Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса

Гурвиц, Берта Яковлевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса"

<л

НАЦИ0НМН1АЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х. БУШТЯМ

На правах рукописи

ГУРВЩ БЕРТА ЯКОВЛЕВНА

• УДК 577.I52.3I4-6I2.0I7

СТРУКТУРА И НОВЫЕ ФУНКЦИИ НЕКОТОРЫХ ИЛМУНОЫОДШТОРОВ -ГИПОТАЛАМУСА

■ 03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени , доктора биологических наук в .виде научного доклада

ЕРЕВАН - 1993 г.

Работа выполнена в Отделе биохимии ноПрогорыонов Института биохимии игл. Г.Х.Бунятяна HAH Армэшш (директор - академик HAH Армении, профессор А. Л.Галош).

Научный консультант: академик 1Ш1 Армении, профессор

А.А.Галоян

Официальные оппоненты: член-корр, HAH Аршшш,

доктор биологических наук, профессор

К.Т.Карагезян

доктор ыэдицинскнх наук, профессор А.В.Зшпфш

доктор биологических неук, профоссор М.М.Мелконян

Ведущее учреждение - Ереванский государственный университет.

Защита состоимся nJ?0" j/c J^KS' 1993 г. в 13-00 ч. на заседании спецнолкзкровашюго совета Д 005.15.01 при Институте биохимии им, Г.Х.Бунятяна HAH Армении в конйеронц. зале Института геологических наук IL'JI Армении по адресу: 375019, Ереван, проспект Маршала Баграшша, 24,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии км. Г.Х.Бунятяна ГШ! Арглошя,

Ученый секретарь специализированного сонота,

_ д.б.н., профессор J^t^cfruc^C* А.А.Симолян

ОЛШ A/irA.TJ'RPüJTIL'a РЛЮТИ

Ап'уадтлюетт. п ■пгктпк. Отгсрюто нового класса кардпоактлг.-лпх iJ0":poi'0p:.!0íiüij г:;шгала".!уса и :iz болг.овлх гфсдаоствслпглсов (Галолл A.A., I0C>'¿, IDG1) ц.ллучолпо флзлко-ххлдчссклх л öi:оло-гпчсских своПств ir: мло.гссгвслллх ('{юр,'.i (Галоя:г Л. Л. л др. ID8C), • a Títur.0 ;;o:,-.n:íci:coü этих иойрогорноиов « болкал.л (Галояя A.A., Сранпошл P.M., 1983) явилось началом нового этапа лсслодозаллл биоетллчсских механизмов гляоталамлчесхо:! рогуляцлл уулгадй влс-цсралглла оргалов организма, в частности, ак'глллостл середа л коронарного кровообрадсппя. . .

Обиаруг.опле феномена лепрссопреторлого горлолообразоваллл гапгллоларллтлл ллпг::амл лродсердля л лослодовашсо за влдо-лелло ряда лепглдлнх горглолов лродссрдил (Галоял A.A. л др., 196?, 1373; Сралпошш P.'.l. л др. lira, 1901), язлящихск §акто- '• раггл лптегратдлл олдо:;рл:лагх слсгам гипоталамуса л сердца, позволило влдвилуть ко:щоацдэ супостоокяш едино:! ^апщлокалшо;! систем г. ис>;росег.ретсриш глпэталамус - од;;о;:рлллое ссрдцс (Гадоял A.A., 199,']).

.'¡сслсдозалля кохаиасио» действия шовь откргаих еояткдгко: горглолов, олазшаю'длх возделегзло ла иороларлоо кролэобращелло и актшшость сердца л друга: влецераяьлгд органов, вшвлли их влияние ла обмел циклических пуклеотлдов, лалтллодуллл С X. ! ) — з ал не ; л л í : о фориелги (Гурвлд Б.Я.'ндр., 1370-1293), тралслор? лаллцля (Галоял A.A., Ксворклн Г.А. л др., I0G8), блоолчтез псГфотралсглцттеров (Чифшяи М.Д. л др., 1036, Г,)80) л лологорле другло пуллцлл.

Но мотаболлчсслог.у действии лоропароакчлвлпе неЛродоятлди, обларулсшшо во у.ралцлн лг.зкоглологулярлик белков и пеятэдов М'БП), 1шдолслло.1 лз глло'галалуса биг.а, место отлеегл к трем ослозллгл группам (Галолп A.A., I99I-I993):

1. Тралслокаторл лопов кальдлл да-оаркоилазштлчоского ротл-дулуиа, сарколсмми к uvroxonnpiifi гяздклх тдляц сосудов гллодарда

во ВПС1СЛОТОЧПОО лростраиство (хороларорасшлряэдд'; нелоогорглол "С" л его млояеетвоплне уорш).

2. ]"1альц11й-нозаш!Сш.шо агдчпзатори Гй-стклулфуожх /Ьорг.юп-тов, осуществляющие свое дейоттого путей связывания'с КМ (дорока-росуглваквдю поГфололтлдн).

3. Стимулятора о'азашюй активности ¡и'~завдслмлх ферментов -

фоссюдиэстеразк (ФДЗ) циклических иуклоотидоп, кшшзи легких ценой мкооипа (К1Щ.0, ииназн фосфорилазы, нротеннглшазн, ас тре-бу.ацпс для своего дснствня присутствия 1X1 и попов кальция. К ото:: группе относятся коропаросугсдаахщие нопронеитндн, наоюн-ituc С-иэдулкпаг.ш, т.к. они, по bccü вероятности, являются регуляторами кардиотрогаюго действия nciippropnoHn "С", а та;:::;с на основанш IK 1С.!-подо0;юго дспстшш па'.'базалшуго активность 1QÜ-зависшлих ферментов (Галоян A.A., Гуршщ Б.Я., I93G, 1992; Абрамян Г. Э., Бобрусгаш II.Д. л др., 1989, 1900).

Дальнейшее изучение вновь откригш: псиропоятдцов л непрогормонов, механизмов их глс-таболичсского действия и структурно-фуипщ-ональнкх характеристик отлридс новые аспекты проблемы взаимоотно- . шопп" ¡je:;;r.y г.гозгог.т i: сердцем и другими системами организма. Полученные дашше свидетельствуют о той, что, наряду с ва-кпеу.пен ролью d высэобогденли трошпк гормонов ццопопшо^иза в oönty» циркуляцию, осуществляемом рглизинг-гормопамя (GuUU-u-in Ii., et uj.,

1971; Schalii' A.v., et ai., v.itv, Wi'd) и регуляции деятельности сержа и .других впеп.орпльпмк органов, а также многочисленных метаболических процессов, гипоталамусу нршщцяемгг роль в осуществлении слоглкс взахюотнои'ошн: мегду Ц11С и nr.jrynnoii систе-Ko'i (1!С). Оказалось, что гипоталамус, подобно органам и клеткам ИС, является источником к.мунатраис:.штторов.

Еще в начале 70-х годов били получены дшшпо о связывании поронар.ора&пнряющик нейрогормошв гипоталамуса с сывороточными гаила-глобулинаш при глсвобогдошш otic: iieiipo гормонов в общин кровоток (Галоян A.A., Огапял Н.В. и др., 1971), что позволило высказать предположение о том, что.их действие тем или гашм образом связано с ПС. В процесса дальнейших исследований участие ги-потолаг.шческих номропептидов в осуществлении взаимоотношений с ИС находило все больнее подтверждение.

Из состава <5Ш впервко балл внделепи нойропоптвдн, относящиеся к семейству тимозшюв, -i>4(I-39), с» такко a1 (1-74) и (1-76) - убшазкгии (Gul'oyan A.A., Üurvtta B.Ya., 1W2, 1ууЗ 5 Галоян A.A., Чанлян С.Г. к'др., 1992), которпе изначально били обнаружены в тклусо - одном из центральных органов HC (coia-Htein A.L., et. el., 1У73; Hooper J.A., i4 ul.', 1У7й>!

игл приписывалась роль регуляторов днфференцнроуки и пролиферации лимфоцитов.

Болеэ того, 'педавио впервые било продемонстрировано наличие-

в ФБГ1 гипоталамуса белка, первичную структуру которого удалось расшифровать tOuivi in <;{.1о;ы- л.л., vj4)i Gtu'vi 1 i

jj^orov Ta. a. , et ni., 1<гп). На основании порвлчной структуры бил идентифицирован внутриклеточный рецептор нового иммуяосуп-россора Ж 50G (Tnnaiiti H., et al., 1'j.-Y). Этот РК 506 - связываю- • щш! белок (FK-СБ), наряду с циклофилшге.л - рецептором циклоспорина А, который широко используется в медицине при операциях по трансплантации органов и тканей для подавления отторжения трансплантанта, ОТНОСИТСЯ К семейству ИШуНОфИЛИГОВ (Hardin;; M.V.'. , et ai., 198ь, iyi<9; siekicrko J.J., et al., vjiy). Удивительны:.! свойством ишдунофилинов является присущая ил активность пеитидил-пролил цис-транс изомерази, катализирующей изменение конформацки пролин-содеркащих пептидов И Некоторых белков Qlandschi.macher r.e. , et 1У04; F.techer о., et y].,i'j89). Функциональное значение активности этого фермента окончательно но раскрыто. Не ясно также, каким образом ферментативная активность иимунофилкнов проявляется при их взаимодействии с соответствующими лигаидакп.

Подтверждением участия кардиотропнкх пептидов, выделении из ФБП, в функционировании ИС явилось такжэ обнаружение их влияния на активность макрофагов к образование антител (Антонин А.К. и др., 1980; Лярикян B.C., Галоян К.А., 1992).

В литературе накоплен значительный материал, свидетельствующий о том, что многие иммунологически активные соединения участвуют в реализации иммуно-нейроэвдокрташх взаимосвязей. Так, химозины стимулируют секрецию лкжиберина из гипоталамуса и латеини-зирущего гормона ИЗ гипофиза (Неbar H.W., et .al., 19В1 ; Hall k.r. , et al., 1S/B2). Шказан синтез нейрогшгофизартсс гормонов окситоцина и вазопрессина, а такгке иейрофизина в клетках тимуса И В культурах лимфоцитов (Geenen v., Le¿roe 1.2., et al., 1986, 1987). В лимфоцитах эти соединения обладают свойствами интерлейкина-2, являющегося фактором роста Т-клеток (Johnoon н.м., et al., 19ь2), оли оказывают влияние на дифферепцировку и пролиферацию Т-лшфоцитов и накопление в них if-кнтерфорона, АКТГ и л -эвдорфша. lia пролиферацию Т-лшфоцигов и биосинтез igA стимулирующее воздействие оказывают субстанция Р и сомато-статин. Иммуномодулирук-щш действием обладают также энкефалкны. Установлены сложные рогуляторныо отношения ло типу обратной связи между интерлеиютом-I и глюкокортикоидными гормонами (Шхинек

Э.К. и др., 1993). Интериайкин-1 - один из немногих известных шимунотрансмиттеров с установленным прямым действием на ЦНС, в частности на гшоталамо-непрогилоиазарную систему. Он вызывает активацию адренокортикотролной функции гипофиза с участием адреноргических систем. Имеются также данные о поптидорпгческой ИННерваЦИК ЛИЫфОИДНОЙ ТКЭШ (РеНег Р.Ь., \7iedermann СЛ.,

198и, 1987) К Т.Д.

Итак, в свете новых данных, свидетельствующих об участии иммунологически актшвннх соединен;!!! и регуляции нейроэндокрин-ной системы, а также о налита:; в гипоталамусе - важнейшем регу-ляторном органе ЦНС кардиоактшшых иелрогорыонов и нойропепти-дов, являющихся элементами ПО, представляется необходимой разработка новых принципов познания взаимоотношений в сфере иммуно-непроэндокрчнной системы организма и роли кеиропоптидов - ишуно-траксшттеров в отих взаимоотношениях, Необходимо отметить, что указанные нейропептидн обладает стабильностью, они сохраняют цельность своей структуры дрл высокой температуре, нлзких значениях рН, выдергивают воздействие ацотонитрила и других химических агентов. Их структура консервативна в эволюционном плане, они обнаружены практически во всех органах и тканях. Эти кейро-пептиды полифункциональны, они обладают широким спектром действия. Подобные внсокостабилыше соединения, осуществляете взаимосвязь между ИС и нелроэндокринной системой, могут определять формирование защитных реакций организма и его адаптации к повреждающим воздействиям самой различной природы. В этой связи изучение данной проблемы является весьма актуальной.

Цель и задачи нослеттовання. Доль настоящей работы заключалась в определении первичной структуры кардиотропных пептид,ов гипоталамуса и изучении механизмов их биохимического действия. В системе руководимого А.А.Галояном исследования новых регуля-торных пептидов гипоталамуса в работе ставились следующие задачи:

1. Разработать методы выделения Са~"ь, КМ-яезависимых активаторов КМ-сткмулируешх фарментов из ФБП гипоталамуса с помощь» высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭ1Х).

2. Провести кинетический анализ изменения активности некоторых КМ-зависимых ферментов под влиянием С-модулинов.

3. Исследовать характер биохимических взаимоотношений двух

ферментов гипоталамуса - ФДЭ циклических нуклеотидов и 5'-нук-леотидазы (5Г-Ш() и провести сравнительный анализ действия на эти форманты КУ и С-глодулша.

4. С использованием методов белковой химии исследовать первичную структуру С-модулинов, а гагам других пептидов, сопут-ствутацих С-модуликам при их выделении.

Научная новизна работа. В гипоталамусе обнаружена ранее неизвестная система Са "''"-независимых пептидных стимуляторов базаль-ной активности КМ-зависимях ферментов. Эти стимуляторы были наз-вшш С-модуянками. На основании кинетического анализа сделано заключение о существования на молекуле одного из этих ферментов - ФДЭ циклических нуклеотидов аллосторического центра, связывающего С-модулиш. Полученные результаты, наряду с литературный! данными, подтверждают предположение'о налички в гидрофобном домене ФДЭ центра, связывание с которым приводит к активации фермента.

Показано наличие в гипоталамусе сопряженной системы двух ферментов: ФДЭ циклических нуклеотидов и 5*-НК; обнаружена функциональная взаимосвязь между каталитическими центрами этих ферментов. Впервыо установлено, что 5'-Ш является КЧ-зависимым ферментом, активность которого возрастает в присутствии (КМ + Са ).

Продемонстрирована активация фосфорилироваиия легких цепей миозина, катализируемого КЛЦМ, под действием С-модулинов, что может свидетельствовать об их участия в процессах мышечной сократи- ■ мости и лежать в основе механизмов их кардиотропного действия.

Предложен метод быстрого единовременного выделения С-моду-линов из ФБЛ гипоталамуса быка с помощью обратно-фазовой ВЭЖХ. Первичную структуру С~модулннов определяли с применением методов аналитической химии (масс-спектрометрии, аминокислотного анализа и шкросеквенирования). Выла идентифицирована структура тимозина

(1-39). Определена его молекулярная масса, Ш- = 4818,9. Продемонстрирована активация КЛЦМ из скелетной мшщы кролика под действием (1-39), т (16-38), Та., и ИЛ. Изучено дей-

ствие Т1*4 (1-39) на активность ФДЭ.

Впервые в гипоталамусе обнаружен иммунофилин (ЕС-СБ). Определена Н-концевая последовательность тридцати аминокислот ГК-СБ и его молекулярная масса, Мг = 11778,4, что соответствует полной структуре нативкой молокулы РК-СБ, ранее выделенного из тимуса

бшса И IIOKOTOpiDC других источников.

¡Гракт- ^юскпя ; г о щ-го с т т,. Полученпио дашше, раскрипающно структуру и особс!шосг№ действия пептидоп, впдолмшнх из гипоталамуса, на активность iC'.I- 'авнсштх ферментов, раслнрямт наши позншнш о молекулярных механизмах, происходящих в подуио-иоЯро-эндокршшоп система. Обнаружение кжупогешшх пептидов в Ц1Ю дает понимание того, что наши ггривичнпе представления о функционировании lit; являются ограничошплш и требуют пересмотра. Данная работа шкот способствовать разработке научио-обоснопанннх рекомендаций по использованию нонрооцдокришшх препаратов для леченнл ссрдечно-сосуднсгнх, ондокриших, нервных, ишупнпх II других заболевании.

Параду с этим, разработанные гютоди dii,целения нонропептидов могут бить использовали при проведении различных биохимических исслсдовшпй.

дпг)ос5г.ттгтт5г рабоп:. Матерпаяп дассортащтониоЯ работы бнли продставлопи па: III Intern. Conference on Cyclic nucleotides, Мел Orleans?, 1977; Intern. Sympoeium "Cyclic Nucleotides and Therapeutic Perspectives, luris, 197B; J LI i'.COCOKXJHOii Конференции, посвященной 80-летмо со дня рождения Коштоянца Х.О., Москва, Т980; Сессии отделения иеднко-бполопгчоских наук АМН СССР, Ереван, 1982; IX. isi: Meeting, Vancouver, 1 эвз; 1-Х licecoronoii конференции по биохшляи нервной системы, Ереван, ISB3; XVI fees Meeting, Moscow, 1984; V Всесоюзном симпозиуме "Цшшгческио яуклеотидц и систеш регуляции ферментативных реакции", Гязанъ, 1985; IBUC Intern. SympoDiuo on lieuroendocrinologjr "feptide and Monoamine Neurohormones in neuroendocrine regulation", Leningrad, 1985; VI ES1I Ceneral Meeting "Molecular Basis of Neural Function", Irague, 19B&; Всесоюзном симпозиуме но модицинскоИ энзимолоига, Махачкала, 1906; X Всесоюзной конфоротцш по бпохн-лнга нервной системы, Горький, 1987; VI кап General Meeting, Qci-teboj^, 1?ЬН; IIJ Всесоюзной конфорощии по нолроэндокршюлопш, Харьков, 1988; Всесоюзном сишозиумо "Роль циклических нук-леотщов и вторичных моссендаеров в регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск, 1988; XIV 1SN Meeting, llontpellier, 1993.

Дубликацки. По тема диссертации опубликованы 42 печатные работы.

Структура диссертации. Диссертация изложена в виде научного доклада.

РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделоние КМ-зависимой ФДЭ из мозга быка и определение ее активности

Фермент выделяли методом, предложенным ранее (Бобрускик И.Д. и др., 1987), с некоторыми модификациями. Метод включает четыре стадии,очистки фермента: анионообменнута хроматографию на колонке ДЭАЭ ТБК, афринную хроматографию на фенил-сефарозе, анионообменнута ВЭКХ на колонке ДЭАЭ так и гель-прошжакщую ВЭКХ на колонке тбк 3000 эй.

Активность ФДЭ определяли методом, предполагающим двухста-дийную реакцию .гидролиза [3К] сАМР и [ н] 5'АМР, катализируемого ФДЭ и 5'-НК змещюго яда, соответственно (тьоорвоп , лрр1е-шап м.м., 1971). рк] аденозин, образовавшийся в результате этой реакции, отделяли от негидролизованных субстратов с помощью анионообмешшх смол "Амбзрлит" или "Дауэкс" и производили счет радиоактивности фракции, содержащей аденозин.

Результаты представлены в относительных единицах активности (ОЕА), рассчитанных по проценту гидролизованного субстрата в минуту с учетом радиоактивности проб в отсутствие фермента и уровня неспецифической сорбции аденозпна на ионообменнике при полном гидролизе субстрата в присутствии избытка фермента.

На рис Л представлены профили элюции ФДЭ в процессе двух-стадийной ионообменной и аффинной хроматографии. Выделенный таким образом препарат фермента обладал высоким сродством к ЮЛ (К0 = 3,3 нМ) и активировался при его добавлении в инкубационную смесь в 10-12 раз. Пик активности ФДЭ, выделенной с помощью гель-проникающей ВЭЖХ, выходил с объемом, соответствующим молекулярной массе ^ 130 кД.

По данным электрофореза в 10$. ПАЛ1 в присутствии 0,1% ДДС-На, выделенный препарат ФДЭ характеризовался наличием двух белковых полос. Это находится в соответствии с имеющимися литературными данными о том, что ФДЭ мозга быка является димером, состоящим из субъединиц с эффективной мг^60 и 64 кД.

VI, ОЕА

200 мл

ЭГТЛ

200 мл

А280 VI, ОЕА 0,4 [о,8 А

0,2

ЫаСI, Ы 0,45

0,30

0,15

100 мл

Рис. I. Выделение КМ-зависимой Ф.ЦЭ циклических нуклооти.цов из мозга быка. . .

A. Профиль элюции ч'ДЭ с колонки ДЭАЭ ТБК (ц х 4 см).

Б. Профиль элюции С'ДЗ с колонки с фенил-сеГГярозоП (6x4 см).

B. Выделение КМ-зависимоН С>ДЭ в системе ВЭлХ на колонке ДЗАЭ ТЭК, ЬКВ-Р(1агтас1а) 21,5 X 150 мы,

I - активность фермента. 2 - изменение оптической плотности. 3 - градиент НаСГ. КМ-ФДЭ - ЮЛ-зависимая 'Ш, злюируемая во. втором пике активности фермента в системе Б010С.

2. Выделение С-модулпнов из гипоталамуса быка и определенно их действия на й.'-зовисш.ше ферменты

Лиофилизировашшл лоро:пок (ЖН растворяли в 0,1$ трифторук-сусной 1СПСЛОТО _('IW), центрифугировали, сулсрнатант фильтровали и подвергали обратно-чТадовой БЭЖХ на колонке C-I8, 4,6 х 250 мм (¿Пел). Элгоцгао осуществляли со скоростью 0,8 мл/мин с использованием 0,1% ТФУ (буфер А) и ацотонитрила, содержащего 0,03/? ТФУ (буфер Б), с помощью линейного градиента (0 - 60,» Б) в течение СО Mini. Элтоировашше фракции после лпофшшзации растворяли в 50 м'.1 трис-HCI буфере, рН 7,8, и определяли их влияние на ба-зальную активность ФДЭ cA'.IP.

На рис. 2 представлена хроматографа фракционирования порошка, содержащего ФЕИ, с помощью обратно^азовой ВЭКХ,' а также показаны фракции, проявляющие способность стимулировать базальную активность ФДО сАЛР. В розультато были выделены три пика активаторов фермента (Gj, 0-> и С^), которые эяпировадись при 1?, 26 и 37% ацетопитрила, соответственно. В присутствии Cj, Gg и Со скорость гидролиза сАТР яри концентрации субстрата 5 мкМ возрастала в 6-10 раз. Максимальную активацию вызывала фракция ¿2* Наблюдаемые эффекта были Са^-незавпсимши. Оли проявлялись в присутствии в илкубацнолной сглосл 0,5 i.:M ЭГТА и при замене ЭГТА на 0,5 м,'Л CaCIg степень активации ФДЭ под действием Cj, Со и О3 не

изменялась.

i.Ii 1 исследовали таете влияние указанных факторов на другой КИ-завнсимый фермент - lOIIf.l, выделенный из скелетной мышцы кролика по методу, включающему аффинную хроматографию па К.1-сефарозо UdelB-tein R.D., ct el., 1978). ,',"лозин получали из того же источника в соответствии со стандартным методом (stopkowoki D., Qi. Ui.,, 19С5).

Определелио активности 101ГГ-1 производили с помощью метода, описанного ралео (Morgan м., ct alL, 1976). иотод предполагает определение степени фосфорилировашш легкгос цепей миозина (ЛД2) в процессе его инкубации с ферментом в присутствии АТР. Это осуществлялось с применением трубчатого электрофюре-за В 10% ПЛАТ В присутствии О М мочевины (Ferric VJ.T., Ferric

А 1,0

¿0 ю

время элмлш, мин

V.%

100

•60

60 глин

Ркс. 2. Выделение С-модулшюв методом обратно-фазовой ВКЛ. А,- Типичная картина хроматографии ФБЦ.

I - изменение оптической плотности, измеренное при 210 нм. ^ - градиент (0 - 60#Б), GO mhii. '

Е. Профиль элюции С-шдулинов. Актишости <:>ДЭ (1) и КЩ1 {¿), выраженные в OriA и и i фосцюрилиропалия . ЛЦ0 миозина {?,%), соответственно. 3 - градиент ацетоиитршт, АсК.

s.v., 1970). Метод основал на различии электрофоретической подвижности фосфоршгированних и дефосфоршглроваяных ЛЦ^ миозина. Количественные результаты получены с помощью спектрофогометри-ческого скашфовония при 560 им.

Было показано, что при нанесении препарата фермента на колонку о НИ-сефарозой в присутствии CaCIg и последующей элюции буфером, содержащим ЭГТА, КЩ.1 полностью отделяется от И'Л. Об этом свидетельствует тот факт, что в отсутствие экзогенного КМ фермент не проявляет никакой активности даже при избытке Са2+. В этом случае при электрофорезе в Г1ААГ обнаруживается полоса ЛП,2< соответствующая их дефосфорилированному состоянию. Однако при добавлении в инкубационную смесь Cj, Со или G3 в концентрации 10 - 1000 нг/мл степень фосфорилирования достигает в некоторых случаях 100$. При этом одна полоса, соответствующая ЛЦз, раздваивается вследствие отделения фосфорилированннх цепей миозина от дефосфорилированных, IIa рис. 2 показано изменение активности ЮЩЧ под действием Cj, С^ и С3.

В отличие от КМ, для проявления своего действия данные эффекторы не требуют присутствия Саь+. Результат остается неиз-менннм при замене в инкубационной среде 10"^ М ЭГТА на 10"^ М СаСГ2.

Было исследовано также влияние Ср С^ и С3 на активность КМ-зависимой протеинкиназы-2 из мозга крысы, выделенной на КГЛ— сефарозе. В качестве субстрата использовали основной белок миелина или синаптин. В работе, проведонной совместно с Севериным С.Е. (мл.) и ItyÖHHHM А.Н., было показано, что фракции Cj, Со и С3 стимулируют в 3 - 4 раза базальную активность фермента. Наибольшей активностью обладала фракция Cg.

По данным, полученным совмеотно с Ливановой Н.Б. и Андреевой Р.Г., фракции C'j и С3 стимулировали в отсутствие Ш и Са2+ активность еще одного КМ-зависиыого (фермента - киназы фосфори-лазы, в состав которой КМ входит в качестве субъединицы. Кроме того, киназа фосфорилазы имеет дополнительный КМ-связыващий центр.

Итак, в ФБП гиноталамуоа были обнаружены Са2+-нозависишв стимуляторы четырех Ш-завнсимнх ферментов. Влияние выделенных факторов на два из этих ферментов (ФДЭ и МВД) было изучено более полно. Эти стимулирующие фактора отличались одним общим свойством: они оказывали характерное для ЮЛ действие

на ферменты, однако, не требовали для проявления своей активности (фисутствия йа^1'. Обнаруженные aam Ca"^-независимые активаторы Кй-зависимых ферментов были названы С-модулинаыи, в связи о тем, что они изначально били обнаружены в составе фракции кар-' диотропного нейрогормопа "С".

В настоящее время известен ряд Са^^-независимых активаторов не только ФДЭ, но и других чувствительных к КМ систем. К их числу ОТНОСЯТСЯ КИрНЫе КИСЛОТЫ И фОСфоЛИПИДЦ (V.olii D.I., Broctrom с. о., белковый аналог КМ, названный бактериомодули-

ном, обнаруженный в составе продуктов секреции стафилококкового экзотоксина St. ыа-еиа (Дудкин С.У. и др., 1984), термостабильный яолилоптид (Мг—17 кД) из сияаптоссмнон фракции коры ГОЛОЕНОГО мозга овцы (Eraniord C.J., et al. , 19U1) и др. Са"+-независимая активация большинства IÜ,'-зависимых ферментов происходит такие В'результате ограниченного протеолиза (Krinke N.M., et al., 1984).

Можно полагать, что при определенных условиях при низком содержании ионов кальция в гштяктной клетке состояние активности КМ-завистдк ферментов может определяться Са2+-неяав;1еимели фактора*«. В этой связи изучение механизмов взаимодействия 0-модулинов с ферментами,'выдслонными из гипоталамуса, вызывало большой интерес. С- этой целью были выбрани два гипоталамичсских фермента - ФДЭ и 5'-ПК.-

Ранее было показано, что нейрогормон "С" и его структурные аналоги ингибируют ФДЭ циклических нуклеотидов сердца и мозга, вместе с тем изменяя содержание аденозина в гомогенатах указанных органов (Гурвиц Б.Я. и др., 1976). Последний является хорошо известным регулятором кровотока в мозгу, сердце, скелетных мышцах. Установлено, что один .из возмогших путей образования аденозина осуществляется через интермедиат 5'АМР с участием 5'-НК. Зто позволило предположить, что кардиотропные факторы оказывают действие на обмен нуклеотидов путем регуляции превращений: сАМР 5'АМР — аденозкн. -

Одновременное образование 5'А.МР и аденозина при накоплении сА'.й? свидетельствовало о том, что происходит быстрое превращение сАМР в аденозин. Поэтому представлялось возможным, что последовательные реакции: с АМР —— 5'АМР —— аденозин катализируются комплексом ФДО-5' -1IK и что влияние кар-

диотропных соединений направлено на регуляцию уровня аденозина путем воздействия на оба фермента, образующие комплекс. В литературе отсутствуют сведения о свойствах ФДЭ и 5'-НК гипоталамуса, важная роль которого в осуществлении гормональной•регуляции клеточных процессов общеизвестна.

Большое значение имеет также исследование эндогенных регуляторов указанных ферментов.

3. Выделение ФДЭ и 5'-НК из гипоталамуса быка и их свойства

Мы исследовали взаимоотношение мевду ФДЭ и 5'-НК, выделенных из растворимой фракции гипоталамуса быка, а также проверили возможность наличия связи 5'-А'ЛР-дезамшазы и аденозиндезашна-зы, участвующих- в катаболизме 5'АМР'и аденозина, соответственно, с ФДЭ и 51 -НК.

Были применены два метода: В первом случае использовали метод, аналогичный описанному вше для определения активности ФДЭ мозга. Однако для определения активности 5'-НК не требовалось применения змеиного яда. В качество субстратов 5'-НК использовали (14С) 5'АМР или (14с] 5'(ЗМР. Во втором случае был применен микрометод, при котором объем инкубационной смеси составлял 10 мкл, Этот метод предусматривал разделение продуктов реакции с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле. Соответствующие пятна, идентифицировашшо в УФ, вырезали к определяли счет их радиоактивности.

С целью разделения этих ферментов была проведена их очистка при помощи I) ионообменной хроматографии па ДЕЛЕ ТЭК 2) аффинной хроматографии на фошш-сефарозе, голубой еефарозе, Соп-А —сефарозе, сАМР-силикагеле, 5'-Л71Р-сефарозэ и 3) гель-фильтрации на сефакриле э-¿00.

3.1. Ионообменная хроматография

С помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕТБК растворимой фракции гипоталамуса быка с использованием градиента концентраций иас1 (0,05-0,30 01) выявлены два пика активности ФДЭ циклических нуклеотидов. Показано, что обоим пикам активности ФДЭ строго соответствуют пики активности 5'-НК, которые элюируются при 0,15 я 0,25 М. N801 (рис.3,Л).;

-i 1-

AKTiuiiiocrb'IO^,

Tue. 3. CoEücoTUoe вкдолйкпе ч>Д5 и С.MIX п процессе ионообменной и гель-ироикка1^:ен хтоттогра&ак. .

А. Выделение £ДЭ СÏ,3) к Íi'-ÜK (2,4) на ДЭЛЭ TtíK.

ü качество субстратои ксиользоыш! сЛ,.:Р U), с«:..Т> (;з), :.'л;;Р(.:) и íi'GMP (4). 5-градкеит NaOl. й-мзмоне.нио оптической плотности.

И. Гель-фальтращш 4>ДЭ (I) и S'-IííC (:¿) на колонке с софифмлои S-200. Стандарты Мр1 ¡;Д: а - каталаза С.-У.О), б - альдолаза (160), в - 1С к (67), г - альбумин яичный (415), д - зшлотрплшшогеи (2л).

Установлено, что эта взаимосвязь нарушается при понижении концентрации ферментов в получениях ярепаратах. При этом, по-видимому, молсет изменяться информация молекулы ФДЭ-5'HK или про- . исходить диссоциация комплекса ФДЭ-5' -НК.

Значения Км и '/шах для ФДЭ и 5'-НК определяли в координатах обратных величин ЛоГпгулвера-Берка. Показано, что как ФДЭ, так и 5'-ШС характеризуются двумя значениями йл и Vmax..

Значения Kmj и йл^ для ФДЭ cALlP составляют 2,5'10~® M и 3,7«И, соответственно, а для 5'-1ГК при использовании в качестве субстрата 5'ЛМР - 5.10""® И и 1-ГО М, соответственно.

Значения vœa*., и vmax0 составляют 6,3*10"^ и 3-Ю"5 моль/мин>мг

1 -6 -5 /

белка, соответственно, для ФДЭ сАМР и 5-10 и 7-10 -моль/мин*

мг белка - для 'гидролиза 5* АГ.ТР. Обнаружено, что гидролиз сЛМР-и cGMP характеризуется одинаковыми значениями Kmj и Км?, однако, отмечалось увеличение Vmax1 и Vmax2 в 3 раза и в 6 раз, соответственно, при использовании в качестве субстрата cGMP.

Это, вероятно, свидетельствует о том, что ФДЭ и 5'-НК имеют по два каталитических центра, проявляющих высокое и низкое сродство к субстрату.

5. Модуляция активности ФДЭ и S'-ffiî

5.1. Активация ферментов под влиянием КМ

Установлено, что все виделеннне форш ФДЭ гипоталамуса проявляют чувствительность к действию Ш в присутствии ионов кальция. Эффективная константа активации ФДЭ в присутствии КМ в внеокоочн-щегошх препаратах фермента составляет M (рис. 4).

Действие ГО.1 на активность ФДЭ заключается в увеличении Утех при неизменном сродстве фермента к субстрату. Как базаль-ная, так и КМ-стшлулировашгая активности фермента тормозятся в присутствии известного антагониста ЮТ - трпфторпоразина; значения Ki составляют ICTJ и 10"'М, соответственно.

Следует отметить, что ГО! активировал в одинаковой степени . ФДЭ, выделенную во всех трех пиках на сефакряло S-200.

Мы впервые обнаружили, что актшзность 5'-НК увеличивается в присутствии Ш и Са2+. Установлено, что лак первая, так и вторая формы фермента, выделенные с помощью фенил-сефарозы, и подаергпутые дальнейшей очистке на Сопл-сефарозе, повышают

■и

0,6

л „ Й 0,3

5 g

о §

л t» о о

S g

-а;

-в

-7 -С lg [КМ, Ы]

-8,0 -7,5 lg [КМ, м]

~3 1« [КМ, м]

Рис. 4. Кинетика действия KU на активности ОДЭ и ö'-ILL

A. Активация ФДЭ сЛНР под влиянием КМ.

Б, Результаты представлены в координатах Хилла.

B. Влияние КЫ на актишость 5'-ИК через 12 часов (1), 24 часа (2) и 48 часов (3) поело выделения фермента.

В качество субстрата использовали 5'АЫГ.

- 21 -

свою активность в присутствии комплекса

Зависимость активности фермента от концентрации Ю.1 носит сигмоидннй xapaJc,гep (рис.4,13). Из рисунка следует, что образование аденозлна увеличивается .в 6 раз в присутствии насыщающих концентрации Ш; полумаксимальный эффект наблюдается в присутствии 5*Ю-7 II Ш. Кроне того, обнаружено, что в процессе хранения фракций ферментов при 4°С повышается базальная активность 5'-ПК, при этом уменьшалась концентрация ДМ, вызывающая полумак-сималышй эффект, до 3-1СГ® М.

Кинетический анализ показал, что актквацш фермента в присутствии КМ проявляется в увеличении V х при постоянном значении К^ для 5* А)'.1Р. Трифторперазин {Ю-5 - Ю-3 Ш подавлял активность фермента как в отсутствие, так и в присутствии Аналогичный эффект наблюдался и для 5' -ПК мозга быка.

Несмотря на наличие сходства в действии КМ на активности ФДЭ и 5'-1К, 5'-НК нельзя поставить в один ряд с известными Независимыми ферментами в В1щу обнаружения существенных различ;ш "в механизме действия 10! на 5'-НК и другие-ферменты, к числу которых относится ФДЭ. Во-первых, концентрация МЛ, необходимая для полумакешалыюй стшлуляции 5' -Ш, на два порядка превыиает концентрацию, необходимую для полумаксимальлой активации ФДЭ. Во-вторнх, мы показали, что повышение базальноа активности ФДЭ, являющееся результатом ограниченного протеолиза (в течение одной минуты в присутствии 0,5 г.П'/мл трипсина), сопровождается потерей чувствительности к КЛ, в т.о вреш как повышение базаль!гой активности 5'-1С не связано с протеолизом и сопровождается уменьшением концентрации -ИЛ, вызывающей цолумаксимальную стиму-ляцшо фермента. В-третьих, 5'-НК проявляет большую лабильность по отношению к действию КМ, которое молно наблюдать лишь в течение 3-4 часов, а в редких случаях - двух суток после выделения фермента. Влияние КЛ па активность ФДЭ сохраняется в тече- ■ ние нескольких суток. Кроме того, мы обнаружит, что утрачиваемую со временем чувствительность ФДЭ к действию К/1, в отлитие от 5'-НК, удается выявить через несколько недель после выделения фермента, добавив в препараты ФДЭ сульфгндрильные реагенты - ДТТ или 2-Ш (1-10 мМ). Возможно, что КМ, связываясь с молекулой ФДЭ, оказывает обнаруженное памп действие на активный центр 5'-ПК, присущи"; той же молекуле.

5.2. Некоторые свойства ФДЭ и 5' —Illi

Наглл било изучено действие классических ингибиторов ФДО -теофиллина, кофеина, папаверина на растворимую ФДЭ и 5* —ПК гипоталамуса. Исследование влияния этих соединении на акттиость ФДЭ и 5'-НХ лроводшш по методам Диксона и Хоршш-Гоудона. Полученные данные -выявили смеианншл характер ингпбпроЕания всеми перечисленными соединениями как ФДЭ, так и 5'-1К. Константи ипгиби-рования этими соединениями у'ДЭ и 5' -ПК находятся в диапазоне Ю"3 - Ю~4 И.

По способности подавлять гидролиз cAI.P исследованию соединения мохно расположить в ряд: папаверин > тоофиллин > кофеин.

Подобно ФДЭ, 5' -Ш( была более чувствительна к действию папаверина (Ki ~3-1СГ/1; lvi^S-IO"3 !Л). Кофеин и теофнллип тормозили гидролиз '5'АМР в одинаковой степени.

Установлено, что активности <[>ДЭ и 5* —IЕС зависят от присутствия в препаратах формантов сул^гидрилышх реагентов. Д'ГТ пли 2-моркалтоэтанол в концентрации 10 глГЛ полностью подавляют активность 5'-НК, но не действуют на базальнуга активность <1>Д0; в присутствии 15 ш'Л наблюдается 30$ ингибирование активности ФДЭ.

Мц исследовали также действие С-модулшюв на актлшность ч>ДЭ и 5'-НК. Установлено, что чувствительность к шал проявляли все выделенные нами формы ферментов при использовании в качество оубстрата <1>ДЭ как сАЧР, так и cGMP, а также 5'А'ЛР и 5'Gf.fP - в качестве субстратов 5'-НК. Максимальной активностью обладал Со.

Обнарукено, что 0о (I мкг/мл) стимулируот как ФДЭ, так и 5'-НК в 6-8 раз (рис. 5,А), в некоторых случаях - в 15 раз (рис. 5,Б). Действие С-модулипа не зависит от присутствия в среде ионов Са2н". При добавлении в инкубационную смесь Ю-4 М Са012 или I0"4 М ЭГТА результат не изменялся,

Итак, обнаруженная нами функциональная взаимосвязь между ФДЭ и 5'-НК, их совместное выделение с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ TSK, афишной хроматографии на фенил-сефарозе, голубой софарозе, Сои А-сефарозе, сШР-силикагеле и геяь-фидьтрацш на софакриле 3-200, а также сходство их регу-ляторцых свойств сведетольствувт о структурно-функциональном 1 сопряжении ФДЭ к 5'-1£С гипоталамуса. При зтом, можно полагать, что

3.2. Аффинная хроматография

Хроматография суммарного элюата первого пика ферментов, полученного на ДЕЛИ TSK, па колонке с фвнил-сефарозой позволила в свои очередь получить такта два лика, фракции которых проявля- , ли как активность ФДЭ, так и S'-IIK. Можно полагать, что связнва-ние с фенилом ферментов первого пика опосредуется участием ЮЛ, молекула которого характеризуется высокой степенью гццрофобности в присутствии Са^+. Элюция этого пика осуществляется с помощью 10 ¡Л ЭГГА, хелатнрующего Са2+ и ослабляющего таким образом гидрофобные взаимодействия. Это взаимодействие может осуществляться и за счет наличия гидрофобных участков на молекуле фермента п нарушаться яри снижении ионной силы среды, что позволяет выделить второй пик активности ферментов удалением из элгаируго-щего буфера HcCl. Аналогичную картину можно было наблюдать при хроматографии на фенил-сефарозе ферментов, выделенных на колонке с ДЕАЕ tsk во втором пике.

. Ш показали, что фракции ферментов, выявленные с помощью фенил-сефарозы и содержащие ФДЭ и 5НК, не проявляли активности 5'АМР-дезамшшзы и аденозшщезаминазы.

Обнаружено также, что на колонках с голубой сефарозой каждый из пиков, полученных с помощью ионообменной хроматографии, можно разделить на два пика, элюирусмыв буфером, содержащим waci в концентрациях 0,15 и 0,50 L!. Фракции этих пиков одновременно проявляли активность двух ферментов, ФДЭ и 5'-НК.

Далее ферменты, выделенные на колонке с фенил-сефарозой как в первом, так и во втором пиках, подвергали аффинной хроматографии на сА'ЛР-сшшкагеле с целью специфичного выделения ФДЭ на основе ее высокого сродства к лиганду этого сорбента. Показано, что в обоих случаях ФДЭ и 5'-Ш' элшругатся совместно буфером, содержащим сАМР. . .

Следует отметить, что не гидролизуемый под действием ФДЭ аналог сАМР, ИЬ,02- дибутирил-cA'.IP (3-300 мкИ), не влиял на активность 5'-ПК, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии на молекуле 5'-НК сАМР-связыващего центра. Можно полагать, что взаимодействие этого фермента с «йМР-сияикагалем опосредовано участием ФДЭ.

Была использовала также возможность специфического выделения 5'-IEK с применением 5'АМ^софарозн. В этом случае 5'-ПК,

полученная как в первом, так и во втором пиках о .помощью фенил-сефарозы, элтоировалась совместно t? <1>ДЭ буфером, содержащим 5' AJ.1P, обладающим специфичностью лишь к З'-ПК. Поскольку 5'Л.'.ГР (3 - 1000 мкМ) не оказывая действия на активность ОДЭ, можно предположить, что связывание ферментов с 5' ЛМР-сефарозои обусловлено взаимодействием с ней 5*-ПК.

Кроме того, аффинная хроматография наСопЛ сефарозе, такко примененная нами для специфичного выделения 5' -Hit, позволила продемонстрировать возможность элюировання, наряду с 5* —ПК, и ОДЭ. При этом, оба фермента, полученные во фракциях как первого, так и второго пиков на фенил-сефарозе, элюируются с Con А-сефарозн в одном пике буфером, содоркащнм а-метилманнозу (0,1 М). Это, ло-видпмому, указывает на то, что выделенная из растворимой фракции гомогената 5*-ПК, подобно ферменту фракции мембран, является глкколротеином, имеющим в своем составе а-в-тлнопирапозилыше остатки.

Итак, полученные результаты свидетельствуют, очевидно, о выделении ФДЭ и 5*-Hit в комплексе с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ TSK и аффинной хроматографии на фенил-сефарозе, голу-Зой сефарозе, сАЗЛР-силикагеле, 5'АМР-сефарозе и Con А-сефарозе.

С целью разделения предполагаемого комплекса ФДЭ-5'-ЛК мы аспользовали гель-фильтрацию фракций ферментов на сефакриле 3-200 и электрофорез в 11ААГ.

3.3. Гель-фильтрация и электрофорез

Гель-фильтрация на сефакриле s-200 алшевоти сушарного >люата двух пиков, а такко фракций второго, доминирующего пика )ерментов, полученное на фенил-оефарозе, выявила наличие строго юответствующих друг другу активностей ФДО и 5*-ПК в трех пиках, »торне характеризовались величинами Mr~220, 114 и 57 кД (рис. |,Б) и, очевидно, соответствовали тетрамеру, димору и мономеру 1врментов. Выделение ферментов на сефакриле £-200 в области мо-екулярннх масс, соответствующей, но литературным данным, моно-еру ФДЭ, может бить следствием диссоциации 5'-ПК и ФДЭ из пред-олагаемого комплекса.

При электрофорезе этих фракций в ША ПЛАТ в присутствии ,1% ДДС-На обнаружена одна белковая полоса с Mr-55 кД.

Это свидетельствует о выделении белка с Mr ^55 кД в шщи-Вдуальном виде. Полученные результаты позволяют предположить,

что активности ФДЭ и 5'-ПК принадлежат одной молекуле (55 кД) или ФДЭ и 5'-Шх, являясь разными белковыми молекулами, имеют очень близкие значения и , что не позволяет разделить их с помощь» электрофореза.

Электрофорез фракции второго пика, полученных с помощью гель-фильтрации, в 10»' ПААГ в присутствии 0,1% ДЦС-Иа выявил наличие двух бодковых полос с м 63 и 91 кД; более вцракена полоса с м 63 кД. йракции, полученные с помощью 5'А.МР-сефарозы, содержали три бел]совыо полосы с ы 7G, 63 и 34 кД, более выражена полоса с мг 63 кД.

Выявленные нами белки с мг 63 и 55 кД, по-видшому, могут являться изоформептами. Однако при электрофорезе препаратов фор-ментов,- полученных с помощью 5'А'ЛР-серарозы, в 10% ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Иа полоса 55 кД по была обнаружена. Поэтому более вероятна возможность образования субъединицы 55 кД в процессе очистки в результате эндогенного протеолиза субъединицы 63 кД, несмотря на наличие в препаратах ферментов ингибиторов протоиназ.

Итак, нам удалось выделять дшлер и мономер ФДЭ и 5'-НК гипоталамуса быка в состоянии, близком к гомогенному, с помощью, последовательных этапов их очистки на Д15АК ïsk, фенил-сераро-зе и сефакриле s -200.

Наличие мономера, вероятно, является специфичной чертой гипоталамуса, поскольку в тотальном мозге быка ФДЭ представлена димером.

Следует отмстить, что фракции элгаага, полученного с помощью софакрпла s - 200, содержали К'Л, который выделяется в пике белка, характеризующемся значением и "21 кД.

Препараты lui, полученные на ссфакрило з - 200, подвергали электрофорезу в 14% ПААГ в присутствии .ДДС-Ка. Обнаружено наличие двух белковых полос с м ~ 19 и 9 кД; более выраг.эпа полоса с мг~19 кД.

liait оказалось, в процессе очистки ¡C.I-завпсшая ФДЭ гипота-лш.1уса быка полностью отделяется от IÎ.VI в присутствии в буфере • Ю-'1 M ЭГГА. При условш гомогенизации и виделогаш фермента на колонке с ДЕЛЕ TSK в присутствии ЭГГА активность ФДЭ в элюи-руемых фракциях но повышалась ионами Са^ь, по возрастала в 1020 раз под действием экзогенного КМ. При условии гомогенизации

и элюирования фермента в отсутствие "ЭГТА на колонке с jjilAKTSK последующие этапы выделения суммарной фракции первого пика на фенпл-сефарозе и б'АИР-сефарозе также приводят к полному отделению фермента от 1СЛ. Гель-фильтрация на сефакриле S-200 ферментативных препаратов, полученных с помощью феннл-сефарозн, внявп-ла воздкшюсть ввделе;ш1 ФДЭ и ICI в разнес фракциях.

Как известно, КМ элшруется с помощью ионообменной хроматографии в присутствии 0,32 ¡VI NaCi. ;,lu жо выделили КМ, используя 0,15 M UaCl. По-видимому, получений наш КЛ был отделен от ферментов в процессе очистки. Следовательно, ФДЭ гипоталамуса быка - фермент, непрочно связывающий K.Î.

На основании приведенных данных можно дать следующую характеристику четвертичной структуры СДО и 5'-ПК растворимой фракции гипоталамуса быка: ФДЭ и 5'-ПК представляют собой фермент, обладающий, по-видимому, обеими каталитическими активностями, либо являющийся комплексом ФДЭ-5' -НК, который содержит непрочно связанный КМ. Возможно, этот фермент существует в виде молекул тетрамера, димэра и мономера я является гликопротоином, содержащим <t- D-маннониранозильные остатки.

Очевидно, что обнаруженное сопряжение активностей ФДЭ и 5'-ПК необходимо для более эффективного осуществления последовательности реакций: -cAMP 5'AMP -«— аденозин, а также сЗМР — 5'Gî.IP -»— гуанозия. Б связи с этим представляется важным проследить за превращениями интермедиатов в реакциях, катализируемых ФДЭ и 5'-1К, .при их совместном выделешш.

4. Функциональная взаимосвязь меяду ФДЭ и 5'-11К

Мы исследовали начальную скорость образования аденозшш из {4} cAI'.TP и (14с) 5" AùïP, используемых в качестве субстратов. Обнаружено, что в первом случао константа скорости реакции первого порядка составляет 2,0 (мпа)"^, во втором случао -Это свидетельствует о преимущественном образовании аденозина из сАМР по сравнению с 5'AI.IP.

¿¡ы проверили возможность стимуляции активности 5'-НК вследствие взаимодействия ее с сАМР, как активатором. Оказалось, что ни сАМР (3-60 мкМ), ни И ,02-дибутирил-сШР (3-60 мкгЛ) не повышают гидролиз ( О'] 5'AMP, используемого в качество субстрата. Долучешше результаты указывают на наличие функциональной взаимосвязи между £>Д0 и 5*~НК.

взаимодействии ФДЭ с активатором.

На рис. 7,В представлен график зависимости активности ФДЭ от концентрации субстрата (сАМР) под действием С2Ш в координатах Лайнунвера-Еерка. Эксперимент проведен в присутствии 0,2 мМ ЭГТА и 0>Ш е двух фиксированных концентрациях - 100 и 1000 нг/мл. Из графика следует, что величина аффективной константы сродства субстрата к молекуле ФДЭ, равная 100 мкМ, не меняется при увеличении концентрации активатора на порядок.

Вместе с тем, значение Vmax претерпевает шестикратное увеличение. Таким образом, связывание Cglll во всей диапазоне представленных ко!щентрации сАМР, по всей видимости, происходит неконкурентно по отношению к субстратному центру на молекуле ФДЭ.

Иначе говоря, способность модуляторов регулировать активность ФДЭ осуществляется аллостеричоски; сродство сЛМР к этому центру не претерпевает околь-нибудь существенных изменений.

На рис. О,А представлена зависимость активности ФДЭ от Cglll при фиксированных концентрациях КМ и в его отсутствие. При изменении концентрации 1СЛ на порядок положение точек перегиба кривых не смещается. Тог ма график, представленный в координатах Хилла, свидетельствует о той", что ЮЛ влияет на кинетические параметры реакции, катализируемой комплексом CglU ФДЭ, посредством увеличения скорости гидролиза оАЫР, не изменяя сродство С2Ш к ферменту.

Таким образом, из приведенных результатов следует, что CgHJ— и КМ-связывающий центры. молекулы фермента не перекрываются, то-есть возможно существование комплекса (Са""*«ЮЛ*ФДЭ)«СоШ. Иными словами, можно говорить о наличии на ФДЭ некоторого участка, способного взаимодействовать о С-модулином.

6.3. Стимуляция ЮПИ под действием СоШ

Была проверена активность гомогенного препарата С0Ш в отношении его действия на ЮЩ",1 скелетной мншцы кролика. Оказалось, что Cglll является сильным активатором этого фермента в отсутствие КМ. В серии экспериментов, проведенных в соответствии о методикой, описанной выше, стимулирующий эффект СоШ бнл изучен в сравнении с действием на MIJ.'I других полипептадов, дринадлежащих к семейству тимоэшюв: Та^ и синтетического фрагмента тимозина (16-38),

фирмы Bachem, США.

0,3

£ 0,2

í o I

Ol u>x

> „ ^ 0

~ -0,1

ад '

-0,2 -0,3

1 r, [Cglli], нг/г. и

1 Ж/ 2

1;. [CgUl] , нг/мл

Piro. 8. Кинотическио пара-лотри действия C2l¡l и Ш на активность ФДЭ мозга бика.

А. Зависимость начальной скорости гидролиза сШР от СоШ в различных концентрациях в отсутствие (I) и в присутствии КМ в и!.1: 100 (2) и 1000 (3).vi- текущая скорость реакции; Vo-скорость реакции в отсутствие С2Ш.

Б. То же - в координатах Хилла.

Опитн проводились в присутствии 2 ы',1 СаСТ^. Кот;ептрация субст-

вата - 5 мкМ.

С помощью спектрофютомотрнческого сканирования гелей, на которых производился электрофорез в 10$ ПЛАТ в присутствии О M мочевины, была получена информация о степени фосфорылнровапия ЛЦ0 миозина (рис, 9). На рисунке покачана сканограмма ЛЦ2 в фосфорилиро-ванном (ЛЦо-Р) и дефосфорилировапном (ЛД^) состояниях. Данный метод позволяет достичь разделения ЛЦ3 п Jlîlg-P. Локазано, что КЩ1, очищенная на Ш-сефарозо, но проявляет формонтативной активности в отсутствие экзогенного lui. Снектрофотометрнчоское сканирование контрольных гелой (рис. Э,А) показывает, что Jllb миозина не подвергается фосфорилированфо в отсутствие эффекторов (пик 3), даже при добавлении избытка Ca*"1".

Однако в присутствии КМ в комплексе с Ca"*", Ti>4 (16-30), Tax или Cglll активность lülif1.] начинает проявиться и степень фосфорили-

рования ЛЧп достигает 50, V0, 35 и fJ!5;2, соответственно. Стимулирующий эффотст при этом наблюдаотся в отсутствие 10.1 и Ca"'. Результаты показывают, что (Заявляется самим мощным из числа исследованных соединении стимулятором базальпой активности 101ЦЫ и характеризуется высоким сродством к формонту.

Гомогенные препараты c^I и СоП в аналогичных условиях не действовали на 1СЛЦМ; при их внесении в инкубационную смесь фосфоршга-рование JTHg не наблюдалось.

Итак, полученные результаты покапали, что O^lil является сильным -независимым стимулятором базальной активности ФДЗ и KJII1M.

6.4. Очистка 'О3 с помощью обратно-фазовой Ю1К Результат рехроматографпи Сд на колонке С-0 (Browniee, Aqua-роге rp зоб, 4,ь х 100) представлен на рис. 6,В, из которого следует, что С3 разделяется на два основных (C3I п С^Н) и одни мннор-Huil (C3III) гаки, злюируемые щи 35, 35,7 и 37/' ацотонитрила, соотвег-ственно. ""'

G.5. Анализ действия фракций С3Г, С^П и суп на активность

ФДЭ cAf.IP и 5' -ПК гипоталамуса Выдолешшо фракции после лнофшгизации растворяли в трис-НСТ буфере и проверяли их активность в отношении внсокоочищениых препаратов ЗДЭ и 5'-ШС, полученных в результате гель-фильтрации. Было обнаружено, что скорость гидролиза сАМР не изменяет-

v } \J

3 ЗР

ЗР

}

ЗР

Рис. 9. Фосфорилировапие ЛЦ^, катализируемое КНР. Миозин инкубировали с КЩ1 в отсутствие эжекторов (А) и в присутствии 100 нМ Ш (Б), 50 нМ Ti>4 (16-38) (В), 50 iiM Taj (Г) и 50 iiM Colli (Ю.

I - тяжелое цепи миозина. 2 - щелочные легкие цепи (JIUj). 3 - ДТПБ легкие цепи (Щ2) в дефосфоршшровшшом состоянии. ЗР - ЛЦ2 в фос-форилировааном состоянии. 4 - щелочные легкие цепи (ЛЩ).

Рлс. 5. Влияние С-шдулина (C¿) на актпыюстм ФДЭ и 5'-11К, А. Активность ФДЭ (а) и 5'-НК (б) в отсутствии (I) и в отсутствии (II) Cg в концентрации I мкг/мл. Б. Выделение ФДЭ (£.3) и 5*-1Ж (2,4) на колонке с Coa А-сефаро-зой. 1,2 - базальная активность ферментов; 3,4 - активность ферментов и присутствии С,,. ¿орменти элпнроьалпсь с помощью а-метидмашшзы Ы-li.í). 5 - изменение оптической плотности.

обнаруженная нами активация 5'-НК под действием КМ и С-модулинов позволяет включить 5'-ПК в число КМ-ст1шулируемнх ферментов, чувствительных к С-модулинам.

Перед нами, однако, стояла важнейшая задача идентификации структуры С-модулинов. С этой целью была проделана работа по очистке выделенных факторов до гомогенного состояния и проверке их способности стимулировать КМ-зависимые ферменты в индивидуальной форме.

6. Выделение гомогенных препаратов С-модулинов

6.1. Очистка С2 с помощью обратно-фазовой ВЭЖХ

Поскольку С£ обладал максимальной активностью в отношении КМ-зависимнх ферментов, именно этот пик был прежде всего подвергнут рехроматографии в системе обратно-фазовой ВЭЖХ на колонках С-8 (Brownlee, Aquapore RP 300, 4,6 X 220 ММ ИЛИ 4,6 X 100мм). Результат рехроматографш Cg показан на рис. 6,А, из которого следует, что С2 разделяется на три основных пика - Cgi, С2П и С2Ш, элюируемые соответственно при 21,9; 22,8 и 24# аце-тонитрила. Для выяснения активного начала в отношении КМ-зависи-мых ферментов эти пики были испытаны на предает их действия на ФДЭ сАМР мозга быка и КЛЩ скелетной мышцы кролика.

6.2. Кинетический анализ действия С-модулина Cglü

на активность ФДЭ сАМР мозга

Проверка влияния выделенных в процессе рехроматографки С2 фракций на активность ФДЭ показала, что стимулятором этого фермента является C¡pl. Поэтому был проведен кинетический анализ изменения активности ФДЭ под влиянием С2Ш. Повторная рехромато-графия CglU выявила гомогенность этого препарата (рис. 6,Б).

Из граТяка, отражающего зависимость начальной скорости гидролиза сМР под влиянием С2Ш от концентрации модулятора в присутствии 0,2 м!Л ЭГТА (рис.7,А), следует, что активация ФДЭ увеличивается с ростом концентрации С2Ш и достигает постоянного уровня в области насыщающих концентраций. Тот же график, представленный в координатах Хплла (рис. 7,Б), свидетельствует о высоком сродстве С2Ш к ферменту, где кажущаяся константа диссоциации его комплекса с ФДЭ составляет ~50 нг/мл. Значение величины п., = I указывает на отсутствие кооперативности при

АсЫ,

л210 0,2

0,1.

30 20

СО мин 0 10 20 30 мин

210 1,0

0,5

А?, 40

30 20

60 мин

40 30 20

10 О

б ТО 20 " 30 мин

210 0,2

з,г

Рис. 6. Очистка фракций Со и Сд (см. рис. 2) на обратно-фазовой колонке в системе ВЭ1Х.

Фракции ликов Со и Сз лнофилизировали, растворяли в 0,1% ТФУ л подвергали рехромато графии. . Элюция фракций С2 (А) и С3 (В) с помощью линейных градиентов АеН - (15 - 30%) и (25 - Л0%), соответственно, в течение 60 мин. Выделение фракций СоШ (Б) и С3П (Г) в гомогенном состоянии в тех же системах в течение 30 глин. По оси абсцисс - время удерживания, мин. I - изменение оптической плотности. 2 - градиент АсЯ.

I/ [cAi.IP], мкМ

Рис. 7, Кинетические параметры действия С-модулина С^И на активность ФДЭ сАМР мозга быка.

A. Зависимость начальной скорости гидролиза cAi.EP от концентрации Colli. Опыты проводились в присутствии 0,2 мГЛ ЭГТА. По оси абсцисс - логарифм концентрации С2Ш в нг/мл.

Б. То пе в координатах Хилла.

B. Зависимость скорости гидролиза сАМР от концентрации субстрата в координатах Лайнуивора-Берка в отсутствие (I) и в присутствии Colli в концентрациях в нг/мл: 100 (2) и 1000 (3).

ся в присутствии Cgi, однако, возрастает в 6-7 раз при добавляй!н Cgll и в 3-4 раза Щ)И добавлении С3Ш в инкубационную среду. Активность 5'-ПК при использовании 5*AMP в качестве субстрата сти-'мулировалась под действием Св ~ 5 раз, а в присутствии Cgi и Cglll но изменялась. Анализ полученных данных показал, что стимулятором ФДЭ и 5' -НК является фракция С3П. Повторная хроматография этой фракции в той же системе показала её гомогенность (рис. 6,Г). Поскольку фракция С^Ш была в некоторой степени активна в отношении ФДЭ, её также рехроматографировали для последующего анализа.

7. Исследование первичной структуры С-модулшов

В плане структурных исследований С-модулинов определяли аминокислотный состав некоторых из них, производили микросекве-нирование и масс-спектральный анализ. Первичная структура С^Ш была исследована Галояном A.A. в лаборатории shiveiy j.k. п Институте Deскглап (City of Норе), Калифорния, США , В СОТрудНИ-чостве С Let т.н.

7.1. Анализ аминокислотного состава C.J1I

Образец CglH (<^100 пмолей) гидролизовали в 6 н HCl в течение 22 часов при П0°С. Аминокислотный состав определяли на анализаторе Becknmu 6300. Элюируемые аминокислоты обрабатывали нин-гидрином и идентифицировали по поглощению при 440 и 540 нм (табл. I). Аминокислотный анализ подтвердил пептидную природу исследуемого соединения.

7.2. Микросеквенирование и масс-спектральный анализ C,Jü

Микросеквешгрование (с использованием деградации пептидов по Эдману) было осуществлено на трехфазном секвенаторе, снабженном реактором непрерывного потока, Аминокислоты анализировали в виде фенилтиогидангоюювых производных на встроенной установке обратно-фазовой ВЭЮС. Результаты обрабатывали'с помощью системы Perkin-Elmer Ыш.

Попытка секвенирования образца 02Ш оказалась безуспешной. Это давало основание полагать, что молекула исследуемого пептида имеет ацетилированшЛ Д-конец.

Для расшифровки аминокислотной последовательности С^Ш образец бил подвергнут ограниченному иротеолиэу под действием эвдо-

Таблица I

Аминокислотный состав С.

Аминокислоты

¿SX

Thr Ser Glx Pro Gly ■Ala Val Met lie Leu Туг Phe H1B Ьув Trp Arg

Содержание аминокислот в пептиде пмоль/моль пептида

Опытные данные

4Д

2,8

3.2

9.3

3.0 1,9

1,9

0,0 0,6 1,8 2,3 0,2

1.1 0,4 7,7 0,0 0,0

Расчетные данные дляТ1>4 (1-39)

3 3 10 3

2 2

1 О 9 О О

лизиновой лротоиназн С с использованием метода, описанного ранее (Lee T.D., Shively JaE., et al., 1990).

Анализ протеолитического гидролизаг.а показал, что яативиый пептид расщепляется на фрагменты, два из которых (I и 8) дают наиболее выраженные пики. Молекулярные массы нативного пептида и продуктов протаолиза определяли на основании масс-спектров, полученных с помощью трех-секционного масс-спектрометра' Finni-gan tsq 700 с источником ионов типа "электроспрей".

Масс-спектральный анализ показал, что молекулярные массы протеолитических фрагментов I и 8 составляют 1303,9 и 655,8, соответственно. Фрагмент I не поддавался секвенированшо. Это свидетельствовало о том, что он представляет собой И -коштевую часть молекулы. Микросеквенирование фрагмента 8 позволило полу-

чить следующую аминокислотную последовательность: Аап-Рх-о-ьеи-Рго-Бег.

Результаты секвенирования использовали для поиска гомоло-гийпо банку аминокислотных последовательностей. Компьютерный анализ показал идентичность расшифрованной структуры фрагменту тимозина и4 (26-30). На основании масс-спектрального анализа было получено значение молекулярной массы нативного пептида Суп, равное 4618,9 (табл. 2).

Таблица 2

Результаты масс-спектрального анализа интактной молекулы СрЧ1 и её протеолитических фрагментов.

, пептид значение Мг структура

опыт расчет

Интактний 4618,9 4619,2 Тв4 (1-39)

Фрагмент I 1303,9 1304,6 Те, (1-Й)

Фрагмент 8 655,8 655,4 Тв4 (26-31)

Аминокислотный состав, приведенный в таблице I, находится в полном соответствии со структурой тимозина »4 (1-39), который отличается от нативной молекулы тимозина ч4(1-43) на четыре аминокислоты. Молекулярная масса Ти4 (1-43) составляет 4982.

Итак, структурные исследования в сочетании с биологической активностью С^Ш и фрагмента Ти4 (16-38) свидетельствуют о том, что С-модулин (С2) является тимозином «4, в молекуле которого отсутствуют четьре С-концевые аминокислоты: А1а-О1у-О1и-Зег (рис. 10,А).

Можно высказать предположение о том, что Т«4 (1-39) является протеолитлческим фрагментом нативной молекулы Тй4, однако, представляется вполне вероятным, что Т"4 (1-39) существует в мозгу, наряду с Т»4 (1-43), играя свою особую специфическую роль. Подтверждением этому служат данные о том, что некоторые структуры, принадлежащие семейству тимозидов, обнаруживаются в процессе их выделения в среде, в которой присутствуют факторы, полностью подавляющие возможность их образования из более высокомолекулярных предшественников в результате протеолиза

■ Бег - Авр - Ьув - 1'го - Авр - Ые Ъ - А1й - 01 и - Не -- 111 и -

Ь:.в - РНе - Авр - 1*ув - Бег - Ьуа - Ье и - Ьуе - Ьув - ТЬг -

01 и - ТЬг - 01и - Ши - Ьуе - Аеп - 1 го - 1,01, - 1го - Бег -

У)

Ьув - (Ли - Т11Г - Не - (Ли - (Ли - 01 и - Ьуе - С1п - ОН

40 41 42 43

•конец Т1>4(1 -43): - А1а - 01.У - Щи - Бег - ОН

Мег - Ип - Не - РИе - Уа1 - Ьув - ТЬг - Ьеи - ТЬг 10 - 01.у -

Ьув - ТЬг - Не - ТЬг -Ьеи - 01и - /а! - 01и - Рго 20 . - Бег -

А ЕС - ТЬг - Не - (Ли - Авп - Уа1 - Ь.7В - А1а - Ьуе Зи - Не -

С1п - Авр - Ьуе - 01и - ту - Не - Рго - Рго - Авр 40 - В1п -

С1П - Аг<; -Ьеи - 11е - РЬе - А1а - 01у - Ьув - 01п 1>0 - Ьеи -

01и - Аер - 01у - Аг|,- - ТИг -Ьеи - Бег - Аьр - Т^г ЬО - Авп -

Не - 01п - Ьуе - (Ли - Бег - Т11Г - Ьеи - Н1а - Ье и 70 - Уа1 -

Ьеи - Агс; - Ьеи 74 - Агс - ОН Ь - (Яу 70 - 01 у - ОН

Рис. 10. Аминокислотная последовательность тимозинов.

Л. Тшозип в4 (1-39). Подчеркнута структура протеолити-ноского фрагмента Тл4(26-31), структура которого била определена с помощью микросеквепировани. Показана С-концовая последовательность Т о4(1-43).

Б. Тиг.юзип вд (1-74). Подчеркнута М-ко:щовая последовательность, определенная с помощью микросеквешфования. Показана С-концовая последовательность Т в1(1-7С).

последних.

Iluci/ютря it<i ТО, ЧТО КЛОСО ТШОЗЛНОВ достаточно обншрон, в литературе, насколько нам известно, отсутствуют какио-либо упоминания о ти4 (1-39). 13 этой связи можно полагать, что нолу-чонныо даннно позволяют расширить класс тимозшюв за. счет внесения в него структур!/ то4 (1-39).

7.3. Млкросоквошгровашю и масс-сноктромотрш! СдПи СдШ

Секвсннроиашю гомогенной фракции С^П проводили па автоматическом секвеиаторе модели 816 (Knauer, ФРГ), снабженном анализатором ОТГ-аынЛОКПСЛОТ, модели 120 A (Applied Bioayatema, Inc.,- США), в Институте молекулярной биологии РАН совместно с Егоровым Ц.А. 1;'асс-спектры пептидов получали на масс-спектро-ыетре с ионизацией типа "олектрослрей". и -коноц C^II оказался не ацетилировашшм; била расшифрована н -концевая последовательность 30 аминокислот. Поиск гомологичной структуры по банку последовательностей пептидов с использованием компьютерного анализа показал, что СдЛ представляет собой тпмозин, т (убиквптин).

Па ословашш иасс-слектралыюго анализа определено значенио молекулярной массы О^П, мг = 8454,6 Д. Эти данные, наряду а полученной нами аминокислотной, последовательностью, показали, что ■ cyi представляет собой т ц^ (1-74) (рис.10,Б). Расчетное значение мг т ^(1-74) составляет 8451 Д.

Была определена такие N -концевая последовательность 20 аминокислот С^Ш, лик которого элюируется в нроцоссе очистки Сд ле— посредственно лоолэ СдЛ, яри 37% ацэгоиигрлма (рис.С,В,Г). Оказалось, что эта аминокислотная последовательность гомологична структуре 1^(1-74). Однако поскольку С^Ш проявлял большую гидрофобность и вццелялся при большей ютщентрацин ацетоннгрила в элюирующем буфере, по сравнению о т а, (1-74), а такмо на основании значения Мг 8600 Д, по дашшм электрофореза п ПЛАТ в присутствии ДДО-Ха, било сделано предположение о том, что выделении!; пептид представляет собой т (1-76)'(рис.10,Б).

Итак, результат анализа структуры С-модулшюв продемонстрировали наличие в гипоталамусе пептидов, принадлежи*« к классу тшлозшюв. ПолучсппЦе данные откршш новые биохимические функции этих соединенна, направленные на С'а^-незовлсилуи регуляцию iii.i-завлепшх систем. Новые рогуляторяне свойства т п4 ц т наряду с их иммунологическими функциями, проявляющимися в относю-

нии дифференцировки и пролиферации лимфоцитов, уча&тием в секреторных И других процессах, происходящих В организме (Goldstein A.I,. , et al., 19В1 ; Spar.elo R.I,., et al., 1987 X а также с широко известными функциями убикпитина в осуществлении внутриклеточной АГР-зависнмой протеолитической деградации белков (Rech-BtelnerM., 1908; Varebcvsky A.Ya., 1991, 1992) служат дополнительным подтвергдешюм полифункциональпости выделенных соединении.

Полифушсцноналыгость является, по-видимому, необходимым свой-, ством ноироиептпдов, которые могут быть отнесены к классу иммуио-трансмиттеров, осуществляющих взаимосвязь между ИС и нейроэпдо-кршшой системой. Они могут участвовать в целом каскаде реакций, происходящих как в лимфоцитах и лиыфоидных тканях, так и в мозгу и висцеральных органах. Далеко не случайно их функции связаны с мощными регуляторныгли система-ли организма, включающими метаболизм сАИР и транспорт кальция.

Са- '-независш.гое действие тимозинов на базальную активность 1<М-зависимих ферментов требует дальнейшего изучения. Высокая ги-дрофобность этих соединений, в особенности убиквитина, лежит, по-видимому, в основе их взаимодействий с фермента™. В то время как гидрофхэбность КМ возрастает в результате увеличения степени спи-рализации его молекулы при связывании С-модулины обладают

способностью проявлять КЛ-подобное действие на ферменты в отсутствие Ca2f. Увеличение степени фосфорилироваиия легких цепей миозина, катализзгруемого Ю1-завис!шой OTÎ.1, можот приводить в конечном итоге к проявлению коронаросуживагощего эффекта С-модулинов. Имеются данные о том, что С-модулшш действуют на КВД1 как скелетной, так и гладкой мускулатуры. При этом необходимо упомянуть о том, что многие реакции, происходящие в процессе мышечной сократимости, осуществляются и в немшечных системах, в макрофагах (Trotter .J.A., Adelstein R.S., 1979), Лимфоцитах (í'cchheiiuer M., Cebra H.I., 19B2 ) И МОЗГу (Barylko li., Sobieezek Л., 1933). Кроме того, было показано взаимодействие Ти4 с актином (safer D., et al., 1991). Некоторые актаг-связнвающие белки, в част-

ности, тропомиозин тромбощтгов (Levtie V.G. , et el., 1983), а таете тяжелые цепи миозина-скелетной шищи (Strehler Е.Е., et al., 1966) имеют в составе молекулы участки, аминокислотные последовательности которых гомологичны Tis. (16-25), что под- „

тверндает участие тимозинов в сократителышх процессах.

Наряду с этим следует учесть, что стимуляция базалыюй активности Д;1~зависимой 4>ДЭ приводит к снижению уровня сАМР в системе, что может способствовать проявлению коронаросуживающего эффекта ü-модулинов, поскольку сАМР является известным фактором мышечной релаксации.

Кроме того, имеются данные об ишуномодуляториой роли аго-нистов »-рецепторов, активация которых, как известно, приводит к накоплению в клетках cjUTP. Это справедливо в отношении лимфоцитов, пролиферация которых тормозится под действием сАМР на ранних стадиях их индуцированной активации (nroüde о.-к., et ь1., 1991). На начальных этапах развития процесса активации лимфоцитов наблюдается повышение уровня Са^'" в клетке, накопление фосфатидплннозита и активация яротеинкииазы "С". При ртом индуцируется секреция интерлейкина-2. Агенты, повышающие уровень сАМР в клетке в результате активации оденилатциклаян, подавляют эти процессы. В этой связи, активация ФДЭ тимозинами может включаться в каскад реакции, приводящих в конечном итоге к известному стимулирующему эффекту тимозинов в отношении дифференцирован И Пролиферации ЛИМфОЦИТОВ (Кикшег J.M., 19od).

По-видимому, полифункциональность тимозинов проявляется в том, что они участвуют в многостадийных процессах. В этой связи следует вспомнить известные данные об активации аденилатциклазы под влиянием убиквитина (Jiiteneky м., 197Ь). Нельзя исключить вероятность того, что тимозины участвуют в системе обратной связи, регулирующей уровень cAI.lP не только в клетках и тканях MC, но также в мозгу и других органах. Следуат учесть, что в механизме действия Ti>4 и в особенности Tftj принимают участие различные лигандн. В комплексе с лигандами тимозины проявляют некоторые из своих регуля^орных свойств.

8. Идентификация структуры иммуиофщпша - FK-СБ

В процессе дальнейших исследований структуры гипоталамнчес-ких пептидов, входящих в состав ФЕП, сшровоздащих О-ыодулшш при их выделении с помощью обратно-фазовой B3SX, была подвергнута дальнейшей очистке фракция (указанная « на рис. 2,А), элтоиру-емая при 41% ацетонитрила. Использование нелрерцвного градиента (30-45#Б) позволило выделить из состава этой фракции два доми-

наитных (П'и Ш") и два минорных (1*и 1У") пика (pi'ic. II). По данным гласо-олектралыюго анализа, молекулярные массы фракций Л* и Ш* составляли соответственно 157^9 и 11778,4 Л. Попытка сек-вепировать фракцию П* оказалась неудачной в связи с тем, что Ii-конец молекулы этого пептида ацотилирован.

Микросеквенирование (по Эдману) фракции Iii* дозволило получить N-концевую последовательность 30 аминокислот. Поиск соответствующей структуры по банку пептидов показал, что расшиФро- ■ вапиая последовательность принадлежит белку, связывающему имму-носупрессор FK 50G, обладающему ферментативной активностью пеп-тидил-пролил цис-транс изомерази (рис. 12). Даниио аминокислотного анализа в совокупности со значониеи Мг = 11778,4 Д, полученным на основании масс-спектров, показали полное совпадение структуры выделенного полипептида со структурой нативпоп молекулы FK-СБ.

Обнаружение в гипоталамусе FK-СБ является дополнительным подтверждением существования взаимосвязи мевду 1ЦТС и ИС. Новый имглуносупрессор F1C 506, выделенный из микроорганизма streptomy-сев tcukubaensiB (Япония), находит все большее применение в медицине при операциях по трансплантации органов и тканей'для подавления отторжения трансплантанта. FK 50G оказался в 10-100 раз эффективнее известного иммуносупрессора - циклоспорина Л. Исследование механизмов действия JK 506 показали, что это соединение обладает супрессорной активностью лишь в комплексе со специфичным к нему FK-СБ. Эта активность проявляется в тормол:ешш диффо-ренцировки и лролифорации Г-лимфоцитов вследствие блокирования транскрипции гена, кодирующего биосинтез интерлейкина-2, который является фактором роста Т-лимфоцитов.

Совершенно очевидно, что FK 506 - не единственный лиганд связывающего его белка. Нет сомнешш в том, что FK-СБ встукает во взаиглодействие с эндогенными лигавдами, с которыми он создает иммунологически активные комплексы. Присущая FK-СБ, а также другим иммуцофилинам, в частности, циклофилину - рецепторному белку циклоспорина А, ферментативная активность пептцдил-пролил цис-транс изомерази является уникальным свойством всех известных соединений этого класса. При образовании активного комплекса с лигандом активность фермента подавляется, однако, этот факт не является критерием иммуносупрессорного действия иммунофилинов.

время удерживания

Рис. II. Очистка фракции, элюпрованноП при ацотонитрила в процессе разделения iffilí на обратно-фазовой колонке в системе B3ZX. I - пзмепепно оптпчоскоП плотности. 2 - градиент ацегонит-рила (30-4G?ß).

NIL, - Ш.у - Val - Gin - Val - Glu - Thr - De - Ser - Pro - Gl ,у -

£ -¿O

Aap - Gly - Ar>; - l't.r - Pht- - Pro - 1,.\п - Агк - Ol.у - Gin -------30

Tin- - C.vb - Val - Val - Hie - Туг - Thr - (ll.y - bet - Leu -

-40

Arg -ЬО Leu -60 Glu -70 Gin -ВО Туг -

ПО 13 о -100 Asp -

Glu - Aep - Üly - Lye - L^a - Phe - Aap - Ser - ÜJer

Aap - Ary; - Ann 1.JE - Pro - Phe - Ljü - Phe - Nie t

Glj - Ljû - ülr - Glu - Val - Ile - Ai'fj - Gly - Trp

Glu - Gly - Vlil - Ala - Gin - Met - Ser - Val - Gly

Arg - Ala - Lys - Leu - Thr - IK' - ¡}e Г • Pro - Asp

Alu - Туг - Gly - A - Thr - Gly - lila - Pro - Gly

lie - Pro - Pro - Hl о - AT u - TI ir - Iil'U - Val - Phe

Val - Glu - Leu - Leu - Li в - Leu - Glu - OH

Ríe. I;,'. Аминокислотная последовательность FK 50G-CK. Подчеркнута М-ко;ш,овая последвательность, определенная о помощью микросоквопировашм.

-40В настоящее время механизм действия иммуносупрессоров окончательно не выяснен. Не ясно значение ферментативной активности иммунофилшюв в подавлении иммунных реакций организма, а также их роль в качестве молекул - шенперонов, которые участвуют во внутриклеточной транслокации различных других молекул, являясь для них двюхущимися связнвающши центрами.

Было обнаружено, что субстратами пептнднл-пролил цис-транс изомеразы, наряду с короткими пролии-содержащнми олигопептидами, являются РЖаза Тр цитохрогл С, а также кальцитонин - полипеп-тлдный гормон, участвующий в метаболизме Са'"'г (Ып L.-N., et ai., 1988; Kern п., 1993). Кроме того, оказалось, что комплексы FK 506 с РК-СБ и циклоспорина А с циклофилином подавляют активность каль-цлнейрина - фосфатазы, являющейся также КМ-зависимшл ферментом (Friedman'J., 1<i?1; Liu J., et ab, 1?91, 1992).

Эти данные, в сочетании с результатами наших экспериментов, указывают на то, что шлмунофилины участвуют в вачшейшей регуля-торной системе, в которую вовлочоны Са"+ и фосфорилирование белков. Наряду с этим, полученные результаты открывают возможность поиска лигандов иллунофилияа - FK-СБ, обладающих шлмунологичес-кой активностью, с целью их применения в медицине.

ВЫВОДЫ

1. В гипоталамусе быка обнаружена ранее неизвестная система Са^-нозависимих пептидных стимуляторов базалыгой активности ЮЛ— зависимых ферментов ('РДЭ, 1СЛЦМ, протеишеиназы, киназы фосфорила-зы, а такие 5'-IK). Эти стимуляторы были названы С-модулипами.

2. Па основании кинетического анализа сделано заключение о существовании в молекуле одного из названных ферментов - ФДЭ -аллостернческого центра, связывающего С-модулины.

3. Показано наличие в гипоталаиусе сопряженной системы ферментов (ФДЭ и 5'-ПК). Обнарркена функциональная взаимосвязь глех-ду каталиттесюши центрами этих ферментов. Впервые показана ЮЛ— зависимость 5'-Ilii, которая активируется КМ в комплексе с Са^+.

4. Предложен мотод быстрого единовременного выделения С-модулинов из гипоталамуса быка с помощью обратно-фазовой B3SX.

5. Методами аналитической химии (масс-спектрометрии, агли-

ноккслотного анализа и микросеквенировашш) определена первичная структура двух С-модулинов. Показано, что С-модулины относятся к классу тимозшюв.

5.1. Впервые в гипоталамусе обнаружен тшозин (1-39). • Определена его молекулярная масса, Иг =4818,9 Д. Первичная структура этого полипептида била получена в результате ограниченного протеолиза в связи с тем, что Н-конец его молекулы ацо-тилкрован. С помощью обратно-фазовой ВЭКХ произведено разделение протеолнтических фрагментов, определена аминокислотная последовательность одного из них, по которому била идентифицирована структура тимозина и4(1-ЗЭ).

5.2. Определена молекулярная масса, Мг =8454,6 Д, и Н-кон-цевая аминокислотная последовательность полилептцда, которая оказалась гомологичной структуре тимозина ¡^ (1-74) - убиквити-на. Бил также выделен и идентифицирован тимозин (1-76).

6. Впервые в гипоталамусе обнаружен ишунофнлин (рецептор нового иммуиосупрессора - РК 506), обладающий ферментативной активностью пэлтидил-пролил цис-транс изомеразы. С помощью мик-росеквенирования определена последовательность 30 М-концовнх аминокислот этого иммунофилина. На основании масс-спектрального анализа определена его молекулярная масса, Мг = 11778,4 Д.

7. Результата проведенных исследований, направленных на выделение и идентификацию нейропептидов и белков гипоталамуса, являющихся регуляторами иммунной системы, свидетельствуют о том, что гипоталамус является не только центральным органом мозга, регулирующим гормонспоэз аденогипофиза, различные метаболические процессы организма и функции висцеральных органов и, в частности, сердца, но и важным центром иммунной системы.

Обнаружение в гипоталамусе нойропептцдов, присущих иммунной системе, оказывающих влияние на кальмодулин-зависимые системы, открывает новые перспективы познания фундаментальных механизмов действия иммудоиодуллторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Погосян U.K. Ингибирование фосфо-диэстеразы циклического аденозин-3' ,5'-монофосфата сердца и мозги крыс поя действием неирогормона "С". Вопросы биохимии мозга.

1976, 11, 89-96.

2. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Галстян Р.Г. Влияние неирогормона "С" на обмен адетшнуклеотндов и аденознна в сердце и нозге крыс. Вопросы биохимии мозга. 1976, 11, 197-207.

3. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Погосян М.А. ИнгиОирование фосфо-диэстеразы циклического аденозин-3' ,5'-монофосфата сердца и мозгл крыс под действием неирогормона "С". Бюлл. эксперим. Оиол. мед.

1977, 83, 691-693.

4. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Конкуренция между нейрогормоном "С" и циклическим AMP за иикло-АМР-связываюшхе белки. МАИ Арм. ССР. 1977, 65, 173-180.

5. Гурвиц Б.Я., Сарибекян Г.А., Сомова Е.С., Галоян А.А. Коррелятивная зависимость между ингиоированием активности фосфодиэс-теразы циклического аденозин-3' ,5' -монофосфата мозга и сердца крыс In vitro и коронарорасширяюшлм эффектом неирогормона "С" In vivo. ДАН Арм. ССР. 1978, 66, 290-295.

6. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Влияние нейрогормона "С" на активность аденилатциклаэы мозга и сердца крыс. Биол. журнал Армении.

1978, 31, 485-490 .

7. Galoyan A.A., Curvlts B.Ya., Klrakosova A.S. Neurohormone "С" and cyclic nucleotides. Advances In Cyclic Nucleotide Res. Abstr. of the III Intern. Conference on Cyclic Nucleotides. New Orleans. Haven Press, N. Y. 1978, 9, 776a.

8. Galoyan A.A., Gurvits B.Ya., Sarlbeklan G.A. Neurohormone "C" and cyclic nucleotides . Atstr. of the Intern. Symposium "Cyclic Nucleotides and Therapeutic Perspectives". Paris. 1978, 1011.

9. Galoyan A.A., Gurvits B.Ya., Klrakosova A.S., Sarlbeklan G.A. Neurohormone "C" and cyclic nucleotides. Abstr. of the Intern. Symposium "Cyclic Nucleotides and Therapeutic Perspectives. Paris.1976, 23-24.

- .13 -

10. Galoyan A.A., Gurvits B.Ya., Sariheklan G.A., Kirakoslva A.5. Neurohormone "C" arid cyclic nucleotides. In: Cyclic Nucleotides and Therapeutic Perspectives. Pergamon Press, Oxford and N.Y. 1979, 165-101 .

И. Галоян А.Д., Гурвиц Б.Я. Молекулярные механизмы деиствия неирогормона "С". Тез. докл. III Всесоюзной конференции, посвященной 80-летию Коштоянца Х.С. "Физиология и биохимия медиаторни> процессов". Москва. I960, с. 52.

12. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Регуляция активности фосфодиэсте-раз циклических нуклеотидов. Тез. докл. Сессии отделения медико-Оиол. наук АМН СССР. "Медицинская эизимология". Ереван. 1981, 27-29.

13. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Регуляция активности фосфодиэсте-раз циклических нуклеотидов. Новые эндогенные регуляторы. Ьестнш АМН СССР. 1982, 9, 64-69.

14. Galoyan A.A., Gurvits b.Ya. Regulation of caliroilu 1 iril CaM 1-stlmulated phosphodiesterase < PDh" l of hypothalamus by neurohormone "C". Hegulatory domain of CaM PDE. J. Heurocliein. 1963, <11 Suppl .3 112C.

15. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова H.I1. Участие неирогормона "С" в регуляции активности гнпоталзмнческоя кзльмолулин-активиру! мои фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. Тез. докл. IX Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы. Ереван. 1983, 104105.

16. Caloyan A.A., Gurvits B.Ya. Regulation of multiple forms of cyclic nucleotide phosphodiesterase from hypothalamus. Abstr. of the XVI FEBS Meeting. 1984,' XXII-050, p. 448.

17. Галоян А.А., Шарова Н.П., Гурвиц Б.Я. Особенности регуля-торних свойств фосфодизстеразы циклических нуклеотидов гипоталамуса быка. Тез. докл. V Всесоюзного симпозиума "Циклические нук-леотиды и система регуляции ферментативных реакции". Рязани. 1985, 48-49.

18. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П. Роль тиоловмх групп в активации фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов кальмодулн-ном. НеИрохимия. 1985, 4, 56-60.

19. Gurvits B.Ya., Galoyan A.A., Sharova N.P. New factors modulating cyclic nuc leot.ide? phosphodiesterase activity from bovine

hypothalamus. Alstr. of IBRO Intern. Symposium or. Neuroendocr Ino-log-y. "Peptide and Monoamine Neurohormones In neuroendocrine regulation". Leningrad. 1985, p. 54.

20. Galoyan Л.А., Gurvits B.Ya. Regulation of multiple forms of cyclic nucleotide phosphodiesterase from bovine hypothalamus. Nev factors modulat 1 rig- enzyme activity. Neurochem. Res. 1985, 10, 1467-1461.

21. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П. Об активации фосфоди-эстеразы циклического гуаноэин-3' ,5 '-монофоефата гипоталамуса ме тилксантинами и папаверином. Нейрохимия. 1986, 5, 139-148.

22. Gurvits B.Ya., Sharova N.P., Galoyan A.A. On the functional differences between catalytic sites of cyclic nucleotide phosphodiesterase from bovine hypothalamus. Abstr. of the VI ESN General Meeting "Molecular Basis of Neural Functions". Prague. 1986,

J 23, p. 275.

23. Галоян А. Л., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П. Функциональные различия каталитических центров фосфодизстеразы циклических нуклеотидов гипоталамуса Оыка. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии. Махачкала, 1986, 53-54.

24. Галоян А.А.. Гурвиц Б.Я. Новый кальций-независимым пептидный активатор фпефодиэстеразы циклических нуклеотидов мозга. Ней-рохимия. 1986, 5, 420-422.

25. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П. Кальмодулип и С-моду-лш1 - активаторы 5'-нуклеотидазы мозга Оыка. Тез. докл. X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы. Горький. 1987, 125-126.

26. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П., Алексанян С.С. Са , кальмояулин-записимая 5'-нуклеотидаза гипоталамуса Оыка и ее регуляция С-модулином. Нейрохимия. 1987, 6, 544-551.

27. Шарова Н.П., Гурвиц Б.Я., Галоян А.А. О взаимосвязи между фосфодиэстрразой циклических нуклеотидов и 5'-нуклеотидазой гипоталамуса быка. Нейрохимия. 1986, 7, 217-224.

28. Galoyan А.Л., Sharova N.P., Gurvits B.Ya. 5'-nucleotidase of hypothalamus and its regulation. Abstr. of the VII ESN General Meet ing. Goteborg. 1988, F 104, p. 115.

29. Галоян А.А., Чцфликян М.Д., Гурвиц Б.Я., Оганесян А.О., Григорян Г.Г. Влияние С-модулина на синтез катехоламинов в мозге

крыс. Тез. докл. Ill Всесоозной конференции по нейрозндокриноло-гии. Харьков. 1986, с. 57.

30. Шарова Н.П., Гурвиц Б.Я., Галоян А.А. Функциональное сопряжение между фосфодиэстерауои циклических нуклеотидов и З'-нуклео-тидазои мозга Сика. Тез. докл. VI Всесовэного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных мессенджеров в регуляции ферментативных реакций". Петрозаводск. 1980, 93-91.

31. Galoyan A.A., Sharova N.P., Gurvlts B.Ya. Cyclic Nucleotide phosphodiesterase and 5'-nucleotidase: A coupled system of functionally bound enzymes. Abstr. of the Intern. Symposium "Molecular Organization or Biologic.ll Structures". Moscow. 1969, D-30, p. 139.

32. Галоян А.А., Бобрускин И.Д. , Гурвиц 15.Я., Абрамян Г.Э. Кальций-независимые активаторы фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. Нейрохимия. 1969, 6, 78-86.

33. Galoyan A.A., Gurvlts B.Ya., Sharova N.P. Cyclic nucleotide phosphodiesterase and 5'-nucleotidase: A coupled system. Neurochem. Res. 1989. 14, 1213-1221.

34. Абрамян Г.Э., Бобрускин И.Д., Гурвиц Б.Я., Галоян А.А. Влияние антагониста кальмодулина W-7 на регуляции активности КМ-за-висимои фосфодиэстеразы из мозга быка С-модулином 1. Нейрохимия. 1990, 9, 196-203.

35. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Новые гипоталамические кардиотроп-ные соединения - универсальные активаторы базальной активности кальмодулим-эависимых ферментов. Нейрохимия. 1990, 9, 369-372,

36. Галоян А.А., Бобрускин И.Д. , Гурвиц Б.Я., Абрамян Г.Э.

Са -независимая регуляция кальыодулин-зависимои фосфодиэстеразы мозга Оыка С-модулинами. Нейрохимия. 1990, 9, 430-459.

37. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я., Шарова Н.П. Сопряженная система ферментов - фосфодиэстераэа циклических нуклеотидов и 5*-нуклео-тидаза гипоталамуса и ее неирогормональная регуляция. В кн.: Современные проблемы биохимии. М. Наука. 1991, 144-157.

30. Galoyan A.A., Gurvlts B.Ya., Shuvalova L.A., Davis M.T., Shlvely J.E., Lee T.D. A hypothalamic activator or calmodulln-dependent enzymes Is thymosin 11-391. Neurochem. Res. 1992, 17, 773-777.

39. Галоян А.А., Гурвиц Б.Я. Открытие поптидил-пролил- цис-транс изоморазы в гипоталамусе. Иейрохимия. 1992, II, 89-91.

40. Турвиц Б.Я., Алекс анян С.С., Галоян А.А. К вопросу об исследовании первичной структуры кальций-независимых активаторов кальмодулин-зависимнх ферментов. НеНрохимия. 1992, II, 317324.

41. Gurvite B.Ya., Galoyan A.A. Isolation of immunophilin, a receptor of lmmunosuppreesor FK 506, from bovine hypothalamus. Abetr. oi the XIV ISB Meeting. Klontpellier, Prance. 1993, ЬА 2D.

42. Galoyan A., Chiflikian M., Gurvite В., Grifiorian a., Challian S. The peptide pool of regulators of catecholamine bioeyntheeie in hypothalamus and atrium. Abetr. of the XXV ASH Meeting. USA. 1993 (in press).

Заказ A3 _

. 1 Тире* ¡00

Отпечатано на ротапринтном участке 1ЩИ0Н АН Араеиии Адрес: Ереван-I, ул.Абовяна,25.

Информация о работе

Гурвиц, Берта Яковлевна
доктора биологических наук
Ереван, 1993
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и новые функции некоторых иммуномодуляторов гипоталамуса
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия