Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторные изменения артерий почек у крыс при сахарном диабете 1 типа

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные изменения артерий почек у крыс при сахарном диабете 1 типа"

На правах рукописи €

БОЛЕЕВА ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АРТЕРИЙ ПОЧЕК У КРЫС ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1 ТИПА

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

28 НОЯ 2013

Москва 2013

005540016

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (зав. кафедрой - профессор A.A. Каменский) Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Тарасова доктор биологических наук, профессор кафедры

Ольга физиологии человека и животных биологического факультета

Сергеевна Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Абушинова

Надежда

Норминовна

Воротников

Александр

Вячеславович

доктор биологических наук, профессор кафедры общей биологии и физиологии факультета педагогического образования и биологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Калмыцкий государственный университет»

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем Российской академии наук

Защита диссертации состоится 16 декабря 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: Ленинские горы, д.1, строение 12, Москва, ГСП-1, 119991, ауд. М-1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, д. 27).

Автореферат разослан «15» ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук / Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) — это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом уменьшения секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов [Дедов, Шестакова, 2006]. СД является одним из наиболее социально значимых заболеваний в современном обществе, его распространенность неуклонно растет и, по эпидемиологическим прогнозам, к 2030 году достигнет 7-8% от общей численности населения мира [Shaw et al., 2010]. Приблизительно 10% всех случаев СД приходится на СД 1 типа [Дедов, Шестакова, 2006], который развивается в результате разрушения ß-клеток поджелудочной железы, в итоге прекращается продукция инсулина -ключевого регулятора процессов углеводного и липидного обмена в организме. В экспериментах на животных СД 1 типа чаще всего моделируют путем введения стрептозотоцина (СТЗ) [Szkudelski 2001; Lenzen 2008].

Патологические изменения в органах и тканях при СД связаны как с непосредственным влиянием гипергликемии, так и с нарушением кровоснабжения. Сосудистые нарушения являются основной причиной ухудшения качества жизни и гибели больных СД. Развитие СД 1 типа ведет к патологическим изменениям всех элементов сосудистой стенки: эндотелия, гладкой мышцы и интрамуральных нервных сплетений [Дедов, Шестакова, 2006; Forbes, Cooper, 2013]. Повреждающее влияние гипергликемии на эндотелий и гладкую мышцу сосудов может развиваться с участием разных механизмов, что связано с различием путей транспорта глюкозы в эти клетки. Транспорт глюкозы в эндотелиальные клетки осуществляется переносчиками, работа которых не зависит от влияния инсулина, в связи с этим дисфункция эндотелия при СД связана с перегрузкой клеток глюкозой [De Vriese et al., 2000]. В гладкомышечные клетки половина всего количества глюкозы транспортируются переносчиком GLUT4, экспрессия и активность которого регулируются инсулином [Park et al., 2005], в связи с чем изменение функционирования гладкой мышцы при СД может развиваться другим путем.

Хотя нарушение регуляции сосудов при СД 1 типа связывают с влиянием системных факторов, таких как гипергликемия и связанный с ней окислительный стресс [Forbes, Cooper, 2013], известно, что динамика и выраженность сосудистых патологий могут существенно различаться в разных органах. Это проявляется как в кровоснабжении разных органов [Lucas, Foy, 1977; Hill, Larkins, 1989; Kiff et al., 1991], так в регуляторных характеристиках изолированных из этих органов артериальных сосудов [Johansen et al., 2013]. Однако в настоящее время судить о регионарной специфике сосудистых изменений при СД 1 типа довольно трудно, так как данные литературы по этому вопросу противоречивы [Ralevic et al., 1995: Johansen et al., 2013]. Для ответа на этот вопрос необходимо исследовать диабетические изменения сосудов разных органов у одних и тех же животных.

Уже на ранней стадии развития СД 1 типа наблюдаются глубокие изменения функционирования почек [Samnegard et al., 2001; Rebsomen et al.,

2006], которые связаны с изменением регуляции тонуса артерий, приносящих кровь к почечным клубочкам [Carmines, 2010]. Ранние гемодинамические нарушения в почках проявляются в виде расширения прегломерулярных сосудов, повышения давления в клубочковых капиллярах и увеличения скорости фильтрации [Forbes, Cooper, 2013; Дедов, Шестакова, 2006]. Считается, что клубочковая гиперфильтрация является важным патогенетическим звеном развития диабетической нефропатии, поскольку она ведет к изменениям в гломерулах (разрастанию мезангиальных клеток и матрикса, гломерулосклерозу) и к изменению проницаемости почечного фильтра [Levine, 2008; Magee et al., 2009].

Следует отметить, что регуляторные изменения артерий почки при СД 1 типа изучены мало: остаются неясными механизмы изменения сократимости гладкой мышцы и эндотелий-зависимой регуляции тонуса (вклад различных эндотелиальных факторов и их взаимодействие с гладкомышечными клетками сосуда). Принимая во внимание важную роль почек в поддержании гомеостаза в организме и регуляции работы сердечно-сосудистой системы, мы считаем, что исследование регуляторных изменений артерий почки при СД 1 типа актуально как для физиологии, так и для фундаментальной медицины.

Целью данной работы было выявить и изучить функциональные изменения гладкой мышцы и эндотелия в мелких артериях почки у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом (СД).

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать экскреторную функцию почек у крыс через 6 недель после введения стрептозотоцина.

2. Исследовать вызванные СД изменения реакций ai-адренергического сокращения и эндотелий-зависимого расслабления артерий почки, сопоставить их с изменениями реакций артерий кожи, скелетных мышц и тонкого кишечника.

3. Исследовать роль сигнальных путей, связанных с активацией Rho-киназы и протеинкиназы С, в регуляции сокращения артерий почки у крыс с СД.

4. Провести экспериментальную проверку гипотезы о сходстве механизмов изменения сокращения почечных артерий при СД и при нарушении симпатической иннервации.

5. Исследовать механизмы изменения эндотелий-зависимого расслабления артерий почки у крыс с СД.

Научная новизна работы. Результаты, полученные в данной работе, развивают современные представления о механизмах изменения регуляции артериальных сосудов при СД 1 типа. Впервые путем прямого сопоставления диабетических изменений в большом числе органов показано, что сосудистые изменения в почке могут качественно отличаться от изменений в таких органах, как кожа, скелетные мышцы и тонкий кишечник. Впервые показано, что нарушение иннервации артерий почки при СД 1 типа приводит к компенсаторному повышению их сократительных ответов при активации

агадренорецепторов вследствие увеличения вклада протеинкиназы С в регуляцию сокращения. В связи с этим полученные результаты дополняют наши представления о механизмах долговременного влияния симпатических нервов на органы-мишени.

Практическая значимость работы. Значимость настоящей работы для фундаментальной и практической медицины связана с неизбежным развитием сосудистых нарушений при СД 1 типа и их ролью в патогенезе диабетических органопатий. Согласно полученным данным, изменение сократительных ответов артерий почки при СД 1 типа происходит в результате повышения активности внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих чувствительность сократительного аппарата гладкомышечных клеток к Са2+. Хотя на ранних этапах СД такие изменения могут компенсировать нарушение нервной регуляции артерий почки, в дальнейшем гиперактивность тех же сигнальных путей может служить причиной уменьшения почечного кровотока и приводить к диабетической нефропатии. Следует отметить, что Rho-киназа и протеинкиназа С рассматриваются в настоящее время в качестве перспективных мишеней для фармакологической коррекции нарушений сократимости гладкой мышцы сосудов. Еще одна сфера использования результатов данной работы связана с необходимостью понимания последствий такого воздействия как денервация почек, которое все чаще применяется в медицине для лечения фармакорезистентной артериальной гипертензии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изменения регуляции артерий при СД 1 типа в почке проявляются раньше и иначе, чем в большинстве других органов.

2. Уменьшение тонуса артерий, расположенных в почке проксимально от почечных клубочков, в гиперфильтрационной фазе СД 1 типа обусловлено ослаблением симпатических влияний вследствие разреживания иннервации и уменьшения констрикторного влияния продуцируемых эндотелием простаноидов.

3. Нарушение иннервации артерий почки в гиперфильтрационной фазе СД 1 типа сопровождается компенсаторным повышением их адренореактивности вследствие увеличения активности протеинкиназы С.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010», «Ломоносов - 2011», «Ломоносов — 2012» и «Ломоносов - 2013» (Москва, 2010 - 2013 гг.), на V Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012 г), на VIII Всероссийской с международным участием конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 220-летию со дня рождения K.M. Бэра (Санкт-Петербург, 2012 г.), на 9-й Международной научной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2013

г.), на XXI и XXII Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010 г., и Волгоград, 2013 г.). Диссертация апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (протокол №58 от 09 сентября 2013 г.).

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 10-04-01723-а и 13-04-02087-а. При проведении исследований использовалось оборудование, приобретенное за счет средств Программы развития Московского университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ, и 9 тезисов докладов в сборниках материалов отечественных и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на \"2_ М страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Список литературы включает источников. Работа

иллюстрирована 6 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали самцов крыс линии Вистар, полученных из питомника лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН, филиал «Столбовая». Исследования проводили в соответствии с правилами, установленными комиссией по биоэтике биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Моделирование сахарного диабета 1 типа у крыс

СД 1 типа вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина (СТЗ, Sigma, США) в дозе 65 мг/кг. Животным контрольной группы вводили растворитель (цитратный буфер, рН 4,5) в эквивалентном объеме. Длительность наблюдения за животными после введения СТЗ составляла 6 недель. В течение этого периода крыс взвешивали (еженедельно) и измеряли концентрацию глюкозы в крови (через трое суток после введения СТЗ и затем раз в две недели); каплю крови для определения брали из надреза кончика хвоста. Если на третьи сутки после введения СТЗ концентрация глюкозы в крови крысы была ниже 15 ммоль/л, ее исключали из эксперимента (3-5% инъецированных СТЗ крыс).

Исследование функции почек в метаболических камерах

Тестирование проводили через 6 недель после введения СТЗ с использованием двух метаболических камер (Tecniplast, Италия, модель 3701М071). В день эксперимента (9-10 ч утра) в одну камеру помещали крысу с диабетом, а в другую - контрольную крысу. Корм и воду животные получали ad libitum. Через сутки крыс извлекали из камер, взвешивали, определяли массу съеденного корма, массу фекалий, объем выпитой воды, объем мочи, затем готовили аликвоты мочи и замораживали их (-20°С). Из надреза кончика хвоста брали пробу крови объемом 0.5 мл в пробирку MiniCollect с К3ЭДТА, отбирали

микропробы для измерения концентрации глюкозы, ß-кетонов и гематокрита, оставшуюся кровь центрифугировали 15 мин при 5000 об/мин, плазму аликвотили и быстро замораживали (-20°С).

Показатели определяли с использованием следующих методик:

- концентрации глюкозы и ß-кетонов в крови - электрохимическим методом с использованием портативного глюкометра Optium Xceed (Abbott, США);

- гематокрит - путем центрифугирование в капиллярах при 7000 об/мин с последующим измерением гематокритной линейкой;

- концентрацию глюкозы в моче - с использованием диагностических тест-полосок Roche Combur 10 Test UX (Roche Diagnostics);

- концентрации креатинина в плазме крови и в моче - по методу Яффе с депротеинизацией (набор Ольвекс Диагностикум), перед проведением депротеинизации мочу контрольных крыс разводили в 50 раз, а мочу крыс с диабетом - в 5 раз;

- концентрацию альбумина в моче - методом иммуноферментного анализа (набор Rat Microalbumin ELISA, Kamiya Biomedical Company).

Для оценки скорости клубочковой фильтрации вычисляли клиренс креатинина. Кроме того, определяли концентрацию альбумина в моче и вычисляли суточную экскрецию альбумина и соотношение альбумин/креатинин (показатель проницаемости почечного фильтра для альбумина, который не зависит от скорости клубочковой фильтрации).

Методика денервации левой почки

Денервацию левой почки проводили с использованием описанной в литературе методики [Krayacich et al., 1987; Mulder et al. 2013], которая обеспечивает почти полную дегенерацию постганглионарных симпатических волокон в течение 2-3 недель после проведения операции. Крыс наркотизировали смесью золетила (Virbac Santé Animale, Франция) и ксилазина (Интенхеми, Голландия). Растворы золетила (100 мг/мл) и ксилазина (20 мг/мл) смешивали в соотношении 1:5 и вводили внутрибрюшинно из расчета 0,7 мл/кг массы тела. Под бинокулярным микроскопом разрушали все идущие к почке видимые нервы, затем по возможности полно счищали адвентицию с почечной артерии и почечной вены и обрабатывали сосуды 20% раствором фенола. Контролем служили ложнооперированные крысы, у которых делали разрез кожи, находили почку, а затем разрез зашивали.

Визуализация адреиергических нервных волокон в артериях почки

Для оценки плотности иннервации артерий почки у крыс с СД и проверки эффективности денервации использовали метод, основанный на взаимодействии катехоламинов с глиоксиловой кислотой с последующей флуоресценцией этого комплекса [Furness, Costa, 1975; Пуздрова и др., 2008]. Выделенные из почки артерии в течение 30 мин инкубировали в 0.1 M фосфатно-солевом растворе (pH 7.4) с добавлением глиоксиловой кислоты (2 %, Sigma, США) и сахарозы (10 %). Затем препараты расправляли на предметном стекле адвентицией вверх, высушивали (30 мин под струей теплого

воздуха, 5 мин при 100°С в сушильном шкафу), заливали вазелиновым маслом и накрывали покровным стеклом. Сплетение адренергических волокон визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert-200 (Германия) при увеличении 40. Длина волны возбуждающего света составляла 380-440 нм, а исследуемой люминесценции - 440-480 нм. Плотность сплетения оценивали, подсчитывая количество пересечений волокон с морфометрической сеткой, которая состояла из 40 маркеров, равномерно распределенных в поле зрения (326 х 258 мкм).

Измерение сократительной активности изолированных сосудов Сокращение сосудов исследовали в изометрическом режиме с использованием 4-канальной системы wire myograph (модель 620А, Danish Myo Technology A/S, Дания). Из артерии вырезали кольцевой сегмент длиной 2 мм и закрепляли его в миографе, содержащем раствор следующего состава (мМ): NaCl 120; NaHC03 26; KCl 4,5; СаС12 1,6; MgS04 1,0; NaH2P04 1,2; D-глюкоза 5,5; EDTA 0,025; HEPES 5,0. Раствор непрерывно аэрировали карбогеном (5% СОг + 95% Ог) для поддержания pH равным 7,4. В случае необходимости проводили механическое удаление эндотелия (использовали ус крысы), затем включали нагрев миографа. После нагрева до 37°С (30 мин) определяли растяжение препарата, оптимальное для проявления сократительной активности [Mulvany, Halpern, 1977]. Затем для активации препарата проводили два-три цикла сокращения-расслабления с использованием норадреналина (10"6М). На фоне одного из этих сокращений проверяли функциональное состояние эндотелия путем добавления ацетилхолина (10 6 М). План исследований и протоколы экспериментов В ходе работы были проведены пять серий экспериментов. Серия 1. Выявление регуляторных изменений артерий разных органов у крыс с СД 1 типа длительностью 6 недель. Целью этих экспериментов было сопоставить влияние СД на вазомоторные ответы артерий, приносящих кровь к разным органам крысы. В экспериментах использовали:

- подкожную артерию {а. saphena), приносящую кровь к коже стопы;

- артерию, приносящую кровь к медиальной головке икроножной мышцы;

- артерию, приносящую кровь к реберному отделу диафрагмы;

- мелкие артерии брыжейки (веточки верхней брыжеечной артерии 2-3 порядков);

- междолевые артерии почки (веточки почечной артерии 2-3 порядков).

Исследовали сократительные ответы на метоксамин (MX, 10~8-10-4 М) и эндотелий-зависимое расслабление в ответ на ацетилхолин (10"9-10"5 М, на фоне сокращения, созданного с помощью фенилэфрина в концентрации, вызывающей ответ в 70-80% от максимального). Реакции на разные концентрации веществ исследовали кумулятивно.

Серии 2 и 3. Исследование роли Rho-киназы и протеинкиназы С (ПКС) в повышении реактивности артерий почки на MX у крыс с диабетом. В этих двух сериях были использованы сходные протоколы экспериментов, но в одной из них (Серия 2) исследовали реакции артерий с интактным эндотелием, а в

другой (Серия 3) - с удаленным эндотелием, что позволило исключить влияние эндотелия на сократительные характеристики гладкой мышцы.

В каждом эксперименте использовали три препарата артерий из почки одной крысы. Протокол эксперимента включал тестирование двух зависимостей «концентрация-эффект» для MX с периодом отмывки между ними (10-15 мин). Первую из них для всех трех препаратов проводили после инкубации в растворе без ингибиторов в течение 25 мин, что было достаточно для развития и стабилизации миогенного тонуса. Вторую зависимость «концентрация-эффект» для одного из препаратов также проводили в отсутствие ингибиторов (этот препарат служил контролем), ко второму препарату добавляли Y 27632 (ингибитор Rho-киназы, 3* 10"6 М), а к третьему -ингибитор GF109203X (ингибитор всех изоформ ПКС, 10"бМ). Концентрации ингибиторов были выбраны на основании данных литературы [Uehata et al., 1997; Ratz et. al., 2005; Davies et al,. 2000] и наших предыдущих исследований [Мочалов и др., 2008]. Время инкубации препаратов с ингибиторами (или без них, для контрольного препарата) составляло 25 минут, как и перед первой зависимостью. Использование такого экспериментального протокола позволяло оценивать эффекты ингибиторов (путем сравнения вторых зависимостей «концентрация-эффект» для контрольного препарата и препаратов, инкубированных с ингибиторами, при условии совпадения первых зависимостей для трех препаратов).

В этой же серии экспериментов также исследовали плотность сплетения симпатических волокон в артериях почки (в результате чего у крыс с СД 1 типа было обнаружено уменьшение плотности иннервации).

Серия 4. Исследование роли Rho-киназы и ПКС в повышении реактивности артерий почки на MX после денервации. Для установления связи изменения сокращения артерий почки при СД 1 с нарушением их иннервации мы проводили хирургическую денервацию почки у крыс с нормальным уровнем глюкозы в крови. Через 2-3 недели сравнивали реакции артерий из денервированной почки и артерий из левой почки ложнооперированных крыс, для всех препаратов проводили процедуру по разрушению эндотелия. Использовали протокол эксперимента, аналогичный таковому в сериях 2 и 3.

Серия 5. Исследование механизмов эндотелий-зависимых реакций артерий почки у крыс при СД 1 типа. В этих экспериментах исследовали вклад различных эндотелиальных механизмов в суммарную реакцию расслабления артерий в ответ на ацетилхолин (108 - 3*10"5 М). Компонент реакции, обусловленный действием N0, вычленяли с использованием ингибитора NO-синтаз L-NNA (10"4 М), а компонент, обусловленный действием продуктов метаболизма арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути - с использованием индометацина (10"5М); препараты инкубировали с ингибиторами в течение 25 минут. В этой же серии экспериментов оценивали NO-чувствительность гладкой мышцы артерий по величине расслабления при действии донора оксида азота DEA-NO (10"9-10~5 М, кумулятивно). Во всех случаях для создания исходного сокращения использовали фенилэфрин в

концентрации, которая вызывала сократительный ответ, равный 60-80% от максимального.

Перед проведением исследований in vitro в этой серии экспериментов у крыс были исследованы параметры почечной функции с использованием метаболических камер.

Обработка результатов. Показания тензометрических датчиков оцифровывали с частотой 10 Гц с использованием аналого-цифрового преобразователя (Е-14-140М, L-Card, Россия) и непрерывно регистрировали на компьютере с помощью программы PowerGraph (ДИСофт, Россия). При обработке зависимости «концентрация-эффект» определяли показания датчика силы перед тестом и при действии каждой из концентраций MX, а затем для каждой из действующих концентраций вычисляли абсолютное изменение силы. Полученные значения нормировали на максимальное значение силы сокращения в первой зависимости «концентрация-эффект». Чувствительность сосудов к MX оценивали по отрицательному логарифму ECj0 — концентрации агониста, вызывающей 50 % максимального ответа. Значение ЕС50 вычисляли в программе GraphPad Prism (версия 4.0). Величину реакции на ацетилхолин (DEA-NO) оценивали по уменьшению силы сокращения (в процентах от предварительного сокращения).

Статистическую обработку результатов для большинства показателей проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Зависимости «концентрация-эффект» для MX сравнивали с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, п - объем выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех сериях экспериментов введение СТЗ сопровождается сходными изменениями в организме крыс

В начале эксперимента концентрация глюкозы в крови контрольных и диабетических животных не различалась и находилась в пределах физиологической нормы (рисунок 1 А). В контрольной группе крыс введение растворителя не оказывало влияния на уровень глюкозы крови. У крыс, получавших СТЗ, уже через трое суток наблюдалась выраженная гипергликемия, которая сохранялась в течение последующих шести недель (рисунок 1 А). Масса тела крыс после введения СТЗ была уменьшенной по сравнению с контролем уже через трое суток, и в ходе эксперимента различие между двумя группами увеличивалось (рисунок 1Б).

Важно, что различия по таким показателям как концентрация глюкозы в крови, масса тела и масса почки между крысами с СД и контрольными крысами были сходными во всех проведенных нами сериях экспериментов. Это говорит о том, что данная модель СД воспроизводима и позволяет проводить совокупный анализ диабетических изменений, обнаруженных в этих экспериментальных сериях.

А

Б

О Контроль

□ Диабет

ЙЬ гЬ

400'

Г

250

-о- Контроль

Диабет

Л

0 3 день 3 4 6 недели

0 Здень 2 3 4 недели

Рисунок 1. Динамика концентрации глюкозы в крови (А) и массы тела (Б) крыс, получавших в день «0» инъекции СТЗ (Диабет, п=11) и растворителя (Контроль, п=11) в первой серии экспериментов. *р<0,05 по сравнению с соответствующим значением в группе «Контроль» (критерий Манна-Уитни).

В почках крыс через 6 недель после введения СТЗ наблюдаются повышение скорости клубочковой фильтрации и микроальбуминурия

Кроме увеличения концентрации глюкозы в крови и снижения массы тела, у крыс с СД зарегистрированы изменения многих других показателей (таблица 1). Так, крысы с СД потребляли значительно больше корма и, соответственно, экскретировали больше фекалий, чем контрольные животные, что согласуется с данными других авторов [Загга^агё ег а1., 2001; ЯеЬзошеп с! а1., 2006]. Гиперфагия при диабете связана с интенсивной экскрецией глюкозы с мочой: в нашем эксперименте концентрация глюкозы в моче у всех крыс с диабетом превышала 56 ммоль/л. Концентрация (3-кетонов в крови у крыс с СД была в два раза выше, чем у контрольных животных.

Масса почки у крыс с СД была увеличенной, а относительная масса почки (в пересчете на 1 кг массы тела) - вдвое больше, чем у контрольных крыс, что отражает изменения почечной функции. В частности, происходит уменьшение продукции эритропоэтина и развитие анемии [Уоткинс, 2006], что в нашем исследовании проявлялось в виде снижения гематокрита.

Концентрация креатинина в плазме крови крыс через 6 недель после введения СТЗ еще не была повышенной, а его концентрация в моче была сниженной в результате многократного увеличения скорости диуреза. Для оценки фильтрационной способности почек мы вычисляли клиренс креатинина, этот показатель у крыс с СД был в 1,7 раз выше, чем в контроле.

Экскреция альбумина, основного белка плазмы крови, с мочой, характеризует проницаемость почечного фильтра для белков. Через 6 недель после введения СТЗ скорость экскреции альбумина у крыс с СД в 4,2 раза выше, чем в контроле. Кроме того, мы вычисляли сотношение альбумина и креатинина в моче, этот показатель позволяет соотнести количество выводимого с мочой альбумина со скоростью гломерулярной фильтрации,

которая соотносима с количеством экскретируемого креатинина [Уо1ре, 2008]. В нашем эксперименте отношение альбумин/креатинин в моче крыс с диабетом было в 2,2 раза больше, чем у крыс контрольной группы.

Таблица 1. Показатели, характеризующие интенсивность обмена веществ и экскреторную функцию почек. * р< 0,05 по сравнению с группой «Контроль» (критерий Манна-Уитни).___

Показатели Контроль (п = 11) Диабет (п= 11)

Масса тела, г 399,1±9,9 260,6±11,1*

Масса правой почки, г 1,14±0,06 1,48±0,06*

Относительная масса правой почки, г/кг 2,9±0,1 5,6±0,2*

Глюкоза в крови, ммоль/л 5,1±0,1 29,2±1,3*

Р-кетоны в крови, ммоль/л 0,22±0,02 0,46±0,06*

Гематокрит, % 46,3±0,7 34,4±3,4*

Потребление корма, г/кг/сутки 68,1±2,1 144,2±9,3*

Масса фекалий, г/кг/сутки 20,6±1,8 81,2±7,1*

Потребление воды, мл/кг/сутки 87,4±3,7 745,5±53,8*

Диурез, мл/кг/сутки 23,5±1,6 616,5±59,3*

Креатинин в плазме крови, мкмоль/л 52,2±2,1 56,3±3,0

Креатинин в моче, мкмоль/л 11426,3±875,1 795,8±64,1*

Клиренс креатинина, мл/кг/сутки 4939,3±227,5 8578,2±721,6*

Альбумин в моче, мкг/мл 36,40±4,10 5,51±0,47*

Экскреция альбумина, мг/кг/сутки 0,82±0,08 3,46±0,47*

Альбумин/ креатинин в моче, мкг/мг 29,31±3,14 64,47±7,18*

В целом, результаты суточного мониторинга животных в метаболических камерах позволяют заключить, что через 6 недель после введения СТЗ в почках крыс развиваются изменения, характерные для гиперфильтрационной фазы СД, которые сопровождаются повышением скорости экскреции альбумина (микроальбуминурией). Следует отметить, что такие изменения нельзя объяснить токсическим влиянием СТЗ на почки: показано, что трансплантация островков Лангерганса в селезенку крыс сразу после введения СТЗ приводит к нормализации у них не только содержания инсулина и глюкозы в крови, но и таких показателей, как потребление воды, диурез, скорость клубочковой фильтрации, экскреция альбумина и напряжение кислорода в ткани почки [Palm et al., 2004].

Поскольку фильтрационная способность почек коренным образом зависит от регуляции тонуса артериальных сосудов почки [Уоткинс, 2006; Дедов, Шестакова, 2006], можно ожидать, что в артериях почек крыс с СД происходят существенные регуляторные изменения. Этот вопрос мы исследовали на следующем этапе работы.

Регуляторные изменения артерий разных органов у крыс с СД

Известно, что в разных органах развитие сосудистых патологий при СД 1 типа может существенно различаться [Lucas, Foy, 1977; Hill, Larkins, 1989; Kiff et al., 1991; Johansen et al, 2013], но вместе с тем в литературе нет данных о сопоставлении изменений артерий большого числа органов у одних и тех же крыс. В связи с этим мы провели сравнение эффектов СД на характеристики артерий, регулирующих кровоснабжение кожи, скелетных мышц (локомоторной и дыхательной), тонкого кишечника и почки у одних и тех же животных. Во-первых, мы исследовали сократительные реакции артерий на MX, агонист ои-адренорецепторов, которые являются основной мишенью норадреналина, выделяющегося из вазомоторных симпатических волокон. Важно, что в отличие от многих других адреномиметиков MX не подвергается нейрональному захвату [Burgen, Iversen, 1965], т.е. его можно использовать для сравнения адренореактивности артерий с разной плотностью симпатической иннервации. Во-вторых, мы исследовали реакции расслабления артериальных препаратов в ответ на ацетилхолин, что является стандартным подходом при оценке функциональной активности эндотелия.

Как видно из таблицы 2, диаметр большинства исследуемых артерий у крыс с СД и контрольных крыс не различался, за исключением артерий брыжейки, просвет которых при СД был шире. Это согласуется с данными других авторов [Johansen et al., 2013] и может отражать структурную адаптацию артерий брыжейки к интенсивному кровоснабжению тонкого кишечника, так как потребление пищи при диабете значительно увеличено (таблица 1).

Максимальная реакция артерий на MX характеризует их сократимость и зависит, в первую очередь, от толщины гладкомышечного слоя в стенке. Сократимость артерий кожи, диафрагмы, брыжейки и почек у двух групп крыс не различалась. Однако сократимость артерии, приносящей кровь к медиальной головке икроножной мышцы, у крыс с СД была на 20% меньше, чем в контроле. Такое изменение коррелировало с 21% уменьшением массы этой мышцы при СД (контроль - 4,39±0,18 г/кг, СД - 3,48±0,16 г/кг массы тела, р<0,05) и могло отражать уменьшение потребностей этой мышцы в кровоснабжении в связи с развитием диабетической миопатии. При этом сократимость артерии диафрагмы при СД не изменялась, что можно объяснить большим содержанием в диафрагме оксидативных волокон [Delp et al., 1996], которые меньше страдают при диабете, чем гликолитические [Jerkovic et al., 2009].

Чувствительность артерий к MX оценивали по показателю -IgECSO (таблица 2). Видно, что большинство исследованных артерий (подкожная артерия, артерии диафрагмы, икроножной мышцы и брыжейки) не различаются по чувствительности к MX у диабетических и контрольных крыс. Однако артерии почки у крыс с СД характеризовались повышенной чувствительностью к MX по сравнению с контролем: концентрация MX, вызывающая 50% ответ, при СД была вдвое меньше, чем в контроле.

Таблица 2. Характеристики мелких артерий разных органов крысы: внутренний диаметр, максимальная реакция на МХ и чувствительность к МХ. Приведены значения внутреннего диаметра артерий при уровне трансмурального давления 100 мм рт.ст. (вычислены по пассивной эластической характеристике). * р<0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни).__

Тип артерии Контроль п Диабет п

Внутренний диаметр (<1юо)

Подкожная артерия 577,0±29,7 9 615,7±20,0 11

Артерия икроножной мышцы 355,0±14,8 10 328,2±20,9 10

Артерия диафрагмы 275,6±5,4 10 266,9±7,4 8

Артерии брыжейки 360,7±14,4 11 420,7±20,2* 11

Артерии почек 398,0±10,5 10 405,0±12,5 11

Максимальная реакция на метоксамин (мН)

Подкожная артерия 32,89±2,98 9 29,91±2,48 11

Артерия икроножной мышцы 19,81±0,95 10 15,82±1,07* 10

Артерия диафрагмы 13,76±1,01 10 12,78±11,11 8

Артерии брыжейки 19,82±0,93 11 21,35±1,31 11

Артерии почек 22,10±1,95 10 20,66±1,05 11

Чувствительность к метоксамину (-1% ЕС ¡о)

Подкожная артерия 5,84±0,12 9 5,75±0,10 11

Артерия икроножной мышцы 5,94±0,07 10 6,01±0,09 10

Артерия диафрагмы 6,03±0,05 10 6,13±0,19 8

Артерии брыжейки 5,83±0,06 11 5,87±0,06 11

Артерии почек 6,24±0,06 10 6,52±0,07* И

Результаты исследования реакций сосудов на ацетилхолин представлены на рисунке 2. Для большинства артерий при диабете было характерным уменьшение реактивности на ацетилхолин. При этом в подкожной артерии, артерии диафрагмы и артериях брыжейки выявлены статистически значимые различия между двумя группами. В артерии икроножной мышцы различия имели характер тенденции, но также в сторону уменьшения. В отличие от всех остальных артерий, артерии почки у крыс с СД 1 типа характеризовались не уменьшением, а увеличением реакций на ацетилхолин (при его действии в высоких концентрациях).

Таким образом, у крыс через 6 недель после введения СТЗ в почке наблюдаются изменения артерий, отличные от изменений артерий в других органах:

- только для артерий почки характерно повышение чувствительности к агонисту агадренорецепторов;

- в почке наблюдается не уменьшение, а увеличение реакций эндотелий-зависимого расслабления артерий.

Далее мы исследовали механизмы изменения функционирования гладкой мышцы и эндотелия в артериях почки крыс с СД.

А. Подкожная артерия

1д [Ацетилхолин] { -7

•О- Контроль -Д- Диабет

-100-

В. Артерия диафрагмы

1д [Ацетилхолин] (М) 0-,—8- -? -го-

си

I -40-

а> с ю

я -60-

с

-О- Контроль -Д- Диабет

Д. Мелкие артерии почки

1д [Ацетилхолин] (М)

-7 -6 -5

г? -20-

-О- Контроль -Д- Диабет

Б. Артерия икроножной мышцы

1д [Ацетилхолин] (М)

Г. Мелкие артерии брыжейки 1д [Ацетилхолин] (М)

-9 -8 -7

-100-1

Рисунок 2. Зависимости «концентрация ацетилхолина -эффект» для препаратов подкожной артерии (А), артерии икроножной мышцы (Б), артерий диафрагмы (В), артерии брыжейки (Г) и артерий почки

(Д)-

р<0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни).

Изменение сократительных ответов артерий почки при СД связано с активностью сигнальных путей, регулирующих чувствительность сократительного аппарата к Са2+

Хорошо известно, что сокращение гладкомышечных клеток развивается в результате активации двух взаимодополняющих механизмов [Hirano, 2007]. Первый из них связан с повышением внутриклеточной концентрации Са2+, активацией киназы легких цепей миозина, фосфорилированием легких цепей миозина и «включением» его моторной активности. Активность второго механизма также приводит к увеличению количества фосфорилированного (активного) миозина в гладкомышечной клетке, но другим способом - путем замедления его дефосфорилирования, т.е. ингибирования фосфатазы легких цепей миозина; в результате происходит повышение чувствительности сократительного аппарата к Са2+. Недавно было показано, что сокращение гладкомышечных клеток в сосудах крыс с СД 1 типа развивается на фоне менее значительного, чем в контроле, повышения внутриклеточной концентрации Са2+ [Chow et al., 2001; Searls et al., 2010]. В связи с этим мы предположили, что увеличение сократительных ответов артерий почки у крыс с СД обусловлено повышением активности «второго пути», т.е. оно происходит в результате увеличения Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы.

Ведущую роль в ингибировании фосфатазы легких цепей миозина при сокращении гладкой мышцы играют две протеинкиназы - Rho-киназа и ПКС [Воротников и др., 2002; Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007]. Повышение активности этих сигнальных путей при СД 1 типа было показано ранее для некоторых артерий крысы, но на более поздних сроках развития патологии [Abebe et al., 1990; Mueed et al., 2005; Kizub et al., 2010], для артерий почки эта проблема не изучена. В связи с этим на следующем этапе работы мы поставили задачу исследовать роль Rho-киназы и ПКС в регуляции сокращения артерий почки у крыс с 6-недельным СД 1 типа. Для выявления вклада этих путей в сократительный ответ гладкой мышцы мы использовали специфические ингибиторы этих киназ - Y27632 (3*10 6 М) и GF109203X (10 6 М).

Влияние этих ингибиторов на сокращение артерий почки исследовали в двух сериях экспериментов, в первой из которых использовали артериальные препараты с интактным (Серия 2), а во второй - с удаленным эндотелием (Серия 3). Результаты этих исследований были сходными. Однако, поскольку о характеристиках гладкой мышцы можно с уверенностью судить только по сократительным ответам в отсутствие эндотелия, в автореферате будут рассмотрены только результаты Серии 3.

Артерии крыс с СД демонстрировали два типа изменений: они характеризовались увеличением спонтанного миогенного тонуса и повышением чувствительности к MX. Инкубация препаратов с ингибитором ПКС не приводила к изменению миогенного тонуса, в этих условиях миогенное сокращение артерий у крыс с СД по-прежнему было выше, чем у контрольных крыс (рисунок 3). Под действием ингибитора Rho-киназы миогенное сокращение препаратов у обеих групп крыс исчезало, что согласуется с

данными о высокой зависимости миогенного тонуса сосудов от активности Rho-киназы [Schubert et al., 2008]. Эти результаты говорят о том, что увеличение миогенного тонуса артерий почки крыс с СД может быть связано с более высокой активностью Rho-киназы.

Рисунок 3. Величина спонтанного миогенного сокращения почечных артерий с удаленным эндотелием у контрольных крыс (п=10) и крыс с СД (п=10) после 25-мин инкубации без ингибиторов, в присутствии ингибитора ПКС (СР109203Х, 10~6 М) и в присутствии ингибитора Мо-киназы (У27632, 3 * 10"6 М).

* р<0,05 по сравнению с соответствующим значением в группе «Контроль»; # р<0,05 по сравнению со значением у той же группы крыс без ингибиторов (крит.

Манна-Уитни).

Иная картина наблюдалась при ингибиторном анализе реакций на МХ. В отсутствие ингибиторов сократительные реакции артерий почки крыс с диабетом были увеличенными по сравнению с реакциями артерий контрольных крыс (рисунок 4 А и Б). Инкубация препаратов с ингибитором Rho-кинaзы приводила к значительному уменьшению сократительных ответов на МХ у обеих групп крыс, о чем свидетельствует выраженный сдвиг зависимостей «концентрация-эффект» вправо (рисунок 4 А). Однако в этих условиях реакции артерий у крыс с диабетом были по-прежнему увеличенными по сравнению с контролем. Это говорит о том, что увеличение адренореактивности артерий почки при СД 1 типа не связано с повышением активности РЬо-киназы.

При ингибировании ПКС в обеих группах также происходило уменьшение реакций на МХ, причем оно было еще более выраженным, чем при ингибировании Rho-кинaзы•. наблюдалось не только уменьшение чувствительности артерий к МХ, но и двукратное снижению максимального ответа (рисунок 4 Б). Но при этом важно, что под действием ингибитора ПКС различия в адренореактивности между двумя группами крыс исчезали, то есть причиной более высокой адренореактивности артерий крыс с СД 1 типа может быть увеличение активности ПКС-пути.

В целом, результаты этих экспериментов говорят о том, что склонность артерий почек у крыс с СД 1 типа к развитию спонтанного миогенного тонуса может объясняться повышенной активностью Rho-кинaзы. Вместе с тем, увеличение адренореактивности артерий почки у крыс с СД 1 типа связано с более выраженным влиянием ПКС, которая локализована в гладкомышечных клетках артериальной стенки.

|д [Метоксамин] (М) 1д [Метоксамин] (М)

1д [Метоксамин] (М) 1д [Метоксамин] (М)

Рисунок 4. Изменения реакций артерий почки с удаленным эндотелием на метоксамин при СД 1 типа (А, Б) и при денервации (В, Г). Приведены зависимости «концентрация метоксамина - эффект» в отсутствие ингибиторов (пунктирные линии на всех рисунках), в присутствии ингибитора Шю-киназы (У27632, 3*10"6 М, рисунки А и В) и в присутствии ингибитора ПКС (СР109203Х, 10"6 М, рисунки Б и Г). Количество экспериментов: диабет - п=10, контроль -п=10; денервация - п=14, контроль к денервации - п=6. *р<0,05 (дисперсионный анализ для повторных измерений)

Возникает вопрос: что может служить причиной изменения регуляции сокращения артерий почки при СД 1 типа? Маловероятно, что оно объясняется прямым влиянием гипергликемии на гладкую мышцу артерий, поскольку в таком случае следовало бы ожидать изменений не только в почке, но и в других органах. Известно, однако, что повышение чувствительности артерий к констрикторным стимулам развивается при нарушении их симпатической иннервации [Пуздрова, 2007; Веуап 1984; Тпроую е1 а1., 2013]. Также показано, что развитие СД приводит к патологическим изменениям симпатической вазомоторной регуляции, причем выраженность таких изменений может различаться в разных сосудистых бассейнах [Брет е1 а1., 2006; ^Иапзеп сМ а1„ 2013]. На основании этих положений мы выдвинули гипотезу о том, что изменение регуляции сокращения артерий почки при СД 1 типа связано с нарушением их симпатической иннервации. Проверке этой гипотезы были посвящены дальнейшие исследования.

Связь изменения сокращения артерий почки при СД 1 типа с нарушением симпатической иннервации.

Плотность иннервации артерий почки уменьшена у крыс при СД

На первом этапе проверки нашей гипотезы мы показали, что у крыс через 6 недель после введения СТЗ в артериях почки наблюдается уменьшение плотности сплетения адренергических нервных волокон. На рисунке 5 в препарате артерии контрольной крысы видно густое нервное сплетение, а в препарате крысы с СД оно более редкое. Количество пересечений нервных волокон с морфометрической сеткой у крыс с СД было уменьшено на 30% по сравнению с контрольными крысами (рисунок 6).

Таким образом, через 6 недель после введения крысам СТЗ в их почках наблюдается нарушение симпатической иннервации артериальных сосудов.

Рисунок 5. Сплетение адренергических нервных волокон в артериях почки контрольной крысы (А) и крысы с СД СТЗ (Б). Увеличение 40, размер кадра 326x258 мкм.

О Контроль □ Диабет 2.5-1

м 2.0Н г

= 1.5 о о о

О 1.0Н

0.5Н 0.0

Рисунок 6. Плотность сплетения адренергических нервных волокон в почечных артериях контрольных крыс (п=6) и крыс с диабетом (п=9). * р<0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни).

Денервация артерий почки приводит к увеличению вклада ПКС в регуляцию сокращения

На втором этапе проверки гипотезы мы исследовали изменения сокращения артерий почки с искусственно нарушенной симпатической иннервацией. Через две-три недели после денервации почки адренергические нервные волокна в стенке артерий либо совсем не выявлялись, либо были единичными и не формировали характерного сплетения. Денервация почки не влияла на массу тела: масса тела ложнооперированных крыс составляла 307,2±9,8 г (п=6), а крыс с денервированной почкой - 295,2±9,7 г (п=14; р>0,05).

Эксперименты т укго проводили на препаратах артерий почки с удаленным эндотелием, как и описанные выше эксперименты на артериях почки крыс с СД. Значения диаметра (с1юо) контрольных и денервированных артерий не различались и составили 369,3±21,3 мкм (п=6) и 392,7±8,8 мкм (п=14, р>0,05). Денервация также не влияла на величину максимального сокращения, развиваемого сосудами в ответ на МХ: контроль - 18,4±1,6 мН (п=6), денервация - 17,6±1,3 мН (п=14, р>0,05). Это свидетельствует о том, что сравнительно кратковременное (в течение 2-3 недель) устранение симпатической иннервации не приводит к структурным изменениям артерий.

Денервированные артерии были более чувствительными к действию МХ, чем артерии из почки ложнооперированных крыс (рисунок 4, В и Г), как и артерии почки крыс СД 1 типа. Изменения реактивности на МХ после ингибирования Юю-киназы и ПКС в денервированных артериях и в артериях крыс с СД также были сходными (рисунок 4, В и Г). Как и в предыдущей серии экспериментов, инкубация препаратов с ингибитором Юю-киназы (У27532, 3*10* М) приводила к уменьшению реакций на МХ, но и в этих условиях денервированные артерии были более чувствительными к МХ, чем иннервированные (рисунок 4В). Однако в присутствии ингибитора ПКС (СР109203Х, 10"6 М) различия в реактивности на МХ между двумя группами не наблюдалось (рисунок 4Г).

Сопоставление данных, полученных в двух сериях экспериментов, показывает, что в артериях с нарушенной (при СД) или с разрушенной (при денервации) иннервацией гладкая мышца более чувствительна к действию MX, чем в нормально иннервированных артериях, причем в обоих случаях различие реакций на MX исчезает при ингибировании ПКС. Такое сходство механизмов изменения сосудистых реакций при двух воздействиях подтверждает нашу гипотезу о том, что изменения в гладкой мышце артерий почки у крыс при СД 1 типа связаны с нарушением их симпатической иннервации.

Механизмы изменения эндотелий-зависимых реакций артерий почки при диабете

Путем секреции различных веществ эндотелий обеспечивает поддержание баланса между сужением и расширением сосудов. К эндотелиальным вазодилятаторным факторам относят оксид азота (N0), простациклин и эндотелиальный гиперполяризующий фактор (EDHF), а к вазоконстрикторным - тромбоксан Аг, эндотелии-1, а также ангиотензин И, супероксид анион и др. [Медведева и др., 2001; Vanhoutte, Tang, 2008]. Относительный вклад этих механизмов в эндотелий-зависимую регуляцию тонуса сосудов и кровотока в органах варьирует в зависимости от пола и вида животного, а также размера сосуда и типа сосудистого русла. В норме, т.е. при отсутствии патологических явлений, секреторная активность эндотелия смещена в сторону продукции вазодилятаторных соединений, а при старении организма и различных патологиях секреторная активность эндотелия смещается в сторону продукции вазоконстрикторов [Медведева и др., 2001; Давыдова и др., 2003; Sandow et al., 2009].

В первой серии экспериментов мы показали, что у крыс с СД 1 типа реакции артерий почек на ацетилхолин не уменьшены, как в большинстве органов, а, напротив, увеличены по сравнению с контрольными животными (рисунок 2Д). В заключительной части работы мы исследовали механизмы таких изменений. Ингибирование NO-синтазы с помощью L-NNA (Ю-4 М) приводило к уменьшению реакции на ацетилхолин, степень уменьшения была приблизительно одинаковой у двух групп крыс (рисунок 7А и Б). Поскольку реакции расслабления артерий при действии донора оксида азота DEA-NO у двух групп крыс не различались (рисунок 7В), то можно говорить о сопоставимой продукции NO эндотелием артерий в контроле и при диабете.

У контрольных крыс при совместном ингибировании NO-синтазы и ЦОГ зависимость «концентрация ацетилхолина - эффект» лежала ниже, чем при ингибировании только NO-синтазы (рисунок 7А). Это говорит о том, что в артериях почки простаноиды, образующиеся из арахидоновой кислоты по ЦОГ-пути, преимущественно оказывают не расслабляющее, а сократительное влияние на гладкую мышцу, причем такое влияние проявляется при действии ацетилхолина в высоких концентрациях. Такое сокращение может быть связано с действием тромбоксана Аг или же простациклина, если он продуцируется эндотелием в большом количестве и взаимодействует с ТР-рецепторами гладкомышечных клеток [Vanhoutte, Tang, 2008].

Контроль

Диабет

В

lg [Ацетилхолин] (М) -8 . -7 -6 -5

-О- без ингибитора L-NNA

-100J -о- L-NNA+индометацин

lg [DEA-NO] (М) -8 -7

-О- Контроль Диабет

200-100-i о

-100 -200--300-

lg [Ацетилхолин] (М)

-7 -6 -5

•100J

Vi

-Д- без ингибитора -Д- L-NNA

•¿г L-NNA+индометацин

NO-компонент ЦОГ-комлонент EDHF-компонент

□ Контроль S Диабет

Рисунок 7. Механизмы эндотелий-зависимых реакций артерий почки у контрольных крыс (n=l 1) и крыс с СД (п=12). А и Б: Зависимости «концентрация-эффект» для ацетилхолина в контроле (А) и при СД (Б) без ингибиторов, при действии L-NNA (10"4 М) и при совместном действии L-NNA и индометацина (10'5 М) #р< 0,05 по сравн.с реакциями «без ингибиторов»; ®р<0,05 по сравн. с «L-NNA» (критерий Манна-Уитни). В: Реакции артерий на донор оксида азота DEA-NO.

Г: Компоненты реакции на ацетилхолин (пояснения в тексте). * р<0,05 по сравн. с «Контроль» (критерий Манна-Уитни).

Примечательно, что у крыс с диабетом сократительное влияние продуктов ЦОГ было выражено в меньшей степени: статистически значимых различий между кривыми «Ь-КЫА» и «Ь-КМА+индометацин» в этой группе не наблюдалось (рисунок 7Б).

Чтобы количественно оценить разные компоненты реакции на ацетилхолин, проводили следующие вычисления:

- компонент реакции, обусловленный действием N0, оценивали по величине области, заключенной между кривыми «концентрация-эффект» в условиях «без ингибиторов» и «Ь-ГТОА»;

- компонент реакции, обусловленный действием продуктов ЦОГ, соответствовал области между кривыми «Ь-№ЫА» и «Ь-ЫИА+индометацин»;

- наконец, компонент реакции, обусловленный действием ЕБНР, принимали равным области между кривой «Ь-МИА+индометацин» и осью абсцисс.

Как видно на рисунке 7Г, компоненты эндотелий-зависимой реакции артерий, обусловленные действием N0 и ЕБНР, не различаются в артериях крыс с диабетом и контрольных крыс. Вместе с тем, компонент, обусловленный действием продуктов ЦОГ, имеет положительное значение, то есть секретируемые эндотелием простаноиды оказывают сократительное влияние. Именно этот компонент различается у двух групп крыс: у крыс с диабетом он уменьшен по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение эндотелий-зависимого расслабления артерий почки у крыс с 6-недельным сахарным диабетом 1 типа связано с менее выраженным констрикторным влиянием секретируемых эндотелием простаноидов, а не с увеличением влияния вазодилататорных путей.

Таким образом, изменение эндотелий-зависимых реакций может вносить свой вклад в уменьшение тонуса почечных артерий, это может происходить при активации эндотелия напряжением сдвига, эндотелином 1 или другими местными регуляторами, которыми богата ткань почки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В сравнительном исследовании артерий из многих сосудистых регионов мы показали, что в почке изменения реакций артерий при СД 1 типа проявляются раньше и могут качественно отличаются от изменений в других органах. Одним из объяснений такой «склонности» артерий почки к диабетическим изменениям может служить то, что они подвергаются воздействию более высокой концентрации глюкозы, чем артерии других органов. Наши измерения показали, что у крыс с СД концентрация глюкозы в моче намного выше, чем в плазме крови. Из почечных канальцев глюкоза может попадать в ткань почки, где и располагаются артерии, которые мы использовали в экспериментах. Известно, что у животных с СД вне- и внутрипочечные артерии обладают разной чувствительностью к повышению концентрации глюкозы. Так, у мышей с СД 2 типа главная почечная артерия,

которая расположена вне почки, развивает значительно больший сократительный ответ на фенилэфрин после 30-мин инкубации в растворе с высоким содержанием глюкозы (22.2 мМ), тогда как такое же воздействие не оказывает влияния на артерии, расположенные внутри почки [ЪГоЬе й а1., 2008].

На основании полученных результатов мы предлагаем следующую схему изменений регуляции почечных артерий и их роли в функционировании почек на стадии ранних диабетических изменений, которые проявляются в виде гиперфильтрации и микроальбуминурии. Увеличение скорости клубочковой фильтрации на ранней стадии развития диабета обусловлено снижением тонуса приносящих артерий в результате двух типов изменений:

- увеличения эндотелий-зависимых реакций расслабления;

— уменьшения нейрогенного тонуса вследствие нарушения иннервации.

Однако нарушение иннервации приводит к повышению активности ПКС

в гладкой мышце артерий почки и к повышению их адреночувствительности. Это может частично компенсировать уменьшение симпатических влияний и ограничивать клубочковую фильтрацию. В связи с этим мы считаем, что повышение адреночувствительности артерий почки при диабете может тормозить развитие диабетической нефропатии.

В пользу такого предположения говорят данные литературы о том, что денервация почки у крыс при СД 1 типа может предотвращать нарушение почечной функции. Так, через две недели после введения СТЗ у крыс с предварительно денервированными почками, в отличие от крыс с иннервированными почками, не наблюдалось повышения скорости гломерулярной фильтрации и увеличения объема гломерул, хотя концентрация глюкозы в крови двух групп животных не различалась [ЬшрроЫ й а!., 2004].

Таким образом, повышение активности ПКС в гладкой мышце артерий почки при нарушении ее иннервации может служить компенсаторным механизмом, ослабляющим развитие почечной патологии при СД 1 типа.

выводы

1. Нарушение функции почек у крыс через 6 недель после введения стрептозотоцина проявляется в виде повышения клубочковой фильтрации и микроальбуминурии, о чем свидетельствует увеличение клиренса креатинина (в 1,7 раза) и отношения альбумин/креатинин в моче (в 2,2 раза).

2. В артериях почки крыс с СД длительностью 6 недель развиваются регуляторные изменения, не свойственные артериям других органов: увеличение сократительных ответов на ai-адреномиметик метоксамин и увеличение реакций эндотелий-зависимого расслабления.

3. Высокая спонтанная миогенная активность артерий почки у крыс с СД объясняется активностью Rho-киназы, а увеличение сократительных ответов при активации ai-адренорецспторов - активностью протеинкиназы С.

4. В артериях почки крыс с СД наблюдается уменьшение плотности сплетения адренергических нервных волокон, а денервация почки у крыс с нормальным уровнем глюкозы в крови сопровождается увеличением роли протеинкиназы С в регуляции сокращения. Это подтверждает гипотезу о связи изменения активности протеинкиназы С в артериях почки при СД с нарушением симпатической иннервации.

5. Увеличение эндотелий-зависимого расслабления артерий почки при СД объясняется уменьшением сократительного влияния простаноидов, но не увеличением влияния N0 или эндотелиального гиперполяризующего фактора.

* * *

Автор выражает искреннюю благодарность Борзых Анне Анатольевне (Институт медико-биологических проблем РАН) и Мартьянову Андрею Александровичу (Биологический факультет имени М.В.Ломоносова) за неоценимую помощь в планировании и проведении экспериментальной работы и в обсуждении результатов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПКС - протеинкиназа С СД - сахарный диабет СТЗ - стрептозотоцин ЦОГ - циклооксигеназа

DEA-NO - diethylamine NONOate diethylammonium salt EDHF - эндотелиальный гиперполяризующий фактор L-NNA -NÜJ-n¡tro-L-Arginine MX - метоксамин

Rho-киназа - киназа, активируемая белком Rho

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Болеева Г.С. Нарушение симпатической нейропередачи в артериях кожи у крыс с инсулин-зависимым сахарным диабетом. Вестник Адыгейского государственного университета. 2012. Вып. 3 (106). С.115-122

2. Болеева Г.С., Шарапова О.Н. Влияние этанола на констрикторные ответы изолированной хвостовой артерии Материалы XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010». Москва, 12-15 апреля 2010 г., С.267-268.

3. Болеева Г.С., Тянь Бо, Шарапова О.Н., Боровик A.C., Тарасова О.С. Механизмы снижения артериального давления при острой интоксикации этанолом. Тезисы докладов XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 19-25 сентября 2010 г., С.75-76.

4. Болеева Г.С., Борзых A.A., Кирюхина О.О., Моргунова Г.В., Тарасова О.С. Влияние инсулин-зависимого сахарного диабета на реактивность артерий разных органов крысы. Тезисы докладов V Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 31 января - 3 февраля 2012 г., С.25 - 26

5. Болеева Г.С. Влияние инсулинозависимого сахарного диабета на констрикторные ответы изолированной подкожной артерии крысы. Материалы XIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2011». Москва, 11-15 апреля 2011 г., С.251

6. Болеева Г.С., Борзых A.A. Механизмы повышения адренореактивности артерий почки у крыс при инсулинозависимом сахарном диабете. Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012». Москва, 9-13 апреля 2012 г., С.250-251

7. Г.С.Болеева, А.А.Борзых, А.А.Мартьянов, О.С.Тарасова Нефропатия у крыс с инсулинозависимым сахарным диабетом: возможная роль нарушения симпатической иннервации почечных артерий. Тезисы докладов VIII Всероссийской с международным участием конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 220-летию со дня рождения K.M. Бэра, Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2012 г., С. 40 - 41.

8. Болеева Г.С. Механизмы эндотелиальной дисфункции артерий почки у крыс с инсулинозависимым сахарным диабетом. Материалы XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2013». Москва, 8-13 апреля 2013 г., С.319

9. Каленчук В.У., Борзых A.A., Болеева Г.С., Тарасова О.С., Кошелев В.Б. Снижение депонирования оксида азота в стенке кровеносных сосудов крыс со стрептозотоцин индуцированным сахарным диабетом. Тезисы докладов. 9-й Международной научной конференции в сборнике «Микроциркуляция и гемореология». Ярославль, 29 июня-02 июля 2013 г., С. 74-74

10. Структурное и функциональное ремоделирование сосудистого русла: роль симпатической нервной системы. Тарасова О.С., Болеева Г.С., Борзых A.A., Гайнуллина Д.К., Софронова С.И., Мартьянов A.A. Тезисы докладов в сборнике XXII съезда Физиологического общества имени И. П. Павлова: Волгоград, 16-29 сентября 2013 г., с. 516-517

Подписано в печать 14.11.2013 Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 2412 Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 119192 Москва, Ломоносовский проспект, 27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болеева, Галина Сергеевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВ А Биологический факультет

На правах рукописи

04201365444

Болеева Галина Сергеевна

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АРТЕРИЙ ПОЧЕК У КРЫС ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1 ТИПА

Специальность - 03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, О.С. Тарасова

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИЗМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ КРОВООБРАЩЕНИЯ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ.................................................................................................10

1.1 Изменения параметров системной гемодинамики и скорости кровотока в разных органах.................................................................................................................10

1.2 Изменения экскреторной функции почек...............................................................11

1.3 Функциональные изменения артерий разных органов..........................................14

1.3.1 Изменения симпатической иннервации...............................................................14

1.3.2 Изменения регуляции сокращения гладкой мышцы сосудов............................16

1.3.2.1 Общая характеристика механизмов регуляция сокращения гладкой мышцы сосудов..............................................................................................................................17

1.3.2.2 Влияние диабета на регуляцию сокращения гладкой мышцы сосудов.........19

1.3.3 Изменения секреторной функции эндотелия.......................................................24

1.3.3.1 Регуляторные факторы, секретируемые эндотелием сосудов........................24

1.3.3.2 Изменение секреторной функции эндотелия при сахарном диабете.............27

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................31

2.1 Экспериментальные животные................................................................................31

2.2 Моделирование сахарного диабета 1 типа у крыс.................................................31

2.3 План проведения исследований...............................................................................32

2.4 Оценка морфологических и функциональных изменений в организме крыс с сахарным диабетом 1 типа..............................................................................................34

2.4.1 Измерение концентрации глюкозы в крови.........................................................35

2.4.2 Исследование почечной функции в метаболических камерах..........................35

2.4.2.1 Методика проведения эксперимента в метаболических камерах...................35

2.4.2.2 Методики определения показателей в образцах крови и мочи......................37

2.5 Методика денервации левой почки у крыс.............................................................37

2.6 Методики исследования артериальных сосудов....................................................39

2.6.1 Подготовка к эксперименту...................................................................................39

2.6.2 Визуализация адренергических нервных волокон в артериях почки...............40

2.6.3 Исследование реакций изолированных артерий.................... ..............................41

2.6.3.1 Принцип метода...................................................................................................41

2.6.3.2 Удаление эндотелия............................................................................................42

2.6.3.3 Нормализация (определение оптимального растяжения препарата).............43

2.6.3.4 Активация препарата...........................................................................................44

2.6.3.5 Материалы (фармакологические агенты), использовавшиеся в экспериментах на изолированных сосудах...................................................................45

2.6.3.6 Протоколы экспериментов.................................................................................47

2.6.3.7 Обработка результатов экспериментов на изолированных сосудах..............51

2.7 Статистическая обработка результатов...................................................................53

3 РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................................................................54

3.1 Характеристика модели индуцированного стрептозотоцином сахарного диабета у крыс................................................................................................................................54

3.1.1 Изменения концентрации глюкозы в крови, массы тела и почек......................54

3.1.2 Результаты исследования физиологических и биохимических показателей с использованием метаболических камер........................................................................57

3.2 Регуляторные изменения артерий разных органов у крыс с диабетом................62

3.3 Реакции артерий почки в растворах с нормальной и повышенной концентрацией глюкозы..................................................................................................68

3.4 Эффекты ингибиторов Шю-киназы и ПКС на сократительные ответы артерий почки с интактным эндотелием в контроле и при диабете.........................................70

3.5 Сравнение реакций на метоксамин артерий почки с интактным и удаленным эндотелием........................................................................................................................75

3.6 Эффекты ингибиторов Шю-киназы и ПКС на сократительные ответы артерий почки с удаленным эндотелием в контроле и при диабете.........................................77

3.7 Плотность иннервации артерий почки в контроле и при диабете........................81

3.8 Эффекты ингибиторов Шю-киназы и ПКС на сократительные ответы денервированных артерий почки с удаленным эндотелием.......................................83

3.9 Механизмы изменения эндотелий-зависимых реакций артерий почки при

диабете..............................................................................................................................87

3.9.1 Сравнение компонентов реакции артерий почки на ацетилхолин у контрольных и диабетических крыс..............................................................................88

3.9.2 Сравнение компонентов реакции на ацетилхолин у двух подгрупп крыс с

диабетом...........................................................................................................................91

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................96

4.1 Изменения артерий почки при диабете по сравнению с артериями других органов..............................................................................................................................96

4.2 Механизмы функциональных изменений гладкой мышцы артерий почки при диабете. Роль трофического влияния симпатических нервов...................................100

4.3 Механизмы функциональных изменений эндотелия артерий почки при диабете

.........................................................................................................................................104

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

ГМК - гладкомышечные клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

КЛЦМ - киназа легких цепей миозина

ЛЦМ - регуляторные легкие цепи миозина

МО - минутный объем сердца

ПКС - протеинкиназа С

СД - сахарный диабет

СТЗ - стрептозотоцин

ФЛЦМ - фосфатаза легких цепей миозина

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭТ - эндотелии

[Ca2+]j - внутриклеточная концентрация Са2+

Л I

ВКСа - Са -активируемые калиевые каналы большой проводимости

CPI-17 - 17-кДа белок, активируемый С-киназой ингибитор фосфатазы (C-kinase-

potentiated inhibitor)

DEA-NO - diethylamine NONOate diethylammonium salt EDHF - эндотелиальный гиперполяризующий фактор

Л i

IKca - Са -активируемые калиевые каналы средней проводимости 1Р3 - инозитолтрифосфат L-NNA -N^-nitro-L-Arginine

MYPT - регуляторная субъединица фосфатазы легких цепей миозина NO - оксид азота

Rho-киназа - киназа, активируемая белком Rho

SKCa - Са2+-активируемые калиевые каналы малой проводимости

VEGF - фактор роста сосудистого эндотелия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) — это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом уменьшения секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов [Дедов, Шестакова, 2006]. СД является одним из наиболее социально значимых заболеваний в современном обществе, его распространенность неуклонно растет и, по эпидемиологическим прогнозам, к 2030 году достигнет 7-8% от общей численности населения мира [Shaw et al., 2010]. Приблизительно 10% всех случаев СД приходится на СД 1 типа [Дедов, Шестакова, 2006], который развивается в результате разрушения ß-клеток поджелудочной железы, в итоге прекращается продукция инсулина - ключевого регулятора процессов углеводного и липидного обмена в организме. В экспериментах на животных СД 1 типа чаще всего моделируют путем введения стрептозотоцина (СТЗ) [Szkudelski 2001; Lenzen 2008].

Патологические изменения в органах и тканях при СД связаны как с непосредственным влиянием гипергликемии, так и с нарушением кровоснабжения. Сосудистые нарушения являются основной причиной ухудшения качества жизни и гибели больных СД. Развитие СД 1 типа ведет к патологическим изменениям всех элементов сосудистой стенки: эндотелия, гладкой мышцы и интрамуральных нервных сплетений [Дедов, Шестакова, 2006; Forbes, Cooper, 2013]. Повреждающее влияние гипергликемии на эндотелий и гладкую мышцу сосудов может развиваться с участием разных механизмов, что связано с различием путей транспорта глюкозы в эти клетки. Транспорт глюкозы в эндотелиальные клетки осуществляется переносчиками, работа которых не зависит от влияния инсулина, в связи с этим дисфункция эндотелия при СД связана с перегрузкой клеток глюкозой [De Vriese et al., 2000]. В гладкомышечные клетки половина всего количества глюкозы транспортируются переносчиком GLUT4, экспрессия и активность которого регулируются инсулином [Park et al., 2005], в связи с чем изменение функционирования гладкой мышцы при СД может развиваться другим путем.

Хотя нарушение регуляции сосудов при СД 1 типа связывают с влиянием системных факторов, таких как гипергликемия и связанный с ней окислительный

стресс [Forbes, Cooper, 2013], известно, что динамика и выраженность сосудистых патологий могут существенно различаться в разных органах. Это проявляется как в кровоснабжении разных органов [Lucas, Foy, 1977; Hill, Larkins, 1989; Kiff et al., 1991], так в регуляторных характеристиках изолированных из этих органов артериальных сосудов [Johansen et al., 2013]. Однако в настоящее время судить о регионарной специфике сосудистых изменений при СД 1 типа довольно трудно, так как данные литературы по этому вопросу противоречивы [Ralevic et al., 1995: Johansen et al., 2013]. Для ответа на этот вопрос необходимо исследовать диабетические изменения сосудов разных органов у одних и тех же животных.

Уже на ранней стадии развития СД 1 типа наблюдаются глубокие изменения функционирования почек [Samnegard et al., 2001; Rebsomen et al., 2006], которые связаны с изменением регуляции тонуса артерий, приносящих кровь к почечным клубочкам [Carmines, 2010]. Ранние гемодинамические нарушения в почках проявляются в виде расширения прегломерулярных сосудов, повышения давления в клубочковых капиллярах и увеличения скорости фильтрации [Forbes, Cooper, 2013; Дедов, Шестакова, 2006]. Считается, что клубочковая гиперфильтрация является важным патогенетическим звеном развития диабетической нефропатии, поскольку она ведет к изменениям в гломерулах (разрастанию мезангиальных клеток и матрикса, гломерулосклерозу) и к изменению проницаемости почечного фильтра [Levine, 2008; Magee et al., 2009].

Следует отметить, что регуляторные изменения артерий почки при СД 1 типа изучены мало: остаются неясными механизмы изменения сократимости гладкой мышцы и эндотелий-зависимой регуляции тонуса (вклад различных эндотелиальных факторов и их взаимодействие с гладкомышечными клетками сосуда). Принимая во внимание важную роль почек в поддержании гомеостаза в организме и регуляции работы сердечно-сосудистой системы, мы считаем, что исследование регуляторных изменений артерий почки при СД 1 типа актуально как для физиологии, так и для фундаментальной медицины.

Целью данной работы было выявить и изучить функциональные изменения гладкой мышцы и эндотелия в мелких артериях почки у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом (СД).

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать экскреторную функцию почек у крыс через 6 недель после введения стрептозотоцина.

2. Исследовать вызванные СД изменения реакций ах-адренергического сокращения и эндотелий-зависимого расслабления артерий почки, сопоставить их с изменениями реакций артерий кожи, скелетных мышц и тонкого кишечника.

3. Исследовать роль сигнальных путей, связанных с активацией Юю-киназы и протеинкиназы С, в регуляции сокращения артерий почки у крыс с СД.

4. Провести экспериментальную проверку гипотезы о сходстве механизмов изменения сокращения почечных артерий при СД и при нарушении симпатической иннервации.

5. Исследовать механизмы изменения эндотелий-зависимого расслабления артерий почки у крыс с СД.

Научная новизна работы. Результаты, полученные в данной работе, развивают современные представления о механизмах изменения регуляции артериальных сосудов при СД 1 типа. Впервые путем прямого сопоставления диабетических изменений в большом числе органов показано, что сосудистые изменения в почке могут качественно отличаться от изменений в таких органах, как кожа, скелетные мышцы и тонкий кишечник. Впервые показано, что нарушение иннервации артерий почки при СД 1 типа приводит к компенсаторному повышению их сократительных ответов при активации ах-адренорецепторов вследствие увеличения вклада протеинкиназы С в регуляцию сокращения. В связи с этим полученные результаты дополняют наши представления о механизмах долговременного влияния симпатических нервов на органы-мишени.

Практическая значимость работы. Значимость настоящей работы для фундаментальной и практической медицины связана с неизбежным развитием сосудистых нарушений при СД 1 типа и их ролью в патогенезе диабетических органопатий. Согласно полученным данным, изменение сократительных ответов артерий почки при СД 1 типа происходит в результате повышения активности

внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих чувствительность

94-

сократительного аппарата гладкомышечных клеток к Са . Хотя на ранних этапах СД такие изменения могут компенсировать нарушение нервной регуляции артерий почки, в дальнейшем гиперактивность тех же сигнальных путей может служить причиной уменьшения почечного кровотока и приводить к диабетической нефропатии. Следует отметить, что Мю-киназа и протеинкиназа С рассматриваются в настоящее время в качестве перспективных мишеней для фармакологической коррекции нарушений сократимости гладкой мышцы сосудов. Еще одна сфера использования результатов данной работы связана с необходимостью понимания последствий такого воздействия как денервация почек, которое все чаще применяется в медицине для лечения фармакорезистентной артериальной гипертензии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изменения регуляции артерий при СД 1 типа в почке проявляются раньше и иначе, чем в большинстве других органов.

2. Уменьшение тонуса артерий, расположенных в почке проксимально от почечных клубочков, в гиперфильтрационной фазе СД 1 типа обусловлено ослаблением симпатических влияний вследствие разреживания иннервации и уменьшения констрикторного влияния продуцируемых эндотелием простаноидов.

3. Нарушение иннервации артерий почки в гиперфильтрационной фазе СД 1 типа сопровождается компенсаторным повышением их адренореактивности вследствие увеличения активности протеинкиназы С.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИЗМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ

КРОВООБРАЩЕНИЯ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

1.1 Изменения параметров системной гемодинамики и скорости кровотока в разных органах

Известно, что вероятность артериальной гипертензии у больных сахарным диабетом в два раза выше, чем для населения в среднем, хотя при СД 1 типа она намного ниже, чем при СД 2 типа [Дедов, Шестакова, 2006]. При СД 1 типа развитие артериальной гипертензии тесно связано с диабетической нефропатией, которая, как правило, развивается у больных с длительным стажем заболевания [Дедов, Шестакова, 2006]. В связи с этим не удивительно, что на ранних сроках развития сахарного диабета 1 типа у крыс не наблюдается повышения артериального давления (АД). Напротив, через 24 ч после введения СТЗ АД может быть снижено [Kuznetsova et al., 1993], но нормализуется через две-четыре недели [Kiff et al.,1991; Hill, Larkins, 1989]. По данным других авторов, АД может сохраняться на низком уровне до 13 недели, что сопряжено с нарушением симпатической регуляции сердца и сосудов [Medvedeva et al.,1991].

Снижение АД обусловлено уменьшением общего периферического сопротивления сосудов, тогда как минутный объем сердца (МО), напротив, увеличен, в основном за счет увеличения ударного объема [Kuznetsova et al., 1993; Medvedeva et al., 1991]. Однако в других работах после введения СТЗ было показано лишь транзиторное увеличение МО к концу второй недели с дальнейшей нормализацией к четвертой неделе [Hill, Larkins, 1989] или же отсутствие изменений МО через 3, 14 и 60 дней после введения СТЗ [Lucas, Foy, 1977].

Данные о распределении сердечного выброса между органами в основном были получены с использованием радиоактивно меченых микросфер, поэтому не надо удивляться, что они относятся к публикациям 20-30 летней давности, когда эта методика удачно использовалась в большом числе лабораторий мира.

Через 24 ч после введения СТЗ наблюдается снижение общего периферического сопротивления, которое связано с расширением сосудов в большом числе органов и тканей: коже, скелетных мышцах, вкл�