Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипоталамических нейропептидов на Са2+-кальмодулин зависимые системы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипоталамических нейропептидов на Са2+-кальмодулин зависимые системы"

РГО од

НАЦИОНАЛЬНАЯ ЛЩЕШ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х.БУИЯТЯНА

На правах рукописи БАРСЕЕЯН КАРИНЕ САШКОВНА

УДК 577,112:547.063

ВЛИЯНИЕ ГШОТАШ'ЩЕСКИХ НЕЙРОПШШРВ НА Са2+-ШЫЮЛУШ ЗАВИСИМЫЕ СИСТЕМЫ

ОЗ.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1993

Работа выполнена в Институте.биохимии НАЛ Армении (директор - академик HAH Армении А.А.Галоян).

Научные руководители: акадевдк HAH Армении,

профессор А.Л.Талоян

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук К.А.Бархударян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Г.С.Хачатрян

.доктор биологических наук, профессор Р. Г. Каманин

Ведущее учреждение - Ереванский государстве*шый университет.

Защита состоится "§Jo "<sSj.,Р 1993 г. в .(Ю чао, на заседании специализированного совета Д 005.15.01 при Институте биохимии им. ГД.Бунятяна HAH Армении, 375044, Ереван-44, ул. Л.С.Севака, 5/1. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. Г.Х.Бунятяна HAH Арме;ши.

Учений секретарь специализированного совета, Донг.биоя.наук, профессор

А.А.Сшлонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ«

Актуальность проблема. В сисгага исследований по Са2+-кальмодулик независимых пептидных регуляторов мозга кальмодулин активируемнх ферментов, развиваемых проф. А.А.Галояном, важное место занимают гилоталамические пептиды, которые активируют фосфодиэстеразу ц.АЖ> и ккназу легкой цепи миозина путем связывания с кальмодулином без участия ионов Са2+ (Гаяоян A.A., 1988, 1989, 1990). Известно, что одним из важным внутриклеточных посредников действия ряда гормонов и нейротрансшттеров являются ионы Ионы Ca , связываясь со своим рецепторпш белком - кальмодулином, вызывают определенные конформацконные изменения, при котором обнажаются гидрофобные участки молекула, что является условием связывания о различными белками-мишенгоот (ферментами). Это приводит к активированию или кягибироьанш активности ряда ферментов (ChzwiaWJ. !9Ю\ dkCUti Jf, №.. cd №ö, Kicc С. ö. d CiL,/9^0). 'J

Кроме ионов Ca^+, кальмодулин способен связывать различные соединения, отличающиеся как ло структуре, так и по фармакологическим свойствам. К их числу откосятся нейролептики (фе-нотиазинн), алкалоиды (вшбластия, лиикристин), антибиотики (ацреамицин) л др. Связывание этих веществ, так называемых антагонистов кальмодулина, препятствует его взаимодействий с различными кальмодулин-зйвисимыми ферментами или модифицирует это взаимодействие ((Сети К- Owii е/ at.№$%).

Показано, что кальмодулин способен Ca*'"'"-зависимым способом связывать и некоторые биологически активные пептида и белки (АКТГ, ß -эндорфин, вегаество Р, гестоны, основной белок миелина и др.) ('tAAaUncih eAat Все эти соединения, в зависимо-

сти от их структуры, связываются с кальмодулином преимущественно через гидрофобные или ионные взаимодействия {JLCilii.it еХ оА. (983 ) • Хотя в настоящее время детально изучена структура кальмодулпна и некоторых его антагонистов, однако ват достаточных знаний о механизмах взаимодействия я функциональных изменений кальмодулина при указанию: взаимодействиях.

В 1990 г. А.А.Гелоян и соавт. сообщали о том, что корона-росужившсвдие пептидные факторы (Гйу^), выделенные из гипоталамуса крупного рогатого скота связываются с кальмодулином как в

присуготвди, гак и в отсутствие.ионов и таким путем оказывают воздействие на активность некоторых Са^+-кальмодулин-залиспшшс фер:„ )нтсв. Важным этапом этих исследований явилось опрздтолениа первичной структуры всех 5-и пегтндных факторов гипоталамуса. (Галоян, Лотшпайх,. 1991).,

.3 настоящей работе представлены новый данные о механизме связывания ПФ^^д с калиюдулдаом, а также об изучении взаимодействия на активность Са2+-кальмодулинзависимой фосфо-яротешзфосфатазы - каиьцинвйрина. Показано, что ПФ^^ изменяют чувствительность кальмодулина к его антагонистам и модифицирует активность ферментов.

Цель и задачи исследований. Принимая во внимание, что ПФ|_ц вызывали активацию пшазы легких целей миозина (КЛЦМ) и кальмодулшчувствитояъной ФДЭ дА№> путем Са2+-независимого связывания с калшодулином (Галоян, Бархударян, 1989) и учитывая соггряженнкй характер процессов фа сформирования и дефосфо-ршгированга , целью настоятей работы было: изучить механизмы связывания с кальмодулином, а также исследовать воздей-

ствия на активность Са^+ , кальыэдулинзависимой фосфопро-

теинфосфатазы - кадьцинейршщ. Перед надо* стояли следующие задача:

1) Определить величину К^ (кажущуюся константу диссоциации) дая комплекса кальшдулин-П5;

2) Изучить- взаимодействие ПФ^ о А/- и С~кокцевыш до-■ менами кальмодулина с определением величины Идля комплексов Д/-концевой фрагмеш- кальмодулика-ПФ и п-кокцевой фрагмент кольмодулияа-ПФ

3) Изучить кооперативное воздействие ПФ1_-- и антагонистов кальмодулика на процесс образования иммунокомллекса кальмоду-лщ-ЕНМтело с использованием метода ферментзависимого иммуно-оорбснтного анализа ( 6 и IЗЛ).

4) Изучать воздействие и соответствующих им но структура синтетических пептидов на активность Са2+, кальмоду-лкязавксжлой фосфопротацкфосфатазы - кальцинейрина как в присутствии, гак и в отсутствие ионов Са2+. Для этой доли выделить из га-ттшого мозга быка гомогенный препарат кальцютпйрина.

Научная, новизна и тактическая ценность.

Впервые показано, что связываются как с. Л/- так

и с С-концевим доменами кальмодулина, облачая более высоким

сродством к Л/-концевому домену. Обнаружено, что ffi>j_g изменяют чувствительность кальмодулина к его антагонистам. Известно, что некоторые антагонисты кальмодулина используются в качестве лекарственных препаратов: феногиазшш в качестве нейролептиков,

в качестве сосудорасширяющего агента, вянбластин и зин-кристин - при химиотерапии опухолей и др. Не исключено, что П%„5 изменяя чувствительность кальмодулина к этим препаратам могут найти применение при создании менее токсичных лекарствен-. ных препаратов. С этой целью предполагается проведение фармакологических исследований с применением специфических тестов. Впервые обнаружено, что ®j_g и соответствующие им по структуре синтетические пептиды являются эффективными ингибиторами активности кальцинейриня (как в присутствии, так и: в отсутствие ионов .Таким образом,•получено еще одно доказательство о регулирующем воздействии яа активность Са^+, кальмодулин-

зависимой системы, что позволяет высказать предположение о как о возможных уииверсальшх аялостерическях регуляторах актив-кости Са2+, кальмодуликзавиоимых ферментов. С этой точки зрения полученные данные имеют фундаментальное значение, поскольку расширяют наши представления' о путях регуляции активности Са*^", кальмедулинзазисимнх систем. Публикации и апробация.

. Основное содержание работа изложено в 4-х печатных работах. Материалы диссертации докладывались на международной школе по фосфопротеинфосфатаэам (Бельгия, X99I г., Лувьенский католический университет) на заседании ученого совета Института биохимия АН Армении.

Объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: .введения, обзора литературы, описания методой исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов. Работа изложена на, f 6 страницах машинописного текста, эюпочвд ¡S рисунков и 2 таблицы. Список цитированной литэратурн содерякт 96 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАЛИ*'

ЛФ|_Г) г.эделялл из ггчоталамуса быка по методу Галояна А-А» к соавт. (1988) В?М пептидов в обращенной фазе проводили: I) на колонке h/ch"wiux6 !ZP~f (Г,6 х 25 см, диаметр частиц

? мкм, „Кп.СШ.е.Ч > ФРГ), с использованием ступенчатого градивн-

тп птгг,тл1„т,чггт г, П гг.-,,", П11 ЛППЧ <• .».ппп ггисст ттотгаошю _

ФРГ), используя градиент концентрации ацетонитрила от 5 до 60% в 0,1#-ной СГоСООН <зреш изменения градиента -1ч), скорость алюцки - I мл/мин. Пептида детектировали при 220 мл.

Гидролиз кальмодулина был проведен трипсином в присутствии 0,1 М Сй012 по методуи соавт. (1977). Фрагменты кальмодулина. (1-77 к 78-148) били выделены из гидролизата в гомогенном виде по методу Cfu.i4.lni и соавт. (1984) с использованием ВЭЖ в обращенной фазе п колошее ЬккхОбОХё (?Р~// (0,4 х 25 см, диаметр частиц 5 мкм, „Всо Зер(ХнО,Иоп. Тк^гИО-¿00 Ш) Венгрия). Элщию проводили 10 (Л'ИЧ)К с использованием линейного градиента ацетонитрила от 10 до 40$. Скорость элюции - I мл/мин. Время изменения градиента - 20 мин. Поглощение измеряли при 214 им. Фрагменты кальмодулина были лиофилизо-ваны и хранились при -20°.

Длл определения образования иммунокомплекса кальмодулин-ан-титело использовали метод непрямого ферыек ^зависимого иммуносор-бентного анализа по методу \/схп Ь(с1ск. и соавт.

(1934) с некоторыми модификациями. Кальшдулин (в концентрации 2,5 мкг/ыл) был иммобилизован на платах при 4° в течение 18 ч. Антитела вносили в лунки плат в концентрации 7,5 мкг/мл и платы инкубпропали 2 ч при комнатной температуре. В экспериментах по определению кооперативного воздействия Щ> (в концентрации, равной Г^д) и антагонистов кальмодулина (использовались различные концентрации антагонистов кальмодулина от 0,8 мкМ до 500 мкМ) на процесс образования иммунокомплекса кальмодулин-антите-ло, исследуемые соединения вносили в лунки плат в разведении вместе о антителами. конъюгированкыЯ в перокедца-

зой хрена вносили в лунки плат в разведении 1:1000 и гагаты инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Через 60 шш после добавления субстрата (Н202 и О-фениендиашш), содержимое лунок фиксировали добавлением 2 н. Й^Оц и измеряли поглощение при 492 нм.

Долучетш ГГрвНЗ-ТЗсУТЯ у^О. калъмодулинзависимой фосфопро-

теинфосфатазы (кальцинвйрина) из головного мозга бш<а.

Длл получения гомогенного препарата гальцинейряна исполь-

зовали методы SJtWtmCL ¡Z и соавт. (1979) и JatlanA В. J. и соавт. (1983) с некоторыми модификациями. 400 г головного мозга гомогенизировали в 2,5 объемах 0,1 M Трис-HCI буфере, рН 7,0, содержащего 2 мМ ЭДТА и I мМ PM.SP. .Гомогенат центрифугировали при 10000 х g в течение 20 мин. Супергигант подвергали осаждению сульфатом аммония (30-55$). После центрифугирования при 10000*^ в течение 30.мин, полученный осадок растворяли в минимальном количестве буфера А (20 мМ Tpzc-HCI буфер, рН 7,0, содержащий I мМ жидазола, I мМ и 10 мМ 2-мер-

каптоэтанола), содержащего 0,01 мМ CaCI^. Полученный препарат даализовали против буфера А, после чего центрифугировали при 100000 х Ç в течение I ч. Супернатант, объемом 100 мл (9 кг/ мл) наносили на колонку с ДЕАЕ-ТО^оре<Х/ь£. 650 M (3 х 30 см), уравновешенную буфером А, содержащим 0,01 мМ СаС12 и 0.05 M /Va Ci. Элюцию проводили буфером А с линейным градиентом концентрации /Va Cl от 0,05 до 0,45 М. Скорость злвдш 85 шт/ч. Фракции, содержащие фосфагазнув активность объединяли и диастзова-ли против буфера А. Огдиализованньй'препарат, объемом 200 мл (0,7 мг/мл) наносили на вторую колонку с ЩШ-Щорса/ct 650 M (2,5 х 20 см), уравновешенную буфером А, содержащем 0,05 Ш MlCi. Злюцшо проводили тем же буфером с линейным градиентом концентрации A/CtCi от 0,05 до 0,4 М. Фракции, содержащие фос-фатазную активность, объединяли, дкализовали против буфера к а кош*ентрирозали'ультрафильтрацией, используя мембрану iJ/nîcûK Ш-10, до 4 мл. Сконцентрированный препарат наносили на колонку с сефакрилом S -200 (2 х 50 см), уравновешенную буфером А. Элюцию проводили тем же буфером со скоростью 15 мл/ч. Фракции, содержание активность калыденейрина объединяли и подвергали аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозэ 4Б. Для этого 12 мл препарата фермента (2 мг/мл), содержащую 1,2 мМ CaGIg инкубировали при.4° в течение 2 ч при постоянном перемешивании о 5 мл кальмодулин-сефарозы 4В. Затем суспензии переносили в колонку (2 х 10 см) и промывали 30-го мл 25 мМ Трис-HCI буфера,• рН 7,0, содержащего 0,1 мМ СаС12, 2 мМ UÛfCt, 0,2 мМ ДГТ, 50 мМ À/'Ctôt. Элюцию проводили тем же буфером, в котором Са2+ бил заменен 2 мМ ЗГТА. Скорость элгация 60 мл/ч. Чистоту полученного препарата кашргаейршга [проверяли электрофорезом в ИААГ в присутствии 0,1,^-ного ДЦС- и I мМ ЭГГА по методу ùaonmtu 1970). •'■'.'

Актив юсть кальщщеНрина <">1гределяли используя чувсшпаль-ный флюоримегричеокиК мотод J?nthouy и сооег. (1986).В качества субстрата был использован 4-«/<етилукбеллкфер1ш$оофат (4-МУФ). Измерение акт.лвности фермента проводили в пробе, объемом I мл, оодэркацей 50 мМ Тршз-HCI буфер, oll 7,5, БОА (I т/т), 0,5 мИ да, Ï мМ ÀAqCiji > 0,3 м.И CuCI,, о60 мМ кальмодулина, 1ькМ 4-МУО, и необходимое колл»ество форманта (12,5-25 -гМ>. Прсби инкубировали I ч rrpi. 32°С. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 30$-ной трихлорукзусног: кислоты. После центрифугирования при 5000 х" ^ } рН прос: доводили до 8,0 добавление;,: 0,5 мл I M Трис-а. Количество образовавшегося 4-шгилумбаллиферона (4-МУ) определили фтоориметрачески на спектрофлюоршотре фирмы, PcnLcn - tim&C ЛЛрр-Ц^^^ США, Флюоресценцию измерит при 445 им (возбуждение при 365 шл). В качестве контроля служили (субстрат а фермент, инкубированные раздельно. За единицу активности фермента лршшмалл такое его количество, которое вызывало в течение I ч при 32°С образоваьше -ИЛУ соответствующее по флюоресценции 0,1 нМ 4-МУ.

Количество белка опрадолял» по цъиатц„¿ОИАХУ и ооавт. (1951), Константы иягибировангя (Kj) для кальцинелрина относительно и Cllj^.j были определены по методу Диксона. Использовались две ко.щеитрации 4-МУФ (0,7 мкМ и 1,4 мкМ) и следующие концентрации пептидов: I нг; 2,5 нг; 5 нг; 16 нг; 15 нг. Инкубационная смесь объемом I ыл содержала 12,5 нМ кальцинэйрина. Фермент и исследуемый паптщ'. цреинкубировали 10 мин ггои комнатной температуре в присутствии и кальмодулина, затем добавляли субстрат у. инкубировали I ч при 32°С.

РЕЗУЛЬТАТ!! ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. О связывании с М- и С-концевлми доменами

кальмодулина

С помощью метода ZHcxÂikowilcc и соавт. (1977) бил проведен ограниченный гидоолиз кальмодулина трипсином в присутствии 0,1 M CaCIp, приведший к образованию двух больших фрагментов (1-77 и 78-148), которые чатем били виделеиа в гомогенном ссстояпли с помощью БЭВС в обращенной фазе. Как видно из ¡.ао.1, после 80 мпь ограниченного гидролиза трипсином каяьмоду-лин полностью раопадаотся на 2 фрагмента. Врлля удерживания

о.гг 0. to

C.Cd о. at

- Д—

to га

Рио.1. Очистка и С-концевых фрагментов кальмодулина о-помощью ВЭЖХ в обращенной фазе на колонке С1сЬч.аоч€ 5 PP-I8 (0,4 х 25 см), с использованием градиента концентрации ацотоигтрила Г0-40>, еэгертацего 10 мМ

СОз > скорость элюции Г мл/мин. Воемя изменения градиента - 20 мич. А, 3, С - ЗЭШ трипоинового гядро-лизага кальмодулина через 0,30 и 6С мин гидролиза соответственно. Пики били идентифицировали как кальмодулин (3), его Af- (2) и С-концевоЛ (I) фрагменты.

С-концевого фрагмента в системе градиента ацетоиитрила 15, Г5 мир., А/-кскцсиого фрагмента - 17,4 мин, а вроггя удерживания кальмодулина - 17,8 мая. 4/- и С-ксщазые фрагмента кальмодулина били лиофштазованы и rot гомогенность била проверена электрофорезом в ПААГ.(12,5%) в присутствии 8 М мочевины:

Била поставлена задача выяснить: связываютоя ли IHj_g с и С-колиевыми фрагментами кальмодулина. Дгси этой цели било решено использовать метод непрямого ЕЫЗЛ} с помощью которого ранее мн установили факт связывания с интактной молекулой кальмодулина, Было изучено воздеи.ствие ШЧ_5 на процесс езяпгоалня антител с иммобилизованным па платах в одном случае инттегннм калшодулшюм, а в другом - аго С-концезшл фрагментом. Kmc в'.дно из рис.2, когда на платах был иммобилизован кашлоду-лин, то под воздействием ПФ происходит значительное (болеэ ■I ¡V на 90f,) ингибированиа образования игам;*нокомплбкса. Когда же

зо го го

ПФр нМ

Рис.2. Влияние пептидного фактора ПФт на образование иммуно-комплекса. Кпльмодулин был импобилизован на платах в концентрации 2,5 мкг/ш (-о-), его С- (-.л-) и /^-концевой (-е-) фрагменты были иммобилизованы в концентрации 3,6 мкг/мл.. Антитела вносили в лунки плат в концентрации 7,5 мкг/ш.

на платах иммобилизован С-концевой тринтический фрагмент кальмо-дуллпа, то наблюдается ингибирование образования иммунокомплек-са лишь ыа ЗС$.

Лолученные данные свидетельствовали о необходимости наличия нативяой структуры кальмодулина для его эффективного связывания с Ш>. Ь то же врет эти дашшэ косвенно указывали на то, что Ж1-концевой домен калшодулина также принимает участие в связывании ЛФ. На рис.2 приведены данные относительно ПФ^. Тот ке эффект был получен при использовании других ПФ. Б случае, когда на платах бшг иммобилизован концевой фрагмзнт каль-модулина, из-за отсутстзия в его структуре антигенного участка, образование иммунокомгашкса не регистрировалось. Поэтому для выяснения вопроса связываются ли с // -концевым доменом были

щпведени следуйте эксперименты» В ин. убационнуя смесь вместе с антител алл вносили л'-концевой триптичвскчй фрагмент лальмо-дулина (были иснользованн 2 постоянные концентрации -концево-. го фрагмента - 0,05 шМ н 3,2 мкМ) и ПФ (в диапазоне концоттра-циЛ от 1,6 иМ до 0,8 мкМ). Как видно уз рис.3 добавление в инкубационную смесь Ж-концевого фрагмента в концентрации 0,05 мкМ приводило к снижение ингибиторного эффекта ПВ на прсцесо образования юялунокомплакса на 30£» Добаьлонив ке н инкубационную смесь концевого фрагмента в яонцектрзцли 3,? мкМ приводило к снижению ингибиторного эффекта ПФ на 7П%. Как видно из того же рисунка, в случае когда инкубационная смось нэ содержала /(/-концевого фрагмента, то под воздействием ПФ происходило ингибирова-ние образования иммунокомшхекса до 90?,

В других экспериментах :» инкубационную смесь вместе с антителами добавляли различные концентрации /V-концевого фрагмента при лостоянной концентрации ПФ (50 нИ). Эта концентрация ПФ в значительной степени (до 60^) подазляла образование иммуноко(>д1лек-са кальмодулин-антитело.

Как видно из рис.4, с повышением концентрации Л'-кокцевого фрагмента ттроисходмо снижение ингибиторного эффекта ПФ на процесс образования имцунокомшгекса. Полученные данные однозначно указывали на связывание ПФ с /С-хонцвзнм фрагментом кальмодули-на, что приводило к образованно комплекса //-концевой (фрагмент - . ПФ и резкому уменьшению концентрации несвязанных ПФ в инкубаци-ошюй смеси. Это, в свою очередь, в значительно!* степени уменьшало возможность образования комплекса кальмоду;лш- -ПО и приводило к тому, что иммобилизований на штатах кальмодулин становился более доступным дл.г антимел.

С поммгыо нелинейного регрессионного анализа данных; полученных методом непрямого £ЦЗ Я били определены величины /С^ для комплексов, образуемте ПФ с яальмодулином и его А/- и С-¿онцевнми фрагментами (//ус^Ч-еп о£ ,

Согласно полученным данным, величины К<£ дая комплексов калъмодулии-ПФ, /Г/-копцевой фрагмент кальмодулина-П<Р и С-конце-в)П фрагмент калшодулкка-ПФ били рашш 2-10 нМ; 15-100 нМ; 300-1000 нМ соответственно. Как видно обладают наибольшим ородолюм к штакткой молекуле кальмодаияа, что позволяет высказать предположение о оуцествованш внутримолекулярного вваимо-дчйг.тиия мочзду Л'- и О-концевнми доменам» кальмодулина при его'

т

60

го

>6

26 (О* 4(3 ЛФ, НМ

Рис.3. Влияние пептидных факторои ПФТ и ПФР на образование • иыыуноко-илетсса кальмодулин-антителб в отсутствие и в присутствия в инкубационной смеси -концевого фрагмента (л/ф) кальмодулина. I - ПФр* 2 - 115^; 3 - ПФ^ +

0,05 ыкМ 'л/Ф\ 4 - ПФ2 + 0,05 мкМ /№>) 5 - ПФХ + 3,2

мкМ Л/*Р; б

ш>2 +

3,2 ынМЛФ.

пттоипаитт л ГТТ>

1-5*

► Таким образом, на основании полученных динных молио заключить, что 1К>2_5 связываются как о , так и о С-концевыш доменами кальмодулина, что типично для таких извеотных антагонистов кальмодулина как ТВД и меллятии. Недавно установленная нами первичная структура доя 3-х из дала доотаточно оснований вноказать мнение о том, что эти пептида связываются о кальмодулнном преимущественно через гидрофобные взаимодействия, что также типично для многих антагонистов кальмодулина. Полученные результаты представляют для нас особую ценность, так как они дали возможность объяснить обнаруженный нами дозозависимый эффект Ш>2_! на активность К1ВД в концентрации Ю"9-10~^ вызывают Са -независимую активацию КЛЦМ» а при концентрации 1Т® Ы и вцше этот эффект но наблодается). Мы думаем, что можно следующим стразом ©с&яонцть это явдепяе; поскольку облада-

гоо

во

60

<0

ёО

о,он ff.es о, г

з.г

■ ж-контдевой фрагмент, мкМ

Рис.4. Влияние различных концентраций /^-концевого фрагмента » кальмодулина в присутствии постоянных концентраций пептидных факторов и ПФ^» I - (50 нМ); 2 - ГИ>2

ют более высоким сродством к/С-концевому фрагменту кальмодули-на, то, по-видимому, при концентрации М ПФ^ связыва-

ются с //-концевым доменом кальмодулина и вызывают такие конфор- . мационино изменения в молекуле кальшдулина, которые приводят к активации КЩ1. При концентрации 10~® М и выше ПФ^д, по-ввдимо-му, связываются как с М—, так и с С-коицевыми доменами кальмодулина и вызывают другие конфэрмационные изменения кальмодулина, при которых он уже не способен активировать фермент.

Вгаеиз-'-оженнов позволяет нам еще раз высказать мнение о существовании внутримолекулярного взаимодёЯгтвия медду /V— и 0-концештн демонами кальмодулина при его связывании о ПО^, ко-горно, вероятно, можно причислить к аллостеричеоким регуляторам кальмодулина.

2. Изменение чувствительности кальмодулина к его антагонистам под влиянием ПФ^д

Исслодовшим, проведеннь-а с г.омоодью метода выявили,

чте антпгонзети- кальмодулина трифторперазин (ТФП), хлорпромазин,

\Х/-7, винбл.гстик, винкристин, в зависимости от своей концентрации могут оказывать двоякое воздействие на процесс образовали иммунокомплекса кальмодудан-антитело. Как можно заметить из рис.5, при низ.шс концентрации эти соединения стимулируют, п при высоких концентрациях подавяшт процесс образования ищуно-коыплекса кальмодулин-антитеяо.

Овади и др. ;1989, 1911) на примере из}ч^гйя воздействия ТИ1 на вроцеос образования ишукокомпявкса калькодуяин-актитело высказааи предположение, что при высоких концентрациях ТФП связывается с С-концемым домеком кальмодулина (где расположен антигенный участок кальмодул;ш£ - последовательность аминокислот 137-143), вызывая такие конформационнне изменения в его молекуле с которые приводят к потере средства кальмодулина к его антителам, а при нгзких концентрациях ТФП, ш-в»д!шому, связываются о А/-концевым я.ог'еном, вызывая иные конформационные изменения в молекуле к.зльмодулшед (вероятное бсьго'р С-концевом домене), которые привода к повышению средства кальмодулина к антителам. Высказанное предположение указывает яакке ка суще;твова<ше внутри,юлекулярного взагаюд&1сиш «езду /V- и С-кэнцевыми доменами кальмодуз-лна при его снизывании с ТФП. Нами бшш проведены экспердменты, подтверядаицие выскачаннук гшкпозу.

На платах вмес.'о интактного кальмодулина был иммобилизован его С-концевой фрагмент (78-148). В этом случае все исследуемые соединения теряли споообность стимулировать образование иммуно-комплекса (риз.6).

' Полученчые данные свидетельствовали о том, что стимулирование образования иммунокомшгекоа сбусловлоно связыванием антап-нтотов кальыо,1улина с егэ/^-гонцевым фрагментом.

Бшго исследовано кооперативное воздействие 1лтагонистов кальмодулина и на процесс образования глыунокомплекса

кальмодулин-антигело. В проведенных экслеримантах были использованы постоянные концентрации П$>£_5 , равные , и различные концентрация антагонлетоп калылоцулииа от 0,8 до 500 мкМ. ¡Сак видно 1гз рис,7, ПФ в сочетании с различными антагонистами кальмодулина оказывает один и тот >;е Еффскг на процесс образования иммунокомллекса. Во-первых, происходят- исчезновение стимулирующего эффект антагонистов кальмодулина на процесс образования юмукокомплекся. Во-вторых, наблюделтея снижение кигибиторного эффекта характерного для высоктх конц ш-грациС антагонистов кап,-

Рло.5, Вяиякие антагонистов кальмодулина (КМ) на образование иммунэкомплекса КМ-антитело. ЮЛ бш иммобилизован на штатах в концентрации 2,5 тг/т. Антитела вносили в лупки плат в концентрации 7,5 мкг/мл. I - трифторпера-зли; 2 - хлотюмазт:; 3 - \)у-7; 4 - вшгблпотин; 5 -ьинкрастин. По оси абсцисс - концентрация чнтагонистсв КМ в мкМ. По оси ординат - % обргзованил имглунокомплеь -са кальмодулия-адтиголо.

модулгаа, на процесс образования имыунокомллокоа (для хлорпрома • зина - на 42%, для ТФП - на 32%, для "$/-4, винблаотшга у. вшг-крисчша - на 15-20$). Антагонисты кальмодулина, в овок. очередь такие изменяют чувствительность кальмодулина к ПФ-^; происходит снижение ингиблторного эффекта на процесс образования ¡г,гну ■

кокомплокса на 45% и более.

Исходя из получению- даннпх и имеющейсл в литературе информации, ми выдвинули следующую гипо.тезу, обья;няющую кооперативный эффект ПФ^р и антагонистов кальмодулина на процесс образования иммунокомплекоа. ПФ^^, обладая высоким сродством к Л'-ко»,

1.9 гь 51,2 сГ-1 500

Рве. 6. Влкяняе аагГи'онкоюв кальмодулина на образованно юлцуно-комхшекса С-концевоЙ фрагмент кальмоду-шщ-анигело. 3-концевой фрагмент кальмодулина (последовательность аминокислот 78-148) был иммобилизован на платах в концентрации 3,6 мкг/шг. Антитела вносили в лунки плат в концентрации 7,5 мкг/мл. I - трифгорпер&зин; 2 - хлор-промазин; 3 -0^-7; 4 - винбластлн; 5 - винкристин . По оси абсцисс - концентрация антагонистов кальмодулина в мкМ. По оси ординат - % образования иммуиокомилекса.

цевому домаау кальмодулина (величина дая комплекса ^-концевой фрагмент кальмодулина-ПФ меньше, величина К<Ц дая комплекса кальмодулия-ангагонист кальмодулина), в первую очеродь связываются с ним, вызнвая такие конформсционкыэ изменении,- которое препятствуют связыванию антегонистов кальмодулина с /У-конце-вш! доменом, Поэтов мы не набледаем активирующего эффок га анта-голиотов кальмодулина па п£юг,есс образования иммунокомячекса,

1,9 7,& ¿a as sao

ñic,7. Кооперативное воздействие антагонистов кальмодулина и коронаросуждвающего пептидного фактора (ПФЧ) в концентрации, равной 1сП (15,8 нм) на образование иммунокомк-лекса кальмо.цулип-цнтитело. Кальмодулин бил иммобшшзо-ван на платах и концентрации.2,5 мкг/мд. Антитела вно-с.иш в лунки плат в концентрации 7,5 mv/wi.

I - Ид + трифторпоразин; 2 - IMg + хлорпромазин; 3 - ПФ3 + W-7; 4 - ПФд + винбластин; 5 - ПФд + винкрио -тин. По оси абсцисо - концентрация антагонистов кальмодулина в мк.М, По оси ординат - % образования иммунокош-лекса,

который, как было показано выше, бил обусловлен связыванием антагонистов кальмодулина о его 4/-концевым доменом. Связывание же с С-концевым доменом кальмодулина происходит почти од-

новременно или последовательно с антагонистами кальмодулина. Об этом говорят близкие величины Кс{ для комплекса С-коицевой фраг мент кальмодулина-® и квльмо.цулил-шпчггонлст начьмодуллна. В р« зультате образуется комплекс кальмодулин-ГСР-антагшшст кальмоду-

л ян а с присущей ему определенной конформаг ,иой и в талом модифицированном состоянии мош.ула кальмодулина изменяет свою чувствительность как к ПО^, так и к его антагонистам.

3, Исследование воздействия.нативяшс и синтетических коронаросуживавдих пептидных факторов на активность кальцинейрина

В 1990 г. была установлена первпиак структура 3-х из llij_5 (Бархударян, Лотшпайх, Галоян). Они оказались фрагментами 33-37, 33-3(? и 32-38 . -цепи гемоглобина. Было высказано предположение что л остальные 2 пептвда с невьявленно!. первичной структурой являются фрагментами р -цепи гемоглобина» Методом твердофазного синтеза были получены синтетические пептиды Crij/Z,WVPWTQRF) и ^(LWyPWTQ), щредставляодие фрагменты 32-41 и 32-39 yg-цепи гемоглобина и изучено их воздействие, а также воздействие 2-х других синтетических пептидов - СПд (LWyPWT) к CIT^(WyPWT), соответотвущигс по структуре ПФд и П1>2 соответственно, на тест-системы, специфичные для Гс лученные результаты указывали на идентичность свойств натив-ннх и синтетических пептидов (Бархударян, Галоян и соавт.,1991). В данной работа было исследовано воздействие нативных и

синтетических ((П|_4) пептидов в концентрации 10 нМ на активность ¿сальцияейрина. Как вгдно из рис.8 и рис.9 как нативные, так и синтетические пет ада вызывали значительное ингибироваше активности кальц! найринп. Нативные пептиды ингибяровали активность фермента на 87, 94 , 99 , 98 и 85$ для IK>j, Ш>2, ГЫ3, IE&j и lilg ооответственно. Синтетические пептвды CIIj, СП2, СПд и СП4 и гагибировали активность фермента на 76, 87, 94, 77% соответственно (данные отиссктбль'ю ингибирующего воздействия H5j_5 и СП|-_4 приведем з вычетов базальноЧ активности фермента, определенной в отсутствие Са^' л кальшдулша в инкубационной среде).

Были определены величины Kj- для капьцинэЛрина относительна ^Х-5 и ^1-4' 0казато^ь» что .^1-5 и й:/еют йаизкио пол;;-

чнн.,' Kj . Величина Kj для находится в дпнпачоне от 1,9 z

Ilf9 М до 2,3 х ГО"9 И; дая СП^' величина Kj находится в д?та-пвроне эт 2,5 х 10"Я И до 3,Т к Ю"3

Учитывай ряяво обнаруженную нами способность IT'j.^ рчэы-

а5

03

02

СН

¿1

1 2 б 15 6 7 6 ,9 10 Ц 12 13 14 15 1Б (? ГЦ

Рис.8. Влияние коронаросуживащик пептидных факторов ПФ^, выделенных из гипоталамуса крупного рогатого скота на активность кальцинейрина. Пептиды использовались в концентрации 10 нМ, I - контроль (Кд), содержащий 0,3 мМ СаС12, 350 нМ кальмодулина (ИЛ), 12,5 нМ кальцинейрина; 2 - К]г + ПФ1; 3 - % + ПФ2; 4 - Кд- + ПФ3; 5 - К^ + ПФ4; 6 - Кд- + ПФ5; 7 - контроль 2 (1^), содержащий I мМ ЭГТА 1 + 360 нМ КМ + 12,5 нМ кальцинейрина; 8 - К2 + ПФ1; 9 -; К2 + ПФ2; 10 - К2 + ПФ3; II - К, + ПФ4; 12 - К, + ®5; ГЗ - Контроль 3 (Кд), содержащий 1' мМ ЭГТА + 12,5 нМ кальцинейрина; 14 - Кд + ПФр 15 - Кд + ПФ2; 16 - Кд + ПФ3; 17 - Кд + ПФ4; 18 - Кд + Ш>5.

ват.ь С а2+-н е з ав ис гало е активирование КЩЛ и кальмодулинзависимой ФДЭ цАГ® путем Са ^-независимого связывания с молекулой кальмодулина, было исследовано влияние как ®т 5, так и СП|_4 на активность кальцинейрина в отсутствие Са . Инкубационная среда содержала при этом кальмодулин и I мМ ЭГТА. Как видно из рисунков 8 и 9, ПФр ПФ2, ПФд, ПФ4, ПФд ингибируют активность фермента (которая в данном случае равна базальной активности каль-

(М

05

02

п

-ь

гЬ Н-1 тЬ г4-|

+1

1 2 3 4 5 б ? 8 3 10 V 12 Ю М 15

Рис.9. Елчнние синтетических пептидов (СП^) на активность кальцинейрина. Пелтиды использовались в концентрации 10 нМ. I - контроль I (К{), содержащий 0,3 м'Л СаС12 360 нМ КМ, 12,5 н'Л кяльциноДрина; 2

Кт + СПр

+ СП4; о - контроль г

Кг + СП.,; 4 - + 0П3; 5 - -г, содержащий I мМ ЭГТЛ ■»• 360 нМ КМ f 12,5 нМ кальци-

(К2>

нейрина; 7 - К2 + СПр* 8 - ^ + СП2; 9 - К^ + СП3; 10 - К^ + СП4; II - контроль 3 (К3), содержащий I мМ ЭГТА + 12,5 яМ кальцинейрина; 12 - Кд + СП25 13 - Кд + К3 + СП3; 15 - Кд + СДд.

2+

СП2; 14

цинейрина, определенной в отсутствие Сай+ и кальмодулина) , в отсутствие Са2+, но в присутствии кальмодулина (360 нМ) на 54, 24, 59, 33 и соответственно; синтетические пептиды также вызывали Са^-независимое ингибироваяле активности кальциней-ркяа в присутствия кальмодулина на 35, 48 , 37, 19$ для СПр СП2 СП3 и СП4 соответственно, Полу?.<энныо результаты позволили внска-згтг. предположение, что ПФ1_5 и СЯ^^, являясь, по-видглому, аллостеричеокимк.регулятора» ш кальмодулина, связывавтся с ним

I

- 21 -

и образуют комплэко к.эльмодулш-пеш'ид, который, в свою очередь, связываясь с каталитической субъединицей кальцинейрина, соде]шащей кальмодулшовязывающий домен, Еызыпакт определенные конфорыационяые изменения в молекула кальцинеИрина, впдугциэ к ингибгровашю его активности. Обнаруженный Hat.ni факт ичгибиро-вашш актдшооти кальцин эГ.рина под влиянием вышеуказанных пептидных факторов как в присутствии Са"+ и кальмодулина, так и л отсутствие но в прис/тствпи кальмодулина корродирует с

данными, ранее полученнигли нами с использованием метода £L/Svi о том, что связываются с кальмо.аулином кап в присутствии,

так и в отоугстя ¡е КальцинеЯрил оказался хороней модатьо

для демонстрации этой особенности

Как было сказано вше, учитывая, vro регуляторная субъединица кальцинейрина иглист высокую стелпнь гомологии (35J?) с каль-модулином, мы не исключали тшежэ лрзлого воздействия ПФ^ на фермент, путем связывания с регуляг:орной субъединицей, поскольку обладают высоким сродством к кальмодулину (К = 2-10 нМ). Поэтому мы исследовали воздействие ПФ^ g и СП-£_4 ы. активность фермента как в отсутствие так и в отсутствие кальмодулина в инкубацюнной среде. В этом случае ш также наблюдали ингибировэние активности фермента (рис.8 (14—18), рис.9 (12-15) , однако оно било выражено значительно слабее, чем в случав, когда инкубационная среда оодэркала кальмодулин. Натиь-ныв коронарссуживагацие пептиды инглбировали активность фермента на 8, 18, 25, II, 18$ для ПТр Mg» ®3, ПФ4 и ПФд соответствен но. Синтетические ыэптиды шгибировали активность калыщнейринь в этом случае на 7, 13, 20, I0J? для СП-j-, СП2, СП- и СП4 сослшт ■ ствонно. На осчовашш полученных результатов можно было предположить, что прямое воздействие и СПj_4, очевидно имеет место и, по-видимому, все же через связывание с пегуллторной субъедиш.цей.

Было изучено кооперативное воздействие коронаросужиптацих пептидов и Т*>П на активность кальцинейрина. В экоперчмонтнх были использованы П">3 и СП3, которые ъ' концентрации 10 нМ ингиои-рова/ii! активность кальцинейрина д:> уровня, базалт.ной. Б свою очередь, ТФП, п концентр, ищи 50 мкМ, также «пггибнровпл активность кальцинейрина до уровня ет'О базачьноП активности. Порученные результаты (таблица) показывали, что при коопераjiidhom воздействии ПФ3 и ТЩ, а также Cllg v ТФТ1 на активность кал ци-

Рис.10. Определение величины К^ дал кальцинейрина относительно коронаросуживамцего пептидного фактора ПФ^» V -относительна? фянхгресцепцня при 445 кх»;; П$3 -нг ПФд в пробе. 12,5 нМ кальцинейрина инкубировали с набором концентраций ПФд (1-15 нг) в течение 10 мин при комнатной температуре, затем добавляли 0,7 мкМ или 1,4 мкМ 4-ШФ- а и инкубировали I ч при 32.

нейрина.происходило уменьшение иягибиторного эффекта вызываемого каждым из этих соединений в отдельности. По-видимому, в данном случае, в результате образования комплекса кальмодулин-пел-тад-ТФП происходят определенные изменения в конформации кальмо-дулина, отличные от тех, которые происходят при его связывании с пептидом или с ТФП. Комплекс кальмодулин-пептид-ТФП, в свою очередь , связываясь с каталитической субъединицей кальцинейрина соответствующим образом изменяет и активность фермента.

Как известно, многие антагонисты кальмодулина применяются

Таблица

Кооперативное воздействие коронаросуживающюс пептидных факторов (ПФ3 и СЛ3) и трифторперазина (ГФП) на активность кальцинейрина

Соединения Относительная активность, %

Калшодулин ЭГТА 19

Са + кальмодулин 100

Са*+ + кальмодулин + ПФ3 21

Са^+ + калшодулин + СП3 23

Са^+ + кальмодулин + ТФП 20

Са2+ + калшодулин + ПФ3 + ТФП 41

Са^+ + кальмодулин ^ СП3 +• ТФП 44

Исследуемые соединения применялись в следующей концентрации: кальмодулин - 350 нМ; СаС^ - 0,3 мМ; ЭГТА - I мМ; кальцинейрш - 12,5 нМ; Ш>3 - ГО нМ; СП3 - 10 нМ; ТФП -50 мкМ,

ТФП к пептид преинкубировали ГО мин при комнатной температуре вместе с кальцинейрином, затем добавляли субстрат (I мкМ 4-МУФ) и инкубировали I ч при 32°.

в качестве лекарственных препаратов: фенотиазины (ТФП и хлор-промазин) как нейролептики, алкалоиды винбластин и винкристин при химиотерапии опухолей. Эти препараты токсичны и оказывают побочные отрицательные эффекты на организм человека. Поэтому обнаруженный наш факт изменения чувствительности кальмодулина к его антагонистам возможно может иметь и практическое значение при создании менее токсичных препаратов. Таким образом, ПФ-^ связываясь с ДА и С-концевыми доменами кальмодулина и являясь, по-видимому, аллостеричесюши регуляторами кальмодулина, оказывают регулаторное воздействие на активность Са^+, кальмо-дулинэависимых систем.

вывода

I. Впервые показано, что ПФ^д связываются как о /]/— , так и с С-концевыми доменами кальмодулина, обладал более высо-

- 24 -

ким сродством к /{/-концевому домену.

2. Определены величины для комплексов кальмодулин-ПФ, /1/-кощ8Вой фрагмент кальмодулина-ЯФ и С-концевой фрагмент кальмодулина-ПФ, которые равны 2-10 нМ; 15-100 нМ и 300-1000 нМ соответственно.

3. Впервые обнаружено, что ПФ^ изменяют чувствительность кальмодулина к его антагонистам.

4. Впервые установлено, что ПФ^д являются эффективными ингибиторами активности кальмодулинзависимой фосфопротеин-фосфатазы - кальцинейрина.

5. Определение величины Kj для кальцинейрина относительно нативных и соответствующих им по структуре синтетических (CH-j-_4> коронаросуживающих пептидов показало, что эти величины близки и находятся для в диапазоне от 1,9 х Ю-9 М до 2,8 х КГ9 м, а для СП£_4 - в диапазоне от 2,5 х Ю-9 М до 3,1 х Ю~9

СПИСОК ОПУЫЩКОВАШЖ РАБОТ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Закарян Г.Р., Щувалова Л.А., Шарова H.H., Чаилян С.Г., Бар-сегян К.С., Бархударян H.A., Галоян А.,А. Са2+ - независимое воздействие коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса на активность Ca' , кальмодулинзависимых ферментов. Тезисы молодежной конференции, ^еван» 1990, с.63.

2. BaTkhuüiiryaBi'N.A.. Bnrsegimi K.S. und Gßlaym A.A. The pffpnt of hypothalamic coronarooonstrictory peptide fictore on calmodulin-dependent protein phosphatune activity. Advances

in Protein Thosphatases.6,Supplement.Leuven,Belgium, 199t,p.42.

3. Еархударлд H.A., Орос Ф., Лютом К., Барсегян К.С., Овади Ю., Галоян A.A. Новые данные о связывании коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса с кальыодулином. "Нейрохи-мия\ т.ГО, № 3-4, с.159-169, 1991.

4. Барсегян К.С., Бархударян H.A.» Галоян A.A. Исследование воздействия нативных и синтетических коронаросуживающих пептидных факторов на активность кальцинейрина. "Нейрохимия", т.II, й 2. 1992.

5. Бархударян H.A., Барсегян К.С., Аветисян H.A., Закарян Т.Р., Галоян A.A. Изменение чувствительности кальмодулина к его антагонистам под влиянием коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса. "Нейрохимия". т.И, !'■ 2, 1992.