группа + верапамил 78,15±0,70 6,18±0,68 15,67±1,04* 0,079±0,001 0,201±0,010

Примечание. КМЦ - кардиомиоциты; * - р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с контролем.

моделях на кроликах (Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д., 2006). Сходство гистологической картины фиброзирования миокарда в условиях атеро-гёйной диеты у разных биологических видов, отличающихся липидным метаболизмом, подтверждает независимое от атеросклеротического процесса холестериновое повреждение кардиомиоцитов.

Морфометрический и стереологический анализ миокарда крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила. Через 30 сут после начала эксперимента отмечалась тенденция к снижению объемной плотности кардиомиоцитов в обеих экспериментальных группах (табл. 3). Объемная плотность соединительной ткани, наоборот, достоверно возрастала на 60 и 58% соответственно у крыс 1-й и 2-й групп. В результате этих изменений происходило увеличение объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам на 74% у крыс обеих опытных групп (см. табл. 3).

Относительный объем капилляров через 30 сут после начала эксперимента у крыс 1 -й группы возрастал незначительно, в то время как у крыс 2-й группы этот показатель был повышен на 14% (р<0,05). В результате этих изменений объемное отношение капилляров к кардиомиоцитам в 1-й группе было увеличено на 11%, а у крыс 2-й группы - на 27% (р<0,05) по сравнению с контролем.

Через 64 сут после начала эксперимента относительный объем кардиомиоцитов в 1-й.группе без введения и с введением верапамила снижался соответственно на 7 и 5%, во 2-й группе практически не отличался от

контроля (см. табл. 3). Объемная плотность соединительной ткани миокарда через 64 сут эксперимента была увеличена у крыс 1-й группы как без введения, так и с введением верапамила (на 49 - 51%, р<0,01). Такие изменения обусловили увеличение объемного отношения соединительной ткани к кардиомиоцитам в обеих подгруппах на 58 - 62% (р<0,05).

Относительный объем капилляров через 64 сут после начала эксперимента в 1-й группе был снижен по сравнению с контрольной группой на 11%, еще в большей степени этот показатель уменьшался в подгруппе с введением верапамила (на 24%, р<0,05). Подобные изменения обусловили достоверное уменьшение объемного отношения капииляров к кардиомиоцитам у крыс 1-й группы с введением верапамила (на 19%, р<0,05).

У крыс 2-й группы без введения и с введением верапамила объемная плотность кардиомиоцитов практически не отличалась от контроля. Объемная плотность капилляров у крыс 2-й группы без введения верапамила была уменьшена на 25% (р<0,05), а объемная плотность соединительной ткани увеличена на 31 %. При введении верапамила отмечалось менее выраженное уменьшение объемной плотности капилляров (на 18%) и менее выраженное увеличение объемной плотности соединительной ткани (на 29%). Тем не менее, объемное отношение соединительной ткани к кардиомиоцитам у крыс обеих подгрупп 2-й группы оставалось увеличенным (соответственно на 36 и 33%).

Анализ изменений диаметров кардиомиоцитов через 30 сут после начала эксперимента выявил тенденцию к увеличению данного показателя у крыс 1-й группы и достоверное его снижение у крыс 2-й группы (табл. 4). Через 64 сут после начала эксперимента у крыс 1-й группы диаметр кардиомиоцитов был увеличен (в среднем на 8%) вне зависимости от того, принимали они верапамил или нет (см. табл. 4). Эти изменения отражают развитие гипертрофии кардиомиоцитов при включении в рацион крыс экзогенного холестерина.

Через 30 сут после начала эксперимента выборки во всех группах были однородными (коэффициент вариации не превышал 33%). Коэффициент асимметрии во всех группах был положительным, во 2-й группе близким к нулю. Коэффициент эксцесса в обеих экспериментальных группах был меньше, чем в контрольной группе: в 1-й группе - на 27%, во 2-й группе - на 33% (см. табл. 4).

Через 64 сут коэффициент асимметрии в контрЬльной группе был отрицательным, в опытных группах - положительным, причем во 2-й группе без введения верапамила он был близок к нулю, как и через 30 сут после начала эксперимента. Коэффициент эксцесса в 1-й группе был меньше на 20%, а в 1-й группе с введением верапамила - на 12%, нем в контрольной группе, что отражает рост вариабельности признака. Во 2-й группе коэффициент эксцесса был сопоставим с таковым в контрольной группе. Введение верапамила повысило коэффициент эксцесса в 1 -й группе на 9%, во 2-й группе - на 4% (см. табл. 4). Эти данные свидетельствуют о том,

15 1

Таблица 4. Показатели дифференциации вариационного ряда диаметров кардиомиоцитов у крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила (М±т)

Группы животных Диаметр КМЦ, мкм V,% Ка Е

Через 30 сут эксперимента

Контроль 11,57±0,13 17,97 0,54 4,01

1-я группа ll,93±0,14ttt 21,98 0,36 2,93

2-я группа 11,05±0,09** 15,37 0,03 2,68

Через 64 сут эксперимента

Контроль 11,56*0,10 13,67 -0,11 3,58

1-я группа 12,45±0,13"*tit 17,10 0,20 2,87

1 -я группа + верапамил 12,40±0,17"*«i 19,98 0,22 3,14

2-я группа 11,53±0,08 14,84 0,03 3,33

2-я группа+ верапамил 11,41±0Д0 15,16 0,29 3,47

Примечание. КМЦ - кардиомиоциты, V - коэффициент вариации, Ка - коэффициент асимметрии, Е - коэффициент эксцесса. " - р<0,01; *** — р<0,001, по

Шавненшо с контрольной группой;+ - - р<0,001, по сравнению со 2-й группой; : - р<0,001, по сравнению со 2-й группой с введением верапамила (Ч-тест).

что введение верапамила препятствует росту вариабельности диаметров кардиомиоцитов при гиперхолестеринемии.

О вариабельности выборки также можно судить по островершинности распределения. Чем больше коэффициент эксцесса, тем компактнее расположены наиболее часто встречающиеся варианты распределения. Соответственно, уплощение кривой распределения свидетельствует о повышении вариабельности признака. Уменьшение коэффициента эксцесса мы наблюдаем в группах с повышенным содержанием холестерина в рационе через 30 и 64 сут после начала эксперимента, по сравнению с контрольными группами соответствующего срока.

Положительный коэффициент асимметрии в 1-й группе на протяжении всего эксперимента отражает преобладание в минорных фракциях кардиомиоцитов с большим диаметром, нежели с меньшим, относительно средней арифметической распределения. Все эти результаты указывают на прямую связь между повышенным содержанием холестерина в рационе крыс и развитием гипертрофии отдельных кардиомиоцитов. В противоположность влиянию экзогенного холестерина, введение мерказолила обусловливало уменьшение диаметра кардиомиоцитов как через 30 сут, так и через 64 сут эксперимента (см. табл. 4), что связано со снижением анаболического влияния тиреоидных гормонов в результате подавления мерказолилом функции щитовидной железы.

Количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила. Через 30 сут после начала эксперимента у крыс 1-й и 2-й

Таблица 5. Количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии н введении вера-памила (М±т)

Группы животных Общая численность КМЦ, х10б Концентрация КМЦ, 103кл./мг Доля одноядерных КМЦ, % Доля дву-ядерных КМЦ, % Доля многоядерных КМЦ, %

Через 30 сут эксперимента

Контроль 18,37±2,56 19,79±0,99 11,57±0,79 87,00±0,90 1,43±0,13

1-я группа 21,92±1,68 21,66±0,92 9,60±0,32* 88,20±0,29 2,20±0,26*

2-я группа 23,67±2,97 21,38±1,47 10,33±0,60 87,93±0,39 1,73±0,22

Через 64 сут эксперимента

Контроль 22,61 ±0,17 18,54±0,55 9,53±1,05 88,93±1,05 1,53±0,03

1-я группа 19,83±1,40 21,73±0,87* 12,47±0,67* 86,47±0,52 1,07±0,19*

1-я группа + верапамил 22,44±1,40 23,56±1,15**++ 12,60±0,64 86,13±0,49*й l,27±0,15i

2-я группа 20,36±0,77* 21,02±0,91* 9,73±1,42 88,83±1,25 1,43±0,2б

2-я группа + верапамил 19,55±1,27* 18,60±0,27^ 6,37±0,93 91,83±0,98 1,80±0,06"

Примечание. КМЦ - кардиомиоциты;' - р < 0,05; *' - р < 0,01 по сравнению с контролем; t - р <0,05 по сравнению со 2-й группой; * - р < 0,05; И - р < 0,01 по сравнению со 2-й группой с введением верапамила (Ч-тест).

групп отмечено увеличение абсолютной численности кардиомиоцитов (соответственно на 19 и 29%) и их концентрации в 1 мг сердечной ткани (соответственно на 9 и 8%). Е 1-й группе доля одноядерных кардиомиоцитов уменьшилась на 17% (р<0,05), а доля многоядерных (трех- и более) кардиомиоцитов увеличилась на 35% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой (табл. 5).

Изменение соотношения ядерности кардиомиоцитов в 1-й экспериментальной группе через 3 0 сут после начала эксперимента - увеличение доли многоядерных с одновременным снижением доли одноядерных кардиомиоцитов - происходило при умеренном увеличении абсолютной численности и концентрации кардиомиоцитов по сравнению с контрольной группой. Это можно интерпретировать как активацию кариокинеза без последующего цитокинеза. Такое увеличение ядерности функциональных кардиомиоцитов, по-видимому, способствует усилению синтетических процессов и может рассматриваться как адаптивная реакция к повышенной нагрузке.

Через 64 сут после начала эксперимента выявлено уменьшение абсолютной численности кардиомиоцитов у крыс 2-й - на 10% (р<0,05) без введения верапамила и на 13,5% (р<0,05) с введением верапамила. Увеличение концентрации кардиомиоцитов выявлено у крыс 1-й (на 15%, р<0,05), наиболее заметно при введении верапамила (на 21%; р<0,01). У крыс 2-й увеличение концентрации кардиомиоцитов выявлено только в подгруппе без введения верапамила (на 12%, р<0,05). Введение верапамила .

крысам 2-й группы приводило к снижению концентрации кардиомиоцитов на 12% (р<0,05).

Через 64 сут после начала эксперимента у крыс 1-й группы отмечено увеличение доли одноядерных кардиомиоцитов на 24% (р<0,05) и уменьшение доли многоядерных кардиомиоцитов на 30% (р<0,05), по сравнению с контрольной группой. В 1-й группе с введением верапамила доля одноядерных кардиомиоцитов увеличилась на 24% (р<0,05), а доля двуядерных - уменьшилась на 3% (р<0,05).

Во 2-й экспериментальной группе не было значимых отклонений в распределении ядерности кардиомиоцитов от контрольной группы. При введении верапамила доля многоядерных кардиомиоцитов возросла на 15% (р<0,01), по сравнению с контрольной группой. В 1-й экспериментальной группе с введением верапамила, по сравнению со 2-й группой с введением верапамила, доля одноядерных кардиомиоцитов была больше на 49% (р<0,01), доля двуядерных кардиомиоцитов - меньше на 6% (р<0,01), а многоядерных - меньше на 49% (р<0,05) (см. табл. 5).

Оценке соотношения одно- и двуядерных кардиомиоцитов в последнее время придается особое значение при определении регенераторного потенциала миокарда. Популяцию одноядерных кардиомиоцитов многие авторы рассматривают в качестве одного из регенераторных резервов миокарда (Лушникова Е.Л. и др., 2011; Chen X. et al., 2007).

При анализе численности и ядерности кардиомиоцитов животных через 64 сут после начала эксперимента обнаружились различные регенераторные стратегии. Во 2-й экспериментальной группе снизилась абсолютная численность кардиомиоцитов, что обусловило снижение абсолютной и относительной массы сердца. В 1-й экспериментальной группе, напротив, при снижении абсолютной и относительной масс сердца абсолютная численность кардиомиоцитов существенно не отличалась от контрольной группы. Вместе с этим заметно повысилась доля одноядерных кардиомиоцитов с увеличением общей концентрации кардиомиоцитов в ткани миокарда. Это может свидетельствовать о формировании пула новообразованных кардиомиоцитов взамен погибших. Выявленное нами увеличение доли одноядерных кардиомиоцитов можно рассматривать как активацию клеточных форм регенерации кардиомиоцитов, способствующую сохранению или увеличению общего числа кардиомиоцитов в сердце.

Обнаружена умеренная корреляция концентрации кардиомиоцитов с относительным объемом стромы миокарда (г=0,32) и умеренная отрицательная корреляция с уровнем триглицеридов в крови (г=-0,31) и парен-химатозно-стромальным отношением (i=-0,31). Абсолютная численность кардиомиоцитов обнаруживала заметную отрицательную корреляцию с паренхиматозно-стромальным отношением в миокарде (r=-0,51), умеренно коррелировала с уровнем холестерина фракции ЛПВП (г=0,33), относительным объемом стромы миокарда (г=0,44) и слабо коррелировала с относительной массой печени (г=0,27).

Доля одноядерных кардиомиоцитов заметно коррелировала с концентрацией кардиомиоцитов (г=0,51) и умеренно отрицательно - с уровнем триглицеридов в крови (г=-0,35). Доля двуядерных кардиомиоцитов очень сильно отрицательно коррелировала с долей одноядерных кардиомиоцитов (г=-0,99), заметно отрицательно - с концентрацией кардиомиоцитов (г=-0,51). Доля многоядерных кардиомиоцитов заметно коррелировала с относительным объемом капилляров (г=0,66) и отношением капилляры/ кардиомиоциты (г=0,56), заметно отрицательно коррелировала с долей одноядерных кардиомиоцитов (г=-0,56), умеренно коррелировала с долей двуядерных кардиомиоцитов (г=0,41), уровнем триглицеридов (г=0,43), холестерином фракций ЛПНП (г=0,49) и ЛПВП (г=0,36), а также соотношением ЛПНП/ЛПВП (г=0,47).

Иммуногистохимический анализ пролиферативной активности кардиомиоцитов при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила. Антиген Ю-67 выявлялся преимущественно в одноядерных кардиомиоцитах. Через 30 сут после начала эксперимента доля меченных Кл-67 ядер кардиомиоцитов в 1 -й группе увеличилась в 14,5 раз (р<0,05), во 2-й группе - в 16,7 раз (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 6).

Через 64 сут после начала эксперимента доля меченных Кл-67 ядер кардиомиоцитов была увеличена во всех экспериментальных группах по сравнению с контролем (см. табл. 6): в 1 -й группе - в 9,2 раза (р<0,05), в 1 -й группе с введением верапамила - в 11,1 раза (р<0,05), во 2-й группе - в 8,2 раза (р<0,05), во 2-й группе с введением верапамила - в 8,4 раза (р<0,01).

Повышение индекса меченных Ю-67 ядер кардиомиоцитов в обеих экспериментальных группах свидетельствует о выходе кардиомиоцитов из фазы покоя и вступлении их в клеточный цикл. Источником новообразованных кардиомиоцитов могут быть клетки-предшественники из костного мозга, мигрирующие в миокард, эмбриональные стволовые клетки и кардиальные стволовые клетки (ВоШш Б. et а1., 2011), а также нетерминально дифференцированные одноядерные кардиомиоциты (Лушникова Е.Л. и др., 2011). Именно пролиферация одноядерных нетерминально дифференцированных кардиомиоцитов обеспечивает физиологическое обновление популяции кардиомиоцитов в течение жизни и при репара-тивной регенерации (Ьеп А. е1 а1., 2011).

Оценка экспрессии генов ЯуК2 и 8ЕЫСА2а в миокарде крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила. В 1-й группе количество мРНК ЯуЯ2 в миокарде крыс Вистар через 30 сут после начала эксперимента снизилось на 73,3% (р<0,01) по сравнению с контрольной группой (рис. 1, а). Во 2-й группе снижение составило 66,9% (р<0,01) по сравнению с контрольной группой (см. рис. 1, а). Количество мРНК гена субъединицы саркоплазматической Са2+АТФазы 8Е11СА2а через 30 сут эксперимента снизилось в миокарде крыс 1 -й группы на 91,4% (р<0,001), у крыс 2-й группы - на 75,4% (р<0,01) по сравненшо с контролем (рис. 1, б).

Таблица 6. Доля ядер кардиомиоцитов, меченных Ю-67, в миокарде крыс Вистар при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила (М±т)

Группы животных Кь67 позитивные кардиомиоциты, %

Через 30 сут эксперимента

Контроль 0,010±0,010

1-я группа 0,145±0,062 *

2-я группа 0,167±0,061 *

Через 64 сут эксперимента

Контроль 0,019 ±0,019

1-я группа 0,174 ±0,057*

1-я группа + верапамил 0,211 ±0,053 *

2-я группа 0,155 ±0,050 *

2-я группа + верапамил 0,160 ±0,032**

Примечание. * - р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с контролем (Ч-тест).

Количество мРНК гена рианодинового рецептора в миокарде крыс Вистар через 64 сут после начала эксперимента у крыс 1-й группы было снижено на 63,6% (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 2, а). При введении верапамила достоверного снижения этого показателя по сравнению с контролем не выявлено. У крыс 2-й группы данный показатель был уменьшен на 11,1% (р<0,05), при введении верапамила снижение составило 55,8% (р<0,05) от контрольного уровня (см. рис. 2, а).

Количество мРНК гена субъединицы саркоплазматической Са2+АТФазы 8ЕЯСА2а в миокарде крыс Вистар через 64 сут после начала эксперимента у крыс 1-й группы было уменьшено на 61,5% (р<0,05), при введении верапамила этот показатель достоверно не отличался от контроля (рис. 2, б). Во 2-й экспериментальной группе снижение данного показателя составило 54,1% (р<0,05), при введении верапамила-48,1% (р<0,05) (см. рис. 2, б).

Обнаружена умеренная корреляционная связь количества мРНК КуЯ2 (г=0,36) и мРНК 8ЕЯСА2а (г=0,37) с относительной массой сердца. Количество мРНК 11у112 слабо отрицательно коррелировало с уровнем общего холестерина в крови (г=-0,30). Количество мРНК 8ЕИСА2а слабо отрицательно коррелировало с уровнем триглицеридов (г=-0,25) и фракции ЛПВП (г=-0,25) в крови. Обнаружена сильная корреляция (1=0,87) между количеством мРНК ЯуЯ2 и 8ЕЯСА2а.

Корректирующее воздействие любого фармакологического препарата является предметом, открытым для изучения. Зачастую остается неясным, на каком уровне происходит коррекция патологического состояния - до-зозависимая компенсация биохимического равновесия, конкурентное связывание или нормализация функциональной активности клеток, что затрудняет прогнозирование дальнейшего развития процесса. Многие препараты обладают плейотропным действием, их эффекты могут быть

контр 1 группа 2 группа

контр

1 группа 2 группа

Рис. 1. Количество мРНК КуК2 (а) и Я ИКСА 2а (б) в миокарде крыс Вистар через 30 сут содержания на атерогенной диете.

0,35

контр 112

группа группа группа группа + вер. + вер.

контр 112 2

группа группа группа группа + вер. + вер.

Рис. 2. Количество мРНК RyR2 (а) и SERCA2a (б) в миокарде крыс Вистар через 64 сут содержания на атерогенной диете.

отсроченными. Поэтому необходима комплексная оценка системного действия препарата в экспериментальных условиях.

Влияние верапамила на метаболизм холестерина остается дискуссионным вопросом. В нашем исследовании верапамил значимо не влиял на изменения биохимических параметров крови: общий уровень холестерина, уровень триглицеридов, уровень холестерина фракций ЛПВП и ЛПНП.

В то же время при введении верапамила наблюдалась нормализация доли многоядерных кардиомиоцитов в 1-й экспериментальной группе. Во 2-й экспериментальной группе введение верапамила сопровождалось повышением ядерности кардиомиоцитов, что может свидетельствовать об усилении активности синтетических процессов клетки,и адаптации к повышенной нагрузке.

При введении верапамила происходило повышение уровня мРНК RyR2 и SERCA2a в миокарде крыс 1-й экспериментальной группы. Это косвенно подтверждает то, что в механизме изменения функциональной активности генов при гиперхолестеринемии задействованы Са2+-каналы L-типа. Исследования in vitro показали, что фармакологический арест

сокращений кардиомиоцитов при поддержании Са2+-токов сопровождается ростом экспрессии мРНК SERCA2a, введение верапамила приводит к нормализации уровня мРНК SERCA2a в кардиомиоцитах (Vlasbom R. et al., 2004; Wu X.D. et al., 2004). Мы установили, что в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии при развитии кардиомиопатии верапамил m vivo также способствует нормализации уровня мРНК RyR2 и SERCA2a в кардиомиоцитах.

ВЫВОДЫ

1. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в течение 30 сут приводит к повышению уровня холестерина в сыворотке крови (гиперхолестеринемии) на 41 и 18% и повышению уровня тригаицеридов (гипертриглицеридемии) на 24 и 64%. Через 64 сут общий уровень холестерина в сыворотке крови у крыс обеих групп с введением и без введения верапамила существенно не отличается от контроля. Введение верапамила сопровождается повышением уровня триглицеридов соответственно на 41 и 48% у крыс 1-й и 2-й групп.

2. Развитие гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии в течение 30 сут не приводит к значимым изменениям абсолютной массы сердца у животных обеих экспериментальных групп. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в течение 64 сут приводит к снижению абсолютной массы сердца соответственно на 23 и 16% в подгруппах без введения верапамила и соответственно на 17 и 12% - в подгруппах с введением верапамила.

3. Морфологические изменения миокарда при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в течение 30 сут носят сходный характер (преобладание кардиомиоцитов с литическими изменениями, выраженное полнокровие вен и капилляров, интерстициальный отек, диффузный фиброз, гипертрофия и гиперплазия гладкомышечных клеток в интрамуральных артериях). Гиперхолестери-немия вызывает выраженные изменения морфологии эритроцитов (появление «звездчатых» форм, слипание эритроцитов), и сопровождается накоплением липидных капель в интерстиции, особенно вблизи кровеносных сосудов.

4. Увеличение срока содержания на атерогенной диете (до 64 сут) приводит к усилению выраженности морфологических изменений миокарда у крыс обеих групп, что проявляется в основном в увеличении количества кардиомиоцитов с литическими изменениями. Введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов и фибропластических реакций стромы с сохранением более выраженного диффузного фиброзирования стромы у крыс 1-й группы.

, 5. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином в течение 3 0 сут приводит к уменьшению на 17% доли одноядерных и уве-

личению на 35% доли многоядерных (трех- и более) кардиомиоцитов. Через 64 сут на 24% увеличивается доля одноядерных и на 30% уменьшается доля многоядериых кардиомиоцитов. Введение верапамила приводит к нормализации доли многоядерных клеток за счет уменьшения доли двуядерных кардиомиоцитов. Содержание крыс на атерогенной диете с мерказолилом не меняет соотношение субпопуляций кардиомиоцитов, при этом общая численность кардиомиоцитов через 64 сут уменьшается на 10%. Введение верапамила приводит к увеличению доли многоядерных кардиомиоцитов, общая численность кардиомиоцитов остается сниженной на 13,5%,

6. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в течение 30 сут сопровождается усилением пролифе-ративной активности кардиомиоцитов (индекс мечения ядер кардиомиоцитов Кл-67 повышен в 14,5 и 16,7 раз по сравнению с контролем). Через 64 сут доля меченных Кл-67 ядер кардиомиоцитов остается повышенной - в 9,2 и 8,2 раза в подгруппах без введения верапамила ив 11,1 и 8,4 раза в подгруппах с введением верапамила.

7. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в течение 30 сут приводит к уменьшению в миокарде крыс Вистар количества мРНК ЯуЯ2 (соответственно на 73,3 и 66,9%) и мРНК 8ЕЯСА2а (соответственно на 91,4 и 75,4%). Через 64 сут в подгруппах без введения верапамила количество мРНК Яу!^2 остается сниженным на 63,6 и 71,7%, количество мРНК 8ЕИСА2а- на 61,5 и 54,1%. Введение верапамила при содержании на атерогенной диете с экзогенным холестерином приводит к исчезновению статистических различий по количеству мРНК ЯуЯ2 и 8ЕКСА2а с контрольной группой. При содержании на атерогенной диете с мерказолилом и введением верапамила количество мРНК КуИ2 и БЕЯСА2а остается сниженным на 55,8 и 48,1%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Южик Е.И., Лушникова Е.Л. Медико-биологические аспекты моделирования атеросклеротического процесса // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10 (1). - С. 176 -183.

2. Южик Е.И. Медико-биологические аспекты моделирования атеросклеротического процесса // 1-я Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, 2012.-С. 193-195.

3. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Южик Е.И. Структурная реорганизация миокарда при гиперхолестеринемии // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2012. — С. 542 — 543.

4. Клинникова М.Г., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д. Влияние экспериментальной гиперхолестеринемии на структурную реорганизацию миокарда // IV Всероссийская научно-практическая конференция с между-

народным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2012. - С. 115 - 116.

5. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Карпова A.A., Непомнящих Р.Д., Южик Е.И. Закономерности структурной реорганизации аорты, коронарных артерий и кардиомиоцитов атеросклеротического сердца //

IV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». — Новосибирск, 2012. - С. 202 - 204.

6. Непомнящих Л.М., Южик Е.И., Клииникова М.Г., Карпова A.A. Кардиотоксические эффекты гиперхолестеринемии // Научно-образовательный форум «Кардиология 2012». - Москва, 2012. - С. 114.

7. Южик Е.И. Гиперхолестеринемия как фактор, индуцирующий ре-моделирование мяо кард а// Всероссийская конференция молодых, ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии». -Томск, 2013.-С. 118-119.

8. Южик Е.И. Массометрические показатели крыс при моделировании алиментарной гиперхолестеринемии // 6-я Всероссийская конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2013. - С. 194 - 195.

9. Южик Е.И., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г. Фармакологическая коррекция гиперхолестеринемии и атерогенных повреждений: возможности восстановления структуры и метаболизма сердечной мышцы // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 7 (2). - С. 456 - 464.

10. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Южик Е.И., Непомнящих Р. Д., Пичигин В.И. Пролиферативная активность кардиомиоцитов при хронической гиперхолестеринемии // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2013. — № 4. - С. 231 - 237.

11. Южик Е.И., Лушникова Е.Л. Исследование паренхиматозно-стро-мальных взаимоотношений в миокарде крыс в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии и при сочетанном действии верапамила // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы

V Международной научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во Южного фед. ун-та, 2013. - С. 147 - 148.

12. Южик Е.И., Лушникова Е.Л. Исследование экспрессии генов RyR и SERCA2A в миокарде крыс Вистар в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии и при сочетанном действии верапамила // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы V Международной научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во Южного фед. ун-та, 2013. - С. 148 - 149.

Соискатель

Е.И.Южик

Подписано в печать 25.10.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ № 79._

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Южик, Екатерина Игоревна, Новосибирск

ФГБУ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ» СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАМН

04201452507 На пРавах рукописи

ЮЖИК ЕКАТЕРИНА ИГОРЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИОКАРДА КРЫС ПРИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ВВЕДЕНИИ ВЕРАПАМИЛА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Е.Л.Лушникова

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.........................................................................................................2

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.............................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................12

Глава 1. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА: МЕХАНИЗМЫ, МОДЕЛИРОВАНИЕ И КОРРЕКЦИЯ..............................................................12

1.1. Современные концепции патогенеза атеросклероза.............................12

1.2. Морфофункциональные аспекты атеросклеротического процесса.....22

1.3. Медико-биологические аспекты моделирования

атеросклеротического процесса. Молекулярные механизмы.....................27

1.4. Фармакологическая коррекция гиперхолестеринемии и атерогенных повреждений: возможности восстановления структуры и метаболизма сердечной мышцы............................................................................................34

1.5. Резюме........................................................................................................47

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................49

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................49

2.1. Характеристика животных и экспериментальных моделей гиперхолестеринемии......................................................................................49

2.2. Биохимические показатели крови...........................................................50

2.3. Метод щелочной диссоциации предварительно фиксированной в формалине ткани..............................................................................................50

2.4. Методы микроскопического анализа миокарда....................................51

2.5. Методы морфометрического и стереологического анализа.................53

2.6. Оценка экспрессии генов ЯуЯ2 и 8ЕЯСА2а в миокарде крыс методом ОТ-ПЦР в реальном времени..........................................................................53

2.7. Статистическая обработка.......................................................................55

2.8. Резюме........................................................................................................56

Глава 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ГРУПП И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ

МОДЕЛИРОВАНИИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ВВЕДЕНИИ ВЕРАПАМИЛА..................................................................................................57

3.1. Общая характеристика животных...........................................................57

3.2. Биохимические показатели сыворотки крови крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила.................61

3.3. Резюме........................................................................................................63

Глава 4. СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ МИОКАРДА КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ВВЕДЕНИИ ВЕРАПАМИЛА..................................................................................................64

4.1. Морфологические изменения миокарда крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила.............................................64

4.2. Иммуногистохимический анализ пролиферативной активности кардиомиоцитов при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила........................................................................................................90

4.3. Морфометрический и стереологический анализ миокарда крыс при моделировании гиперхолестеринемии и введении верапамила.................92

4.4. Количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила........................................................................................................97

4.5. Резюме......................................................................................................100

Глава 5.ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЯУК2 И 8ЕЯСА2А В МИОКАРДЕ КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ

ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ВВЕДЕНИИ ВЕРАПАМИЛА.................102

Резюме.............................................................................................................104

Глава 6. СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНОВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

МИОКАРДА (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ).......105

ВЫВОДЫ.............................................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................125

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИГХ - иммуногистохимия ИЛ - интерлейкин ИНФ - интерферон

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПЛ - липопротеинлипаза

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФИО - фактор некроза опухоли

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

СЕТР- белок, транспортирующий эфиры холестерина

ЬСАТ- лецитин-холестерин ацилтрансфераза

ЬОЫ1- рецептор липопротеинов низкой плотности

МАРК- митоген-активируемая протеинкиназа

РРАЯ- ядерный рецептор-пролифератор пероксисом

РС8К- протеин-конвертаза субтилизин/кексин

ЯуЯ - рианодиновый рецептор

БЕЯСА - саркоплазматическая Са2+-АТФаза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является распространенной причиной сердечно-сосудистых патологий в человеческой популяции [Климов А.Н., 1977; Сох R.A., Garcia-Paimieri Iví.R., 1990; Ivlann D.L., 2002; Cole J.E. et al., 2010]. Изучение проблемы гиперхолестеринемии и атероскле-ротического процесса имеет длительную историю [Ignatowski А.С., 1908; Anitschkow N., Chalatow S., 1913; Duguid J.B., 1946; Zilversmit B.A., 1973; Kunitomo M. et al., 1986], однако по-прежнему остается актуальным. Гиперхолестеринемия приводит к структурно-функциональным перестройкам в сердце и развитию сердечной недостаточности [Семенова JI.A. и др., 1985; Непомнящих Л.М., 1991]. Морфогенез и механизмы холестеринового повреждения миокарда, в отличие от повреждений сосудов [Лысова Н.Л. и др., 2007; Соловьева Н.А. и др., 2008; Рагино Ю.И. и др., 2008, 2011; Соловьева Н.А., Лысенко А.И., 2010; Shah Р.К., 2002, 2003], мало изучены. Понимание процессов формирования компенсаторно-приспособительного ответа на тканевом и клеточном уровнях помогает выяснению закономерностей развития общих патологических процессов и позволяет решать частные задачи восстановления функции поврежденного миокарда.

Анализ литературы дает представление о комплексной природе холестериновых повреждений сосудов и сердца, затрагивающих различные функциональные системы организма, в том числе иммунную систему [Климов А.Н. и др., 2003; Нагорнев В.А. и др., 2007; Cole J.E. et al., 2010; Santos M.J., Fonseca J.E., 2010; Luczak M. et al., 2011], что создает дополнительные сложности при исследовании данной патологии. Особенности липидного обмена у крыс [Cullen P. et al., 2003; Xiangdong L. et al., 2011] позволяют изучать токсическое воздействие избыточного содержания холестерина в крови на миокард в отсутствие ишемии и вызванных ею метаболических нарушений в кардиомиоцитах.

В выяснении причин сократительной недостаточности сердца большую

роль играют методы молекулярной биологии и морфологии. Повышенный

2+

уровень холестерина в крови влияет на Са -сигналинг в кардиомиоцитах через изменение экспрессии белков, вовлеченных в транспорт кальция [Alvarez Е. et al., 2010; Luo T.Y. et al., 2004], a также изменяя функциональность ионных каналов, модулируя мембранный потенциал и активность ионных об-

менников [Luo T.Y. et al., 2004; D'Aranzo N. et al., 2011; Deng W. et al., 2012]. Нарушение Ca -сигналинга меняет электрофизиологические характеристики кардиомиоцитов - потенциал действия, плато потенциала действия; появляются осцилляции в работе Na+- и К+-ионных каналов [Noble D., Noble P.J., 2006; Ceylan-Isik A.F. et al., 2011; Liang S. et al., 2012; Rozanski G.J., 2012], что обусловливает формирование аритмогенной активности и снижение сократительной функции сердца.

В свою очередь, изменения сократительной функции кардиомиоцитов в результате модификации кальциевого обмена обусловливают развитие комплекса структурных перестроек мышечных клеток сердца, отражающих их функционирование в измененных условиях регуляции сократительной активности. Анализ морфофункциональных изменений миокарда при развитии гиперхолестеринемии должен включать не только характеристику структурной реорганизации кардиомиоцитов, выяснение типов их повреждения и форм гибели, но также и возможные изменения их пролиферативной активности и потенциал развития компенсаторно-приспособительных реакций. В конечном итоге интенсивность процессов гибели и регенераторной (в том числе, и пролиферативной) активности кардиомиоцитов в условиях гиперхолестеринемии определяет особенности ремоделирования миокарда, оценка которых имеет непосредственное отношение к прогнозу состояния, обратимости структурных перестроек и выбору способов коррекции атерогенных повреждений миокарда.

Одним из основных подходов к коррекции атеросклеротических повреждений органов и тканей в настоящее время является применение препаратов и биоактивных соединений (статинов, фибратов, секвестрантов желчных кислот, соЗ-жирных кислот и т. п.), снижающих уровень холестерина в крови. Применение препаратов и химических соединений, модулирующих активность ионных каналов, потенциал действия сарколеммы и сопряжение процесса сокращения-расслабления, определяется симптомами нарушений сердечной деятельности и связано, как правило, с лечением осложнений ате-росклеротического процесса, когда структурная реорганизация миокарда может носить необратимый характер.

Верапамил - блокатор кальциевых каналов, широко используемый при лечении гипертонии, коронарной болезни сердца и аритмии [Кулешова Э.В.,

1999; Ргошшеуег в. е1 а1., 2012; МПЬег§ Р. е1 а1., 2012)]. В последнее время появляются данные и о целесообразности использования верапамила для коррекции атерогенных повреждений сердца [УегБап О. е1 а1., 2009; 8а1аЬе1 Т.К. е1 а!., 2012]. Однако эти данные основаны преимущественно на статистическом анализе клинических данных, в то время как механизмы действия верапамила изучены недостаточно, что сужает область его применения и не позволяет предупредить нежелательные побочные эффекты. Использование верапамила в экспериментальной модели позволит изучить вклад внутриклеточных токов Са2+ в повреждение кардиомиоцитов при экспериментальной гиперхол естеринемии.

Цель исследования - изучить характер структурной реорганизации миокарда и изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер структурной реорганизации миокарда крыс при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

2. Изучить динамику изменений общей численности кардиомиоцитов в сердце и субпопуляций кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

3. С помощью иммуногистохимических методов изучить пролифера-тивную активность кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

4. Изучить характер изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.

Научная новизна. Впервые с помощью комплексного морфологического, биохимического и молекулярно-биологического анализа проведено изучение характера структурной реорганизации миокарда, пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменений их общей численности в сердце крыс, а также изменений экспрессии мРНК ЯуИ2 и 8ЕЯСА2а в миокарде при моделировании хронической гиперхолестеринемии (в течение 64 сут) и введении верапамила. Показано, что морфологические изменения миокарда при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с

мерказолилом носят сходный характер (преобладание кардиомиоцитов с ли-тическими изменениями, выраженное полнокровие вен и капилляров, интер-стициальный отек, диффузный фиброз, гипертрофия и гиперплазия гладко-мышечных клеток в интрамуральиых артериях) и усиливаются по мере увеличения сроков цитопатического воздействия.

Впервые установлено, что введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов и фибропла-стических реакций стромы с сохранением более выраженного диффузного фиброзирования стромы у крыс, получавших с кормом экзогенный холестерин.

Впервые показано, что морфофункциональные изменения миокарда при развитии гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии сопровождаются усилением пролиферативной активности кардиомиоцитов (индекс мечения ядер кардиомиоцитов Кл-67 повышен в 14-17 раз по сравнению с контролем через 30 сут эксперимента). Впервые установлено, что введение верапамила способствует более выраженному повышению пролиферативной активности кардиомиоцитов.

Впервые установлено, что содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином первоначально приводит к уменьшению (на 17%) доли одноядерных и увеличению (на 35%) доли многоядерных кардиомиоцитов с инверсией этих показателей в более поздние сроки. Введение верапамила приводит к нормализации доли многоядерных клеток за счет уменьшения доли двуядерных кардиомиоцитов. Содержание крыс на атерогенной диете с мерказолилом не меняет соотношение субпопуляций кардиомиоцитов, при этом общая численность кардиомиоцитов через 64 сут уменьшается на 10%). Введение верапамила приводит к увеличению доли многоядерных кардиомиоцитов при сохранении уменьшенной общей численности кардиомиоцитов.

Впервые показано, что при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в миокарде значительно уменьшается количество мРНК ЯуИ2 (в среднем на 70%>) и мРНК 8ЕЯСА2а (в среднем на 80%>). Введение верапамила способствует нормализации количества мРНК ЯуИ2 и 8ЕЯСА2а только при атерогенной диете с экзогенным холестерином.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о характере структурной реорганизации миокарда, молекулярных механизмах нарушения сократительной функции кардиомиоцитов и их регенераторных стратегиях при развитии гиперхолестеринемии и введении верапамила, которые расширяют существующие представления о вариантах ремоделиро-вания и репаративной регенерации миокарда.

Установленное влияние верапамила на пролиферативную активность кардиомиоцитов, изменения общей численности клеток, соотношений одно-и многоядерных кардиомиоцитов, снижение выраженности литических повреждений клеток (цитопротекторный эффект), нормализация под его влиянием количества мРНК ЯуЯ2 и 8ЕЯСА2а в миокарде открывают новые перспективы использования данного препарата для оптимизации репаративных процессов миокарда при атерогенных кардиомиопатиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Атерогенная диета с введением экзогенного холестерина или мерка-золила обусловливает развитие гиперхолестеринемии и гипертриглицериде-мии у крыс, которые сопровождаются структурной реорганизацией миокарда, повышением пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменениями общей численности кардиомиоцитов в сердце и пулов одно-, дву- и многоядерных клеток.

2. Введение верапамила существенно не влияет на уровень холестерина, но сопровождается достоверным увеличением уровня триглицеридов в сыворотке крови. Введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов без выраженных изменений фибропластических реакций стромы, усилению пролиферативной активности кардиомиоцитов и увеличению доли многоядерных клеток.

3. Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом приводит к уменьшению в миокарде крыс Вистар количества мРНК ЯуЯ2 и 8ЕЯСА2а. Введение верапамила приводит к исчезновению статистических различий по количеству мРНК ЯуИ2 и 8ЕЯСА2а только при содержании на атерогенной диете с экзогенным холестерином.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на 1-й Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), XIX Российском

национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск,

О Л 1 О ^ Нал7ии/л_гл^пс1'ЭГ\тэа'готтт_и/-\А,с //Т/"а »Л гтттгл гт/м^ттсг ОПТ О ч\ /'Л Ап^ггтзп О А 1 О Л

¿.v i J uv^w^wLiwivJiuiivm j mv uivw^^iivjiui ri/l ^ \J 1 // ^lnwivlJU)

Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии» (Томск, 2013), 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт р