Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регионарная специфичность и механизмы гормональной регуляции продукции оксида азота эндотелием артерий у крыс в раннем постнатальном онтогенезе

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регионарная специфичность и механизмы гормональной регуляции продукции оксида азота эндотелием артерий у крыс в раннем постнатальном онтогенезе"

На правах рукописи

<4

СОФРОНОВА СВЕТЛАНА ИВАНОВНА

РЕГИОНАРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМЫ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА ЭНДОТЕЛИЕМ АРТЕРИЙ У КРЫС В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

1 8 СЕН 2014

005552511

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (зав. кафедрой - профессор A.A. Каменский) Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Тарасова доктор биологических наук, профессор кафедры

Ольга физиологии человека и животных биологического факультета

Сергеевна Федерального государственного бюджетного

образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Цорин доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Иосиф Федерального государственного бюджетного учреждения

Борисович НИИ Фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Воротников Института экспериментальной кардиологии Федерального Александр государственного бюджетного учреждения «Российский Вячеславович кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем Российской академии наук.

Защита диссертации состоится 6 октября 2014 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: Ленинские горы, д.1, строение 12, Москва, ГСП-1, 119234, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, д. 27) и на сайте http://www.bio.irisu.ru.

Автореферат разослан «5» сентября 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост и развитие организма сопровождаются значительными изменениями в строении и функционировании сосудистого русла, которые необходимы для адекватного кровоснабжения органов и тканей в соответствии с их метаболическими потребностями. При этом формирование артериального русла в ходе развития организма происходит по-разному в разных органах, о чем свидетельствуют перераспределение сердечного выброса между органами и изменение кровотока в отдельных органах. Например, в таких органах как головной мозг, селезенка и почки кровоток по мере созревания организма растет, а в тонком кишечнике и коже - напротив, снижается; в скелетных мышцах он может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от их метаболических характеристик [Boegehold, 2010; Nankervis et al., 2001; Stulcova, 1977]. Следует отметить, что механизмы изменений артерий в раннем постнатальном онтогенезе изучены мало.

Важная роль в регуляции уровня системного артериального давления (АД) и кровоснабжения органов принадлежит эндотелию сосудов. В здоровом организме регуляторная роль эндотелия реализуется в секреции факторов, которые вызывают расслабление гладких мышц сосудистой стенки и/или ослабляют вазоконстрикторные влияния (т.н. антиконстрикторное влияние эндотелия) [Медведева, 2001; Мелькумянц, 2005]. Среди релаксирующих эндотелиальных факторов наиболее изученным и значимым является оксид азота. Ранее было показано, что эндотелий подкожной артерии 1-2 недельных крысят, в отличие от взрослых крыс, не только секретирует NO в ответ на дилятаторные агонисты, но и тонически продуцирует NO, что приводит к ослаблению сократительных ответов этой артерии; такое влияние эндотелия у молодых крыс связано с повышенной экспрессией и активностью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [Gaynullina et al., 2013]. Вместе с тем остается неясным, существует ли повышенная продукция NO в эндотелии других сосудистых регионов и является ли этот механизм важным для формирования уровня системного артериального давления, который в раннем постнатальном периоде значительно ниже, чем в последующие периоды жизни. Второй неясный вопрос состоит в том, под влиянием каких факторов может формироваться такой «неонатальный» фенотип секреции эндотелия сосудов.

В настоящее время установлено, гормоны, которые циркулируют в крови и/или локально синтезируются в сосудистой стенке, оказывают влияние на различные функции эндотелия. Во-первых, среди гормональных систем следует выделить эстрогеновую. Существует большое количество данных о протекторных эффектах эстрогенов на сердечно-сосудистую систему, связанных в первую очередь с влиянием на функции эндотелия. Известно, что у женщин степень эндотелий-зависимой дилятации варьирует в течение менструального цикла и увеличивается при заместительной гормональной терапии эстрогенами после наступления менопаузы [Duckies, Miller, 2010]. На культуре эндотелиальных клеток было описано прямое потенцирующее действие эстрадиола на экспрессию eNOS [MacRitchie et al., 1997]. Эстрогены также могут регулировать активность eNOS: хроническое введение эстрогенов

овариэктомированым самкам приводит к увеличению продукции N0 в артериях мозга, что связано с повышением уровня активирующего фосфорилирования eNOS и снижением уровня экспрессии кавеолина-1, ингибитора eNOS [Schreihofer et al., 2010; Stirone et al., 2005]. Основываясь на этих наблюдениях, можно предположить, что эстрогены могут стимулировать продукцию NO эндотелием и в раннем постнатальном периоде, ведь известно, что их содержание в крови крыс в первые дни после рождения выше, чем во взрослом возрасте [Cheng, Johnson, 1973; Ojeda et al., 1975; Weisz, Gunsalus, 1973].

Во-вторых, недавно было продемонстрировано, что продукция NO в эндотелии сосудов находится под контролем тиреоидных гормонов. Как повышение, так и снижение секреторной активности щитовидной железы сопровождаются изменениями сопротивления периферических сосудов [Danzi, Klein, 2012]. Например, введение трийодтиронина приводит к увеличению эндотелий-зависимого расслабления за счет повышения содержания белка eNOS и продукции NO [Büssemaker et al., 2003]. Так как гормоны щитовидной железы играют ключевую роль в регуляции роста и развития организма, дифференцировки практически всех клеток и тканей [Смирнов, 2008], можно предположить, что в сферу влияния тиреоидной системы входит и эндотелий сосудов. Однако роль тиреоидных гормонов в ранней регуляции секреторной активности эндотелия практически не изучена.

Целью данной работы было оценить антиконстрикторное влияние эндогенно продуцируемого NO в артериях разных органов у самцов крыс 2-недельного возраста по сравнению со взрослыми и изменения такого влияния при хроническом подавлении действия эстрогенов и тиреоидных гормонов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить активность NO-пути в организме 2-недельных и взрослых крыс по изменению уровня артериального давления после блокады синтеза NO и содержанию метаболитов NO в крови.

2. Сравнить показатели активности NO-пути в артериях тонкого кишечника, кожи, скелетной мышцы и почки у крыс разного возраста по изменению сократительных реакций при блокаде продукции NO в эндотелии, чувствительности гладкой мышцы к NO и уровню экспрессии мРНК белков, которые могут влиять на синтез N0.

3. Исследовать влияние блокады эстрогеновых рецепторов и ароматазы в раннем постнатальном периоде на показатели активности NO-пути в артериях крыс 2-недельного возраста.

4. Исследовать изменения активности NO-пути в организме 2-недельных крыс при потреблении тиреостатика пропилтиоурацила самками в период беременности и вскармливания.

Научная новизна работы. Результаты, полученные в данной работе, развивают наши представления о NO-зависимой регуляции сокращения артерий гемодинамически важных органов в раннем постнатальном онтогенезе. Впервые в результате комплексного исследования активности NO-пути в артериальных сосудах показано, что в раннем постнатальном периоде в артериях многих органов оксид азота оказывает мощный антиконстрикторный

эффект, который градуально уменьшается при взрослении. Впервые установлено, что уровень артериального давления у 2-недельных крысят в бодрствующем состоянии подвержен более значительной регуляции оксидом азота, чем у взрослых животных, что может быть одним из механизмов поддержания артериального давления на низком уровне. Принципиальная новизна работы состоит в том, что в ней проведено исследование регуляторных последствий антенатального гипотиреоза в отношении секреторной активности сосудистого эндотелия. Полученные данные являются уникальными и демонстрируют важную роль тиреоидных гормонов в модуляции активности пути оксида азота в артериях крыс в раннем постнатальном периоде.

Практическая значимость работы. Значимость настоящей работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена тем, что в последнее время у новорожденных детей все чаще обнаруживаются патологические изменения функционирования сердечно-сосудистой системы. Такие нарушения могут развиваться как во время внутриутробного развития, так и после рождения ребенка, и приводить к серьезным заболеваниям в последующие годы жизни, если не предпринимать попыток их медикаментозной коррекции. В работе раскрыты регионарные особенности регуляции тонуса артериальных сосудов, которые следует принимать во внимание при определении путей коррекции возможных нарушений органного кровообращения. Данные о механизмах влияния антенатального гипотиреоза на регуляцию тонуса кровеносных сосудов в раннем постнатальном онтогенезе указывают, что при выборе фармакологического способа коррекции нарушений сосудистой системы в раннем возрасте необходимо принимать во внимание не только особенности регуляции сосудов в данном сосудистом регионе, но и гормональный статус организма.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Продуцируемый эндотелием оксид азота оказывает мощный антиконстрикторный эффект в артериях тонкого кишечника, кожи и скелетных мышц 2-недельных крысят, такое влияние градуально снижается по мере взросления.

2. Эстрогены не являются специфическими регуляторами повышенной активности >Ю-пути в организме 2-недельных крыс.

3. Тиреоидные гормоны в антенатальном и раннем постнатальном периодах оказывают потенцирующее действие на продукцию оксида азота в артериях тонкого кишечника, а также на системном уровне.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на съезде Немецкого физиологического общества (Регенсбург, Германия, 2011), на XX Международном симпозиуме по резистивным сосудам (Ребилд, Дания, 2011), на Международных научных конференциях «Ломоносов - 2011» и «Ломоносов - 2013» (Москва, 2011, 2013), на съезде Скандинавского физиологического общества (Берген, Норвегия, 2011), на V Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012),

на XI и XII Всероссийских с международным участием научных школах-конференциях по механизмам адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке (Казань, 2012, 2014), на совместном съезде Обществ по микроциркуляции и сосудистой биологии Германии и Нидерландов (Мангейм, Германия, 2012), на XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013), на X Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: новые факты и гипотезы» (Пущино, 2014) и на совместном съезде Европейского общества по гипертензии и Международного общества по гипертензии (Афины, Греция, 2014). Диссертация апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (протокол № 41 от 19 мая 2014 г.).

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №13-04-02087-а и №14-04-31377-мол_а и субсидии Минобрнауки России (соглашение между Минобрнауки России и ГНЦ РФ-ИМБП РАН №14.604.21.0029). При проведении исследований использовалось оборудование, приобретенное за счет средств Программы развития Московского университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, и 16 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 136 источников. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 32 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы крысы Вистар, полученные из вивария НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977).

Экспериментальные группы животных: (1) половозрелые самцы в возрасте 10-12 недель; (2) самцы в возрасте 4-5 недель; (3) самцы в возрасте 2 недели, не подвергавшиеся экспериментальным воздействиями или же получавшие инъекции растворителя (контроль к группам 4-5); (4) самцы в возрасте 2 недели, которым вводили антагонист эстрогеновых рецепторов а/Р;

(5) самцы в возрасте 2 недели, которым вводили ингибитор ароматазы;

(6) самцы в возрасте 2 недели с антенатальным гипотиреозом.

Хроническая блокада эстрогеновых рецепторов и ароматазы в раннем постнатальном периоде. В качестве антагониста эстрогеновых рецепторов а/р использовали препарат ICI 182,780: (фулвестрант: (7-альфа,17-бета)-7-[9-[(4,4,5,5,5 пентафторпентил)-сульфинил]нонил]эстра-1,3,5(10)-триен-3,17-диол, Sigma-Aldrich. В качестве ингибитора ароматазы использовали нестероидный препарат летрозол (4,4'-[(1Н-1,2,4-триазол-1-ил) метилен] бисбензонитрил, Sigma-Aldrich.

Вещества вводили в дозе 1 мг/кг один раз в сутки с первого дня жизни до дня, предшествующего взятию в эксперимент. Вещества разводили в ДМСО и

персиковом масле до концентрации 400 мкг/мл и вводили подкожно в области холки из расчета 2.5 мкл на грамм массы тела. Эффективность действия блокаторов оценивали по относительной массе матки (для ICI 182,780 - с использованием специальной группы крысят женского пола) или по содержанию эстрадиола в сыворотке крови (для летрозола). Эксперименты проводили параллельно на самцах из групп «ICI», «Летрозол» и «Контроль», возраст крысят составлял 14-15 дней.

Модель антенатального гипотиреоза. Для создания гипотиреоза у самок и их потомства использовали 6-пропил-2-тиоурацил (PTU, Sigma-Aldrich). PTU ингибирует тиропероксидазу, которая катализирует йодирование и связывание остатков тирозина на тироглобулине. Наряду с этим PTU ингибирует дейодиназу-1 , которая превращает тироксин (Т4) в более активный трийодтиронин (Т3) в щитовидной железе и других тканях [Manna et al., 2013]. Половозрелых самок подсаживали в клетку к самцам на ночь и на следующее утро брали влагалищные мазки. Если в мазке обнаруживали сперматозоиды, этот день считали первым днем беременности. В таком случае самок помещали в индивидуальные клетки и начинали вести учет потребления воды и прироста массы тела. Самкам экспериментальной группы в течение всей беременности и последующих двух недель в питьевую воду добавляли PTU в концентрации 0.0005% (5 ррт); доза вещества составляла в среднем 0.7 мг/кг/сутки. Самки контрольной группы потребляли воду без PTU. Эксперименты проводили параллельно на самцах групп «PTU» и «Контроль» в возрасте 14-15 дней.

Эксперименты in vivo. Показатели системной гемодинамики регистрировали у 2-недельных и взрослых самцов. Катетер для регистрации системного АД вживляли в правую сонную артерию, а катетер для введения веществ - в правую яремную вену. Операцию проводили под эфирным наркозом, который подавали капельным способом. Длительность операции не превышала часа, эксперимент начинали через час после завершения операции.

Установка для измерения АД состояла из тензометрического датчика, усилителя потенциалов, компьютера типа PC и аналого-цифрового преобразователя USB-6211 (National Instruments, США), частота опроса сигнала АД составляла 1000 Гц. Для регистрации и обработки экспериментальных данных использовали программное обеспечение, разработанное в среде программирования LabView 2011 (National Instruments, автор - в.н.с. Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ Е.В. Лукошкова). Непосредственно в ходе эксперимента для каждого сердечного цикла программа вычисляла среднее значение АД и длительность. После адаптации животного к условиям эксперимента и регистрации фонового уровня АД вводили L-NAME (ингибитор NO-синтазы): болюсно в дозах 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг и 7 мг/кг (кумулятивно), промежутки времени между инъекциями составляли 5 минут. При обработке результатов вычисляли значения среднего АД в фоне (усреднением данных для 5-мин участка записи, предшествующего введению L-NAME) и на последней минуте действия каждой дозы L-NAME, когда значения показателей выходили на плато. Для оценки прессорных реакций на разные дозы L-NAME изменения среднего АД выражали в процентах от фонового уровня.

Определение показателей крови

Получение сыворотки крови. После декапитации крыс ножницами собирали порции крови в пробирки «Эппендорф», далее инкубировали их 5 минут при комнатной температуре, 30 минут при 37°С и 15-30 минут при 4°С, для ретракции сгустка. Затем образцы центрифугировали 15 минут при 8000 об/мин, отбирали супернатант, замораживали и хранили при -20°С.

Измерение содержания метаболитов NO в сыворотке крови. Последовательно проводили депротеинизацию образцов, экстракцию липидов и восстановление N03" до N02" с использованием VC13 одновременно с проведением реакции Грисса [Miranda et al., 2001]. Измерение оптической плотности проводили с использованием спектрофотометра (Jenway 6715) при 543 нм. По значениям оптической плотности для калибровочных проб (растворы NaN02 в концентрациях от 10"8 M до 3*10"5 М) строили зависимость, по которой определяли концентрацию N02~ в экспериментальных пробах (эквимолярную суммарному содержанию N03" и N02~ в сыворотке крови).

Определение содержания гормонов методом иммуноферментного анализа. Использовали наборы для определения эстрадиола, тестостерона, общего Т4, свободного Т4 и свободного Т3 (ЗАО «НВО Иммунотех»), а также для определения дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГА-С, Diagnostics Biochem Canada Inc.). Процедуры проводили по инструкциям производителей.

Эксперименты на изолированных сосудах

Объекты исследования. Эксперименты проводили на артериях брыжейки третьего порядка ветвления, подкожной артерии, артерии икроножной мышцы и междолевых артериях почки 2-недельных, 4-недельных и взрослых крыс.

Методика эксперимента. Сокращение кольцевых сегментов артерий длиной 2 мм исследовали в изометрическом режиме с использованием двух систем wire myograph (41 OA и 620М, DMT A/S, Дания). Каждый из кольцевых препаратов с помощью двух натянутых струн из нержавеющей стали (диаметр 40 мкм) закрепляли между головками миографа, одна из которых была соединена с тензометрическим датчиком, а другая — с микрометром, с помощью которого устанавливалось расстояние между струнами, т.е. растяжение препарата. В случае необходимости проводили механическое удаление эндотелия с помощью крысиного уса. Показания тензометрических датчиков оцифровывали с частотой 10 Гц и непрерывно записывали на жесткий диск компьютера с использованием аналого-цифрового преобразователя (Е14-140М, L-CARD, Россия) и программы PowerGraph 3.3 for Windows (ДИСофт, Россия).

Объем камеры миографа, в которой располагался каждый препарат, был равен 5 мл. Раствор в камере имел состав (мМ): NaCl 120; NaHC03 26; КС1 4,5; СаС12 1,6; MgS04 1,0; NaH2P04 1,2; D-глюкоза 5,5; ЭДТА 0,025; HEPES 5,0; 5% C02 + 95% 02; pH 7,4. После нагрева раствора в камере миографа до 37°С (3040 мин) определяли растяжение препарата, оптимальное для проявления сократительной активности [Mulvany, Halpern, 1977]. Затем препараты активировали однократным добавлением норадреналина (10"5М), а затем двукратным добавлением метоксамина (MX, агонист di-адренорецепторов, 10°М). На фоне второго добавления MX на сосуд действовали ацетилхолином для оценки функционального состояния эндотелия.

Протоколы экспериментов. При исследовании эффектов блокады продукции оксида азота в эндотелии сравнивали сократительные ответы артерий на МХ после инкубации с блокатором NO-синтазы (L-NNA, 100 цМ) или с его неактивным аналогом (D-NNA, 100 цМ). В эксперименте использовали два однотипных сегмента из артерий, полученных от одного и того же животного. Через 25 минут после завершения процедуры активации проводили кумулятивное добавление МХ в диапазоне концентраций от 10"8 до Ю^М. Затем препараты отмывали в течение 15 минут и добавляли в один из каналов L-NNA, а в другой — D-NNA. Через 25 минут, не меняя раствор, проводили вторую зависимость «концентрация-эффект» для МХ. Для выявления эффекта блокады продукции NO сравнивали вторые зависимости «концентрация-эффект» сосудов в присутствии L-NNA или D-NNA. При этом важно, что первые зависимости «концентрация-эффект» для двух групп артерий (далее инкубированных с L-NNA или D-NNA) не различались.

В экспериментах по исследованию чувствительности гладкой мышцы артерий к донору NO использовали препараты с удаленным эндотелием, чтобы избежать наложения эффектов эндогенного и экзогенного NO. После проведения зависимости «концентрация-эффект» для МХ препараты отмывали и через 25 минут вносили такую концентрацию МХ, которая вызывала 50-70% сокращение от максимального в зависимости «концентрация-эффект». Через 5-10 минут (после стабилизации сократительного ответа) начинали кумулятивное добавление донора NO (DEA-NO, от 10'9М до 10"5М). Следующую концентрацию вещества вносили, когда эффект предыдущей выходил на плато.

Обработка результатов. Сначала определяли значение силы (в мН), соответствующей состоянию полного расслабления гладкой мышцы препарата («пассивное» значение силы). В каждой зависимости «концентрация-эффект» определяли значение силы до добавления первой концентрации МХ (его превышение уровня «пассивной» силы свидетельствовало о наличии базального тонического сокращения препарата) и значения силы при действии каждой концентрации МХ. Затем вычисляли соответствующие значения «активной» силы, для этого из каждого полученного значения вычитали пассивное. Все полученные значения «активной» силы выражали в процентах от максимального значения «активной» силы в первой зависимости «концентрация-эффект».

При анализе зависимостей «концентрация-эффект» для DEA-NO сначала вычисляли величину предсокращения, вызванного МХ, относительно пассивного значения силы. Затем вычисляли уменьшения силы при действии каждой концентрации DEA-NO и выражали их в процентах от уровня предсокращения, вызванного МХ.

Исследование уровней экспрессии мРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

С использованием метода количественной ПЦР в ткани артерий взрослых и 2-недельных крыс определяли содержание мРНК следующих генов: эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), аргиназы-2 (Arg-2), эстрогенового рецептора альфа (ERa), мембранного рецептора эстрогенов GPR30, ароматазы,-

рецептора тиреоидных гормонов альфа (TRa), дейодиназы-2 (D2). В качестве референсных генов использовали гены глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), малой рибосомной РНК (18S) и рибосомного белка Р0 (RPLP0).

Для приготовления одного образца сосудистой мРНК взрослых крыс использовали 2-3 артерии брыжейки, 1 подкожную артерию, 3 артерии икроножной мышцы (от двух крыс) и 4 междолевые артерии почки. Для приготовления одного образца сосудистой мРНК 2-недельных крыс использовали 6 артерий брыжейки, 2 подкожные артерии, 6 икроножных артерий (от трех крыс) и 6 междолевых артерий почки. Каждая экспериментальная группа включала 4-10 образцов мРНК.

Артерии быстро изолировали, помещали в буфер RNA-later (Qiagen), и хранили при -80°С. Для экстракции РНК использовали раствор ExtractRNA (Евроген). Выделенную мРНК подвергали обратной транскрипции для синтеза комплементарной ДНК с помощью набора реактивов MMLV RT kit, Евроген, после чего проводили ПЦР в реальном времени в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) с использованием набора реактивов, содержащего интеркалирующий краситель SYBR Green I и Taq-полимеразу (Синтол, Россия).

Обработку результатов проводили в программе Rotor Gene 6000 Software. Значение уровня экспрессии исследуемых генов в каждом образце рассчитывали как 1/ЕлСт, где Е - эффективность праймеров, а Ст— номер цикла, на котором кривая накопления продукта пересекает порог детекции флуоресценции. Затем эти значения нормировали на среднее геометрическое из уровней экспрессии трех референсных генов в этом же образце. В итоге сравнивали нормированные значения в исследуемых группах по каждому гену.

Статистическая обработка результатов Статистический анализ данных проводили с использованием критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони на множественные сравнения и метода дисперсионного анализа для повторных измерений. Различия считали статистически значимыми при р<0.05. Данные приведены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего, п - объем выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ NO-ПУТИ НА СИСТЕМНОМ УРОВНЕ

Исходные значения среднего АД у крыс 2-нед. возраста в два раза ниже по сравнению со взрослыми: 50.9±3.9 мм рт. ст. и 107.2±3.2 мм рт. ст., соответственно (р<0.05). Введение блокатора NO-синтазы приводило к повышению среднего АД. При действии L-NAME в высоких дозах (от 3 мг/кг до 7 мг/кг) прессорные ответы у двух возрастных групп был сопоставимыми: 30-40% (рис. 1А). Однако при введении L-NAME в дозе 1 мг/кг увеличение АД у взрослых крыс составило всего 8% от исходного уровня, тогда как у 2-нед. животных прирост АД был намного больше (около 22%).

Известно, что величина прессорного ответа на L-NAME корелирует с содержанием метаболитов NO в крови [Glushkovskaya-Semyachkina et al., 2006; Pavlov et al., 2009]. Действительно, суммарное содержание нитритов и нитратов значительно повышено в крови 2-нед. крыс по сравнению со взрослыми (рис.

1Б). Сходные данные были получены при измерении содержания нитратов в крови человека: их уровень значимо выше в организме детей на протяжении первых трех лет жизни по сравнению со взрослыми [Elli et al., 2005].

Таким образом, для 2-нед. крыс по сравнению со взрослыми характерны более низкий уровень АД, повышение чувствительности к L-NAME и увеличение содержания метаболитов NO в крови. Эти данные свидетельствуют о повышенной активности NO-пути в организме крыс в раннем постнатальном периоде, что, по-видимому, важно для поддержания уровня артериального давления на низком уровне.

А Б

!1п

X o-U^—-L

2-нед Взрослые

Рисунок 1. А: Влияние L-NAME на среднее АД у 2-нед. (п=5) и взрослых крыс (п=5). Б: Суммарное содержание нитритов и нитратов в сыворотке крови 2-нед. (п=10) и взрослых крыс(п=9).*р<0.05 по сравн. со взрослыми (критерий Стьюдента).

ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ NO-ПУТИ В АРТЕРИЯХ РАЗНЫХ ОРГАНОВ Диаметр и сократимость артерий у крыс разного возраста

Внутренний диаметр всех исследуемых артерий увеличивается от 2-нед. к взрослому возрасту более чем в два раза, что отражает рост и развитие артериального русла при взрослении (табл. 1).

Таблица 1. Внутренний диаметр и сила сокращения артерий при действии максимальной концентрации МХ в первой зависимости «концентрация-эффект» у 2-нед., 4-нед. и взрослых крыс.____

Артерии Показатели 2-нед 4-нед Взрослые

Масса тела, г 30.8±0.9 124.5±8.8 318.3±10.0

Артерии брыжейки Диаметр, мкм 159.3±5.9 266.3±9.0 338.7±11.8

Сила сокращения, мН 3.71±0.2 13.9±0.8 20.2±1.4

Подкожная артерия Диаметр, мкм 257.8±5.2 500.5±14.3 569.7±27.8

Сила сокращения, мН 13.1±0.7 27.2±1.3 41.Ш.8

Артерия икроножнои мышцы Диаметр, мкм 112.8±6.0 199.6±4.6 251.7±10.1

Сила сокращения, мН 3.0±0.3 10.Ш.0 15.3±0.9

Артерии почки Диаметр, мкм 163.2±6.5 - 348.2±7.2

Сила сокращения, мН 3.4±0.4 - 16.0±1.3

13 5 7

L-NAME, мг/кг

Наряду с этим растет и сократимость артерий: у взрослых крыс сила сокращения в пять раз выше, чем у 2-нед. (кроме подкожной артерии, где сила сокращения больше в 3 раза) (табл. 1). Отметим, что сила сокращения растет в большее число раз, чем диаметр, т.е. с возрастом, вероятно, происходит увеличение относительной толщины гладкомышечного слоя стенок сосудов. Увеличение сократимости артерий также связано с дифференцировкой гладкомышечных клеток в ходе постнатального развития [Р1кс1гоуа й а1., 2014].

Антиконстрикторный эффект N0 присутствует во многих сосудистых регионах 2-недельных крыс и уменьшается при взрослении

В артериях брыжейки 2-нед. крыс блокада продукции N0 приводит: (1) к развитию выраженного тонического сокращения, величина которого составляет около половины от максимальной реакции на МХ в первой зависимости «концентрация-эффект»; (2) к усилению сократительных ответов артерий на МХ: кривая «концентрация-эффект» сдвигается влево и вверх по отношению к контрольной «Б-МЧА» (рис. 2А). В артериях брыжейки 4-нед. крыс наблюдались сходные изменения сократительных ответов, однако в этом возрасте эффекты Ь-МчГА были гораздо слабее, чем у 2-нед. крыс (данные не представлены), а в артериях брыжейки взрослых животных эффекты Ь-1чПЧА еще менее выражены (рис. 2Б). Наши данные согласуются с результатами исследования продукции N0 в сосудистом русле брыжейки новорожденных свиней: сопротивление этого бассейна минимально в первые дни после рождения, а далее растет, стабилизируясь к 30 дню, причем такое низкое сопротивление сосудов связано с тонической продукцией N0 в эндотелии [Ыапкетэ й а1., 2001]. Помимо этого известно, что с возрастом в артериях брыжейки может происходить переключение механизмов эндотелий-зависимого расслабления: уменьшается вклад N0 и увеличивается вклад эндотелиального гиперполязирующего фактора (ЕБНР).

В подкожной артерии эффекты блокады продукции N0 были сходными с таковыми в артериях брыжейки, но менее выраженными. На рис. 2В видно, что в артериях 2-нед. крыс Ь-Ы1ЧА вызывает развитие лишь небольшого тонического сокращения и умеренно потенцирует сократительные реакции на МХ, как было показано ранее [ОаупиШпа ег а!., 2013]. В 4-нед. возрасте эффекты ингибирования ЫО-синтазы сохранялись в той же степени, что и в 2-нед. (данные не представлены). Во взрослом возрасте происходит полное исчезновение эффектов Ь-№\[А (рис. 2Г).

В артерии икроножной мышцы 2-нед. крыс блокада синтеза N0 приводит к увеличению базального тонического сокращения и к увеличению сократительных ответов на МХ (рис. 2Д). У 4-нед. крыс эффекты ингибирования Ж)-синтазы проявлялись в меньшей степени, чем у 2-нед. (данные не представлены). У взрослых животных эффекты блокады синтеза N0 были выражены слабо, но наблюдалось развитие тонуса и небольшое увеличение сократительных ответов при действии низких концентраций МХ (рис. 2Е). Как и в артериях брыжейки, в артерии икроножной мышцы уменьшение влияния эндогенного N0 во взрослом возрасте может быть связано с увеличением вклада других путей, например, ЕБНР [Тарасова и др., 2008].

А. Артерии брыжейки: 2-нед.

Б. Артерии брыжейки: взрослые

ЬЫЫА

-8 -7 -6 -5 1д[Метоксамин], (М)

1д[Метоксамин], (М)

В. Подкожная артерия: 2-нед. Г. Подкожная артерия: взрослые

-8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

120 ч * 1001 803"

8. 60-

ас О

« 40-

гс

с:

• 1_-ЫМА О

О

■—1 I-1-1-1-1

В1 -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

иЫЫА О-ЫМО,

Д. Артерия икроножной м.: 2-нед. 120-, * 100-

I 803

а во-

X

0

« 40 га

1 20

0J

-8 -7 -6 -5 -4 !д[Метоксамин], (М)

Е. Артерия икроножной м.: взрослые

120-1

^ 100-

к

I 80-

а бо-

0

" 40 га

1 20-

<н о В1

о --о-

-8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

Рисунок 2. Влияние блокады синтеза N0 (Ь-МЫА, 100 цМ) на сократительные ответы артерий брыжейки 2-нед. (А, п=12) и взрослых (Б, п=7) крыс; подкожной артерии 2-нед. (В, п=6) и взрослых (Г, п=9) крыс; артерии икроножной мышцы 2-нед. (Д, п=9) и взрослых (Е, п=8) крыс. «В1» - значение силы сокращения до добавления МХ. *р<0.05 - сравн. значений силы для условий «L-NNA» и «В-ЫИА» (критерий Стьюдента), "р<0.05 - сравн. зависимостей «концентрация-эффект» для МХ в присутствии Ь-Т<ГМА и О-МЫЛ в диапазоне концентраций от 10"8 М до 10"4 М (дисперсионный анализ для повторных измерений).

А. Артерии почки: 2-нед.

Б. Артерии почки: взрослые

120-1

100-

оГ

S

I 0) 80-

3

п О. 60-

X

О 40

С

= о 20-

0-

• L-NNA О D-NNA

BI -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

120-1 100 806040 20 0

-8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

Рисунок 3. Влияние блокады синтеза N0 (Ь-№ч[А) на сократительные ответы артерий почки 2-нед. (А, п=12) и взрослых (Б, п=7) крыс. «В1» - значение силы сокращения до добавления первой концентрации МХ. *р<0.05 - сравн. значений силы в отсутствие МХ для условий «Ь-МЧА» и «О-М^ГА» (критерий Стьюдента).

А. Артерии брыжейки. 120-,

Б. Подкожная артерия

-9 -8 -7 -6 lg[DEA-NO], (М)

В. Артерия икроножной мышцы

• 2-нед О Взрослые

-9 -8 -7 -6 -5 lg[DEA-NO], (М)

• 2-нед О Взрослые

-9 -8 -7 -6 lg[DEA-NO], (N1)

Рисунок 4. Реакции артерий брыжейки (А, п=10;5), подкожной артерии (Б, п=5;5) и артерии, питающей икроножную мышцу (В, п=10;5) на различные концентрации DEA-NO. *р<0.05 по сравнению со взрослыми (критерий Стьюдента).

В артериях почки крыс 2-нед. возраста, в отличие от остальных исследованных артерий, блокада продукции N0 не приводила к изменениям сократительных ответов на MX (рис. ЗА). У взрослых крыс L-NNA также не изменял сократительные ответы на MX, однако развивалось небольшое тоническое сокращение (рис. ЗБ). Ранее было показано, что реакции эндотелий-зависимого расслабления почечных артерий морских свинок увеличиваются с возрастом и это связано с повышением вклада NO [Thompson, Weiner, 1996]

Описанные выше результаты говорят об антиконстрикторном влиянии эндогенного N0 на сократительные реакции артерий брыжейки, подкожной артерии и артерии икроножной мышцы в возрасте 2-нед. и о градуальном ослаблении такого влияния с возрастом. В следующей серии экспериментов был проведен анализ чувствительности гладкой мышцы этих артерий к N0. В подкожной артерии не было выявлено различий по реакции на донор NO между 2-нед. и взрослыми крысами (рис. 4Б). В артериях брыжейки и икроножной мышцы 2-нед. крыс чувствительность гладкой мышцы к NO была не выше, а даже ниже, чем у взрослых животных (рис. 4 А и В), что может быть следствием более высокой продукции N0 в эндотелии [Ohashi et al., 1998]. Таким образом, возрастные различия в активности NO-пути связаны с изменениями на уровне эндотелиальных, а не гладкомышечных клеток сосуда.

Уровни экспрессии аргиназы-2 в артериях 2-недельных крыс ниже, чем у взрослых

Продукция NO в эндотелии сосудов может регулироваться за счет изменения уровня экспрессии eNOS [Гайнуллина и др., 2013; Fleming, 2010]. Однако, несмотря на различия во влиянии эндогенного NO на сократительные реакции артерий (рис. 2), уровни экспрессии мРНК eNOS у 2-нед. и взрослых крыс не различались (рис. 5А).

#

Ш 2-нед □ Взрослые

Л

Л

Артерии Подкожная Артерия Артерии брыжейки артерия икроножной почки мышцы

о j 0.0015

к i

Ш 2-нед О Взрослые

шП ¿П

# т

Артерии Подкожная Артерия брыжейки артерия икроножной мышцы

Артерии почки

Рисунок 5. Уровни экспрессии мРНК еЫОБ (А) и аргиназы-2 (Б) в артериях брыжейки (п=7;9), подкожной артерии (п=9;9), артерии икроножной мышцы (п=6;4) и артерии почки (п=6;8) 2-нед. и взрослых крыс. *р<0.05 по сравн. со взрослыми (критерий Стьюдента), $р<0.05 по сравн. с остальными артериями 2-нед. крыс, #р<0.05 по сравн. с остальными артериями взрослых крыс (однофакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони).

Другим важным механизмом регуляции продукции N0 может быть изменение доступности субстрата eNOS, L-аргинина, за счет конкуренции eNOS с другим ферментом - аргиназой-2. Как показано на рис. 5Б, содержание мРНК аргиназы-2 значительно ниже во всех исследуемых артериях 2-нед. животных по сравнению со взрослыми, что указывает на большую доступность субстрата синтеза N0 в 2-нед. возрасте.

Интересно, что наблюдались значительные регионарные различия в уровнях экспрессии мРНК данных генов. В артериях брыжейки, где антиконстрикторное влияние N0 выражено в наибольшей степени, экспрессия eNOS также выше, чем в других артериях. Напротив, в почечной артерии, где NO-компонент регуляции представлен в наименьшей степени, уровень экспрессии eNOS самый низкий, а уровень экспрессии аргиназы-2 значительно выше, чем в остальных артериях.

Результаты проведенного исследования сосудистых реакций у крыс разного возраста в экспериментах in vivo и in vitro говорят о том, что в артериях большинства органов активность эндотелиального NO-пути у 2-нед. крыс выше, чем у взрослых. Можно предположить, что это служит одной из причин низкого уровня системного артериального давления в 2-нед. возрасте. Такое предположение согласуется с большей чувствительностью АД к блокаде синтеза NO и с повышенным содержанием метаболитов NO в крови. Вклад N0-компонента в регуляцию сосудистого тонуса градуально уменьшается при взрослении, что не связано с изменениями в экспрессии мРНК eNOS, но коррелирует с повышением экспрессии мРНК аргиназы-2.

Два следующие раздела работы посвящены выявлению возможных механизмов, регулирующих активность NO-пути в раннем постнатальном онтогенезе. Наличие изменений NO-пути во многих сосудистых регионах позволяет предположить существование системной регуляции, например, за счет действия циркулирующих в крови факторов. Известно, что экспрессия и активность eNOS регулируются множеством гормонов, в первую очередь, эстрогенами, а также гормонами щитовидной железы [Duckies, Miller, 2010]. В связи с этим далее мы исследовали возможную роль этих гормональных систем на секреторную функцию эндотелия в раннем постнатальном онтогенезе.

Далее в экспериментах использовали только 2 типа артерий: подкожную артерию, для которой хорошо изучены механизмы регуляции ее тонуса в раннем постнатальном онтогенезе [Gaynullina et al., 2013], и артерии брыжейки, в которых наблюдался наиболее яркий антиконстрикторный эффект N0.

Влияние эстрогенов на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе

В крови 2-нед. самцов по сравнению со взрослыми наблюдалось повышенное содержание эстрадиола (556.6±16.0 пмоль/л и 312.6±16.4 пмоль/л; р<0.05) и его метаболического предшественника ДГА-С (13102.3±1482.9 пмоль/л и 5529.5± 1467.8 пмоль/л, р<0.05). Кроме того, мы показали, что в подкожной артерии 2-нед. крыс уровень экспрессии ERa, основного посредника влияния эстрогенов в эндотелии сосудов [Kim et al., 2014], почти в

пять раз выше, чем у взрослых, хотя в артериях брыжейки крысят и взрослых крыс уровни экспрессии мРНК ЕЯа не различаются (рис. 6).

Ш 2-нед

Подкожная Артерии

артерия брыжейки

Рисунок 6. Уровни экспрессии мРНК ЕЯа в подкожной артерии(п=5;9) и артериях брыжейки (п=6;9) 2-нед. и взрослых самцов крыс. *р<0.05 по сравн. со взрослыми, $р<0.05 по сравнению с артериями брыжейки 2-нед. самцов (критерий Стьюдента).

Чтобы оценить возможное влияние эстрогенов на синтез N0 в эндотелии, у крысят проводили хроническую блокаду ERa/(3 с первого дня жизни. Вопреки нашим ожиданиям, такое воздействие не привело к изменениям сократительных реакций подкожной артерии 2-нед. крысят. Ингибирование продукции NO в эндотелии приводило к развитию спонтанного тонического сокращения и увеличению сократительных реакций в ответ на MX как в группе «Контроль» (рис. 7А), так и в группе «ICI» (рис. 7Б). В артериях брыжейки также не было выявлено эффектов антагониста ERa/p на антиконстрикторный эффект N0 (данные не представлены).

А. Подкожная артерия «Контроль»

BI -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

Б. Подкожная артерия «ICI»

140-1 • L-NNA # 120-° D-NNA*

| 100-

ф

3 80-

ге

S 60-

и

™ 40-q

о 20- *

oJ 5

■—i i-1-1-1-1

BI -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

Рисунок 7. Влияние блокады продукции NO (L-NNA) на сократительные ответы подкожной артерии у двух групп 2-нед. крыс: А — контроль (п=7); Б - крысы, получавшие блокатор ERa/p ICI 182,780 (n=12). «Bl» - значение силы сокращения до добавления первой концентрации MX; *р<0.05 - сравн. значений силы для условий «L-NNA» и «D-NNA» в отсутствие MX (критерий Стьюдента); "р<0.05 - сравн зависимостей «концентрация-эффект» для MX в присутствии L-NNA и D-NNA в диапазоне концентраций от 10~8 M до 10"4 M (дисперсионный анализ для повторных измерений).

Таким образом, хроническая блокада ERa/p не приводит к изменениям антиконстрикторного эффекта N0 в эндотелии подкожной артерии у 2-нед. крыс. Для обнаружения возможных системных изменений NO-пути в организме 2-нед. крыс, получавших блокатор ERa/p, проводили измерение содержания метаболитов N0 в сыворотке крови. Оказалось, что в крови крысят группы «ICI» суммарное содержание нитритов и нитратов было статистически значимо выше, чем в группе «Контроль» (28.8±2.8 мкмоль/л и 20.9±0.7 мкмоль/л, соответственно, р<0.05).

Такое наблюдение свидетельствует о наличии других путей проведения эстрогеновых сигналов в организме 2-нед. самцов при введении ICI 182,780. Известно, что помимо ERa/p эстрадиол может оказывать быстрые эффекты на сердечно-сосудистую систему через рецептор GPR30 [Lindsey, Chappell, 2011]. Мы показали, что уровень экспрессии мРНК GPR30 в подкожной артерии 2-нед. крыс во много раз выше, чем у взрослых (рис. 8). В связи с таким наблюдением мы полагаем, что отсутствие эффекта ICI 182,780 на антиконстрикторное действие N0 может быть связано с действиями эстрогенов через GPR30. К тому же известно, что ICI 182,780 не только блокирует ERa/p, но и является агонистом GPR30 [Meyer et al., 2010].

s о m x M I 0.0004

0.0008-^ ^^^^^

о § | ^^^^ Рисунок 8. Уровни экспрессии мРНК

ОРЯЗО в подкожной артерии (п=7;9) 2-нед. и взрослых крыс. *р<0.05 по сравнению со взрослыми (критерий Стьюдента).

2-нед Взрослые

В качестве альтернативной модели подавления эстрогеновых влияний в раннем постнатальном онтогенезе в нашей работе была выбрана хроническая блокада ароматазы - фермента обеспечивающего локальный синтез эстрогенов из тестостерона в организме, в том числе, в эндотелии некоторых артерий [Gonzales et al., 2007]. С первого дня после рождения до 2-нед. возраста самцам вводили ингибитор ароматазы летрозол, что привело к снижению концентрации эстрадиола в крови на 22% по сравнению с контролем.

Как видно на рис. 9, хроническая блокада ароматазы также не оказала влияния на сократительные реакции подкожной артерии 2-нед. крысят. Ингибирование продукции NO в эндотелии приводило к развитию спонтанного тонического сокращения и увеличению сократительных реакций в ответ на MX как в группе «Контроль» (рис. 9А), так и в группе «Летрозол» (рис. 9Б). Содержание метаболитов NO в сыворотке крови крысят группы «Летрозол» не отличалось от значений в группе «Контроль» (20.9±2.6 мкмоль/л и 20.9±0.7 мкмоль/л, соответственно, р>0.05), то есть снижение концентрации эстрадиола в крови 2-нед. крысят не привело к изменениям NO-пути на системном уровне.

А. Подкожная артерия «Контроль»

Б. Подкожная артерия «Летрозол»

Рисунок 9. Влияние блокады продукции N0 (ЫчПЧА) на сократительные ответы подкожной артерии 2-нед. крыс: А - в контроле (п=7); Б - после введения ингибитора ароматазы летрозола (п=8). «В1» - значение силы сокращения до добавления первой концентрации МХ; *р<0.05 - сравн. значений силы для условий «Ь-^А» и «Б-ЫКА» в отсутствие МХ (критерий Стьюдента); яр<0.05 - сравн. зависимостей «концентрация-эффект» для МХ в присутствии Ь-1^А и О-МЫА в диапазоне концентраций от 10"8 М до 10"4 М (дисперсионный анализ для повторных измерений).

Таким образом, нам не удалось обнаружить эффектов ингибирования ароматазы на МО-зависимую регуляцию тонуса артерий 2-нед. крысят. В соответствии с этим мы обнаружили, что ген ароматазы не экспрессируется в подкожной артерии как 2-нед., так и взрослых крыс, что может говорить об отсутствии локального синтеза эстрадиола в данной артерии.

Исходя из изложенных выше результатов, можно заключить, что несмотря на более высокое содержание эстрадиола в крови и повышение экспрессии мРНК ER.cc, активность МО-пути в эндотелии сосудов 2-нед. крыс не снижается в результате блокады влияния эстрогенов через ERa/p или снижения концентрации эстрадиола путем ингибирования ароматазы.

Влияние тиреоидных гормонов на РЮ-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе

На заключительном этапе работы проводилась проверка гипотезы о том, что антиконстрикторный эффект N0 в артериях крыс 2-нед. возраста может быть связан с влиянием тиреоидных гормонов, которые являются регуляторами активности е>ТО8 [Нпо1 е1 а1., 2006].

Анализ содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови показал, что не только концентрация общего Т4 (96.5±5.3 нмоль/л и 62.6±3.0 нмоль/л, р<0.05), но и содержание активной гормональной формы - свободного Т3 (10.7±0.6 пмоль/л и 8.5±0.5 пмоль/л, р<0.05) у самцов крыс в возрасте 2 недель . гораздо выше, чем у взрослых.

На рис. 10А представлены данные по экспрессии рецептора тиреоидных гормонов а-типа (TRa) в подкожной артерии и артериях брыжейки. Видно, что

ген ТЯа экспрессируется в артериях как 2-нед., так и взрослых крыс, причем различий между двумя типами артерий не обнаружено (рис. 10А).

Ключевым ферментом локального превращения Т4 в Т3 в стенке артерий является дейодиназа 2 типа (02) [СегеЬеп й а1., 2008]. В подкожной артерии уровни экспрессии мРНК 02 у 2-нед. и взрослых крыс не различаются (рис. 10Б) однако значимо выше, чем в артериях брыжейки крыс соответствующего возраста. Важно, что в артериях брыжейки уровень экспрессии мРНК 02 у крысят намного выше, чем у взрослых крыс (рис. 10Б). Таким образом, у 2-нед. животных наряду с повышенным содержанием тиреоидных гормонов в крови существует возможность более интенсивной локальной продукции Т3 в артериях брыжейки.

а ¡г

2

* 0.010-

Ш 2-нед О Взрослые

шаД

Подкожная артерия

Артерии брыжейки

5 0.004-

■I 2-нед СШ Взрослые

Рисунок 10. Уровни экспрессии мРНК ТЯа (А, п=9;9;7;9) и дейодиназы-2 (Б, п=9;9;7;9) в подкожной артерии и артериях брыжейки 2-нед. и взрослых самцов. *р<0.05 по сравн. со взрослыми, $р<0.05 по сравн. с артериями брыжейки 2-нед. животных. "р<0.05 по сравн. с артериями брыжейки взрослых животных (критерий Стьюдента).

Для проверки гипотезы о потенцирующем влиянии тиреоидных гормонов на продукцию N0 в эндотелии артерий 2-нед. крыс у животных моделировали антенатальный гипотиреоз путем ингибирования синтеза тиреоидных гормонов в организме матери с первого дня беременности и затем у крысят до достижения ими 2-нед. возраста. Исходно и во время беременности масса тела самок в группах «Контроль» и «РТи» статистически значимо не различались. Длительность беременности в обеих группах составила в среднем 22 дня. Однако масса тела крысят в первый день жизни в группе «РТи» была меньше, чем в контрольной группе: 6.1±0.4 г и 7.3±0.2 г соответственно (р<0.05), различие сохранялось и в 2-нед. возрасте (24.2±1.1 г и 29.2±1.3 г соответственно, р<0.05).

В табл. 2 представлены данные о содержании тиреоидных гормонов в крови самок и их потомства. Видно, что у матерей, получавших РТи, концентрация общего Т4 и свободного Т4 значимо ниже, чем в контроле, а у 2-нед. самцов с антенатальным гипотиреозом сильно снижены не только общий и

свободный Т4, но и свободный Т3 по сравнению с крысятами группы «Контроль». Полученные результаты позволяют говорить, что применение РТи привело к сравнительно мягкому гипотиреозу у самок и к более выраженному гипотиреозу у их потомства.

Таблица 2. Содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови самок и их потомства в группах «Контроль» и «РТи» через две недели после родов. *р<0.05 по сравнению с контрольной группой 2-нед. самцов. #р<0.05 по сравнению с контрольной группой взрослых самок (критерий Стьюдента).

Показатели Самки 2-нед самцы

Контроль (п=6) РТи (п=12) Контроль(п=16) РТи (п=22)

Общ. Т4, нмоль/л 65.4±4.8 30.7±4.2# 90.8±7.0 23.74±2.3*

Св. Т4, пмолъ/л 14.5±2.8 6.0±0.9# 21ХШ.1 1.8±0.3*

Св. Т3, пмолъ/л 5.2±0.7 5.4±0.9 7.7±0.9 5.5±0.5*

Эффекты антенатального гипотиреоза на активность МО-пути в подкожной артерии и артериях брыжейки 2-нед. самцов крыс принципиально различались. Как видно на рисунке 11, в подкожной артерии антенатальный гипотиреоз не оказал влияния на эффекты Ь-ИЫА: как в контроле, так и в группе «РТи» Ь-ЫЫА вызывал развитие спонтанного тонического сокращения, наряду с этим наблюдался сдвиг кривой «Ь-№ч[А» влево относительно кривой «О-ША».

А. «Контроль» Б. «РТи»

ЬЫЫА

В1 -8 -7 -6 -5 -4 |д[Метоксамин], (М)

В1 -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

Рисунок 11. Влияние блокады продукции N0 (Ь-ЬГМА) на сократительные ответы подкожной артерии 2-нед. крыс в группах «Контроль» (А, п=7) и «РТи» (Б, п=12). «В1» - значение силы сокращения до добавления первой концентрации МХ. *р<0.05 -сравн. значений силы для условий «Ь-КЫА» и «О-КЫА» в отсутствие МХ (критерий Стьюдента); "р<0.05 — сравн. зависимостей «концентрация-эффект» для МХ в присутствии Ь-]чГЫА и Б-ЬПЧА в диапазоне концентраций от 10"8 М до 1СГ4 М (дисперсионный анализ для повторных измерений).

Однако в артериях брыжейки, в отличие от подкожной артерии, под действием РТи произошло изменение эффектов блокады ЫО-синтазы в эндотелии: действие Ь-ЬГЫА на артерии крысят с антенатальным гипотиреозом (рис. 12Б) проявлялось в меньшей степени, чем в контроле (рис. 12А). В итоге вызванное Ь-ГчГЫА спонтанное тоническое сокращение и сдвиг кривой «Ь-№ч(А» в группе «РТШ были меньше, чем в контрольной группе (рис. 12В).

А. «Контроль» Б. «РТи»

О О-ЫМ '

В1 -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], (М)

1д[Метоксамин], (М)

В. «Контроль» и «РТи» в присутствии

В1 -8 -7 -6 -5 -4 1д[Метоксамин], {М)

Рисунок 12. Влияние блокады продукции N0 (Ь-№ЧА) на сократительные ответы артерий брыжейки 2-нед. крыс в группах «Контроль» (А, п=8) и «РТи» (Б, п=12). На рисунке В совмещены зависимости «концентрация-эффект», зарегистрированные у двух групп крысят в присутствии Ь->Лч[А. «В1» - значение силы до добавления первой концентрации МХ; *р<0.05 - сравн. значений силы в отсутствие МХ для условий «Ь-КЫА» и «0-1\ГЫА» (критерий Стьюдента); #р<0.05 - сравн. зависимостей «концентрация-эффект» для МХ в присутствии Ь-ЬПМА и В-ЫЫА в диапазоне концентраций от 10"8 М до 10"4 М (дисперсионный анализ для повторных измерений); $р<0.05 - сравн. значений силы в отсутствие МХ для условий «Ь-№ЫА» группы «Контроль» и «РТи» (критерий Стьюдента); ®р<0.05 - сравн. зависимостей «концентрация-эффект» для МХ в присутствии Ь-ЫЫА в диапазоне концентраций от 10"8 М до 10"4 М (дисперсионный анализ для повторных измерений).

На рис. 13А видно, что реакции подкожной артерии на DEA-NO не различаются между группами «Контроль» и «PTU». Однако для артерий брыжейки 2-нед. самцов с гипотиреозом наблюдается значительное увеличение чувствительности гладкой мышцы к донору N0 относительно артерий группы «Контроль» (рис. 13Б). Такое изменение может отражать компенсаторное повышение чувствительности гладкой мышцы к N0 при снижении его продукции в артериях брыжейки крысят с антенатальным гипотиреозом.

А. Подкожная артерия

Б. Артерии брыжейки

120-

аг 100< МьО О Контроль ¿S

oí • PTU к

1 80- S X

§ 1

| 6(Ь ГС а.

о о

1 4°" и

с; с

о 20- о

0- —i-1-

120

-9 -8 -7 -6 lg[DEA-NO], (М)

-5

-8 -7 -6 -5 lg[DEA-NO], (М)

Рисунок 13. Чувствительность гладкой мышцы подкожной артерии (А, п=5;4) и артерий брыжейки (Б, п=10;4) 2-нед. крыс к донору NO DEA-NO в группах «Контроль» и «PTU». &р<0.05 по сравн. с группой «Контроль» (критерий Стьюдента).

Для обнаружения возможных системных изменений ЫО-пути в организме 2-нед. крыс с антенатальным гипотиреозом проводили измерение содержания метаболитов N0 в сыворотке крови. Суммарное содержание нитритов и нитратов в крови крысят группы «РТи» значительно ниже, чем в группе «Контроль» (19.7±1.4 мкмоль/л и 28.8±1.5 мкмоль/л). Такие данные говорят о возможном нарушении продукции N0 в организме 2-нед. крыс с гипотиреозом.

В целом, наши данные о влиянии антенатального гипотиреоза на функциональные характеристики артерий брыжейки подтверждают гипотезу о регуляторной роли тиреоидных гормонов в формировании специфического секреторного фенотипа сосудистого эндотелия в раннем постнатальном онтогенезе. Различные эффекты антенатального гипотиреоза на артерии брыжейки и подкожную артерию могут быть связаны с функциями этих артерий в организме крысят и с изменением их функционирования при гипотиреозе, но для ответа на этот вопрос нужны дополнительные исследования. Вместе с тем на основании снижения содержания метаболитов N0 в крови крыс с антенальным гипотиреозом можно предполагать, что влияние тиреоидных гормонов на синтез N0 в эндотелии проявляется не только в артериях брыжейки, но и в других артериях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе впервые получены данные о наличии антиконстрикторных эффектов NO в различных сосудистых регионах и характере их проявления в зависимости от возраста. Основываясь на полученных результатах и данных литературы, мы приходим к заключению, что в организме 2-нед. крыс активность NO-пути гораздо выше, чем у взрослых крыс, что выявляется не только на уровне отдельных сосудистых бассейнов, но и на системном уровне. Обнаруженные нами особенности NO-зависимой регуляции тонуса артерий 2-нед. крыс позволяют предполагать наличие связи между ними и изменениями кровотока в отдельных органах в раннем постнатальном онтогенезе [Stulcovä, 1977]. При этом увеличенная продукция NO в организме 2-нед. крыс и его антиконстрикторное действие в большинстве сосудистых регионов могут служить одним из механизмов поддержания артериального давления на низком уровне в первые недели после рождения, когда еще не сформированы структурные и функциональные характеристики сердца и артериальных сосудов.

В работе также исследованы возможные механизмы гормональной регуляции продукции NO в раннем постнатальном онтогенезе. Мы предположили, что потенцирующее влияние на продукцию N0 в эндотелии артерий 2-нед. крыс оказывают эстрогены. Однако нам не удалось выявить эффектов блокады ERa/ß или ароматазы на продукцию N0 артериальным эндотелием у крысят. Поэтому мы считаем, что эстрогены не являются специфическими регуляторами NO-пути в артериях самцов крыс в раннем постнатальном онтогенезе.

Помимо эстрогенов стимулирующее влияние на продукцию NO в эндотелии могут оказывать тиреоидные гормоны. При моделировании антенатального гипотиреоза у крысят были выявлены изменения активности NO-пути как на регионарном, так и на системном уровнях: ослабление антиконстрикторного действия эндогенного NO в артериях брыжейки и снижение содержание метаболитов N0 в крови. Полученные данные говорят о выраженном потенцирующем влиянии тиреоидных гормонов на синтез NO в организме в раннем постнатальном онтогенезе.

Следует отметить, что помимо регуляции тонуса артерий у новорожденных животных NO может регулировать процессы формировании структуры сосудистой стенки путем влияния на пролиферативную активность гладкомышечных и эндотелиальных клеток [Pilz, Casteel, 2003]. Кроме того, сигнальные каскады от N0 могут приводить к изменению экспрессии белков, участвующих в процессах дифференцировки клеток: например, показано, что действие протеинкиназы G ускоряет переход клеток от пролиферативного фенотипа к сократительному [Pilz, Casteel, 2003]. Таким образом, помимо прямого влияния на сократительную активность артерий высокий базапьный уровень продукции NO в эндотелии новорожденных животных может быть важным для формирования специфического фенотипа как эндотелиальных, так и гладкомышечных клеток.

23

ВЫВОДЫ

1. Для 2-недельных самцов крыс по сравнению со взрослыми характерны: низкий уровень АД, увеличение прессорных ответов на L-NAME в низкой дозе (1 мг/кг) и содержания метаболитов N0 в крови, что указывает на повышение активности NO-пути во многих сосудистых регионах.

2. У 2-недельных самцов крыс в артериях тонкого кишечника, кожи, скелетной мышцы, но не почки блокада продукции N0 приводит к более выраженному приросту сократительных ответов по сравнению со взрослыми животными, что объясняется повышением продукции NO в эндотелии и сопровождается снижением экспрессии аргиназы-2.

3. Содержание эстрадиола и ДГА-С в крови, уровень экспрессии рецепторов ERa в подкожной артерии и уровень экспрессии рецептора GPR30 в подкожной артерии и артериях брыжейки повышены у 2-недельных самцов крыс относительно взрослых.

4. Антагонист ERa/p ICI 182,780 и ингибитор ароматазы летрозол, вводимые с первого дня жизни, не приводят к уменьшению антиконстрикторного эффекта N0 в подкожной артерии и артериях брыжейки 2-недельных самцов крыс.

5. У 2-недельных самцов крыс по сравнению со взрослыми наблюдается повышенные содержание тиреоидных гормонов в крови и уровень экспрессии дейодиназы 2 в артериях брыжейки.

6. Антенатальный гипотиреоз приводит к уменьшению антиконстрикторного влияния эндогенного NO в артериях брыжейки и

снижению содержания метаболитов N0 в крови.

***

Автор выражает искреннюю благодарность Дине Камилевне Гайнуллиной, Андрею Александровичу Мартьянову, Илье Владимировичу Кузьмину, Анастасии Алексеевне Швецовой (Биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова) и Анне Анатольевне Борзых (Институт медико-биологических проблем РАН).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление; ДГА-С - дегидроэпиандростерон сульфат; ДМСО - диметилсульфоксид; МХ - метоксамин; Т3 — трийодтиронин;

- тироксин; 02 - дейодиназа 2; ЕБНР - эндотелиальный гиперполяризующий фактор; еЫОБ - эндотелиальная N0 - синтаза; ЕК - рецептор эстрогенов; РТИ - пропилтиоурацил; TRa - рецептор тиреоидных гормонов альфа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Софронова С.И., Платовская М.Е., Тарасова О.С., Позднее В.Ф., Медведева Н.А.. Исследование эффектов эндотелина на реактивность артерий легкого и почки у крыс путем хронической блокады эндотелин-превращающего фермента. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 4. -С.29-34.

2. Илатовская М.Е., Софронова С.И., Позднев В.Ф., Медведева Н.А.. Влияние блокатора синтеза эндотелина-1 на развитие реноваскулярной гипертензии у крыс (модель «одна почка, один зажим»), // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011 - № 4 - С.23-28.

3. Gaynullina D, Lubomirov LT, Sofronova SI, Kalenchuk VU, Gloe T, Pfitzer G, Tarasova OS, Schubert R. Functional remodelling of arterial endothelium during early postnatal development in rats. // Cardiovascular Research. - 2013. - V.99(4). - P.612-621.

4. Гайнуллина Д.К., Софронова С.И., Тарасова O.C. Эндотелий и оксид азота. // Природа РАН. - 2014 - №9. - С.3-10.

5. Софронова С.И., Илатовская М.Е., Тарасова О.С., Медведева Н.А.. Реактивность мелких артерий легких и почки при хронической блокаде эндотелин-превращающего фермента у крыс. // Материалы научной конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов». - Москва, 15 сентября 2010. - С.74-75.

6. Schubert R., Gaynullina D., Kalenchuk V., Sofronova S., Tarasova O. Plasticity of vasoregulatory mechanisms: contribution to the blood pressure increase during maturation. // Abstracts of the 90th Annual Meeting of German Physiological Society. Regensburg, Germany March 26-29, 2011. Acta Physiologica. - 2011. - V.201. - Sup.682. - P. 118.

7. Gaynullina D., Lubomirov L., Kalenchuk V., Sofronova S., Pfitzer G., Tarasova O., Schubert R. The disappearance of an endothelial brake on vasoconstrictor-induced contraction may contribute to the blood pressure increase during maturation. Abstracts of the 10th International Symposium on Resistance Arteries. Rebild , Denmark, May, 2011. -P.35.

8. Софронова С.И., Гайнуллина Д.К. Роль оксида азота в эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов у крыс в раннем постнатальном периоде. // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», Москва, 2011. - С.244-245.

9. Sofronova S.I., Ilatovskaya М.Е., Tarasova O.S., Pozdnev V.F., Medvedeva N.A.. Reactivity of pulmonary and renal arteries after chronic endothelin converting enzyme blockade in rats. И Abstract of Scandinavian Physiological Society. Bergen, Norway August 12-14, 2011. Acta Physiologica - 2011 - V.202. - Sup.685. - P.91.

10. Gaynullina D.K., Kalenchuk V.U., Sofronova S.I., Tarasova O.S., Schubert R. Developmental changes of skin feed artery endothelium in the rat. // Abstract of Scandinavian Physiological Society Bergen, Norway August 12-14, 2011. Acta Physiologica. - 2011. - V. 202. - Sup. 685. - P.63-64.

11. Schubert R., Gainullina D., Lubomirov L., Kalenchuk V., Sofronova S., Pfitzer G., and Tarasova O.. Disappearance of an endothelial brake on vasoconstrictor-induced contractions: functional remodelling during postnatal development. // Abstract. Journal of Vascular Research. -2011. - V.48. - P. 175.

12. Софронова С.И., Гайнуллина Д.К., Мартьянов А.А., Тарасова О.С. Роль эстрогенов в регуляции продукции NO эндотелием сосудов у крыс в раннем

постнатальном периоде. // Сборник тезисов V Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 31 января-3 февраля 2012. - С.153-154.

13. Гайнуллина Д.К., Софронова С.И., Мартьянов А.А., Тарасова О.С. Секреторная функция эндотелия сосудов у крыс в раннем постнатальном периоде. // Материалы XI Всероссийской с международным участием научной школы-конференции по механизмам адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке. Казань, 2012. - С.31-32.

14. Gaynullina D., Lubomirov L., Sofronova S., Kalenchuk V., Gloe Т., Pfitzer G., Tarasova O., Schubert R.. The existence of an endothelial brake on agonist-induced contraction may restrict the blood pressure level during early postnatal development. // Abstract book of joint meeting of Society of Microcirculation and Vascular Biology (GfMvB) and Dutch Society for Endothelial Biology (DEBS) Society for Microcirculation and Vascular Biology (MiVaB). Mannheim, Germany, September 27-29 2012. - P.16.

15. Софронова С.И. Влияние продуцируемого эндотелием оксида азота на сократительные реакции артерий разных органов у крыс в раннем постнатальном онтогенезе. // Тезисы XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». Москва, 2013. - С.345.

16. Тарасова О.С., Болеева Г.С., Борзых А. А., Гайнуллина Д.К., Софронова С.И., Мартьянов А.А. Структурное и функциональное ремоделирование сосудистого русла: роль симпатической нервной системы. // Тезисы докладов XXII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. Волгоград, 16-20 сентября 2013. - С.516-517

17. Sofronova S.I., Borzykh А.А., Gaynullina D.K., Tarasova O.S. Developmental alterations of arterial smooth muscle and endothelium in different vascular beds. // Abstract book of Biological motility: new facts and hypotheses. Pushino, 2014. - P.286-288

18. Tarasova O.S., Morgunova G.V., Borzykh A.A., Shvetcova A.A., Selivanova E.K., Gaynullina D.K., Sofronova S.I., Vinogradova O.L. AMPK as a master controller of skeletal muscle metabolism and blood supply. Abstract book of Biological motility: new facts and hypotheses. Pushino, 2014. - P.303-304

19. Софронова С.И., Мартьянов А.А., Борзых A.A., Кузьмин И.В., Гайнуллина Д.К., Тарасова О.С. Изменения гормональной регуляции в раннем постнатальном онтогенезе: возможное влияние на тонус сосудов. Адаптация растущего организма: материалы XII Международной научной школы-конференции. 13-15 июня 2014. -Казань: Вестфалика, 2014. -С.99-100.

20. Sofronova S.I., Borzykh А.А., Tarasova O.S. Endothelial nitric oxide production weakens arterial constrictor responses in most of organs during early postnatal development in rats. // Journal of Hypertension. - 2014. - V.32. - eSup. 1. - P.e213.

Заказ № 01-Р/08/2014 Подписано в печать 04.08.14 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5 , тел. (495)649-83-30

1 ) www. cfr. ru ; e-mail: zakpark@cfr. ru