Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование легких цепей-2 миозина сердца и его регуляция кардиоактивными средствами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование легких цепей-2 миозина сердца и его регуляция кардиоактивными средствами"

Р Г Б ОД

л »"» "ЛЛГ

' •:.. I ■

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ОГАНЕСЯН АСМИК ТЕЛЬМАНОВНЛ

ФОСФОРИЛИРОЗЛНИЕ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ-2 МИОЗИНА СЕРДЦА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ КЛРДИО АК'ГИШ1ЫМИ СРЕДСТВАМИ { 03.00.04 - Биохимия )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискаяке ученой степени кандидата биологических паук

- ЕРЕВАН - 1995

Работа выполнена в Институте кардиологии МЗ РА .

. Научный руководитель: канд. биологических паук,

старший научный сотрудник Кайфаджян М.А.

Научный консультант: член-корреспондент АН РА,

доктор биологических наук, профессор С.С. Оганесян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор П. О.Вардевапяп, ; канд. биологических паук, старший паучпыйсотрудпик Г. А. Геворкян

Ведущее учереждепие - Ереванский медицинский

университет, кафедра биохимии.

Защита состоится " 1995г. в_____часов

на заседании специализированного Совета К.055.01.08 Ереванского госдарствеппого университета по адресу: 375049, Ереван, ул. Алека Мапукяпа 1, Ереванский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан"{{

- Ученый секретарь ' специализированного Совета, - г кандидат, биологических наук — Л.Г.Ананяп

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фосфорилирование легких цепей-2 (ЛЦ-2) миозина влияет на структуру тяжелых цепей (ТЦ) миозина, модифицируя взаимодействие актина с миозином. В отличие от гладких мышц фосфорилирование ЛЦ миозина сердца и скелетных мышц позвоночных животных не является необходимым условием для обеспечения взаимодействия миозина с актином. Однако в последние годы было обнаружено, что структура комплекса актппа с тяжелым меромиозипом: зависит от степени фосфорилирования ЛЦ-2 миозина (Stгеркow.ski D., 1-985).

До сих пор остается спорным вопрос о влиянии фосфорилирования ЛЦ на связывание Са^+ с миозином. Одни авторы (Michael J., 1979) указывают на то, что фосфорилирование ЛЦ-2 миозина не влияет на связывание Са^+ с миозином, а другие - повышение концентрации' свободного Ca в перфузате до 5мМ снижает скорость включения Pf в ЛЦ-2 миозина предсердий (Herring В., 1986).

С другой стороны, показано, что инкубация миофпбрилл сердца в присутствии киназы'ЛЦ миозина приводит к 50%-80%-ному фосфорилировапию миозина, АТФазпая же активность при этом не изменяется (Franks К., 1984). Но доказательство роли фосфорилирования • как модулятора сокращения миокарда остается сомнительным .(Gevers W., 1984). С этой целью необходимо выяснение роли фосфорилирования ЛЦ-2 миозипа сердца в регуляции актип-мнозинового взаимодействия, особенно при сердечнососудистой патологии, а также фармакологической коррекции этого взаимодействия.

Цель и задачи исследования. В работе была поставлена цель: сравнить степень фосфорилирования ЛЦ-2 миозина из разных отделов сердца человека (аутопсический материал) н животных. Исследогтгь влияние фосфорилирования ЛЦ-2

миозина па регуляцию актин-миозипового взаимодействия при патологии и фармакологическая коррекция этого взаимодействия некоторыми кардиоактивпыми препаратами.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить степень фосфор илирования ЛЦ-2 миозйна в разных отделах сердца человека и животных:

а) в контрольной ipynne животных

б) у животных с экспериментальным инфарктом миокарда

в) в сердце человека (аутопсия)

2. Изучить взаимосвязь между АТФазной активностью и степенью фосфорилировапия ЛЦ-2 миозина, а также их зависимость от изоферментного спектра миозина в разных отделах сердца человека.

3. Изучить влияние кардиоактивпых препаратов на степень фосфорилнрования ЛЦ-2 миозина и АТФазную активность миокарда крыс в опытах in vivo и in vil го.

Научная новизна и практическая значимость работы. Из разных отделов сердца человека (аутопсия) выделен и исследован изоэнзимный спектр миозина и актомиозина. Отмечена гетерогенность как в разных отделах сердца, так и у разных лиц при одной и той же патологии, т.е. отмечались индивидуальные различая.

Впервые была исследована взаимосвязь между степенью фосфорилировапия ЛЦ-2 и АТФазной активностью миозина разных отделов сердца человека и животных. Показано, что при сердечно-сосудистых заболеваниях снижается степень фосфорилнрования ЛЦ-2, что сопровождается снижением АТФазной активности миозина.

Впервые установлено влияние кардиоактивных средств . на фосфорилирование ЛЦ-2 миозина, доказано, что р-блокаторы способны изменять степень фосфорилнрования ЛЦ2 миозина сердца. ,

На основании предложенного исследования получены новые данные о молекулярных механизмах нарушения сократительной функции миокарда у человека. Результаты позволят в будущем разработать новые подходы в терапии недостаточности сердца.

Анробаттая работы. Результаты работы докладывались: на VIII Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности", г. Тбилиси,. 1987г., на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических систем", г.Москва, 1989, на III Респуб. конф. "Достижение физико-химической биологии ' и биотехнологии", г. Ереван, 1989, на VI Всесоюзной конференции по биохимии мыщц, г. Тбилиси,- 1989, на IX Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биолох'ической подвижности (мышечное сокращение)", г. Тбилиси, 1990г., на I Международном конгрессе по терапии мыпщ, Италия, г. Соропто, 1991.

Работа апробирована на заседании Ученого совета Института кардиологии МЗ РА от 29 марта 1995г и па заседании кафедры биохимии биологического факультета Еревапского государственного университета от 15 мая 1995г.

По материалам диссертация имеется 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертациоппая работа состоит из введения, обзора литературы, материалов' и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит • 23 рисунка и ? таблиц. Библиография включает 201 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами, исследования являлись: трупное сердце человека (аутопсия) и животных (белые беспородные • крысы и кролики), а также скелетные мышцы кроликов.

Материалами исследования являются: нативный актомиозип, миозин из разных отделов сердца (левый и правый желудочки, межжелудочковая перегородка, левое к правое предсердия), киназа легких цепей миознпа.

Экспериментальную модель ишемии миокарда вызывали перевязкой левой нисходящей ветви коронарной артерия. Лечили крыс продранололом в дозе 2мг/кг веса в течение 4 дней. Животных исследовали на 5-ый день после операции.

Нативный актомиозин получали по методу Schaub (1967).

Миозин получали по методу Shiverick et al (1975).

Получение киназы ЛЦ миозина. Осадок актомиозина, получаемый на первой стадии выделения миозина, собирали центрифугированием, промывали раствором 50mM КС1 и осаждали. Осадок лиофилизировали и хранили при -20^С.

АТФазпая активность миозина. В основе определения активности АТРазы по ' расщеплению Фн лежит колориметрический метод (Lowiy О., 1946, Fiske С., Subba Row, 1925).

Электрофорез белков. Содержание компонентов актомиозипа и миозина определяли электрофоретически в ПААГ-е согласно Laenili (1970) с некоторыми модификациями, а для определения степени фосфорилирования миозина проводили электрофорез в 8 М мочевине согласно Репу (1970). Отмытые гели сканировали на лазерном денситометре XL LKB "Ультраскан". Статистическую достоверность полученных данных рассчитывали по критерию Стьюдента.

Молекулярный вес исследуемых белков определяли по калибровочной кривой, представляющей собой зависимость электрофоретической подвижности белков с известным молекулярным весом от логарифма молекулярного веса.

Кол;(Ciirpацпю белка определяли по методу Lowry (1951) и по светопоглощепию при 230нм.

Оценка действия кардноактивных соединений па АТРазиую активность миозяпа. Влияние кардноактивных соединений па ЛТРаздую активность миозина миокарда человека проверялось в 0.02М трнс-HCl буфере, рН 7.35, содержаще:.! 5mM Na2 ATG; 0.5мгр/мл белка: 0.01М ЕДТА нли 0.013М СаС12, после преинкубации в течение Юмин Верапамил использовали в виде готовых растворов, применяемых в клинике.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Молекулярная характеристика сократительных белков в

разных отделах сердца при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Было сопоставлено количественное соотношение компонентов дативного актомиозппа (НАМ) в разных отделах сердца: в ловом и правом желудочках, предсердиях, межжелудоч к ов oil пер crop од ice.

По электрофоретпческой мпграцпии белков маркеров были рассчнтапы молекулярные веса компонентов НАМ разных отделов сердца с целью их идентификации. В препаратах HAiVI миокарда желудочков белковые полосы идентифицированы в следующей последовательности в зависимости от скорости миграции: ТЦ миозина - 200 кД, а-актинин - 180 кД, актин - 41-42 кД, Тн-Т - 38 кД, Тм - 37 кД, ЛЦМ-1 - 26-28 1чД, Тн-И - 2.9,5 кД, ЛЦМ-2 - 18-20 кД, Тп-С - 18 1сД. Препараты миокарда, которые рассматриваются в настоящем исследовании, представлены легкими цепями двух тинов: ЛЦ-1 "щелочные" и ЛЦ-2 "peiy ля-горные".

Сократительные белки предсердий и желудочков сердца характеризуются гетер oreиностыо и различным, стехиометрическим соотношением как сократительных, так и регуляторных компонентов НАМ. В условиях патологии

сердечно-сосудистой системы это соотношение значительно изменяется. Неравномерное распределение компонентов сократительных белков в разных регионах сердца, в зависимости от биомеханических особенностей, предопределяет степень и прострапствепиую картппу их нарушения из-за неоднообразного изменения функции этих регионов.

Левый и правый желудочки различаются по количественному содержанию ТЦ миозина, тропонипа-Т и ЛЦ1 при инфаркте миокарда левого желудочка (таб.1, N11, мужчина, 69 лет, через 10 часов после смерти). В предсердиях наблюдаются различия в содержании ТЦ миозина, а-актинпна, актина, Тн-И, ЛЦ1 и ЛЦ2 мпозппа, т.е. в отношении всех компонентов актомиозиного комплекса. Это согласуется с известными литературными данными (Höh J.F.Y., 1979, Yazaki Y., 1984) о различном изопротеидовом спектре миофпбрплл предсердий и желудочков. Кроме того в левом желудочке наблюдается появление ЛЦЗ мпозипа с молекулярной массой 15-17кД.

Полученные результаты можно объяснить не только с позиции различной экспрессии отдельных гепов и их семейств, ответственных за синтез отдельных нолкпептндных цепей белковых компонентов сократительного комплекса, но и различной степенью протеолиза, имеющего место прп ацпдозе, вследствие ишемии миокарда (Mercadier J, 1981). В зависимости от нарушений кислотно-щелочного баллапса,

поеттрапеляционпые изменения могут превалировать над процессами синтеза, изменяя изоэнзпмную картину сократительных структур, что в свою очередь, отражается на биомеханической их хар актер ист и ice.

При кардиомиопатии (N5, женщина, 35 лет, через 24 часов после смерти) значительные изменения наблюдаются в количественном содержании ТЦ миозина. Только в

"Таблица 1"

М ± ш Левый желудочек Правый желудочек Инф. участок лев. желуд. Предсердия

тцм 25.82±0.86 21.0 ±0.81** 25.16±0.88~~ 22.37 ±0.84**

С-белок 5.42±0.39 8.37 ±0.3" 6.19±0.47~ 6.15±0.6~

а -актинии 7.13±0.3-1 6.35±0.4Г 7.89 ±0.46" 8.6 ±0.49"

Актин 8.87 ±0.69 7.8 ±0.41" ' 8.35±0.42" 6.29±0.52"

Тн-Т 1.0 ±0.24 2.02 ±0.22** 1.11 ±0.24" 0.67 ±0.16"

Тм 6.57 ±0.32 7.02 ±0.52" ■ . 6.6 ±0.28" 5.27 ±0.56*

Тн-И 0.79±0.19 1.62±0.36* 0.7 ±0.18" 0.27 ±0.06"

ЛЦ-1 6.43±0.65 4.82±0.45" 6.8 ±0.52" 8.87 ±0.65"

ЛЦ-2 9.45 ±0.54 9.52±0.66" 10.38 ±0.78" 4.97 ±0.71"

Тн-С 3.65 ±0.34 3.71 ±0.41" 4.48±0.48~ 2.52±0.41*

ЛЦ-3 3.17±0.53 0 .0 0

п 4 4 4 4

ЛЦ1/ЛЦ2 1.0 0.49 0.67 1.84

М/А 2.98/1 2.64/1 3/1 3.6/1

Содержание компонентов НАМ из. разных отделов сердца человека при инфаркте миокарда (N11) Достоверность подсчитана относительно левого желудочка. ** достоверно, * малодостоверно, недостоверно

предсердиях оно приближенно к норме к стехиометрическом отношения к актину. В желудочках же ото отношение значительно уменьшается. В правом желудочке заметно снижается количественное содержание ТЦ миозина, однако относительное количественное содержание актина не меняется в правом и левом желудочках. Зато оно достоверно снижается в предсердиях, что отражается па повышении содержания 'ГЦ миозина (таб.2). Интересно отметить разнонаправленный характер изменения относительного содержания щелочных и регуляторных ЛЦ миознпа. В правом желудочке наблюдается в четыре раза бом.тиое содержание щелочной цени ЛЦ1 по сравнению с левым желудочком, то же самое наблюдается и в межжелудочковой перегородке. В предсердиях же содержание ЛЦ1 возрастает в 1.5 раза. В противоположность этому количественное содержание регулятор ной ЛЦ2 во всех отделах сердца не меняется.

Значительные изменения в " распределении Компонентов сохсратительпых и регулятор них белков в разных отделах сердца наблюдаются и при . диффузном кардиосклерозе (N2, женщина, 25 лет, через 17 часов после смерти).

Итак, можно заключить, что прп инфаркте миокарда, кардиомиопатни и диффузном кардиосклерозе наблюдается различная экспрессия генов белковых субъедпниц актомнозипового комплекса, а также экспрессия ЛЦ миозина с молекулярным весом в области 15-17 кД. Неодинаковая экспрессия генов белковых компонентов сократительного аппарата выражается как в разных отделах сердца, так и-у разных индивидуумов при одной и той же патологии. По всей вероятности, это связано как с разной стенепыо повреждения миокарда, так и с индивидуальными особенностями.

"Таблица 2"

М ± ш Левый желудочек Правый желудочек Можжелуд. перегородка Предсердия

тцм 35.93 ±1.07 27.0 ±7 2.3" 33.78±3.71~ 40.0±0.72"

С-бслок 10.1 ±0.58 9.35±0.74~ 6.72±0.44" 9.87 ±2.25"

а-актииин 3.07 ±0.34 3.87 ±0.18' 2.54 ±0.43" 2.26 ±0.54"

Актин 13.77±0.58 13.3 ±0.76" 11.0 ±0.83" 9.47±1.03"

Тн-Т 2.46 ±0.49 2.23 ±0.37" . 3.4 ±0.51" 1.17±0.17"

Тм 1.87 ±0.07 4.2 ±0.69" 2.06 ±0.49" 3.27 ±1.43"

Тн-И 2.93±0.12 5.02±0.64" 4.52±0.07" 1.87 ±0.73"

ЛЦ-1 1.93 ±0.21 7.98±1.03" 8.26±0.83" 3.1 ±0.55'

ЛЦ-2 9.05±0.44 6.73-1.96" 9.9 ±0.41" 11.33±1.86"

Ти-С 11.3 ±0.60 10.57 ±2.07" 12.12±1.12" 14.5 ±2.35"

лц-з 0 0 0 0

п 6 6 • . ' 5 5

ЛЦ1 / ЛЦ2 0.21. 1.18 . 0.83 0.27

М/А 2.6/1 2.1/1 3.1/1 4.2/1

Содержание компонентов НАМ из разных отделов сердца человека при кардиомпопатии (N5) Достоверность подсчитана относительно левого желудочка. . ** достоверно, * малодостоверно, ■ недостоверно

2. Степень фосфорилнрования ЛЦ-2 миозина и АТФазиая активность мпозшта миокарда человека

На рис. 1 (N14, мужчина, 35 лет, через 29 часов носле смерти) представлены результаты относительного содержания ЛЦ миозина левого и правого желудочка в норме (не страдавшего сердечно-сосудистой патологией). Изоформы миознпа из левого и правого желудочков не отличаются по составу ЛЦ миозина. Содержание фосфор илировашшх ЛЦ-2 (ЛЦ2Ф) миозина превышает содержание нефосфорилнрованпьтх ЛЦ2 миозина. Однако, при инфаркте миокарда количественное содержание ЛЦ миозина в разных отделах сердхт;а достоверно отличается (рис. 1, N15, женщина, 68 лет, через 25 часов после смерти). Наблюдается увеличение содержания фосфорилированной изоформы миозина но сравнению с нефосфорилированной в желудочке«. В предсердиях соотношение

фосфорилированной изоформы илп снижается, или не изменяется. Интересно отметить тот факт, что в инфарктном участке левого желудочка и в самом левом желудочке фосфорилнропатшъте ттзоформы ЛЦ миозина не отличаются друг от друга ¿я- . . ■ сросфорнляровапия. Наблюдаются также индивидуальные различия при инфаркте миокарда у разпых больных

Итак, г.о всех случаях при ипфаркте миокарда степень фосфорилирования ЛЦ-2 миозипа колебалась в пределах от 15% до 25%. Это указывает на то, что была фосфорплярована только одпа ЛЦ миозина.

На основании полученных данных можно заключить, что в нормальном миокарде содержание фосфорилпроваппой ЛЦ-2 миозина (оба желудочка) выше содержания нефосфорилпрованных ЛЦ-2 миозина. Кроме того, левый н правый желудочки не -отличаются но содержанию ЛЦ миознна, что нельзя сказать об инфаркте миокарда. "У разных пациентов при инфаркте миокарда наблюдалось

ООДИ'ЖЛШ тхм МЖАРДА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ (ДУГОНШ X14J

,--гГ\ ЧЛ

.. I

i -■'•

\v\ i <• - ' I ' -V

^

СОДЕРЖАНИЕ ЛЦМ ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА (АУТШОЯ N15)

разпое количественное содержание фосфорнлпрованной ЛЦ-2 мпозпна.

Эти исследования могут иметь важное физиологическое значение, т.к. известно, что фосфорилирование как сердечной, так и скелетных мышц (Peisechiui А., 1905) увеличивает Са^+ - активируемую силу сокращения. В гипертрофированном сердце у хронически гппертепзпвных крыс in vivo фосфорплирование ЛЦ-2 миозппа уменьшается почти наполовину по сравнению с их контрольными величинами (Morano I., 1988), и фосфоршшроваппые ЛЦ вовлекаются в регуляцию скорости укорочения скипироваиных скелетных мышечных волокон (Moss R., 1986).

В разных отделах сердца АТФазпая активность миозина в присутствии двухвалентных п одновалентных катионов отличается друг от друга. На рисунке 2а представлены результаты, получепные при исследовании миокарда человека в норме (N27). Правый желудочек характеризуется более высокой К+-ЭДТЛ и Са2 + -ЛТФазной активностью по сравнению с левым желудочком в 1.61 и 1.81 раза. Велпчнпа - активируемой АТФазы миозипа пиже

базальной величины как в правом, так и' в левом желудочках, что коррелирует с повышенным содержанием "щелочной" ЛЦ1 миозина. Кинетические кривые, как Qa2-\-l так п К+-ЭДТА АТФазпоп реакции миозина, носят енгмоидпый характер, указывающий па кооператпвпость ферментативной реакции как в нравом, так и в левом желудочхеах.

Как следует из рисунка 2(b,c,d) при сердечнососудистой патологни сохраняется сигмопдпый характер К'^-ЭДТА - АТФазной реакции миознпа, однако кооперативяоеть Са2+-АТФазы мнознна значительно изменяется и в некоторых случаях -при инфаркте миокарда -спгмоедность кривых реакции исчезает (рис. 2Ь). Такая же

картина паблтодасгггя и гтртт ревматизме (рис. 2с). Что касается величины Са- -ЛТФазной активности миозипа, то о гг."; гпижастся при инфаркте миокарда как в левом, так ив ', ~

правом желудочках. Такая же картина наблюдается и при ревматизме. Спижепие величины Са2+-ЛТФа зпои активности миозина в обоих желудочках соирс1>о«чдистся уменьшением степени фосфсрилировапия ЛЦ2 миозина. К~'~-ЭДТА-АТФазиая активность также снижается при . .

инфаркте и ревматизме как в левом, так и в правом ' ■ •

желудочках.

Исходя из полученных результатов, можно полагать, что изменение степени фосфорилированпя ЛЦ-2 миозина,

I-.

отражается па способности миозита активироваться ионами Са- + , что в свою очередь должно несомненно отразиться па актин- мнозиповсм г. •..¡имодеистпии я всей работе сократительного агтарстл сердечной мътшцы. ¡Изменение АТФазной активности миозина в отсутствие ионов Са, при патологических услсьпях сердца, также подтверждает ' •-» возможность изменения компонентов тяжелых и легких целей миозина. Становится очевидным, что эффект фосфорилированпя, если степень фосфорилиреваппя изменяется, отражается па миозиповой и ил.томлозаногой кинетике АТФазпой реакции.

Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) и С а- + вызывают увеличение уровня фосфсрклировапия ЛЦ-2 миозина в скипировапных волоктх гродсердпй человека (Мотано I.. 1983). Как впдпе из наших экспериментов, КЛЦМ повкзтаст величину К + -ЭДТА А'ГФазиой активности миозина левого желудочка сердца человека при инфаркте мг.ска: да в 1.3 раза (рис. 2с1). Помимо этого более эффективно увеличивается стененъ фосфорнлироваиия столетних мышц кролика при 37°С в присутствии 0.1 мМ Са2-*' (таб.3). Однако, в сердце наличествует недостаточная активность кипазы для довольно быстрою фосфорилировашта ;\Ц

* 1.К+ Е DTA

о 2.Св* +

* З.К + EDTA

л 4.Са+ +

70 СО

Г

[? SO •ь

Е

L

00 го ю

15 ПИН

"Рисунок 2"

• 1.К+ EDTA о ' 2.Са++ З.К+ EDTA

0)\

r.l 1

fc

и • го

¡>9 МЙЯ

d)

О 6.Са+ +

МИН

Кинетика + . и К+ ЭДТЛ АТФазной реакции миозина левого и правого желудочков сердца человека в норме (N27, а), при ревматизме (N21, Ь), при инфаркте миокарда (N23, с) к при инфаркте миокарда в присутствии КЛЦМ (N19, d). 1-2 Миозин левого желудочка, 3-4 миозяк правого желудочка, 5-6 миозвк левого желудочка +КЛЦМ.

" Таблица 3 "

М±т Контроль 0.05мМ Са + КЛЦМ 0.1 мМ Са +КЛЦМ

ЛЦ1 27.35±1.13 25.бЗ±1.4б~ 25.0б±2.27~

ЛЦ2 37.о4±2.85 26.51 ±2.57" 22.69srl.31™

ЛЦ2Ф 12.16±2.31 22.71 ±2.47" 30.11 ±2.56"

ЛЦЗ 21.5 ±2.04 24.94 ±3.47" 19.60 а: 2.49"

а = 45 п = 6 п=5

Содержание ЛЦ миозина схелетнцх мышц кролика после

инкубация при 370с в присутствии ионов Са ц КЛЦМ. Контроль - в отсутствии Сд2+ - д КЛЦМ.

" достоверно, * малодостоверно, недостоверно

миозина, чтобы счЬшх^ этот путь эффектпззшм для увеличения концентрации внутриклеточного Са2-г, необходимого для повышения скор.остя сокращения мышц (Ег.д1апс1 Р., 1984).

3.Влияние кар диоактив иых препаратов до ЛхСГ^азпую активность и фосфорнлирование миозина миокарда

Исследовали 3 трудны животных: первая группа -контрольная, вторая - крысы с эксторкмеотальпой ишемией миокарда и третья - крысы, леченные нрогграяололом в дозе 2 мкг/кг веса в течение 5 дней после операции. Определение количесгеепного соотношения ЛЦ угпозвял \евого желудочка миокарда показало, что в первые 5 дней развития экспериментальной ишемии миокарда происходили значительные изменения в содержании ЛЦ миозина. Достоверно снижалось относительное содержание Ьссфорилированнои ЛЦ-2 и отмечалось увеличение

содержания ЛЦ1 и АЦ2. В группе животных, полыхавших ежедневно пропранолол наблюдалось незначительное увеличение содержания фосфорилцрованной ЛЦ-2, а содержание ЛЦ2 значительно уменьшалось по сравнению с контролем, содержание же ЛЦ1 продолжало увеличиваться. Итак, нарушения, вызванные экспериментальной ишемией миокарда в распределении количественного содержания ЛЦ миознпа при лечении пропрапололом, полностью не восстанавливались. Изменения в распределении количественного содержания ЛЦ миозина е правом желудочке миокарда носили противоположно направленный характер. Однако,после лечепия пропранололом, возникшие парушепия устранялись (рис. 3).

Было исследовано также влияние Са-аптагописта верапамила па величину Са2+- и К +-ЗДТЛ ЛТФазпой активпости миозина миокарда человека в норме in vitro. Еерапамил использовался в концентрации 10-5м н 1б"бМ. В левом желудочке верапамил в концентрации Ю'^М незначительно увенчивал величину - и К+- ЭДТЛ

АТФазной активности миозипа в 1.03 и 1.02 раза, соответственно. Однако/ при концентрации

10-5 м

верапамила активность увеличивалась в 1.3 и 1.23 раза соответственно (рис. 4а). В правом желудочке верапамил. в концентрации Ю'^М в 1.02 раза увеличивал величину К +

-ЭДТА АТФазной активности миозина и в 1.18 раза величину Са^+ - АТФазной активности миозина (рис. 4Ь). Как известно, Са^-Ь-связывающие участки на молекуле миозина находятся иа ДТНБ-ЛЦ (ЛЦ2 миозина), т.е. надо полагать, что активирующее действие верапамила па миозиновую АТФазу проявляется именно посредством этих регуляторных компонентов миозиповой молекулы.

4. Сравнение степени фосфорилирования ЛЦ2 миозипа миокарда у животных и человека

СОДЕРЖАНИЕ ЛЦМ В ПРАВОМ ЖЕЛУДОЧКЕ МИОКАРДА КРЫС

~ ......,»1 .

ни

И ?

■¿а

. ...

СОДЕРЖАНКЕ ЛЦМ В ЛЕВОМ ЖЕЛУДОЧКЕ МИОКАРДА ЮШ

b)

/Л" У.У

¡f /г

/ я

// V/

13 №

Влияние верапамила (10"5М и 10"6М) на Са2+. и к + ЭДТА АТФазную активность миозипа левого (а) и правого (Ь) желудочков человека в норме (N27).

1-2 Миозин желудочка, 3-4 Миозии желудочка + верапамил 10"6М, 5-6 Миозин желудочка + верапамил 10"5М

При сравнении содержания ЛЦ миозипа миокарда у хрьгс, кроликов и человека обнаружено, что левый и правый желудочки миокарда имеют сходное количественное содержания ЛЦ миозипа у кроликов и человека. А у крыс содержание миозипа левого и правого желудочков достоверно отличается. Но с другой стороны, содержание ЛЦ миозипа левого желудочка крыс'сходно по количеству с ЛЦ миозина левого желудочка человека, где степень фосфорилирования ЛЦ2 миозипа составляла около 28%. Содержание ЛЦ2 миозина в правом желудочке человека отличается от такового у крыс более высокой степенью фосфорилирования, что составляло у человека 31%, а у крыс - 20%. У кроликов степень фосфорилирования ЛЦ2 миозина fio сравнению с крысами и человеком' была ниже. Она составляла в левом желудочке 8%, а в правом желудочке -13%.

Таким образом, рассматривая полученные результаты, можно придти к' выводу, что фосфорилирование ЛЦ-2 миозина миокарда может играть существенную роль при

взаимодействий миозина с актином при различных сердечно-сосудистых заболеваниях человека.

Фармакологические соединения способны коррелировать актип-миозиновое взаимодействие, как на уровне регуляции Са-связывающях белков, так и влияя на степень фосфор илирования ЛЦ ыиозипа. Аполиз полученных данных позволяет заключить, что фосфорилированпе ЛЦ2 миозина вовлекается в процесс регуляции мышечного сокращения сердца, а при различных нарушениях гемодинамики может играть 'значительную модулирующую роль в этом взаимодействии. В связи с этим дальнейшие ' исследования на патологическом сердце могут выявить более конкретную роль фосфорилирования ЛЦ2 миозина з сердечной мышце.

ВЫВОДЫ

1 .Субъедипичпый состав отдельных компонентов актомиозипого комплекса не изменяется, как при

различных формах сердечно-сосудистой патологии, так и в разных отделах сердца, одпако количественное соотношение различных субъединиц зависит от патологии, возраста,пола и других индивидуальных особенностей человеческого организма.

2. Степень фосфорилирования легких цепей-2 миозина миокарда в порме у крыс составляет 20-26%, у человека -26-30%, а у кроликов - 8-13%.

3.При инфаркте миокарда и ревматизме степень фосфорилирования легких цепей-2 миозина в разных "отделах сердца человека снижается.

4. При инфаркте миокарда и ревматизме снижается К+ -ЭДТА и -АТФазпая активность миозина, а также уменьшается кооперативность АТФазной реакци}! миозина.

5. Снижение степени фосфор шшрдвапия легких цепей-2 миозина, сопровождающееся уменьшением

энзиматической активности миозина, указывает па то, что фосфорилирование легких цепей-2 миозина сердца человека И1рает регуляторпую роль при актип миозиновом взаимодействии в патологических условиях.

6. Верапамил в концентрации Ю^М - Ю'^М способен повышать величину Са^+ и К+ -ЭДТА А'ГФазной активности миозина, как в левом.так и в правом желудочке

о '

миокарда человека.

?. Такие кардиоактивные соединения, как верапамил и пропранолол, способны модулировать АТФазпую активность миозина и актомиозина в отсутсвии иопов Са, а также изменять степень фосфорнлировааия ЛЦ-2 миозина сердца.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Влияние С а-антагонистов на физико-химические свойства миофибриллярпых белков миокарда в норме и при рабочей перегрузке сердца. Тезисы докладов .VIII Всесоюзного симпозиума "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, стр.104, 1987. (соавт. Кайфаджян М.А.).

2.Молекулярпая гетерогенность и иоппая регуляция сократительного аппарата разных отделов сердца. Международный симпозиум "Молекулярная организация биологических систем", Москва, стр.224, 1989 (соавт. Кайфаджян М.А.., Оганесян С.С.).

. З.Молекулярпая характеристика сократительных белков патологического сердца. Тезисы докладов III Республиканской конференции "Достижение физико-химической бйологии и биотехнологии ", Ереван, стр.65-66, 1989 (соавт. Кайфаджян М.А.).

4.Роль кальция в регуляции сократительного аппарата сердца человека при сердечно-сосудистой патологии. Тезисы VI Всесоюзной конференции по биохимия мышц, Тбилиси, стр.54, 1989 (соавт. Кайфаджян М.А., Маргарян С.Б.).

5.Два сгруктурно-фупкциоиалт.ных состояния актомшпина: Устойч и кость к денатур«рующим вочдепстииям. ii полог. ж. Армении, т.-12. N6. стр.646-551, 19!>9 (го,н'.т Тикуьоч о Д., Милом и А. к., Коифадлкпи М.Д.).

6.Влияние фосфор илирования ЛЦ-2 миозина па структурно Фз'п«ст^!онак.т,!тос состояние акта.шозипсвого комилокса.Тознеи докладов IX Всесоюзного симпозиума "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, стр. 10, 1990 (соавт. Кайфаджяп М.А.).

'/.Действие Са-антагонистов на белковый обмен миокарда при экспериментальной ишемии. Сборник трудов Института кардиологии МЗ РА, Ереван "Ауйс", стр.166-165, 1992 (соавт. Оганесян С., Кайфад;кян М., Каранетян Р., Джаниоладян И., Гукасяп А.).

".The cbaucjc oi pioleolytic activity and isoenzyme sped mm oi contractile p roteins in model experience in the conditions of weight • lossness. Soionio-Italy, 1991, Its international meeting on tiierapy of muscle dystrophies and related disorden;: In: Acta Cuidiomyologica, V.III, N.3, p.<101-410 (со woik. Kaifadjyan M., Oganesyau S., Karapetyau R., Ghukasyan A.).

9. The cliauqe of molecular diaraclerisfic of contractile proteins by treatment rats will experimental isckumia oi myocaid by propranolol. Cardioscience, 1994 (in press) (co-work. Kaifadzhynn M., Danpoladyan E., Ghukasyan A.).

с

24

3.(3. ^nijhujGGbujiuQ Upmfi üfinqfiüfi рЬрЬ';2ПРш-2 флифпр|цшдгшЗ[] UOpiu ЦшрсциЦпртОо ^шргфпшЦшЬЦ^шпдйЬрпЦ

U2|mumujGßh И|и50ш1|шй Ощшшш^П tp upinfi шшррЬр piud|iGGbpni.i5 пшпи50ши}1рЬ[ 'jfinqhfij-» pbpli 2qpui-2 фпифпр^шдйшй luqqbgrupjruGp ujljinbG-ii|inq|iüiujhG фл(ч1и;аг(!:дгип!шй tjuipquji{npdi.uG i[pui lufumiupuiGoiLimG uiiujiiiüGübpruü U Gpui цЬцш^фопдифй 1)шрс^ш4прт.йо: Ujü fipiuqnpöfj[nL'hmi5wn Lpuinujpi|h[ bG qfiinunfinprtbp L|bGquiGfiGbp|i L qtiujli'juj|iG uprnh Gi5ni2Ghpfi i|pui (шпиппицфш):

SbuuuL)iuG шптйпЦ ui2hJtUunuGß[i hjnLiGujl'UjG q}nmuljujf] Gnprujpo iujG h, np tfuipryu uprnfi uircujGüfiG ршфОйЬргий hiuuinuiiru[uiö t illjiuGujpb[mjfiü uuifiuiLuLjrugGbph ¡iqnäbbpfi inuippbpnipjruGGbp, pLugfi iujq huijmGiupbpLjb] t üfuiqliGfi $nu.t>npfiLwgLiujG ljiufurilll[] uiGhuiinhg b hpi[iuG.qnLpjujQ iupimühuijint|iuirupjniG|ig: Srnjg h трЦшб, np ufipui-iuGripLujfaG h{ii|iuürjrupjruGGbp|i pGpmgpnid ОЦшо^пи] t üfinqpüji phpb 2rlpw-2 фпифпр^шдйшй шиифбшОр, про лщЬ^дфи! t dfrnqhGh Ub3nuj[iG uj!.;u-![iiJnipjtuG GiiiüqnLÜriij: Ujiuun[bL t iitupqni L l}hGr}iuG)nGbpfi upinmül^Gh wiuppbpniLpjniÜQ ujju qbuißruli: IbqiuüfiorigGbplig iul|mj-ii[ UiqqhgnipjnLU mGhG tfjinq|4G|i фпифпр^шдйшй Црш Ьш1л1|ши|Ьи pbimnm-iupqb[iulj!iiljbpLi:

U^tUUJimiiG^h q(imoi-qnp6GuiL|UjG lupdbßQ рйпрпгЦпиЗ t nuiniüGLuufipnipjniGGbph hhtSuiG Црш итщдф^й Gnp imjjuJL&bpnil йшрпт иртшйцшГф qnpöruübrupjiuCi йгцЬ^пцшфй

dbfumdfiqdGbpii i|hpuipbpjuji_: UpqjrnGpGbpp ргид. bG тш^ти qbquiüftgngiujjiG pnidtfuG Gnp i5nmbgnu5Gbp biGbinij ириф muipphp piudpüGbpruü üfinqjiG}) фпифлр^ишдйшй tuuinfiötuGh Ь

йЦшйшрЬрлфй иифк-ПшЦгидйЬгф qiuqüp 2bqnLLlGbpjig:

- - '

Заказ IIS ^ Tupas 5ü

, . Оперативная лолпгра^:.. геканского гос-^ университета, Ег>.:. "Ал.Ыанукниа I