Эндотелий-зависимая регуляция сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе

Гайнуллина, Дина Камилевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эндотелий-зависимая регуляция сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эндотелий-зависимая регуляция сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе"

На правах рукописи

ГАЙНУЛЛИНА ДИНА КАМИЛЕВНА

ЭНДОТЕЛИЙ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СОКРАЩЕНИЯ ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ У КРЫС В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - Физиологи "" дцоооч" 03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з КОЯ 2011

Москва у

2011 /С.О/' • /

4858533

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - профессор А.А. Каменский), в Институте сердечно-сосудистой физиологии Гейдельбергского университета в г. Мангейм и в Институте вегетативной физиологии университета г. Кёльн (Германия).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Ольга Сергеевна Тарасова

Александр Вячеславович Воротников

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Петр Михайлович Маслюков

Мария Павловна Давыдова

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии с биофизикой Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Ярославская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Учреждение Российской академии наук Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Защита диссертации состоится 14 ноября 2011 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: Ленинские горы, д. 1, строение 12, Москва, ГСП-1,119991, ауд. М-1

Автореферат разослан 13 октября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рост и развитие организма сопряжены с изменениями в строении и функционировании многих органов и систем, в том числе и сердечнососудистой системы. В ходе постнатального онтогенеза кровеносная система претерпевает как количественные, так и качественные изменения: происходят рост и ветвление сосудистого русла, увеличение толщины стенок сосудов, что ведет к повышению периферического сопротивления сосудов и уровня артериального давления. У крыс, например, давление в большом круге кровообращения приближается к взрослому уровню к 3-4 неделям постнатального развития, причем существенное повышение давления происходит между второй и третьей неделями после рождения (Тарасова, 2010; Kasparov, Patón, 1997).

Благодаря росту сосудистого русла в постнатальном онтогенезе развивающиеся органы и ткани обеспечиваются необходимым количеством кислорода и питательных веществ. Увеличение толщины стенок артерий, транспортирующих большие объемы крови при возрастающем давлении, происходит в результате гипертрофии гладкомышечных клеток, а также за счет увеличения количества клеточных слоев (Sandow et al., 2004).

Одновременно с существенными структурными перестройками кровеносной системы в процессе постнатального развития изменяется и функционирование отдельных сосудов. Симпатическая регуляция тонуса сосудов у новорожденных крыс еще практически отсутствует, и полное ее формирование заканчивается лишь к концу первого месяца жизни (Мочалов и др., 2008; Todd, 1980; Sandow, Hill, 1999). В отсутствие трофического влияния симпатических нервов регуляция сокращения гладкой мышцы сосудов у новорожденных крыс также существенно отличается от регуляции у взрослых. В гладкомышечных клетках новорожденных и взрослых крыс были обнаружены разные паттерны экспрессии сократительных и ре1уляторных белков, то есть с возрастом происходит изменение механизмов сокращения артерий (Пуздрова, 2007; Owens 1995, 2004). В раннем постнатальном периоде артерии в большей степени демонстрируют так называемый «Са2+-независимый» путь регуляции сокращения, который к взрослому возрасту сменяется более «Ca -зависимым», то есть у новорожденных животных проявляется феномен повышенной чувствительности сократительного аппарата к Са2+ (Пуздрова, 2007; Мочалов, 2010; Akopovetal., 1998).

Помимо гладкомышечных клеток, модификациям могут подвергаться и эндотелиальные клетки сосудов. Эндотелий продуцирует целый ряд факторов, которые могут вызывать как расслабление, так и сокращение гладкой мышцы сосудов. В здоровом организме секреторная активность эндотелия смещена в сторону продукции вазодилятаторных соединений, важнейшими из которых являются оксид азота, простациклин и эндотелиальный гиперполяризующий фактор (Triggle, Ding, 2011). Хотя эндотелий играет важную роль в регуляции

сосудистого тонуса с самого рождения животного, его секреторная активность изменяется в процессе постнатального развития (Boegehold, 2010).

В момент рождения происходит переход с плацентарного на легочное дыхание, что, естественно, влечет за собой значительные перестройки в кровеносном русле легких. Этот переход реализуется, в том числе, благодаря усилению эндотелий-зависимой дилятации и падению сопротивления легочных сосудов (Boegehold, 2010; Aschner et al., 2009; Zellers, Vanhoutte, 1991; Liu et al., 1992). Сходное увеличение релаксирующего влияния эндотелия наблюдается в сосудистых бассейнах головного мозга и скелетных мышц (Boegehold, 2010; Williams, Реагсе, 2006; Williams et al., 2005; Linderman, Boegehold, 1998, 1999). Напротив, в сосудистом русле брыжейки базальная продукция NO эндотелием и дилятация под действием вазоактивных агонистов наиболее выражены в первые дни после рождения и уменьшаются с возрастом (Boegehold, 2010; Nankervis et al., 2001).

Приведенные выше данные характеризуют неоднородность протекающих в онтогенезе процессов: изменение эндотелиального фенотипа подчиняется метаболическим запросам и нуждам в кровоснабжении конкретных органов и тканей. Вместе с тем, возрастные изменения эндотелиальной функции исследованы не для всех сосудистых регионов. В раннем постнатальном онтогенезе одним из гемодинамически важных органов является кожа: у 1-2-недельных крыс кожный кровоток составляет почти 20% сердечного выброса, а с возрастом его доля уменьшается (Stulkova, 1977). Однако регуляция тонуса сосудов кожи со стороны эндотелия в возрастном аспекте практически не исследована. Также следует отметить, что для всех сосудистых регионов мало изучены механизмы эндотелий-зависимой регуляции сосудистого тонуса, такие как относительный вклад различных эндотелиальных факторов, регуляция их продукции, взаимодействие с гладкомышечными клетками сосуда и др.

Целью данной работы было исследовать механизмы эндотелий-зависимой регуляции сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) сравнить влияние эндотелия на сокращение артерий у молодых (в возрасте 1-2 недель) и у взрослых крыс;

2) установить, с активностью какого из эндотелий-зависимых механизмов связано ослабление сокращения артерий у молодых животных;

3) исследовать возрастные особенности сигнальных каскадов в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, которые могут обеспечивать ослабление сократительного ответа артерий молодых животных.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые систематически исследованы механизмы эндотелий-зависимой регуляции сокращения питающих кожу артерий у крыс в первые недели после рождения, когда кожа является гемодинамически важным сосудистым регионом, а также изменения этих механизмов в процессе взросления организма. Использование разнообразных современных методических подходов и выполнение контрольных экспериментов на разных этапах исследования позволили адекватно сравнить влияние эндотелия на сокращение гладкомышечных клеток сосудов у 1-2-недельных и взрослых животных. Представленное исследование впервые охватывает весь путь проведения дилятаторного сигнала от эндотелиальных к гладкомышечным клеткам. В отличие от большинства опубликованных исследований, в которых эндотелий-зависимое расслабление изучалось с использованием веществ, напрямую активирующих эндотелиальные клетки, в данной работе обнаружено влияние эндотелия на эффекты сократительного агента, активирующего гладкомышечные клетки и не оказывающего прямого влияния на эндотелий сосудов. Такое антиконтрактильное влияние эндотелия в сосудах 1-2-недельных крыс, связанное с тонической секрецией оксида азота, проявляется вне зависимости от природы стимула, вызывающего сокращение, что указывает на потенциальную важность этого механизма для регуляции тонуса сосудов in vivo.

Практическая значимость работы

Значимость настоящей работы для практической и фундаментальной медицины связана с распространенностью и ростом встречаемости в последние десятилетия сердечно-сосудистых заболеваний среди новорожденных детей (Flynn, 2008). В то время как среди взрослого населения развитых стран артериальная гипертензия уже давно считается, по данным Всемирной Организации Здравоохранения, одним из наиболее распространенных заболеваний, в детском и подростковом возрасте признаки сердечно-сосудистых расстройств часто внешне не проявляются. Тем не менее, наличие скрытых патологических изменений, в том числе изменений эндотелиальной функции, может приводить к серьезным последствиям в более поздние годы жизни. Для определения механизмов возникновения и прогрессирования таких заболеваний сначала необходимо выяснить изменения эндотелиального фенотипа, происходящие в здоровом организме вскоре после рождения и в течение последующего развития. Однако работ, посвященных изучению происходящих в норме возрастных изменений эндотелий-зависимой регуляции тонуса артерий большого круга кровообращения, крайне мало, они охватывают лишь отдельные регионы сосудистого русла и часто носят феноменологический характер. Изучение тонких механизмов эндотелий-зависимой регуляции тонуса артерий является основой для создания новых лекарственных препаратов, способных влиять на уровень артериального давления за счет изменения тонуса сосудов и не обладающих нежелательными эффектами на сердечную деятельность. Результаты данного исследования указывают на необходимость учитывать при

фармакологических воздействиях не только региональные, но и возрастные особенности механизмов эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов.

Основные положения, выносимые на защиту

1) В отличие от взрослых крыс, у крыс в возрасте 1-2 недель эндотелий ослабляет сократительные ответы подкожной артерии, такое влияние эндотелия связано с продукцией оксида азота.

2) Эндотелий 1-2-недельных крыс продуцирует оксид азота тонически, что связано с повышенным (по сравнению со взрослыми) уровнем экспрессии эндотелиальной МО-синтазы и ее активацией посредством А1й/Р13-киназного пути.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты диссертационной работы были представлены на IX Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, Украина, 2007), на V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007), на IV Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2008), на VII Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, Россия, 2008), на XV и XVIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» и «Ломоносов-2011» (Москва), на Съездах Скандинавского физиологического общества (Оулу, Финляндия, 2008; Берген, Норвегия, 2011), на съездах Немецкого физиологаческого общества (Гиссен, Германия, 2009; Регенсбург, Германия, 2011), на совместном съезде Немецкого и Скандинавского физиологических обществ (Копенгаген, Дания, 2010), на XX Международном симпозиуме по резистивным сосудам (Ребилд, Дания, 2011) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ, и 14 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Список литературы включает 154 источника. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на крысах Вистар в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Возраст животных составлял 9-15 дней (группа «новорожденные») и 2-3 месяца (группа «взрослые»).

Эксперименты на изолированных сосудах

Измерение сократительной активности сосудов в изометрическом режиме проводили с помощью системы «wire myograph» (модель 6 ЮМ, DMT A/S, Дания). Животных наркотизировали СО2, декапитировали гильотиной и выделяли подкожную артерию. Вырезали кольцевой сегмент сосуда длиной 2 мм и закрепляли его в миографе. В случае необходимости проводили механическое удаление эндотелия. Раствор в миографе имел состав (в мМ): NaCl 120; NaHC03 26; КС1 4,5; СаС12 1,6; MgS04 1,0; NaH2P04 1,2; D-глюкоза 5,5; EDTA 0,025; HEPES 5,0; pH=7,4. После нагрева миографа до 37°С (в течение 30 мин) определяли растяжение препарата, оптимальное для проявления его сократительной активности (Mulvany, Halpern, 1977). В начале каждого эксперимента препарат дважды активировали 10 мкМ фенилэфрина и проводили проверку функциональной активности эндотелия путем аппликации ацетилхолина (10 мкМ).

В большинстве экспериментов исследовали сократительные ответы артерий на метоксамин (MX) или U46619. Для этого после окончания процедуры активации к каждому препарату добавляли растворитель (см. далее) и через 25 мин проводили кумулятивное добавление MX в диапазоне концентраций от 0,01 до 100 мкМ или U46619 в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мкМ. После этого препараты отмывали и в один из каналов добавляли ингибитор, а в другой (контрольный) - соответствующий растворитель (деионизированную воду или диметидсульфоксид - ДМСО) в таком же объеме. Через 25 мин без отмывки препарата проводили такую же «концентрацию-эффект» на MX, как описано выше. Такой протокол, включающий параллельное исследование зависимостей «концентрация-эффект» для двух препаратов, позволял сравнивать между собой исходную чувствительность сосудов (по первому сократительному ответу на MX), а также давал возможность учесть спонтанное изменение реакций со временем. Для оценки эффектов ингибиторов сравнивали вторые зависимости «концентрация-эффект» для сосудов с растворителем и с ингибитором.

Обработка результатов. При обработке зависимости «концентрация-эффект» определяли абсолютное изменение силы сокращения под действием каждой из концентраций агониста. Полученные значения нормировали на значение максимальной силы сокращения, зарегистрированное при проведении первой зависимости «концентрация-эффект». Статистический анализ данных проводили с использованием дисперсионного анализа для повторных измерений. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. В тексте и

на графиках данные приведены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего, п - объем выборки.

Измерение сократительной активности сосудов в изобарическом режиме. Ключевые эксперименты, выполненные в изометрическом миографе, были воспроизведены в изобарических условиях, т.е. при постоянном трансмуральном давлении. Для этого сегмент сосуда помещали в камеру изобарического миографа (DMT, Дания) и закрепляли между двумя стеклянными канюлями. Проксимальный конец сосуда надевали на канюлю подходящего диаметра, а его дистальный конец привязывали к другой канюле. Таким образом, просвет сосуда сообщался только с входной канюлей, которую с помощью системы трубок подсоединяли к емкости с раствором. Меняя расположение этой емкости по вертикали, можно было создавать разное давление внутри сосуда. В экспериментах с сосудами новорожденных крыс уровень давления составлял 40 мм рт.ст. Через камеру миографа осуществлялся постоянный проток раствора.

Миограф устанавливали на специальной стойке с инвертированным микроскопом и видеокамерой. Сигнал от видеокамеры передавался на компьютер, где непрерывно обрабатывался при помощи программы В VA 300 (Hasotec, Германия). Эта программа вычисляла значения внутреннего и наружного диаметра сосуда (в мкм).

Обработка результатов. В ходе первичной обработки данных определяли диаметр сосуда в отсутствие MX, а также минимальный диаметр сосуда во время действия каждой из концентраций MX. Затем значения внутреннего диаметра при действии каждой из концентраций MX нормировали на значение, зарегистрированное до исследования соответствующей зависимости «концентрация-эффект». Статистический анализ данных проводили с использованием дисперсионного анализа для повторных измерений.

Исследование уровня экспрессии мРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Оценку уровня экспрессии мРНК эндотелиальной (eNOS), нейрональной (nNOS) и индуцибельной (¡NOS) форм NO-синтаз, а также глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД) в подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени. Для экстракции мРНК использовали набор RNeasy Mini Kit от Qiagen. Выделенную мРНК подвергали обратной транскрипции для синтеза комплементарной ДНК (с помощью набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits от Applied Biosystems), после чего проводили ПЦР в реальном времени (используя набор MAXIMA SYBR Green qPCR Master Mix от Fermentas). Последовательности прямых и обратных праймеров для eNOS, nNOS, iNOS и ГАФД для крыс были взяты из опубликованных статей (Kim, Suh, 2010; Joshi et al., 2009).

Обработка результатов количественной ПЦР. Для каждого из образцов значения ср для интересующих генов были соотнесены со значениями для ГАФД

(ср - crossing point - это точки кривых (номер цикла амплификации), в которых флуоресценция продукта реакции начинает превышать базальную флуоресценцию смеси). Две группы экспериментальных образцов (от новорожденных и взрослых крыс) были сравнены между собой на предмет статистически значимых различий в специальной программе REST software от QIAGEN. Считали, что группы различаются между собой, когда уровень значимости был меньше 0,05.

Исследования содержания и степени фосфорилирования белков в тканях сосудов

Подготовка препаратов. Для получения образцов, в которых исследовали влияние MX и/или L-NNA на фосфорилирование регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина (MYPT1) или регуляторных легких цепей миозина (РЛЦМ), использовали кольцевые сегменты подкожной артерии крысы. Для воспроизведения условий экспериментов по измерению силы сокращения все препараты (и от взрослых, и от новорожденных животных) подвергались ступенчатому растяжению до уровня, соответствующего среднему растяжению в предыдущих опытах на сосудах каждой из возрастных групп. Препараты двукратно активировали 10 мкМ фенилэфрина, после каждого сокращения следовала отмывка длительностью 15 мин. Затем сосуды от крыс каждого возраста подразделяли на группы в зависимости от вида воздействий:

- «контроль» - в камеру миографа добавляли растворитель (Н20) на 43 мин;

- «L-NNA» - на 43 мин добавляли L-NNA в концентрации 100 мкМ.

После окончания каждого из воздействий сосуды очень быстро охлаждали до -80°С в ацетоне, содержащем 15% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Через 3 ч проводили отмывку препарата от ТХУ ацетоном. Затем образцы ткани гомогенизировали в буфере, имевшем состав: глицерин 10%, додецилсульфат натрия (SDS) 2%, Tris-HCl 0,063 М, бромфеноловый синий. В буфер непосредственно перед применением были добавлены лейпептин (10 мкМ), фенилметансульфонил флуорид (1 мМ), дитиотреитол (10 мМ) и апротинин (20 мкг/мл).

Электрофорез и Western Blotting. Для разделения белков использовали электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Электрофорез проводили в приборе Biorad (США) в электродном буфере (0,025 М трис-НС1, 0,192 М глицин, 0,1% SDS, рН 8,3). При прохождении белков через 3,3% концентрирующий гель сила тока составляла 9 мА, через 6-15% разделяющий - 16 мА. Электроперенос белков методом Western Blotting на нитроцеллюлозные мембраны проводили в буфере для электропереноса (0,025 М трис-HCl, рН 8,3, 0,192 М глицин, 20% метанол, 0,1% SDS) сразу после завершения электрофореза. Электроперенос осуществляли в течение 70 мин при напряжении 80 В с использованием прибора фирмы Biorad (США).

Иммунодетекция белков с использованием антител. Мембраны инкубировали в течение 1 часа в буфере TBS (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 20 мМ NaCl) с добавлением 2% обезжиренного молока, затем отмывали буфером TBST

(TBS с добавлением 0,1% Tween 20). Далее мембраны инкубировали в течение ночи с раствором первичных антител (AT I) в буфере TBST с добавлением 2% обезжиренного молока или бычьего сывороточного альбумина (БСА) в зависимости от типа антител. В работе были использованы следующие AT I: к фосфо-MYPT Ser-695 (любезно предоставлены Timothy Haystead, Duke University, Durham, NC), к MYPT1 (Abstate), к фосфо-РЛЦМ Ser-19 (Rockland), к РЛЦМ (Sigma), к протеинкиназе G (PKG - Santa Cruz Biotechnology) и к ГАФД (BioMol). Затем мембраны отмывали тремя сменами TBST и в течение часа инкубировали со вторичными антителами (AT II), которые выбирали в зависимости от типа AT I. Для мембран, окрашенных AT к MYPT1, фосфо-MYPT Ser-695, фосфо-РЛЦМ Ser-19, РЛЦМ и ГАФД, применяли AT II с флуоресцентной меткой, видимой в инфракрасном диапазоне. В случае PKG использовали AT II, меченые пероксидазой хрена. AT II отмывали буферами TBST и TBS, после чего мембраны, окрашенные флуоресцентными AT, сканировали при помощи сканера Odyssey, снабженного программой Odyssey system software. Мембраны, окрашенные AT к PKG, проявляли с помощью раствора ECL.

Обработка результатов. Изображения, полученные в программе Odyssey system software, обрабатывали с использованием той же программы. За 100% принимали относительную степень фосфорилирования белка в образце сравнения от новорожденных крыс. Данные по PKG обрабатывали в программе Phoretix ID, для чего пленку предварительно сканировали. Полученные значения по содержанию белка соотносили с количеством ГАФД в тех же образцах. Среднее по образцам для взрослых животных принимали за 100%. Статистический анализ данных проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эндотелий уменьшает сокращение артерий у 1-2-недельных крыс и не влияет на сокращение у взрослых

В качестве основного сократительного агента мы использовали MX -селективный агонист агадренорецепторов, которые функционально активны только в гладкомышечных клетках артерий (Atalik et al., 2000; Vanhoutte, 2001). Как видно на рис. 1 А, Б, MX вызывает сокращение артерий как новорожденных, так и взрослых крыс. Удаление эндотелия в подкожной артерии взрослых крыс не приводит к изменению сократительного ответа на MX (рис. 1А), что неудивительно, т.к. MX активирует агадренорецепторы гладкомышечных клеток и не оказывает прямого влияния на эндотелий. Однако в аналогичном эксперименте на сосудах 1-2-недельных животных был получен качественно иной результат: удаление эндотелия привело к значительному усилению сократительного ответа на MX (рис. 1Б). Таким образом, у 1-2-недельных животных эндотелий ослабляет сокращение артерий, т.е. оказывает антиконтрактильное действие.

Сходное антиконтактильное влияние эндотелия было обнаружено у новорожденных животных при использовании другого агониста U46619 (аналог тромбоксана А2), рецепторы которого отличаются от агадренорецепторов по активируемым внутриклеточным сигнальным путям и, кроме того, обнаруживаются не только на гладкомышечных, но и на эндотелиальных клетках сосудов (Crane, Garland, 2004).

Дальнейшие эксперименты были посвящены исследованию механизмов реализации антиконтрактильного влияния эндотелия у 1-2-недельных животных.

Исследование механизмов антиконтрактильного влияния эндотелия в сосудах новорожденных крыс

Известно, что эндотелий-зависимое расслабление может происходить под влиянием нескольких факторов, таких как простациклин, эндотелиальный гиперполяризующий фактор и оксид азота. Однако оказалось, что ни блокада продукции простациклина с помощью ЮмкМ индометацина (рис. 2А), ни блокада действия эндотелиального гиперполяризующего фактора с помощью блокаторов Са2"-активируемых калиевых каналов малой и средней проводимости (0,1 мкМ UCL-1684 и 1 мкМ TRAM-34, соответственно) (рис. 2Б) не изменяли сократительный ответ артерий новорожденных животных на MX. Это свидетельствует о том, что ни простациклин, ни эндотелиальный гиперполяризующий фактор не вовлечены в реализацию антиконтрактильного эффекта эндотелия в сосудах 1-2-недельных животных.

Для определения роли N0 в реализации антиконтрактильного эффекта эндотелия в сосудах новорожденных животных был использован ингибитор N0-синтазы L-NNA (100 мкМ). Действие L-NNA в сосудах 1-2-недельных животных приводило к значительному усилению сократительных ответов на MX (рис. ЗА) и U46619 (рис. ЗБ). Действие ингибитора L-NNA обнаруживалось только в сосудах новорожденных крыс с интактным эндотелием, оно не проявлялось в сосудах новорожденных крыс с поврежденным эндотелием, а также в сосудах взрослых крыс с интактным эндотелием. К аналогичному усилению сократительного ответа на MX у новорожденных животных приводило ингибирование (с помощью 1 мкМ ODQ - рис. ,3В) растворимой гуанилатциклазы - основной мишени действия NO в гладкой мышце (Bruckdofer, 2005).

125-1

___

3 га 2 100-

с 1> >< £ 75-

& X га

О о. 5 50-

О. о

с г? 25-

-в—+Эндотелий -»—Эндотелий

1-2 недели

-7 -6 -5

1д[Метоксамин] (М)

-7 -6 -5

1д[Метоксамин] (М)

Рис. 1. Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов с интактным и удаленным эндотелием у взрослых (А; п=12, 11; р=0,58) и 1-2-недельных (Б; п=9, 9; р<0,05) крыс.

Рис. 2. А: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием в присутствии ДМСО или 10 мкМ индометацина (п=10, 10; р=0,22).

Б: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием в присутствии ДМСО или смеси из 1 мкМ ТЫАМ-34 и 0,1 мкМ 1ЛХ-1684 (п=8, 6; р=0,67).

125n

—•— L-NNA

1д[Метоксамин] (M)

125-1

-7 -6 -5

1д[Метоксамин] (M)

|д[1!46619] (М)

Рис. 3. А-Б: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ (А; п=7, 9; р<0,05) и и46619 СБ; п=Ю, 10; р<0,05) для сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием в присутствии 100 мкМ Ь-КЫА или 100 мкМ Б-ЫЫА. В: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием в присутствии ДМСО или 1 мкМ СЮС) (п=19, 21; р<0,05).

Ключевой результат, полученный в экспериментах на артериях новорожденных крыс в изометрических условиях и заключающийся в том, что антиконтрактильный эффект эндотелия обусловлен высвобождением оксида азота, был воспроизведен в изобарических условиях. В таких условиях препарат артерии подвергается воздействию физиологического давления в течение всего эксперимента. Оказалось, что в изобарических условиях, как и в изометрических, инкубация артерий новорожденных животных со 100 мкМ Ь-№>ГА приводит к увеличению сократительного ответа на МХ (рис. 4).

125п

О о

5 о X S

X w

-•—L-NNA

-e-D-NNA

+Эндотелий J---1—

-7

-6 -5 -4

1д[Метоксамин] (М)

Рис. 4. Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием, полученные в изобарических условиях в присутствии 100 мкМ Ь-№1А или 100 мкМ Б-ША (п=9, 7; р<0,05).

Результаты описанных экспериментов убедительно доказывают, что антиконтрактильный эффект эндотелия у новорожденных животных связан с активностью Ж)-синтазы.

Исследование механизмов NO-пути на уровне гладкой мышцы сосуда

Активность NO-пути в стенке сосуда может изменяться с возрастом на нескольких уровнях. Во-первых, эндотелий новорожденных животных может производить большее количество N0 по сравнению со взрослыми, во-вторых, чувствительность гладкой мышцы к оксиду азота может различаться у двух возрастных групп и, наконец, в сосудах взрослых животных может наблюдаться ускоренная деградация N0 или циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Для того, чтобы выявить возможные возрастные изменения NO-пути на уровне гладкой мышцы сосудов, были проведены несколько следующих серий экспериментов.

Для проверки предположения о том, что проявление антиконтрактильного эффекта эндотелия у новорожденных животных и его отсутствие у взрослых связаны с разной чувствительностью гладкой мышцы сосудов к оксиду азота, мы сравнили чувствительность сосудов с удаленным эндотелием к донорам N0. Как показали эксперименты с использованием доноров оксида азота DEA-NO (рис. 5А), SNAP (0,01+10 мкМ) и нитропруссида натрия (0,3-300 нМ), чувствительность гладкой мышцы к N0 у двух возрастных групп не различается. Еще одним свидетельством в пользу того, что регуляция NO-пути на уровне гладкой мышцы не различается между двумя возрастными группами, являются результаты экспериментов по определению содержания PKG, основного

посредника реализации эффектов N0 в гладкомышечных клетках артериальных сосудов (Muenzel et al., 2003). Содержание этого белка оказалось одинаковым у новорожденных и взрослых животных (рис. 5Б), что согласуется с нашими данными об одинаковой NO-чувствителыюсти гладкой мышцы артерий.

Действие продуцируемого эндотелием N0 на гладкомышечные клетки в сосудах взрослых крыс может быть незаметным из-за его быстрой деградации под действием свободных радикалов (Balligand et al., 2009). Однако инкубация эндотелий-интактных артерий взрослых крыс с каталазой (1000 Ед/мл) и супероксид дисмутазой (SOD-PEG, 140 Ед/мл) не изменяла сократительный ответ на MX (рис. 6), что говорит о том, что отсутствие антиконтрактильного влияния эндотелия в сосудах взрослых крыс не связано с ускоренной деградацией NO.

Прекращение релаксирующего влияния NO-пути в гладкой мышце сосудов обеспечивается активностью фосфодиэстеразы 5, которая разрушает цГМФ. Показано, что активность этого фермента с возрастом может как увеличиваться (Moreno et al., 2004), так и снижаться (White, Реагсе, 1996). Хотя мы не сравнивали активность фосфодиэстеразы 5 в сосудах новорожденных и взрослых крыс, но полагаем, что ее изменение не служит причиной исчезновения антиконтрактильного влияния эндотелия в подкожной артерии взрослых крыс. Если даже такое изменение имеет место, его влияние должно компенсироваться изменением других механизмов реализации NO-сигнала в гладкой мышце, поскольку, в конечном итоге, чувствительность мишени - гладкой мышцы к NO в сосудах новорожденных и взрослых крыс не различается.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что суммарный эффект NO на гладкую мышцу сосудов не подвергается возрастным изменениям. Следовательно, изменение активности NO-пути должно объясняться возрастными модификациями в эндотелиальных клетках.

Исследование регуляторных механизмов NO-пути на уровне эндотелия

На эндотелиальяом уровне возможна регуляция NO-синтазы за счет изменения уровня ее экспрессии и/или активности с возрастом. Действительно, экспрессия мРНК eNOS в сосудах новорожденных животных значительно выше по сравнению со взрослыми животными (рис. 7А). Экспрессия мРНК nNOS и iNOS не была обнаружена в сосудах обеих возрастных групп.

Помимо уровня экспрессии eNOS важна также и активность этого фермента. Основными регуляторами активности eNOS считаются Са2+ и Akt/PI3-киназный путь (Flemming, 2010). Показано, что вход ионов Са+ в эндотелиал ьные клетки при поток-зависимой и агонист-стимулируемой дилятации сосудов может осуществляться через ТЯРУ4-каналы (Koehler et al., 2006, Zhang et al., 2009). Для тестирования роли этих каналов в реализации обнаруженного нами антиконтрактильного эффекта эндотелия у новорожденных животных был использован их ингибитор рутений красный. Инкубация сосудов 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием с 1 мкМ рутения красного не приводила к увеличению сократительного ответа на MX (рис. 7Б), что говорит о том, что ЖРУ4-каналы не вовлечены в реализацию антиконтрактильного влияния эндотелия у новорожденных животных.

PKG ГАФД

—*— Взрослые -о- 1-2 недели

Эндотелий

-Э -8 -7 -6 -5 lg[DEA-NO] (М)

Взрослые

1-2 недели

Рис. 5. А: Зависимости «концентрация-эффект» для донора оксида азота DEA-NO, полученные в экспериментах на сосудах 1-2-недельных и взрослых крыс с удаленным эндотелием (п=9, 8; р=0,69).

Б: Относительный уровень содержания протеинкиназы G в сосудах 1-2-недельных и взрослых крыс (п=5, 5; р=0,66).

125-,

- каталаза+SOD-PEG контроль

-7 -6 -5

1д[Метоксамин] (М)

Рис. 6. Зависимости «концентрация-эффект» на MX для сосудов взрослых крыс с интактным эндотелием в присутствии Н?0 или смеси из 1000 Ед/мл каталазы и 140 Ед/мл супероксиддисмутазы (п=6, 5; р=0,68).

Взрослые

1 -2 недели

125-,

3 « 2 100-

с 2 75-

ь о

о то

о о. 2 50-

О. о

С 25-

-о- контроль

+Эндотелий

-7 -6 -5

1д[Метоксамин) (М)

125-

л 10 100-

с. X >< 2 75-

о X

н У

о го

о а. 2 50-

5 н

П. о

С £ 25-

1У294002 -о- контроль

125-1

-7 -6

1д[Метоксамин] (N1)

-7 -6 -5

1д[Метоксамин] (М)

Рис. 7. А: Относительный уровень экспрессии мРНК сЫ08 в артериях взрослых и 1-2-недельных крыс (п=5, 5; р<0,05). Б: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов новорожденных крыс с интактным эндотелием в присутствии Н20 или 1 мкМ рутения красного (ЯиЯ, п=10, 11; р=0,27). В-Г: Зависимости «концентрация-эффект» на МХ в присутствии ДМСО или 10 мкМ 1.У294002 для сосудов 1-2-недельных крыс с удаленным (В; п=16, 18; р<0,05) и интактным (Г; п=10, 9; р=0,62) эндотелием.

Другим способом активации eNOS в эндотелии является фосфорилирование по остатку Ser-1177 посредством Akt/PD-киназного пути (Flemming, 2010). Для исследования роли РБ-киназы в антиконтрактильном эффекте эндотелия у 1-2-недельных крыс был использован ингибитор этой киназы LY294002. Однако нужно отметить, что этот ингибитор может также действовать на Р13-киназу, которая находится в гладкой мышце и оказывает просократительное влияние (Morello et al., 2009). Действительно, в отсутствие эндотелия действие LY294002 (10 мкМ) приводило к уменьшению сократительного ответа артерий новорожденных крыс на МХ (рис. 7В). Вместе с тем, на сосуды с интактным эндотелием LY294002 такого влияния не оказывал (рис. 7Г). Соответственно, действие LY294002 на эндотелиальные клетки приводило бы к увеличению сократительного ответа, если бы этот эффект не маскировался действием ингибитора на гладкомышечные клетки. Таким образом, в сосудах новорожденных крыс с интактным эндотелием активность eNOS регулируется Р13-киназой.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что активность N0 пути в сосудах 1-2-недельных крыс связана с высоким уровнем экспрессии eNOS и ее активацией по Р13/Ак1-киназному пути.

Метоксамин не активирует NO-синтазу в эндотелии сосудов 1-2-недельных животных

Следующей проблемой, вставшей перед нами, был вопрос о том, влияет ли МХ на активность NO-синтазы в эндотелии 1-2-недельных крыс. Как говорилось выше, агадренорецепторы, на которые действует МХ, в эндотелии функционально не активны, т.е. сигнал для синтеза N0 в эндотелии новорожденных крыс должен каким-то образом передаваться от гладкомышечных клеток к эндотелиальным.

Согласно данным литературы, агонисты, действующие на гладкую мышцу и не воздействующие напрямую на эндотелий, могут вызывать вторичную активацию эндотелия посредством передачи сигнала (ионов Са2+ или 1Р3) из гладкомышечных клеток в эндотелиальные через миоэндотелиальные щелевые контакты (Dora et al., 1997). Однако в наших экспериментах инкубация артерий новорожденных крыс с интактным эндотелием с блокатором этих контактов 18-а-глицирретиновой кислотой (100 мкМ) не приводила к изменению сократительного ответа на МХ (рис. 8). Эти данные свидетельствуют о том, что миоэндотелиальные щелевые контакты не вовлечены в реализацию антиконтрактильного эффекта эндотелия у новорожденных крыс, что говорит в пользу тонической продукции N0 эндотелием.

Эндотелий сосудов 1-2-недельных крыс тонически продуцирует N0

В подтверждение гипотезы о тонической продукции N0 мы показали, что добавление 100 мкМ ингибитора еШ8 1,-МЫА к сосудам 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием вызывает сокращение и в отсутствии МХ (рис. 9, 10). Важно, что в сосудах взрослых крыс Ь-№ЧА не вызывал такого эффекта (рис. 10). Более того, добавление (Ю<3 к сосудам 1-2-недельных крыс также приводило к сокращению, сопоставимому по величине с сокращением в присутствии Ь-№ЧА (рис. 10).

10 мин

Мх

ЬША 100 мкМ

Рис. 9. Блокада синтеза N0 приводит к развитию тонического сокращения артерии с интактным эндотелием у новорожденной крысы (пример оригинальной записи эксперимента).

Рис. 8. Зависимости «концентрация-эффект» на МХ для сосудов новорожденных крыс с интактным эндотелием в присутствии ДМСО или 100 мкМ 18а-глицирретиновой кислоты (п= 8, 9; р=0,84).

-*- 18а-глицирретиновая к-та -о- контроль

1д[Метоксамин] (М)

СЮО

о-

О-ЖА 1_-ША Ц-ША ЬША Взрослые 1-2 недели

контроль ООО

1-2 недели

Рис. 10. Группа столбиков «Ь-МИА»: увеличение силы сокращения сосудов взрослых (п=7, 7) и 1-2-недельных (п=7, 9) крыс с интактным эндотелием под влиянием 100 мкМ Ь-МЧА или 0-№\ГА (*р<0,05 для L-NNA по сравнению с В-№ГА у 1-2-недельных). Группа столбиков «ODQ»: увеличение силы | сокращения сосудов новорожденных крыс с интактным эндотелием под I влиянием 1 мкМ СЮС> (п=19, 21, #р<0,05 для ОБО по сравнению с контролем у новорожденных крыс).

Развитие тонического сокращения сосудов новорожденных крыс при | добавлении Ь-ММА было исследовано также и на уровне измерения степени фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (РЛЦМ, рис. 11 А). Фосфорилирование РЛЦМ у взрослых животных при добавлении 100 мкМ Г-КГЫА оставалось на базальном уровне, в то время как у новорожденных животных оно значительно возрастало. Эти результаты согласуются с данными, полученными при регистрации силы сокращения, и дают основания предполагать, что именно конститутивная активность еЖ)8 в сосудах -новорожденных крыс обеспечивает антиконтрактильный эффект эндотелия, проявляющийся в уменьшении сократительных ответов артерий на агонисты. Т.е. оксид азота в эндотелии новорожденных крыс синтезируется спонтанно и I постоянно.

Дополнительные сведения в пользу конститутивной продукции N0 у 1-2-недельных животных были получены в экспериментах по определению степени фосфорилирования МУРТГ Согласно современным представлениям, действие N0 в гладкой мышце приводит к активации РКХ}, одной из ключевых мишеней которой является МУРТ1 (Бопйуо, 8от1уо, 2003). Фосфорилирование МУРТ1 по остатку 8ег-695 приводит к увеличению активности фосфатазы, и, | соответственно, к расслаблению гладкой мышцы. Таким образом, повышенная активность МО/цГМФ/РКХ} пути должна приводить к более высокому уровню фосфорилирования МУРТ1 по Бег-695 (Ыерр1 е1 а!., 2009).

В подтверждение гипотезы о высокой базальной активности еМОЭ в эндотелии новорожденных животных, базальный уровень фосфорилирования МУРТ1 по 8ег-695 был значительно выше у новорожденных крыс по сравнению

со взрослыми (рис. 11 Б). Далее, в подтверждение того, что этот высокий базальный уровень фосфорилирования зависит от продукции N0, ингибитор еМОБ Ь-№МА приводил к уменьшению фосфорилирования до уровня, характерного для сосудов взрослых животных.

рРЛЦМ S19

РЛЦМ

ГАФД

PMYPTS695 MYPT1 ГАФД

Рис. 11. А: Относительный уровень фосфорилирования РЛЦМ по сайту S19 в сосудах взрослых и 1-2-недельных крыс с интактным эндотелием в присутствии Н20 или 100 мкМ L-NNA (п=7, 10; *р<0,05 по сравнению с контролем у 1-2-недельных, р=0,67 L-NNA по сравнению с контролем у взрослых). Б: Относительный уровень фосфорилирования MYPT1 по сайту S695 в сосудах взрослых и новорожденных крыс с интактным эндотелием в присутствии Н20 или 100 мкМ L-NNA (п=6, 7; *р<0,05 по сравнению с контролем у взрослых, # р<0,05 по сравнению с контролем у новорожденных).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что эндотелий 1-2-недельных крыс спонтанно продуцирует оксид азота, действие которого приводит к ослаблению сокращения артерий или, иными словами, эндотелий новорожденных оказывает постоянное антиконтрактильное влияние. Такое влияние эндотелия отсутствует у взрослых животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе были исследованы механизмы изменений эндотелий-зависимой регуляции тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе. В ходе исследования было установлено, что эндотелий 1-2-недельных, но не взрослых крыс ослабляет сокращение подкожной артерии. В этом проявляется антиконтрактильная роль эндотелия у новорожденных животных, которая обусловлена действием оксида азота. Чувствительность гладкой мышцы к N0 в сосудах животных разного возраста не различается, и антиконтрактильное действие оксида азота в сосудах новорожденных крыс объясняется его повышенной секрецией. Такая секреция N0 в раннем постнатальном онтогенезе происходит тонически и связана, во-первых, с высоким содержанием eNOS и, во-вторых, с активацией eNOS под действием PD/Akt-киназного пути. Таким образом, тоническое выделение оксида азота в сосудах новорожденных крыс приводит к проявлению у них антиконтрактильной функции эндотелия даже в экспериментальных условиях, исключающих воздействие напряжения сдвига на эндотелий. В сосудах взрослых животных в тех же экспериментальных условиях эндотелий такого эффекта не оказывает. В данной работе рассмотрен весь путь проведения дилятаторного сигнала от эндотелия к сократительному аппарату гладкомышечных клеток. Использование различных экспериментальных и методических подходов повышает достоверность сделанных выводов и минимизирует вероятность ошибок.

Мы предполагаем, что обнаруженный нами феномен антиконтрактильного влияния эндотелия в кожных сосудах может проявляться у новорожденных животных и в других сосудистых бассейнах. В частности, было показано, что в сосудах, приносящих кровь к желудочно-кишечному тракту, эндотелий-зависимая дилятация, связанная с N0, с возрастом также уменьшается (Nankervis, Nowicki, 1995). Следует отметить, что у крыс кровоток в кишечнике, как и в коже, существенно падает в процессе постнатального онтогенеза (Stulkova, 1977). Антиконтрактильная роль эндотелия у новорожденных животных за счет тонического выделения оксида азота в двух гемодинамически важных сосудистых регионах (желудочно-кишечном тракте и коже) должна сказываться на уровне системного артериального давления, способствовать его поддержанию на низком уровне, что препятствует перерастяжению и повреждению артерий в раннем постнатальном периоде, когда сосудистая система претерпевает бурный рост.

Кроме влияния на тонус сосудов, выделяющийся N0 в артериях новорожденных животных может играть роль и в формировании структуры сосудистой стенки. Активация пути NO/цГМФ может оказывать про- или антипролиферативное действие в зависимости от типа клеток (Pilz, Casteel, 2003). Кроме того, сигнальные каскады от оксида азота посредством цГМФ могут участвовать в процессах дифференцировки клеток. Показано, что действие PKG приводит к увеличению экспрессии белков, свойственных для дифференцированных гладкомышечных клеток: тяжелых цепей гладкомышечного миозина, гладкомышечного актина и калыюнина, т.е. ускоряет

переход клеток от пролиферативного фенотипа к сократительному (Pilz, Casteel, 2003). Наконец, было обнаружено, что путь NO/PKG стимулирует транскрипцию гена и стабильность малого G-белка RhoA (Sauzeau et al., 2003). Белок RhoA активирует Rho-киназу, которая имеет принципиальное значение для реализации механизма Са2+-сенситизации, который, в свою очередь, обеспечивает значительную часть сокращения гладкой мышцы сосудов у новорожденных животных (Мочалов C.B., 2010).

Таким образом, высокий базальный уровень продукции N0 в эндотелии новорожденных животных помимо прямой реализации антиконтрактильной функции может быть важным для формирования специфического фенотипа как эндотелиальных, так и гладкомышечных клеток.

ВЫВОДЫ

1. В отличие от взрослых крыс, у крыс в возрасте 1-2 недель эндотелий уменьшает сократительные ответы подкожной артерии, такое влияние эндотелия устраняется ингибитором NO-синтазы.

2. Чувствительность гладкой мышцы к донорам N0 и содержание протеинкиназы G в артериях молодых и взрослых животных не различаются.

3. Уровень экспрессии мРНК эндотелиальной NO-синтазы в артериях молодых крыс в 2,4 раза больше, чем у взрослых. Активность NO-синтазы в эндотелии артерий молодых крыс регулируется Р13-киназой.

4. Блокада миоэндотелиальных щелевых контактов не изменяет сократительный ответ артерий молодых крыс, что говорит в пользу тонической продукции N0 эндотелием.

5. Ингибирование эндотелиальной NO-синтазы в артериях молодых, но не взрослых, крыс приводит к развитию тонического сокращения, которое связано с повышением уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (по сайту Ser 19) и снижением уровня фосфорилирования регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина (по сайту Ser695).

6. Эндотелий подкожной артерии молодых крыс тонически продуцирует оксид азота, что приводит к ослаблению сократительных ответов на стимулы различной природы.

* * *

Автор выражает искреннюю благодарность профессору Рудольфу Шуберту и доктору Торстену Глое (Институт сердечно-сосудистой физиологии Гейдельбергского университета в г. Мангейм, Германия), доктору Любомиру Любомирову и профессору Габриэле Пфитцер (Институт вегетативной физиологии университета г. Кёльн, Германия), Вячеславу Устиновичу Каленчуку (Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова) и Светлане Ивановне Софроновой (Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мочалов С.В., Каленчук В.У., Гайнуллина Д.К., Воротников А.В., Тарасова О.С. Вклад протеинкиназы С и Rho-киназы в регуляцию рецептор-зависимого сокращения артерий уменьшается с возрастом и не зависит от симпатической иннервации // Биофизика. - 2008. - Т. 53,№6. -С. 1102-1108.

2. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Мочалов С.В., Гайнуллина Д.К., Шуберт Р., Каленчук В.У., Кудряшова Т.В., Воротников А.В. К вопросу о трофическом влиянии симпатических нервов на кровеносные сосуды: регуляция чувствительности сократительного аппарата к ионам кальция // Материалы IX Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы», Донецк-Славянск, 23 - 25 мая 2007г. Нейронауки: теоретические и клинические аспекты. - 2007. - Т.З, №1.-С.49.

3. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Мочалов С.В., Гайнуллина Д.К., Шуберт Р., Каленчук В.У., Кудряшова Т.В., Воротников А.В. Трофическое влияние симпатических нервов на кровеносные сосуды связано с изменением активности белков, регулирующих актомиозиновое взаимодействие в гладкомышечных клетках // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского, Санкт-Петербург, октябрь 2007. - С. 306-307.

4. Тарасова О.С., Пуздрова В.А., Гайнуллина Д.К., Кудряшова Т. В., Воротников А.В., Шуберт Р., Олкер К., Нильссон X. Механизмы, обеспечивающие быстрые изменения тонуса сосудов под влиянием симпатических нервов // Материалы IV Всероссийской школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 29 января - 1 февраля 2008. - С. 95-96.

5. Tarasova O.S., Puzdrova V.A., Gainullina D.K., Kudryashova T.V., Vorotnikov A.V., Schubert R., Aalkjaer C., Nilsson H. The impact of sympathetic innervation on the development of rapid contractile phenotype of vascular smooth muscle on ontogenesis // Abstracts of the VII International Symposium "Biological Motility: Achievements and Perspectives". Pushchino, Moscow region, Russia, May, 2008. - P. 116-117.

6. Gainullina D.K., Kalenchuk V.U., Dietterle V.Y., Tarasova O.S., Vorotnikov A.V. The role of mitogen- activated protein kinase in the contraction of rat saphena artery // Acta Physiologica. - 2008. - V. 193, Suppl. 664. - P.103.

7. Tarasova O.S., Puzdrova V.A., Gainullina D.K., Kudryashova T.V., Vorotnikov A.V., Schubert R., Aalkjaer C., Nilsson H. Postnatal maturation of arterial smooth muscle (ASM): the impact of sympathetic innervation // Acta Physiologica. - 2008. - V.193, Suppl. 664. - P.90.

8. Vorotnikov A., Tarasova O., Puzdrova V., Gainullina D., Kudryashova Т., Schubert R., Aalkjaer C., Nilsson H. Sympathetic control of postnatal

remodeling and Ca2+-sensitivity in arterial smooth muscle // J. Muscle Res. Cell. Motil. - 2008. - V. 29. - P. 289-290.

9. Гайнуллина Д.К., Каленчук В.У. Участие митоген-активируемых протеинкиназ в развитии сокращения подкожной артерии крысы в раннем постнатальном периоде // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2008». Москва, апрель 2008. - С. 209.

10. GaynuIIina D., Tarasova О., Vorotnikov A. The role of mitogen-activated protein kinases in the contraction of arterial smooth muscle II Acta Physiologica. -2009. - V. 195, Suppl.669.-P.278.

11. GaynuIIina D.K., Kalenchuk V.U., Tarasova O.S., Schubert R. Developmental changes of the communication between endothelial and smooth muscle cells in rat saphenous artery // Acta Physiologica. - 2010. - V. 198, Suppl. 677. - P. 130.

12. Schubert R., GaynuIIina D., Kalenchuk V., Sofronova S., Tarasova O. Plasticity of vasoregulatoiy mechanisms: contribution to blood pressure regulation during maturation // Abstracts of the 90th Annual Meeting of German Physiology Society. Regensburg, Germany, March, 2011. - P. 118.

13.Софронова С.И. Гайнуллина Д.К. Роль оксида азота в эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов у крыс в раннем постнатальном периоде // Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2011». Москва, апрель 2011.-С. 244-245.

14. GaynuIIina D., Lubomirov L., Kalenchuk V., Sofronova S., Pfitzer G., Tarasova O.S., Schubert R. The disappearance of an endothelial brake on vasoconstrictor-induced contraction may contribute to the blood pressure increase during maturation // Abstracts of the 10th International Symposium on Resistance Arteries. Rebild, Denmark, May, 2011. - P. 35.

15. GaynuIIina D.K., Kalenchuk V.U., Sofronova S.I., Tarasova O.S., Schubert R. Developmental changes of skin feed artery endothelium in the rat // Acta Physiologica. - 2011. - V. 202, Suppl. 685. - P.63-64.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТ - антитело

ГАФД - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

ДМСО - диметилсульфоксид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЛЦМ - регуляторные легкие цепи миозина

ТХУ - трихлоруксусная кислота

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

еЫОБ - эндотелиальная №Э-синтаза

¡N08 - индуцибельная Ж)-синтаза

МХ - метоксамин

МУРТ1 - регуляторная субъединица фосфатазы легких цепей миозина п№)8 - нейрональная NO-cинтaзa РКй - протеинкиназа О ЗББ - додецилсульфат натрия

Подписано в печать: 12.10.2011

Заказ № 6031 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Тииография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайнуллина, Дина Камилевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Механизмы эндотелий-зависимого расслабления сосудов.

1.1.1 Простациклин.

1.1.2 Оксид азота.

1.1.2.1 Регуляция экспрессии эндотелиальной ЫО-синтазы.

1.1.2.1.1 Регуляция еМЭБ на транскрипционном уровне.

1.1.2.1.2 Регуляция еМОЭ на посттранскрипционном уровне.

1.1.2.2 Регуляция еИОБ на посттрансляционном уровне.

1.1.2.2.1 Посттрансляционная химическая модификация еЖ)8.

1.1.2.2.2 Взаимодействие еИОБ с другими белками.

1.1.2.2.3 Регуляция активности еЖ)8 фосфорилированием.

1.1.2.2.4 Регуляция активности еИОБ доступностью субстрата и кофакторов.

1.1.2.3 Регуляция биодоступности оксида азота.

1.1.2.4 Сигнальные пути гладкомышечных клеток, обеспечивающие расслабление гладкомышечных клеток под действием N0.

1.1.3 Эндотелиальный гиперполяризующий фактор.

1.1.4 Механизмы активации эндотелиальных клеток.

1.2 Изменение эндотелиальной функции в раннем постнатальном онтогенезе.

1.2.1 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов легочного кровообращения.

1.2.1.1 Регуляция тонуса сосудов легочного круга кровообращения в раннем постнатальном периоде у свиней.

1.2.1.2 Регуляция тонуса сосудов легочного круга кровообращения в раннем постнатальном периоде у овец.

1.2.1.3 Регуляция тонуса сосудов легочного круга кровообращения в раннем постнатальном периоде у других видов.

1.2.2 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов большого круга кровообращения.

1.2.2.1 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции артерий эластического типа.

1.2.2.2 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов головного мозга.

1.2.2.3 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов скелетных мышц.

1.2.2.4 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов брыжеечного бассейна.

1.2.2.5 Возрастные изменения эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов других бассейнов.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объект исследования.

2.2 Эксперименты на изолированных сосудах.

2.2.1 Исследование сокращения в изометрическом режиме.

2.2.1.1 Нормализация (определение оптимального растяжения сосуда).

2.2.1.2 Активация препарата и проверка функциональной активности эндотелия.

2.2.1.3 Протоколы экспериментов.

2.2.1.3.1 Основной протокол эксперимента.

2.2.1.3.2 Другие протоколы экспериментов.

2.2.1.4 Обработка результатов.

2.2.2 Влияние уровня растяжения кольцевого препарата артерии взрослой крысы на его сократительную активность.

2.2.3 Исследование сокращения в изобарическом режиме.

2.2.3.1 Активация препарата и проверка функционального состояния эндотелия.

2.2.3.2 Протокол экспериментов в изобарическом режиме.

2.2.3.3 Обработка результатов.

2.3 Исследование уровня экспрессии мРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.3.1 Приготовление образцов мРНК.

2.3.2 Праймеры для еИОЗ, пЫОБ, ¡N08 и ГАФД.

2.3.3 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.

2.3.4 Синтез комплементарной ДНК.

2.3.5 Количественная ПЦР или ПЦР в реальном времени.

2.3.6 Обработка результатов количественной ПЦР.

2.4 Исследования содержания и степени фосфорилирования белков в тканях сосудов.

2.4.1 Приготовление образцов тканей для проведения биохимических исследований.

2.4.2 Экстракция белков.

2.4.3 Разделение белков методом гель электрофореза.

2.4.4 Выравнивание образцов по фил амину.

2.4.5 Электроперенос белков.

2.4.6 Иммунодетекция белков с использованием антител.

2.4.7 Стриппирование мембран.

2.4.8 Обработка результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Сравнение сократительных ответов на метоксамин подкожных артерий новорожденных и взрослых крыс.

3.2 Исследование механизмов антиконстрикторного влияния эндотелия в сосудах новорожденных крыс.88.

3.2.1 Влияние блокады, синтеза простациклина на антиконстрикторную функцию эндотелия у новорожденных крыс.

3.2.2 Влияние блокады синтеза оксида азота на антиконстрикторную функцию эндотелия у новорожденных крыс.

3.2.3 Влияние ингибитора индуцибельной ]ЧО-синтазы на сокращение артерий новорожденных крыс.

3.2.4 Влияние блокады действия эндотелиального гиперполяризующего фактора на антиконстрикторную функцию эндотелия у новорожденных крыс.

3.3 Исследование антиконстрикторного влияния эндотелия на сокращение артерий новорожденных крыс, вызванное 1146619.

3.4 Исследование сокращения на метоксамин артерий новорожденных крыс с интактным эндотелием в изобарических условиях.

3.5 Исследование регуляторных механизмов ЫО-пути на эндотелиальном уровне.

3.6 Исследование регуляторных механизмов ЫО-пути на уровне гладкой мышцы артерий

3.7 Исследование механизмов, обеспечивающих активацию ЫО-синтазы у новорожденных животных.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Основные результаты исследования.

4.2 Эндотелий ослабляет сокращение артерий новорожденных крыс.

4.3 Природа антиконстрикторной роли эндотелия у новорожденных крыс.

4.4 Синтез оксида азота у новорожденных крыс проявляется в изобарических условиях эксперимента.

4.5 Возможные причины различия в эндотелий-зависимой регуляции тонуса подкожной артерии у новорожденных и взрослых крыс.

4.5.1 Сигнальные каскады ЫО-пути в гладкой мышце не изменены в раннем постнатальном онтогенезе.

4.5.2 Повышенное содержание и способы активации еИОБ в эндотелии артерий новорожденных крыс.

4.6 Физиологическая роль активного Т^О-пути в эндотелии артерий у крыс в возрасте 1 недель.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эндотелий-зависимая регуляция сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе"

Рост и развитие организма сопряжены с изменениями в строении и функционировании многих органов и систем, в том числе и сердечно-сосудистой системы. В ходе постнатального онтогенеза кровеносная система претерпевает как количественные, так и качественные изменения: происходят рост и ветвление сосудистого русла, увеличение толщины стенок сосудов, что ведет к повышению периферического сопротивления сосудов и уровня артериального давления. У крыс, например, давление в большом круге кровообращения приближается к взрослому уровню к 3-4 неделям постнатального развития, причем существенное повышение давления^ происходит между второй и третьей неделями после рождения (Тарасова, 2010; Kasparov, Patón, 1997).

Благодаря росту сосудистого русла в постнатальном онтогенезе развивающиеся органы и ткани обеспечиваются необходимым' количеством кислорода и питательных веществ. Увеличение толщины стенок артерий, транспортирующих большие объемы крови при возрастающем давлении, происходит в результате гипертрофии гладкомышечных клеток, а также за счет увеличения количества-клеточных слоев (Sandow et al., 2004).

Одновременно с существенными структурными перестройками кровеносной системы в процессе постнатального развития изменяется и функционирование отдельных сосудов. Симпатическая регуляция тонуса сосудов у новорожденных крыс еще практически отсутствует, и полное ее формирование заканчивается лишь к концу первого месяца, жизни (Мочалов и др., 2008; Todd; 1980; Sandow, Hill, 1999). В отсутствие трофического влияния симпатических нервов регуляция сокращения гладкой мышцы сосудов у новорожденных крыс также существенно отличается от регуляции у взрослых. В гладкомышечных клетках новорожденных и взрослых крыс были обнаружены разные паттерны экспрессии сократительных и регуляторных белков, то есть с возрастом происходит изменение механизмов сокращения артерий (Пуздрова, 2007; Owens 1995, 2004). В раннем постнатальном периоде артерии в большей степени демонстрируют так называемый «Ca -независимый» путь регуляции сокращения, который к взрослому возрасту л i сменяется более «Ca -зависимым», то есть у новорожденных животных проявляется феномен повышенной чувствительности сократительного аппарата к Са2+(Пуздрова, 2007; Мочалов, 2010; Akopov et al., 1998).

Помимо гладкомышечных клеток, модификациям могут подвергаться и эндотелиальные клетки сосудов. Эндотелий продуцирует целый ряд факторов, которые могут вызывать как расслабление, так и сокращение гладкой мышцы сосудов. В здоровом организме секреторная активность эндотелия смещена в сторону продукции вазодилятаторных соединений, важнейшими из которых являются оксид азота, простациклин и эндотелиальный гиперполяризующиш фактор (Triggle, Ding, 2011). Хотя эндотелий играет важную-роль в регуляции* сосудистого тонуса с самого рождения животного, его секреторная активность изменяется в процессе постнатального развития (Boegehold, 2010).

В момент рождения- происходит переход с плацентарного на легочное дыхание, что, естественно, влечет за собой значительные перестройки в кровеносном русле легких. Этот переход реализуется, в том числе, благодаря усилению эндотелий-зависимой' дилятации и падению сопротивления' легочных сосудов (Boegehold; 2010; Aschner et al., 2009; Zellers, Vanhoutte, 1991; Liu et al., 1992). Сходное увеличение релаксирующего влияния, эндотелия^ наблюдается в сосудистых бассейнах головного мозга и скелетных мышц (Boegehold, 2010; Williams, Pearce, 2006; Williams et al., 2005; Linderman, Boegehold; 1998, 1999). Напротив, в сосудистом русле брыжейки базальная ■ продукция1 NO эндотелием» и дилятация под действием вазоактивных агонистов наиболее выражены в первые дни после рождениями уменьшаются, с возрастом (Boegehold, 2010; Nankervis et al., 2001).

Приведенные выше данные характеризуют неоднородность протекающих в онтогенезе процессов: изменение эндотелиального фенотипа подчиняется метаболическим запросам и нуждам в кровоснабжении конкретных органов и тканей. Вместе с тем, возрастные изменения эндотелиальной функции-исследованы не для всех сосудистых регионов. В раннем постнатальном онтогенезе одним из гемодинамически важных органов является кожа: у 1-2-недельных крыс кожный кровоток составляет почти 20% сердечного выброса, а с возрастом его доля, уменьшается (Stulkova, 1977). Однако регуляция тонуса сосудов кожи со стороны эндотелия в возрастном аспекте практически не исследована. Также следует отметить, что для всех сосудистых регионов мало изучены механизмы эндотелий-зависимой регуляции сосудистого тонуса, такие как относительный вклад различных эндотелиальных факторов, регуляция их продукции, взаимодействие с гладкомышечными клетками сосуда и др.

Целью данной работы было исследовать механизмы эндотелий-зависимой регуляции сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе. /

В работе были поставлены следующие задачи:

1) сравнить влияние эндотелия на сокращение артерий у молодых (в возрасте 1-2 недель) и у взрослых крыс;

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые систематически исследованы механизмы эндотелий-зависимой регуляции сокращения питающих кожу артерий у крыс в первые недели после рождения, когда кожа, является гемодинамически важным сосудистым регионом, а также изменения этих механизмов в процессе взросления организма. Использование разнообразных современных методических подходов и выполнение контрольных экспериментов на разных этапах исследования позволили адекватно сравнить влияние эндотелия' на сокращение гладкомышечных клеток сосудов у 1-2-недельных и взрослых животных. Представленное исследование впервые охватывает весь путь проведения^ дилятаторного сигнала от эндотелиальных к гладкомышечным клеткам. В отличие от большинства опубликованных исследований, в которых эндотелий-зависимое расслабление изучалось с использованием веществ, напрямую активирующих эндотелиальные клетки, в данной работе обнаружено влияние эндотелия на эффекты сократительного агента, активирующего гладкомышечные клетки и не оказывающего прямого влияния на эндотелий сосудов. Такое антиконтрактильное влияние эндотелия в сосудах 1-2-недельных крыс, связанное с тонической секрецией оксида азота, проявляется вне зависимости от природы стимула, вызывающего сокращение, что указывает на потенциальную важность этого механизма для регуляции тонуса сосудов in vivo.

Практическая значимость работы

Значимость настоящей работы для практической и фундаментальной медицины связана с распространенностью и ростом встречаемости в последние десятилетия сердечно-сосудистых заболеваний среди новорожденных детей (Flynn, 2008). В то время; как среди взрослого-населения; развитых стран артериальная« гипертензия уже давно считается, по данным Всемирной' Организации Здравоохранения, одним из, наиболее распространенных заболеваний, в детском» и подростковом возрасте признаки сердечно-сосудистых расстройств часто« внешне не проявляются: Тем не менее, наличие скрытых патологических изменений, в том числе изменений эндотелиальной функции, может приводить, к серьезным последствиям- в более поздние- годы жизни. Для определения^ механизмов возникновения и- прогрессирования таких заболеваний сначала необходимо выяснить изменения эндотелиального фенотипа, происходящие Bf> здоровом, организме вскоре после рождения и в течение последующего развития. Однако работ, посвященных изучению происходящих в норме возрастных изменений эндотелий-зависимой регуляции тонуса артерий большого круга кровообращения,, крайне мало, они охватывают лишь отдельные регионы сосудистого русла-и часто носят феноменологический' характер. Изучение тонких механизмов, эндотелий-зависимой, регуляции: тонуса, артерий, является основой для создания новых лекарственных препаратов, способных влиять на уровень артериального давления за счет изменения тонуса сосудов и не обладающих нежелательными эффектами на сердечную деятельность. Результаты данного исследования указывают на необходимость учитывать при фармакологических воздействиях не только региональные, но и возрастные особенности механизмов эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гайнуллина, Дина Камилевна

выводы

1. В отличие от взрослых крыс, у крыс в возрасте 1 -2 недель эндотелий уменьшает сократительные ответы подкожной артерии, такое влияние эндотелия устраняется ингибитором 1ЧО-синтазы.

2. Чувствительность гладкой мышцы к донорам N0 и содержание протеинкиназы в в артериях молодых и взрослых животных не различаются.

3. Уровень экспрессии мРНК эндотелиальной 1ЧО-синтазы в артериях молодых крыс в 2,4 раза больше, чем у взрослых. Активность >Ю-синтазы в эндотелии артерий молодых крыс регулируется Р13-киназой.

4. Блокада миоэндотелиальных щелевых контактов не изменяет сократительный ответ артерий молодых крыс, что говорит в пользу тонической продукции N0 эндотелием. ^

5. Ингибирование эндотелиальной ИО-синтазы в артериях молодых, но не взрослых, крыс приводит к развитию тонического сокращения, что связано с увеличением уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (по сайту Бег 19) и уменьшением уровня фосфорилирования регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина (по сайту 8ег695).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайнуллина, Дина Камилевна, Москва

1. Максимов Г., Полозюк О., Житник И. Качества чистопородных и помесных свиней // Животноводство России. 2011. - Т. 26. - С.26-27.

2. Мелькумянц A.M., Балашов С.А. Механочувствительность артериального эндотелия. Москва. : Триада. - 2005.-208 с.

3. Мочалов C.B. Роль Rho-киназы и протеинкиназы С в, регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс — Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — Москва, 2010.

4. Практикум по биохимии. М.: Изд. МГУ 1991 - С. 16-26.

5. Пуздрова В.А. Трофическое влияние симпатической иннервации на кальциевую чувствительность сократительного аппарата подкожной артерии крысы — Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. -Москва, 2007.

6. Тарасова Н.В. Снижение роли Rho-киназы в регуляции тонуса сосудов и артериального давления при созревании симпатической нервной системы у крыс Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - Москва, 2010.

7. Фундаментальная и клиническая физиология. Под редакцией Камкина А.Г., Каменского A.A. Москва.: Академия - 2004. - 1072 с.

8. Aaker A., Laughlin М.Н. Differential adenosine sensitivity of diaphragm and skeletal muscle arterioles // J. Appl. Physiol. 2002. - V. 93. - P. 848 - 856.

9. Abman S.H., Chatfield B.A., Rodman D.M., Hall S.L., McMurtry I.F. Maturational changes in endothelium-derived relaxing factor activity of ovine pulmonary arteries in vitro // Am. J. Physiol. 1991. - V.260; №4 Ptl. - L.280-285.

10. Akopov S.E., Zhang L., Pearce W.J. Regulation of Ca2+ sensitization by PKC and rho proteins in ovine cerebral arteries: effects of artery size and age // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275; №3 Pt 2. - P.H930-939.

11. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition // Biochem. J. -2001. -V. 357. -P. 593-615.

12. Armstead W.M., Zuckerman S.L., Shibata M., Parfenova H., Leffler C.W. Different pial arteriolar responses to acetylcholine in the newborn and juvenile pig // J. Gereb. Blood Flow Metab.-l994.-V. 14.-P. 1088-1095.

13. Aschner J.L., Smith T.K., Kovacs N., Pinheiro J.M.B:, Fuloria M. Mechanisms of bradykinin-mediated dilation in newborn piglet pulmonary conducting and resistance vessels // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol: 2002. - V. 283. - P. 373-382.

14. Atalik E.K., Sahin A.S., Kili? M., Dogan N. Role of the endothelium on the response to adrenoceptor agonists of rabbit aorta during cooling // Fundam. Clin. Pharmacol. -2000.-V. 14; № l.-P. 25-30.

15. Azzawi M., Austin C. The effects of endothelial factor inhibition on the time course of responses of isolated rat coronary arteries to intraluminal flow // J. Vase. Res. -2007. V. 44; № 3. - P. 223-233.

16. Balch Samora J., Frisbee J.C., Boegehold M.A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. -2007. V. 292. - P. H207-214.

17. Balch« Samora J., Frisbee J.C., Boegehold M.A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone' in skeletal muscle arterioles during juvenile growth // Microcirculation. 2008. - V. 15. - P. 151-161.

18. Balligand J.L., Feron O., Dessy C. eNOS Activation by Physical Forces: From Short-Term Regulation of Contraction to Chronic Remodeling of Cardiovascular Tissues // Physiol. Rev. 2009. - V. 89. - P. 481-534.

19. Boegehold M.A. Endothelium-Dependent Control of Vascular Tone during Early Postnatal and Juvenile Growth // Microcirculation. 2010. - V. 17. - P.394-406.

20. Boels P.J., Deutsch J., Gao B., Haworth S.G. Maturation of the response to bradykinin in resistance and conduit pulmonary arteries // Cardiovascular Research. — 1999.-V. 44. -P.416^428.

21. Boettcher M., de Wit C. Distinct endothelium-derived hyperpolarizing factors emerge in vitro and in vivo and** are mediated4 in part via connexin 40-dependent myoendothelial coupling // Hypertension. 2011. - V. 57; № 4*. - P.802-8.

22. Bornfeldt K.E., Krebs E.G. Crosstalk between protein kinase A and growth factor receptor signaling pathways in arterial smooth muscle // Cell. Signal. 1999. - V.ll; №7. - P.465-477.

23. Bruckdorfer R. The basics about nitric oxide // Molecular Aspects of Medicine. -2005.-V. 26.-P.3-31.

24. Burgen A.S.V., Iversen L.L. The inhibition of noradrenaline uptake by sympathomimetic amines in the rat isolated heart // Br. J. Pharmacol. 1965. - V. 25. - P.34-49.

25. Cao S., Yao J., Mccabe T.J., Yao Q., Katusic Z.S., Sessa W.C., Shah V. Directinteraction between endothelial nitric-oxide synthase and dynamin-2. Implications forinitric-oxide synthase function // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 14249-14256.

26. Chatterjee S., Cao S., Peterson T.E., Simari R.D., Shah V. Inhibition of GTP-dependent vesicle trafficking impairs internalization of plasmalemmal eNOS and cellular nitric oxide production // J. Cell. Sci. 2003. - V. 116. - P.3645-3655.

27. Cheng H.C., Johnson D.C. Serum Estrogens and Gonadotropins in Developing Androgenized and Normal Female Rats // Neuroendocrinology. 1973 - V. 13; №6. -P. 357-365.

28. Davis T.A., Fiorotto M.L. Regulation of muscle-growth in-neonates,// Curr. Op in. Clin: Nutr. Metab; Care. 2009. - V. 12; №1. - P. 78-85.

29. Delp M.D., Duan C. Composition and size of type I, IIA, IID/X, and IIB fibers and citrate synthase activity of rat muscle // J. Appl. Physiol. 1996. — V. 80; .№ 1. -P.261-270.

30. Dora K. A., Doyle M. P:, Duling B. R. Elevation!of intracellular calcium in*smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; - V. 94.- P.6529-6534.

31. Drouin A., Thorin-Trescases N., Hamel E., Falck J.R., Thorin E. Endothelial nitric oxide synthase activation leads , to dilatory H202 production in mouse cerebral arteries II Cardiovascular Research. 2007. - V. 73. -P.73-81.

32. Duckies S.P., Miller V.M. Hormonal modulation of endothelial NO production // Pflugers Arch.-2010-V. 459; №6.-P. 841-851.

33. Earley S., Pauyo T.,Drapp R., Tavares M.J., Liedtke W., Brayden J.E. TRPV4-dependent dilation of peripheral resistance arteries influences arterial pressure // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2009. - V. 297; № 3. - P.HI096-1102.

34. Erecinska M., Cherian S., Silver I.A. Energy metabolism in mammalian brain during development // Progress in Neurobiology. 2004. - V. 73. - P.397-445.

35. Erwin P.A., Mitchell D.A., Sartoretto J., Marietta M.A., Michel T. Subcellular targeting and differential S-nitrosylation of endothelial nitric-oxide synthase // J. Biol. Chem.- 2006. -V. 281. -P.151-157.

36. Fish J. E., Marsden P. A. Endothelial nitric oxide synthase: insight into cell-specific gene regulation in the vascular endothelium // Cell. Mol. Life Sci. 2006. - V. 63. -P. 144-162.

37. Fleming I. Molecular mechanisms underlying the activation of eNOS // Pflugers Arch. 2010. - V. 459; № 6. - P.793-806.

38. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature (London). 1980. -V. 288. -P.373-376.

39. Galley H.F., Webster N.R. Physiology of the endothelium // Br. J. Anaesth. 2004. -V. 93; № 1. — P. 105-113.

40. Gao Y., Raj J.U. Regulation of the pulmonary circulation in the fetus and newborn// Physiol. Rev. -2010. -V. 90; №4. P. 1291-1335.

41. Garcia-Sainz. al-adrenergic action: receptor subtypes, signal transduction and regulation // Cellular Signalling. 1993. - V. 5; №5. - P.539-547.

42. Geary G.G., Buchholz J.N., Pearce W.J. Maturation depresses mouse cerebrovascular tone through endothelium- dependent mechanisms // Am. J. Physiol. Reg. Int. Comp. Physiol. 2003. - V. 284. - P.734-741.

43. Geary G.G., Osol G.J., Longo L.D. Development affects in vitro vascular tone and calcium sensitivity in ovine cerebral arteries // J. Physiol. 2004. - V. 558. - P.883-896.

44. Ghanayem N.S., Gordon J.B. Modulation of pulmonary vasomotor tone in the fetus and neonate // Respir. Res. 2001. - V. 2; № 3. - P. 139-144.

45. Grgic I., Kaistha B.P., Hoyer J., Kohler R. Endothelial Ca2+-activated K+ channels in normal and impaired EDHF-dilator responses relevance to cardiovascular pathologies and drug discovery // British Journal of Pharmacology - 2009. - V. 157.- P.509-526.

46. Hou Y., Lascóla J., Dulin N.O., Ye R.D., Browning D.D. Activation of cGMP-dependent protein kinase by protein kinase C // J Biol Chem 2003. - V. 278; № 19. -P.16706-16712.

47. Hutanu C., Cox B.E., DeSpain K., Liu X.T., Rosenfeld C.R. Vascular development in early ovine gestation: carotid smooth muscle function, phenotype, and biochemical markers // Am J Physiol ReguMntegr Comp Physiol 2007. - V. 293; № 1. -P.R323-333.

48. Hwa J. J., Ghibaudi L., Williams P., Chatterjee M.: Comparison of acetylcholine-dependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed // Am. J. Physiol. 1994. - V. 266. - P.H952-H958.

49. Isakson B.E., Ramos S.I., Duling B.R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated'signaling across the myoendothelial junction // Circ. Res. 2007. - V. 100.- P.246-254.

50. Iwamoto H.S., Teitel D., Rudolph A.M. Effects of birth-related events on blood flow distribution // Pediatr. Res. 1987. - V. 22; №6. - P.634-640.

51. Jin Z.G., Wong C., Wu J., Berk B.C. Flow shear stress stimulates Gabl tyrosine phosphorylation to mediate protein kinase B and endothelial nitric-oxide synthase activation in endothelial cells // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 12305-12309.

52. Joshi S., Sedivy V., Hodyc D., Herget J., Gurney A.M. KCNQ Modulators Reveal a Key Role for KCNQ Potassium Channels in Regulating the Tone of Rat Pulmonary Artery Smooth Muscle // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009. - V. 329; №1. - P. 368376.

53. Kasparov S., Paton J.F. Changes in baroreceptor vagal reflex performance in the developing rat // Pflugers Arch. 1997. -V.434; №4. - P.438-444.

54. Kawakami K'., Ago A., Gonda T. Strain differences of hypertension induced by dietary NG-nitro-L-arginine in normotensive rats // Exp. Anim. 1999. - V. 48; № 3. -P.171-180.

55. Kim W.T., Suh E.S. Retinal Protective Effects of Resveratrol via Modulation of Nitric Oxide Synthase on Oxygen-induced Retinopathy // Korean J. Ophthalmol. -2010.-V. 24; № 2. — P. 108-118.

56. Koehler R., Hoyer J. The endothelium-derived hyperpolarizing factor: insights from genetic animal models // Kidney International. 2007. - V. 72. - P. 145-150.

57. Kolber K.A., Gao Y., Raj J.U. Maturational changes in endothelium-derived (nitric oxide-mediated relaxation of ovine pulmonary arteries // Biol. Neonate. 2000. - V. 77; № 2. -P.123-130.

58. Laughlin M.H., Woodman C.R., Schräge W.G., Gute D., Price E.M. Interval sprint training enhances endothelial function and eNOS content in some arteries that perfuse white gastrocnemius muscle // J. Appl. Physiol. 2004. - V. 96. - P. 233 - 244.

59. Linderman J.R., Boegehold'M. A. Growth-related changes in the influence of nitric oxide on arteriolar tone // Am. J: Physiol. Heart Circ. Physiol. 1999. - V. 277. -P.H1570- H1578.

60. Linderman J.R., Boegehold M.A. Modulation of arteriolar sympathetic constriction by local nitric oxide: onset diiring rapid juvenile growth // Microvasc. Res. — 1998. — V. 56.-P. 192-202.t

61. Liu S.F., Hislop A.A., Haworth S.G., Barnes. P.J. Developmental changes in endothelium-dependent pulmonary vasodilatation, in pigs I I Br. J. Pharmacol. 1992. -V. 106; № 2. - P.324-330.

62. Mills E., Smith P.G. Mechanisms of adrenergic control of blood pressure in developing rats // Am. J.' Physiol.-1986.-V.250; №2 Pt2.-P.R188-192:

63. Moncada S., Gryglewski R., Bunting S., Vane J.R. An enzyme isolated from arteries transforms prostaglandin endoperoxides to an unstable substance that inhibits platelet aggregation //Nature. 1976. - V. 263; № 5579. -P.663-665.

64. Moneada S., Vane J.R. Pharmacology and endogenous roles of prostaglandin endoperoxides, thromboxane A2, and prostacyclin // Pharmacol. Rev. 1978. - V. 30; № 3. -P.293-331.

65. Morecroft I., MacLean M.R. Developmental changes in endothelium-dependent vasodilation and the influence of superoxide anions in perinatal rabbit pulmonary arteries // Br. J. Pharmacol. 1998. - V. 125; № 7. - P.1585-93.

66. Morello F., Perino A., Hirsch E. Phosphoinositide 3-kinase signalling in the vascular system // Cardiovasc. Res. 2009. - V.82; №2. - P.261-71.

67. Muenzel T., Feil R., Mulsch A., Lohmann S.M., Hofmann F., Walter U. Physiology and pathophysiology of vascular signalling by guanosine 3', 5' cyclic monophosphate-dependent protein kinase // Circulation. - 2003. - V. 108. - P.2172-2183.

68. Mulvany M.J., Halpern W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats // Circ. Res. 1977. - V. 41; №1.-P. 19-26.

69. Nakahata N. Thromboxane A2: physiology/pathophysiology, cellular signal transduction and pharmacology // Pharmacol. Ther. 2008. - V. 118; № 1. - P.18-35.

70. Nakamura K., Koga Y., Sakai H., Homma K., Ikebe M. cGMP-Dependent Relaxation of Smooth Muscle Is Coupled With the Change in the Phosphorylation of Myosin Phosphatase // Circ. Res. 2007. - V. 101. - P.712-722.

71. Nankervis C.A., Dunaway D.J., Nowicki P.T. Determinants of terminal mesenteric artery resistance during the first postnatal month // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2001a. - V. 280; № 4. - P.G678-686.

72. Nankervis C.A., Nowicki P.T. Role of nitric oxide in regulation of vascular resistance in postnatal intestine // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1995. - V. 268. - P.G949-958.

73. Nilius B., Droogmans G. Transient Receptor Potential Channels in Endothelium: Solving the Calcium Entry Puzzle? // Endothelium. 2003. - V.10. - P.5-15.

74. Nilsson H. Adrenergic nervous control of resistance and capacitance vessels. Studies. on isolated^blood vessels from the rat // Acta Physiol. Scand. 1985. - V.541 - P.l-34.

75. Nilsson H., Sjoblom N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat // Acta. Physiol. Scand. 1985. - V. 125; №3. - P.429-435.

76. Nurkiewicz T.R., Boegehold M.A. Calcium-independent release of endothelial nitric oxide in the arteriolar network: onset during rapid juvenile growth // Microcirculation. 2004. - V. 11; №6. - P.453-462.

77. O'Donnell D.C., Tod M.L., Gordon J.B. Developmental changes in endothelium-dependent relaxation of pulmonary arteries: role of EDNO and prostanoids // J. Appl. Physiol. 1996.-V. 81; № 5. -P.2013-2019.

78. Ojeda S.R., Kalra P.S., McCann S.M. Further Studies on the Maturation of the Estrogen Negative Feedback on Gonadotropin Release in the Female Rat // Neuroendocrinology. 1975. - V. 18; № 3. - P. 242-255.

79. Owens G.K. Regulation of Differentiation of Vascular Smooth Muscle Cells // Physiol. Rev. 1995. - V. 75. -P.487-517.

80. Owens G.K., Kumar M.S., Wamhoff B.R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease // Physiol. Rev. -2004.-V. 84; №3.-P.767-801.

81. Palmer R.M., Ferrige A.G., Moneada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature (London). 1987. - V. 27. - P. 524-526.

82. Parfenova H., Massie V., Leffler C.W. Developmental changes in endothelium-derived vasorelaxant factors in cerebral circulation // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. - V. 278. - P.H780-H788.

83. Parker T.A., le Cras T.D., Kinsella J.P., Abman S.H. Developmental changes in endothelial nitric oxide synthase expression and activity in ovine fetal lung // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2000. - V. 278; № 1. - P.L202-208.

84. Perreault T., De Marte J. Maturational changes in endothelium-derived relaxations in newborn piglet pulmonary circulation // Am. J. Physiol. 1993. - V. 264; № 2 Pt 2. - P.H302-309.

85. Pilz R.B., Casteel D.E. Regulation of gene expression by cyclic GMP // Circ. Res.-2003.-V. 93; № 11.-P.1034-1046.

86. Popp R, Brandes R.P., Ott G., Busse R., Fleming I. Dynamic modulation of interendothelial gap junctional communication by 11,12-epoxyeicosatrienoic acid // Circ. Res. 2002. - V. 90. - P.800-806.

87. Ratliff B., Rodebaugh J., Sekulic M., Dong K.W., Solhaug M. Nitric oxide synthase and renin-angiotensin gene expression and NOS function in the postnatal renal resistance vasculature // Pediatr. Nephrol. 2009. - V. 24; № 2. - P.355-365.

88. Reber K.M, Su B.Y., Clark K.R., Pohlman D.L., Miller C.E., Nowicki P.T. Developmental expression of eNOS in postnatal swine mesenteric artery // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002. - V. 283. - P.G1328-1335.

89. Reber K.M., Mager G.M., Miller C.E., Nowicki P.T. Relationship between flow rate and NO production in postnatal mesenteric arteries // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2001. - V. 280. - P.G43-50.

90. Rendas A-., Branthwaite M., Reid L. Growth of pulmonary circulation in normal1 pig—structural analysis and cardiopulmonary function // J. Appl. Physiol. — 1978. Vi 45; № 5.'- P.806-817.

91. S relationship,to function? // Anat. 2009b. - V. 214; № 2. - P.258-266.

92. Sandow S.L., Haddock R.E., Hill C.E., Chadha P.S., Kerr P.M., Welsh D.G.,Plane F. What is where and why at vascular myoendothelial microdomain signaling complex // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2009a. - V. 36. - P.67-76.

93. Sauzeau V., Rolli-Derkinderen M., Marionneau C.T., Loirand G., Pacaud P. RhoA Expression Is Controlled by Nitric Oxide through cGMP-dependent Protein Kinase Activation // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278; №11,- P.9472-9480.

94. Schubert R., Nelson M. Protein kinases: tuners of the BKCa channel in smooth muscle // TRENDS in Pharmacological Sciences. 2001. - V. 22; №10. - P. 505512.

95. Searles C. D. Transcriptional and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase expression // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2006. - V. 291. -P.C803-816.

96. Searles C.D., Ide L., Davis M.E., Cai H., Weber M. Actin cytoskeleton organization and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase during cell growth // Circ. Res. 2004. - V. 95. -P.488-495.

97. Searles C.D., Miwa Y., Harrison D.G., Ramasamy S. Posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase during cell growth // Circ. Res. 1999. -V. 85. - P.588-595.

98. Seider F.J., Slotkin T.A. Adrenomedullary function in the neonatal rat: responses to acute hypoxia//J. Physiol. 1985. -V. 358. - P. 1-16.

99. Shaul P.W. Regulation of endothelial nitric oxide synthase: location, location, location // Ann. Rev. Physiol. 2002. - V. 64. - P.749-774.

100. Shaul P.W., Farrar M.A., Magness R.R. Pulmonary endothelial nitric oxide production is developmentally regulated in the fetus and newborn // Am. J. Physiol. -1993. V. 265; № 4 Pt 2. - P.H1056-1063.

101. Somlyo A.P., Somlyo A.V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase // Physiol. Rev. 2003. - V. 83; №4. - P.1325-1358.1

102. Steinhorn R.H., Morin F.C. Ill, Gugino S.F., Giese E.C., Russell J.A. Developmental differences in endothelium- dependent responses in isolated pulmonary arteries and veins // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1993. - V. 264. -P.H2162-2167.

103. Stoen R., Brubakk A.M., Vik T., Lossius K., Jynge P., Karlsson J.O. Postnatal changes in mechanisms mediating acetylcholine-induced relaxation in piglet femoral arteries // Pediatr. Res. 1997. - V. 41; № 5. -P.702-707.

104. Stulkova B. Postnatal development of cardiac output distribution measured by radioactive microspheres in rats // Biol. Neonate. 1977. - V. 32. - P. 119-124.

105. Tarasova O., Sjoblom-Widfeldt N., Nilsson H. Transmitter characteristics of cutaneous, renal and skeletal muscle small arteries in the rat // Acta Physiol. Scand. -2003.-V. 177; № 2. —P.157-166.

106. Thompson L.P., Weiner C.P. Acetylcholine relaxation of renal artery and nitric oxide synthase activity of renal cortex increase with fetal and postnatal age // Pediatr. Res. 1996. - V. 40; № 2. - P. 192-197.

107. Todd M.E. Development of adrenergic innervation in rat peripheral'vessels: a fluorescence microscopic study//J. Anat. 1980. -V. 131; №1.-P. 121-133.

108. Torok J., Gerova M. Developmental dynamics of* endothelial and neurogenic control of canine thoracic aorta // Mech. Ageing Dev. 1997. - V. 95; №1-2. -P.143-152.

109. Trachte G.J. Prostacyclin mediates arachidonic acid-induced relaxation of rabbit isolated mesenteric arteries // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1986. - V. 8; № 4. -P.758-764.

110. Triggle C.R., Ding H. The endothelium in compliance and resistance vessels // Front Biosci. (Schol Ed). 2011. - V. 3. - P.730-744.

111. Vallance P., Chan N. Endothelial function and nitric oxide: clinical relevance // Heart. 2001. - V. 85; № 3. - P.342-350.

112. Vanhoutte P.M. Endothelial Adrenoceptors // J. Cardiovasc. Pharmacol. -2001.-V. 38; №5.-P. 796-808.

113. Waldron G. J., Ding H., Lovren F., Kubes P., Triggle C. R: Acetylcholine-induced relaxation of peripheral arteries isolated from mice lacking endothelial nitric oxide synthase // Br. J. Pharmacol. 1999. - V. 128. - P.653-658.

114. Wallace K.B., Hook J.B., Bailie M.D. Postnatal development of the renin-angiotensin system in rats // Am. J. Physiol. 1980. - V. 238; № 5. - P.R432-437.

115. Wang X., Chu W., Lau F., van Breemen C. Bradykinin potentiates acetylcholine induced responses in native endothelial cells from rabbit aorta // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -V. 213; № 3. -P.1061-1067.

116. Weisz J., Gunsalus P. Estrogen Levels in Immature Female Rats: True or Spurious—Ovarian or Adrenal? // Endocrinology. 1973 - V. 93(5) - P. 1057 -1065.

117. White C.R., Pearce W.J. Effects of maturation on cyclic GMP metabolism in ovine carotid arteries // Pediatr. Res. 1996. - V. 39; №1. - P. 25-31.

118. Williams J.M., Hull A.D., Pearce W.J. Maturational modulation of endothelium-dependent vasodilation in ovine cerebral arteries // Am. J. Physiol. Reg. Int. Comp. Physiol: 2005. - V. 288. - P.R149-157.

119. Williams J.M., Pearce W.J. Age-dependent modulation of endothelium-dependent vasodilation by chronic hypoxia in ovine cranial arteries // J. Appl. Physiol. 2006. - V. 100. -P.225-232.

120. Willis A.P., Leffler C.W. Endothelial NO and prostanoid involvement in newborn and juvenile pig pial arteriolar vasomotor responses // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. - V. 281. - P.H2366-2377.

Информация о работе

Гайнуллина, Дина Камилевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Эндотелий-зависимая регуляция сокращения подкожной артерии у крыс в раннем постнатальном онтогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы