Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трофическое влияние симпатической иннервации на кальциевую чувствительность сократительного аппарата подкожной артерии крысы
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Трофическое влияние симпатической иннервации на кальциевую чувствительность сократительного аппарата подкожной артерии крысы"

На правах рукописи

ПУЗДРОВА ВИКТОРИЯ АНАТОЛЬЕВНА

ТРОФИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ СИМПАТИЧЕСКОЙ ИННЕРВАЦИИ НА КАЛЬЦИЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СОКРАТИТЕЛЬНОГО АППАРАТА ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ КРЫСЫ

03.00.13 - физиология 03.00.04 - биохимия

0031сэзи^

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17

Москва 2007

003175902

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (заведующий - профессор А А Каменский), на кафедре биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины (заведующий - академик В А Ткачук) МГУ им М В Ломоносова, в Институте физиологии университета г Росток (Германия), а также в Институте физиологии университета г Орхус (Дания)

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор кафедры

Тарасова физиологии человека и животных биологического

факультета МГУ им МВ Ломоносова

Александр Вячеславович кандидат биологических наук, ведущий научный Воротников сотрудник кафедры биологической и медицинской

химии факультета фундаментальной медицины МГУ им М В Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Татьяна Павловна доктор биологических наук, ведущий научный

Сторожевых сотрудник лаборатории мембранологии с группой

генетических исследований ГУ Научного центра здоровья детей РАМН

Аскер Юсуфович кандидат биологических наук, старший научный

Хапчаев сотрудник лаборатории клеточной подвижности

ФГУ Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава РФ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита диссертации состоится ,^декабря^2007 года в 15ч ЗОмин на заседании диссертационного совета Д 501 001 93 биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова по адресу Ленинские горы, д 1, строение 12, Москва, ГСП-1,119991, ауд М-1

Автореферат разослан 19 октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Б А Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что симпатические нервы оказывают трофическое влияние на кровеносные сосуды они регулируют пролиферацию, рост и дифференцировку гладкомышечных клеток (Орбели, 1962, Bevan 1984, Damon 2005) У многих млекопитающих, в том числе у крыс, становление симпатической иннервации органов происходит только после рождения, в раннем постнатальном периоде (Todd, 1980, Hill et al, 1983, Hill, 1999, Luff 1999, Sandow, Hill 1999), что совпадает во времени с процессом дифференцировки гладкой мышцы сосудов (Owens, 1995) Известно, что симпатическая иннервация необходима для формирования сократительного фенотипа гладкомышечных клеток в онтогенезе (Bevan 1984, Damon 2005), однако ни молекулярные мишени трофических воздействий, ни их взаимодействие на внутриклеточном уровне практически не исследованы Кроме того, остается совершенно неясной роль симпатической иннервации в формировании функциональной активности сосудов Сосудистые гладкие мышцы обладают характерной способностью к длительному поддержанию напряжения, т е тоническому сокращению Поскольку нарушение тонического сокращения может быть причиной как локальных вазоспазмов, так и системных сердечно-сосудистых нарушений, выяснение физиологических механизмов формирования тонуса является весьма актуальным

Данная работа направлена на проверку гипотезы о том, что трофическое влияние симпатических нервов связано с формированием определенного баланса Са2+-зависимых и Са'+-независимых механизмов регуляции сокращения гладкой мышцы сосудов за счет изменения уровня экспрессии их ключевых молекулярных компонентов Мы предполагаем, что этот баланс определяет чувствительность сократительного аппарата к ионам Са2+ и является важным механизмом формирования адекватной регуляции тонуса сосудов в онтогенезе, а повреждение симпатической иннервации приводит к его нарушению

Трофическое влияние симпатических нервов в основном реализуется на пострецепторных этапах регуляции сокращения, поскольку рецепторный аппарат гладкомышечных клеток достаточно консервативен Показано, что ai-адренорецепторы, которые в основном опосредуют вазомоторные и трофические эффекты симпатических нервов (Yu et al, 1996, Chen et al, 1995), не претерпевают значительных изменений ни в ходе становления иннервации сосудов, ни после денервации во взрослом возрасте (Bobik, Anderson, 1983, Nassen et al, 1985, Phillips et al, 1996, Phillips, Hill, 1999)

Всю последовательность событий от активации рецепторов наружной мембраны до сокращения гладкой мышцы можно разделить на два этапа На первом этапе происходит повышение концентрации свободного кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток ([Ca2+]J) (Thorneloe, Nelson, 2005) Здесь трофическое влияние симпатических нервов проявляется в контроле экспрессии канальных и транспортных белков, которые обеспечивают

типичные для гладкомышечных клеток уровень мембранного потенциала и кальциевый гомеостаз (Fleming, 1999)

На втором этапе Са2н взаимодействует с сократительным аппаратом, что приводит к сокращению Симпатические нервы контролируют экспрессию гладкомышечных изоформ актина и миозина (Damon 2005) Однако вопрос о Юм, влияют ли они на активность механизмов, регулирующих актомиозиновое взаимодействие в гладкомышечных клетках, и осуществляется ли такое влияние через изменение экспрессии соответствующих регуляторных белков, к началу данной работы оставалось неисследованным

Ключевым Са2+-связывающим белком гладкомышечных клеток является кальмодулин (Гусев, 2001) Основной мишенью комплекса Са2+-кальмодулин является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ), которая фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина (Somlyo, Somlyo, 2003, Hirano, 2007), активируя миозиновый мотор и сокращение гладкой мышцы Еще одной мишенью Са2+-кальмодулина является кальдесмон, который локализуется на нитях актина и вместе с тропомиозином блокирует участки сильного связывания миозина на актине, как это делает тропонин в поперечно-полосатой мускулатуре Взаимодействие кальдесмона с комплексом Са2+-кальмодулин устраняет тропомиози новый блок и тем самым делает возможным взаимодействие миозина с актином (Воротников и др, 2002) Снижение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме сопровождается инактивацией КЛЦМ и восстановлением ингибирующего действия кальдесмон-тропомиозина Последующее расслабление определяется дефосфорилированием РЛЦ Са2+-независимой фосфатазой легких цепей миозина (ФЛЦМ), инактивацией миозина и переходом тонких филаментов в неактивное состояние

Описанные выше механизмы обеспечивают -зависимую регуляцию сокращения, которая происходит при деполяризации наружной мембраны гладкомышечных клеток Однако на самом деле процесс регуляции сокращения гладких мышц более сложный, поскольку в естественных условиях активация рецепторов наружной мембраны, ассоциированных с G-белками, приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов и изменению амплитуды и/или длительности сократительного ответа без существенных изменений [Ca2+]i (Somlyo, Somlyo 2003, Воротников и др 2002) Этот феномен известен как «изменение Са2 -чувствительности сократительного аппарата г ладко мышечных клеток» (Horowitz et al, 1996) и является одним из наиболее интенсивно исследуемых вопросов физиологии гладкой мышцы При этом, увеличение силы сокращения при относительно неизменной [Са2+], (повышение Са -чувствительности) обозначается как

Саъ -сенситизация, а уменьшение сократительного ответа (снижение Са2+-чувствительности) - как десепситизация к Са'Л

Основным механизмом изменения Са2+-чувствительности является ингибирование ФЛЦМ, которое достигается действием двух ферментов Rho-киназы и протеинкиназы С (Somlyo, Somlyo, 2003, Hirano, 2007) Это замедляет дефосфорилирование РЛЦ миозина и поддерживает сокращение даже при сравнительно низкой активности КЛЦМ Дополнительное повышение силы

сокращения обеспечивается независимо от фосфорилирования РЛЦ миозина, путем Са2+-независимой активации каскада митог ен-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ) Это приводит к фосфорилированию кальдесмона и устранению его ингибирующего действия на актомиозиновое взаимодействие (Воротников и др, 2002, 2004) Кроме того, МАР-киназы могут усиливать сокращение путем активации КЛЦМ (Morrrison et al, 1996, Kim et al, 2000)

Данная работа проводилась с использованием двух экспериментальных моделей Во-первых, было исследовано формирование баланса Са2+-зависимых и Са2+-независимых регуляторных механизмов при развитии симпатической иннервации сосудов крыс в постнатальном периоде Во-вторых, было исследовано изменение этого баланса при экспериментальной симпатической денервации сосудов взрослых животных Этот подход позволил связать возрастные изменения Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы с влиянием именно симпатических нервов, а не факторов иной природы (механической или гуморальной) В работе были зарегистрированы изменения силы сокращения и [Са2+|, для сосудов с различной степенью симпатической иннервации Эти данные были сопоставлены с изменением экспрессии ключевых белков-регуляторов взаимодействия актина и миозина в гладкомышечных клетках В результате исследования были выявлены потенциальные мишени трофического воздействия симпатической иннервации и описан вероятный механизм становления функциональной активности, характерной для зрелых сосудов

В качестве объекта исследования была выбрана подкожная артерия крысы (.a saphend) Это артерия мышечного типа, у взрослых крыс она густо иннервирована симпатическими волокнами (Todd, 1986, Тарасова и др , 2007), то есть является удобной моделью для исследования механизмов трофического влияния симпатической иннервации

Целью настоящей работы являлось исследовать формирование механизмов, регулирующих чувствительность сократительного аппарата гладкомышечных клеток сосудов к Са2+, у крыс в период созревания симпатической иннервации, и их изменение при экспериментальной денервации сосудов во взрослом возрасте В работе решались следующие задачи

1) исследовать динамику развития иннервации подкожной артерии в раннем постнатальном периоде,

2) исследовать, как изменяется чувствительность сократительного ответа подкожной артерии к [Ca2+]i при созревании симпатической иннервации,

3) исследовать, как изменяется чувствительность сократительного ответа подкожной артерии к [Ca2+]i при денервации во взрослом возрасте,

4) связать обнаруженные изменения чувствительности сократительного ответа к [Са2+]! с экспрессией регуляторных белков сократительного аппарата

Научная новизна работы. Доказан факт существования долговременного трофического влияния симпатических нервов на регуляцию сокращения

гладкой мышцы сосудов путем изменения баланса Са2+-зависимых и Са2+-независимых регуляторных механизмов Впервые показано, что становление симпатической иннервации сопровождается уменьшением роли Са2+-сенситизации в сокращении периферических резистивных сосудов большого круга кровообращения Впервые показано, что нарушение симпатической иннервации приводит к обратным изменениям, то есгь к >величению роли Са2+-сенситизации в сокращении сосудов Впервые в этих двух экспериментальных моделях сопоставлены изменения экспрессии белков, регулирующих зависимость силы сокращения от [Са2+]л Важно, что весь комплекс физиологических и биохимических исследований выполнен на одном объекте, в отличие от предыдущих работ, где затрагивались только функциональные или только биохимические аспекты этой проблемы

Практическая значимость работы. Значимость работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена необходимостью разработки новых способов коррекции тонуса сосудов, лишенных симпатической иннервации при регуляторных расстройствах у новорожденных детей, а также при нарушении иннервации во взрослом возрасте (в результате травм, аутотрансплантации или трансплантации тканей, диабетической нейропатии и др ) Результаты работы дают основание полагать, что развитие патологий сердечно-сосудистой системы, сопряженных с нарушением симпатической иннервации, может быть связано с уменьшением роли Са2+-зависимых и возрастанием роли Са2+-независимых механизмов регуляции сокращения гладких мышц сосудов Следовательно, для лечения таких патологий следует использовать не традиционно применяемые блокаторы Са2+-каналов, а препараты, действие которых направлено на снижение активности Са2+-независимых механизмов регуляции сокращения

Основное положение, выносимое на защиту Трофическое влияние симпатических нервов на сосуды приводит к изменению экспрессии белков, обеспечивающих тоническое Са2+-независимое сокращение гладкой мышцы, что обеспечивает возможность динамической регуляции тонуса сосудов симпатическими вазомоторными влияниями

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, 2004, 2006), на конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк, 2003), на III и V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003, 2007), на III Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2004), на IX Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, 2007), на XX Съезде физиологического общества И П Павлова (Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на-^ J страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов Список литературы включает^-/источников Работа иллюстрирована 4 таблицами и 25 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на крысах линии Вистар в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» Возраст животных составлял 3-8-дней («новорожденные»), 11-14-дней («2-недельные») и 2-3 месяца («взрослые») Масса тела новорожденных крысят составляла 8-12 г, двухнедельных - 26-40 г, а взрослых - 300-350 г Кроме того, в экспериментах использовали препараты подкожной артерии взрослых крыс, денервированные за 2-3 недели до эксперимента

Модель хирургической денервагщи подкожной артерии Для денервации сосудов задней части тела (в том числе, подкожной артерии) проводили удаление поясничных симпатических ганглиев Поскольку при этом воздействии иннервация жизненно важных органов (сердца, головного мозга, почек) остается интактной, удается исключить нежелательные системные эффекты, которые неизбежно проявляются при химических способах денервации (Lew, Quay 1972, MacLean et al 1980)

Под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно) у крыс удаляли левую симпатическую цепочку от уровня L2 до бифуркации брюшной аорты, что приводило к практически полному исчезновению сплетения адренергических волокон в левой подкожной артерии С правой стороны доступ к верхним поясничным ганглиям был ограничен, поэтому правую подкожную артерию в экспериментах не использовали Контролем служили ложнооперированные крысы

Визуализация адренергических нервных волокон в стенке сосуда Сегмент артерии изолировали из тела крысы, промывали в физиологическом растворе и помещали в 0,1 М фосфатно-солевой раствор (рН 7,2) с добавлением глиоксиловой кислоты (2 %), сахарозы (10 %) и понтамина небесно-голубого (0,03 %) После 30-мин инкубации препарат расправляли на предметном стекле адвентицией вверх, высушивали (30 мин под струей теплого воздуха, 5 мин при 100 °С), заливали вазелиновым маслом и накрывали покровным стеклом Использовали микроскоп ЛЮМАМРЗ (JIOMO, СССР, окуляр х7, объектив х40) Длина волны возбуждающего света составляла 380-440 нм, исследуемой люминесценции - 480-700 нм

Эксперименты на изолированных сосудах

Измерение сократительной активности сосудов Сокращение сосудов исследовали в изометрическом режиме с помощью системы wire myograph (модель 310, Danish Myo Technology A/S, Дания) Животных декапитировали гильотиной и выделяли подкожную артерию Из средней части сосуда вырезали кольцевой сегмент длиной 2 мм и закрепляли его в миографе, содержащем раствор следующего состава (мМ) NaCl 120, NaHC03 26, KCl 4,5, CaCi2 1,6, MgSO, 1,0, NaH2P04 1,2, D-глюкоза 5,5, EDTA 0,025, HEPES 5,0 Раствор непрерывно аэрировали карбогеном (5% С02 + 95% 02) для поддержания pH равным 7,4

После прогрева миографа до 37°С (40 мин) проводили процедуру нормализации (Mulvany, Halpern, 1977), в результате которой определялось растяжение препарата, оптимальное для проявления сократительной активности Затем для активации препарата проводили несколько циклов сокращения-расслабления путем добавления норадреналина (10 мкМ), серотонина (10 мкМ) или серотонина (10 мкМ) в 120 мМ KCl Вызывали 2 или 3 сокращения длительностью 5 Mira с 10-мин интервалами

Измерение внутриклеточной концентрации свободного ионизированного кальция ([Ca24],) Для измерения [Са2+], использовали индикатор fura 2, который обладает способностью к флуоресценции и в свободном от Са2+, и в связанном с ним состоянии Загрузку клеток сосуда проводили при 37°С с использованием ацетометильной формы индикатора (fora 2-АМ)

В экспериментах на сосудах крыс разного возраста препараты инкубировали с 5 мкМ fura 2-АМ, который предварительно растворяли в ДМСО (конечная концентрация ДМСО в растворе - 0,1%) Инкубацию проводили двукратно по 40 мин, заменяя раствор перед вторым периодом инкубации

В экспериментах по исследованию эффектов денервации концентрация fura 2-АМ в растворе составляла 6 мкМ, в качестве растворителя использовали смесь ДМСО, CremophorEL и Pluronic F-127 (конечные концентрации растворе 0,16%, 0 3% и 0,007%, соответственно) Инкубацию проводили двукратно по 45 мин, заменяя раствор между инкубациями

В обоих случаях эксперимент начинали после 20-мин отмывки препарата от избытка fura 2-АМ Для возбуждения флуоресценции препарат попеременно освещали ртутной (100 Вт) или ксеноновой (75 Вт) лампой при длине волны 340 нм (для fura 2, связанного с Са2+) и 380 нм (для fura 2, свободного от Са2+) Флуоресценцию регистрировали при 515-520 нм с использованием фотоумножителя, от которого сигнал поступал на персональный компьютер с соответствующим программным обеспечением

В экспериментах на сосудах крыс разного возраста изменения [Са2+], оценивали по отношению сигналов флуоресценции связанного с Са2+ и свободного fora 2 (F340/F380) В экспериментах по исследованию эффектов денервации проводили калибровку сигнала флуоресценции по методике Jensen et al (1992), что позволило определить истинные значения [Ca2+]i

fí экспериментах исследовали реакции сосудов при активации ai-адренорецепторов метоксамином (поскольку в отличие от многих адреномиметиков метоксамин не захватывается нервными терминалями, с его использованием можно аккуратно сопоставлять реакции иннервированных и неиннервированных сосудов),

реакции сосудов при активации рецепторов тромбоксана агонистом U46619 («воздействие неадренергической природы»),

реакции сосудов при «нерецепторной активации» в ответ на добавление в окружающий раствор Са2+ (0,03 - 3 мМ) на фоне деполяризации (120 мМ КС1) Для блокады действия норадреналина, выделяющегося при деполяризации из нервных окончаний, раствор содержал фентоламин (1 мкМ)

Все зависимости «концентрация-эффект» исследовали кумулятивно Действие веществ в каждой концентрации длилось 3-5 мин, до стабилизации силы сокращения

Обработка резучътатов При обработке зависимостей «концентрация-эффект» определяли показания датчика силы и значение [Ca2+J; в фоне (перед тестом) и при действии каждой из концентраций агониста (или Са2+), а затем для каждой из действующих концентраций вычисляли абсолютное изменение натяжения и [Са2+], В экспериментах на сосудах крыс разного возраста полученные значения нормировали на изменения при максимальном сокращении (10 мкМ серотонина в 120 мМ КС1) При исследовании эффектов денервации значения силы сокращения нормировали на ответ при максимальной концентрации агонисга, значения [Са2+], анализировали в ненормированном виде (в нМ)

По полученным данным для каждого из стимулов строили графики зависимости силы сокращения и [Са2+], от концентрации агониста (или [Са2+] в растворе), а также зависимость силы сокращения от изменения [Са2+]ь что позволило сопоставить кальций-зависимость сокращения гладкой мышцы сосудов у разных групп крыс

Fura-2 AM, Cremophor EL и Pluronic F-127 были получены из фирмы Molecular Probes (США), остальные фармакологические препараты - из фирмы Sigma (США)

Исследование экспрессии белков в гладкомышечных клетках сосудов

Разделение баков в почиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсучъфата натрия (ДСН) Экстракты тканей подвергали электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля в присутствии анионного детергента (ДСН) и p-меркаптоэтанола по методу Леммли В зависимости от массы разделяемых белков использовали 7% концентрирующий гель (0,5 мМ трис-НС1, рН 6,8, 0,4% ДСН) и 7,5, 10 и 12% разделяющие гели со стандартной сшивкой 2,7% (1,5 M трис-НС1, 0,4% ДСН, рН 8,8)

Иммунобчоттинг Электроперенос белков на поливинилиден-дифлуоридные (PVDF) или нитроцеллюлозные мембраны (метод Western Blotting) проводили в буфере (0,025 M трис-0,192 M глицин, рН 8,3, 20%

этанол, 0,02% ДСН) сразу после завершения электрофореза Электроперенос осуществляли с использованием прибора фирмы Biorad (Protean III для электропереноса, США) при силе тока 350 мА

Время электропереноса для разных белков варьировало в зависимости от их молекулярной массы Электроперенос РЛД миозина осуществляли в течение 40 мин, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), тяжелых цепей миозина, КЛЦМ, кальдесмона, МАРК р38 и МАРК р42/44 - в течение 60 мин, регуляторной субъединицы ФЛЦМ (MYPT) - в течение 90 мин, а Rho-киназы -в течение ночи Мембраны блокировали 1 ч при комнатной температуре 5% раствором сухого обезжиренного молока или 3% БСА (V фракция) на трис-солевом буфере с добавлением Tween 20 (ТСБТ 20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 20 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) После блокирования неспецифического связывания мембрану отмывали тремя сменами ТСБТ по 10 мин и инкубировали с первичными антителами в 1% растворе обезжиренного молока или 1% БСА (V фракция) на ТСБТ в зависимости от определяемого белка Затем в течение 1 ч мембрану инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, отмывали ТБСТ и проявляли с помощью хемилюминесцентной системы ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech)

В работе были использованы антитела к РЛЦ миозина (Sigma), КЛЦМ (КЗ6) (Sigma), тяжелым цепям гладкомышечного миозина (Covance), МАРК р42-44 и МАРК р38 (Cell Signalling), MYPT (AbCam), Rho-киназе (Bethil) Антитела к ГАФД были любезно предоставлены А Г Катрухой, а к кальдесмону - М А Крымским Также использовали наборы вторичных антител (Amersham или Pierce)

Концентрацию белка в образцах ткани определяли по методу Шафнера и Вайсмана (Schaffner, Weissmann, 1973)

Обработка результатов Полученные пленки сканировали, используя программу Quantity One (Bio-Rad Laboratories, США, 2000) Далее изображения обрабатывали в программе Image J (Scion Corporation, США)

Для каждого из исследуемых белков полученные данные нормировали на содержание ГАФД в тех же образцах Данные литературы (Payne et al, 2005), а также результаты специально проведенных нами измерений свидетельствуют о том, что содержание ГАФД по отношению к общему белку в образцах ткани сосудов с возрастом и после денервации не изменяется

В данных, полученных при сканировании каждой мембраны, усредняли значения, отражающие содержание данного белка в контрольных сосудах взрослых крыс На это среднее нормировали значения, отражающие содержание белка в каждом из индивидуальных образцов данной мембраны (среднее значение для образцов взрослых крыс в контроле всегда равно 1) Нормирование данных на «взрослый контроль» позволило адекватно сопоставить содержание белка в сосудах разных групп крыс, а также объединить данные, полученные в разных сериях экспериментов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни Различия считали статистически

значимыми при р<0,05 Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, п - объем выборки

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика возрастных изменений морфологии сосудов крыс

Формирование нервного сплетения в подкожной артерии крысы происходит в первый месяц постнатачъного развития В возрасте 3-5 дней нервные волокна в стенке подкожной артерии, как правило, отсутствуют Формирование нервного сплетения начинается с 8-дневного возраста, с 11 по 14-й дни после рождения плотность периартериального нервного сплетения сильно увеличивается В возрасте 24-28 дней в стенке артерии выявляется ярко флуоресцирующее сплетение нервных волокон, сопоставимое по плотности с сосудами взрослых крыс Таким образом, формирование нервного сплетения в сосудах крыс происходит в первые недели постнатального развития и заканчивается к 1-месячному возрасту, что согласуется с данными других авторов (Todd, 1980, Sandow, Hill, 1999, Luff, 1999)

На основании полученных данных для дальнейших исследований были выбраны три возрастные группы крыс «.новорожденные)/) (возраст 3-8 дней, иннервация сосудов отсутствует или только начинает формироваться), «двухнедельные», (возраст 11-14 дней, период установления трофических влияний на сосуды), «взрослые» (возраст 2-3 месяца, законченные изменения гладкой мышцы сосудов вследствие трофического влияния симпатических нервов)

Взросление крыс сопровождается увеличением диаметра подкожной артерии (таблица 1) Величина максимального сократительного ответа при этом также растет, поскольку увеличивается количество слоев гладкомышечных клеток в стенке артерии (Sandow et al, 2004)

Таблица 1 Диаметр и величина максимального сокращения препаратов подкожной артерии у крыс разного возраста_____

Группа крыс Внутренний диаметр, мкм Максимальное сокращение, мН/мм

Новорожденные (9) 190,0 ±10,4 0,82±0,04

Двухнедельные (9) 295,6±17,2 1,22±0,03

Взрослые (9) 389,9 ± 17,8 4,36±0,27

Возрастное изменение Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии крысы

С а2 -зависимое сокращение гладкой мышцы сосудов с возрастом не изменяется В экспериментах с постепенным повышением концентрации Са24 в наружном растворе на фоне деполяризации наружной мембраны у новорожденных, 2-недельных и взрослых крыс обнаружены одинаковые

изменения силы сокращения и F340/F380. Соответственно, зависимости «сила сокращения - F340/F380», построенные для трех групп крыс, достоверно не различаются (рис. 1 ). Это свидетельствует о том, что в отсутствие рецепторной стимуляции Са2+-зависимость сокращения гладкой мышцы сосудов с возрастом не изменяется.

Такое наблюдение согласуется с данными литературы, согласно которым «собственная» чувствительность сократительного аппарата к Са2+ с возрастом может снижаться в артериях эластического типа (Akopov et al., 1997-1998), портальной вене (Brus, Nixori, 1997), мочевом пузыре (Ekman et al., 2005), но остается неизменной в артериях мышечного типа (Akopov et al., 1997-1998; Charles et al., 2007), к которым относится и подкожная артерия крысы.

—•—3-8 дней —О—11-14 дней - -О - взрослые

0.8 -

s s

ш 0.6 -3" га

S" 0.4 -

о о

£ 0.2 -s

о

0.0 -i

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Изменение F340/F380

Рисунок 1. Зависимость силы сокращения от F340/F380 ([Са2+]0 для сосудов новорожденных (п=5), 2-недельных (п=4) и взрослых (гг=6) крыс в экспериментах с повышением наружной

концентрации Са2+ на фоне деполяризации наружной мембраны гладкомышечных клеток (120 мМ KCl).

'Значения силы и F340/F380 нормированы на соответствующие значения при действии ЮмкМ серотонииа в 120 мМ KCl.

При активации рецепторов, связанных с О-белками, Са" -чувствительность сократительного аппарата с возрастом уменьшается. Совершенно иная картина, чем при нерецепторной стимуляции, наблюдается при сокращении сосудов в ответ на метоксамин (рис. 2 А-В). У крыс разного возраста одинаковая сила сокращения (рис. 2А) развивалась при существенно различающемся изменении [Са2+];, что следует из изменений Р340/Р380 (рис. 2Б). У взрослых крыс сокращение развивалось на фоне значительного повышения [Са2+];, в то время как у новорожденных крысят [Са' ], практически не изменялась. Соответственно, угол наклона зависимости «сила сокращения-Р340/Т380» у трех групп крыс сильно различается: у новорожденных крысят эта зависимость расположена почти вертикально, а у взрослых - наиболее пологая (рис. 2В).

Сходные результаты были получены при действии агониста рецепторов тромбоксана - Ш6619 (рис. 2Г). Таким образом, феномен снижения Са2+-чувсгвительности с возрастом не специфичен для осрадренорецепторов,

А

1,0 0,8

к

5

|0,6

ГО

а

8°>4 го

с;

U 0,2 0,0

т-1-1-1

0,1 0,33 1 3,3 10 33

Метоксамин (мкМ)

0,0

0,1 0,33 1 3,3 10 33 Метоксамин (мкМ)

—•—3-8 дней —о—11-14 дней - -О - взрослые

0,0 0"-1-1-1-1-1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Изменение F340/F380

Метоксамин

Ж

U46619

Т-

0,1 0,2 0,3 Изменение F340/F380

80,4

СП С

0 0,2

Рисунок 2. Изменения силы сокращения и F340/F380 ([Ca2+]i) у крыс разного возраста, зарегистрированные при действии метоксамина (А-В) и U46619 (Г). И экспериментах с метоксамином использованы 6 препаратов новорожденных, 4 - 2-недельных и б ■ взрослых крыс; в экспериментах с Ö46619 число препаратов равно 7. б и б, соответственно. Значения силы и F340 F3H0 нормированы на соответствующие значения при действии ЮмкМ серопютша в ¡20 мМ KCl. * р<0,05 по сравнению с взрослыми.

поскольку он наблюдается и при активации рецепторов другого типа. Это свидетельствует о том, что механизмы, ответственные за изменение Са2+-чувствительности при созревании гладкой мышцы сосудов, являются общими и реализуются не на уровне рецепторов и активируемых ими в-белков, а на последующих этапах фармакомеханического сопряжения.

Для количественного анализа зависимостей «сила сокращения-Р340уТ380» и статистической обработки данных у трех групп крыс определяли изменение Р340/Т380 ([Са2+],), необходимое для повышения натяжения стенки до 40% от максимума (т.е. до значения «0,4» на рис. 1, 2В и 2Г). Результаты вычислений приведены на рис. 3. Видно, что при действии метоксамина изменение [Са2+]| у новорожденных и 2-недельных крыс значительно меньше по сравнению со взрослыми (в среднем на 94% и 52% соответственно). Такая же закономерность наблюдается и при действии Ш6619: в этом случае у новорожденных крыс повышение [Са2+]| на 80 % меньше, чем у взрослых, а у 2-недельных - на 42%. В экспериментах с повышением внеклеточной концентрации С а' различий между группами крыс не наблюдается.

□ 3-8 дней

Метоксамин 1146619 Са2+

Рисунок 3. Изменение Р340/Т380 ([Са2+],), необходимое для развития силы, составляющей 40% от максимального значения, при сокращении в ответ на метоксамин, 1146619 и на повышение наружной концентрации Са2+ на фоне деполяризации (120мМ КС1) для препаратов подкожной артерии новорожденных, 2-недельных и взрослых крыс. * р<0,05 по сравнению с взрослыми; @.р '0.05 по сравнению с изменением Р340 Р380 у этой группы крыс при нерецепторной стимуляции.

Почученные результаты свидетельствуют о том, что созревание симпатической иннервации сопровождается уменьшением Са2-чувипвительности сократительного аппарата гладкочышечных клеток сосудов

Данные литературы о возрастном изменении Са2+-чувствительности при сокращении гладкой мышцы не очень многочисленны, но единодушны Снижение значимости это1 о механизма с возрастом показано для артерий мозга овцы и кролика (Akopov et al, 1997-1998, Sandovall et al, 2007), бедренной артерии кролика (Akopov et al, 1998), портальной вены крысы (Brus, Nixon, 1997), то есть оно характерно для гладкой мышцы артерий эластического и мышечного типа, а также вен Однако наша работа является первой, где обнаружены возрастные изменения Са2+-сенситизации при сокращении периферических резистивных сосудов

Изменение Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии крысы при симпатической денервацни

После удаления поясничных симпатических ганглиев внутренний диаметр контрольных (548,2±20,4 мкм, п=8) и денервированных (529,6±24,0 мкм, п=9) препаратов не различался Также не обнаружено различий в величине максимального сокращения препаратов контроль - 8,70±0,46 мН/мм, после денервации - 7,97±0,51 мН/мм Это свидетельствует о том, что сравнительно кратковременное (в течение 2-3 нед) устранение симпатической иннервации у взрослых крыс не приводит к структурным изменениям стенки артерии (а именно, толщины медии)

Даже в отсутствие стимуляции денервированные препараты развивали спонтанный миогенный тонус В среднем миогенное сокращение денервированных препаратов составило 1,01 ±0,17 мН/мм (п=8), тогда как для иннервированных препаратов оно было незначительным (0,22±0,05 мН/мм, п=9, р<0,05) Базальное значение [Ca2+]t в денервированных сосудах (121,0±15,2 нМ, п=9) также было выше, чем в контроле (79,4±11,6 нМ, п=8, р<0,05) Феномен усиления миогенной активности сосудов после денервации был описан ранее (Fleming, 1999) Его причиной служит стойкая деполяризация мембраны I ладкомышечных клеток, которая провоцирует вход в клетки Са2+ через потенциалуправляемые каналы (в основном, L-типа)

Денервация сосудов взрослых крыс приводит к Со2 ' -сенситизации сокращения г падкой мышцы.

Как видно из рис 4А, денервированные сосуды характеризуются более высокой чувствительностью к метоксамину Повышение [Ca2+]j при низких концентрациях метоксамина для денервированных сосудов также несколько больше, чем в контроле Однако при дальнейшем повышении концентрации метоксамина кривые пересекаются и, начиная с концентрации 1,6 мкМ, зависимость для денервированных сосудов лежит значительно ниже, чем для контрольных сосудов

1,2 -| —»—Контроль

—О— Денервация

0,05 0,2 0,8 3,2 12,8 Метоксамин (мкМ)

-т-Е-1-Г-

0,05 0,2 0,8 3,2 12,8 Метоксамин (мкМ)

Метоксамин

1,2 1

0 100 200 300 400 500 600 700 Изменение [Са2+]* (нМ)

и46619

0 50 100 150 200 250 300 350 Изменение [Са2+], (нМ)

Рисунок 4. Изменения силы сокращения и [Са~ ]| для денервированных и иннервированных артерий взрослых крыс, зарегистрированные при действии метоксамина (А-В) и Ш6619 (Г).

В экспериментах с метоксамином использованы 5 денервированных и 3 контрольных препарата, в экспериментах с 1146619 число препаратов равно 5 и 6, соответственно. Значения сичы нормированы на величину максимального сокращения при действии метоксамина (А, В) или 1)46619 (Г). * р<0,05 по сравнению с контролем.

Угол

наклона зависимости «сила сокращения-[Са'

2+1

ДЛЯ

денервированных препаратов значительно больше, чем в контроле (рис 4В) Такой характер расположения кривых свидетельствует о том, что для развития сходного усилия денервированным препаратам требуется меньшее повышение [Са2+]1 Сходные результаты получены при действии агониста тромбоксановых рецепторов (рис 4Г)

Для сравнения кальций-зависимости сокращения гладкой мышцы ин нервированных и денервированных сосудов вычисляли изменение [Са2+]ь необходимое для развития натяжения стенки сосуда до 40% от максимума, а также вычисляли изменение [Са2+]ъ необходимое для 80% максимального сокращения

Как видно из рис 5, повышение [Са2+]ъ соответствующее 40% сокращению, в денервированных сосудах по сравнению с иннервированными при действии метоксамина уменьшено в среднем на 56%, а при действии 1146619 - на 30% В случае 80% сокращения различия между двумя группами сосудов еще более значительные для метоксамина - 64%, а для Ш6619 - 45% Таким образом, после денервации сокращение гладкой мышцы меньше зависит от повышения [Са2+]ь чем в контроле

600 -i

500 ■

400 -

Чв

£ 300

■ Контроль □ Денервация

Метоксамин 40%

U46619

Метоксамин 80%

U46619

Рисунок 5. Изменение [Са2+]ь необходимое для развития силы, составляющей 40% и 80% от максимального значения, при сокращении иннервированных и денервированных сосудов в ответ на метоксамин и U 46619

* р<0,05 по сравнению с контролем

Ранее проблема Са2+-чувстви*гельности сокращения гладкой мышцы после денервации исследовалась лишь в одной работе (Ramos et al, 1985) В ней использовали препараты семявыносящего протока, но не сосудов, после грубого скинирования тритоном Х-100 Оцениваемая таким образом Са2+-чувствительность сократительного аппарата оказалась выше для

денервированных препаратов Однако так и осталось невыясненным, как при денервации работают сигнальные пути, запускаемые регуляторами-лигандами рецепторов наружной мембраны и обеспечивающие Са2+-сенситизацию сократительного аппарата

Сопоставчение данных, полученных в двух сериях экспериментов (с исмпъзованиеы сосудов новорожденных крыс и денервированных сосудов) позволяет сделать сгедующее заключение В обоих случаях при действии агонистов гладкая мышца сосудов, лишенных симпатической иннервации, по сравнению с иннервированными сосудами, развивает сокращение на фоне менее значитечьного повышения /Со2*],

Влияние возраста и денервации на экспрессию сократительных и регуляторных белков в гладкомышечных клетках подкожной артерии

Наши результаты свидетельствуют о том, что процесс дифференцировки гладкомышечных клеток в подкожной артерии крысы к моменту рождения еще не завершен Особенно ярко на это указывают данные об экспрессии изоформ кальдесмона (рис 6 А-Б) У новорожденных крыс в значительном количестве экспрессируется /-изоформа, которая не характерна для дифференцированных гладкомышечных клеток (Цек1 е1 а!, 1987, Црта е! а1, 2001) Созревание гладкой мышцы сопровождается переключением экспрессии кальдесмона на /?-изоформу

Вместе с тем, в сосудах новорожденных крыс уже имеется сформированный сократительный аппарат, о чем свидетельствует достаточно высокий уровень экспрессии тяжелых цепей гладкомышечного миозина (данные не представлены) Интересно, что содержание РЛЦ миозина у новорожденных крыс значительно выше, чем у взрослых (данные не представлены), то есть соотношение РЛЦ и тяжелых цепей миозина в гладкомышечных клетках сосудов новорожденных крыс значительно увеличено по сравнению со взрослыми Можно предположить, что значительная часть миозина в сосудах новорожденных животных представлена немышечной изоформой, которая замещается гладкомышечной на ранних этапах постнатального развития (Е<Мт§ег, Меег, 2007, НШапи е1 а1, 2007) При этом немышечный миозин также может участвовать в развитии сокращения его ингибирование блеббисгатином не влияет на сократительный ответ гладкомышечных препаратов мочевого пузыря взрослых мышей, но уменьшает его у новорожденных (Ектап й а1, 2005)

После денервации экспрессия тяжелых и РЛЦ миозина не изменяется (данные не представлены), что согласуется с отсутствием изменений максимального сокращения

( одержание белков, регулирующих Са2' -зависимое сокращение гладкой мышцы

Созревание гладкой мышцы сопровождается увеличением экспрессии двух основных мишеней комплекса Са2+-кальмодулин КЛЦМ (рис 6В) и к-кальдесмона (рис 6Б) В сосудах новорожденных крыс содержание КЛЦМ

уменьшено на 42%, а /г-кальдесмона - на 57% по сравнению со взрослыми животными Такое повышение экспрессии КЛЦМ согласуется с данными литературы (Belik et al, 2005) Денервация гладкой мышцы сосудов приводит к обратному изменению (снижению) экспрессии обоих белков - и КЛЦМ, и h-кальдесмона (рис 6Б,В)

Экспрессии регуляторной субъединицы ФЛЦМ (MYPT) у новорожденных крысят также снижена по сравнению со взрослыми животными (на 30% -рис 6Г) Денервация приводит к двукратному снижению экспрессии MYPT по сравнению с контролем

lakitM образом, созревание гладкой мышцы сосудов в постнатальном периоде сопровождается повышением экспрессии белков, регулирующих Са2+-зависимое сокращение гладкой мышцы Денервация сосудов обращает эти изменения то есть приводит к снижению экспрессии этих белков

С Содержание белков, потенциирующих сокращение по Са2^ -независимому пути

Согласно данным, представленным на рис 7А, экспрессия Rho-киназы в сосудах крысят (новорожденных и 2-недельных) увеличена по сравнению со взрослыми крысами приблизительно в 1,6 раза Однако между денервированными и иннервированными сосудами взрослых крыс различий в экспрессии этого белка не обнаружено

Экспрессия МАР-киназ с возрастом значительно падает (рис 7Б и 7В) У новорожденных крысят содержание МАРК р42/44 и МАРК р38 больше, чем у взрослых в 4,6 и 3,7 раза соответственно Существенные различия в экспрессии этих регуляторных белков наблюдаются также между контрольными и денервированными сосудами взрослых крыс После денервации экспрессия обеих МАРК возрастает МАРК р42/44 - в 1,7 раза, а МАРК р38 - в 1,9 раза Таким образом, с возрастом экспрессия МАРК в гладкомышечных клетках снижаегся, но вновь возрастает после денервации сосудов

Таким образом, с возрастом происходит снижение экспрессии регуля горных белков, обеспечивающих Са2+-независимую регуляцию сокращения гладкой мышцы по миозиновому (Rho-киназа) и актиновому (МАР-киназы) механизмам Интересно, что денервация сосудов приводит к увеличению экспрессии МАР-киназ

В данной работе был исследован уровень экспрессии регуляторных белков, но не уровень их активности в гладкомышечной ткани Следует заметить, что увеличение экспрессии MYPT с возрастом обычно сопровождается повышением общей активности ФЛЦМ (Belik et al, 2005, Ekman et al, 2005, Payne et al, 2006), причем это может наблюдаться и при неизменном содержании каталитической субъединицы ФЛЦМ (Belik et al, 2005)

Далее, мы имеем косвенные свидетельства тому, что активность Rho-киназы в подкожной артерии крысы с возрастом также снижается. Согласно результатам, полученным С В Мочаловым (пока не опубликовано), селективный ингибитор Rlio-киназы Y27632 намного сильнее подавляет сокращение препаратов подкожной артерии у новорожденных крыс, чем у взрослых Примечательно, что такое уменьшение сократительного ответа не

0,8 -| 0,7 0,6 0,5 0,4 -0,3 -0,2 0,1 0,0

*#

/-кальдесмон

■.г

ЕЯ

■Я' - .1

V V

дай

3-5 д

п=7

11-14 д ВК

п=8 п=19

вд

п=22

I 2

В

1,2 1,0

г

? 0,8

0,6 ■

ч:

3 0.2

0,0

' Щ

4

клцм

к'. ■ *

¡■Ш ■

3-5 д 11-14 д ВК ВД

11=7 п=8 п=19 п=21

то •]

Ь о,

о

(в ' К

«о,

' 0,0

Ь -кальдесмон

еЬ

т

3-5 д 11-14 д

ВК

п=19

12 3 4

Г

1,2, МУРТ

ь- 1,0 -

о.

>-

^ 0,8 -ф

I 0,6

ГО

х

о 0.4

4

5 0,2 -

0,0

шЩ

гЬ

3-5 д 11-14 д ВК

ВД

п=22

ВД

п=6

Рисунок 6. Содержание /-кальдесмона (А), /г-кальдесмона (Б), киназы легких цепей миозина (В) и регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина - МУРТ (Г) в образцах подкожной артерии крыс в возрасте 3-5 дней, 11-14 дней, взрослых контрольных (ВК) и взрослых после денервации (ВД). Содержание белков нормировано на среднее значение в группе ВК (за исключением /-кальдесмона, содержание которого нормировано на среднее для /г-кальдесмона в группе ВК).

Условные обозначения: 1 — 3-5 дней; 2 - 11-14 дней; 3 — взрослые-контроль, 4 - взрослые-денервация. *р<0,05 по сравнению с ВК, * р<0,05 по сравнению с крысами в возрасте 11-14 дней; п — число образцов в группе.

2,0 п

а 1,6 -

О 1,2 а.

\ 0,8 •

К а

0,0

(ЧИо-киназа

-

X >

3-5 д 11-14 д ВК ВД

п=7 ¡1=8 п=7 п=7

В

х.

а. <

ч

о

и

?«> • ч

МАРК р42/44

г

3-5 д 11-14 д

1

п=6

3

п=7

*

"I

1 ВК ВД

п=13 п=15

5,0

00

о. 4,0 *

о.

| 3,0 0>

I 2,0 *

о. о

§ 1.0 о

0,0

МАРК р38

"а»1 "•■

3-5 д 11-14 д вк

п=6 п=7 п=13

ВД

¡1=14

1 2

3

Рисунок 7. Содержание Шю-киназы (А) и митоген-активируемых протеинкиназ: МАРК р42/44 (Б) и МЛРКр38 (В) в образцах подкожной артерии у в образцах подкожной артерии крыс в возрасте 3-5 дней, 11-14 дней, взрослых контрольных (ВК) и взрослых после денервации (ВД). Содержание белков нормировано на среднее значение в группе ВК.

Условные обозначения: 1 — 3-5 дней; 2 — 11-14 дней; 3 - взрослые-контролъ; 4 - взрослые-денервация. *р<0,05 по сравнению с ВК; п число образцов в группе.

сопровождается снижением [Са2+], Об уменьшении роли Шю-киназного пути в сокращении гладкой мышцы при взрослении организма свидетельствуют и данные литературы (ВеИк еГ а1, 2005, Ектап е1 а1, 2005)

В отличие от МАР-киназ, экспрессия Шю-киназы после денервации не изменяется Тем не менее, ранее было показано, что, как и сосуды новорожденных крыс, денервированные сосуды более чувствительны к ингибирующему действию У27632 (Тагазоуа й а1, 2006) В связи с этим нельзя исключить, что после денервации роль Шю-киназного сигнального пути все же повышается, но не за счет увеличения экспрессии самой Шю-киназы, а в результате обнаруженного нами снижения экспрессии МУРТ, путем фосфорилирования которой Шю-киназа ингибирует ФЛЦМ и тем самым провоцирует сокращение гладкой мышцы

В данной работе остался неисследованным еще один Са2+-независимый механизм - ингибирование ФЛЦМ через протеинкиназу С Однако наши результаты, а также данные литературы дают основание полагать, что в регуляции сокращения подкожной артерии крысы этот путь задействован в меньшей степени, чем ингибирование ФЛЦМ Шю-киназой Ни у новорожденных, ни у взрослых крыс, как в контроле, так и после денервации, ингибитор протеинкиназы С ОР 109203Х не оказывает видимых эффектов на сокращение препаратов подкожной артерии (С В Мочалов, пока не опубликовано, Тагазоуа е1 а1, 2006) Основываясь на этих наблюдениях, мы пришли к заключению, что протеинкиназа С не играет большой роли в регуляции сократительной активности подкожной артерии крысы и сочли возможным исключить ее из числа анализируемых регуляторных каскадов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты, полученные в данной работе, суммированы в приведенной ниже таблице Видно, что в большинстве случаев созревание симпатической иннервации в постнатальном периоде и денервация приводят к противоположным изменениям регуляции сокращения гладкой мышцы и уровня экспрессии ключевых регуляторных белков

С возрастом происходит десенситизация сократительного аппарата подкожной артерии к Са2+ (т е , снижается Са2+-чувствительность сокращения за счет подавления Са2+-независимых сигнальных каскадов, запускаемых рецепторами, связанными с Сг-белками) После устранения симпатической иннервации во взрослом возрасте происходит обратный процесс Са2+-сенситизации сократительного аппарата и Са2+-чувствительнос1ь сокращения, напротив, увеличиваются Такие противоположные изменения дают основание полагать, что трофическое влияние симпатических нервов имеет важное значение для постнатального формирования механизмов регуляции сокращения гладкой мышцы, характерных для данного сосуда

Таблица 2 Изменение регуляции сокращения подкожной артерии крысы, происходящие с возрастом (при созревании симпатической иннервации сосудов) и после денервации

ПАРАМЕТРЫ Изменения с возрастом Изменения после денервации

С а' -сснситизация сокращения 1 1

1яж'е >ые цепи миозина = =

Регу шторные легкие цепи миозина II =

И-качьдесмон 1 1

Киназа /егких цепей миозина 1 1

Регучяторная субъединица фосфатазы ¡егких цепей миозина 1 1

Кко-киназа 1 =

МАРКр42 44 II 1

МАРК р38 II 1

Са2+-зависимая регуляция

Са -независимая регуляция

Трофическое влияние симпатических нервов реализуется через изменение белкового состава гладкомышечных клеток При этом следует отметить, что зависимость экспрессии разных белков от иннервации неодинакова Из таблицы 2 видно, что содержание основных сократительных белков, исследованное в данной работе на примере миозина, после денервации не изменяется То есть структура сократительного аппарата сосудов определяется не только влиянием иннервации, но и действием других факторов

Вместе с тем, очевидно, что влияние симпатических нервов приводит к изменению экспрессии многих регуляторных белков При этом изменения, характерные для данного белка, определяются его ролью в регуляции сокращения гладкой мышцы

При созревании симпатической иннервации сосудов повышается значимость Са2+-зависимых механизмов сокращения гладкой мышцы Во-первых, растет экспрессия КЛЦМ, что обеспечивает увеличение фосфорилирования РЛЦ миозина Во-вторых, увеличивается содержание кальдесмона, который совместно с Са2+-кальмодулином регулирует тропомиозиновый блок актомиозинового взаимодействия

Примечательно, что содержание регуляторной субъединицы ФЛЦМ (МУРТ) с возрастом также растет, чго, вероятно, соответствует повышению активности ФЛЦМ То есть происходит однонаправленное изменение активности двух ключевых ферментов, регулирующих фосфорилирование РЛЦ миозина Вероятно, именно этим объясняется тот факт, что базальная Са2+-зависимость сократительного аппарата (регистрируемая при КС1-деполяризации) с возрастом не изменяется

Значимость механизмов, регулирующих сокращение относительно независимо от изменений внутриклеточной концентрации Са2+, с возрастом, напротив, падает, а после денервации растет В сосудах, лишенных иннервации, увеличено содержание МАР-киназ, которые могут усиливать сокращение путем ослабления кальдесмон-тропомиозинового блока и/или активации КЛЦМ, влияние МАР-киназ может облегчаться вследствие снижения содержания капьдесмона Кроме того, в неиннервированных сосудах может быть увеличена просократительная роль Юю-киназного механизма Усиление Са2+-независимой регуляции должно облегчать поддержание тонического сокращения сосудов Следует отметить, что такой способ сокращения выгоден в энергетическом отношении, поскольку не требует дополнительных затрат АТФ на фосфорилирование РЛЦ миозина

В каких же физиологических условиях может использоваться такой способ регуляции сокращения"? Очевидно, что повышение роли Са2+-сенситизации в сокращении гладкой мышцы может обеспечивать поддержание тонуса сосудов и уровня артериального давления в период, когда еще отсутствует вазомоторная симпатическая регуляция Оно может усиливать действие циркулирующих в крови вазоконстрикторных веществ катехоламинов надпочечников, ангиотензина II и других

Если нарушение иннервации сосудов происходит во взрослом возрасте, сниженная вследствие симпатических влияний Са2+-чувствительность сократительного аппарата вновь растет, что также способствует тоническому сокращению сосудов и обеспечивает поддержание кровотока через орган

С другой стороны, для быстрой регуляции тонуса сосудов наиболее оптимален Са2+-зависимый механизм, поскольку Са2+-независимая регуляция сокращения более инертна Она, как правило, реализуется в сосудах тонического типа и сопряжена с медленным расслаблением гладкой мышцы Поэтому снижение Са2+-чувствительности сократительного аппарата сосудов может быть необходимым условием для динамической регуляции тонуса сосудов симпатическими регуляторными влияниями Возможно, в разных сосудах этот феномен реализуется неодинаково, поскольку плотность иннервации артериальных сосудов в разных органах может существенно различаться (Фолков, Нил, 1976) Можно предположить, что снижение Са2+-чувствительности сокращения характерно в основном для сосудов, тонус которых во взрослом организме регулируется преимущественно нервным механизмом В частности, к таким сосудам относятся артерии, приносящие кровь к коже, одной их которых и является подкожная артерия крысы

выводы

1 Сплетение адренергических волокон в стенке подкожной артерии крысы формируется в течение первого месяца постнатального развития

2 При деполяризации наружной мембраны КС1 сокращение сосудов новорожденных и взрослых крыс развивается на фоне одинакового повышения [Са2+], Однако при активации рецепторов, сопряженных с в-белками, достижение одинаковой силы сокращения требует большего повышения [Са2+], у взрослых крыс, чем у новорожденных, что свидетельствует о снижении роли Са2 -сеисити?,ации в сокращении сосудов при постнатальном созревании

3 Денервация подкожной артерии у взрослых крыс, напротив, приводит к повышению Са2+-сенситизации сокращения гладкой мышцы сосудов

4 Постнатальное созревание гладкой мышцы сосудов сопровождается переключением экспрессии кальдесмона с I- на /г-изоформу Экспрессия тяжелых цепей гладкомышечного миозина с возрастом не изменяется, а регуляторных легких цепей миозина значительно падает С возрастом в подкожной артерии происходит увеличение экспрессии белков, регулирующих Са2+-зависимое сокращение гладкой мышцы (киназы легких цепей миозина, регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина и /г-кальдесмона), и снижение экспрессии белков, обеспечивающих Са2+-сенситизацию сократительного аппарата (МАР-киназ и Шю-киназы)

5 После денервации происходят обратные изменения в экспрессии киназы легких цепей миозина, регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина, Ь-кальдесмона и МАР-киназ Эти белки могут рассматриваться как внутриклеточные мишени трофического влияния симпатических нервов на кровеносные сосуды

Автор искренне благодарен профессору Р Шуберту (Институт физиологии университета г Росток), профессору К Олкеру (Институт физиологии университета г Орхус), профессору В П Ширинскому (ФГУ РКНПК РЗ РФ) и Т В Кудряшовой (ФФМ МГУ им М В Ломоносова) за предоставленную возможность проведения исследований и неоценимую помощь в планировании экспериментальной работы и обсуждении результатов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Тарасова О С , Солуянова И А, Пуздрова В.А., Боровик А С , Швалев В Н

Последствия денервадии подкожной артерии крысы при нормальном и сниженном давлении крови Тезисы докладов конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы», Донецк, 3-6 июня 2003 г , с 50

2 Тарасова О С , Пуздрова В.А., Каленчук В У Повышение чувствительности

сосудов к констрикторным влияниям после денервации и снижении давления крови Тезисы докладов конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург, 29 сентября-01 октября 2003 г, с 316-

3 Пуздрова В.А., Тарасова О С Влияние трансмурального давления на характеристики нервного сплетения в стенке подкожной артерии крысы Тезисы докладов III Всероссийской школы-конференции по физиологии кровообращения, Москва, 27-30 января 2004 г, с 82

4 Taiasova О S , Kalentchuk V U, Puzdrova V.A., Borovik A S The impact of chronically lowered transmural pressure on post-denervation hypersensitivity of vascular smooth muscle to constrictor agents Abstracts of the International Symposium "Biological motility", Puschmo, 2004, p 157-158

5 V.A. Puzdrova, О S Tarasova, R Schubert Calcium sensitivity of smooth muscle contraction ю vessels from newborn rats International Symposium "Biological Motility Basic Research and Practice" Pushchmo, May 11-15, 2006, p 137-138

6 Тарасова О С, Пуздрова В.А., Каленчук В У, Кошелев В Б Повышение чувствительности гладкой мышцы сосудов к констрикторным влияниям после денервации и при снижении давления крови Биофизика, 2006, т 51 (№5), с 912-

7 ОС Тарасова, В.А. Пуздрова, С В Мочалов, Д К Гайнуллина, Р Шуберт, В У Каленчук, Т В Кудряшова, А В Воротников К вопросу о трофическом влиянии симпатических нервов на кровеносные сосуды регуляция чувствительности сократительного аппарата к ионам кальция - Нейронауки теоретические и клинические аспекты 2007, т 3 (№1), с 49

8 ОС Тарасова, В.А. Пуздрова, С В Мочалов, В У Каленчук, Т В Кудряшова, А В Воротников Внутриклеточные мишени трофического влияния симпатических нервов на кровеносные сосуды Тезисы докладов XX Съезда Физиологического общества им И П Павлова, Москва, 4-8 июня 2007 г, с 440

9 Тарасова О С , Пуздрова В.А., Мочалов С В , Гайнуллина Д К , Шуберт Р , Каленчук В У, Кудряшова Т В , Воротников А В Трофическое влияние симпатических нервов на кровеносные сосуды связано с изменением активности белков, регулирующих актомиозиновое взаимодействие в гладкомышечных клетках - V Всероссийская конференция с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» Санкт-Петербург, Россия, 16-19 октября 2007 г, с 306-307

10 В.А. Пуздрова, Р А Каргина-Терентьева, О С Тарасова Влияние хронической гипотензии на адренергическое нервное сплетение а saphena, и его регенерацию после повреждения бедренного нерва Морфология Архив анатомии, гистологии и эмбриологии (Принято к печати)

317

917

Подписано в печать 15 10 2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л Тираж 100 экз. Заказ № 674 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пуздрова, Виктория Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Формирование симпатической иннервации сосудов в онтогенезе.

1.1.1.Формирование сплетения постганглионарных симпатических волокон в разных сосудах.

1.1.2 Функциональное созревание симпатической иннервации сосудов.

1.2 Трофическое влияние симпатических нервов на гладкомышечные клетки сосудов

1.3 Регуляция актин-миозинового взаимодействия в гладкомышечных клетках.

1.4 Возрастные изменения гладкой мышцы сосудов.

1.4.1 Изменение содержания белков сократительного аппарата при дифференцировке гладкомышечных клеток сосудов.

1.4.2 Са -чувствительность сократительного аппарата гладких мышц.

1.4.3 Возрастные изменения Са -чувствительности сокращения гладкой мышцы.

1.4.4 Возрастные изменения экспрессии/активности белков, регулирующих Са -чувствительность сокращения гладких мышц сосудов.

1.5 Изменение Са -чувствительности сокращения гладкой мышцы после симпатической денервации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Общие методические подходы.

2.1.1 Объект исследования.

2.1.2 Животные.

2.1.3 Визуализация нервных волокон в стенке сосуда.

2.1.4 Модель хирургической денервации подкожной артерии.

2.2 Эксперименты на изолированных сосудах.

2.2.1 Исследование вазомоторных реакций с помощью системы «wire myograph».

2.2.1.1 Принцип метода.

2.2.1.2 Нормализация (определение оптимального растяжения сосуда).

2.2.2 Исследование изменений [Ca2+]j при сокращении сосудов крыс разного возраста

2.2.2.1 Подготовка к эксперименту, используемые растворы.

2.2.2.2 Измерение [Ca2+]i.

2.2.2.3 Протокол эксперимента.

2.2.2.4 Обработка результатов.

2.2.3 Исследование изменений [Са ]j при сокращении иннервированных и денервированных сосудов.

2.2.3.1 Подготовка к эксперименту, используемые растворы.

2.2.3.2 Измерение [Ca2+]j.

2.2.3.3 Протокол эксперимента.

2.2.3.4 Обработка результатов.

2.2.3.5 Проверка эффективности денервации.

2.2.4 Реактивы, использованные в экспериментах на изолированных сосудах.

2.3 Исследование экспрессии белков в гладкомышечных клетках сосудов.

2.3.1 Приготовление образцов ткани.

2.3.2 Приготовление экстрактов ткани.

2.3.3 Электрофоретическое разделение белков.

2.3.4 Иммуноблоттинг.

2.3.5 Определение концентрации общего белка.

2.3.6 Обработка результатов.

2.3.7 Материалы и реактивы, использованные в биохимических исследованиях.

2.4 Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Морфологическое исследование иннервации подкожной артерии у крыс разного возраста.

3.2 Исследование изменений [Ca2+]j при сокращении сосудов крыс разного возраста

3.2.1 Изменения [Са ]i и натяжения стенки сосуда при добавлении в раствор разных концентраций метоксамина.

3.2.2 Изменения [Ca2+]j и натяжения стенки сосуда при добавлении в раствор разных концентраций U46619.

3.2.3 Изменения [Ca2+]j и натяжения стенки сосуда при нерецепторной стимуляции

3.2.4 Количественный анализ кальций-зависимости сокращения гладкой мышцы сосудов у крыс разного возраста.

3.3 Исследование изменений [Ca2+]j при сокращении иннервированных и денервированных сосудов взрослых крыс.

3.3.1 Свидетельства эффективности денервации подкожной артерии.

3.3.2 Особенности сосудов и методики исследования.

3.3.2 Изменения натяжения стенки сосуда и [Ca2+]j при при добавлении в раствор разных концентраций метоксамина.

3.3.3 Изменения натяжения стенки сосуда и [Са2+]; при добавлении в раствор разных концентраций U46619.

3.3.4 Количественный анализ кальций-зависимости сокращения гладкой мышцы иннервированных и денервированных сосудов.

3.4 Влияние возраста и денервации на экспрессию сократительных и регуляторных белков в гладкомышечных клетках подкожной артерии.

3.4.1 Экспрессия гладкомышечного миозина и кальдесмона.

3.4.2 Экспрессия киназы и регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина.

3.4.3 Экспрессия митоген-активируемых протеинкиназ и Rho-киназы.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Основные результаты работы.

4.2 Характеристика иннервации и сократительного аппарата подкожной артерии у крыс разного возраста.

4.3 Са2+-чувствительность сокращения подкожной артерии у крыс разного возраста

4.4 Экспрессия регуляторных белков в подкожной артерии крыс разного возраста.

4.5 Изменения Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии крысы после денервации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трофическое влияние симпатической иннервации на кальциевую чувствительность сократительного аппарата подкожной артерии крысы"

Известно, что симпатические нервы оказывают трофическое влияние на кровеносные сосуды: они регулируют пролиферацию, рост и дифференцировку гладкомышечных клеток (Орбели, 1962, Bevan 1984; Damon 2005). У многих млекопитающих, в том числе у крыс, становление симпатической иннервации органов происходит только после рождения, в раннем постнатальном периоде (Todd, 1980; Hill et al, 1983, Hill, 1999, Luff 1999, Sandow, Hill 1999), что совпадает во времени с процессом дифференцировки гладкой мышцы сосудов (Owens, 1995). Известно, что симпатическая иннервация необходима для формирования сократительного фенотипа гладкомышечных клеток в онтогенезе (Bevan 1984; Damon 2005), однако ни молекулярные мишени трофических воздействий, ни их взаимодействие на внутриклеточном уровне практически не исследованы. Кроме того, остается совершенно неясной роль симпатической иннервации в формировании функциональной активности сосудов. Сосудистые гладкие мышцы обладают характерной способностью к длительному поддержанию напряжения, т.е. тоническому сокращению. Поскольку нарушение тонического сокращения может быть причиной как локальных вазоспазмов, так и системных сердечно-сосудистых нарушений, выяснение физиологических механизмов формирования тонуса является весьма актуальным.

Данная работа направлена на проверку гипотезы о том, что трофическое влияние симпатических нервов связано с формированием определенного баланса Са -зависимых и Са2+-независимых механизмов регуляции сокращения гладкой мышцы сосудов за счет изменения уровня экспрессии их ключевых молекулярных компонентов. Мы предполагаем, что этот баланс определяет чувствительность сократительного аппарата к ионам Са2+ и является важным механизмом формирования адекватной регуляции тонуса сосудов в онтогенезе, а повреждение симпатической иннервации приводит к его нарушению.

Трофическое влияние симпатических нервов в основном реализуется на пострецепторных этапах регуляции сокращения, поскольку рецепторный аппарат гладкомышечных клеток достаточно консервативен. Показано, что ai-адренорецепторы, которые в основном опосредуют вазомоторные и трофические эффекты симпатических нервов (Yu et al., 1996; Chen et al., 1995), не претерпевают значительных изменений ни в ходе становления иннервации сосудов, ни после денервации во взрослом возрасте (Bobik, Anderson, 1983; Nasseri et al., 1985; Phillips et al., 1996; Phillips, Hill, 1999).

Всю последовательность событий от активации рецепторов наружной мембраны до сокращения гладкой мышцы можно разделить на два этапа. На первом этапе происходит повышение концентрации свободного кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток ([Са ]j]) (Thorneloe, Nelson, 2005). Здесь трофическое влияние симпатических нервов проявляется в контроле экспрессии канальных и транспортных белков, которые обеспечивают типичные для гладкомышечных клеток уровень мембранного потенциала и кальциевый гомеостаз (Fleming, 1999).

На втором этапе Са2+ взаимодействует с сократительным аппаратом, что приводит к сокращению. Симпатические нервы контролируют экспрессию гладкомышечных изоформ актина и миозина (Damon 2005). Однако вопрос о том, влияют ли они на активность механизмов, регулирующих актомиозиновое взаимодействие в гладкомышечных клетках, и осуществляется ли такое влияние через изменение экспрессии соответствующих регуляторных белков, к началу данной работы оставалось неисследованным.

Ключевым Са2+-связывающим белком гладкомышечных клеток является кальмодулин (Гусев, 2001). Основной мишенью комплекса Са -кальмодулин является киназа легких цепей миозина (КЛИМ), которая фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина (Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007), активируя миозиновый мотор и сокращение гладкой мышцы. Еще одной мишенью Са2+-кальмодулина является кальдесмон, который локализуется на нитях актина и вместе с тропомиозином блокирует участки сильного связывания миозина на актине, как это делает тропонин-тропомиозиновый комплекс в поперечно-полосатой мускулатуре. Взаимодействие кальдесмона с комплексом Са2+-кальмодулин устраняет тропомиозиновый блок и тем самым делает возможным взаимодействие миозина с актином (Воротников и др., 2002). Снижение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме сопровождается инактивацией КЛЦМ и восстановлением ингибирующего действия кальдесмон-тропомиозина. Последующее расслабление определяется дефосфорилированием РЛЦ Са -независимой фосфатазой легких цепей миозина (ФЛЦМ), инактивацией миозина и переходом тонких филаментов в неактивное состояние.

Описанные выше механизмы обеспечивают Са -зависимую регуляцию сокращения, которая происходит, например, при деполяризации наружной мембраны гладкомышечных клеток. Однако на самом деле процесс регуляции сокращения гладких мышц более сложный, поскольку в естественных условиях активация рецепторов наружной мембраны, ассоциированных с G-белками, приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов и изменению амплитуды и/или длительности

Л I сократительного ответа без существенных изменений [Са ]j (Somlyo, Somlyo 2003; Воротников и др. 2002). Этот феномен известен как «изменение Са -чувствительности сократительного аппарата гладкомышечных клеток» (Horowitz et al., 1996) и является одним из наиболее интенсивно исследуемых вопросов физиологии гладкой мышцы. При этом увеличение силы сокращения на фоне относительно неизменной [Са ]; (повышение Са -чувствительности) обозначается как Са2+-сенситизация, а уменьшение сократительного ответа (снижение Са2+-чувствительности) - как десенситизация к Са2+.

Основным механизмом изменения Са -чувствительности является ингибирование ФЛЦМ, которое достигается действием двух ферментов: Rho-киназы и протеинкиназы С (Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007). Это замедляет дефосфорилирование РЛЦ миозина и поддерживает сокращение даже при сравнительно низкой активности КЛЦМ. Дополнительное повышение силы сокращения обеспечивается независимо от фосфорилирования РЛЦ миозина, путем Са2+-независимой активации каскада митоген-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ). Это приводит к фосфорилированию кальдесмона и устранению его ингибирующего действия на актомиозиновое взаимодействие (Воротников и др., 2002, 2004). Кроме того, МАР-киназы могут усиливать сокращение путем активации КЛЦМ (Morrrison et al., 1996; Kim et al., 2000).

Данная работа проводилась с использованием двух экспериментальных моделей.

Л I

Во-первых, было исследовано формирование баланса Са -зависимых и Са -независимых регуляторных механизмов при развитии симпатической иннервации сосудов крыс в постнатальном периоде. Во-вторых, было исследовано изменение этого баланса при экспериментальной симпатической денервации сосудов взрослых животных. Такой подход позволил связать возрастные изменения Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы с влиянием именно симпатических нервов, а не факторов иной природы (механической или гуморальной). В работе были зарегистрированы изменения силы сокращения и [Са2+], для сосудов с различной степенью симпатической иннервации. Эти данные были сопоставлены с изменением экспрессии ключевых белков-регуляторов взаимодействия актина и миозина в гладкомышечных клетках. В результате исследования были выявлены потенциальные мишени трофического воздействия симпатической иннервации и описан вероятный механизм становления функциональной активности, характерной для зрелых сосудов.

В качестве объекта исследования была выбрана подкожная артерия крысы (a. saphena). Это артерия мышечного типа, у взрослых крыс она густо иннервирована симпатическими волокнами (Todd, 1986; Тарасова и др., 2006), то есть является удобной моделью для исследования механизмов трофического влияния симпатической иннервации.

Целью настоящей работы являлось исследовать формирование механизмов, регулирующих чувствительность сократительного аппарата гладкомышечных клеток сосудов к Са2+, у крыс в период созревания симпатической иннервации и их изменение при экспериментальной денервации сосудов во взрослом возрасте. В работе решались следующие задачи:

1) исследовать динамику развития иннервации подкожной артерии в раннем постнатальном периоде;

2) исследовать, как изменяется чувствительность сократительного ответа подкожной артерии к [Ca2+]i при созревании симпатической иннервации;

3) исследовать, как изменяется чувствительность сократительного ответа подкожной артерии к [Са2+]; при денервации во взрослом возрасте;

4) связать обнаруженные изменения чувствительности сократительного ответа к [Са2+], с экспрессией регуляторных белков сократительного аппарата.

Научная новизна работы. Доказан факт существования долговременного трофического влияния симпатических нервов на регуляцию сокращения гладкой мышцы сосудов путем изменения баланса Са2+-зависимых и Са2+-независимых регуляторных механизмов. Впервые показано, что становление симпатической иннервации сопровождается уменьшением роли Са2+-сенситизации в сокращении периферических резистивных сосудов большого круга кровообращения. Впервые показано, что нарушение симпатической иннервации приводит к обратным изменениям, то есть к увеличению роли Са2+-сенситизации в сокращении сосудов. Впервые в этих двух экспериментальных моделях сопоставлены изменения экспрессии белков, регулирующих зависимость силы сокращения от [Ca2+]j. Важно, что весь комплекс физиологических и биохимических исследований выполнен на одном объекте, в отличие от предыдущих работ, где затрагивались только функциональные или только биохимические аспекты этой проблемы.

Практическая значимость работы. Значимость работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена необходимостью разработки новых способов коррекции тонуса сосудов, лишенных симпатической иннервации: при регуляторных расстройствах у новорожденных детей, а также при нарушении иннервации во взрослом возрасте (в результате травм, аутотрансплантации или трансплантации тканей, диабетической нейропатии и др.). Результаты работы дают основание полагать, что развитие патологий сердечно-сосудистой системы, сопряженных с нарушением симпатической иннервации, может быть связано с уменьшением роли Са2+-зависимых и возрастанием роли Са2+-независимых механизмов регуляции сокращения гладких мышц сосудов. Следовательно, для лечения таких патологий следует использовать не традиционно применяемые блокаторы Са2+-каналов, а препараты, действие которых направлено на снижение активности Са2+-независимых механизмов регуляции сокращения.

Основное положение, выносимое на защиту. Трофическое влияние симпатических нервов на сосуды приводит к изменению экспрессии белков, обеспечивающих

Л I тоническое Са -независимое сокращение гладкой мышцы, что обеспечивает возможность динамической регуляции тонуса сосудов симпатическими вазомоторными влияниями.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, 2004, 2006), на конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк, 2003), на III и V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003, 2007); на III Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2004), на IX Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, 2007), на XX Съезде физиологического общества И.П. Павлова (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Пуздрова, Виктория Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Сплетение адренергичееких волокон в стенке подкожной артерии крысы формируется в течение первого месяца постнатального развития.

2. При деполяризации наружной мембраны КС1 сокращение сосудов новорожденных и взрослых крыс развивается на фоне одинакового повышения [Ca2+]i. Однако при активации рецепторов, сопряженных с G-белками, достижение одинаковой силы сокращения требует большего повышения [Ca2+]i у взрослых крыс, чем у новорожденных, что свидетельствует о снижении роли Са2+-сенситизации в сокращении сосудов при постнатальном созревании.

3. Денервация подкожной артерии у взрослых крыс, напротив, приводит к повышению Са2+-сенситизации сокращения гладкой мышцы сосудов.

4. Постнатальное созревание гладкой мышцы сосудов сопровождается переключением экспрессии кальдесмона с /- на /z-изоформу. Экспрессия тяжелых цепей гладкомышечного миозина с возрастом не изменяется, а регуляторных легких цепей миозина значительно падает. С возрастом в подкожной артерии происходит увеличение экспрессии белков, регулирующих Са2+-зависимое сокращение гладкой мышцы (киназы легких цепей миозина, регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина и /г-кальдесмона), и снижение л. экспрессии белков, обеспечивающих Са -сенситизацию сократительного аппарата: МАР-киназ (р42/44 и р38) и Rho-киназы.

5. После денервации происходят обратные изменения в экспрессии киназы легких цепей миозина, регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина, h-кальдесмона и МАР-киназ. Эти белки могут рассматриваться как внутриклеточные мишени трофического влияния симпатических нервов на кровеносные сосуды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пуздрова, Виктория Анатольевна, Москва

1. Воротников А.В., Крымский М.А., Хапчаев А.Ю., Серебряная Д.В. Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц // Физиол. ж. им. И.М.Сеченова. 2004. - Т.90. - С.705 - 718.

2. Воротников А.В., Крымский М.А., Ширинский В.П. Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц // Биохимия. 2002. - Т.67.-С.1587- 1610.

3. Гусев Н.Б. Основы биохимии мышечных тканей в кн.: Мышечные ткани. Под ред. Ю.С. Ченцова. М.: Медицина. - 2001. - С.176-226.

4. Кеннон В., Розенблют А. Повышение чувствительности денервированных структур. Закон денервации. М.: Изд-во иностр. литературы 1951. - 262 с.

5. Орбели J1.A. Избранные труды в пяти томах. Том второй: Адаптационно-трофическая функция нервной системы. M.-JL: Изд-во Академии наук СССР. -1962.-606 с.

6. Смирнов А.Н. Элементы эндокринной регуляции, М.: Изд. гр. «Гэотар-Медиа» -2006-352 с.

7. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Каленчук В.У., Кошелев В.Б. Повышение чувствительности гладкой мышцы сосудов к констрикторным влияниям после денервации и при снижении давления крови // Биофизика. 2006. - Т. 51. — С.912-917.

8. Фолков Б., Нил Э. Кровообращение. М.: Медицина. 1976. - 463 с.

9. Хапчаев А.Ю., Ширинский В.П., Воротников.А.В. Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина// Успехи биологической химии. 2003. - Т. 43. - С.365-420.

10. Швалев В.Н., Сосунов А.А., Гуски Г. Морфологические основы иннервации сердца. М.: Наука 1992 - 360 с.

11. Abel P.W., Hermsmeyer К. Sympathetic cross-innervation of SHR and genetic controls suggests a trophic influence on vascular muscle membranes // Circ. Res. -1981.-V. 49; №6.-P.1311-1318.

12. Abraham S.T., Robinson M., Rice P.J. A role for protein kinase С in the supersensitivity of the rat vas deferens following chronic surgical denervation // Pharmacology. 2003. - V.67. - P.32 - 40.

13. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Physiological variations in ovine cerebrovascular calcium sensitivity // Am J Physiol. 1997. - V.272. - P. H2271-H2281.

14. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Maturation alters the contractile role of calcium in ovine basilar arteries // Pediatr Res. 1998-a. - V.44; №2. - P. 154-60.

15. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Regulation of Ca2+ sensitization by PKC and rho proteins in ovine cerebral arteries: effects of artery size and age // Am J Physiol. -1998-6.-V.275.-H930-939.

16. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Developmental changes in the calcium sensitivity of rabbit cranial arteries // Biol. Neonate. 1998-в. - V.74; №1. -P.60-71.

17. Anderson C.R., McLachlan E.M. The time course of the development of the sympathetic innervation of the vasculature of the rat tail // J. Auton. Nerv. Syst. -1991. -V. 35; №2. -P.l 17-32.

18. Angus J.A., Broughton A., Mulvany M.J. Role of a-adrenoceptors in constrictor responses of rat, guinea-pig and rabbit small arteries to neural activation // J. Physiol. 1988. - V.403. -P.495-510.

19. Arens Y.H., Rosenfeld C.R., Kamm K.E. Maturational differences between vascular and bladder smooth muscle during ovine development // Am. J. Physiol.- 2000. V. 278; №5. P.R1305-R1313.

20. Bailly K., Ridley A.J., Hall S.M., Haworth S.G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific // Circ. Res. 2004. -V. 94; №10. - P1383-1391.

21. Belik J., Kerc E., Pato M.D. Rat pulmonary arterial smooth muscle myosin light chain kinase and phosphatase activities decrease with age // Am. J. Phisiol. 2005. -V. 290. -P.509-516.

22. Bentzer P., Nielson N., Arner M., Danielsen N., Ekblad E., Lundborg G., Arner A. Supersensitivity in rat micro-arteries after short-term denervation // Acta Physiol. Scand. 1997. -V. 161. - P. 125-133.

23. Bevan R.D. Trophic effects of peripheral adrenergic nerves on vascular structure // Hypertension. 1984. - V.6, №6, Suppl.III. - P.III-19 -111-26.

24. Birukov K.G., Shirinsky V.P., Stepanova O.V., Tkachuk V.A., Hahn A.W., Resink T.J., Smirnov V.N. Stretch affects phenotype and proliferation of vascular smooth muscle cells // Mol Cell Biochem. 1995. -V. 144; №2. -P.131-139.

25. Blaes N., Boissel J.P. Growth-stimulating effect of catecholamines on rat aortic smooth muscle cells in culture // J Cell Physiol. 1983. - V. 116; №2. - P.167-172.

26. Bobik A., Anderson W.P. Influence of sympathectomy on alpha 2 adrenoceptor binding sites in canine blood vessels // Life Sci. 1983. -V. 33; №4. - P331-336.

27. Bobik A., Campbell J., Snow P., Little P.J. The effects of endogenous phosholipase A2 activation on beta adrenoceptor function in cardiac cells // J. Mol. Cell Cardiol. -1983,-V.15; №2.-P.759-767.

28. Bruce L., Nixon G.F. Increased sensitization of the myofilaments in rat neonatal portal vein: a potential mechanism // Exp. Physiol. 1997. - V. 82; №6. - C.985-993.

29. Burnstock G. Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission // Physiol. Rev. 2007. - V. 87; №2. - P.659-797.

30. Charles S.M., Zhang L., Longo L.D., Buchholz J.N., Pearce W.J. Postnatal maturation attenuates pressure-evoked myogenic tone and stretch-induced increases in Ca2+ in rat cerebral arteries // Am. J. Physiol. 2007. - V. 293; №2. - P.R737-R744.

31. Chen L., Xin X., Eckhart A.D., Yang N., Faber J.E. Regulation of vascular smooth muscle growth by alpha 1-adrenoreceptor subtypes in vitro and in situ // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270(52). - P.30980-30988.

32. Cogolludo A., Moreno L., Lodi F., Tamargo J., Perez-Vizcaino F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction // Cardiovasc. Res. 2005. - V. 66; №1. - P.84-93.

33. Crane G.J., Garland C.J. Thromboxane receptor stimulation associated with loss of SKCa activity and reduced EDHF responses in the rat isolated mesenteric artery // Br. J. Pharmacol. 2004. - V. 142; №1. P. 43-50.

34. Dalessandri K.M., Giri S.R., Robison T.W., Hayashi H.H., Talken L. No change in alpha 1 adrenoceptors in canine femoral arteries after lumbar sympathectomy // J. Invest. Surg. 1991. - V. 4; № 2. - P. 137-140.

35. Damon D.H. Sympathetic innervation promotes vascular smooth muscle differentiation // Am. J. Physiol. 2005. - V.288. - P.H2785 - H2791.

36. Eddinger T.J., Meer D.P. Myosin II isoforms in smooth muscle: heterogeneity and function // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2007. - V. 293; №2. - P.C493-C508.

37. Ekman M., Fagher K., Wede M., Stakeberg K., Arner A. Decreased Phosphatasej I

38. Activity, Increased Ca Sensitivity, and Myosin Light Chain Phosphorylation in Urinary Bladder Smooth Muscle of Newborn Mice // J. Gen. Physiol. 2005. -V.125. -P.187-196.

39. Erami C., Zhang H., Ho J.G., French D.M., Faber J.E. Alpha(l)-adrenoceptor stimulation directly induces growth of vascular wall in vivo // Am. J. Physiol. -2002.-V. 283; №4. -P.H1577-H1587.

40. Erlinge D. Extracellular ATP: a growth factor for vascular smooth muscle cells // Gen. Pharmacol. 1998. -V. 31; №1. P. 1-8.

41. Erlinge D., Brunkwall J., Edvinsson L. Neuropeptide Y stimulates proliferation of human vascular smooth muscle cells: cooperation with noradrenaline and ATP // Regul. Pept. 1994. - V. 50; №3. - P.259-265.

42. Fleming W.W. Cellular adaptation: journey from smooth muscle cells to neurons // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. - V. 291. - P.925 - 931.

43. Frid M.G., Shekhonin B.V., Koteliansky V.E., Glukhova M.A. Phenotypic changes of human smooth muscle cells during development: late expression of heavy caldesmon and calponin // Dev. Biol. 1992. - V. 153; №2 - P. 185-193.

44. Furness J.B., Costa M. The use glyoxylic acid for the fluorescence histochemical demonstration of peripheral stores of noradrenaline and 5-hydroxytryptamine in whole mounts // Histochemistry. 1975. - V.41; №4. - P.335-352.

45. Gattone V.H., Evan A.P., Overhage J.M., Severs W.B. Developing renal innervation in the spontaneously hypertensive rat: evidence for a role of the sympathetic nervous system in renal damage // J. Hypertens. 1990. - V. 8; №5 - P.423-428.

46. Greene E.C. Anatomy of the rat. Hafner Publishing Company, New York and London. 1968.

47. Griffith J.Q., Farris E.J., Lippincott J.B. The rat in laboratory investigation // Company, Philadelphia-Montreal-London. 1942. - P.394-395.yt

48. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. -P.3440-3450.

49. Hartshorne D.J. Myosin phosphatase: subunits and interactions // Acta. Physiol. Scand. -1998. V. 164; №4. - P. 483-493.

50. Hedges J.C., Yamboliev I.A., Ngo M., Horowitz В., Adam L.P., Gerthoffer W.T. Phosphorylation of caldesmon by ERK MAP kinases in smooth muscle // Am. J. Physiol. 1998 - V .278. - P. 718-726.

51. Hill C.E. Development of peripheral autonomic synapses: neurotransmitter receptors, neuroeffector associations and neural influences // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. -1999. -V. -26; №8. -P.581-590.

52. Hill C.E., Hirst G.D., Helden D.F. Development of sympathetic innervation to proximal and distal arteries of the rat mesentery // J. Physiol. 1983. - V. 338 -P.129-147.

53. Hirano K. Current topics in the regulatory mechanism underlying the Ca sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle //J. Pharmacol. -2007.-V 104; №2. P109-115.

54. Horowitz A., Menice C.B., Laporte R., Morgan K.G. Mechanisms of smooth muscle contraction // Physiol. Rev. 1996. - V. 76; №4. - P.967-1003.

55. Hutanu С., Сох B.E., DeSpain K., Liu X.T., Rosenfeld C.R. Vascular development in early ovine gestation: carotid smooth muscle function, phenotype, and biochemical markers // Am J Physiol. 2007. - V. 293; №1. - P.R323-R333.

56. Iijima M., Yamamoto J., Takada N., Ohata H., Momose K. Changes in Ca2+ signaling and contractile protein isoforms in smooth muscle cells from guinea pig ileum during culture // J. Smooth Muscle Res. 2001. - V. 37; №42. - P.53-66.

57. Jensen P.E., Mulvany M.J., Aalkjaer C. Endogenous and exogenous agonist-induced changes in the coupling between Ca2+.i and force in rat resistance arteries // Pfliigers Arch. 1992. - V. 420. - P.536-543.

58. Kacem K., Sercombe R. Differing influence of sympathectomy on smooth muscle cells and fibroblasts in cerebral and peripheral muscular arteries //Auton. Neurosci. -2006. V. 124; №1-2. - P.38-48.1. Л I

59. Kasturi R., Vasulka C., Johnson J.D. Ca , caldesmon, and myosin light chain kinase exchange with calmodulin.//J Biol Chem. 1993 Apr 15;268(11):7958-64.

60. Klemke R.L., Cai S., Giannini A.L., Gallagher P.J., de Lanerolle P., Cheresh D.A. Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase // J. Cell. Biol. -1997. V. 137; №2. - P.481-492.

61. Ljung В., Stage L. Adrenergic excitatory influences on initiation and conduction of electrical activity in the rat portal vein // Acta. Physiol. Scand. 1970. - V. 80; №1.-P.131-141.

62. Luff S.E., Development of neuromuscular junctions on small mesenteric arteries of the rat // J. Neurocytol. 1999 - V. 28; №1. - P.47-62.

63. Luff S.E., McLachlan E.M., Hirst G.D. An ultrastructural analysis of the sympathetic neuromuscular junctions on arterioles of the submucosa of the guinea pig ileum // J. Сотр. Neurol. 1987. -V. 257; №4. - P.578-594.

64. Mangiarua E.I., Joyce E.H., Bevan R.D. Denervation increases myogenic tone in a resistance artery in the growing rabbit ear // Am. J. Physiol. 1986. - V. 250; № 5 (Pt 2). -P.H889-H891.

65. Marston S.B., Redwood C.S. Modulation of thin filament activation by breakdown or isoform switching of thin filament proteins: physiological and pathological implications // Circ. Res. 2003. V. 93; №12. - P.l 170-1178.

66. Morano I. Tuning SM contraction by molecular motors // J. Mol. Med. 2003. -V.81. -P.481-487.

67. Morrison P., Saltiel A.R., Rosner M.R. Role of mitogen-activated protein kinase kinase in regulation of the epidermal growth factor receptor by protein kinase С // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271; №22. -P.12891-12896.

68. Mueed I., Bains P., Zhang L., MacLeod K.M. Differential participation of protein kinase С and Rho-kinase in ai-adrenoceptor mediated contraction in rat arteries // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2004. - V.82. - P.895 - 902.

69. Mulvany M.J., Halpern W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats // Circ. Res. 1977. - V. 41; №1.-P. 19-26.

70. Nasseri A., Barakeh J.F., Abel P.W., Minneman K.P. Reserpine-induced postjunctional supersensitivity in rat vas deferens and caudal artery without changes in alpha adrenergic receptors // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1985. - V. 234; №2. P.350-357.

71. Nilsson H. Adrenergic nervous control of resistance and capacitance vessels. Studies on isolated blood vessels from the rat // Acta Physiol. Scand. 1985. - V.541 - P.l-34.

72. Nilsson H., Sjoblom N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat // Acta. Physiol. Scand. 1985. - V. 125; №3. - P.429-435.

73. Noma K., Oyama N., Liao J.K. Physiological role of ROCKs in the cardiovascular system // Am. J. Physiol. 2006. - V. 290; №3. - P.C661-C668.

74. Owens G.K., Kumar M.S., Wamhoff B.R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease // Physiol. Rev. 2004. - V. 84;№3.-P.767-801.

75. Owens G.K. Regulation of Differentiation of Vascular Smooth Muscle Cells // Physiol. Rev. 1995. -V. 75. -P.487-517.

76. Payne M.C., Zhang H.Y., Prosdocimo Т., Joyce K.M., Koga Y., Ikebe M., Fisher S.A. Myosin phosphatase isoform switching in vascular SM development // J. Mol. Cell Cardiol. 2006. - V.40. - P.274-282.

77. Pearce W.J., Williams J.M., Chang M.M., Gerthoffer W.T. ERK inhibition attenuates 5-HT-induced contractions in fetal and adult ovine carotid arteries // Arch. Physiol. Biochem. 2003. - V. 111. - P.36-44.

78. Phillips J.K., Hill C.E. Neuroreceptor mRNA Expression in the rat mesenteric artery develops independenly of denervation // Int. J. Dev. Neurosci. 1999. - V. 17; №4. -P.377-386.

79. Phillips J.K., Vidovic M., Hill C.E. Alpha-adrenergic, neurokinin and muscarinic receptors in rat mesenteric artery;an mRNA study during postnatal development // Mech. Ageing Dev. 1996. - V. 92; №2-3. - P.235-246.

80. Ramos K., Gerthoffer W.T., Westfall D.P. Denervation-induced supersensitivity to calcium of chemically skinned smooth muscle of the guinea-pig vas deferens // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1985. - V.236. - P.80 - 84.

81. Ridley A.J., Hall S.M., Haworth S.G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific // Circ. Res. 2004. - V. 94; №10. -P.1383-1391.

82. Sadoshima S., Yoshida F., Ibayashi S., Shiokawa O., Fujishima M. Upper limit of cerebral autoregulation during development of hypertension in spontaneously hypertensive rats-effect of sympathetic denervation // Stroke. 1985. - V. 16; №3. -P.477-481.

83. Sandoval R.J., Injeti E.R., Gerthoffer W.T., Pearce W.J. Postnatal maturationч Imodulates relations among cytosolic Ca , myosin light chain phosphorylation, and contractile tone in ovine cerebral arteries // Articles in Press. Am. J. Physiol. 2007.

84. Sandow S.L., Goto К., Rummery N.M., Hill C.E. Developmental changes in myoendothelial gap junction mediated vasodilator activity in the rat saphenous artery // J. Physiol. 2004. - V. 556. - P.875-886.

85. Sandow S.L., Hill E.C. Physiological and anatomical studies of the development of the sympathetic innervation to rat iris arterioles // Auton. Nerv. Syst. 1999a - V.77; №2-3. -P.152-163.

86. Sandow S.L., Hill C.E. Specialised sympathetic neuroeffector associations in immature rat iris arterioles // J. Anat. 19996 - V. 195(Pt 2) - P.257-270.

87. Schaffner W., Weissmann C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution // Anal. Biochem. 1973. - V.56; №2. -P.502-514.

88. Seidel C.L., Allen J.C. Pharmacologic characteristics and actomyosin content of aorta from neonatal rats // Am. J. Physiol. 1979. - V. 237; №1. P.C81-C86.

89. Seidler F.J, Slotkin T.A. Adrenomedullary function in the neonatal rat: responses to acute hypoxia // J. Physiol. 1985. - V. 358. - P.l-16.

90. Shvalev V.N., Zhuchkova N.I. Method for identifying adrenergic nervous elements by the glyoxylic method using pontamine sky blue // Neurosci. Behav. Physiol. -1991. V. 21; №2. - P. 117-118.

91. Siwik D.A, Brown R.D. Regulation of protein synthesis by alpha 1-adrenergic receptor subtypes in cultured rabbit aortic vascular smooth muscle cells // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1996. - V. 27; №4. -P.508-518.

92. Slovut D.P., Mehta S.H., Dorrance A.M., Brosius F.C., Watts S.W., Webb R.C. Increased vascular sensitivity and connexin43 expression after sympathetic denervation //Cardiovasc. Res. 2004. - V. 62; №2. - P.388-396.

93. Somlyo A.P., Somlyo A.V. Signal transduction by G-proteins, rho-kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II // J. Physiol. 2000. - V. 522.-P.177- 185.y I

94. Somlyo A.P., Somlyo A.V. Ca sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase // Physiol Rev. 2003. -V. 83; №4, P.1325-1358.

95. Sung C.P., Arleth A.J., Berkowitz B.A. Endothelial thromboxane receptors: biochemical characterization and functional implications // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989.-V. 158; №1. - P.326-333.

96. Tarasova O.S., Mochalov S.V., Kalentchuk V.U., Aalkjaer C., Nilsson H. Calcium sensitivity of smooth muscle contraction in chronically denervated arteries // In. Biological motility: basic research and practice. Pushino. - 2006. - P.37 - 38

97. Thorneloe K.S., Nelson M.T. Ion channels in smooth muscle: regulators of intracellular calcium and contractility // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2005. - V. 83; №3,-P.215-242.

98. Todd M.E. Development of adrenergic innervation in rat peripheral vessels: a fluorescence microscopic study // J Anat. 1980 - V. 13 l(Pt 1). - P.121-133.

99. Todd M.E. Trophic interactions between rat nerves and blood vessels in denervated peripheral arteries and in anterior eye chamber transplantants // Circulation Research. 1986. - V.58. - P.641-652.

100. Uddin M.R., Muthalif M.M., Karzoun N.A., Benter I.F., Malik K.U. Cytochrome P-450 Metabolites Mediate Norepinephrine-Induced Mitogenic Signaling // Hypertension. 1998. - V. 31. - P.242-247.

101. Ueki N., Sobue K., Kanda K., Hada Т., Higashino K. Expression of high and low molecular weight caldesmons during phenotypic modulation of smooth muscle cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. - V. 84; №24. - P.9049-9053.

102. Wallace, K.B., Hook J.B., Bailie M.D. Postnatal development of the renin-angiotensin system in rats // Am. J. Physiol. 1980 - V. 238. - P.R432-R437.

103. Woodsome T.P., Eto M., Everett A., Brautigan D.L., Kitazawa T. Expression of CPI-17 and myosin phosphatase correlates with Ca sensitivity of protein kinase C-induced contraction in rabbit smooth muscle // J. Physiol. 2001. - V. 535. - P.553 -564.

104. Yu S.M., Tsai S.Y., Guh J.H., Ко F.N., Teng C.M., Ou J.T. Mechanism of catecholamine-induced proliferation of vascular smooth muscle cells // Circulation. -1996. V. 94; №3. - P.547-554.

105. Zhao Y., Long W., Zhang L., Longo L.D. Extracellular signal-regulated kinases and contractile responses in ovine adult and fetal cerebral arteries // J. Physiol. 2003. -V.551. -P.691-703.

106. Zukowska-Grojec Z. Neuropeptide Y. A novel sympathetic stress hormone and more // Ann. N Y Acad. Sci. 1995 - V. 771 - P.219-33.