Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние производных смешанных арилгетериламинов гиперидинового ряда и веществ, выделенных из гипоталамуса на Са-кальмодулин зависимые ферменты и процессы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние производных смешанных арилгетериламинов гиперидинового ряда и веществ, выделенных из гипоталамуса на Са-кальмодулин зависимые ферменты и процессы"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ ШОХИМИИ ш. Г.Х.БУНЯТЯНА

На правах рукописи АЛЕКСАНЯН АРШАК РУБЕНОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ СМЕШАННЫХ. АИШГЕТЕРШАМИНОВ 1ШПЕРИ-ДИНОВОГО РЯДА И ВЕЩЕСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЕШОТАЛАМУСА М Са-ШШОДШН ЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ПРОЦЕССЫ

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1991

Работа выполнена в Отделе биохимии нейрогормонов Института биохимии им. Г.Х.Бунятяна АН Республики Армения й в лаборатории фармакологии холинергических средств Института тонкой органической химии им.А.Л.Мндаояна Республики Армения.

Научные руководители: академик АН РА, профессор

А.А.Галоян

кандидат медицинских наук Дж.А.Терасидан

Официальные оппоненты: член-корр. АН РА, доктор

биологических' наук, профессор Карагезян К.Г.

доктор медицинских наук, про фессор

Гарибдаанян Б.Т.

Ведущая организация - кафедра фюхимии Ереванского

государственного университета

Зашта диссертации состоится " / У" ИРЛ&М_1991 ]

в 1£=00 часов на заседании специализированного совета Д 005.1! 01. при Институте биохимии им. .Г.Х.Бунятяна А11 Армении по ада су: 375044, г.Ереван, ул. И.Севака, 5/Т.

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке Институ: биохимии им. Г.Х.Бунятяна АН РА".

Автореферат разослан "{[_" О Ю'У?Л О 1^91 :

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук,

профессор А.А.Симонян

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сигналы, поступающие к клетке извне, подаются внутриклеточным биохимическим системам при помощи вто-чных мессенджеров. Кальций служит одним из этих вторичных мес-нджеров. Однако, для того, чтобы кальций эффективно управлял еточвдми процессами, его функционирование, в свою очередь, лжно подвергаться регуляции. Поэтому в клетке в ходе эволюции зникла сложная система белков, которые взаимодействуют с иона-кальция, тем самым управляя передачей и приемом внутриклеточ-:х сообщений. Кальмодулин, являющийся одним из этих Са -связн-ющих белков, связываясь с кальцием, в свою очередь взаимодей-■вует с другими белками, тем самым регулируя множественные клешне функции. На сегодняшний день известны более 30 Са2+-КМ ~ стивируемых ферментов в различных тканях и количество таких фер-штов непрерывно растет.

Очевидно поэтому те биологически активные вещества, кото-ie влияют на Са2+-КМ зависимые ферменты и физиологические про-5ссы, полезны не только для фундаментальных биологических ис-юдований, направленных на познание молекулярных основ жизнен-ix процессов, но и приобретают все возрастающее значение для армакологяи, в том числе и для создания новых лекарств. За пос-эдние десятилетия создано большое количество синтетических эедств, являющихся антагонистами Са^+ и кальмодулина, которые эочно вошли в медицинскую практику. Однако, несмотря на значи-зльные успехи в деле изыскания лекарственных веществ подобного эйствия, дальнейшая работа в этом направлении продолжает оста-агься весьма актуальной

Наряду с этим особый интерес представляют и эндогенные. био-огически активные вещества, влияющие на Са^+-КМ-зависимые фер-енты и физиологические процессы. Ранее сообщалось о существова-ии веществ пептидной природа, которые обладают кардиотропным ействием. Били обнаружены как коронарорасширяющие, так и коро-аросуживающие факторы и установлено, что эти нейропептиды явля-тся уникальными регуляторами уровня вторичных посредников клети - циклических нуклеотидов и ионов кальция (Галоян A.A., 1986). 1 дальнейшем Галояном A.A. были обнаружены пептида» которые дей-;твуют на зависимые ферменты без участия ионов и Ш,

. также пептиды, которые активируют некоторые Са^+-КМ ферменты

без участия ионов калытя, что свидетельствует о наличии дополнительных систем регуляции активности этих ферментов (Галоян A.A., 1990).

Исходя из вышеизложенного и принимая во внимание весьма важное значение поиска новых эндогенных физиологически активные веществ, нами были исследованы также новые гомогенные вещества, выделенные из гипоталамуса.

Пель и задачи работы. Целью настоящей работы явился поиск новых биологически активных веществ синтетического происхождения среди арилгетернламинов тетрагидропиранового и пипервдино-вого ряда, и из веществ эндогенного происхождения, выделенных из гипоталамуса,действующих на Са2+-КМ зависимые ферменты и про пессы. Нашей целью было также изучение фармакологического действия этих веществ на сердечно-сосудистую систему и на рост злокачественных новообразований. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

I. Провести первичный отбор, изучая действие новых веществ на сократимость гладких мышц, вызываемых разными агонистами.

П. Изучить влияние выявленных активных веществ на Са2+-КМ зависимые ферменты и процессы, такие как фосфорилирование легких цепей миозина, активность фосфодиэстеразы цАШ и пролифера-/ция клеток яичника китайского хомячка.

Ш. Выявить наиболее активные вещества и изучить их свойства в качестве средств направленного фармакологического действия на следующих экспериментальных моделях:

а) влияние на коронарный кровоток,

б) влияние на разные модели аритмии, вызванные СаС12, адре налином, строфантином и перевязкой левой нисходящей артерии сердца,

в) влияние на агрегационную способность тромбоцитов, вызванную разными индукторами агрегации: Ада, адреналином и коллагеном,

г) влияние на пролиферацию клеток,

д) влияние на рост злокачественных новообразований,

6), определение острой токсичности.

Научная новизна работы. Среди большой группы новых оригинальных соединений - арилгетерияаыинов тетрагидропиранового и пиперидинового ряда обнаружены..соединения, являющиеся блокатора ми входа ионов Ca? * в клетку и антагонистами кальмодулина. На

сновании проведенных биохимических и фармакологических исследо-аний отобрано наиболее активное вещество - дигвдрохпорид N-j^-,2,5-триметил-4-фенилпиперидат-4ил)этил ] -N-цианометил-Ы-3,4-диметоксибензил)амина.

Было обнаружено также новое гомогенное вещество непептид-ой природы, выделенное из гипоталамуса, влияющее на некоторые зависимые ферменты и физиологические процессы.

Изучено фармакологическое действие этих веществ на сердеч-э-сосудистую систему, а также на пролиферацию интактных клеток на рост злокачественных новообразований.

Практическая ценность. Выявленные новые биологически актив-ае вещества имеют потенциальную возможность стать лекарственны-и средствами дня лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Ведется работа по подготовке экспериментального материала т представления в Фармакологический Комитет Министерства здра-оохранения СССР.

Апробация работы. Материалы и положения диссертации доложе-в и обсуждены на заседаниях ученого совета Института биохимии И Армении и Института тонкой органической химии АН Армении Ереван, 1990, 1991).

По материалам диссертации опубликовано в работ*

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 стра-вдах машинописного текста, содержит 21 рисунок и I таблицу, на состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной юти, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка ци-ируемой литературы, насчитывающего 197 наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы

Для разработки и решения поставленных задач был подобран цд биохимических и фармакологических методов:

Эксперименты на изолированных гладких мышцах. Исследование зияния веществ на сократительную способность гладких мышц про-эдили на изолированном препарате рога матки и портальной вене эысы, а также на изолированных аортах крыс и кроликов по мето-Ч Гренджера и др. ( Granger et al., 1985). Было изучено влия-яе исследуемых веществ на сокращения этих гладких мышц при дей-рвии разных агонистов (норадреналина, гистамина и окситоцина)

в раствэре Кребса, а также вызванные постепенно возрастающими концентрациями Са2+ (от Ю-5 до Ю-2 М) в К^-деподяризувдем pai воре. Механическую активность гладких мышц изучали в изометрическом режиме с помощью двуханодного диодного механатрона типа 6МХХ2Б. Раствор в камере при температуре 37+0,5°С, рН-7,4 аэрировали смесью 95/Ü - Ъ% - COg.

Исследование действия веществ на йюоФоршгирosanие легких цепей миозина. Фосфорилирование ЛЦ2 проводили инкубацией очище: ного миозина, выделенного методом Б.Ф.Поглазова с некоторыми модификациями (Левицкий и др., 1982), содержащего полностью де фосфорилированные JILLg, с "грубым" экстрактом киназы лзгких цепе миозина, полученным из скелетных мышц кролика по методу Морган (Morgan at al., 1976). В контрольных образцах использовали та кое соотношение фермента и миозина, при котором происходит фос форялирование на 100$. В опытные образцы добавляли и испытуемы вещества. Степень фосфорилирования ЛЕ[g регистрировали по увели чению электрофоретической подвижности JlUg при электрофорезе в ПААГ в присутствии 8 М мочевины.

Метод исследования действия веществ на активность Са^+-КМ зависимой Фосс&одиэстеразы. Препарат ФДЭ получали по методу, предложенному ранее (Бобрускин и Шайхин, 1985). Кальмодулин вь деляли из мозга крупного рогатого скота по методу Гопалакришнь И Андерсона С некоторыми модификациями ( Gopalakrlsbne and An dereon, 1982). Дальнейшую его очистку проводили с помощью ВЭЮ на колонке tsk ДЭАЭ.

Полученная нами ФДЭ в присутствии 200 нМ кальмодулина и I • Ю-4 М СаС^ активировалась приблизительно 10-15 раз. В ис пытуемые пробы добавляли исследуемые вещества. Активность ФДЭ определяли по методу Томпсона и Аг.племача v Thompson end Арр-leman,' 1971) с использованием двухстадийной реакции гидролиза [^Н] цАМР и [3Н] 5 AMP с участием ФДЭ и 5-нуклеотидазы зыеипо: яда соответственно. аденозин, образовавшийся в результат! этой двухстадийной реакции, отделяли от негидролизованных cy6i ратов анионообменной хроматографией на смоле Дауэкс AC I-X2 и определяли уровень радиоактивности во фракции, содержащей аде нозин. Результаты представлены в относительных единицах актив ' ности (ОЕА), рассчитанных по проценту гидролизованного субстр та в минуту с учетом остаточной радиоактивности проб в отсутствие фермента и уровня неслехдафической сорбции аденозина на

онообменнике при полном гидролизе субстрата в присутствии из-ытка фермента.

Исследование действия веществ на пролиферативную активность леток яичника китайского хомячка Kj(CHO-Kj). Для исследования ;ействия веществ на клеточную пролиферацию в культуре была ис-шьзована линия клеток яичника китайского хомячка Kj(CHO-Kj). нтенсивность синтеза ДНК в клетках определяли по включению Н-Тимидина ( Hidaka et al., 1981 ).

Метод исследования агрегапионных функций тромбоцитов. Изу-■ение воздействия веществ на агрегационную способность тромбоци-'ов проводилось на крови человека. Агрегацию тромбоцитов индуци-ювали АДФ, коллагеном и норадреналином в концентрациях 5 мкМ,

мкг/мл, 2 мкг/мл, соответственно. Критерием агрегационной спо-юбности кровяных пластинок служил процент снижения оптической. иотности богатой тромбоцитами плазмы, величину которого опреде-шли по методу Борна (Born, 1962) с использованием двухка-[ального агрегометра "Payton". Уменьшение оптической плотно-¡ти БТП при образовании агрегатов оценивали в процентах. Учиты-!али также время начала агрегации, наличие и отсутствие дезагре-<ации, степень выраженности последней. •

Метод определения величины коронарного кровотока Измерение объемной скорости коронарного кровотока производили на наркотизированных уретаном с хлоралозой кошках по мето-(У (Morawltz, 1914) в модификации Н.В.Кавериной (1958). [змерялся объем крови, оттекающей из коронарного синуса за еди-imiy времени до и после применения испытуемого соединения. Методы изучения антиаритмического действия соединений Желудочковую аритмию, возникающую вследствие нарушения сровоснабления миокарда, воспроизводили в опытах на наркотизи-юванных этаминалом натрия кошках по методу Столярчук и др. [1985), вставляя лигатуру на нисходящей ветви левой коронарной фтерии, на уровне нижнего края ушка предсердия. Вследствие этого у части животных возникали ранние ишемические нарушения сер-очного ритма в виде'желудочковой экстрасистолии.

Модель хлоркалышевой аритмии воспроизводили на наркотизированных уретаном (I мг/кг) крысах по методу Малинова и др. [ Kalinov et al., 1955). Вещества вводили в бедренную вену. 3 процессе опыта на ЭКГ регистрировали частоту возникновения фитмии, частоту восстановления синусового ритма и выживаемость

животных в каждой группе, по сравнению с животными, получившим только хлорид кальция.

Строфантиновую аритмию у наркотизированных нембуталом (40 мг/кг) морских свинок получали внутривенным введением строфантина в дозе 0,5 мг/кг. Аритмия развивалась сразу и продолжалась 10-15 мин, заканчиваясь смертью животного. Активность соединений оценивали по способности предупреждать развитие строфантин о-вой аритмии и удлинять время выживания животных.

Адреналиновую аритмию получали на наркотизированных урета-ном (I мг/кг) крысах внутривенным введением адреналина в дозе 0,03 мг/кг. Аритмия развивалась сразу (брадикардия, экстрасисто-лия) и продолжалась в среднем 56,5+18 с. ЭКГ регистрировали непрерывно II стандартным отведением.

Изучение противоопухолевой активности

Изучение противоопухолевой активности соединений проводили известными методами (Софьиной и др., 1976) на мышах с саркомой 180, асцитной карциномой Эрлиха, раком-легкого Люиса и гемоцито-бластозом ia. Лечение животных проводили внутрибрюшинным введением веществ в дозах, составляющих 1/6 от их ЛД^. Терапевтический эффект на животных с раком легкого Люиса оценивали по проценту торможения роста опухоли, а при саркоме 180, асцитной карциноме Эрлиха и гемоцитобластозё La по увеличению средней продолжительности жизни животных.

Метод определения острой токсичности.

Острую токсичность соединений определяли на белых мышах-самцах массой 18-21 г при внутривенном введении. Каждую дозу соединений испытывали на 7 животных. Результаты опытов учитывали через 24 часа в альтернативной форме по числу погибших животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изыскание новых высокоэффективных антагонистов кальция синтетического и эндогенного происхождения

Антагонисты кальция в настоящее время определяются как препарата, изменяющие клеточную функцию Са2+, ингибируя его ' вход или высвобождение, или же препятствуя одному из его внутриклеточных воздействий, при этой эти вещества необязательно конкурируют с кальпием за место его связывания.

Елокагоры входа ионов кальция и антагонисты кальмодулина, являющиеся подгруппами антагонистов кальция, широко применяются в медицинской практике, особенно при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Применяемые в настоящее время в медицинской практике препараты антагонистов кальция, принадлежат, в основном, к четырем группам органических соединений: производным фенилалкил-аминов, дигидропиридинов, пиперазина и бензодаазепина. Поэтому с целью поиска новых эффективных антагонистов кальция проводились исследования, направленные на изучение зависимости между строением и действием среди смешанных арилгетериламинов из тет-рагидропиранового и пиперидинового рядов, которые можно рассматривать и как производные фенилалкил&минов,*я как производные пиперидинов или тетрагидропиранов. В общей сложности исследовано 63 соединения, синтезированных в секторе № 6 Института тон- " кой органической химии АН РА под руководством д.х.н. А.А.Тосуня-на.

Нами были также исследованы новые гомогенные вещества, выделенные из гипоталамуса методом ВЭЖХ в Институте биохимии АН РА под руководством А.А.Галояна.

Идя выявления и отбора высокоактивных соединений, ингиби рующих Са^-КМ зависимые процессы, было решено первоначально изучить их действие на сокращение гладкой мускулатуры аорты, индуцированное ионами К+. Этот метод является идеальным скрининго-вым тестом, так как все известные гетерогенные группы антагонистов и КМ проявляют активность на этом тест объекте (ингиби-руют сокращение гладкой мускулатуры). При этом в-первичном отборе обнаружена активность двух соединений из ряда тетрагидропира-на и восьми - из ряда пиперидина. Палее было исследовано действие этих активных соединений на сокращение гладких мышц других органов (рога матки, портальной вены), индуцированных разными агонистами - KCl, норадреналином, гистамином.

Наряду с этими исследованиями изучалось и действие выявлен-

р.

ных активных соединений на некоторые Ca -КМ зависимые ферменты и процессы, например, на активность Са^-КМ зависимой фосфодиэс-теразы и вд фосфорилирование легких цепей миозина. На основании этих опытов были отобраны три активных соединения из арилгетериламинов пиперидинового ряда: дигдцрохлорвды N [^-1,2,5-три-метил-4-фенилпиперидин-4-ил) этил-Ы~пианометил-Ы-( 3,4-диметок-сяйелзшОамана, Ы- [^-1,2,5-тр»е7ид-4-бензилпипаридин-4ил)

- 10 -

этил -Ы-цианометил-Н-(3,4-диметоксибензил)амина и П- -(1,2,5 -триметил-4-д)еншщипервдин-4-ил)этил -Ы-метил-1£-(3,4-диметоксибензил)амина с общей формулой

/^ДЯ /^Л 3 1./2=Р/г, Н=СНгС/

г нее. к ^ шя=рь>

Био выявлено, что наиболее активным и менее токсичным среди них является дигвдрохлорид !£•[ £ -I,2,5-тимегил-4-фешшшпери-дин-4-ил) этил -Ы-цианометил-Ы-(3,4-диметоксибензил) ашн (Соед.1).

Была также обнаружена активность и у гомогенных веществ, выделенных из гипоталамуса быка. Выявлены факторы, вызывающие как сужение, так и .релаксацию гладких мышц. Исследования КМ зависимых ферментов показали, что вещество, вызывающее релаксацию гладких мышц, подавляет активность Са^+-КМ зависимой фосфодиэстеразы, а также ингибирует фосфорилирование легких цепей миозина. Это вещество условно было названо нами веществом 44.

В дальнейшем было проведено глубокое исследование соедине-. ния I и вещества 44 с помощью биохимических и фармакологических тестов. При этом все опыты были проведены и пренилашюом, который является структурным и фармакологическим аналогом соед.1.

- Биохимические и фармакологические исследования соединения I и вещества 44

Было исследовано влияние соед.1 и вещества 44 на сократимость гладких мышц под воздействием разных агонистов. Соединение I ингибирует спонтанные сокращения рога матки и портальной вены на 50% в концентрациях 1,5 . Ю~7 М, соответственно. Тот же эффект прениламин проявляет в концентрациях 8 • 10~7 и I • Ю-6 М.

Соединение I и прениламин при концентрациях 2 - Ю-7 М и Ю-6 М, соответственно, ингибирует на 505? сокращение рога маткв, индуцированное 1СГ4 г/мл, концентрацией окситоцина.

Было также установлено, что сбединение I ингибирует тоничес-ие сокращения маткй крысы и аорты кролика, вызываемые К4" (калие-ая деполяризация), представляющие собой чистый случай сопряже-ия, обеспечиваемый только внеклеточным Са2+. В этих опытах было ¡сследовано влияние соединения I и прениламина на кривые концен-рация-эффект, полученные постепенным увеличением концентрации

1а2+ от I

Ю~5 до 3

10 М. Исследуемые соединения в концен-

'рациях I . 10 до I 10'

гб

галыми концентрациями Са'

2+

М ингибируют сокращения, вызванные При дальнейшем же увеличении концен-

трации Са^+ до 3 • 10""^ М, ингибирующее действие соединений, пол-' гостью устраняется. Это отчетливо проявляется в опытах, лроведен-шх на аорте кролика (ряс.1). Прениламин

о—о Яон гпрол. ь о- -о 3*ГО'ум

100

5 50

Соединение о—о Контроя ь о—о Я*ГО *м

А—А/Л/о'/М^ ию'5*^ -у

50

7 1Л-3

10'* /О'* 10'3 /О2

Яомцехтрация СаС£3 (М/

Ряс.1. Влияние соедЛ и прениламина на сокращение полоски аорты кролика, вызванное Са^+ в К+ деполяризующем растворе. Кумулятивные концентраций-эффект кривые получали до (контроль) и после 20 минутной инкубации соед. I и прениламином в указанных концентрациях.

Полученные данные являются существенным доказательством того, что эти соединения ингибируют вход ионов Са^+ из внеклеточного, пространства

В то же время, как видно из того же рисунка, ингибирующее действие соединения I уже в концентрации I • 10"^ М восстанавливается частично при увеличении концентрации калымя до М. В концентрации же 3*10"^ М соед.1 полностью ингибирует сокращение гладкой мышцы даже.при наличии таких больших концентраций

кальция.

Известно, что удаление экзогенного кальция или присутствие блокаторов кальциевых каналов уменьшает, но не устраняет ваэоконстрикторные эффекты различных биорегуляторов. В наших исследованиях соед. I в концентрациях 1*10 до ЬЮ"*5 М не действует на сокращения, вызываемые такими агонистами, как нор-адреналин и гистамин. Однако концентрации соед. I М и

выше), ингибирувдее действие которых не восстанавливалось при дальнейшем увеличении концентрации кальция до 3*1 (Г2 м, ингиби-руют и сокращения, вызываеше этими агонистами (рио.2). Опыты

Концентрация норадреналина (А) и г истам и на (Б) -м

Рис.2. Влияние соединения I на сокращение полоски аорты кролика, вызванное норадрёналином, гистамином в нормальном растворе Кребса. Кумулятивные концентрация-эффект кривые получали до и после добавления соединения I в указанных концентрациях.

были проведены на аортах кроликов и крыс. Известно, что индуцированное норадрёналином сокращение двух артерий только частичнс зависит от внеклеточного кальция и при устранении этого катиона сокращения у аорты крыс ингибируются на 50-60%, а у кролики - на 15-30$. В наших опытах соед. I в концентрации 1*10 М, как и все известные антагонисты кальшя (верапамил, прениламин и др.) ингибируют сокращения аорты крысы на 50%, вызванные норадрёналином в концентрации 1*10~5 М (рис.3). Однако уже в концентрации 2 • М соед. I полностью ингибирует сокращение, вызванное норадрёналином. Это все доказывает, что соед. I, начиная с концентрации 1-10~® до I•М, блокирует вход кальция

внутрь клетки, тогда как в больших концентрациях (1-1СГ5 -1-1СГ3 М) действует по другому механизму.

В основе всего вышеизложенного было целесообразно изучение соед.1-на Са2+-кальмодулин (КМ) зависимое фосфорилирование легких цепей миозина, так как главенствующая роль в регуляции сокращения гладкомышечных клеток связана с влиянием Са2+ на молекулу миозина. Так обнаруживается отчетливая связь между степенью фо сформирования миозина и развитием напряжения полоски артериальных гладких мышц, необратимое фосфорилирование миозина приводит и к необратимой активации сокращения, подавление же миозин-киназы ML-9 вызывает исчезновение напряжения, несмотря на присутствие Са2+ ( Saitoh et а!.. 1987).

100

Аорта крысы ,

концентрация яорадренал им а 10' м

а

S

I

50

контроль Верапамил Прениламин (¿¿единение I Са яесодержащий (М) Ю'5Н Ю-*м /0'5М ЕСТ А 3*Ю^ЛС

Рис.3. Влияние верапамила, прениламлна, соед.1 и

на сокращение аорты крысы, вызванное М

норадреналина. Соединения добавляли за 20 мин до добавления норадреналина.

Исследуемое нами соед. I в концентрациях 50 мкМ и 150 мкИ янгйбирует фосфорилирование легких цепей миозина на 50$ и 90$, соответственно (рис.4). Прениламин в концентрациях 80 мкМ и 150 мкМ ингибирует фосфорилирование ЛЦ2 на 50 и 90%, соответственно.

Исходя из того, что соед.1 действует на Са2+-КМ зависимое фосфорилирование легких цепей миозина, было целесообразно изучение действия этого соединения на другие Са^+-КМ зависимые про-

цессы, так как предполагалось^ что соед. тивнэсть, взаимодействуя с Са +-ИД комплексом

I может проявлять як-Поэт ому нами бы-

• - 14 -

ло исследовано действие этого соединения на активность Са2+-КМ зависимой фосфодиэстеразы и на пролиферативную активность клеток китайского хомячка, так как Са^+-Ш комплекс играет большую роль в периодах G1 и s цикла интерфазы. Как и предполагалось, соед.1 ингибирует активность Ga2+-KM зависимой фосфодоэстеразы и пролиферацию клеток яичника китайского хомячка приблизительно при тех же концентрациях, при которых оно ингибировало фосфори-лирование легких цепей миозина. Так, соединение I в концентрациях 10 мкМ и 150 мкМ ингибирует активность Са2+-КМ зависимой фосфодиэстеразы на 50$ и 80% соответственно. Прениламин тот же эффект проявляет при концентрациях 15 мкМ и 150 мкМ.

Рис.4. Сканограшы гелей, электрофореза с S М мочевиной миозина с дефосфорилированными (ЛЦ^) и фосфорили-рованными CJHig—Ф) легкими цепями, а и б - влияние соединения I в концентрациях 50 мкМ и 150 мкМ.

Было показано также, что соединение I при концентрациях 10 мкМ и 100 мйЛ ингибирует пролиферацию клеток яичника китайского хомячка на 1Ь% и 60)6, соответственно.

На основании этих экспериментов, можно с уверенностью утверждать, что соед. I, начиная с концентрации 1-10"^ М, действует на Са -КМ зависимые процессы, по-видимому, каким-то образом Взаимодействуя с кальмодулином.

Проведенный в дальнейшем ряд кинетических экспериментов проделан с целью выяснения механизма воздействия соед.1 на активность комалекса (Са -КМ • ФДЭ). Из графиков представленных

на рис.5, следует, что соед. I влияет на кинетические параметры протекаемой реакции посредством существенного изменения константы Михаэлиса при незначительном изменении Умаяс (случай, относящийся к классическому примеру конкурентного ингибирования), что соответствует имеющимся на сегодняшний день литературным

данным относительно известных антагонистов кальмодулина.

а - зависимость начальной скорости гидролиза цАШ> от конпентраши КМ при различных концентрациях соединения I, в мкМ: I - 0, 2 - 10, 3 - 100. По, оси абсцисс - логарифм концентрации КМ, выраженный в 1 ' нг/.мл, по оси ординат - скорость гидролиза цАМФ

при концентрации субстрата 5 мкМ, выраженный в ОЕА, где — текущая скорость реакции, у0 - скорость ' реакции в отсутствие активатора. Измерения выполнены в присутствии 2 мМ СаСЗ^.-б - зависимость начальной скорости гидролиза пАРИФ от конпентрации Ш при различных концентрациях соед. I в координатах Лай-нуивера-Зэрка.

Таким образом, соед. I при.значительно низких концентрациях (1-ГО-8 - Ыи-5 ¡Л) блокирует вход ионов Са2+ в клетку, а при сравнительно 5олыцих (начиная с 1-1О-5 М - ингибирует ЮЛ. При этом оказалось, что соед. I превосходит прениднмин и в качестве слокаторо. ионов Са2+ и в 1сачестве антагониста кальмодулина.

- 16*-

Нами также было исследовано влияние нового гомогенного вещества (вещество 44), выделенного из гипоталамуса, методом • ВЭЖХ на Са2+-КМ зависимые ферменты и физиологические процессы. Эксперименты показали, что вещество 44 в концентрации 2-10" оп. ед. ингибирует сокращение аорты кролика, вызванные Са в К+ деполяризующем растворе и норадреналином в растворе Кребса (Рис.6).

Вещество

фЮ'3ОП.

?оо а-аКонтроль г

о4

ч

5»

$ 50

з-"

10'5 (О'* Ю-3 10-2 Концентрация саС£г(м

тп р—а Лонтролъ

50

/¿'в Ю-1 Ю'6 /О-5 'О'*1 Ланцентрация норадремалина(м

Рис.6. Влияние вещества 44 на сокращение полоски аорты кролика, вызванное Са2+ в К+-деполяризующем растворе и норадреналином в нормальном растворе Кребса Кумулятивные кривые концентрация-эффект получали до (контроль) и после (через 30 мин) добавления вещества 44 в указанной концентрации.

С целью выяснения механизма действия вещества 44 нами бшп изучено влияние вещества на Са2+-Ш зависимые ферменты. Было 01 наруженэ, что вещество 44 ингибирует Са2+-й<! зависимое фосфори-лирование легких цепей миозина и активность Са^+-КМ зависимой фосфодиэстеразы при тех же концентрациях, при которых оно ингибирует сокращение аорты, вызванное 1С+ и норадреналином. Вещество 44 в концентрации 1"11Г3 и оп. ед. ингибирует

фосфорилирование Л!^ на 30% и 70«, соответственно. При этих ле концентрациях соед. I ингибирует активность Са^-КУ зависимой фосфодиэстеразы на 2Ь и Ъ0%, соответственно. (Рис.7).

Таким образом, обнаружив биологически активные вещества

интетического и эндогенного происхождения, влияющие на Са2+-КМ ависимые ферменты и процессы, мы задались иачью исследовать их армакологическое действие. Исходя из, того, что антагонисты а. и КМ в основном применяются при лечении сердечно-сосудис-*х заболеваний, фармакологические исследования были проведены !авным образом в этом направлении.

/ 2 3

Рис.7. Влияние вещества 44 на активность Са2+-КМ зависимой фосфодиэстеразы.

I - контроль, 2, 3 - вещество 44 в концентра-3 я

аии 1-10 и 5•10 оп. ед., соответственно.

Первоначально было исследовано влияние этих веществ на ко-нарный кровоток и на артериальное давление. При этом было об-ружено, что соед. I в дозе 3 мг/кг кратковременно, но заметно еличивает объемную скорость коронарного кровотока. А.налогич-■л действием обладают известные антагонисты кальция - верапа-ш и дилтиазем. В оуличие от соед. I у вещества 44 (в конп. [(Г^ оп. ед.) коронарорасшряющяй эффект наступает через 10-минут и длится 1,5 часов и более. Следует отметить, что со. I после внутривенного введения снижает артериальное давле-з, которое постепенно восстанавливается в течение 15 мин. цество 44 не обладает заметным гипотензивным действием.

Было исследовано действие соед. I и вещества 44 на разные 1шги аритмии. При этом обнаружено, что вещество 44 не облада-антиаритмическим действием, в то время как соед. I в концен-щии 3 мг/кг обладает выраженным антиаритмическим действием, 1Т0Й дозе соед.1 устраняет аритмии, вызванные разными аритмо-

- 18,-

генными веществами (адреналином, строфантином, CaGIg). При СаСГ2 аритмии проявляется и амгифиориллягорная активность этого соединения. Соед. I полностью устраняет и аритмию, вызванную окклюзией левой нисходящей коронарной артерии. Далее било исследовано действие соед. I и вещества 44 на агрегацию тромбоцитов. Известно, что в тромбоцитах имеются белки, аналогичные сократительным белкам гладких мыщц, и что эти белки играют основную роль в изменении формы, агрегации и секреции кровяных пластинок. Регуляция сократительного аппарата тромбоцитов схожа с регуляцией аналогичных белков гладких мышц. Поэтому было интересно изучение соед.1 и вещества 44 на агрегацию тромбоцитов, вызванную разными индукторами (АД£, норадреналином, коллагеном), Исследования показали, что соед. I и вещество 44 в :концентраци-

с _о

ях 5.10 М и 5*10 оп. ед. ингибируют АДФ-вызванную агрегацию на 50$ и 20$, соответственно. Было обнаружено также, что соед.1 в концентрации 3-Ю-5 М ингибирует на 50% вызванную норадреналином и коллагеном агрегацию. Следует при этом отметить, что известные антагонисты кальция влияют на агрегацию тромбоцитов в концентрациях свыше 100 мкМ.

В последние годы появилось много сообщений, что Са2+ и КМ являются важными регуляторами роста, пролиферации и злокачественной трансформации клеток. Более того, антагонисты Са^+ и кальмодулина.действуют на лекарственную резистентность многих клеток и нашли широкое применение в сочетании с противоопухолевыми препаратами при лечении злокачественных новообразований (Ye lgl et el., 1984).

' Исходя из всего вышеизложенного, било изучено действие соед. I на рост злокачественных опухолей. Опыты были проведены на мышах с саркомой 180, асштной карциномой Эрлиха,- раком легкого Люиса и гемопитобластозом La ). Установлено, что соединение I увеличивает среднюю продолжительность жизни крыс с саркомой 180 на 40$ в дозе, равной 1/6 от его ЛД^ (9 мг/кг), в то время как на асцитную карциному Эрлиха, рака легкого Лшс и на гемоцитобластозу La не оказывает достаточного терапевтического действия.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены новые биологически активные соединения среди арилгетериламинов тетрагвдропирановэго и пиперидинового ряда, блокирующие вход ионов кальция в клетку и ингибирующие'некоторые Са"+-КМ зависимые ферменты и физиологические процессы (Са^+-КМ зависимую ФДЭ, фосфорилирование легких цепей миозина и пролиферацию клеток).

2. Среди изученных 63 соединений выявлено 10 активных соединений, из которых отобран наиболее активный представитель -дигидрохлорид N- -1,2,5-триметил-4-фенилпиперидин-4ил) этил ] -Ы-цианометил-Ы-(3,4-диметоксибензил)амин (соединения I) и при этом обнаружены определенные закономерности медду химическим строением" тт биологической активностью.

3. Установлен конкурентный характер действия соед. I на активность комплекса (Са^+«КМ-ФДЭ), сопровождающийся существенным изменением константы Михаэлиса при незначительном изменении максимальной скорости гидролиза цА№.

4. Обнаружено новое гомогенное вещество (вещество 44) непептидной природы из гипоталамуса быка, обладающее ингибирующим действием на некоторые Са^+-КМ зависимые ферменты и физиологические процессы.

5. При изучении фармакологических свойств соед. I и вещества на сердечно-сосудистой системе выявлено: ,

а) Соед. I и вещество 44 ингибируюг сокращение гладких мышц (аорты, портальной вены), вызванные разными агонистами - KCl, норадреналином, гистамином.

б) Соед. I и вещество 44 обладают коронарорасширяющим действием.

в) Соед. I проявляет антиаритмическое действие на моделях аритмий, вызванных перевязкой левой нисходящей артерии, CaCIg. строфантином, адреналином.

г) Соед. I и вещество 44 обладают антиагрегационной активностью, ингибяруя агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ, коллагеном, норадреналином.

6. Соед. I увеличивает продолжительность жизни крыс с саркомой 180 на 4056.

7. Совокупность полученных биохимических и фармакологичес-

ких экспериментальных данных позволяет допустить, что представленные вещества могут представлять большой интерес для лечения многих сердечно-сосудистых заболеваний.

Слисок работ по теме диссертации

1. Бархударян Н.А., Закарян Т.Р., Шувалова Л.А., Чаилян С.Г., Алексанян. А.Р., Галоян А.А. Влияние коронаросуживаодих пептидных факторов гипоталамуса на активность киназы легких цепей миозина // Нейрохшщя.-1989. - Т.8, №4. - С.336-341.

2. Galoyan A., Chifliklan М., Galoyan К., Chailian S., Ulanovsky I., Antonian A., Babaian M., Shuvalova L., Alexa-nian A., Sharova N. New compounds of hypothalamus regulating catecholamine biosynthesis and iiwnunogenesis // European Society for Neurochemistry, 8th General Meeting. - t990. - P. 102. Leipzig.

3. Barkudaryan N., Zakaryan Т., Alexanian A., Sharova N., Suvalova L., Chailyan S., Galoyan A. New date about Ca2+ - independent regulatory action // European Society for Neurogh-

mistry. 8th General Meeting, т 1990. - P.141. Leipzig.

4. Шагинян К.С., Норавян О.С., Алексанян А.Р., Тосунян А.О. Синтез и фармакологическое изучение дазамещенных арилал-киламинов, содержащих тетрагидропирановое кольцо // Арм. Хим. ж. - 1990. - Т.43, Ш. - С.723-727.

5. Алексанян А.Р. Действие гидроиорид амина Ы -[(1,2,5-триметил-4-бензил-пиперидин-4ил) - этил]- К - (п-метоксикорично кислоты на сократительную способность гладкой мускулатуры и на фософоршшровалие легких цепей миозина // Тезисы докл. X Молодежной конференции по синтетическим и природам фцзмыгагическл активным соединениям, Ереван. - 1990. - J.oiJ.

- 21 -

6. Алексанян А.Р. Влияние гипоталнмического фактора на :а сократительную способность гладкой мускулатуры аорты // [ейрохимия. - 1991. - T.I0, №1. - C.9I-92.

7. Срапионян P.M., Палова Т.В., Алексанян А.Р., Галоянс i.A. О некоторых биохимических свойствах коронароактивных бел-сов, идентифицированных в сердце быка // Украинский биохимичес-сий яурная. - 1991. - Г.63, - С.28-31.

8. .Галоян A.A., Алексанян А.Р., Островская М.В., Чаилян ¡.Г., Улановский И.1. К молекулярным механизмам действия но-зых кардиоактивных соединений непелтидной природы на гладкую /шшцу // ДАН РА (в печати).