Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+-независимая регуляция активности киназы легких цепей миозина скелетной и гладкой мускулатуры коронаросуживающими пептидными факторами гипоталамуса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са2+-независимая регуляция активности киназы легких цепей миозина скелетной и гладкой мускулатуры коронаросуживающими пептидными факторами гипоталамуса"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х.ЕУНЯТЯНА

На правах рукописи

ЗЛКАЕЯН ТАНЯ РАФИКОВНА

УДК 577.112:547.963

Са2+-НЕЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА СКЕЛЕТНОЙ И ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЫ КОРО-НАРОСУШАЮПЩИ ПЕГШЩШИ ФАКТОРАМИ ГИПОТАЛАМУСА

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1201

Работа выполнена в Институте биохимии АН Армении (директор - академик All Армении, профессор А.Л.Галоян).

Научные руководители: академик АН Армении

А.Л.Галоян

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Н.Л.Бархударян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Г.К.Парсаданян

доктор биологических наук Р. Г. Кашлял

Р.едущее учреждение - Ереванский государственный медицинский институт.

Защита состоится QCiCO^hxA vßjy. в (Я' — ч.

на заседании специализированного совета Д 005.15.01 по защите диссертаций па соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН Армении (375044, Ерзвап-44, ул. П.Севака, 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Армении.

Автореферат разослан 22 ноября 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета, докт.биол.наук, проф. ßx(UL(yccoi

А.А.Симонлн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». является фундаментальным регулятором различного рода внутриклеточных пропессов. Одним из крупных достижений в области регуляции клеточного метаболизма явилось обнаружение мультяфункционального Са^+-связывающего белка - кальмодулина (Cheung W. У. 1970; Kakiucht $. etctf-IST70).

К белкам, регулируемш кальмодулином при участии (таких белков становится все больше и на сегодняшний день лх известно более 30), относятся некоторые фосфодиэстеразк,пикличес-ких нуклеотидов ( Hikl /У. dal. 1972; feo ?■ S. eb al,. 1973), аденнлатциклаза ( bra ¿troт. t.O.dal. 1975), мембранные- Са -АТР-азы. ( Gopinatíí. R.M. et at. 1977), киназа фосфорилазы ( Со-hen- Р. eíai.pW киназа легких цепей миозина из гладких r0\vska. Я. St at. 1978) и скелетных {Уауь et at, 1978/ мыши и др. Присоединение Са^+, приводящее к аллостерической актива-иии кальмодулина ведет к тому, что ранее свободный кальмодулнн связывается в клетке с различными белками - мишенями и играет ключевую роль во многих ферментативных реакциях и системах мембранного транспорта, активируемых ( WaiUf -J-М- в-í CCt. 1979; Adelsielru R.S. etai. 1981). Важнейшая функция кальмодулина. в гладкой мускулатуре - это активация киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) - фермента, играющего ключевую роль в реализации мышечного сокращения в гладкой мускулатуре путем ковалентного фосфор;:-лирования'легких цепей миозина (ЛЦ^) ( P&TTtj ¿feé-

TQWskcc Я-si coÍ. 1978), Независимо от источника выделения .КЯЦМ проявляет активность при одновременном присутствии и кальмодулина.

За последние годы в нашей лаборатории накоплен большой фактический материал, подтверждающий ранее предложенную академиком А.Л.Галопном концепцию о существовании в мозгу Са^-независгалой пептидной системы регуляции активности калшодулинзависи-

мых ферментов, допускающую наличие в организме иных, дополнительных систем регуляции активности этих ферментов при физиологических условиях, когда концентрация ионов Са^+ I0~? М.

Недавно появились работы, указывающие на существование ряда факторов, вызывающих Са^- независимую активацию ФДЭ сАМР

и других чувствительных к кальмодулину систем. К ним откосятся жирные кислоты, фосфолипиды, бактериомодулин и др. (Втап-ЙУоШ^еЫ-1Ю&\ Дудкин и др., 1984). К этой группе соединений относятся и выделенные нами из гипоталамуса крупного рогатого скота 5 коронаросуживающих пептидных факторов.

В настоящей работе представлены данные'об очистке этих соединений из гипоталамуса и изучении'их Са2+-независимого регуля-торного- воздействия на активность КЛЦМ скелетной и гладкой мус- , кулатуры.Полученные данные будут способствовать расширению наших представлений о Са^+-независимых путях регуляции клеточного метаболизма и с этой точки зрения имеют, фундаментальное значение.

Цель и задачи исследований. Учитывая тот факт, что кардиоак-тивные соединения гипоталамуса обладали регуляторным воздействием на активность ряда Са2+, кальмодулинзависимых ферментов (ФДЭ сАМР, 5 -нуклеотидаза), а также принимая во внимание физиологический эффект коронаросуживающих соединений,гипоталамуса, целью настоящей работы было изучение воздействия вышеуказанных соединений на активность киназы легких цепей миозина гладкой и скелетной мускулатуры. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Выделить в гомогенном состоянии из гипоталамуса крупно- • го рогатого скота коронаросуживающие соединения и охарактеризовать их.

2. Получить гомогенные препараты киназы легких цепей миозина из скелетной и гладкой мускулатуры.

3. Изучить воздействие коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса на активность киназы легких цепей миозина как в присутствии, так и в отсутствие ионов' Са2+.

4. Изучить воздействие пептидных факторов гипоталамуса на процесс агрегации тромбоцитов и сокращение гладкой мускулатуры, так как эти процессы также находятся в зависимости от Са^+ -кальмодулинового комплекса.

5. Изучить воздействие коронаросуживающих соединений гипоталамуса на активность Са^+, кальмодулинчувствительной ФДЭ сАМР, учитывая то обстоятельство, что повышение уровня сАМР в гладкой мускулатуре приводит к ингибированию КЛЦМ.

Научная новизна и практическая ценность. Нагл и впервые был . предложен метод получения в гомогенном состоянии из гипоталамуса

крупного рогатого скота 5 коронаросуживающих пептидных факторов .

Впервые било показано, что эти соединения вызывают независимую активацию киназы легких цепей миозина в присутствии' кальмодулина. На основании полученных экспериментальных данных высказано предположение о механизме действия пептидных факторов гипоталамуса на КЛЦМ: n$j_g оказывают регуляторное воздействие на активность КЛЦМ путем Са^+-независимого связывания с кальмо-дулином и образования комплекса кальмодулин-ПФ, который, связываясь с каталитической субъединицей фермента, вызывает его активацию. ®2_5 являются, по-видимому (как я ионы Са2+), аллостеря-ческями активаторами кальмодулина. Недавно была выяснена первичная структура этих соединений (Галоян A.A., Бархударян H.A., Лотшпайх , 1990). На основе выявленной структуры были получены синтетические пептиды и подтверждено их Са^+~независимое активирующее воздействие на КЛЦМ. Изучение физиологического эффекта синтетических пептидов (способность стимулировать сокращение изолированной аорты кролика в ¡^-деполяризующем растворе я процесс агрегации тромбоцитов, вызванный 5 мкМ АДР) показало, что он аналогичен эффекту нативных П5т_д.

Все вышесказанное позволяет начать работа по внедрению этих соединений в медицинскую практику э качестве лекарственных препаратов при кровотечениях, атонии кишечника и др»

Публикации и апробации. Основное содержание работы изложено в 8 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на УХ Всесоюзной конференции по биохимия мыши (Тбилиси, 1989) на 8 Общем собрании Европейских нейрохимических обществ (Лейпциг, 1990), на заседании ученого совета Института биохимии АН РА.

Объем Ьаботн. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, заключения и выводов. Работа изложена на 23 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 2 таблицы. Список цитированной литературы содеркит 141 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

Коронаросуяивающие соединения выделяли из уксуснокислого экстракта пептидной фракции гипоталамуса (Галоян A.A. и соавт.,

1963). Дальнейшую очистку проводили, используя голь-фильтрацию на сефадексе G-10'и ИОХ на Даузксе 50W х 8 по ранее описанной схеме (Галоян А.А. и соавт. ,• 1987).

ВЭЖХ пептидов в обращенной фазе проводили: I) на колонке LLcnrosori RP-а (1,6 х 25 см, диаметр частиц 7 мкм; "Knaver" ФРГ), с использованием ступенчатого градиента ацетонитрила в 0,1%-ной GFgCOOH (время изменения градиента - 1,5 ч), скорость элюции 3 мл/мин; 2) на колонке Hutte, о s l-l Cjg (0,46 х 25 см, диаметр частиц 7 мкм ; "Нае&гтеу. -Haqtt, ФРГ), используя градиент концентрации ацетонитрила от 5 до 60%' в 0,1^-ной CFgCOOH ■ (время изменения градиента - I ч), скорость элюпии - I мл/мин. Пептиды детектировали при 220 нм. ,

ftf-концевые'аминокислоты в пептидах определяли в виде их 1~диметиламино-5-сульфонильных (ДНС) производных по методу. Грея (1967). Хроматографию проводили на пластинках, размером • 6 х 6 см с закрепленным■слоем силикагеля марки КСК в следующих системах: I - ацетон-изопропаиол-25$нн4он, (-9:7:0,5) и (9:7: 0,7) - первое направление; хлороформ-бензиловый спирт-этилаце-тат-уксуспая кислота (6:4:5:0,2) - второе направление. П - аце-тон-изопропанол-25/S ш^он,'(9:7:2) и (9:7:3) - первое направление; хлороформ-бензиловый спирт-метанол-уксусная кислота (5:4: 1:1) - второе направление.

Катепсин В (К.Ф, 3.4.22.1) выделяли по ранее описанному методу (Галоян А.А.,и соавт., 1984) „ Гидролиз пептидов катепсином В проводили в 0,1 M фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 2 мМ дитиотрейтол и 2 мМ ЭДТА при 37° в течение 4 ч а соотношении фермент/субстрат 1:10.

Гидролиз трипсином и химотрипоином проводили в 0,1 M аммо-нийбикарбонатном буфере, рН 8,1 при 37° в течение 4 ч и фермент/ субстратном соотношении 1:10.

Количество белка определяли по методу ¿owry и соавт. (1956).

ТСХ Ферментативных гидролизатов проводили на пластинках силикагеля ("Нетк", ФРГ) (9 х 12 см) в системе: н-бутанол-пири-дин-уксусная кислота-вода (15:10:3:12), Хроматограммы проявляли 0,2%-ти раствором нингидрина в ацетоне.

Эксперименты на изолированной аорте кролика проводили по методу Канамори'и соавт. (1981). "ni "

Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрогометре гаи*оп.)

(США) с использованием в качестве агреганта 5 мкМ АДР. Исследования проводили на крови здоровых доноров. Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 2000 <р в течение 10 мин по методу Вот- и соавт. 1962).

Получение препарата КЛИМ из скелетной и гладкой мускулату-Ш- Лля получения гомогенного препарата КЛЦМ из гладкой мускулатуры желудка кур (или скелетной мышш кролика) использовали методы ¡/clz a-wa. и соавт. (1976), Dairowsки. и соавт. (1977) с некоторыми модификациями. 100 г желудков кур гомогенизировали з 4-х объемах 40 мМ трис-HCI буфера, рН 7,5, содержащего 60 мМ KCI, 25 м?,1 MgCl2, I мМ ДТТ, 5 кМ ЭГТА, 0,2^-ный тритон Х-100, Ю-3 М PMSF Ю-3 U диизопропилфторфосфата и пепстатин в концентрапии I мг/л. Гомогенат центрифугировали при 15000 x(j-в течение 30 мин. Супернатант подвергали осадденив сульфатом аммония (42-60$). Полученный осадок растворяли в 30 мл (25 мг/ мл) 15 кМ трис-HCI буфера, рН 7,5 диалязировали против того же буфера и наносили на колонку с сефакрилом 5-300 (5 х 87 см), уравновешенную 15 мМ трис-HCI буфером, рН 7,5, содержащим 0,5 М н«С1, I М ЭГТА, I мМ ДТТ, Ю-3 М PMSF. Злшию проводили тем не буфером со скоростью 200 мл/ч. Собранные с колонки фракции, содержащие КЛЦМ, объединяли и подвергали ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефацелем (2 х 20 см), уравновешенной 20 мМ трис~НС1 буфером, рН 7,8, содержащим I мМ'ЭГТА, I мМ ДТТ, Ю-3 М PMSF, На колонку наносили 250 мл раствора КЛЦМ (1,5 мг/ мл). Элюшго проводили тем же буфером с линейным градиентом Nací ~ 0,02-0,6 М. Скорость ашш 60 мл/ч.

На последнем этапе очистки использовали аффинную хроматографию на кальмодулин-сефароза 4В. 50 мл а раствора КЛЦМ (0,7 мг/мл) наносили на колонку с кальмодулин-сефарозой (I см х 8,5 см), уравновешенную 40 мМ трис-HCI буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ fíaCl, 0,2 мМ СаС12, 3 мМ MsCi2. I мМ ДТТ (буфер А). Для элшии неспецифически сорбированных белков колонку промывали тем же буфером, содержащим 0,2 М НаСХ. Элюпию проводили буфером А, в котором Са2+ был заменен 2 мМ ЭГТА. Скорость элюдии 50 мл/ч.

ФосФооилирование легких цепей (Щ) миозина скелетной и гладкой мускулатуры желудков кур с Мг 20 кД проводили в течение 25 минут при 25°С в инкубационной среде, содержащей 70 мкг очищенного миозина, 20 мМ фосфатного буфера, рН 8,0, 12,5 мМ

MgCl2, ОД мМ CaCIg. 10.мМ ATP, 1,5 мМ КЛЩ1 и 4,5 мМ кальмо-дулина. Включение фосфата в ЛЦ2 миозина регистрировали с помощью электрофореза в Ю$-ном ПААГ в присутствии 8 М мочевины по метода ßrrifS- и соавт. £1970). Относительное содержание фосфо-рилированных в миозине определяли при анализе денситограш гелей электрофореза, окрашенных Кумасси R-250.

Выделение ФДЭ сАМР из гипоталамуса быка проводили по методу Бобрускина и соавт. (1985).

Активность ФДЭ сАМР определяли по методу T^ompson^pptt-marui 1971), основанному на измерении концентрации [ HJ адено-зина в среде, образующегося з результате двухстадийной реакции гидролиза [Зн] сАМР' и р! ] 5' —AMP с участием ФДЭ и 5' -нуклеотн-дазы змеиного яда соответственно . Для определения влияния Ш на активность ФДЭ сАМР в инкубационную среду, объемом 100 мкл, содержанию 25 мГЛ трис-HGI буфер (pH 7,0), I ыМ i>'gCI?, 3 мкМ сАМР, [Зн] сАМР (0,1 мкКи) и достаточное количество фермента, добавляли от I нМ до I мкМ пептидного фактора.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение и очистка короиаросукивающих пептидных факторов гипоталамуса

Коронаросукивающие пептидные факторы выделяли из уксусного экстракта гипоталамуса по методу Галояна A.A. и соавт. (1963). Дальнейшую очистку проводили, используя гель-фильтрацию на со-фадексе G-Ю и ИОХ на Дауэксе 50 V х 8 по ранее описанной схеме (Гадоян A.A. и др., 1987). Затем последовательно были проведены полупрепаративное и аналитическое разделение методом ВЭКХ в обращенной фазе. Полупрепаративное разделение осуществляли на колонке lickrosori SP-B (1,6 х 25 см) с использованием ступенчатого градиента апетонитрила в 0,1^-иой CF3COOH (рис.1). В результате этого разделения в 3-х из полученных фракций была обнаружена биологическая активность. Фракции I и Ш обладали четко выраженным коронарорасширяющим свойством. Дальнейшему исследованию была подвергнута фракция П,' в которой обнаружилась коронаро-сукивающая активность. Эта,фракция была лиофилааирована и подвергнута рехроматографии на колонке HucCeosit Cjg (0,46 х 25 см) с применением градиента концентрации апешонитрила (5-60$) в 0,1^-ной CFJ300H (рис.2). В результате были получены 5 коро-

о использованием ступенчатого градиента апетонятрила (пунктир) в 0,1% CF3COOH. Скорость элшии 3 мл/мин.

Рис.2. Рехроматография фракция II (см. рис.1), содержащей смесь коронаросуживамцих пептидных факторов на колонке Nucfeosit- CTg (0,46 х 25 см), с использованием градиента концентрации ацетс^ нитрила (5-60%) в Q,l% СР3СООН. Скорость элшии I мл/мин.

наросуживающих пептидных факторов IK;j_5 (время их удерживания 14; 38,8; 42; 46,2 и 52,5 минут соответственно ).

Гомогенность выделенных пептидных факторов определяли с помощью ТОХ их дансанированных производных. Гыло показано, что N -концевой аминокислотой для 3 4 является валинг для ®2 - аланин, а для ПФ^ - пролил.

Кислотный гидролиз этих пептидных факторов (5,7 н HGI при П0°С в течение 18 ч) приводил к потере биологической активности.

При изучении действия рада протеолитическнх ферментов, таких как трипсин, химотрипсин и катепсин В, на коронаросуживаю-щие пептидные факторы оказалось, что после 4-часовой инкубации при 37°С й соотношении фермент/субстрат1:10 наблюдалось исчезновение их коронаросуживаклцей активности Полученные данные указывали на пептидную природу этих соединений. Гыло высказано предположение, что эти пептиды являются фрагментами одной и той же полипептидиой цепи и образуются, по-видимому, в условиях in. vivo в результате действия внутриклеточных протеолитическнх ферментов. В недавно проведенных исследованиях (Галэян A.A., Бархударян H.A., Лотшпайх Ф., 1990) была выявлена следующая первичная структура для 3-х из них: I) VVYP//;2) VVYFA'T; 3) LVVyPiVT, Как видно эти пептиды различаются только длиной пептидной цепи, т.е. наше предположение подтвердилось.

2. Физиологический эффект ®j_5

Исследования показали, что при внутривенном введении кошкам в условиях in- siiu. вызывали заметное снижение объемной емкости крови, оттекающей от венозных сосудов сердца.

Эксперименты, проведенные на изолированной аорте кролика показали, что все пять короиаросуживающих пептидных факторов стимулировали сокращение изолированной аорты в ^-деполяризующем растворе, содержащем 40 мМ KCl примерно от 25 до 30%. Физиологический эффект наблюдается уже через 5 минут после дачи 0,1 мкг пептида и продолжается до I- часа и более.

Те же соединения стимулировали процесс агрегации тромбоцитов, вызванный 5 мкМ АДР, от 25 до 30$ по сравнению с контролем не содержащим пептидных факторов.

Таким образом, из гипоталамуса крупного рогатого скота были выделены в гомогенном виде 5 короиаросуживающих пептидных

факторов, которые обладали также способностью стимулировать сокращение гладкой мускулатуры и процесс агрегаций тромбоцитов.

3. Влияние на активность киназы легких цепей

миозина скелетной мышцы

Нами было изучено влияние 5 гяпоталамических коронаросуаи-зающих пептидных факторов на активность киназн легких пепей миозина (КЛЦМ) - Са^+, калъмодулинзависимогб'фермента, который играет ключевую роль в запуске мышечного сокращения в гладкой мускулатуре, регулируя взаимодействие миозина с актином путем ковалентного фосфоршшрования'легких цепей миозина.

Фосфорилирование легких цепей (ЛЦр) миозина проводил:! в течение 25 минут при 25° в инкубационной среде, содержащей 70 мкг миозина, 0,5 M KCI, 20 m фосфатного буфера, рН 8,0, 12,'5 tëgcig, 5 î.ï.î ATP и 30 мкг "грубого" экстракта КЛЦМ, полученного я? скелетных мыши кролика, содержащего та:с;:е примеси кальмодулз-на. Резкий» останавливали добавленном 10-кратного объема холодной дистиллированной воды. После центрифугирования в теч'екде 5 минут при 10000 xj! выпавший в осадок миозин растворяли з 150 мкл 12 мМ. трис-глицинового буфера, рН 8,6, содержащего 8 M мочевину, f-меркаптоэтанол 15^-ный глицерин и использовали для электрофореза в 10^-ном ПААГ. В качестве контроля, взятого за 100^-ную активность КЛЦМ, использовали такое соотношение фермента и миозина в инкубационной смеси, которое вызывало фосфорилирование JlUg на 502. Это условие было выбрано для того, чтобы одновременно определить как возможное.ингибирование, так и активирование КЩМ под воздействием исследуемых пептидных факторов.

Исследование влияния на активность КЛЦМ скелетной

мышцы показало, что при добавлении их в инкубационную смесь в концентрации 0,05 мкМ в отсутствие ионов кальция (при наличии I мМ ЭГТА) происходит активация фермента от 30$ до 100^ по' сравнению с контролем, не содержащим пептидных дикторов.

Следующий этап экспериментов был связан с-применением очищенного препарата КЛЦМ. Результаты Са2+-независимой активации гомогенного препарата КЛЦМ под воздействием ®j_g подтвердила данные, полученные в отношении "грубого" экстракта КЛЦМ (рис. 3). Необходимо отметить, что активация КЛЦМ происходила только при добавлении в инкубационную смесь кальмодулика. Очищенный

Рис.3. Фосфорилирование легких цепей миозина (Л!^) под воздействием коронаросуживающих пептидных факторов (®). Электрофорез в ПААГ проводили в присутствии 8 М мочевины. I - контроль, содержащий I мМ ЭГГА + 4,1 мкМ кальмодули-на + 1,5 мкМ КЛЦМ; 2 - контроль + 3 - контроль + 102; 4 ~ контроль + ®3; 5 - крнтроль + Ш^; 6 - контроль + Ш использовались в концентрации 0,05 мкМ. Скано-граммы гелей Ка) и 5(6) соответственно.

препарат фермента не содержал примесей кальмодулина, что было показано методом электрофореза в ПААГ, Полученные данные позволили предположить, что в молекулярном механизме действия на активность киназы легких цепей миозина важную роль играет кальмодулин.

Была исследована также зависимость активности КЛЦМ от кон-

миграции ГО. Использовали диапазон концентраций Ш от I нМ до I мкМ. Кок видно из рис.4, где приведены данные о воздействии ПФ на активность КДВД в диапазоне .концентраций от I нМ до 160 нМ) концентрация пептидных факторов, необходимая для полумаксимальной активации КЛЦМ находится в области от 2,5 до 4 нМ. При использовании концентраций ® выше 300 нМ мы наблюдали постепенное уменьшение активирующего эффекта КЛЦМ, который полностью исчезал при концентрации ПФ равной Ю-6 М. Таким образом, можно сказать, что Са2+-пезависимое воздействие пептидных факторов гипоталамуса на активность КЛЦМ имеет четко выраженный дозоза-висимый характер.

Рис.4, Са^+-независимое активирование КЯЦМ скелетной мышцы

под воздействием различных концентраций пептидных факторов (ГО) гипоталамуса: а) - ГВ>3; б) - 1©4; в) - ПФ^. Инкубационная смесь содержала 1,5 мкМ КЛИМ; 4,5 мкМ кальмодулина и I мМ ЭГТА. По оси абсцисс - концентрация Ш в нМ.

Недавно методом фермент-зависимого иммуносорбентного анализа (ELISA) было показано (Галоян A.A., Бархударян H.A., Ова-ди Ю., 1990), что коронаросуживающие пептидные факторы гипотала-s муса (Ilijc }ингибируют образование лммунокомплекса кальмодулин-антитело 1до 90/? и более) путем Са^+-независимого связывания с кальмодулином, причем по сравнению с известным антагонистом кальмодулина - трифторпиразином, в концентрации меньшей на три порядка. Основываясь на полученных экспериментальных данных, Галоян

А.А., Бархударян Н.А. выдвинули следующую гипотезу: связывание ПФ с кальмодулином вызывает конформапяонные изменения в его антигенном' участке, расположенном в С-концевом домене кальмодули-на (последовательность аминокислот 137-143), в результате чего теряется чувствительность кальмодулина к антителам, приводящая к ингибированию образования иммунокомплекса кзльмодулин-антите-ло.

Эти данные позволили по-новому осветить Са^+-независю.юе регуляторное влияние па активность ЮЩМ и высказать пред-

положение о следующем механизме действия коронаросуживаю-

щяе пептидные факторы гипоталамуса осуществляют свое воздействие на активность КЛЦМ путем связывания с молекулой кальмодулина и образования комплекса кальмодулин-пептидпый фактор, который, з свою очередь, сзязываясь с каталитической субъеднни-цей фермента, вызывает его актявашш.

4. Влияние 1®1_5 на активность киназы легких пепей миозина гладкой мускулатуры

Как известно, именно в гладкой мускулатуре киназа легких цепей миозина .играет ключевую роль в запуске мышечного сокращения. Нами было также показано, что коронаросужизающие пептидные факторы гипоталамуса оказывают стимулирующее воздействие на сократительную функцию изолированной аорты кролика. Поэтому представлялось целесообразным изучить воздействие ПФ^ на активность КЛЦМ гладкой мускулатуры.

Исследование влияния ПФ^ на активность КЛЦМ гладкой мускулатуры желудков кур показало, что при добавлении их в инкубационную среду в концентрации 0,05 мкМ в отсутствие ионов кальция (при наличии I мМ ЭГГА) происходит активация фермента от 100% до 200$ соответственно по сравнейию с контролем, не содержащем Стимулирующее воздействие ®£_5 на активность гомогенного препарата КЛЦМ имело место только при наличии в инкубационной среде кальмодулина (табл.). Эти данные аналогичны результатам, полученным нами при изучении воздействия 1®£_5 на активность КЯЦМ из скелетной мышцы, с той лишь разницей, что степень активации КЛЦМ гладкой мускулатуры под воздействием ПФ1-5 значительно выше.

Изучение степени активации ЮЩМ гладкой мускулатуры в за-

Таблица .

Активирование киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) гладкой мускулатуры под воздействием коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса (Ш)

Соединения . • Относительная.активность {%)

__

100 О

о 100 по 200 180 200

Примечание. Исследуемые соединения применялись в следующих концентрациях: кальмодулин -4,5 мкМ, СаС12 -ОД мМ; ЭГГА - 1 мМ; КЛЦМ гладкой мышпы - 1,5 мкМ; ПФ|_5 - 0,05 мкМ. За ЮО^-ную активность фермента принимали такое количество КЩ1, которое вызывало в течение 25 минут при 25°С фосфо-рилированив легких цепей миозина на 50$.

висимости от концентраций пептидных факторов показало, что и -в. этом случае, как в случае КЛИМ скелетной мышцы, воздействие пептидных факторов носит дозозавясимый характер. Концентрации П5д и ®4, необходимые для полумаксимальной активации КЛЦМ находятся в области от 2 до 4 нМ. Определение константы активации (Кд) КЛЦМ пептидными факторами показало, что ее величина находилась в диапазоне от 1,8 до 4 нМ для соответственно.

Поскольку Ш'1_ь оказывают свое воздействие на активность КЛЦМ из гладкой мускулатуры только при наличии в инкубационной среде кальмодулина (эти данные полностью совпадают с данными о воздействии ПФ-£_5 на активность КЛЦМ скелетной мышпы), то предложенный нами механизм действия. 1%_5 на активность КЛЦМ одинаков, независимо от источника выделения КЛИМ.

Са

Са2+ кальмодулин Са2+ + ®{1,2,3,4,5) ЭГГА + кальмодулин ЭГТА + кальмодулин + ЭГГА + кальмодулин + ®2 ЭГГА + кальмодулин + ЭГГА + кальмодулин + ЭГТА + кальмодулин +

о

- 16 -

Таким образом, говоря об активации КЛЩ из гладкой мускулатуры и учитывая тот факт, что в гладкой мускулатуре КЛЦМ ответственна за запуск мышечного сокращения, можно заключить, что получены новые доказательства регуляторного воздействия коронаросуживающих на сократительную функцию гладкой мускулатуры, которые коррелируют с "полученными нами результатами о стимулирующем воздействии n<J?j_g на сократительную функцию изолированной аорты кролика.

Известно, что такие антагонисты кальмодулина, как W-7 и его структурные аналоги в условиях т. viiro ингибируют процесс агрегации тромбоцитов и обеспечивают релаксацию гладкой мускулатуры путем Са2+~зависимого связывания с кальмодулином, что в свою очередь ингибирует активность Са2+ кальмодулинзависимых систем и, в частности, активность КЛЦМ. стимулируют эти

процессы, по-видимому, также путем связывания с молекулой кальмодулина, но Са2+-независимым способом, что приводит к активации КЛИМ комплексом каяьмодулин-ПФ. В данном случае выполняют функцию ионов Са2"1", являясь его эндогенными заменителями.

5. Влияние коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса на активность Са2+, кальмодулин-чувствительной ФДЭ сАМР

Как известно из литературных данных { Cortil НА. etal. 1981) повышение уровня сАМР в гладкой мускулатуре вызывает уменьшение сродства КЛЦМ к комплексу кальмодулина с Са2+, т.е. к ингибированию фермента.

Поэтому представлялось интеиесным изучить воздействие пептидных факторов на активность Са^+-кзльмодулинчувствительной ФДЭ cAf.tP.

Проведенные исследования показали, что пептидные факторы гипоталамуса в отсутствие ионов кальция стимулируют активность Са2+, кальмодулинчувствительной ФДЭ сАМР в 4 раза по сравнению с контролем не содержащим пептидных факторов (рис.5). Необходимо отметить, что в присутствии Са2+,мы не наблюдали активирующего эффекта I®, а в отсутствие. Са2+ активирующий эффект пептидов имел место только при наличии в инкубационной среде кальмодулина. Очевидно, что, как и в случае КЛЦМ, Са2+-независимое

50

ЬО

5 *

ч

20

1т1

г/'

1Т1-1

I 23456189

Ряс.5. Влияние пептидных факторов (ПФд и И>4) гипоталамуса на активность Са -кальмодулинзависимой ФДЭ сАМР.

По оси абсцисс: I - ОД мМ СаС12 + 3 мкМ ФДЭ сАМР (контроль I - Кх); 2 - ОД кМ СаС12 + 3 мкМ ФДЭ сАМР +4,5 мкМ кальмодулин (Кд - контроль 2); 3 - Кз + 0,05 мкМ ®3; 4 - К2 + 0,05 мкМ 1В>4; 5 -К: + 0,05 мкМ Г®3; 6 - Кх + 0,05 миГ.1 ®4; 7 - I мМ ЭГТА + 3 мкМ ФДЭ сАМР + 4,5 мкМ кальмодуляна (Кд -контроль 3); 8 - К3 + 0,05 мкМ Щ>3, 9 - Кд + 0,05 мкМ ПФ4. По оси ординат - активность ФДЭ сАМР (нмоль гидрсшизованного сАМР/мин).

воздействие пептидных факторов на активность ФДЭ сАМР осуществляется путем их связывания с молекулой кальмодулина, что приводит к аллостерической активации последнего.

Гыла изучена зависимость активности ФДЭ оАМР от концентрации ПФ. Установлено, что концентрация I®, при которой происходит полумаксимальная активация ФДЭ сАМР находится в области от 3,2 до 5,25 нМ.

Таким образом, на основании полученных данных, можно заюш- . чить, что коронаросуживающие пептидные факторы гипоталамуса можно причислить к числу Са2+-независимых регуляторов в клетке, которые, по—видимому, и в условиях in.Yi.vo могут принимать участие в регуляции активности ЮЩМ» ФДЭ сАМР и, возможно, дру- '.-гих Са2+, кальмодулинзависимых систем (при низком внутриклеточ-

ном уровне содержания Са^+) путем Са^+~независимого связывания с кальмодулином, обеспечивая при этом и регуляцию сокращения гладкой мускулатуры, вероятно, являясь в данном случае зядогвн- ■ ними заменителями Са^+. ■

ВЫВОДУ

1. С помощью полупрепаративной и аналитической ВЭКХ в обращенной фазе разработан метод получения в гомогенном состоянии из биологически активной фракции гипоталамуса 5 коронаросуживаю-щих пептидных факторов.

2. Изучение физиологического эффекта этих'соединений показало, что ПФ|_5 стимулируют сокращение изолированной аорты кролика в К+-деполнризующем растворе,(до 25$) и процесс агрегация тромбоцитов, вызванный 5 мкМ АДР (до 30$).

3. Впервые установлено, что коронаросуживающие пептидные факторы гипоталамуса (ПФ^^) вызывают Са^+-независимую активацию ЮЩМ скелетной мускулатуры от 30$- до 100^ и, в значительной большей степени - до 200$ активацию ЮЩМ гладкой мускулатура,' что, по-видимому, связано с биологической функцией этих соединений как возможных Са2+-независимых регуляторов процесса сокращения гладкой мускулатуры в условиях ¿л- \sLvO.

4. Определение концентрации ПФ^5, необходимой для полумак-сямальной активации КЛЦМ из скелетной и гладкой мускулатуры доказало, что ее величина составляет от 2 до 4 кМ и не зависит от источника выделения йешента,

" " о.

5. Показано, что Са -независимое воздействие на активность КЛЦМ имеет четко выраженный дозозависишй характер. Эти соединения активны в диапазоне концентраций Ю-® - Ю~' М, в то же время они не проявляют активирующего эффекта уже при концентрации 10""® М и выше. э

6. Обнаружено, что коронаоосуживавдяе пептидные фактош гипоталамуса вызывают Са -независимую активацию кальмодулинчувст-вителькой ФДЭ сАГЛР более.чем в 4 раза по сравнению с контролем, не содержащим ПФ. Концентрация ®|_5> необходимая для полумаксимальной активации фермента составляла от 3,2 до 5,25 нМ.

7. Установлено, что для проявления Са^+-независимого воздействия 1©2_д на активность КЛЦМ необходимо обязательное присутствие кальмодулина в инкубационной смеси. Предложен следую-

:цяй механизм действия Iî®j_5 на активность КЛЦМ: 1%_5 проявляют свое воздействие путем Са2+-иезависимого связывания с каль-модуликом. к образования комплекса кальмодулин-ПФ, который, связываясь с каталитической субъздиниией фермента, вызывает его активацию. •

СПИСОК 0ПУБ.5ИК0ВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бархударян H.A., Серобян С.С., Алексанян С.С., Закарян Т.?., Мурадян М.Ш., Галоян A.A. Выделение и характеристика корона-росуживающих пептидных факторов из гипоталамуса крупного рогатого скота. X Всесоюзная конференция ло биохимии нервной системы: "фундаментальные достижения яейрохимии медицине", Горький, 1987, с.70.

2. Галоян A.A., Бархударян H.A., Валко К., Закарян Т.Р. Очистка •л характеристика коронаросугкаваэдих пептидных факторов кз ги-лоталамуса. "ИеИрохимвя", -г.7, .'5 4, с.519-524, 1988.

3. Бархударян H.A., Закарян Т.?., Шувалова Л.А., Галоян A.A. Влияние коропаросукизаю'а'нх пептидных факторов гкпотала"иус& -па активность киказы легких иепей миозина. Тезисы докл. 71 Всесоюзной • конференции-по 'биохимии мшн, Тбилиси, I98S, с.19.

4. Бархударян H.A., Закарян ,Т.Р., Шувалова Л.А., Чаилян С.Г., Алексэнян А.Р., Галоян A.A. Влияние коронаросуяшваюэдх пептидных факторов гипоталамуса на активность кяназы легких цэ-пей миозина. "Иейрохямяя", т.8» C.IS0-IS7,-I9S9.

5. Закарян Т.Р., Бархударян H.A., Шувалова-Л.А.,.Галоян A.A. Ре-гуляторное слияние коронаросужизаютих пептидных факторов ги- -, поталамуса на активность кяназк легких цепей миозина. В сб.: "Теоертические и прикладные -аспекты молекулярной биологии". Н1Щ МЗ СССР, Москва, 1989. Дел.. ВИНИТИ 13.02.90 г. №-816-Е90, с.192.

6. Barkhtidaryan Я., ZakaryanT., Aleksnnyan А., Sharova N.. Shu-valova M., Chailyan S., Galoyan A. New data about Ca-^-inde-pendent regulatory action. Oth General ESN Meeting, Leipzig, 1990, p.141.

7. Закарян T.P., Шувалова Л.А., Шарова H.П., Чаилян С.Г.,Бар- . сегян К.С., Бархударян H.A., Галоян A.A. Са~+-незазиеимов • воздействие коронаросуживавдих пептидных факторов гипотала--муса на активность Ca , кальмодулинзависимых ферментов.

Тезисы молодежной конференции, Ереван, IS90, с.63. 8. Закарян Т.Р., Г-архударяк H.A., Шувалова Л.А., Островская М.В., Шарова H.IL, Галоян A.A. Регуляция сокращения гладкой мускулатуры пептидными факторами гипоталамуса. "Нейрохимия", т.9, 14, с.444-449, 1990.

Заказ 30

Тираа joo

Отлачатано аа ротапрглтном участке ЦНИОН АН Армении Адрес; Ереван-I, ул.Абовяна,15.