Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс

Мочалов, Степан Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс"

(ШШИИИ!

\_____0У4Ь ¿- <1.-

На правах рукописи

МОЧАЛОВ СТЕПАН ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

РОЛЬ КНО-КИНАЗЫ И ПРОТЕИНКИНАЗЫ С В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАЩЕНИЯ ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ НОВОРОЖДЕННЫХ И ВЗРОСЛЫХ КРЫС

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

1 7иЮп2 и I ь

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (заведующий - профессор A.A. Каменский) МГУ имени М.В. Ломоносова, на кафедре биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины (заведующий - академик В.А. Ткачук) МГУ имени М.В. Ломоносова и в Институте физиологии университета г. Росток (Германия).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор кафедры

Тарасова физиологии человека и животных

биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Владимир Павлович Ширинский

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией клеточной подвижности Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития России

Мария Павловна Давыдова

кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем РАН

Защита диссертации состоится 07 июня 2010 года в 15 ч ЗОмин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: Ленинские горы, д.1, строение 12, Москва, ГСП-1, 119991, ауд. М-1

Автореферат разослан 07 мая 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Mß

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гладкая мышца стенки артериальных сосудов обеспечивает изменение их тонуса и, следовательно, регуляцию кровоснабжения органов и уровня системного артериального давления. В раннем постнатальном онтогенезе в системе кровообращения происходят значительные изменения, которые связаны как с активностью регуляторных систем, так и с сократительными характеристиками гладкомышечных клеток сосудов. Нарушение сбалансированности этих процессов ведет к развитию различных сердечно-сосудистых патологий (Wettschureck, Offermanns, 2002).

Динамика процессов возрастных изменений кровообращения различается у разных видов млекопитающих и коррелирует с темпом общего созревания организма. Удобной экспериментальной моделью таких изменений в организме человека являются крысы: по степени зрелости систем организма новорожденный крысенок сходен с недоношенным (рожденным на 7-8 месяце беременности) ребенком. Изучение механизмов регуляции кровообращения у новорожденных крысят позволяет понять, как происходят соответствующие изменения в организме человека, а также моделировать различные патологические процессы и разрабатывать новые способы их коррекции.

В отличие от поперечно-полосатой, в гладкой мышце в основном реализуется миозиновый тип регуляции сокращения. Это означает, что для выполнения своей моторной функции (взаимодействия с актином) гладкомышечный миозин должен быть предварительно активирован путем фосфорилирования остатка Ser" регуляторных легких цепей (ЛЦМ). Такое фосфорилирование осуществляется киназой легких цепей миозина (КЛЦМ), которая активируется комплексом Са2+-кальмодулин при повышении концентрации внутриклеточного Са2+ ([Ca2+]¡) (Hartshorne, 1998; Ito et al., 2004; Somlyo, Somlyo, 2003). Противоположным по функции ферментом является фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ), ее каталитическая активность обеспечивает расслабление гладкой мышцы. Сила сокращения гладких мышц во многом зависит от уровня фосфорилирования миозина в клетке, т.е. от баланса активностей КЛЦМ и ФЛЦМ. Важно, что многие сократительные стимулы (активация рецепторов, сопряженных с G-белками, деполяризация наружной мембраны и др.) могут сдвигать этот баланс в сторону фосфорилирования, в основном за счет подавления активности ФЛЦМ (Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007; Ratz 2005). В результате ингибирования ФЛЦМ количество фосфорилированных ЛЦМ возрастает при неизменной активности КЛЦМ. Следовательно, при той же [Ca2+]¡ развивается большее сокращение, такой феномен получил название Са~*-сенситизации или увеличения чувствительности сократительного аппарата к Ca*т (Horowitz et al., 1996).

ФЛЦМ может ингибироваться вследствие активации внутриклеточных сигнальных каскадов, включающих Rho-киназу и/или протеинкиназу С (Somlyo, Somlyo, 2003), причем вклад этих путей в гладкой мышце разных сосудов может существенно различаться. Например, в артериях брыжейки

Са2+-чувствительность сокращения регулируется в основном протеинкиназой С (Budzyn et al., 2006), а в хвостовой артерии - Rho-киназой (Mueed et al., 2004).

На данный момент установлено, что Са2+-чувствигельность сократительного аппарата гладкой мышцы сосудов у млекопитающих в раннем постнатальном периоде или на поздних этапах эмбрионального развития выше, чем у взрослых (Akopov et al., 1997; Akopov et al., 1998; Bruce, Nixon, 1997; Ekman et al., 2005; Sandoval et al., 2007; Пуздрова, 2007). Такое повышение Са2*-чувствительности коррелирует с увеличением степени фосфорилирования ЛЦМ (Sandoval et al., 2007), то есть оно связано с ингибированием ФЛЦМ. Однако механизмы этого явления исследованы крайне слабо. Некоторые авторы полагают, что высокая Са2+-чувствительность сокращения развивающейся гладкой мышцы обеспечивается активностью Rho-киназы (Akopov et al., 1998; Belik et al., 2005; Ekman et al., 2005), другие же связывают ее с активностью протеинкиназы С (Su et al., 2003).

В данной работе впервые проведено систематическое исследование механизмов повышения Са2+-чувствительности артериальных сосудов у крыс в возрасте 5-10 дней по сравнению с взрослыми животными. В качестве объекта исследования была выбрана подкожная артерия - ветвь бедренной артерии, приносящая кровь к плюсне и стопе. Подкожная артерия является сосудом мышечного типа, такие артерии играют роль в регуляции общего периферического сопротивления и уровня системного артериального давления. Предыдущие исследования Са2+-чувствительности сокращения сосудов в развивающемся организме проводились в основном для артерий головного мозга (Akopov et al., 1998) или легких (Belik et al., 2005), которые отличаются от артерий многих других органов по характеру иннервации и другим регуляторным характеристикам (Морман, Хеллер, 2000).

В наших экспериментах проводилась одновременная регистрация двух параметров - силы сокращения и [Са2+],, в отличие от предыдущих работ, где измерялась только сила сокращения сосудов (Belik et al., 2005; Ekman et al., 2005). Такой подход позволил нам адекватно оценить изменения Са2+-чувствителыюсти сократительного аппарата сосудов под действием ингибиторов Rho-киназы и протеинкиназы С. Важно, что исследование роли этих сигнальных киназ проводилось нами в артериях с интактной, а не пермеабилизированной, как ранее (Akopov et al., 1998), гладкой мышцей, что важно для сохранения в клетках ключевых регуляторных белков.

Наконец, в данной работе впервые исследовано сайт-специфическое фосфорилирование основной мишени Rho-киназы - MYPT (регуляторной субъединицы ФЛЦМ) в сосудах взрослых и новорожденных животных. Такой подход позволил нам оценить базальную активность Rho-киназы и ее изменения при активирующих воздействиях, что оказалось очень важным для интерпретации результатов, полученных при исследовании функциональных характеристик гладкой мышцы сосудов.

Целью данной работы являлось сравнительное исследование участия Rho-киназы и протеинкиназы С в регуляции сокращения подкожной артерии у новорожденных (в возрасте 5-10 дней) и взрослых (в возрасте 2,5 - 3,5 мес.) крыс.

В работе решались следующие задачи:

1) исследовать вклад Rho-киназы и протеинкиназы С в сокращение сосудов новорожденных и взрослых крыс при активации ai-адренорецепторов;

2) исследовать участие Rho-киназы и протеинкиназы С в сокращении сосоудов новорожденных и взрослых крыс при деполяризации гладкой мышцы;

3) оценить при этих воздействиях активность Rho-киназы в гладкой мышце новорожденных и взрослых крыс по изменению фосфорилирования регуляторной субъединицы ФЛЦМ (MYPT) по сайтам Thr696 и Thr

Научная новизна работы.

Впервые исследованы механизмы регуляции Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы для периферических артерий большого круга кровообращения новорожденных крыс, у которых динамика созревания гладкой мышцы сосудов сходна с таковой у человека. Исследование проведено на сосуде с интактной гладкой мышцей, что имеет несомненное преимущество, поскольку пермеабилизация гладкомышечных клеток сопряжена с изменением их белкового состава. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о ведущей роли Rho-киназы в регуляции сокращения сосудов новорожденных крыс как при активации aj-адренорецепторов, так и при К+-деполяризации.

Впервые установлено, что весомый вклад Rho-киназы в регуляцию сокращения сосудов новорожденных крыс проявляется в увеличении степени сайт-специфического фосфорилирования регуляторной субъединицы ФЛЦМ -MYPT. Такой комплексный анализ участия Rho-киназы в регуляции Са2+-чувствительности гладкой мышцы сосудов новорожденных и взрослых крыс, как в данной работе, ранее не проводился.

Впервые показано, что в гладкой мышце новорожденных крыс активация Rho-киназы при К+-деполяризации не зависит от изменения [Ca2+]i.

С использованием двух взаимодополняющих подходов - селективной блокады каналов и их активации К+-деполяризацией - установлено, что в сосудах взрослых крыс Rho-киназа регулирует активность Са2+ каналов L-типа.

Практическая значимость работы. Значимость работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена необходимостью разработки новых способов коррекции гипертонуса кровеносных сосудов при различных регуляторных расстройствах. Как известно, у преждевременно рожденных детей существует высокий риск развития артериальной гипертензии как в первые дни и месяцы после рождения (Fanaroff, Fanaroff, 2006), так и на более отдаленных этапах постнатального онтогенеза (Johansson et. al., 2005). В данной работе обнаружены существенные различия механизмов регуляции сокращения сосудов у новорожденных и взрослых животных, что говорит о необходимости использования разных подходов для коррекции сосудистых нарушений на

разных этапах постнатального онтогенеза. Основываясь на полученных в данной работе результатах, можно предположить, что для коррекции тонуса развивающейся гладкой мышцы нужно использовать фармакологические препараты, действие которых направлено на сигнальные пути, регулирующие Са2+-чувствительность сокращения, тогда как в зрелой гладкой мышце вероятной мишенью для терапии является Са2+-зависимый путь сокращения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокая Са2+-чувствнтельность сократительного аппарата гладкой мышцы артериальных сосудов на ранних этапах постнатального онтогенеза в основном обусловлена высокой активностью Rho-киназы; вклад протеинкиназы С намного меньше.

2. В раннем постнатальном периоде Rho-киназа регулирует в основном Са2+-чувствительность сокращения гладкой мышцы сосудов, тогда как во взрослом организме она может влиять и на Са2+-гомеостаз гладкомышечных клеток путем активации потенциалзависимых Са2+ каналов L-типа.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2006, 2010); на Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, Украина, 2007); на XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); на V и VII Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), на XXXVII Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания, 2008), на Ежегодном съезде Скандинавского физиологического общества 2008 (Оулу, Финляндия, 2008), на IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); на VI Конгрессе международного общества по автономной нервной системе (Сидней, Австралия, 2009); на Съезде Немецкого и Скандинавского физиологических обществ (Копенгаген, Дания, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья и 15 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на '^страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 1 ^"источников. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на крысах линии Вистар в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Возраст животных составлял 5-10 дней («новорожденные») и 2,53,5 месяца («взрослые»). Масса тела новорожденных крысят составляла 19,5±0,8 г, а взрослых - 330±6 г.

Эксперименты на изолированных сосудах

Измерение сократительной активности сосудов. Сокращение сосудов исследовали в изометрическом режиме с помощью системы «wire myograph» (модель 310, DMT A/S, Дания). Животных декапитировали гильотиной и выделяли подкожную артерию. Из средней части сосуда вырезали кольцевой сегмент длиной 2 мм и закрепляли в миографе. После прогрева миографа до 37°С (в течение 30-40 мин) определяли растяжение препарата, оптимальное для проявления сократительной активности (Mulvany, Halpern, 1977).

Измерение внутриклеточной концентрации свободного ионизированного кальция ([Са2*]¡). Для измерения [Ca2+]¡ использовали индикатор fura 2. Для возбуждения флуоресценции препарат попеременно освещали ртутной лампой (100 Вт) при длине волны 340 нм (для fura 2, связанного с Са2+) или 380 нм (для fura 2, свободного от Са2+). Флуоресценцию регистрировали при 515-520 нм с использованием фотоумножителя, от которого сигнал поступал на персональный компьютер. Изменения [Ca2+]¡ оценивали по отношению сигналов флуоресценции связанного с Са2+и свободного fiira 2 (F340/F380).

Загрузку клеток сосуда индикатором проводили с использованием ацетометильной формы fura 2-АМ (5 мкМ) в течение 90 мин при 37°С. Fura 2-АМ растворяли в ДМСО (конечная концентрация ДМСО в камере миографа -0,1%). Эксперимент начинали после 20-мин отмывки препарата от избытка fura 2-АМ и стандартной активации (сначала метоксамином (MX) (0,1-10 мкМ), а затем - К+-деполяризацией (120 мМ) с добавлением серотонина (10 мкМ)).

В большинстве экспериментов использовали раствор следующего состава (мМ): NaCl 120, NaHC03 26, КС1 4.5, MgS04 1.0, NaH2P04 1.2, D-глюкоза 5.5, EDTA 0.025, HEPES 5.0. Раствор непрерывно аэрировали карбогеном (5% СОг + 95% О2) для поддержания рН 7,4. Исходно раствор был бескальциевым. СаС12 добавляли при исследовании зависимостей «концентрация-эффект» для наружной концентрации Са2+ ([Са2+]0) (см. далее). В экспериментах с К+-деполяризацией использовали растворы, содержащие 42 или 120 мМКС1.

Зависимость «концентрация-эффект» на кумулятивное повышение наружной кощеьтрагщи Са2+ (0,01 - ЗмМ) в следующих условиях:

- в контроле (без дополнительных активирующих воздействий на препарат);

- на фоне активации ai-адренорецепторов MX (10 мкМ)

- на фоне активации гладкой мышцы деполяризацией К (42 мМ).

В этих же условиях исследовали влияние ингибиторов Rho-киназы (Y27632, 3 мкМ), протеинкиназы С (GF109203X, 1 мкМ) и Са2+ каналов L-типа (нимодипин, 1 мкМ). В каждом эксперименте исследовали эффекты только одного активирующего воздействия и одного ингибитора. Дополнительно были проведены соответствующие контрольные эксперименты, в которых тестировали эффект времени, т.е. эффекты MX и К+-деполяризации при трехкратном воздействии (без ингибиторов). Серьезных изменений регистрируемых параметров ([Ca2+]¡ и силы сокращения) в ходе контрольных экспериментов не выявлено.

MX, в отличие от многих адреномиметиков, не захватывается нервными терминалями. Поэтому, используя MX, можно аккуратно сопоставлять адренергические сократительные реакции иннервированных сосудов взрослых крыс и сосудов новорожденных крыс, которые еще лишены симпатической иннервации (Мочалов и др., 2008).

Обработка результатов. При обработке зависимости «концентрация-эффект» определяли абсолютное изменение натяжения и [Ca2+]¡. Полученные значения нормировали на соответствующие значения, зарегистрированные при максимальной активации препарата.

По полученным данным для каждого из стимулов строили графики зависимости силы сокращения и [Ca2+]¡ от концентрации Са2+ в растворе. Чтобы сопоставить изменения этих параметров при активирующих воздействиях, вычисляли индекс Са2+-чувствительности препарата. Для этого вычисляли площадь под кривой сигнала F340/F380 и под кривой сигнала силы сокращения. Полученные значения использовали в качестве координат для точки на плоскости. Линия, соединяющая эту точку с началом координат, образует с осью абсцисс угол, характеризующий Са2+-чувствительность сокращения (чем он больше, тем выше Са2+-чувствительность). Индекс Са2+-чувствительности сокращения вычисляли как тангенс этого угла: отношение площади под кривой силы сокращения к площади под кривой F340/F380. Такой подход позволил нам сопоставить Са2+-чувствительность сокращения гладкой мышцы сосудов при различных воздействиях.

Fura-2 AM был получен из фирмы Molecular Probes (США), остальные фармакологические препараты - из фирмы Sigma (США).

Исследование степени фосфорилирования MYPT в гладкомышечных клетках сосудов

Подготовка препаратов. Препараты для биохимического анализа получали после проведения экспериментов в миографе, в ходе которых воспроизводили такие же условия, как и в ходе описанных выше физиологических экспериментов: контроль, активация ai-адренорецепторов и К+-деполяризация (42 мМ К+), а также эти условия на фоне ингибитора Rho-киназы (всего шесть вариантов). Немедленно после завершения опыта препараты фиксировали в 15% растворе трихлоруксусной кислоты в ацетоне при температуре ~-80°С. Т.к. масса одного препарата недостаточна для анализа,

в одном образце объединяли 4 одинаково активированных сегмента сосудов от взрослых крыс или 10 сегментов от новорожденных.

Электрофорез и вестерн-блоттинг. Экстракты тканей подвергали электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля в присутствии анионного детергента (додецил сульфата натрия (SDS)) и ß-меркапгоэтанола по методу Леммли. Использовали 7% концентрирующий гель и 7,5% разделяющий гель. Электрофорез проводили на приборе Biorad (Mini Protean III System, США) при напряжении 130 В в течение 1,5 ч. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (метод Western Blotting) проводили сразу после завершения электрофореза с использованием прибора фирмы Biorad (Protean III для электропереноса, США) в течение 90 мин при 75 В.

Иммунодешекцш белка на мембране. Полученные мембраны блокировали в течение ночи при +4°С смесыо сухого обезжиренного молока и БСА (5% и 1% соответственно) на трис-солевом буфере с добавлением Tween 20 (TBST). После блокирования неспецифического связывания мембрану отмывали (здесь и далее отмывку производили тремя сменами TBST по 10 мин). Далее осуществляли нанесение первичных антител (на общий MYPT Abeam, ab24670), разведенных в 1% БСА на TBST - в течение ночи при +4°С. После инкубации с первичными антителами мембрану отмывали. Затем инкубировали 1 час со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anty-rabbit, антитела любезно предоставлены лабораторией проф. А.Г. Катрухи), разведенными в 1% растворе сухого обезжиренного молока на TBST. Затем мембрану отмывали и проявляли с помощью хемилюминесцентной системы ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания).

После получения данных для общего MYPT мембрану стриппировали (буфер производства Pierce, США), затем отмывали. После этого наносили первичные антитела к фосфорилированному MYPT (по сайту Thr696 (Abeam, ab59202) или по сайту Thr850 (Upstate, 36-003), их очередность менялась от мембраны к мембране), разведенные в 1% молоке на TBST. Далее процедура повторялась по описанной выше схеме. После проявки мембраны на первый из исследуемых фосфорилированных сайтов ее повторно стриппировали и окрашивали на другой фосфорилирсзанный сайт.

Обработка результатов. Полученные пленки обрабатывали, используя программу Quantity One (Bio-Rad Laboratories, США, 2000). Степень фосфорилирования MYPT определяли как отношение количества фосфорилированного белка к общему в соответствующем образце. Поскольку на каждый гель наносили по шесть образцов, полученных в разных условиях для одной группы крыс, все значения, полученные при обработке данной мембраны, нормировали на значение в контроле («концентрация - эффект» для Са2+ без других воздействий).

Статистическая обработка результатов. Сравнение зависимостей [Са2+], и силы сокращения от [Са2+]„ в одной группе крыс в контроле при различных воздействиях проводили с использованием дисперсионного анализа для повторных измерений, используя вариант для связанных выборок

(программа SPSS 16.0.0 for Windows (SPSS Inc., США)). Сравнение индекса Са2+-чувствительности сокращения проводили с использованием парного t-теста (программа Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США)). Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, п - объем выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование роли Rho-киназы и протеинкиназы С в сокращении подкожной артерии, вызванном активацией ai-адренорецепторов

Изучение роли Rho-киназы. При исследовании вклада Rho-киназы в сокращение подкожной артерии получены следующие результаты (рис.1 и 2). В контроле (в отсутствие MX) при постепенном увеличении [Са2+]0 у обеих групп крыс происходит увеличение [Ca2+]j (рис. 1А, 2А), которое не сопровождается выраженным сокращением (рис. 1Б, 2Б), что свидетельствует о низкой Са2+-чувствительности сократительного аппарата (рис 1В,Г, 2В,Г). В этих условиях ингибитор Rho-киназы Y27632 не оказывает влияния ни на силу сокращения, ни на [Са +], в обеих возрастных группах.

В гладкой мышце взрослых крыс на фоне активации ai-адренорецепторов наблюдается значительный прирост [Са2+]; (рис. 1А) и силы сокращения (рис 1Б) по сравнению с контролем. При этом сокращение растет сильнее, чем [Ca2+]i, что говорит об увеличении Са2+-чувствительности сокращения (рис 1В,Г). На фоне действия MX проявляется эффект Y27632: у взрослых крыс ингибитор заметно подавляет вызванные MX увеличение [Ca2+]j, силы сокращения, и Са2+-чувствительности, но эти параметры остаются выше контрольных значений (рис. 1).

У новорожденных крыс MX также приводит к значительному увеличению силы сокращения сосудов (рис. 2Б), но, в отличие от взрослых, не оказывает влияния на [Са2+]; (рис. 2А). Таким образом, у новорожденных крыс сокращение происходит исключительно за счет повышения Са2+-чувствительности, а вклад Са2+-зависимого пути сокращения минимален. При совместном действии MX и Y27632 изменения [Са2+]; также не наблюдается, но вызванный MX прирост силы сокращения полностью подавляется Y27632 (рис. 2А,Б). Снижается до контрольного уровня и Са2+-чувствительность (рис. 2В,Г).

Таким образом, у взрослых крыс сокращение сосудов при активации ai-адренорецепторов обусловлено повышением как [Са2+]ь так и Са2+-чувствительности сокращения, а у новорожденных - только повышением Са2+-чувствительности. Снижение прироста [Ca2+]i у взрослых крыс под действием Y27632 говорит о том, что, кроме сокращения, Rho-киназа может принимать участие в регуляции Са2+-гомеостаза гладкомышечных клеток.

В сосудах взрослых крыс повышение Са2+-чувствительности сокращения при активации ai-адренорецепторов частично зависит от активности Rho-киназы, а частично - от активности других сигнальных путей. В сосудах

новорожденных крыс повышение Са2+-чувствительности полностью подавляется ингибитором Rho-киназы.

Изучение роли протеинкиназы С. В обеих возрастных группах ингибитор протеинкиназы С не оказывал влияния на [Са +]j и силу сокращения в отсутствие MX. На фоне активации ai-адренорецепторов эффекты ингибитора на параметры сокращения гладкой мышцы также были небольшими. У взрослых крыс GF109203X не влиял на изменения [Са2+], (рис. ЗА), но немного подавлял силу сокращения (рис. ЗБ) и Са2+-чувствигельность сокращения (рис ЗВ,Г). У новорожденных крыс, в отличие от взрослых, ингибитор протеинкиназы С не влиял на Са2+-чувствительность сокращения (рис. 4В,Г).

Полученные данные позволяют заключить, что сокращение гладкой мышцы новорожденных крыс в ответ на агонист ai-адренорецепторов не зависит от активности протеинкиназы С. У взрослых же крыс протеинкиназа С может быть одним из механизмов, регулирующих Са2+-чувствительность сокращения гладкой мышцы сосудов. В частности, она может быть ответственна за компонент Са2+-сенситизации, не чувствительный к ингибитору Rho-киназы (рис. 1В,Г).

Следует отметить, что активация двух путей регуляции Са2+-чувствительности (через Rho-киназу и через протеинкиназу С) приводит к одинаковому результату - ингибированию ФЛЦМ. Основной механизм влияния протеинкиназы С заключается в фосфорилировании и активации эндогенного ингибитора ФЛЦМ - белка CPI-17 (Eto et al., 1995; Eto et al., 1997). С другой стороны, активация CPI-17 может происходить и вследствие фосфорилирования его Шю-киназой (Kitazawa et al., 2000). Кроме того, Rho-киназа может ингибироватъ ФЛЦМ и напрямую, без участия CPI-17 (Hirano, 2007; Somlyo, Somlyo, 2003).

Таким тесным переплетением двух сигнальных путей может объясняться отсутствие вклада протеинкиназы С в увеличение Са2+-чувствительности, вызываемое MX у новорожденных животных. Если ФЛЦМ уже сильно ингибирована Rho-киназой, сравнительно невысокая активность протеинкиназы С может быть незаметной. У взрослых животных Rho-киназа не полностью обеспечивает возрастание Са2+ -чувствительности в ответ на MX, в Са2+-сенситизации может участвовать и протеинкиназа С.

Как уже отмечалось, вклад протеинкиназы С в сокращение подкожной артерии у обеих возрастных групп крыс намного меньше, чем вклад Rho-киназы. Кроме прочих причин, это может объясняться разной динамикой активации этих сигнальных путей при сокращении гладкой мышцы. Показано, что протеинкиназа С ответственна за увеличение Са2+-чувствительности на первом этапе сокращения (секунды - десятки секунд), тогда как на втором этапе (минуты) доминирует Rho-киназа (Nobe, Paul, 2001; Dimopoulos et al., 2007). Так как в наших экспериментах сокращенное состояние препарата поддерживалось продолжительное время, то мог реализовываться именно второй путь, что и объясняет небольшой вклад протеинкиназы С в регуляцию сокращения по сравнению с Rho-киназой.

Рис. 1. Влияние МХ (10 мкМ) и ингибитора Шю-киназы У (3 мкМ) на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата (В,Г) сосудов взрослых крыс (п=7) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

Контроль -тк-МХ -О-У -Л-МХ+У

0,1

[Са^]0 (мМ)

20 40 60 80 100 120 140 Площадь под кривой Р340/Р380

о о

л с

О) н

ш н о

ш >>

го

2,0

1,5 1,0-

0,5

0,0

[Са*Ч0 (мМ)

■

Контроль МХ У МХ+У

Рис. 2. Влияние МХ (ЮмкМ) и ингибитора Шю-киназы У (ЗмкМ) на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствителыгости сократительного аппарата (В,Г) сосудов новорожденных крыс (п=4) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

20 40 60 80 100 Площадь под кривой Р340/Р380

Контроль МХ вР МХ+вР

Рис. 3. Влияние МХ (10 мкМ) и ингибитора протеинкиназы С СЕ (1 мкМ) на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата (В,Г) сосудов взрослых крыс (п=6) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

Площадь под кривой Я340/Р380

Контроль МХ вЯ МХ+вР

Рис. 4. Влияние МХ (10 мкМ) и ингибитора Протеинкиназы С СР (1 мкМ) на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата (В,Г) сосудов новорожденных крыс (п=5) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

Изучение роли С а2' каналов L-muna в увеличении [Ca^]t в сосудах взрослых крыс при активации а^адренорецепторов

В описанных выше экспериментах с ингибитором Rho-киназы мы показали, что активность этой киназы влияет на повышение [Са2+]; в гладкой мышце сосудов взрослых животных при действии MX. В связи с этим представлялось интересным изучить, какой из путей входа Са2+ в цитоплазму гладкомышечных клеток может регулироваться Rho-киназой. Известно, что в артериях мышечного типа увеличение [Ca2+]i происходит в основном благодаря входу Са2+ в клетку через потенциалзависимые Са2+ каналы L-типа (Thorneloe, Nelson, 2005: Park et al., 2008). Прежде всего, мы проверили, реализуется ли такой механизм регуляции [Ca2+]j в подкожной артерии крысы. Эксперимент был построен по той же схеме, что и предыдущие, но вместо ингибиторов протеинкиназ использовали блокатор L-типа Са2+ каналов нимодипин.

Показано, что в сосудах взрослых крыс нимодипин полностью предотвращает увеличение [Ca2+]j, вызываемое действием MX (рис 5А) и частично подавляет силу сокращения (рис. 5Б). Таким образом, в подкожной артерии крысы увеличение [Ca2+]i происходит исключительно за счет входа через Са+ каналы L-типа. Неполное ингибирование увеличения силы нимодипином говорит о том, что сокращение гладкой мышцы под действием MX связано не только с увеличением [Са2+];, но и с повышением Са2+-чувствительности, что подтверждает наши предыдущие данные.

Рис. 5. Влияние МХ (10 мкМ) и ингибитора Са2+ каналов L-типa нимодипина (Ним, 1 мкМ) на изменения [Са2+]; (А) и силы сокращения (Б) сосудов взрослых крыс (п=4) при градуальном повышении [Са2+]0 от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

Исследование роли Шю-киназы и протеинкиназы С в сокращении подкожной артерии, вызванном К+-деполяризацией (42 мМ К4).

На следующем этапе работы для активации гладкой мышцы сосуда вместо МХ использовали К+-деполяризацию. Общий протокол эксперимента не изменился: исследовали зависимости «концентрация-эффект» для Са2+ без активирующего воздействия («контроль»), на фоне деполяризации (42 мМ К+) и

на фоне совместного действия деполяризации и одного из ингибиторов. Такой подход позволил нам, во-первых, исследовать роль Rlio-киназы и протеинкиназы С в регуляции активности потенциалзависимых Са2+ каналов L-типа и, во-вторых, сопоставить вклад этих сигнальных путей в сокращение сосудов новорожденных и взрослых крыс при двух различных воздействиях (активации ai-адренорецепторов и деполяризации).

Роль Rho-киназы и протеинкиназы С в регуляции [Ca2+]i при деполяризации гладкой мышцы.

У взрослых крыс деполяризация гладкой мышцы сосуда сопровождается выраженным повышением [Са (рис. 6А). Этот эффект объясняется тем, что деполяризация наружной мембраны является адекватным стимулом для активации Са2+ каналов L-типа. В отдельной серии экспериментов мы показали, что Са2+ каналы L-типа сильно активированы уже при 42 мМ К+: дальнейшее повышение К+ до 120 мМ не приводит к дополнительному росту [Ca2+]j.

Ингибитор протеинкиназы С не оказывал влияния на вызванное деполяризацией повышение [Са2+]; у взрослых крыс (данные не приведены). В отличие от него, ингибитор Rho-киназы заметно снижал вызванный деполяризацией прирост [Ca2+]i (рис. 6А). Этот эффект ингибитора на [Ca2+]i позволяет полагать, что в гладкомышечных клетках подкожной артерии Са2+ каналы L-типа находятся под регуляторным влиянием Rho-киназы.

Ранее влияние ингибиторов Rho-киназы на Са2+ каналы L-типа было обнаружено в фазической гладкой мышце мочеточника крысы (Shabir et al., 2004), однако не было выявлено в артериальных сосудах (Ghisdal et al., 2003; Villalba et al., 2008). Отметим, что авторы этих работ использовали более жесткие условия деполяризации (60 - 120 мМ К+), в которых возможна не только активация, но и инактивация Са2+ каналов L-типа.

Мишенью Rho-киназы в гладкой мышце могут быть и потенциалзависимые К+-каналы (Jin, 2009); ингибирование их Шю-киназой также может приводить к увеличению [Ca2+]j. Однако для наших результатов такое объяснение маловероятно: при 42 мМ К+ в наружном растворе уровень мембранного потенциала близок к равновесному потенциалу для К+, поэтому влияние К+-тока минимально. Следовательно, исключено и влияние Rho-киназы на К+-каналы. Таким образом, мы считаем, что влияние Rho-киназы на [Са2+]; реализуется путем регуляции активности Са2+ каналов L-типа.

Интересно, что у новорожденных крыс деполяризация гладкой мышцы (42 мМ К"1) не сопровождается увеличением [Са2 ]; (рис. 7А). При более жесткой деполяризации (120 мМ К*) повышения [Са2+]; также не происходило. Наиболее простое объяснение этого феномена состоит в том, что в гладкой мышце сосудов новорожденных крыс отсутствуют Са2+-какалы L-типа. Данные литературы по этому вопросу противоречивы. Показано, что в аорте новорожденных крысят таких каналов нет (Quignard et al., 1996). Однако другими авторами обнаружено увеличение экспрессии (Blood et al., 2002) или эффективности действия блокаторов этих каналов (Long et al., 1999; Cogolludo et al., 2005) в развивающейся гладкой мышце. Отметим, что в нашей работе

Площадь под кривой Р340/Р380

Контроль

У 42+У

Рис. 6. Влияние К+-деполяризации (42 мМ) и ингибитора Шю-киназы У (3 мкМ) на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата (В,Г) сосудов взрослых крыс (п=5) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; // р<0.05 по сравнению с МХ

со

СО

и. о

со и.

Контроль -А- КС 142 -О-У

-Д-КС142+У

0,1 1 [Са2+]0 (мМ)

о к § 1 31

X га <и о.

^ 8

О 50 100 150 200 250 Площадь под кривой Я340/Р380

о -

- .д

.А*

о о

л с;

О)

ь-х а н о

а у

со О

0,01

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

0,1 1 [Са2+]0 (мМ)

Ж»Х<&Й ♦МС-ж» ♦лчК*

Мй IДО

Контроль 42

42+У

Рис. 7. Влияние К+-деполяризации (42 мМ) и ингибитора Шю-киназы У (3 мкМ) на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ (А), силы сокращения (Б) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата (В,Г) сосудов новорожденных крыс (п=8) при градуальном повышении Са2+ в наружном растворе от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ

сосуды новорожденных крыс развивали сокращение при действии активатора Са2+-каналов L-типа, S(-) BAY К8644, а их сокращение в ответ на MX подавлялось нимодипином, как и у взрослых крыс.

Возможно, в гладкой мышце сосудов новорожденных крыс Са2+-каналы L-типа активны уже при физиологической концентрации К+ (5 мМ); тогда деполяризация может и не приводить к дополнительному повышению [Са2+];. Такое предположение согласуется с данными о высокой базальной [Са2+]; в сосудах новорожденных крыс (Charles et al., 2007). Кроме того, сдвиг мембранного потенциала гладкой мышцы при повышении наружной концентрации К+ также может различаться у новорожденных и взрослых крыс. Таким образом, механизмы «стабильности» [Ca2+]j в гладкой мышце сосудов и новорожденных крыс пока не ясны и требуют дальнейшего исследования.

Роль Rho-киназы и протеинкиназы С в регуляции Са*+-чувствительности сокращения сосудов при деполяризации.

Как у взрослых, так и у новорожденных крыс деполяризация приводит к значительному увеличению Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы сосудов (рис. 6В). В обеих группах ингибитор Rho-киназы очень сильно, но все-таки не полностью, подавляет вызванный деполяризацией прирост Са2+-чувствительности.

Ингибитор протеинкиназы С на фоне деполяризации не влиял на Са2+-чувствительность сокращения сосудов взрослых крыс (рис 8А), однако в сосудах новорожденных он снижал Са2+-чувствительность сокращения (рис 8Б). Следовательно, вклад протеинкиназы С в регуляцию Са2+-чувствительности сокращения сосудов при деполяризации не проявляется у взрослых крыс, но заметен у новорожденных.

Долгое время считалось, что К+-деполяризация активирует лишь Са2+-зависимый путь сокращения гладкой мышцы, но впоследствии оказалось, что это не так (Ratz et al., 2005). Известно, что деполяризация наружной мембраны может активировать Rho-киназный путь регуляции Са2+-чувствительности (Mita et al., 2002; Sakurada et al., 2003), однако механизм такой активации еще плохо изучен. Авторы этих работ полагают, что активация Rho-киназы при деполяризации гладкой мышцы связана с повышением [Са2+];. Однако в нашей работе показано, что [Ca2+]j в гладкой мышце новорожденных при деполяризации не увеличивается, но тем не менее Са2+-чувствительность возрастает, то есть активация Rho-киназы происходит независимо от изменения [СаМеханизмы такого влияния деполяризации требуют дальнейшего исследования.

Еще одно объяснение может заключаться в неоднородном повышении [Ca2+]i в разных компартментах гладкомышечной клетки. Показано, что активация Rho-киназы происходит в области кавеол (Ratz et al., 2005). Если [Са2+]; в области кавеол повышается при деполяризации сильнее, чем в среднем по клетке, это может быть достаточным для активации Rho-киназы. При

измерении [Са2+]; с использованием Алга-2 такое локальное повышение незаметно, нужны исследования с использованием конфокальной микроскопии.

Таким образом, при К+-деполяризации происходит увеличение Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы сосудов как новорожденных, так и взрослых крыс. Как и при активации агадренорецепторов, это увеличение в основном зависит от активности Шю-киназы.

Контроль 42 вР 42-ИЗР

Контроль 42 вР 42+бР

Рис. 8. Влияние К+-деполяризации (42 мМ) и ингибитора протеинкиназы С ОР109203Х (1 мкМ) на изменения Са2+ -чувствительности сократительного аппарата сосудов взрослых (А, п=5) и новорожденных (Б, п=5) крыс при градуальном повышении [Са2+]0 от 0 до 1 мМ. * р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 по сравнению с МХ.

Исследование степени фосфорилнрования МУРТ

В описанных выше экспериментах нами обнаружен значительный вклад Шю-киназы в регуляцию Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии как новорожденных, так и взрослых крыс. Однако физиологические эксперименты не позволяют охарактеризовать изменения активности Шю-киназы при различных воздействиях. Например, оставалось неясным, происходит ли под действием МХ дополнительная активация Шю-киназы, или же эта киназа активна и в базальных условиях, но ее регуляторная роль не может реализоваться при низкой [Са2+];.

Для ответа на этот вопрос были проведены биохимические исследования, в которых оценивали активность Шю-киназы по степени фосфорилнрования ее основной мишени - регуляторной субъединицы ФЛЦМ (МУРТ). МУРТ может быть фосфорилирована по двум сайтам: ТЬгб% и ТЬг850 (Ко е1 а!., 2004); в обоих случаях это приводит к ингибированию ФЛЦМ и сокращению.

Значительных различий в степени фосфорилнрования МУРТ по сайту ТИг656 между новорожденными и взрослыми животными нами не обнаружено (рис.9 А, В). Видно, что при обоих способах активации степени фосфорилнрования не увеличивается. Вместе с тем, в большинстве случаев У27632 подавляет фосфорилирование ТЬг696, то есть оно зависит от активности Шю-киназы.

Рассмотрим подробнее изменения степени фосфорилирования по сайту Thr850. В контроле степень фосфорилирования Thr850 высока как у взрослых (рис.9 Б), так и у новорожденных (рис. 9 Г) крыс, причем это также определяется активностью Rho-киназы (в присутствии Y27632 фосфорилирование падает во много раз).

Самый интересный результат этой части работы - повышение фосфорилирования Thr850 в гладкой мышце новорожденных крыс при действии MX (рис 9 Г), то есть у новорожденных крыс активация aj-адренорецепторов действительно сопровождается активацией Rho-киназы.

В присутствии ингибитора Rho-киназы степень фосфорилирования Thr850 без активирующих воздействий и при активации арадренорецепторов у новорожденных крыс не различается. Это свидетельствует о том, что повышение фосфорилирования Thr850 при активации препарата MX связано именно с увеличением активности Rho-киназы, а не других сигнальных путей.

В гладкой мышце взрослых животных степень фосфорилирования Thr850 в контроле и при действии MX не различается (рис 9 Б). Это говорит о том, что дополнительной активации Rho-киназы (по сравнению с контролем) не происходит. Однако активность Rho-киназы в контроле высока, то есть ФЛЦМ сильно ингибирована. По-видимому, это важно для развития мощного сокращения, как только в результате стимуляции возрастает [Ca2+]i и активируется КЛЦМ.

В отличие от новорожденных, у взрослых крыс действие MX на фоне Y27632 сопровождается значительным приростом фосфорилирования Ihr850 (рис 9Б). Это говорит о том, что в гладкой мышце взрослых животных активация арадренорецепторов может приводить к запуску сигнальных каскадов, которые реализуются независимо от активности Rho-киназы, но также могут приводить к повышению фосфорилирования Thr850 MYPT, а значит, и увеличивать Са2+-чувствительность сокращения.

Активация гладкой мышцы 42 мМ К+ не приводит к повышению фосфорилирование Thr850 ни у взрослых, ни у новорожденных крыс (рис.9).

Таким образом, сокращение сосудов взрослых крыс происходит в основном за счет увеличения [Ca2+]i и активации КЛЦМ. Это легко осуществляется на фоне активной Rho-киназы, то есть ингибированной ФЛЦМ. В отличие от взрослых, у новорожденных крыс сокращение развивается по Са2+-независимому механизму: при активации агадренорецепторов происходит дополнительная активация Rho-киназы, что еще больше ингибирует ФЛЦМ и обеспечивает сокращение. При активации гладкой мышцы деполяризацией, дополнительной активации Rho-киназы у новорожденных крыс не происходит, однако активируется протеинкиназа С, что может частично объяснить увеличение силы сокращения. Механизмы, обеспечивающие остальную часть сокращения - пока неясны.

■контроль |j|y И MX ЙМХ+Y

IKCI42 SKCI42+Y

Рис. 9, Влияние ингибитора Rho-киназы Y (3 мкМ), MX (10 мкМ), К+-деполяризации (КС1 42 мМ) и комбинаций этих воздействий на степень фосфорилирования регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина (MYPT) по сайтам Thr696 (А, В) и Thr850 (Б, Г) в гладкой мышце сосудов взрослых (А, Б, п=9) и новорожденных (В, Г, п=7) крыс. pMYPT - содержание фосфо-MYPT; total MYPT - общее содержание MYPT.

* р<0.05 по сравнению с контролем; # р<0.05 - по сравнению со значением при том же воздействии без Y27632; & р<0.05 по сравнению с Y27632

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в данной работе показано, что вклад Rho-киназы в регуляцию сокращения подкожной артерии крысы значительно больше, чем протеинкиназы С, как при активации ai-адренорецепторов, так и при К+-деполяризации. Такой характер регуляции наблюдается как для развивающейся, так и для развитой гладкой мышцы. Сокращение гладкой мышцы сосудов новорожденных животных почти полностью зависит от увеличения Са2+-чувствительности по Rho-киназному пути. Сокращение сосудов у взрослых крыс зависит не только от этого механизма, но также и от изменения [Ca2+]¡, который, в частности, регулируется активностью Rho-киназы.

Исследование активности Rho-киназы показало, что уровень фосфорилирования MYPT высок в контроле, причем это связано с активностью Rho-киназы. Базовая активность Rho-киназы позволяет взрослым крысам эффективно реализовывать Са2+-зависимый путь сокращения. В гладкой мышце новорожденных крыс Са2+-зависимый путь сокращения не выражен, поэтому для обеспечения сокращения их сосудов необходима дополнительная активация Rho-киназы и еще большее увеличение степени фосфорилирования/ингибирования MYPT.

Подводя итог, можно сказать, что изменение активности Rho-киназы является основным механизмом регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных крыс, тогда как у взрослых, кроме этого механизма, большую роль играют Са2+ -зависимый путь сокращения и другие пути, способные ингибировать ФЛЦМ.

Мы полагаем, что механизмы регуляции тонуса сосудов у новорожденных и взрослых крыс, обнаруженные нами на примере подкожной артерии, реализуются и в других артериальных сосудах. Это подтверждается результатами, полученными в экспериментах in vivo (на целом животном) (Н.В. Тарасова, 2010). В этих экспериментах также обнаружено более выраженное влияние ингибиторов Rho-киназы на сокращение сосудов при стимуляции адренорецепторов у крыс в первые недели постнатального развития по сравнению со взрослыми. Таким образом, высокая активность Rho-киназы, характерная для сосудов новорожденных крыс, проявляется не только на уровне отдельного сосуда, но и на системном уровне.

Автор искренне благодарен профессору Р. Шуберту (Институт физиологии университета г. Росток) и к.б.н. A.B. Воротникову (ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова) за предоставленную возможность проведения исследований и неоценимую помощь в планировании экспериментальной работы и обсуждении результатов.

выводы

1. Проведено сравнение механизмов регуляции сокращения подкожной артерии крыс разного возраста. Показано, что сокращение артерии при активации агадренорецепторов метоксамином или при деполяризации (42 мМ К1") у взрослых крыс связано с повышением [Са2+]( и Са2+-чувствительности сокращения, а у крыс в возрасте 5-10 дней - только с повышением Са2+-чувствительности.

2. Увеличение [Са2+]; в гладкой мышце сосудов взрослых крыс при активации агадренорецепторов метоксамином происходит в основном за счет входа Са2+ в клетку через потенциалзависимые Са2+ каналы Ь-типа, в регуляции активности этих каналов участвует Шю-киназа.

3. Повышение Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии при активации агадренорецепторов у 5 - 10 дневных крысят происходит за счет активности Ию-киназного сигнального пути, тогда как у взрослых крыс проявляется вклад и других механизмов.

4. Вклад протеинкиназы С в регуляцию Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии намного меньше, чем Шю-киназы, как у взрослых крыс, так и у крыс в возрасте 5-10 дней. У взрослых животных он проявляется при активации сокращения метоксамином, а у 5 - б дневных - при активации сокращения гладкой мышцы деполяризацией.

5. При активации агадренорецепторов у 5 - 10 дневных крыс, в отличие от взрослых, наблюдается увеличение фосфорилирования регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина. Такое увеличение происходит за счет дополнительной активации Шю-киназы.

6. Ию-киназный сигнальный путь является основным механизмом регуляции Са2+-чувствительности сократительного аппарата гладкой мышцы в сосудах 5-10 дневных крысят.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мочалов С.В., Каленчук В.У., Гайнуллина Д.К, Воротников А.В, Тарасова О С. Вклад протеинкиназы С и Rho-киназы в регуляцию рецептор-зависимого сокращения артерий уменьшается с возрастом и не зависит от симпатической иннервации // Москва, Биофизика, 2008, том 53, вып.6, с.1102-1108.

2. Tarasova O.S., Mochalov S.V., Kalentchuk V.U., Aalkjaer С., Nilsson H. Calcium sensitivity of smooth muscle contraction in chronically denervated arteries // International Symposium "Biological Motility: Basic Research and Practice" Pushchino, May, 11 - 15. - 2006. - P.37-38

3. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Мочалов С.В., Гайнуллина Д.К., Шуберт Р., Каленчук В.У., Кудряшова Т.В., Воротников А.В. К вопросу о трофическом влиянии симпатических нервов на кровеносные сосуды: регуляция чувствительности сократительного аппарата к ионам кальция // Материалы IX Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы», Донецк-Славянск, 23 - 25 мая 2007г. Нейронауки: теоретические и клинические аспекты. - 2007. - Т.З (№1). - С.49.

4. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Мочалов С.В., Каленчук В.У, Кудряшова ТВ., Воротников А.В. Внутриклеточные мишени трофического влияния симпатических нервов на кровеносные сосуды // Тезисы докладов XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня 2007 г., С. 440.

5. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Мочалов С.В., Гайнуллина Д.К., Шуберт Р., Каленчук В.У., Кудряшова Т.В., Воротников А.В. Трофическое влияние симпатических нервов на кровеносные сосуды связано с изменением активности белков, регулирующих акгомиозиновое взаимодействие в гладкомышечных клетках // V Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского, «Механизмы функционирования висцеральных систем» Санкт-Петербург, Россия, 16-19 октября 2007 г., С. 306-307

6. Tarasova О., Tarasova N., Mochalov S., Puzdrova V., Vorotnikov A., Schubert R. Increased ROCK expression in arterial smooth muscle of newborn rats: functional manifestation in vitro and in vivo // XXXVII European Muscle Conference, Keble College Oxford 13-16 September 2008 J Muscle Res Cell Motil 2008,29, p. 288.

7. Mochalov SV, Schubert R, Tarasova OS The role of Rho-kinase in regulation of Ca2+-sensitivity of saphenous artery contraction in newborn and adults rats // Acta Physiologica, Vol. 193, Supp 664, August 2008 p. 90-91

8. Tarasova NV, Mochalov SV, Tarasova OS The role of Rho-kinase in adrenergic vasopressor response decreases during postnatal development // Acta Physiologica, Vol. 193, Supp 664, August 2008 p. 104

9. Мочалов C.B., Шуберт P, Тарасова O.C. Механизмы сокращения подкожной артерии у новорожденных и взрослых крыс при активации адренорецепторов // Тезисы IX Всероссийской научно - теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма», Россия, Казань 3-5 октября 2008 г. с. 93.

10. Тарасова Н.В, Мочалов С.В., Тарасова О.С. Созревание симпатической регуляции артериального давления в раннем постнатальном онтогенезе сопровождается снижением роли Rho-киназы в сокращении сосудов // Тезисы IX Всероссийской научно - теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма», Россия, Казань 3-5 октября 2008 г. с. 156.

11. Мочалов С.В. Вклад Rho-киназы и протеинкиназы С в изменения Са2+-чувствительности сосудов новорожденных и взрослых крыс, вызванные деполяризацией // Сборник тезисов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" 14-17 апреля 2009 г. с. 271,

12. Tarasova OS, Puzdrova VA, Tarasova NV, Mochalov SV, Vorotnikov AV, Schubert R. Rapid contractile phenotype of vascular smooth muscle is controlled by trophic influence of sympathetic nerves // The 6th Congress of the International Society for Autonomic Neuroscience. Sydney, Australia 1-4 September 2009. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 2009; 149 (l-2):86-87.

13. C.B. Мочалов, P. Шуберт, ОС. Тарасова Роль Rho-киназы в регуляции Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии у новорожденных и взрослых крыс // VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем», Россия, Санкт-Петербург 29 сентября - 02 октября 2009 г. Тезисы докладов. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2009, с. 301.

14. Н.В. Тарасова, С.В. Мочалов, О С. Тарасова Снижение роли rho-киназы в сокращении сосудов при созревании симпатической системы у крыс // VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем», Россия, Санкт-Петербург 29 сентября - 02 октября 2009 г. Тезисы докладов. - СПб.: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2009, с. 416.

15. Mochalov S.V., Tarasova N V., Tarasova O S. The role of Rho-kinase in adrenergic contraction of arterial vessels in rats diminishes with development of sympathetic innervation: in vitro study // Acta Physiologica, Vol. 198., Supp 677, March 2010 p. 136

16. Tarasova OS., Mochalov S.V., Tarasova N.V., Vorotnikov A.V., Schubert R. The role of Rho-kinase in control of vascular contractility in newborn and neonatally sympathectomised rats // International Symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies" Pushchino, Moscow region, Russia M region, Russia May 11-15, 2010

БСА - бычий сывороточный альбумин ДМСО - диметилсульфоксид КЛИМ - киназа легких цепей миозина ЛЦМ - регуляторные легкие цепи миозина ФЛЦМ - фосфатаза легких цепей миозина [Ca2+]j - внутриклеточная концентрация Са2+ [Са2+]0 - концентрация Са2+ в наружном растворе

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота (ethylenediaminetetraacetic acid) HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфо кислота (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl]ethanesulfonic acid) MX - метоксамин

MYPT - регулягорная субъединица фосфоразы легких цепей миозина TBST - триссолевой буфер с добавлением TWEEN 20 (tris buffer solution TWEEN)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Заказ №277. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мочалов, Степан Вячеславович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Гладкая мышца: роль в регуляции тонуса сосудов и артериального давления.

1.2 Регуляция концентрации Са" в цитоплазме гладкомышечных клеток.

1.2.1 Механизмы повышения Са2+в цитоплазме гладкомышечных клеток

1.2.2 Механизмы снижения Са" в цитоплазме гладкомышечных клеток.

1.3 Механизмы сокращения гладкой мышцы при повышении внутриклеточной концентрации Са2+.

1.4 Повышение чувствительности сократительного аппарата к Са2+ - важный механизм сокращения гладкой мышцы.

1.4.1 Механизмы Са" -сенситизации, связанные с повышением степени фосфорилирования РЛЦ миозина.

1.4.2 Механизмы Са" -сенситизации без изменения степени фосфорилирования РЛЦ миозина.

1.4.3 Временные характеристики Са -зависимого и Са" -независимого сокращения.

1.5 Регуляция активности ФЛЦМ.

1.5.1 Механизм действия ПКС.

1.5.2 Механизм действия Rho-киназы.

1.5.3 Временные характеристики Са2+-сенситизации с участием протеинкиназы С и Rho-киназы.

1.5.4 Относительный вклад ПКС и Rho-киназы в разных кровеносных сосудах.

1.6 Возрастные изменения механизмов сокращения гладкой мышцы.

1.6.1 Изменения на уровне регуляции Са2+-гомеостаза.

1.6.1.1 Изменение мембранного потенциала.

1.6.1.2 Изменение калиевых и кальциевых каналов.

1.6.1.2.1 Калиевые каналы.

1.6.1.2.2 Кальциевые каналы.

1.6.2 Изменения на уровне регуляции чувствительности сократительного аппарата к Са2+.

1.6.3 Изменения экспрессии/активности белков, регулирующих сокращение гладкой мышцы.

1.6.3.1 Изменения вклада протеинкиназы С и Шю-киназы в регуляцию сокращения.

1.7 Актуальность и логика построения данной работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные и объект исследования.

2.2. Физиологические эксперименты.

2.2.1 Растворы, использованные в физиологической части работы.

2.2.2 Приготовление препарата. Измерение силы сокращения в изометрическом режиме.

2.2.3 Нормализация растяжения препарата.

942.2.4 Измерение концентрации Са внутри клеток.

2.2.5 Активация препарата.

2.2.6 Общий протокол эксперимента.

2.2.7 Обработка результатов.

2.2.7.1 Нормирование силы сокращения.

2.2.7.2 Нормирование Р340/Р380.

2.2.8 Вычисление Са -чувствительности.

2.2.9 Статистическая обработка результатов.

2.2.10 Реактивы, использованные в экспериментах на изолированных сосудах.

2.3 Биохимические эксперименты.

2.3.1 Получение образцов для биохимического анализа.

2.3.2 Гомогенизация и экстрагирование образцов.

2.3.3 Электрофорез.

2.3.4. Иммуноблоттинг.

2.3.5 Обработка результатов.

2.3.6 Статистическая обработка результатов.

2.3.7 Реактивы, использованные в биохимической части работы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Результаты физиологических экспериментов.

3.1.1 Эффекты МХ и ингибитора Шю-киназы У27632 на силу сокращения, [Са~ ], и Са -чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-У».

3.1.2 Воспроизводимость эффектов МХ на силу сокращения, [Са~ ], и

Са2+чувствительность (контроль к серии «КС15-МХ-У»). Серия экспериментов «Кон-МХ-У».

3.1.3 Эффекты МХ и ингибитора протеинкиназы С ОР109203Х на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-вР».

3.1.4 Воспроизводимость эффектов МХ на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность для серии экспериментов «КС15-МХ-ОР». Серия экспериментов «Кон-МХ(ОР)».

3.1.5 Эффекты МХ и ингибитора Ь-типа Са2+ каналов нимодипина на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-№ш».

3.1.6 Эффекты К+-деполяризации и ингибитора Шю-киназы У27632 на силу сокращения, [Са2+]; и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-КС142-У».

3.1.7 Воспроизводимость эффектов К+-деполяризации на силу сокращения,

Са ]; и Са" -чувствительность - контроль к серии экспериментов «КС15-КС142-У». Серия экспериментов «Кон-КС142(У)».

3.1.8 Эффекты К+-деполяризации и ингибитора протеинкиназы С вР109203X на силу сокращения, [Са2+]! и Са2+-чувствительность.Серия экспериментов «КС15-КС142-СР».

3.1.9 Воспроизводимость эффектов К+-деполяризации на силу сокращения, [Са21 и Са2+-чувствительность - контроль к серии экспериментов «КС15-КС142-ОР». Серия экспериментов «Кон- КС142(ОР)».

1/¥ 4*

3.1.10 Изменения [Са^ и силы сокращения при разной степени К -деполяризации (42 и 120 мМ КС1). Серия экспериментов «КС1120-КС142-КС15».

3.1.11 Эффекты ингибитора Шю-киназы У27632 на силу сокращения, [Са2+]; и Са2+-чувствительность при действии МХ на фоне К+-деполяризации. Серия экспериментов «КС142(МХ-У)».

3.1.12 Сопоставление эффектов МХ и К+-деполяризации на силу сокращения, [Са" и Са -чувствительность. Серия экспериментов «Кон

КС142-МХ».

3.1.12 Сопоставление эффектов МХ и К+-деполяризации на силу

•у, 9-4сокращения, [Са ]; и Са -чувствительность. Серия экспериментов «Кон-КС142-МХ».

943.1.13 Расслабление гладкой мышцы сосудов при высокой [Са ]0: влияние капсайцина.•.

3.1.14 Сопоставление эффектов МХ и ингибитора Шю-киназы У27632 на сокращение сосудов с эндотелием и без эндотелия. Серия экспериментов

Кон-Энд».

3.2 Результаты биохимических экспериментов.

3.2.1 Измерение фосфорилирования МУРТ в гладкой мышце сосудов взрослых животных.

3.2.2 Измерение фосфорилирования МУРТ в гладкой мышце сосудов новорожденных животных.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Основные результаты работы.

4.2 Базальная Са2+-чувствительность сокращения.

4.3 Изменения регуляции [Са2+]; у новорожденных крыс.

4.4 Роль Шю-киназы и протеинкиназы С в изменении Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии крысы.

4.5 Роль других путей регуляции Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии у новорожденных и взрослых крыс.

4.6 Механизмы активации Шю-киназы при активации а 1 - адр с н о р еце птор о в МХ и при деполяризации.

944.7 Роль Шю-киназы в повышении [Са в гладкой мышце сосудов взрослых крыс.

4.8 Роль Юю-киназы в регуляции Са -чувствительности адренергического сокращения сосудов новорожденных крыс по сравнению со взрослыми.

4.9 Оценка активности Шю-киназы в сосудах взрослых и новорожденных крыс по фосфорилированию МУРТ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс"

Гладкая мышца образует средний слой стенки всех кровеносных сосудов. Правильное функционирование гладкой мышцы очень важно для нормального кровоснабжения органов и тканей. Нарушение регуляции тонуса гладкой мышцы сосудов ведет к развитию артериальной гипертензии, спазм)- мозговых и коронарных сосудов и другим патологическим состояниям (Uehata et al., 1997; Mukai et al., 2001; Wettschureck, Offermanns, 2002; Jarajapu, Knot, 2005; Salamanca, Khalil, 2005). Для разработки новых способов коррекции тонуса гладкой мышцы необходимо понимать принципы его поддержания и регуляции.

В раннем постнатальном онтогенезе происходят значительные изменения регуляции кровообращения. Динамика процессов возрастных изменений кровообращения различается у разных видов млекопитающих и коррелирует с темпом общего созревания организма. Удобной экспериментальной моделью таких изменений в организме человека являются крысы: по степени зрелости систем организма новорожденный крысенок сходен с недоношенным (рожденным на 7-8 месяце беременности) ребенком. Изучение механизмов регуляции кровообращения у новорожденных крысят позволяет понять, как происходят соответствующие изменения в организме человека, а также моделировать различные патологические процессы и разрабатывать новые способы их коррекции.

Следует отметить, что созревание механизмов регуляции кровообращения в модельных экспериментах на крысах исследуется весьма интенсивно. Показано, что в первые неделп постнатального развития у крыс происходит формирование и функциональное созревание симпатической иннервации сосудов (Todd, 1980; Hill et al., 1983; Hill et al., 1999; Luff, 1999; Sandow, Hill, 1999), увеличивается вклад симпатической системы в формирование уровня системного артериального давления (АД). У новорожденных крысят уровень среднего АД очень низкий (всего 40-50 мм рт.ст.), но в течение месяца он достигает «взрослого» уровня - 90-100 мм рт.ст. (Mills, Smith, 1986; Kasparov, Patón, 1997). Известно, что симпатические нервы не только регулируют просвет сосудов, но и оказывают на них трофическое влияние: они регулируют пролиферацию, рост и дифференцировку гладкомышечных клеток (Орбели, 1962; Bevan, 1984: Damon, 2005). Симпатическая иннервация необходима для формирования сократительного фенотипа гладкомышечных клеток в онтогенезе, чго связано с экспрессией специфических гладкомышечных изоформ белков сократительного аппарата -актина и миозина (Bevan, 1984; Damon, 2005). Кроме того, трофическое влияние симпатических нервов на сосуды обеспечивает формирование специфического сократительного фенотипа гладкой мышцы сосудов, что обеспечивает возможность динамической регуляции тонуса сосудов симпатическими вазомоторными влияниями (Пуздрова, 2007).

Различия в регуляции гладкой мышцы сосудов между новорожденными и взрослыми проявляются как в регуляции кальциевого гомеостаза гладкомышечных клеток, так и на этапе взаимодейс i вия Са2+ с сократи гельным аппаратом клетки. Хотя экспрессия и активность ионных каналов, которые обеспечивают формирование уровня мембранного потенциала и могут влиять на концентрацию Са2+ в цитоплазме клеток, являются предметом многолетних исследований, ясного ответа на этот вопрос нет. Согласно литературным данным из разных источников, активность кальциевых каналов у новорожденных животных по сравнению со взрослыми может быть повышена (Long et al., 1999; Blood et al., 2002) или снижена (Quignard et al., 1996); также противоречивы данные об активности калиевых каналов ( Reeve et al., 1998; Belevych et al., 2002). По-видимому, характер этих изменений может зависеть от вида используемых животных или от типа сосудов, на которых проводится исследование.

Вместе в тем, многие авторы единодушны во мнении, что созревание гладкой мышцы сосудов в постпаталыюм онтогенезе сопряжено со снижением Са2+-чувствительности сократительного аппарата гладкомышечных клеток (Пуздрова, 2007; Àkopov et al., 1997; Bruce, Nixon, 1997; Akopov et al., 1998b; Ekman et al., 2005; Sandoval et al., 2007a). Са2+-чувствительность сократительного аппарата характеризуется зависимостью сокращения от [Са2+];: увеличение силы сокращения на фоне относительно неизменной [Са2+], обозначается как повышение Са~ -чувствительности (Са~ -сенситизация), а уменьшение сократительного ответа - как снижение Са2+-чувствительности

Л I десенситизация к Са ).

Выраженность гладкомышечного сокращения в основном зависит от степени фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (ЛЦМ), то есть от баланса активностей киназы (КЛЦМ) и фосфатазы (ФЛЦМ) легких цепей миозина. Основным механизмом повышения Са" -чувствительности является ингибирование ФЛЦМ. это замедляет дефосфорилирование ЛЦМ и поддерживает сокращение даже при сравнительно низкой активности зависимой от Са2+ КЛЦМ. Такое ингибирование ФЛЦМ может происходить в результате активности внутриклеточных сигнальный путей, сопряженных, в первую очередь, с активацией протеинкиназы С и Rho-киназы (Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007). Механизм действия протеинкиназы С включает фосфорилирование белка CPI-17, в результате чего CPI-17 становится очень сильным ингибитором ФЛЦМ (Eto et al., 1997; Eto el al., 1995; Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007). Rho-киназа ингибирует ФЛЦМ путем фосфорилирования ее регуляторной субъединицы MYPT по двум сайтам - Thr и

Thr850 (Somlyo,

Somlyo, 2003; Hirano, 2007;). Фосфорилирование no Thr850 приводит к диссоциации ФЛЦМ и миозина (Velasco et al., 2002), тогда как фосфорилирование по Thr696 приводит к снижению каталитической активности ФЛЦМ, но не сродства к субстрату (Feng et al., 1999).

Таким образом, Са2+-чувствительность сократительного аппарата гладкой мышцы на позднем эмбриональном периоде развития и в раннем постнатальном развитии выше, чем у взрослых животных. Вместе с тем, механизмы этого явления остаются во многом неясными. Результаты ингибиторного анализа свидетельствуют о возможном повышении активности Rho-киназы (Akopov et al., 1998с; Ekman et al., 2005; Belik et al., 2006). Следует отметить, что трактовка этих данных может быть неоднозначной, поскольку они получены либо в экспериментах на пермеабилизованной гладкой мышце сосудов (Akopov et al., 1998с), либо без измерения [Ca2+]j. Наряду с данными о важной роли Rho-киназы показано, что активация протеинкиназы С может приводить к более значительному увеличению Са2+-чувствительности у развивающихся животных, чем у взрослых (Akopov et al., 1998с). Такая разнородность данных литературы также может быть связана с использованием разных объектов исследования, поскольку известно, что относительный вклад протеинкиназы С и Rho-киназы в регуляцию Са -чувствительности сокращения может существенно различаться не только для артерий эластического и мышечного типа (Budzyn et al., 2006), но и для мышечных артерий, приносящих кровь к разным органам (Mueed et al., 2004; Budzyn et al., 2006).

Кроме того, относительный вклад протеинкиназы С и Rho-киназы может зависеть от стимула, который вызывает сокращение гладкой мышцы сосуда. Например, сигнализация через Gq/n белки ведет к активации фосфолипазы С и, следовательно, протеинкиназы С (Varma, Deng, 2000). тогда как путь от G12/13-белков сопряжен с активацией малого G-белка RhoA и его мишени - Rho-киназы (Seasholtz et al., 1999). Долгое время считали, что сокращение, вызванное деполяризацией мембраны является полностью Са" -зависимым, но впоследствии было показано, что увеличение [Са2+]; также может приводить к активации Rho-киназы и тем самым к повышению Са2+-чувствительности сокращения (Ratz et al., 2005).

Таким образом, данная работа направлена на изучение механизмов регуляции чувствительности сократительного аппарата гладкой мышцы артерий к Са2+ у крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Она включает исследование роли двух ключевых сигнальных путей, регулирующих активность ФЛЦМ. В качестве объекта исследования была выбрана подкожная артерия - ветвь бедренной артерии, приносящая кровь к плюсне и стопе. Эта артерия является сосудом мышечного типа, под действием различных стимулов она способна значительно изменять свой просвет и тем самым регулировать кровоснабжение дистальных отделов задней конечности. Хорошая сократительная активность стенки подкожной артерии и способность развивать значительную силу сокращения- делает её удобным объектом для сравнительного изучения механизмов регуляции работы сократительного аппарата гладкой мышцы у взрослых и новорожденных животных.

Целью настоящей работы являлось провести сравнительное исследование участия Шю-киназы и протеинкиназы С в регуляции сокращения артерий у новорожденных (в возрасте 5-10 дней) и взрослых (в возрасте 2,5 -3,5 месяца) крыс.

В работе решались следующие задачи:

1) исследовать роль Шю-киназы и протеинкиназы С в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс при активации агадренорецепторов;

2) исследовать участие Шю-кииазы и протеинкиназы С в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс при деполяризации гладкой мышцы;

3) оценить при этих воздействиях активность Шю-киназы в гладкой мышце новорожденных и взрослых крыс по изменению фосфорилпрования регуляторной субъединицы ФЛЦМ (МУРТ) по сайтам ТЬг606 и ТЬг850.

Научная новизна работы.

Впервые исследованы механизмы регуляции Са2+-чувствительности сокращения гладкой мышцы для периферических артерий большого круга кровообращения новорожденных крыс, у которых динамика созревания гладкой мышцы сосудов сходна с таковой у человека. Исследование проведено на сосуде с интактной гладкой мышцей, что имеет несомненное преимущество, поскольку пермеабилизация гладкомышечных клеток сопряжена с изменением их белкового состава. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о ведущей роли Шю-киназы в регуляции сокращения сосудов новорожденных крыс как при активации агадренорецепторов, так и при К+-деполяризации.

Впервые установлено, что весомый вклад Шю-киназы в регуляцию сокращения сосудов новорожденных крыс проявляется в увеличении степени сайт-специфического фосфорилирования регуляторной субъединицы ФЛЦМ -МУРТ. Такой комплексный анализ участия Шю-киназы в регуляции Са2+-чувствительности гладкой мышцы сосудов новорожденных и взрослых крыс, как в данной работе, ранее не проводился.

Впервые показано, что в гладкой мышце новорожденных крыс активация Rho-киназы при К -деполяризации не зависит от изменения [Ca

Практическая значимость работы.

Значимость работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена необходимостью разработки новых способов коррекции гипертонуса кровеносных сосудов при различных регуляторных расстройствах. Как известно, у преждевременно рожденных детей существует высокий риск развития артериальной гипертензии как в первые дни и месяцы после рождения (Fanaroff, Fanaroff, 2006), так и на более отдаленных этапах постнатального онтогенеза (Johansson et. al„ 2005). В данной работе обнаружены существенные различия механизмов регуляции сокращения сосудов у новорожденных и взрослых животных, что говорит о необходимости использования разных подходов для коррекции сосудистых нарушений на разных этапах постнатального онтогенеза. Основываясь на полученных в данной работе результатах, можно предположить, что для коррекции тонуса развивающейся гладкой мышцы нужно использовать фармакологические препараты, действие которых направлено на сигнальные пуги, регулирующие Са2+-чувствительность сократительного аппарата, тогда как в зрелой гладкой мышце вероятной мишенью для терапии является Са2+-зависимый путь сокращения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокая Са~ -чувствительность сократительного аппарата гладкой мышцы артериальных сосудов на ранних этапах постнатального онтогенеза в основном обусловлена высокой активностью Rho-киназы; вклад протеинкиназы С намного меньше.

2. В раннем постнатальном периоде Rho-киназа регулирует в основном Ca -чувствительность сокращения гладкой мышцы сосудов, тогда как во взрослом организме она может влиять и на Са2+-гомеостаз гладкомышечных клеток путем активации потенциалзависимых Са2+ каналов L-типа.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2006, 2010); на Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, Украина, 2007); на XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); на V и VII Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007. 2009), на XXXVII Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания. 2008), на Ежегодном съезде Скандинавского физиологического общества 2008 (Оулу, Финляндия, 2008), на IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); на VI Конгрессе международного общества по автономной нервной системе (Сидней, Австралия, 2009); на Съезде Немецкого и Скандинавского физиологических обществ (Копенгаген, Дания, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья и 15 тезисов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Мочалов, Степан Вячеславович

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнение механизмов регуляции сокращения подкожной артерии крыс разного возраста. Показано, что сокращение артерии при активации агадренорецепторов метоксамином или при деполяризации (42 мМ К+) у взрослых крыс связано с повышением [Са2+]; и Са2+-чувствительности сокращения, а у крыс в возрасте 5-10 дней - только с повышением Са2+-чувствительности.

3. Повышение Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии при активации агадренорецепторов у 5 - 10 дневных крысят происходит за счет активности Шю-киназного сигнального пути, тогда как у взрослых крыс проявляется вклад и других механизмов.

4. Вклад протеинкиназы С в регуляцию Са2+-чувствительности сокращения подкожной артерии намного меньше, чем Шю-киназы, как у взрослых крыс, так и у крыс в возрасте 5-10 дней. У взрослых животных он проявляется при активации сокращения метоксамином, а у 5 - 10 дневных - при активации сокращения гладкой мышцы деполяризацией.

6. Шю-киназный сигнальный путь является основным механизмом регуляции Са2+-чувствительности сократительного аппарата гладкой мышцы в сосудах 5-10 дневных крысят.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе показано, что вклад Rho-киназы в регуляцию сокращения подкожной артерии крысы значительно больше, чем протеинкиназы С, как при активации агадренорецепторов, так и при К+-деполяризации. Такой характер регуляции наблюдается как для развивающейся, так и для развитой гладкой мышцы. Сокращение гладкой мышцы сосудов новорожденных животных почти полностью зависит от увеличения Са2+-чувствительности по Ию-киназному пути. Сокращение сосудов у взрослых крыс зависит не только от этого механизма, но таюке и от [Ca2+]i5 которая регулируется, в частности, активностью Rho-киназы.

Исследование активности Rho-киназы показало, что у обеих групп крыс в уровень фосфорилирования MYPT в базальных условиях высокий, причем это связано с активностью Rho-киназы. Базовая активность Rho-киназы позволяет взрослым крысам эффективно реализовывать Са2+-зависимый путь сокращения. В гладкой мышце новорожденных крыс Са" -зависимый путь сокращения не выражен, поэтому для обеспечения сокращения их сосудов необходима дополнительная активация Rho-киназы и еще большее увеличение степени фосфорилирования/ингибирования MYPT.

Са2+ -зависимый путь сокращения и другие пути, способные ингибировать ФЛЦМ.

Следует отметить, что наряду с участием в регуляции сокращения, Rho-киназа важна для осуществления других, более длительных процессов в гладкой хмышце: она участвует в регуляции экспрессии генов, миграции и пролиферация клеток и др. (Loirand et al., 2006). На культуре гладкомышечных клеток аорты крысы с конститутивно активным RhoA белком было показано, что такие клетки в большей степени экспрессируют гены, ответственные за дифференцировку по мышечному типу (кодирующие гладкомышечные изоформы актина и миозина), а ингибирование Rho-киназы Y27632 сильно снижает уровень экспрессии этих генов и тормозит дифференцировку (Mack et al., 2001). Эти данные говорят о том, что Rho-киназа может регулировать не только сокращение гладкой мышцы сосудов, но ее развитие в онтогенезе.

Есть основание полагать, что механизмы регуляции тонуса сосудов у новорожденных и взрослых крыс, обнаруженные нами на примере подкожной артерии, реализуются и в других артериальных сосудах. Это подтверждается результатами, полученными в экспериментах in vivo (на целом животном) (Тарасова, 2010). В этих экспериментах обнаружено более выраженное влияние ингибиторов Rho-киназы на повышение артериального давления при активации агадренорецепторов у крыс в первые недели постнатального развития по сравнению со взрослыми. Таким образом, высокая активность Rho-киназы. характерная для сосудов новорожденных крыс, проявляется не только на уровне отдельного сосуда, но и на системном уровне и является важным механизмом регуляции гемодинамики в перинатальный период развития организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мочалов, Степан Вячеславович, Москва

1. Ашмарин И.П., Каменский A.A., Сухова Г.С. Руководство к практическим занятиям по физиологии человека и животных // М.: Изд-во МГУ 2004 - 256 с.

2. Воротников A.B. Крымский М.А. Ширинский В.П. Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц I! Биохимия 2002. - Т.67; - С. 1587-1610.

3. Воротников A.B., Крымский, М.А. Хапчаев, А.Ю., Серебряная, Д.В. Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц // Физиол. ж. им. ILM.Сеченова. 2004. - Т.90; - С.705-718.

4. Воротников A.B., Щербакова О.В., Кудряшова Т.В., Тарасова О.С., Ширинский В.П., Пфитцер Г., Ткачук В.А. Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции сокращения гладких мышц // Физиол. ж. им. И.М. Сеченова 2009. - Т. 95; №10 - С.1058-1073.

5. Гусев Н.Б. Основы биохимии мышечных тканей в кн.: Мышечные ткани. Под ред. Ю.С. Ченцова. -.М.: Медицина 2001. - С. 176-226.

6. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. Наука - 1986. - 255 с.

7. Морман Д., Хеллер JL Физиология сердечно-сосудистой системы. СПб.: Питер - 2000. - 256 с.

8. Орбели J1.A. Избранные труды в пяти томах. Том второй: Адаптационно-трофическая функция нервной системы. M.-JL: Изд-во Академии наук СССР. - 1962.-606 с.

9. Пуздрова В.А. Трофическое влияние симпатической иннервации на кальциевую чувствительность сократительного аппарата подкожной артерии крысы — Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2007. - 132 с.

10. Тарасова Н.В. Снижение роли Rho-киназы в регуляции тонуса сосудов иартериального давления при созревании симпатической нервной системы у крыс — Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2010. - 178 с.

11. Хапчаев А.Ю., Ширинский В.П., Воротников А.В. Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина // Успехи биологической химии 2003. - Т. 43; - С.365-420.

12. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Physiological variations in ovine cerebrovascular calcium sensitivity // Am J Physiol 1997. - V. 272; №5 Pt 2 -P.H2271-2281.

13. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Developmental changes in the calcium sensitivity of rabbit cranial arteries // Biol Neonate 1998a. - V. 74; №1 -P.60-71.

14. Akopov S.E. Zhang L. Pearce W.J. Maturation alters the contractile role of calcium in ovine basilar arteries // Pediatr Res 1998b. - V. 44; №2 - P. 154160.

15. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Regulation of Ca2+ sensitization by PKC and rho proteins in ovine cerebral arteries: effects of artery size and age // Am J Physiol 1998c. - V. 275; №3 Pt 2 - P.H930-939.

16. Albert A.P., Large W.A. Signal transduction pathways and gating mechanisms of native TRP-like cation channels in vascular myocytes // J Physiol 2006. -V. 570; №Pt 1 - P.45-51.

17. Ark M., Kubat H., Beydagi H., Ergenoglu T., Songu-Mize E. Involvement of rho kinase in the ouabain-induced contractions of the rat renal arteries // Biochem Biophys Res Commun 2006. - V. 340; №2 - P.417-421.

18. Azam M.A., Yoshioka K., Ohkura S., Takuwa N., Sugimoto N., Sato K.,94

19. Takuwa Y. Ca -independent, inhibitory effects of cyclic adenosine 5-monophosphate on Ca2+ regulation of phosphoinositide 3-kinase C2alpha, Rho, and myosin phosphatase in vascular smooth muscle // J Pharmacol Exp Ther 2007. - V. 320; №2 - P.907-916.

20. Belevych A.E., Beck R., Tammaro P., Poston L., Smirnov S.V. Developmental changes in the functional characteristics and expression of voltage-gated K+ channel currents in rat aortic myocytes // Cardiovasc Res -2002,- V. 54; №1 P. 152-161.

21. Belik J., Kerc E., Pato M.D. Rat pulmonary arterial smooth muscle myosin light chain kinase and phosphatase activities decrease with age // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006. - V. 290; №3 - P.L509-516.

22. Bevan R.D. Trophic effects of peripheral adrenergic nerves on vascular structure // Hypertension 1984. - V. 6; №6 Pt 2 - P.I1I19-26.

23. Blaustein M.P., Lederer W.J. Sodium/calcium exchange: its physiological implications // Physiol Rev 1999. - V. 79; №3 - P.763-854.

24. Blood A.B., Zhao Y., Long W., Zhang L., Longo L.D. L-type Ca channels in fetal and adult ovine cerebral arteries // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002. - V. 282; №1 - P.R131-138.

25. Bregestovski P.D., Printseva O., Serebryakov V., Stinnakre J., Turmin A.,• 2+ + Zamoyski V. Comparison of Ca -dependent K channels in the membrane ofsmooth muscle cells isolated from adult and foetal human aorta // Pflugers

26. Arch 1988. - V. 413; №1 - P.8-13.

27. Brock J.A., Cunnane T.C. Studies on the mode of action of bretylium and guanethidine in post-ganglionic sympathetic nerve fibres // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1988. - V. 338; №5 - P.504-509.

28. Bruce L., Nixon G.F. Increased sensitization of the myofilaments in rat neonatal portal vein: a potential mechanism // Exp Physiol 1997. - V. 82; №6- P.985-993.

29. Budzyn K., Paull M., Marlcy P.D., Sobey C.G. Segmental differences in the roles of rho-kinase and protein kinase C in mediating vasoconstriction // J Pharmacol Exp Ther 2006. - V. 317; №2 - P.791-796.

30. Bukoski R.D. Dietary Ca" and blood pressure: evidence that Ca -sensing receptor activated, sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca with vascular tone // Nephrol Dial Transplant 2001. - V. 16; №2 -P.218-221.

31. Burn J.H. Release of noradrenaline from sympathetic endings // Nature 1971.- V. 231; №5300 P.237-240.

32. Camello-Almaraz C., Macias B., Gomez-Pinilla P.J., Alcon S., Martin-Cano F.E., Baba A., Matsuda T., Camello P.J., Pozo M.J. Developmental changes in

33. Ca homeostasis and contractility in gallbladder smooth muscle // Am J Physiol Cell Physiol 2009. - V. 296; №4 - P.C783-791.

34. Chikumi H., Vazquez-Prado J., Servitja J.M., Miyazaki H., Gutkind J.S. Potent activation of RhoA by Galpha q and Gq-coupled receptors // J Biol Chem 2002. - V. 277; №30 - P.27130-27134.

35. Clapham D.E. TRP channels as cellular sensors // Nature 2003. - V. 426; №6966-P.517-524.

36. Cogolludo A., Moreno L., Lodi F., Tamargo J., Perez-Vizcaino F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction // Cardiovasc Res 2005. - V. 66; №1 -P.84-93.

37. Colyer J. Phosphorylation states of pliospholamban // Ann N Y Acad Sci -1998.-V. 853; P.79-91.

38. Cosens D.J., Manning A. Abnormal electroretinogram from a Drosophila mutant // Nature 1969. - V. 224; №5216 - P.285-287.

39. Damon D.FI. Sympathetic innervation promotes vascular smooth muscle differentiation // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005. - V. 288; №6 -P.H2785-2791.

40. Davies S., Reddy H.,Caivano M., Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors // Biochem. J. 2000. -V. 351;-P.95-105.

41. De Mey J.G., Megens R., Fazzi G.E. Functional antagonism between endogenous neuropeptide Y and calcitonin gene-related peptide in mesenteric resistance arteries // J Pharmacol Exp Thcr 2008. - V. 324; №3 - P.930-937.

42. Devine C.E., Somlyo A.V., Somlyo A.P. Sarcoplasmic reticulum and excitation-contraction coupling in mammalian smooth muscles // J Cell Biol -1972.-V. 52; №3 P.690-718.

43. Dimopoulos G.J., Semba S., Kitazawa K., Eto M., Kitazawa T. Ca2+-dependent rapid Ca2+ sensitization of contraction in arterial smooth muscle // Circ Res 2007. - V. 100; №1 - P.121-129.

44. Ekman M., Andersson K.E., Arner A. Developmental regulation of nerve and receptor mediated contractions of mammalian urinary bladder smooth muscle //Eur J Pharmacol 2006. - V. 532; №1-2 - P.99-106.

45. Ekman M., Fagher K., Wede M., Stakeberg K., Arner A. Decreased phosphatase activity, increased Ca~ sensitivity, and myosin light chain phosphorylation in urinary bladder smooth muscle of newborn mice // J Gen Physiol 2005. - V. 125; №2 - P. 187-196.

46. Eto M., Ohmori T., Suzuki M., Furuya K., Morita F. A novel protein phosphatase-1 inhibitory protein potentiated by protein kinase C. Isolation from porcine aorta media and characterization // J Biochem 1995. - V. 118; №6-P.l 104-1107.

47. Eto M., Senba S. Morita F., Yazawa M. Molecular cloning of a novel phosphorylation-dependent inhibitory protein of protein phosphatase-1 (CPI17) in smooth muscle: its specific localization in smooth muscle // FEBS Lett 1997. - V. 410; №2-3 - P.356-360.

48. Evans A.M., Osipenko O.N., Haworth S.G., Gurney A.M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells // Am J Physiol 1998. - V. 275; №3 Pt 2 - P.H887-899.

49. Fanaroff J.M., Fanaroff A.A. Blood pressure disorders in the neonate: hypotension and hypertension // Seminars in Fetal and Neonatal Medicine -2006.-V. 11; P.174-181.

50. Feng J., Ito M., Ichikawa K., Isaka N., Nishikawa M., Hartshorne D.J., Nakano T. Inhibitor}' phosphorylation site for Rho-associated kinase on smooth muscle myosin phosphatase // J Biol Chem 1999. - V. 274; №52 -P.37385-37390.

51. Fleischmann B.K., Murray R.K., Kotlikoff M.I. Voltage window for sustained elevation of cytosolic calcium in smooth muscle cells // Proc Natl Acad Sci U S A 1994. - V. 91; №25 - P. 11914-11918.

52. Fukuhara S., Chikumi FT., Gutkind J.S. RGS-containing RhoGEFs: the missing link between transforming G proteins and Rho? // Oncogene 2001. - V. 20; №13 - P.1661-1668.

53. Ghisdal P., Vandenberg G., Morel N. Rho-dependent kinase is involved in agonist-activated calcium entry in rat arteries // J Physiol 2003. - V. 551; №Pt 3 - P.855-867.

54. Gollasch M., Haase H. Ried C., Lindschau C„ Morano I., Luft F.C., Haller H. L-type calcium channel expression depends on the differentiated state of vascular smooth muscle cells // FASEB J 1998. - V. 12; №7 - P.593-601.

55. Gomez J.P., Ghisdal P., Morel N. Changes of the potassium currents in rat aortic smooth muscle cells during postnatal development // Pflugers Arch -2000. V. 441; №2-3 - P.388-397.

56. Greene E.C. Anatomy of the rat. Hafner Publishing Company, New York and London. - 1968.

57. Haase PL, Pfltzmaier B., McEnery M., Morano I. Expression of Ca~ channel subunits during cardiac ontogeny in mice and rats: identification of fetal aicand (3 subunit isoforms // Journal of Cellular Biochemistry 2000. - V. 76; -P.695-703

58. Haeusler G., Haefely W., Huerlimann A. On the mechanism of the adrenergic blocking action of bretylium and guanethidine // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmakol 1969. - V. 264; №3 - P.241-243.

59. Hart M.J., Jiang X., Kozasa T., Roscoe W. Singer W.D., Oilman A.G., Sternweis P.C., Bollag G. Direct stimulation of the guanine nucleotide exchange activity of pi 15 RhoGEF by Galphal3 // Science 1998. - V. 280; №5372 -P.2112-2114.

60. Hartshorne D.J. Myosin phosphatase: subunits and interactions // Acta Physiol Scand 1998. - V. 164; №4 - P.483-493.

61. Hartshorne D.J., Ito M., Erdodi F. Role of protein phosphatase type 1 in contractile functions: myosin phosphatase // J Biol Chem 2004. - V. 279; №36-P.37211-37214.

62. Hill C.E., Hirst G.D., van Helden D.F. Development of sympathetic innervation to proximal and distal arteries of the rat mesentery // J Physiol -1983. -V. 338; -P.129-147.

63. Hill C.E., Phillips J.K., Sandow S.L. Development of peripheral autonomic synapses: neurotransmitter receptors, neuroeffector associations and neural influences // Clin Exp Pharmacol Physiol 1999. - V. 26; №8 - P.581-590.24*

64. Hirano K. Current topics in the regulatory mechanism underlying the Ca sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle // J Pharmacol Sci 2007. - V. 104; №2 - P. 109-115.

65. Hirano K., Phan B.C., Hartshorne D.J. Interactions of the subunits of smooth muscle myosin phosphatase // J Biol Chem 1997. - V. 272; №6 - P.3683-3688.

66. Ito M., Nakano T., Erdodi F., Hartshorne D.J. Myosin phosphatase: structure, regulation and function // Mol Cell Biochem 2004. - V. 259; №1-2 - P. 197209.

67. Jaggar J.H., Porter V.A., Lederer W.J., Nelson M.T. Calcium sparks in smooth muscle // Am J Physiol Cell Physiol 2000. - V. 278; №2 - P.C235-256.

68. Janssen L.J., Lu-Chao H. Netherton S. Excitation-contraction coupling in pulmonary vascular smooth muscle involves tyrosine kinase and Rho kinase // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001. - V. 280; №4 - P.L666-674.

69. Jarajapu Y.P. Knot H.T. Role of phospholipase C in development of myogenic tone in rat posterior cerebral arteries // Am J Physiol Heart Circ Physiol -2002. V. 283; №6 - P.H2234-2238.

70. Jarajapu Y.P., Knot H.J. Relative contribution of Rho kinase and protein kinase C to myogenic tone in rat cerebral arteries in hypertension // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005. - V. 289; №5 - P.H1917-1922.

71. Jensen P.E., Mulvany M.J., Aalkjaer C. Endogenous and exogenous agonist-induced changes in the coupling between Ca2+.j and force in rat resistance arteries // Pflugers Arch 1992. - V. 420; №5-6 - P.536-543.

72. Jernigan N., Walker B.,Resta T. Reactive oxygen species mediate RhoA/Rho kinase-induced Ca" sensitization in pulmonary vascular smooth muscle following chronic hypoxia // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008. -V.295; - P.L515-L529.

73. Jin L.M. Rock 'n' Rho: regulation of ion channels // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009. - V. 296; №4 - P.H908-909.

74. Johansson S., Iliadou A., Bergvall N., Tuvemo T., Norman M., Cnattingius S. Risk of high blood pressure among young men increases with the degree of immaturity at birth // CJ Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005 - V. 112: -P.3430-3436.

75. Kasparov S., Paton J.F. Changes in baroreceptor vagal reflex performance in the developing rat // Pflugers Arch 1997. - V. 434; №4 - P.438-444.

76. Khan I., Sandhu V., Misquitta C.M., Grover A.K. SERCA pump isoform expression in endothelium of veins and arteries: every endothelium is not the same // Mol Cell Biochem 2000. - V. 203; №1-2 - P.ll-15.

77. Kitazawa T., Eto M., Woodsome T.P., Khalequzzaman M. Phosphorylation of the myosin phosphatase targeting subunit and CPI-17 during Ca" sensitization in rabbit smooth muscle // J Physiol 2003. - V. 546; №Pt 3 - P.879-889.

78. Kitazawa T., Takizawa N., Ikebe M., Eto M. Reconstitution of protein kinase C-induced contractile Ca~ sensitization in triton X-100-demembranated rabbit arterial smooth muscle // J Physiol 1999. - V. 520 Pt 1; - P.139-152.

79. Knok G., Snetkov V. Shaifta Y„ Drndarski S„ Ward J., Aaronson P. Role of src-family kinases in hypoxic vasoconstriction of rat pulmonary artery // Cardiovascular Research 2008. V.80; - P.453-462.

80. Knot H.J. Nelson M.T. Regulation of arterial diameter and wall Ca2+. in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure // J Physiol 1998. - V. 508 ( Pt 1); - P. 199-209.

81. Koyama M., Ito M., Feng J., Seko T., Shiraki K., Takase K., Hartshome D.J., Nakano T. Phosphorylation of CPI-17, an inhibitory phosphoprotein of smooth muscle myosin phosphatase, by Rho-kinase // FEBS Lett 2000. - V. 475; №3 - P.197-200.

82. Kozasa T., Jiang X., Hart M.J., Sternweis P.M., Singer W.D., Gilman A.G., Bollag G., Sternweis P.C. pi 15 RiioGEF, a GTPase activating protein for Galphal2 and Galphal3 // Science 1998. - V. 280; №5372 - P.2109-2111.

83. Laufs U., Liao J. Post-transcriptional Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase mRNA Stability by Rho GTPase // J Biol Chem 1998. - V. 273; №37 - P.24266-24271.

84. Li S., Moon J., Miao H„ Jin G., Chen B., Yuan S., Hu Y., Usami S„ Chien S. Signal transduction in matrix contraction and the migration of vascular smooth muscle cells in three-dimensional matrix // J Vase Res 2003. - V.40; -P.378-388.

85. Lin M.T., Hessinger D.A., Pearce W.J. Longo L.D. Developmental differences in Ca~ -activated K channel activity in ovine basilar artery // Am J PhysiofHeart Circ Physiol 2003. - V. 285; №2 - P.H701-709.

86. Loirand G., Guerin P., Pacaud P. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology // Circ Res 2006. - V. 98; - P.322-334.

87. Long W., Zhang L., Longo L.D. Cerebral artery sarcoplasmic reticulum Ca stores and contractility: changes with development // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2000. - V. 279; №3 - P.R860-873.

88. Long W., Zhao Y., Zhang L., Longo L.D. Role of Ca2+ channels in NE9.Jinduced increase in Ca and tension in fetal and adult cerebral arteries // Am J Physiol 1999. - V. 277; №1 Pt 2 - P.R286-294.

89. Luff S.E. Development of neuromuscular junctions on small mesenteric arteries of the rat // J Neurocytol 1999. - V. 28; №1 - P.47-62.

90. MacDonald J.A., Borman M.A., Muranyi A., Somlyo A.V., Hartshorne D.J., Haystead T.A. Identification of the endogenous smooth muscle myosin phosphatase-associated kinase // Proc Natl Acad Sci U S A 2001. - V. 98; №5 -P.2419-2424.

91. Mack C., Somlyo A., Hautmann M., Somlyo A., Owens G. Smooth muscle differentiation marker gene expression is regulated by RhoA-mediated actin polymerization // J Biol Chem 2001. - V. 276; №1 - P.341-347.

92. Maguire J.J., Davenport A.P. Regulation of vascular reactivity by established and emerging GPCRs // Trends Pharmacol Sci 2005. - V. 26; №9 - P.448-454.

93. McFadzean I., Gibson A. The developing relationship between receptor-operated and store-operated calcium channels in smooth muscle // Br J Pharmacol 2002. - V. 135; №1 - P.l-13.

94. Mills E., Smith P.G. Mechanisms of adrenergic control of blood pressure in developing rats // Am J Physiol 1986. - V. 250; №2 Pt 2 - P.R188-192.

95. Mita M., Yanagihara H., Hishinuma S„ Saito M., Walsh M.P. Membrane depolarization-induced contraction of rat caudal arterial smooth muscle involves Rho-associated kinase // Biochem J 2002. - V. 364; №Pt 2 - P.431-440.

96. Mizuno Y., Isotani E., Huang J., Ding H., Stull J.T., Kamm K.E. Myosin light chain kinase activation and calcium sensitization in smooth muscle in vivo // Am J Physiol Cell Physiol 2008. - V. 295; №2 - P.C358-364.

97. Mueed I., Bains P., Zhang L., Macleod K.M. Differential participation of protein kinase C and Rho kinase in alpha 1 -adrenoceptor mediated contraction in rat arteries // Can J Physiol Pharmacol 2004. - V. 82; №10 - P.895-902.

98. Mukai Y., Shimokawa H. Matoba T., Kandabashi T., Satoh S., Hiroki J., Kaibuchi K., Takeshita A. Involvement of Rho-kinase in hypertensive vascular disease: a novel therapeutic target in hypertension // FASEB J 2001. - V. 15; №6-P. 1062-1064.

99. Mulvany M.J., Halpern W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats // Circ Res -1977.-V. 41; №1 -P.19-26.

100. Nakanishi T., Gu H. Abe K., Momma K. Developmental changes in the contractile system of the mesenteric small artery of rabbit // Pediatr Res -1997. V. 41; №1 -P.65-71.

101. Nelson M.T., Patlak J.B., Worley J.F., Standen N.B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone // Am J Physiol 1990. - V. 259; №1 Pt 1 - P.C3-18.

102. Nelson M.T., Standen N.B., Brayden J.E., Worley J.F., 3rd Noradrenaline contracts arteries by activating voltage-dependent calcium channels // Nature -1988. V. 336; №6197 - P.382-385.

103. Nelson M.T., Worley J.F. Dihydropyridine inhibition of single calcium channels and contraction in rabbit mesenteric artery depends on voltage // J Physiol 1989. - V. 412; - P.65-91.

104. Nilius B., Droogmans G. Ion Channels and Their Functional Role in Vascular Endothelium // Physiological Reviews 2001. - V. 81; - P. 1415-1459.

105. Nilsson H. Adrenergic nervous control of resistance and capacitance vessels. Studies on isolated blood vessels from the rat // Acta Physiol Scand Suppl -1985.-V. 541; P.1-34.

106. Nilsson H., Sjoblom N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat // Acta Physiol Scand 1985. - V. 125; №3 - P.429-435.

107. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications lor cellular regulation // Nature 1988. - V. 334; №6184 - P.661-665.

108. Nixon G.F., Iizuka K., Haystead C.M., Haystead T.A., Somlyo A.P., Somlyo A.V. Phosphorylation of caldesmon by mitogen-activated protein kinase with no effect on Ca2+ sensitivity in rabbit smooth musclc // J Physiol 1995. - V. 487 (Pt 2); - P.283-289.

109. Nobe K., Paul R.J. Distinct pathways of Ca2+ sensitization in porcine coronary artery: effects of Rho-related kinase and protein kinase C inhibition on force and intracellular Ca2+ // Circ Res 2001. - V. 88; №12 - P.1283-1290.

110. Noma K., Oyama N., Liao J.K. Physiological role of ROCKs in the cardiovascular system // Am J Physiol Cell Physiol 2006. - V. 290; №3 -P.C661-668.

111. Osol G., Laher I., Kelley M. Myogenic tone is coupled to phospholipase C and G protein activation in small cerebral arteries // Am J Physiol 1993. - V. 265; №1 Pt 2-P.H415-420.

112. Parekh A.B., Putney J.W., Jr. Store-operated calcium channels // Physiol Rev -2005.-V. 85; №2 P.757-810.

113. Patel C.A., Rattan S. Spontaneously tonic smooth muscle-has characteristically higher levels of RhoA/ROK compared with the phasic smooth muscle // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006. - V. 291; №5 - P.G830-837.

114. Payne M.C., Zhang H.Y., Prosdocimo T., Joyce K.M., Koga Y., Ikebe M., Fisher S.A. Myosin phosphatase isoform switching in vascular smooth muscle development // J Mol Cell Cardiol 2006. - V. 40; №2 - P.274-282.

115. Perez G.J., Bonev A.D., Nelson M.T. Micromolar Ca2+ from sparks activates Ca2+ -sensitive K channels in rat cerebral artery smooth muscle // Am J Physiol Cell Physiol 2001. - V. 281; №6 - P.C1769-1775.

116. Quignard J.F., Grazzini E., Guillon G., Harricane M.C., Nargeot J., Richard S. Absence of calcium channels in neonatal rat aortic myocytes // Pflugers Arch -1996. V. 431; №5 - P.791-793.

117. Ramsey I.S. Delling M., Clapham D.E. An introduction to TRP channels // Annu Rev Physiol 2006. - V. 68; - P.619-647.

118. Ratz P.H., Berg K.M., Urban N.H., Miner A.S. Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KC1 as a calcium-sensitizing stimulus // Am J Physiol Cell Physiol 2005. - V. 288; №4 - P.C769-783.

119. Redwood C.S., Marston S.B., Gusev N.B. The functional effects of mutations Thr673~>Asp and Ser702—>Asp at the Pro-directed kinase phosphorylation sites in the C-terminus of chicken gizzard caldesmon // FEBS Lett 1-993. - V. 327; №1 - P.85-89.

120. Reeve H.L., Weir E.K., Archer S.L., Cornfield D.N. A maturational shift in4. 94pulmonary K channels, from Ca sensitive to voltage dependent // Am J Physiol 1998.-V. 275; №6 Pt 1 - P.L1019-1025.

121. Sakurada S., Takuwa N., Sugimoto N. Wang Y., Seto M., Sasaki Y., Takuwa94

122. Y. Ca -dependent activation of Rho and Rho kinase in membrane depolarization-induced and receptor stimulation-induced vascular smooth muscle contraction // Circ Res 2003. - V. 93; №6 - P.548-556.

123. Salamanca D.A., Khalil R.A. Protein kinase C isoforms as specific targets for modulation of vascular smooth muscle function in hypertension // Biochem Pharmacol 2005. - V. 70; №11 - P.1537-1547.

124. Sandow S.L., Goto K., Rummery N.M., Hill C.E. Developmental changes in myoendothelial gap junction mediated vasodilator activity in the rat saphenous artery // J Physiol 2004. - V. 556; №Pt 3 - P.875-886.

125. Sandow S.L., Hill C.E. Physiological and anatomical studies of the development of the sympathetic innervation to rat iris arterioles // J Auton Nerv Syst 1999. - V. 77; №2-3 - P. 152-163.

126. Seasholtz T.M., Majumdar M., Brown J.H. Rho as a mediator of G proteincoupled receptor signaling // Mol Pharmacol 1999. - V. 55; №6 - P.949-956.

127. Shabir S., Borisova L., Wray S.s Burdyga T. Rho-kinase inhibition and• 9 4electromechanical coupling m rat and guinea-pig ureter smooth muscle: С a" -dependent and -independent mechanisms // J Physiol 2004. - V. 560.; №Pt 3 -P.839-855.

128. Sigma-RBl eHandbook. Электронный ресурс. Систем, требования: Adobe Acrobat Reader. URL: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/ Sigma/RBIHandbook/rbibook5pkc.Par.0001 .File.tmp/rbibook5pkc.pdf (дата обращения: 27.04.2010)

129. Somlyo A.P., Somlyo A.V. Signal transduction by G-proteins, rho-kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II // J Physiol -2000.-V. 522 Pt 2; P.177-185.

130. Somlyo A.P., Somlyo A.V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase // Physiol Rev-2003. -V. 83; №4 P.1325-1358.

131. Strehler E.E., Zacharias D.A. Role of alternative splicing in generating isoform diversity among plasma membrane calcium pumps // Physiol Rev -2001.- V. 81; №1 -P.21-50.

132. Su B.Y. Reber K.M., Nankervis C.A., Nowicki P.T. Development of the myogenic response in postnatal intestine: role of PKC // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003. - V. 284; №3 - P.G445-452.

133. Takai Y., Sasaki T., Matozaki T. Small GTP-binding proteins // Physiol Rev -2001. -V. 81; №1 P.153-208.

134. Takashima S. Phosphorylation of myosin regulatory light chain by myosin light chain kinase, and muscle contraction // Circ J 2009. - V. 73; №2 -P.208-213.

135. Biological motility: basic research and practice. Pushino. - 2006. - V. - P.2.

136. Thomeloe K.S., Nelson M.T. Ion channels in smooth muscle: regulators of intracellular calcium and contractility // Can J Physiol Pharmacol 2005. - V. 83; №3 -P.215-242.

137. Todd M.E. Development of adrenergic innervation in rat peripheral vessels: a fluorescence microscopic study // J Anat 1980. - V. 131; №Pt 1 - P.121-133.

138. Toh C.C., Lee T.S., Kiang A.K. The pharmacological actions of capsaicin and analogues // Br J Pharmacol Chemother 1955. - V. 10; №2 - P. 175-182.

139. Trendelenburg U., Maxwell R.A., Pluchino S. Methoxamine as a tool to assess the importance of intraneuronal. uptake of 1-norepinephrine in the cat's nictitating membrane // J Pharmacol Exp Ther 1970. - V. 172; №1 - P.91-99.

140. Tribe R.M., Moriarty P., Poston L. Calcium homcostatic pathways change with gestation in human myometrium // Biol Reprod 2000. - V. 63; №3 -P.748-755.

141. Varma D.R., Deng X.F. Cardiovascular alpha 1-adrenoceptor subtypes: functions and signaling // Can J Physiol Pharmacol 2000. - V. 78; №4 -P.267-292.

142. Yelasco G., Armstrong C., Morrice N., Frame S., Cohen P. Phosphorylation of the regulatory subunit of smooth muscle protein phosphatase 1M at Thr850 induces its dissociation from myosin // FEBS Lett 2002. - V. 527; №1-3 -P.101-104.

143. Villalba N., Stankevicius E., Simonsen U., Prieto D. Rho kinase is involved in Caentry of rat penile small arteries // Am J Physiol Heart Circ Physiol -2008. V. 294; №4 - P.H1923-1932.

144. Vogt S., Grosse R., Schultz G., Offermanns S. Receptor-dependent RhoA activation in G12/G13-deficient cells: genetic evidence for an involvement of Gq/Gu // J Biol Chcm 2003. - V. 278; №31 - P.28743-28749.

145. Wang J., Weigand L., Foxson J., Shimoda L.A., Sylvester J.T. Ca signaling in hypoxic pulmonary vasoconstriction: effects of myosin light chain and Rho kinase antagonists // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007. - V. 293; №3 - P.L674-685.

146. Wettschureck N., Offermanns S. Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology // J Mol Med 2002. - V. 80; №10 - P.629-638.

147. Williams D.A., Fay F.S. Calcium transients and resting levels in isolated smooth muscle cells as monitored with quin 2 // Am J Physiol 1986. - V. 250; №5 Pt 1 -P.C779-791.

148. Woodsome T.P., Eto M. Everett A., Brautigan D.L., Kitazawa T. Expression of CPI-17 and myosin phosphatase correlates with Car sensitivity of protein kinase C-induced contraction in rabbit smooth muscle // J Physiol 2001. - V. 535; №Pt 2 - P.553-564.

149. Wu K.D., Bungard D., Lytton J. Regulation of SERCA Ca2+ pump expression by cytoplasmic Ca" in vascular smooth muscle cells // Am J Physiol Cell Physiol 2001. - V. 280; №4 - P.C843-851.

150. Xiao D., Longo L.D., Zhang L. Alpha 1-adrenoceptor-mediated phosphorylation of MYPT-1 and CPI-17 in the uterine artery: role of ERK/PKC // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005. - V. 288; №6 - P.H2828-2835.

151. Yamboliev I.A., Hedges J.C., Mutnick J.L., Adam L.P., Gerthoffer W.T. Evidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HSP27 pathway // Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000.- V. 278; №6-P.H 1899-1907.

152. Yanagisawa T., Okada Y. KC1 depolarization increases Ca sensitivity of contractile elements in coronary arterial smooth muscle // Am J Physiol -1994. V. 267; №2 Pt 2 - P.H614-621.

153. Yatani A., Irie K., Otani T., Abdellatif M., Wei L. RhoA GTPase regulates L-type Ca currents in cardiac myocytes // Am J Physiol Heart Circ Physiol -2005. V. 288; №2 - P.H650-659.

154. Yu S.M., Tsai S.Y., Guh J.H., Ko F.N., Teng C.M., Ou J.T. Mechanism of catecholamine-induced proliferation of vascular smooth musclc cells // Circulation 1996. - V. 94; №3 - P.547-554.

155. Zemlickova E., Johannes F.J. Aitken A., Dubois T. Association of CPI-17 with protein kinase C and casein kinase I // Biochem Biophys Res Commun -2004. -V. 316; №1 P.39-47.

156. Zoer B., Blanco C.E. Villamor E. Role of Rho-kinase in mediating contraction of chicken embryo femoral arteries // J Comp Physiol B 2010. -V. 180; №3 - P.427-435.

Информация о работе

Мочалов, Степан Вячеславович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы