Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточный эритродиерез и его особенности в раннем постнатальном онтогенезе у белых крыс
ВАК РФ 03.03.01, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Клеточный эритродиерез и его особенности в раннем постнатальном онтогенезе у белых крыс"
На правах рукописи
У/
ГОЛУБЕВА Елена Константиновна
КЛЕТОЧНЫЙ ЭРИТРОДИЕРЕЗ И ЕГО ОСОБЕННОСТИ В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ У БЕЛЫХ КРЫС
03.03.01 - Физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
г 7 т гт
005062338 Москва-2013
005062338
Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Назаров Сергей Борисович, заведующий кафедрой нормальной физиологии
Официальные оппоненты:
Дегтярев Виталий Прокофьевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации;
Каюмова Алия Фаритовна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной физиологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации;
Козлов Иван Генрихович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Ведущая организация — медицинский факультет государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации.
Защита состоится « // » сентября 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П. К. Анохина» РАМН по адресу: 125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П. К. Анохина» РАМН.
Автореферат разослан «
» 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Кубряк Олег Витальевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы
Эритроцитарное равновесие, существующее в норме в организме, достигается благодаря динамической взаимосвязи процессов продукции и разрушения эритроцитов (Судаков К. В., Захаров Ю. М., 2002). В реализации механизмов эритродиереза ведущая роль принадлежит клеточному гемолизу (Бриллиант М. Д., 1985) при участии макрофагов-резидентов органов кроверазрушения. Изучены морфофункцио-нальные характеристики эритроцитов, подвергающихся деструкции (Козлова Н. М., Слобожанина Е. И., Черницкий Е. А. 1998; Sambrano G. R., Terpstra Y., Steinberg D., 1997; Owuor B. O. et al., 2008; Anong W. A. et al., 2009; Sánchez-Gallego J. I. et al., 2010), реакция макрофагов на эритроциты с измененными свойствами (Racca A., Biondi С., Cotorruelo С., 1999; Kay М. М., Goodman J., 2004; Ensinck A. et al., 2006), описано влияние некоторых веществ на эритрофагоцитоз (Вга-tosin D., Mazurier J., Debray H., 1995; Beppu M. et al., 2001 a, b, с). Однако физиологическая роль эритродиереза, механизмы и регуляция процесса элиминации эритроцитов во многом остаются неясными.
В настоящее время уделяется большое внимание оксиду азота (NO) как одному из основных факторов регуляции различных физиологических процессов. Оксид азота - биологически активное соединение, короткоживущий свободный радикал с высокой проникающей способностью (Журавлева И. А., Мелентьева И. А., Виноградов Н. А., 1997). Источником этого вещества являются азотсодержащие соединения, широко распространенные в народном хозяйстве, применяемые в качестве пищевых добавок, содержащиеся в некоторых лекарственных препаратах, используемых при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы (Лупанов В. П., 2006; Стуров Н. В., Мак-симкин Д. А., 2008). Известно влияние оксида азота на течение различных физиологических процессов. Доказана его роль в регуляции сердечно-сосудистой, иммунной, нервной, дыхательной и других систем организма (Салова JI. М., Плеханова Н. Г. 2006; Ignarro L. J. et al., 1999; Gerlach H. et al., 2003; Kuwai Т., Hayashi J., 2006; Erusalimsky J. D., Moneada S., 2007). Существует мнение о значении NO как универсального медиатора физиологических процессов (Wennmalm A., Ben-thin G., Peterson А., 1992). Однако вопрос об участии оксида азота в
регуляции эритроцитарного равновесия исследован недостаточно. Данные о значении N0 в механизме клеточного эритродиереза немногочисленны и во многом противоречивы (Tsujita R., Shiraishi Т., Kakinuma К., 1997; Ке X. et al., 2001; Kusmartsev S. A., Danilets M. G., Belskaya N. V., 2003; Aleksieieva I. M. et al., 2005). Поэтому актуальным представляется изучение роли оксида азота в осуществлении межклеточных взаимодействий в процессах деструкции эритроцитов.
Существенные преобразования эритрона в ранний постнатальный период (Назаров С. Б., Горожанин JI. С., 1996; Новожилов А. В., Ка-тюхин JT. Н., 2008) определяются значительными особенностями эри-тропоэза и эритродиереза. Транзиторное снижение параметров периферической крови, получившее название «ранней анемии» (Halvorsen К., Halvorsen S., 1973), происходит в результате сочетанных изменений процессов образования и разрушения эритроцитов, одно из которых - усиление гемолиза, способствующее разрушению как феталь-ных эритроцитов, так и образованных после рождения (Васку-рянА. К., Манакова Т. Е., Карташов А. Г., 1993; Hermle Т. et al., 2006). Эритроциты новорожденных более подвержены и спонтанному апоптозу, и спровоцированному оксидативным стрессом (Hermle Т. et al., 2006). Возможно, активация эритродиереза обеспечивает элиминацию неполноценных клеток, образованных в предшествующие возрастные периоды (Новожилов А. В., 2009; Edoh D., Antwi-Bosaiko С., Amuzu D., 2006). При наличии немногочисленных данных о механизмах изменения интенсивности эритропоэза (Горожанин JI. С., 1996; Sanengen Т. et al., 1987а) состояние, значение и физиологические механизмы гемолиза в раннем постнатальном онтогенезе практически не исследованы. Тем не менее, оценка параметров эритрона и его возрастных преобразований невозможна без характеристики эритродиереза.
Формирование физиологических систем потомства во многом зависит от состояния организма матери во время беременности. Показатели эритрона в системе мать-плод были предметом ряда исследований. Воздействие гипоксии при беременности приводит к развитию эритроцитоза у новорожденных (Bacon В. J. et al., 1984). По другим данным, хроническая внутриутробная гипоксия сопровождается задержкой внутриутробного развития и снижением показателей эритрона новорожденного (Бахмутова JI. А., Штепо М. В., Лапеко С. В., 2006). Дефицитная анемия беременных является фактором риска раз-
вития перинатальной патологии, в том числе, сопровождается анемией у новорожденных (Гущин И. В., 1986). Исследования, проводимые в нашей лаборатории, позволили выявить зависимость процессов эритродиереза плода и новорожденного от функционального состояния организма матери во время беременности в условиях измененной двигательной активности (Назаров С. Б., 1995; Назаров С. Б., Горожанин Л. С., 1996). Тем не менее, вопрос о зависимости эритродиереза потомства от функционального состояния организма матери во время беременности остается открытым. Учитывая важное физиологическое значение оксида азота в регуляции различных физиологических механизмов, для характеристики постнатального становления эритроцитарного равновесия необходимо оценить влияние метаболитов N0 на эритрон растущего организма, что позволит выявить особенности его физиологического и повреждающего действия в условиях незавершенного развития системы крови. Целесообразным является изучение как непосредственного действия оксида азота на эритро-диерез растущего организма, так и опосредованного влияния в функциональной системе мать-плод, что представляет собой важную научно-практическую задачу, актуальную не только для физиологии, но также для акушерства и педиатрии. Воздействие на материнский организм экстремальных факторов различной этиологии отражается на развитии потомства и проявляется отдаленными нарушениями в по-стнатальный период (Резников А. Г. и др., 2004; Булыгина В. В. и др., 2006; ^ояЬеуа N. ег а!., 2004). Прямых доказательств влияния пренатального стресса на эритродиерез в доступной литературе нами не обнаружено. Данные о состоянии эритродиереза потомства матерей, подвергавшихся стрессу во время беременности, позволят более полно охарактеризовать развитие эритрона в постнатальном периоде, раскрыть некоторые механизмы его адаптации и повреждения.
Цель работы
Установить закономерности клеточного эритродиереза у белых крыс и его Ж)-опосредованной регуляции; выявить особенности клеточного эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе в зависимости от состояния организма матери во время беременности и лактации.
Задачи исследования
1. Дать характеристику клеточного эритродиереза у белых крыс в норме и при некоторых изменениях функционального состояния эри-трона (полицитемия, острая кровопотеря).
2. Выявить эффекты оксида азота на процесс клеточного эритродиереза.
3. Дать морфофункциональную характеристику процессов эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс.
4. Охарактеризовать влияние острой нитритной интоксикации на состояние клеточного эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс.
5. Выявить особенности эритродиереза потомства крыс, подвергнутых во время беременности и лактации хронической нитритной интоксикации.
6. Показать особенности эритродиереза потомства крыс, перенесших иммобилизационный стресс во время беременности.
Концепция
Клеточный эритродиерез как фактор поддержания эритроцитар-ного равновесия в норме и при изменении функционального состояния эритрона крыс реализуется при участии NO-опосредованных механизмов. Оксид азота оказывает стимулирующее влияние на эрит-рофагоцитоз in vitro в зависимости от концентрации донатора (L-аргинина и нитропруссида натрия), действуя как на макрофаги, так и на эритроциты. В раннем постнатальном онтогенезе гемолиз обеспечивает элиминацию эритроцитов с неадекватными морфофункцио-нальными свойствами, способствуя становлению эритропоэза. Эритродиерез у потомства зависит от функционального состояния матери во время беременности и лактации (хронической нитритной интоксикации, иммобилизационного стресса), определяющего особенности адаптации эритрона крысят, наиболее чувствительного к действию адаптогенных факторов в критические периоды развития.
Научная новизна
На основании полученных результатов показана физиологическая роль эритродиереза в поддержании эритроцитарного равновесия взрослого и развивающегося организма, подтверждено значение гемолиза как фактора стимуляции эритропоэтической функции красного костного мозга.
В экспериментах in vitro доказано стимулирующее влияние оксида азота на эритродиерез. Выявлены особенности дозозависимого действия на эритрофагоцитоз L-аргинина и нитропруссида натрия, в малых количествах обладающих выраженным активирующим эффектом без существенного его нарастания при увеличении концентрации.
Показано, что влиянию оксида азота подвержены и эритроциты, и макрофаги. Стимулирующий эффект на макрофаги проявляется лишь увеличением их адгезионных свойств, тогда как взаимодействие производных NO с эритроцитами приводит к значительной активации всех стадий процесса фагоцитоза.
Проведено изучение становления эритрона в раннем постнаталь-ном онтогенезе крыс с системных позиций. Исследовано состояние периферической крови, процессы эритропоэза и эритродиереза, что позволило выявить особенности эритроцитарного равновесия в динамике постнатального развития эритрона и показать роль эритродиереза в его формировании: клеточный гемолиз обеспечивает элиминацию неполноценных эритроцитов, одновременно способствуя становлению эритропоэтической функции костного мозга.
Выявлены особенности адаптации эритрона к острой нитритной интоксикации в раннем постнатальном онтогенезе, установлены периоды наибольшей чувствительности к повреждающему действию производных оксида азота.
Дана комплексная оценка эффектов хронической нитритной интоксикации на эритрон потомства матерей, получавших нитрит натрия в период беременности и лактации.
Показано, что у крысят, матери которых во время беременности подвергались иммобилизационному стрессу, снижена активность клеточного эритродиереза на фоне общей тенденции к замедлению развития эритрона.
Установлено, что как в норме, так и при действии адаптогенных факторов наиболее уязвимым периодом эритроцитарного системоге-
неза является 21-й день жизни крысят, когда происходят преобразования эритропоэза и эритродиереза, существенно влияющие на формирование эритрона и во многом определяющие характер его адаптации.
Дополнены представления о гематологических критериях стресса, которые кроме типичных симптомов включают в себя трансформацию эритроцитов по эхиноцитарному типу у интактных взрослых крыс, а также лейкопению и снижение показателя гематокрита у беременных животных.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные дополняют представления о клеточных механизмах эритродиереза и его физиологическом значении у взрослого и развивающегося организма, позволяют на новом уровне охарактеризовать развитие эритрона в постнатальном периоде, раскрыть некоторые механизмы его адаптации и повреждения в зависимости от состояния материнского организма во время беременности и лактации, создать теоретическую основу антенатальной профилактики нарушений формирования эритрона и их коррекции в постнатальный период.
Реализация результатов исследования
Основные результаты исследования используются: в лекционном курсе кафедр нормальной физиологии (Акты внедрения «Возрастные особенности эритродиереза», «Особенности эритродиереза растущего организма, подвергнутого пренатальному стрессу», «Особенности клеточного эритродиереза при острой кровопотере и полицитемии» от 17 октября 2011г), патофизиологии и иммунологии (Акт внедрения «Влияние нитритной интоксикации на эритрон в ранний постнатальный период» от 17 октября 2011 г) ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации; кафедры физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации (Акт внедрения «Участие оксида азота в регуляции эритродиереза у крыс» от 1 декабря 2011г.); работе научно-исследовательской лаборатории биохимии и хроматографии НИЦ ГБОУ ВПО «Иванов-
екая государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Акт внедрения «Концентрация нитрит-ионов как показатель суммарного содержания производных оксида азота в ранний постнатальный период у крыс в норме и при хронической нитритной интоксикации» от 20 октября 2011 г).
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XVII съезде Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова (Ростов-на-Дону, 1998); 3 Всероссийском международном симпозиуме «Физиологические механизмы природных адаптаций» (Иваново, 1999); Пироговской межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2000); XVIII съезде Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова (Казань, 2001); II Российской конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 75-летию со дня рождения А. М. Уголева (Санкт-Петербург, 2001); III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 175-летию со дня рождения Ф. В. Овсяникова (Санкт-Петербург, 2003); XIX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Екатеринбург, 2004); I съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005); Международной научной конференции «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии» (Ярославль, 2005); IV научно-практической конференции «Природа и человек. Антропогенное воздействие на окружающую среду» (Иваново, 2005); XX съезде Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова (Москва, 2007); 4-й Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010); XI международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии, акушерства и гинекологии» (Тернополь, 2011); 15-й международной научно-практической конференции «Клинические и фунда-
ментальные аспекты репродуктивных проблем и здоровья женщины» (Кемерово, 2011); XVI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Париж, Франция, 2011).
По теме диссертации опубликовано 37 научных работ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 204 русскоязычных источника и 345 источников на иностранных языках. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 85 рисунками, изложена на 308 страницах машинописного текста.
Положения, выносимые на защиту
1. Эритродиерез имеет важное значение в поддержании эритро-цитарного равновесия как у взрослых крыс, так и в раннем постна-тальном периоде.
2. В регуляции клеточного эритродиереза участвует оксид азота, способствующий дозозависимой активации эритрофагоцитоза.
3. Эритродиерез потомства в раннем постнатальном онтогенезе крыс зависит от функционального состояния матери в период беременности и лактации.
4. В ранний постнатальный период наблюдаются особенности реактивности эритрона, связанные с наличием критических периодов его развития.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы исследования
В экспериментах использовано 178 взрослых нелинейных крыс-самок массой 180-200г и 573 крысенка 1-28 дней жизни. Для получения животных с датированным сроком беременности использовался метод вагинальных мазков (Дыбан А. П. и др., 1975). Животные содержались в условиях вивария с соблюдением основных зоогигиени-ческих требований (Западнюк И. П. и др., 1983), получали сбалансированный рацион питания, имели свободный доступ к воде. Контроль
общего состояния животных осуществлялся по массе тела, концентрации лейкоцитов в периферической крови, лейкоцитарной формуле.
Исследовался клеточный состав периферической крови. Концентрации эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови определялись стандартными способами в камере Горяева. Для определения концентрации гемоглобина применялся унифицированный гемигло-бинцианидный метод с использованием гемоглобинометра ГФЦ-04. Определение гематокрита производилось микрометодом с использованием гепаринизированных капилляров (производство фирмы "Medata АВ", Швеция) и центрифуги МЦГ-8. При подсчете количества ретикулоцитов использовался стандартный способ окраски мазков крови бриллианткрезилблау. Лейкоцитарная формула и процент ок-сифильных нормоцитов определялись в мазках крови, окрашенных азур-2-эозином по Романовскому. Абсолютное содержание эозино-филов подсчитывалось с помощью камеры Горяева (Пиралишви-ли И. С., 1962).
Для более детальной характеристики морфофункциональных особенностей циркулирующих эритроцитов производился расчет их морфометрических параметров: среднего содержания гемоглобина в эритроците (ССГЭ), средней концентрации гемоглобина в эритроците (СКГЭ), среднего объема эритроцита (СОЭр) (Любина А. Я. и др., 1984), исследовалась кислотная, глицериновая, осмотическая, пере-кисная и механическая резистентность мембраны. Для оценки способности эритроцитов противостоять воздействию 0,004Н раствора соляной кислоты (Гительзон И. И., Терсков И. А., 1959), 0,ЗМ раствора глицерина (Ефименко А. М., Ширяев В. В., Купреенко В. И., 1980), пониженного осмотического давления (Valbonesi М. et al., 1983) при помощи специального устройства, состоящего из термоста-тируемой кюветы (в ней поддерживалась температура 24° С), ультратермостата УТ-15, фотоэлектроколориметра ФЭК-56М, регистрирующего потенциометра КСП-4, регистрировалась кинетика разрушения красных клеток крови. Перекисная резистентность исследовалась с использованием тест-набора для определения перекисного гемолиза (НПО "Реакомплекс", Чита). Для оценки механической стойкости эритроцитов использовалось механическое воздействие с применением магнитной мешалки. Определение степени гемолиза в обо-
их случаях производилось с помощью фотоэлектроколориметра КФК-4. Как один из критериев оценки структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов исследовалась их поверхностная ци-тоархитектоника (Козинец Г. И., Симварт Ю. А., 1984). Условия фиксации эритроцитов для последующего исследования их формы были оптимизированы нами в специальной серии исследований (Миронова А. А. и др., 1994). Подсчет клеток производился с использованием фазово-контрастного светового микроскопа "Люмам-Р1" под иммерсией.
Для оценки биохимических свойств мембраны эритроцитов определялось соотношение холестерин/фосфолипиды и уровень пере-кисного окисления липидов (ПОЛ). Анализ липидных фракций производился по данным тонкослойной хроматографии эритроцитов с использованием пластин с силикагелем (Ростовцев В. Н., Резник Г. Е., 1982). ПОЛ оценивалось по содержанию малонового диальде-гида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК). Наличие МДА определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой, ДК — спектрофотометриче-ским методом (Ржевская О. Н., Коровина Н. А., 1984). Исследование биохимических свойств мембраны эритроцитов проведено совместно с сотрудниками лаборатории биохимии и хроматографии НИЦ ГБОУ ВПО ИвГМА Минздрава России.
Для оценки клеточных механизмов эритродиереза использована методика исследования клеточного гемолиза in vitro в краткосрочных культурах макрофагов с аутологичными эритроцитами (Федорова М. Ю., Назаров С. Б., 1996; Mantovani В., 1987). Интенсивность внутриклеточного гемолиза оценивалась по проценту макрофагов, образующих розетки с разным количеством эритроцитов. Для характеристики завершенного фагоцитоза проводилась бензидиновая реакция на внутриклеточный гемоглобин (Хейкоу Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983). В специальной серии экспериментов совместно с Мясоедовой Е. Е. исследовали особенности и механизмы влияния оксида азота на фагоцитоз эритроцитов перитонеальными макрофагами. Исследование проводилось в специальных боксах для культур клеток (БП-4-005). 100, 400 и 800 мкмоль/л растворы L-аргинина служили источниками эндогенного оксида азота (Ignarro J., Buga G. M., Wood К. S., 1987; Ischiropoulos H. et al., 1992). В качестве донатора экзогенного оксида азота применяли растворы нитропруссида натрия в концен-
трациях 10, 100, 1000 мкмоль/л (Ванин А. Ф., 2000; Викторов И. В., 2000; Осипов А. Н. и др., 2000; Ignarro J., Buga G. M., Wood К. S., 1987; Radomski M. W., Palmer R. M., Moneada S., 1990). Для уточнения локализации эффекта оксида азота осуществляли дифференцированное воздействие раствора нитропруссида натрия с концентрацией 100 мкмоль/л на эритроциты и перитонеальные макрофаги, которые затем инкубировали с соответствующими интактными клетками.
Определение содержания нитрат-ионов в биологических жидкостях производилось с помощью метода потенциометрического исследования (Скуг Д., Уэст Д., 1979) при использовании ионоселективно-го электрода (НИИ химии СПГУ) на иономере ЭВ-74. Концентрацию нитрит-ионов исследовали как суммарный показатель содержания нитратов и нитритов в сыворотке крови с использованием методики восстановления нитрат-ионов и окрашивания реактивом Грисса (Miranda К. М., Espey М. G-, Wink D. А., 2001). Последующее определение производилось с помощью спектрофотометра. Исследование содержания метаболитов оксида азота проведено совместно с сотрудниками лаборатории биохимии и хроматографии НИЦ ГБОУ ВПО ИвГМА Минздрава России.
Для создания модели острой постгеморрагической анемии проводилось кровопускание из подъязычной вены в объеме 2,5% от массы (Ивасивка С. В. и др., 1989). Экспериментальная полицитемия воспроизводилась двукратным, с интервалом 24 часа, введением 80% суспензии эритроцитов внутрибрюшинно в количестве 2% массы тела (Байшукурова А. К., 1980). Через сутки после кровопотери и последней трансфузии эритроцитов оценивали концентрацию эритроцитов, гемоглобина, содержание ретикулоцитов, гематокрит, концентрацию лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, поверхностную цито-архитектонику эритроцитов, эритрофагоцитарную активность пери-тонеальных и селезеночных макрофагов, концентрацию нитрат-ионов в перитонеальной жидкости, суспензии селезеночных клеток, крови, супернатанте культур перитонеальных и селезеночных макрофагов после культивирования их с аутологичными эритроцитами.
Для воспроизведения острой нитритной интоксикации крысятам 5, 14, 21 и 28 дней жизни подкожно вводили раствор нитрита натрия из расчета 50 мг/кг (Овчинников В. В., 1967; Гоженко А. И., Дорен-ский В. С., Рудина Е. И., 1996; Реутов В. П. и др., 1997). Через час после введения определяли концентрацию эритроцитов, гемоглобина,
гематокрит, содержание ретикулоцитов, исследовали поверхностную цитоархитектонику эритроцитов, фагоцитарную активность перито-неальных макрофагов, концентрацию нитрат-ионов в гемолизате крови.
При создании модели хронической нитритной интоксикации матери крысят экспериментальной группы с первого дня беременности и в течение всего периода лактации получали 0,2% раствор нитрита натрия вместо питьевой воды (Roth А. С. et al., 1987). В 5, 14, 21 и 28 дней жизни у крысят исследовали концентрацию эритроцитов, гемоглобина, гематокрит, содержание ретикулоцитов, поверхностную цитоархитектонику эритроцитов периферической крови, фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. В сыворотке крови измеряли содержание нитрит-ионов.
Иммобилизационный стресс моделировался путем ежедневной 2,5-часовой иммобилизации в индивидуальных пластиковых клетках-пеналах в течение всей беременности (Серова JI. В., 1988). Для оценки реактивности беременных крыс к стрессу в 1-й, 5-й, 10-й, 15-й и 20-й дни беременности у животных опытной и контрольной групп определялись следующие показатели периферической крови: концентрация лейкоцитов, лейкоцитарная формула, концентрация эозино-филов, концентрация эритроцитов, концентрация гемоглобина, показатель гематокрита, содержание ретикулоцитов. Эритрон потомства крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу, исследовался в 1-й, 5-й, 10-й, 21-й и 28-й дни жизни, все показатели сравнивались с аналогичными параметрами крысят контрольной группы и контрольной группы взрослых животных.
Забор крови у взрослых крыс для исследования состава периферической крови и резистентности мембраны эритроцитов к гемолитическим воздействиям производился из насечки хвоста, в других случаях — из подъязычного венозного сплетения. Забор крови у крысят производился из общего кровотока после декапитации. В качестве антикоагулянта использовался С-гепариноид ("Спофа", Чехия). Эвтаназия осуществлялась посредством дислокации шейных позвонков.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием электронных таблиц Excel, Statistica. Рассчитывались среднее арифметическое, среднее квадратическое отклонение, ошибка среднего; достоверность различий между выборками оценивалась при помощи t-критерия Стьюдента (Лакин Г. Ф., 1980). В ряде
случаев для выявления достоверности различий использовались непараметрические критерии. Проводился анализ парных коэффициентов корреляции.
Особенности клеточного эритродиереза у крыс в условиях нарушения эритроцитарного равновесия
Острая постгеморрагическая анемия характеризуется значительным снижением концентрации эритроцитов, гемоглобина, гематокрита. Увеличивается относительное и абсолютное содержание ретику-лоцитов, отрицательно коррелируя с концентрацией гемоглобина и гематокритом. Это обусловлено ускоренным выходом эритроцитар-ных клеток из красного костного мозга (Al-Huniti N. Н. et al., 2005) и, как правило, сопровождается появлением эритроцитов с измененными свойствами, приводя к их ускоренной элиминации, что может усугубить анемию (Chan J. Y. et al., 2001). Выявлено уменьшение СОЭр при неизменном ССГЭ и увеличении СКГЭ, отражающее повышение плотности клетки в результате дегидратации (С. Б. Назаров, JI. С. Горожанин, 1996), что является одним из признаков старения (Bookchin R. М. et al., 2000). Полицитемия проявляется значительным увеличением концентрации эритроцитов, гемоглобина, гематокрита с одновременным выраженным снижением относительного и абсолютного содержания ретикулоцитов.
Острая кровопотеря и полицитемия сопровождаются аналогичными неспецифическими изменениями лейкоцитарного состава крови, характеризующими стресс-реакцию, возникающую при данных функциональных состояниях (Горизонтов П. Д., Белоусова О. И., Федотова М. И., 1983). В том и в другом случае наблюдаются относительные нейтрофилез и лимфоцитопения. При острой кровопотере также уменьшается процент эозинофилов. Изменения поверхностной цитоархитектоники тоже имеют неспецифический характер. Так, при кровопотере возрастает содержание обратимо деформированных эритроцитов с гребнем на фоне повышения индекса обратимости (ИО). При полицитемии значительно уменьшается процент дискоци-тов, увеличивается содержание эритроцитов с множественными выростами из группы обратимо деформированных и ИО. Эхиноцитар-ная трансформация эритроцитов является наиболее частым морфологическим признаком старения (Bessis М., Lessin L. S., 1970). Однонаправленные изменения формы эритроцитов могут отражать особен-
ности проявления общего адаптационного синдрома со стороны системы крови. С другой стороны, могут быть следствием ускоренного эритропоэза при постгеморрагической анемии или являться результатом повреждающего действия производных оксида азота.
Полученные данные демонстрируют существенные различия эритрофагоцитарной активности перитонеальных и селезеночных макрофагов и могут свидетельствовать о неодинаковом функциональном значении N0 в их активации (рис. 1).
1 2 3 4 5 6 7 8
Параметры эритрофагоцитоза
■ перитонеальные макрофаги
■ селезеночные макрофаги
Рис. 1. Эритрофагоцитарная активность перитонеальных и селезеночных макрофагов у крыс
Примечание: по оси абсцисс - макрофаги, не образующие розеток (1), образующие розетки 1-го (2), 2-го (3), 3-го (4), 4-го (5) типа, нефаго-цитирующие макрофаги (6), макрофаги с фагосомами (7), макрофаги с включениями (8);
* - статистически значимые различия (р < 0,05).
Активность селезеночных макрофагов у интактных крыс выше, чем перитонеальных, что находит отражение в достоверно меньшем количестве селезеночных макрофагов, не образующих розеток, боль-
шем содержании макрофагов, образующих розеткоподобные структуры с 3-мя и более эритроцитами, а также меньшем проценте макрофагов, не участвующих в эндоцитозе, и большей доле макрофагов с фагосомами.
Постгеморрагическая анемия сопровождается устранением указанных различий вследствие некоторого повышения способности пе-ритонеальных макрофагов к адгезии и эндоцитозу, а также тенденции к уменьшению активности селезеночных макрофагов. Это подтверждается наличием отрицательной корреляционной связи между содержанием перитонеальных макрофагов с включениями гемоглобина в цитоплазме и показателями красной крови (концентрацией гемоглобина, гематокритом). Концентрация эритроцитов прямо коррелирует с количеством не образующих розеток селезеночных макрофагов и обратно - с содержанием селезеночных макрофагов с включениями, что свидетельствует о значении эритропении в механизме поддержания активности клеточного эритродиереза. Прямая корреляционная зависимость процента перитонеальных макрофагов с включениями от относительного содержания ретикулоцитов подтверждает предположение о появлении неполноценных клеток, способствующих увеличению активности клеточного гемолиза.
Через сутки после острой кровопотери уменьшается концентрация нитрат-ионов в исследуемых жидкостях, отрицательно коррелируя с показателями фагоцитарной активности перитонеальных и селезеночных макрофагов. Это, возможно, связано с истощением N0-продуцирующих систем. Прямые корреляционные связи концентрации эритроцитов и содержания нитратов в крови, супернатанте культур перитонеальных и селезеночных макрофагов с аутологичными эритроцитами позволяют предположить уменьшение концентрации нитратов вследствие снижения количества эритроцитов, в норме обеспечивающих депонирование и транспорт метаболитов оксида азота (Dejam А. е1 а1., 2005; ШШпё I. М. е1 а1., 2009).
При полицитемии фагоцитарная активность селезеночных макрофагов снижается, что проявляется уменьшением процента розеток 1-го типа и макрофагов с фагосомами. Активность перитонеальных макрофагов не изменяется. Вероятно, их розеткообразующая способность поддерживается увеличением содержания обратимо трансформированных эритроцитов, о чем можно судить на основании прямой корреляционной связи процента розеток 2-го и 3-го типа с индексом
трансформации (ИТ) и индексом обратимой трансформации (ИОТ). Различия фагоцитарной способности перитонеальных и селезеночных макрофагов при полицитемии отсутствуют. Уменьшение эритрофа-гоцитарной активности селезеночных макрофагов, имеющих большое значение в реализации механизмов клеточного эритродиереза в целостном организме, по-видимому, отражает общую тенденцию к снижению интенсивности гемолиза при полицитемии. Это подтверждает мнение о ведущей роли эритродиереза как фактора дополнительной стимуляции эритропоэтической активности красного костного мозга и относительно меньшем участии этого процесса в восстановлении эритроцитарного равновесия при полицитемии. Полицитемия сопровождается значительным увеличением концентрации нитрат-ионов в исследуемых жидкостях, что, возможно, обусловлено антигенной стимуляцией макрофагов чужеродными эритроцитами (Moneada S., Palmer R. М. J., Higgs E. A., 1991). Это подтверждается обратной корреляционной взаимосвязью между концентрацией нитратов в крови и процентом селезеночных макрофагов, не содержащих фрагментов гемоглобина. Нельзя исключить, что увеличение количества оксида азота может отражать развитие тканевой гипоксии в результате критического возрастания вязкости крови при полицитемии.
Влияние оксида азота на клеточный эритродиерез in vitro
L-аргинин, эндогенный предшественник оксида азота, вызывает дозозависимый стимулирующий эффект. Выраженность эффекта возрастает при увеличении концентрации вещества, что отражается в основном на розеткообразующей способности макрофагов. Так, 100 мкмоль/л раствор способствует активации как начальных, так и заключительных этапов фагоцитоза. Это проявляется уменьшением процента розетконеобразующих макрофагов, увеличением количества розеток с 1 -го типа, снижением количества макрофагов без бензи-дин-позитивного материала, увеличением доли макрофагов с фагосо-мами и гемоглобиновыми включениями. L-аргинин в концентрации 400 мкмоль/л вызывает более выраженное уменьшение количества макрофагов, не образующих розеток. Общее количество адгезирую-щих макрофагов увеличивается вдвое, тогда как в предыдущем случае увеличение составляет 1,6 раза по сравнению с контролем. Повышение концентрации L-аргинина в культуральной среде
(800 мкмоль/л) приводит к дальнейшему увеличению степени адгезии эритроцитов макрофагами. Количество розеток 1-го, 2-го и 3-го типа достоверно превышает эффект L-аргинина в концентрации 100 мкмоль/л. Увеличивается по сравнению с контролем количество розеткоподобных структур не только 1-го, но и 2-го типа. В то же время используемые концентрации L-аргинина практически не влияют на способность макрофагов адгезироваться к стеклу.
Использование нитропруссида натрия как экзогенного донатора оксида азота также выявило его стимулирующее действие на эритро-фагоцитоз. Раствор в минимальной концентрации вызывает активацию как адгезии, так и эндоцитоза (увеличение количества розеток 1-го типа, количества макрофагов с фагосомами и гемоглобиновыми включениями). Наблюдаемое снижение числа розеток 2-го и 4-го типа может быть связано с активацией внутриклеточной фазы фагоцитоза, поскольку макрофаги в стадии эндоцитоза при данном способе окраски воспринимаются как неактивные клетки. Однако более высокие концентрации вещества стимулируют только начальные этапы фагоцитоза. Выраженность эффекта нарастает с увеличением концентрации. Процентное содержание макрофагов, образующих розетко-подобные структуры с аутологичными эритроцитами, при использовании растворов нитропруссида натрия в концентрациях 100 и 1000 мкмоль/л возрастает по сравнению с контролем в 1,5 и 1,7 раза соответственно. Тем не менее, показатели завершенного фагоцитоза не отличаются от контроля и снижены в сравнении с результатами для концентрации 10 мкмоль/л.
Нитропруссид натрия (100 мкмоль/л) специфически влияет как на макрофаги, так и на эритроциты. Инкубация макрофагов с нитро-пруссидом натрия приводит к активации в основном начальных этапов эритрофагоцитоза: повышается способность макрофагов адгезироваться к стеклу и образовывать розеткоподобные структуры с 1-2-мя аутологичными эритроцитами. Инкубация макрофагов в среде, содержащей оксид азота, повышает их рецепторную чувствительность за счет увеличения уровня циклогуанозинмонофосфата (цГМФ) (Bromberg Y., Pick Е., 1980). Показатели более поздних этапов фагоцитоза существенно не изменяются, хотя процент макрофагов, не содержащих бензидин-позитивного материала, уменьшается в сравнении с контролем. Значительная активация адгезии и эндоцитоза происходит в результате влияния NO на эритроциты. Эффект обработки
нитропруссидом натрия эритроцитов проявляется уменьшением количества розетконеобразующих макрофагов, увеличением процента розеток 1-го типа. Все характеристики внутриклеточного этапа свидетельствуют о выраженном повышении активности завершающих стадий фагоцитоза. Вероятно, оксид азота вызывает изменение мембраны эритроцита (Tsujita R., Shiraishi T., Kakinuma К., 1997), являясь индуктором перекисного окисления липидов (Wink D. A., Mitchell J. В., 1998). Это сопровождается увеличением фагоцитарной активности макрофагов (Mantovani В., 1987; Racca A., Biondi С., Cotorruelo С., 1999).
Характеристика эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Эритрон интактных новорожденных крысят характеризуется низкими значениями концентрации эритроцитов (рис. 2), гемоглобина, гематокрита на фоне повышенного содержания ретикулоцитов и ок-сифильных нормоцитов, что, наряду с двукратным увеличением СОЭр, является следствием высокой активности эритропоэза в прена-тальный период (Mohandas N. et al., 1980; Новожилов А. В., 2009).
■ ■■
5 10 21
Возраст (дни)
28
Рис. 2. Концентрация эритроцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Примечание (здесь и на рис. 3-6): * - статистически значимые различия с показателем взрослых крыс (Взр.)
Кислотная, осмотическая, механическая и перекисная резистентность эритроцитов однодневных животных превышает параметры взрослых крыс, что, вероятно, связано с увеличением удельного веса молодых клеток в периферической крови. Тем не менее, доля диско-цитов снижена (рис. 3), а процент обратимо деформированных эритроцитов повышен. Количество предгемолитических форм коррелирует с содержанием в крови оксифильных нормоцитов.
% 90 7
Взр. 1 5 10 21 28
Возраст (дни)
Рис. 3. Содержание дискоцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Высокая концентрация продуктов ПОЛ, отражающая напряжение липидного метаболизма, прямо корреляционно взаимосвязана с соотношением холестерин/фосфолипиды, что свидетельствует о дестабилизации эритроцитарной мембраны. Выявленные особенности сопровождаются активацией эритродиереза: количество розеток 1-го типа превышает показатель взрослых животных (рис. 4).
Концентрация эритроцитов до 10-го дня жизни практически не изменяется, тогда как происходит уменьшение содержания ретикуло-цитов и оксифильных нормоцитов. У 5-дневных крысят высокая резистентность эритроцитарной мембраны к растворам соляной кислоты, глицерина, пониженному осмотическому давлению. Увеличение интенсивности перекисного гемолиза, прямо коррелирующей с концентрацией ретикулоцитов, свидетельствует о недостаточной антиок-
сидантной активности незрелых эритроцитов. К 5-му дню жизни происходит некоторое повышение процента дискоцитов, снижение содержания обратимо деформированных эритроцитов и увеличение концентрации предгемолитических форм. Активность клеточного гемолиза также возрастает, о чем можно судить по увеличению количества перитонеальных макрофагов, формирующих розеткоподоб-ные структуры с аутологичными эритроцитами.
%
35 30 25 20 15 10
Взр.
5 10 21 Возраст (дни)
Рис. 4. Количество макрофагов, образующих розетки 1-го типа в раннем постнатальном онтогенезе крыс
В 10 дней жизни концентрация ретикулоцитов достигает своего минимального значения, соответствуя показателю взрослых животных. Содержание в крови оксифильных нормоцитов продолжает снижаться. СОЭр и СКГЭ превышают параметры взрослых крыс. ССГЭ максимально для исследуемого возрастного периода, положительно коррелирует с содержанием в крови дискоцитов, отрицательно- с концентрацией необратимо деформированных эритроцитов, которая, в свою очередь, отрицательно взаимосвязана со СОЭр. Содержание обратимо деформированных клеток имеет тенденцию к снижению, не отличается от показателя взрослых крыс и прямо коррелирует с концентрацией ретикулоцитов. Возможно, молодые эритроциты в большей степени склонны к обратимой трансформации. У 10-дневных животных кислотная и осмотическая резистентность
повышена, как и в предшествующей возрастной группе. Однако процент перекисного гемолиза превышает уровень крысят 5-го дня жизни, а содержание продуктов ПОЛ максимально, вероятно, вследствие недостаточной эффективности антиоксидантных систем эритроцитов. В то же время, интенсивность клеточного эритродиереза низкая, о чем свидетельствует увеличение количества нефагоцитирующих макрофагов и минимальное для исследуемых возрастных групп содержание макрофагов с включениями (рис. 5), что может быть связано с
улучшением качественного состава популяции эритроцитов.
%
30 -г----—-
Взр. 1 5 10 21 28 Возраст (дни)
Рис. 5. Количество макрофагов с включениями в раннем постна-тальном онтогенезе крыс
В постнатальном развитии эритрона белых крыс 21-й день жизни является одним из критических периодов (Назаров С. Б., Горожанин Л. С., 1996). К 21-дневному возрасту происходит нарастание концентрации эритроцитов и ретикулоцитов, отражая повышение активности эритропоэза, обусловленное качественно новым уровнем регуляции в связи с увеличением выработки эритропоэтина в почках (Peschle С. et al., 1975; Fricol W., Barone-Varelas J., Barone Т., 1982). На фоне повышенной гемолитической резистентности практически ко всем применяемым воздействиям у 21-дневных крысят выявлена минимальная устойчивость эритроцитарной мембраны к перекисному гемолизу с одновременным снижением содержания продуктов ПОЛ. Процент дискоцитов и обратимо деформированных эритроцитов не
отличается от показателей взрослых животных при повышенном содержании необратимо деформированных клеток. Это сопровождается активацией клеточного гемолиза, о чем свидетельствует увеличение количества макрофагов с гемоглобиновыми включениями.
В 28 дней жизни концентрация эритроцитов, гемоглобина и гематокрит интактных крысят так и не достигают показателей взрослых животных на фоне увеличения содержания ретикулоцитов. Снижаются показатели кислотной, глицериновой, осмотической и механической резистентности эритроцитов, приближаясь к уровню взрослых животных. Процент перекисного гемолиза по-прежнему повышен, прямо коррелируя с концентрацией эритроцитов и отрицательно — с содержанием ретикулоцитов. Количество продуктов ПОЛ продолжает уменьшаться. Процент дискоцитов снижается, а количество обратимо деформированных эритроцитов возрастает по сравнению с 21-м днем жизни, не отличаясь при этом от показателей взрослых животных. Отмечается снижение общего количества розеткообра-зующих макрофагов, увеличение процента нефагоцитирующих макрофагов, уменьшение количества макрофагов с фагосомами и включениями, свидетельствуя о снижении активности клеточных механизмов эритродиереза.
Влияние нитритной интоксикации на эритрон в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Однократное введение нитрита натрия в дозе 50 мг/кг крысятам исследуемого возрастного периода не приводит к летальному исходу. В 5-дневном возрасте острая нитритная интоксикация проявляется уменьшением гематокрита (рис. 6), прямо коррелирующим с процентом оксифильных нормоцитов, и снижением относительного содержания ретикулоцитов. Концентрация нитрат-ионов в гемолизате повышена. У экспериментальных крысят этой возрастной группы процент дискоцитов существенно больше контрольного показателя, отрицательно коррелирует с содержанием оксифильных нормоцитов и необратимо деформированных клеток, а ИТ и ИОТ снижены. Возможно, поддержание концентрации эритроцитов обеспечивается выходом их из депо. На фоне меньшей численности клеток-предшественников эритроцитов снижается способность макрофагов образовывать розетки с аутологичными эритроцитами in vitro (рис.7).
■ контроль ■ ОПЫТ
Рис. 6. Влияние острой нитритной интоксикации на гематокрит в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Примечание (здесь и далее): * - статистически значимые различия.
5 14 21 28
Возраст (дни)
14
21
28
Возраст (дни) ■ контроль ■ опыт
Рис. 7. Влияние острой нитритной интоксикации на количество макрофагов, образующих розетки 1-го типа, в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Это может быть обусловлено как уменьшением количества поврежденных клеток, так и дисфункцией фагоцитов в условиях высокого содержания оксида азота. Выявленное уменьшение процента нейтро-
филов, возможно, связано с миграцией лейкоцитов в гипоксически поврежденные ткани (Цой Е. М., Коваленко Р. И., Кузьмин Д. А., 2008).
В 14-дневном возрасте острая нитритная интоксикация сопровождается увеличением концентрации эритроцитов, содержания гемоглобина и показателя гематокрита на фоне большего поступления в кровоток оксифильных нормоцитов и значительного повышения абсолютного содержания ретикулоцитов. В условиях ускоренного выхода из красного костного мозга незрелых форм эритроцитов увеличивается интенсивность клеточного эритродиереза, что проявляется уменьшением количества макрофагов, не образующих розеток, и повышением процента розеток 1-го типа. Наличие положительной корреляционной взаимосвязи содержания гемоглобина с процентом стоматоцитов, а также обратной взаимозависимости между количеством эритроцитов с гребнем и процентом неадгезирующих макрофагов подтверждает активацию гемолиза в связи появлением клеток с измененными морфофункциональ-ными свойствами. Вместе с тем продукты гемолиза способствуют поддержанию уровня эритропоэза.
В результате инъекции нитрита натрия у 21-дневных крысят снижается гематокрит при одновременном увеличении СОЭр. Прослеживается отрицательная корреляционная связь показателя гематокрита с относительным содержанием ретикулоцитов, процентом макрофагов 1-го типа и с гемоглобиновыми включениями в цитоплазме, что указывает на тенденцию к активации как эритропоэза, так и эритродиереза. Этот возраст у крыс наряду с 5 днем жизни является одним из критических периодов становления эритрона, когда он наиболее подвержен неблагоприятным влияниям. Наблюдаются лейкопения, возможно, связанная с миграцией лейкоцитов в ткани, и относительная эозинофилия, вероятно, являющаяся маркером аллергенного действия метаболитов N0 или продуктов гипоксического повреждения тканей. В 28 дней введение нитрита натрия не вызывает изменений эритрона, вероятно, благодаря достаточной зрелости адаптивных механизмов. Повышается содержание эозинофилов, процент лимфоцитов падает.
Изменения исследуемых показателей у потомства матерей, подвергнутых хронической нитритной интоксикации в период беременности и лактации, в отличие от острого эффекта нитрита натрия имеют в основном адаптивный характер и способствуют ограничению
действия производных оксида азота на эритрон. В 5-дневном возрасте отмечается высокая эритропоэтическая активность. Это проявляется увеличением количества ретикулоцитов и оксифильных нормоцитов, показатели относительного содержания которых прямо коррелируют. Одновременно имеет место активация гемолиза: существенное увеличение процента розеток 4-го типа (рис. 8). Концентрация эритроцитов превышает показатель крысят с острой интоксикацией (рис. 9). Значительное увеличение количества дискоцитов, более выраженное, чем при острой интоксикации, снижение процента обратимо трансформированных клеток, ИТ, ИОТ, ИНОТ (индекса необратимой трансформации) в целом свидетельствует о сбалансированности эритроцитарного равновесия с некоторым преобладанием регенеративного компонента. Относительные нейтропения, эозинопения, мо-ноцитопения могут быть следствием цитостатического эффекта метаболитов N0 на уровне красного костного мозга или миграции фагоцитов в ткани (Цой Е. М., 2009).
Благодаря высокой интенсивности эритропоэза, выражающейся в повышенном относительном содержании ретикулоцитов, прямо коррелирующем с их концентрацией, к 14-му дню жизни у крысят опытной группы гематокрит превышает контрольное значение, положительно коррелируя с концентрацией эритроцитов.
%
6 5 4 3 2 1 О
5
14
21
28
Возраст (дни) ЕЗ контроль ■ опыт
Рис. 8. Влияние хронической нитритной интоксикации на количество макрофагов, образующих розетки 4-го типа
Т/л
5 4 3 2 1 О
5 14 21 28
Возраст (дни) 0 острая интоксикация ■ хроническая интоксикация
Рис. 9. Влияние острой и хронической нитритной интоксикации на концентрацию эритроцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Содержание дискоцитов повышено как по сравнению с нормой, так и с показателем, характеризующим острую интоксикацию, а процент обратимо деформированных эритроцитов и дегенеративных форм - уменьшен. Концентрации эритроцитов и гемоглобина при хронической нитритной интоксикации ниже, чем при острой, а содержание ретикулоцитов выше (рис. 10). Отмечается увеличение СОЭр при одновременном снижении СКГЭ и неизменном ССГЭ, возможно, вследствие выхода в кровоток макроретикулоцитов с недостаточной степенью гемоглобинизации. В отличие от острой интоксикации отсутствует увеличение фагоцитарной способности пери-тонеальных макрофагов. Это может быть обусловлено более благоприятным качественным составом эритроцитов или нарушением функциональной активности макрофагов. Тем не менее, наличие отрицательной корреляционной связи СОЭр с количеством макрофагов без фрагментов гемоглобина и положительных с процентом эритроцитов с 1 выростом и количеством предгемолитических форм в виде спущенного мяча дает основание предполагать возможную инициацию гемолиза, направленную на элиминацию эритроцитов с неадекватными морфофункциональными свойствами. В лейкоцитарной
III
формуле кроме относительной нейтропении и эозинопении выявляется лимфоцитоз, являющийся признаком интоксикации.
%0 *__
I I I I
5 14 21 28
Возраст (дни)
0 острая интоксикация ■ хроническая интоксикация
Рис.10. Влияние острой и хронической нитритной интоксикации на содержание ретикулоцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Неблагоприятное влияние хронического оксидативного стресса проявляется декомпенсацией адаптационно-приспособительных реакций, связанной с прохождением эритрона через критический период развития. В 21-дневном возрасте, как и при острой интоксикации, гематокрит ниже контрольного значения. Но концентрация ретикулоцитов при хронической интоксикации значительно больше. Содержание дискоцитов по-прежнему превышает контрольный показатель на фоне меньшего процента эритроцитов с гребнем, прямо коррелирующего с численностью розеток 3-го и 4-го типа, а также общим количеством необратимо деформированных эритроцитов. Концентрация нитритов в сыворотке крови значительно повышена по сравнению с контрольным значением. Хроническая интоксикация, как и в предыдущих возрастных группах, проявляется относительной ней-тропенией, моноцитопенией и увеличением процента лимфоцитов.
350 300 250 200 150 100 50 0
У 28-дневных крысят уже не отмечается негативных изменений эритрона. Поверхностная цитоархитектоника эритроцитов характеризуется особенностями, аналогичными описанным для крысят младшего возраста: существенно повышен процент дискоцитов за счет уменьшения количества обратимо деформированных клеток, которое меньше как по отношению к контрольному показателю, так и к аналогичному показателю крысят с острой нитритной интоксикацией. Изменения морфофункциональных свойств эритроцитов можно расценивать как проявление долговременной адаптации эритрона. В лейкоцитарной формуле сохраняются такие признаки интоксикации как нейтропения и лимфоцитоз.
Особенности эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс как результат формирования эритрона в функциональной системе мать-плод, подвергнутой иммобилизационному стрессу
Постиммобилизационное снижение концентрации лимфоцитов и эозинофилов в периферической крови беременных крыс практически во все сроки исследования свидетельствует о стресс-реакции. При наличии в лейкоцитарной формуле абсолютный нейтрофилез отсутствует в связи с развитием лейкопении и снижением гематокрита. В 5-й день беременности отмечается снижение чувствительности к стрессу (постиммобилизационные изменения концентрации лимфоцитов, эозинофилов, лейкоцитов и гематокрита не достоверны). Уменьшение специфических показателей в более поздние сроки можно рассматривать как результат вторичного снижения резистентности, характерное для стадии истощения общего адаптационного синдрома. Это подтверждается тенденцией к уменьшению концентрации лимфоцитов и эозинофилов. Независимо от иммобилизации во второй половине беременности снижаются концентрация гемоглобина и гематокрит. У экспериментальных крыс достоверный характер носит и фоновое уменьшение содержания эритроцитов. Отмеченные показатели не опускаются ниже контрольных значений группы взрослых животных и описанных в литературе нормативов красной крови интактных белых крыс (Музуров И. В., Власов В. И., Лукачев Н. В., 1989).
У потомства крыс, подвергнутых серии иммобилизаций, при рождении снижена масса тела, что отражает влияние пренатального
стресса на развитие плода. Содержание гемоглобина (рис. 11) и гематокрит повышены по сравнению с интактными крысятами. Более выражен ретикулоцитоз. Концентрация эритроцитов не отличается от контроля, а оксифильных нормоцитов несколько снижена.
1 5 10 21 28
Возраст (дни) -контроль -- опыт
Рис. 11. Влияние пренатального стресса на концентрацию гемоглобина в раннем постнатальном онтогенезе крыс
Устойчивость мембраны эритроцитов однодневных крысят к большинству гемолитических факторов соответствует контролю, кислотная резистентность снижена. Уменьшение процента деформированных эритроцитов, более низкая интенсивность клеточного гемолиза (больший процент макрофагов, не образующих розеток) могут свидетельствовать об улучшении качественного состава популяции эритроцитов (рис. 12).
Концентрация эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, гематокрит снижаются к 5-дневному возрасту при относительно стабильном содержании оксифильных нормоцитов. Глицериновая и осмотическая резистентность эритроцитов не изменяются, тогда как в контроле наблюдается их увеличение. Концентрация дискоцитов по-прежнему повышена (рис. 13). Снижено содержание МДА в эритроцитах, свидетельствуя о меньшей активности ПОЛ. Интенсивность
клеточного гемолиза ниже контрольной (меньше количество макрофагов, образующих розетки).
Возраст (дни) -контроль -- опыт
Рис. 12. Влияние пренатального стресса на количество макрофагов, не образующих розеток, в раннем постнатальном онтогенезе крыс
%
Возраст (дни)
-контроль -- опыт
Рис. 13. Влияние пренатального стресса на содержание дискоци-тов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
BIO дней жизни концентрация эритроцитов больше средневозрастной (рис. 14). Содержание дискоцитов уменьшается по сравнению с 5-м днем. Концентрация ретикулоцитов повышена вследствие снижения контрольного показателя. Относительное содержание ретикулоцитов возрастает, также превышая контроль, а концентрация окси-фильных нормоцитов значительно уменьшается.
Возраст (дни) -контроль -- опыт
Рис. 14. Влияние пренатального стресса на концентрацию эритроцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс
У 10-дневных крысят по сравнению со средневозрастными параметрами снижены кислотная резистентность эритроцитов и время 50% (150) осмотического гемолиза. Интегральный показатель эритро-граммы (ИП) и г50 глицеринового гемолиза не отличаются от контроля, но меньше, чем у взрослых крыс, тогда как параметры интактных крысят соответствуют уровню взрослых. Содержание МДА в эритроцитах возрастает в меньшей степени, чем в контроле. Содержание ДК уменьшается. Меньший уровень перекиси ого окисления липидов может быть обусловлен большей активностью антиоксидантных ферментов, что связано с циркуляцией в крови более зрелых клеток. Наличие прямой корреляционной взаимосвязи концентрации МДА с соотношением холестерин/фосфолипиды, а также отрицательной связи с интегральным показателем осмотической резистентности эритроци-
тов свидетельствует о более стабильном состоянии липидного метаболизма красных клеток крови опытных животных.
21-й день жизни экспериментальных крысят характеризуется меньшим увеличением концентрации эритроцитов по сравнению с контролем. Абсолютное содержание ретикулоцитов не отличается от предыдущего срока исследования, тогда как у интактных крысят оно вновь возрастает, что приводит к исчезновению достоверных различий. Относительное содержание ретикулоцитов достоверно больше контрольного значения, как и предшествующей возрастной группе. СОЭр уменьшается, однако превышает средневозрастной показатель. Эритроциты менее устойчивы в растворах соляной кислоты, глицерина, к осмотическому и перекисному гемолизу. По сравнению с предыдущим исследуемым сроком снижается только перекисная резистентность, но содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах практически не изменяется, не отличаясь от контроля. Содержание дискоци-тов возрастает параллельно уменьшению процента необратимо деформированных (предгемолитических) форм. Количество обратимо деформированных клеток не изменяется.
Большинство исследуемых показателей 28-дневных крысят, подвергнутых пренатальному стрессу, соответствует возрастным нормам за исключением меньшей концентрации гемоглобина, более низкой СКГЭ, укорочения 150 глицеринового гемолиза, повышенного процента перекисного гемолиза, увеличенной концентрации дискоцитов, меньшего содержания обратимо деформированных эритроцитов. Повышение процента дискоцитов сопровождается снижением интенсивности ПОЛ, отрицательно коррелируя с содержанием МДА в мембране. Концентрация ДК более низкая. Изменения, выявленные у крысят, матери которых во время беременности подвергались иммо-билизационному стрессу, отражают формирование системного структурного следа адаптации, что проявляется большей выраженностью и эффективностью эритропоэза у новорожденных и перестройкой клеточного метаболизма на более поздних этапах раннего постнатально-го онтогенеза.
ВЫВОДЫ
1. В реализации клеточного эритродиереза у взрослых интактных крыс большее значение имеют резидентные макрофаги селезенки по сравнению с перитонеальными, что проявляется более выраженной способностью к адгезии и эндоцитозу в реакции эритро-фагоцитоза с аутологичными эритроцитами in vitro. Нарушение эритроцитарного равновесия сопровождается исчезновением различий фагоцитарной активности перитонеальных и селезеночных макрофагов за счет некоторого повышения роли перитонеальных при кровопотере и снижения активности селезеночных в условиях полицитемии, отражающего общую тенденцию к уменьшению интенсивности клеточного гемолиза при этом функциональном состоянии.
2. В регуляции эритрофагоцитоза участвует оксид азота, влияние которого зависит от концентрации и источника вещества. Эндогенный донатор NO (L-аргинин) в диапазоне концентраций 100-800 мкмоль/л и экзогенный (нитропруссид натрия) в концентрациях 10-1000 мкмоль/л способствуют увеличению фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов in vitro в зависимости от количества в культуральной среде. Минимальные концентрации веществ стимулируют как адгезию, так и эндоцитоз ауто-логичных эритроцитов. Дальнейшее увеличение содержания предшественников оксида азота в среде сопровождается преимущественной активацией начальных стадий реакции (адгезии эритроцитов). Причем увеличение адгезионных свойств макрофагов в присутствии L-аргинина проявляется лишь при наличии эритроцитов как объекта инициации эритрофагоцитоза и не сопровождается повышением способности адгезироваться к стеклу.
3. Стимулирующее влияние экзогенного оксида азота характеризуется действием его и на макрофаги, и на эритроциты. Эффект нитропруссида натрия на перитонеальные макрофаги проявляется в основном повышением их адгезионной способности, тогда как обработка этим донатором NO эритроцитов приводит к значительной активации как адгезии, так и эндоцитоза, что обусловлено изменением морфофункциональных свойств эритроцитов, представляющих собой фактор естественной стимуляции эритрофагоцитоза.
4. В раннем постнатальном онтогенезе у крыс происходят сложные преобразования эритрона, проявляющиеся изменением процессов продукции и разрушения эритроцитов и связанными с этим особенностями состава красной крови. Увеличение резистентности эритроцитарной мембраны к большинству гемолитических факторов является следствием высокого содержания молодых клеток с низкой антиоксидантной активностью, о чем свидетельствует высокая интенсивность свободнорадикальных процессов. Активность клеточного эритродиереза в ранний постнатальный период возрастает параллельно увеличению интенсивности эритропоэза, обеспечивая элиминацию неполноценных клеток и способствуя становлению эритропоэтической функции костного мозга.
5. 21-й день жизни, один из критических периодов постнатального онтогенеза у крыс, характеризуется повторным увеличением интенсивности эритропоэза с образованием эритроцитов, практически не отличающихся по морфометрическим параметрам от эритроцитов взрослых животных. Одновременная активация эритродиереза способствует элиминации клеток, образованных в предшествующие возрастные периоды и не соответствующих по своим свойствам изменившимся потребностям организма.
6. Адаптация эритрона к острой нитритной интоксикации в раннем постнатальном онтогенезе у крыс представляет собой комплекс реакций на действие гипоксического стимула, направленный на обеспечение адекватного состава циркулирующих эритроцитов, что достигается оптимальным соотношением процессов эритропоэза и эритродиереза. Острая нитритная интоксикация по-разному проявляется у животных разных возрастных групп. Крысята 5-го дня жизни наиболее чувствительны к повреждающему действию N0 и его производных, что сопровождается более выраженным снижением содержания ретикулоцитов и показателя гематокрита на фоне возрастной депрессии эритропоэза, а также уменьшением адгезионной способности перитонеальных макрофагов. У 21-дневных животных эффект острой нитритной гипоксии проявляется отсутствием стимуляции эритропоэза и уменьшением гематокрита.
7. При хронической нитритной интоксикации у крысят происходят адаптивные изменения, способствующие повышению резистентности организма и ограничению неблагоприятного действия про-
изводных оксида азота на эритрон, что характеризуется увеличением интенсивности эритропоэза и стабильности эритроидных клеток с некоторым отставанием активности эритродиереза. В 21-дневном возрасте отмечается срыв адаптационных возможностей эритрона, проявляющийся низким значением показателя гематокрита.
8. Иммобилизационный стресс матери во время беременности влияет на характер и темпы формирования эритрона потомства. Концентрация эритроцитов и гемоглобина у потомства матерей, перенесших стресс, нарастает более медленно, чем у интактных животных, что свидетельствует о торможении развития эритрона. Депрессия эритропоэза приводит к развитию эритропении в 21-й день жизни.
9. Эритроциты крысят, матери которых во время беременности подвергались стрессу, характеризуются пониженной резистентностью к гемолитическим факторам, что наиболее выражено в 21-дневном возрасте. Поддержание численности эритроцитарной популяции потомства матерей, подвергнутых во время беременности стрессу, достигается в основном за счет уменьшения интенсивности клеточного эритродиереза, что, в свою очередь, может иметь неблагоприятное значение в связи с недостаточным стимулирующим эффектом на эритропоэз, приводя к нарушению его функциональной активности и торможению развития эритрона.
10. Нарушение эритроцитарного равновесия у взрослых крыс при острой кровопотере и полицитемии сопровождается характерными для стресс-реакции неспецифическими изменениями лейкоцитарного состава периферической крови и эхиноцитарной трансформацией эритроцитов. Гематологический стресс-синдром у беременных крыс наряду с типичными лимфо- и эозинопенией включает в себя лейкопению и уменьшение гематокрита.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Факторы, влияющие на поверхностную цитоархитектонику эритроцитов в процессе ее исследования / А. А. Миронова, Е. К. Го-лубева, О. А. Пахрова, С. Б. Назаров // Клиника, диагностика и лечение микроциркуляторных нарушений при соматических заболеваниях взрослых и детей: сб. науч. трудов. - Иваново, 1994. — С.21-25.
2. Динамика показателей красной крови беременных крыс при им-мобилизационном стрессе / Е. К. Голубева // Вестник Ивановской медицинской академии. - 1996. - Т. 1, № 2. - С. 97.
3. Влияние иммобилизационного стресса матери во время беременности на гемолитическую резистентность эритроцитов потомства/ Е. К. Голубева, Л. С. Горожанин, С. Б. Назаров // Вестник Ивановской медицинской академии. - 1997. -Т. 2, № 1-2. - С. 3538.
4. Участие клеточных механизмов эритродиереза в раннем постна-тальном становлении эритрона в норме и у потомства матерей, подвергнутых во время беременности иммобилизации / Е. К. Голубева, Л. С. Горожанин, С. Б. Назаров // Вестник Ивановской медицинской академии. - 1997. - Т. 2, № 3. - С. 27-31.
5. Некоторые особенности биохимического состава эритроцитарной мембраны потомства матерей, перенесших стресс во время беременности / Е. К. Голубева, Л. С. Горожанин, Л. Л. Хомякова, Э. С. Акайзин, С. Б. Назаров // Вестник Ивановской медицинской академии. - 1997. - Т. 2, № 4. - С. 143.
6. Функциональная эритроцитарная система и ее исследование в онтогенезе / С. Б. Назаров, Л. С. Горожанин, О. А. Пахрова, Е. К. Голубева, Л. А. Полумискова, А. Н. Булыгин, Т. А. Блохи-на// Матер. XVII съезда Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова. - Ростов-на-Дону, 1998. - С. 156.
7. Особенности гематологических показателей у беременных крыс при стрессе / Е. К. Голубева, Л. С. Горожанин, С. Б. Назаров // Вестник Ивановской медицинской академии. - 1998. — Т. 3, № 3. — С. 26-28.
8. Эритродиерез в раннем постнатальном онтогенезе белых крыс в норме и у потомства матерей, перенесших стресс во время беременности / Е. К. Голубева // Медико-биологические, клинические и социальные вопросы здоровья и патологии человека: сб. науч. трудов. — Иваново, 1999. - С. 21—24.
9. Влияние уровня двигательной активности во время беременности на развитие эритрона плода и новорожденного у белых крыс / С. Б. Назаров, JI. С. Горожанин, Е. К. Голубева // Физиологические механизмы природных адаптаций: тез. докл. III Всероссийского международного симпозиума. — Иваново, 1999. — С. 115— 116.
10. Эритродиерез в раннем постнатальном онтогенезе белых крыс в норме и у потомства матерей, перенесших стресс во время беременности / Е. К. Голубева // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2000. - № 2 (12). -С. 149.
11. Физиологическая роль оксида азота в регуляции процесса эрит-рофагоцитоза у белых крыс in vitro / Е. Е. Мясоедова, Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Матер. XVIII съезда Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова. - Казань, 2001.-С. 169.
12. Роль оксида азота в механизме фагоцитоза эритроцитов перито-неальными макрофагами у белых крыс in vitro / Е. К. Голубева, Е. Е. Мясоедова // Матер. II Российской конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2001. - Т.П. -С. 277.
13. Оксид азота как стимулятор процесса эритрофагоцитоза у белых крыс in vitro / Е. К. Голубева, Е. Е. Мясоедова, С. Б. Назаров // Материалы международ, конф. «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 75-летию со дня рождения А. М. Уголева. - Санкт-Петербург, 2001. - С. 83-84.
14. Особенности эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе потомства белых крыс, перенесших стресс во время беременности / Е. К. Голубева, JI. С. Горожанин, С. Б. Назаров // Материалы международ, конф., посвященной 75-летию со дня рождения А. М. Уголева. - Санкт-Петербург, 2001. - С. 83.
15. Влияние оксида азота на эритрофагоцитоз у белых крыс in vitro / Б. Е. Мясоедова, Е. К. Голубева, О. А. Пахрова, М. В. Пророко-ва // Здравоохранение Башкортостана. - 2001. - № 8. - С. 46-48.
16. Влияние нитропруссида натрия на процесс фагоцитоза эритроцитов перитонеальными макрофагами у белых крыс / Е. Е. Мясоедова, Е. К. Голубева, М. В. Пророкова, С. Б. Назаров // Российский физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 2002. - Т. 88, № 1. - С. 32-37.
17. Влияние острой кровопотери на состояние клеточного эритро-диереза у крыс / Е. К. Голубева, М. В. Казак, С. Б. Назаров // Материалы III Всероссийской конференции с международ, участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 175-летию со дня рождения Ф. В. Овсянникова. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 74-75.
18. Оксид азота - регулятор внутриклеточных механизмов эритро-диереза / Е. К. Голубева, Е. Е. Мясоедова, С. Б. Назаров, М. В. Пророкова // Российский физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 2004. - Т. 90, № 8. - С. 144-145.
19. Характеристика клеточных механизмов эритродиереза после острой кровопотери у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Российский физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 2004. — Т. 90, №8.-С. 135.
20. Влияние острой кровопотери на состояние клеточных механизмов эритродиереза у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров, М. В. Казак // Российский физиол. журнал им. И. М. Сеченова. -
2004. -Т. 90, №9.-С. 1151-1155.
21. Оксид азота как один из факторов регуляции клеточного эритродиереза / С. Б. Назаров, Е. К. Голубева, Е. Е. Мясоедова, А. С. Иванова, М. В. Пророкова // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Сочи, Дагомыс,
2005. - Т. 1.-С. 92.
22. Характеристика клеточных механизмов эритродиереза при поли-цитемии у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Материалы международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Савелия Соломоновича Полтырева «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии». - Ярославль, 2005. - С. 15-16.
23. Состояние клеточных механизмов эритродиереза при острой гипоксии у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Природа и человек: Материалы IV научно-практической конференции «Природа и человек. Антропогенное воздействие на окружающую среду». -Иваново, 2005. - С. 84-86.
24. Влияние полицитемии на состояние клеточных механизмов эри-тородиереза и продукцию оксида азота у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Российский физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 2007. - Т. 93, № 3. - С. 283-288.
25. Влияние оксида азота на активность клеточного эритродиереза / Е. К. Голубева, А. С. Иванова, Е. Е. Мясоедова, О. А. Пахрова, С. Б. Назаров // Матер. XX съезда Всероссийского физиологического общества имени И. П. Павлова. - Москва, 2007. - С. 296.
26. Эритрофагоцитоз в раннем постнатальном онтогенезе у крыс в норме и после перенесенного пренатального стресса / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4 (13), № 4. - С. 383.
27. Особенности формирования эритрона в условиях хронической перинаталной нитритной интоксикации у крыс / Е. К. Голубева // Матер. XI международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни». - Москва, 2010. - С. 564-565.
28. Влияние острой нитритной интоксикации на эритрон в раннем постнатальном онтогенезе у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров// Вестник новых медицинских технологий. - 2011. -Т. XVIII, № 1.-С. 93-95.
29. Влияние хронической нитритной интоксикации матери на эритрон в раннем постнатальном онтогенезе у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Вестник Ивановской медицинской академии. -2011.-Т. 16, № 1.-С. 15-19.
30. Влияние пренатального иммобилизационного стресса на показатели клеточного состава периферической крови в раннем постнатальном онтогенезе у крыс / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Врач-аспирант. - 2011. -№ 1.2 (44). - С. 260-265.
31. Гематологические особенности потомства крыс, подвергнутых оксидативному стрессу при беременности и лактации / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Мать и дитя в Кузбассе. - 2011. -№ 1 (44). - С. 24-29.
32. Особенности постнатального эритроцитарного системогенеза крыс в условиях воздействия неблагоприятных факторов в период беременности и лактации / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Актуальні питання педіатріі, акушерства та гінекології. - 2011. — №2 (8).-С. 198-201.
33. Эритрофагоцитоз у потомства белых крыс, подвергаемых хронической нитритной интоксикации в период беременности и лактации / Е. К. Голубева, И. К. Томилова, Е. JI. Алексахина // Аллергология и иммунология. - 2011. - Т. 12, № 1. - С. 49.
34. Морфофункциональные и биохимические свойства эритроцитов в раннем постнатальном онтогенезе крыс в норме и после пренатального стресса / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров, И. К. Томилова // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. - 2011. - Т. 97, № 7. - С. 725-732.
35. Физиологические механизмы эритродиереза / Е. К. Голубева // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2011. - Т. 16, № 3. - С. 56-61.
36. Возрастные особенности резистентности эритроцитарной мембраны крыс к гемолитическим факторам in vitro / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // Вестник новых медицинских технологий. -2011. - Т. XVIII, № 4. - С. 93-95.
37. Постнатальные особенности эритродиереза у крыс как результат стрессорного воздействия на систему мать-плод / Е. К. Голубева, С. Б. Назаров // В мире научных открытий. - 2011. -№9.1 (21).-С. 315-324.
Подписано в печать 30.05.2013. Формат 60x84 1/16. Печать плоская. Печ. л. 2,5. Усл. печ. л. 2,3. Уч.-изд. л. 2,36. Заказ № 114т. Тираж 100 экз.
Изд. лицензия ЛР № 010221 от 03.04.1997 Отпечатано в ОАО «Издательство «Иваново».
153012, г. Иваново, ул. Советская, 49. Тел.: 32-47-43, 32-67-91. E-mail: riaivan37@mail.ru, www.ivanovo.ucoz.com
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Голубева, Елена Константиновна, Москва
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ИВАНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
_ „ _ _ На правах рукописи
05201351631
ГОЛУБЕВА Елена Константиновна
КЛЕТОЧНЫЙ ЭРИТРОДИЕРЕЗ И ЕГО ОСОБЕННОСТИ В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
У БЕЛЫХ КРЫС
03.03.01 - Физиология
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Назаров Сергей Борисович
Иваново - 2013
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................5
ВВЕДЕНИЕ..................................................................................7
ГЛАВА 1. ЭРИТРОДИЕРЕЗ КАК ФАКТОР ПОДДЕРЖАНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО РАВНОВЕСИЯ ВЗРОСЛОГО И РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ ОРГАНИЗМА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ АДАПТАЦИИ (обзор литературы).....................................................16
1.1. Эритроцитарное равновесие и его особенности в раннем постнатальном онтогенезе....................................................................................16
1.2. Механизмы старения эритроцитов................................................22
1.3. Оксидативный стресс и его влияние на эритрон...............................28
1.4. Механизмы разрушения эритроцитов.............................................31
1.5. Характеристика гематологических проявлений стресс-реакции............35
1.6. Влияние нитритной интоксикации на систему крови.........................41
1.7. Зависимость состояния эритрона потомства от функционального состояния матери во время беременности............................................49
1.8. Резюме...................................................................................53
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................55
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ЭРИТРОДИЕРЕЗА У КРЫС
В УСЛОВИЯХ НАРУШЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО РАВНОВЕСИЯ.......72
3.1. Влияние острой кровопотери и полицитемии на показатели клеточного
состава периферической крови.........................................................73
3.2 Влияние острой кровопотери и полицитемии на состояние клеточных
механизмов эритродиереза и концентрацию нитрат-ионов.......................77
3.3. Резюме..................................................................................87
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА НА КЛЕТОЧНЫЙ ЭРИТРОДИЕРЕЗ IN VITRO....................................................................................91
4.1. Влияние на эритрофагоцитоз эндогенного донатора оксида азота (Ь-аргинина).................................................................................92
4.2. Влияние на эритрофагоцитоз экзогенного донатора оксида азота (нитропруссида натрия)...................................................................96
4.3. Особенности эритрофагоцитоза в зависимости от локализации эффекта оксида азота................................................................................100
4.4. Резюме..................................................................................105
ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭРИТРОДИЕРЕЗА В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС.......................................108
5.1. Динамика показателей периферической крови...............................109
5.2. Особенности гемолитической резистентности эритроцитов...............115
5.3. Динамика морфофункциональных и биохимических свойств эритроцитарной мембраны.............................................................122
5.4. Состояние клеточных механизмов эритродиереза...........................129
5.5. Резюме.................................................................................134
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА ЭРИТРОН В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС..........................138
6.1. Влияние острой нитритной интоксикации на эритрон в раннем постнатальном онтогенезе..............................................................139
6.2. Влияние хронической нитритной интоксикации матери в период беременности и лактации на формирование эритрона в раннем постнатальном онтогенезе потомства................................................155
6.3. Сравнительная характеристика эффекта острой и хронической нитритной интоксикации.............................................................................161
6.4. Резюме.................................................................................167
ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ ЭРИТРОДИЕРЕЗА В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС КАК РЕЗУЛЬТАТ ФОРМИРОВАНИЯ ЭРИТРОНА В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ МАТЬ-ПЛОД, ПОДВЕРГНУТОЙ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМУ СТРЕССУ..................................................................................174
7.1. Изменение лейкоцитарного состава крови беременных крыс при иммобилизационном стрессе..........................................................175
7.2. Изменения эритроцитарного состава крови беременных крыс при иммобилизационном стрессе...........................................................181
7.3. Динамика показателей периферической крови потомства матерей, подвергнутых иммобилизационному стрессу......................................185
7.4. Особенности гемолитической резистентности эритроцитов потомства матерей, подвергнутых иммобилизационному стрессу..........................193
7.5. Динамика морфофункциональных и биохимических свойств эритроцитарной мембраны потомства матерей, подвергнутых иммобилизационному стрессу.........................................................201
7.6. Состояние клеточных механизмов эритродиереза потомства матерей, подвергнутых иммобилизационному стрессу.......................................208
7.7. Резюме.................................................................................213
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................217
ВЫВОДЫ..................................................................................245
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................249
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АТФ - аденозинтрифосфат
ДК - диеновые конъюгаты
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗВУР - задержка внутриутробного развития плода
ИНОТ - индекс необратимой трансформации
ИО - индекс обратимости
ИОТ - индекс обратимой трансформации
ИП - интегральный показатель эритрограммы
ИТ - индекс трансформации
М — среднее арифметическое
МДА - малоновый диальдегид
ш - ошибка среднего
НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СКГЭ - средняя концентрация гемоглобина в эритроците
СМ - сфингомиелин
СОД - супероксиддисмутаза
СОЭр - средний объем эритроцита
ССГЭ - среднее содержание гемоглобина в эритроците
СТГ - соматотропный гормон
ФС - фосфатидилсерин
ФХ - фосфатидилхолин
ФЭ - фосфатидилэтаноламин
ЭМП - электромагнитное поле
НЬ - гемоглобин
НЬА - гемоглобин А (взрослого) НЬБ - гемоглобин Б (фетальный) НЬР - гемоглобин Р (примитивный) НЬ02 - оксигемоглобин ^ - иммуноглобулин
- иммуноглобулин в Ме£НЬ - метгемоглобин N0 - оксид азота 1;0- время начала гемолиза ^оо- время окончания гемолиза ^оо - длительность гемолиза 150- время 50%-ного гемолиза
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Эритроцитарное равновесие, существующее в норме в организме, достигается благодаря динамической взаимосвязи процессов продукции и разрушения эритроцитов [165]. В реализации механизмов эритродиереза ведущая роль принадлежит клеточному гемолизу [19] при участии макрофагов-резидентов органов кроверазрушения. Изучены морфофункциональные характеристики эритроцитов, подвергающихся деструкции [75, 215, 414, 479, 489], реакция макрофагов на эритроциты с измененными свойствами [280, 380, 469], описано влияние некоторых веществ на эритрофагоцитоз [245, 287, 363, 536]. Однако физиологическая роль эритродиереза, механизмы и регуляция процесса элиминации эритроцитов во многом остаются неясными.
В настоящее время уделяется большое внимание оксиду азота (N0) как одному из основных факторов регуляции различных физиологических процессов. Оксид азота - биологически активное соединение, короткоживущий свободный радикал с высокой проникающей способностью [52]. Источником этого вещества являются азотсодержащие соединения, широко распространенные в народном хозяйстве, применяемые в качестве пищевых добавок, содержащиеся в некоторых лекарственных препаратах, используемых при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы [89, 164]. Известно влияние оксида азота на течение различных физиологических процессов. Доказана его роль в регуляции сердечно-сосудистой, иммунной, нервной, дыхательной и других систем организма [147, 274, 291, 385, 429]. Существует мнение о значении N0 как универсального медиатора физиологических процессов [540]. Однако вопрос об участии оксида азота в механизмах регуляции эритроцитарного равновесия исследован недостаточно. Данные о значении N0 в механизме клеточного эритродиереза немногочисленны и во многом противоречивы [384, 434, 525, 531]. Поэтому актуальным представляется
изучение роли оксида азота в осуществлении межклеточных взаимодействий в процессах деструкции эритроцитов.
Существенные преобразования эритрона в ранний постнатальный период [104, 111] определяются значительными особенностями эритропоэза и эритродиереза. Транзиторное снижение параметров периферической крови, получившее название «ранней анемии» [336], происходит в результате соче-танных изменений процессов образования и разрушения эритроцитов, одно из которых - усиление гемолиза, способствующее разрушению как феталь-ных эритроцитов, так и образованных после рождения [24, 270]. Эритроциты новорожденных более подвержены и спонтанному апоптозу, и спровоцированному оксидативным стрессом [270]. Возможно, активация эритродиереза обеспечивает элиминацию неполноценных клеток, образованных в предшествующие возрастные периоды [112, 279]. При наличии немногочисленных данных о механизмах изменения интенсивности эритропоэза [43, 452] состояние, значение и физиологические механизмы гемолиза в раннем постна-тальном онтогенезе практически не исследованы. Тем не менее, оценка параметров эритрона и его возрастных преобразований невозможна без характеристики эритродиереза.
Известно, что формирование физиологических систем потомства во многом зависит от состояния организма матери во время беременности. Показатели эритрона в системе мать-плод были предметом ряда исследований. Воздействие гипоксии при беременности приводит к развитию эритроцитоза у новорожденных [459]. По другим данным, хроническая внутриутробная гипоксия сопровождается задержкой внутриутробного развития и снижением показателей эритрона новорожденного [12]. Дефицитная анемия беременных является фактором риска развития перинатальной патологии, в том числе, сопровождается анемией у новорожденных [46]. Исследования, проводимые в нашей лаборатории, позволили выявить зависимость процессов эритродиереза плода и новорожденного от функционального состояния организма ма-
si?
тери во время беременности в условиях измененной двигательной активности [104, 106]. Тем не менее, вопрос о зависимости эритродиереза потомства от функционального состояния организма матери во время беременности остается открытым.
Воздействие на материнский организм экстремальных факторов различной этиологии отражается на развитии потомства и проявляется отдаленными нарушениями в постнатальный период [29, 130, 464]. Прямых доказательств влияния пренатального стресса на эритродиерез в доступной литературе нами не обнаружено. Данные о состоянии эритродиереза потомства матерей, подвергавшихся стрессу во время беременности, позволят более полно охарактеризовать развитие эритрона в постнатальном периоде, раскрыть некоторые механизмы его адаптации и повреждения.
Учитывая важное физиологическое значение оксида азота в регуляции различных физиологических механизмов, для характеристики постнатально-го становления эритроцитарного равновесия необходимо оценить влияние метаболитов N0 на эритрон растущего организма, что позволит выявить особенности его физиологического и повреждающего действия в условиях незавершенного эритроцитарного системогенеза. Целесообразным является изучение как непосредственного действия оксида азота на эритродиерез растущего организма, так и опосредованного влияния в функциональной системе мать-плод, что представляет собой важную научно-практическую задачу, актуальную не только для физиологии, но также для акушерства и педиатрии.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Установить закономерности клеточного эритродиереза у белых крыс и его МЭ-опосредованной регуляции; выявить особенности клеточного эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе в зависимости от состояния организма матери во время беременности и лактации.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Дать характеристику клеточного эритродиереза у белых крыс в норме и при некоторых изменениях функционального состояния эритрона (полици-темия, острая кровопотеря).
2. Выявить эффекты оксида азота на процесс клеточного эритродиереза.
3. Дать морфофункциональную характеристику процессов эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс.
4. Охарактеризовать влияние острой нитритной интоксикации на состояние клеточного эритродиереза в раннем постнатальном онтогенезе крыс.
5. Выявить особенности эритродиереза потомства крыс, подвергнутых во время беременности и лактации хронической нитритной интоксикации.
6. Показать особенности эритродиереза потомства крыс, перенесших иммо-билизационный стресс во время беременности.
КОНЦЕПЦИЯ
Клеточный эритродиерез как фактор поддержания эритроцитарного равновесия в норме и при изменении функционального состояния эритрона крыс реализуется при участии NO-опосредованных механизмов. Оксид азота оказывает стимулирующее влияние на эритрофагоцитоз in vitro в зависимости от концентрации донатора (L-аргинина и нитропруссида натрия), действуя как на макрофаги, так и на эритроциты. В раннем постнатальном онтогенезе гемолиз обеспечивает элиминацию эритроцитов с неадекватными морфофунк-циональными свойствами, способствуя становлению эритропоэза. Эритродиерез у потомства зависит от функционального состояния матери во время беременности и лактации (хронической нитритной интоксикации, иммобили-зационного стресса), определяющего особенности адаптации эритрона крысят, наиболее чувствительного к действию адаптогенных факторов в критические периоды развития.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
На основании полученных результатов показана физиологическая роль эритродиереза в поддержании эритроцитарного равновесия взрослого и развивающегося организма, подтверждено значение гемолиза как фактора стимуляции эритропоэтической функции красного костного мозга.
В экспериментах in vitro доказано стимулирующее влияние оксида азота на эритродиерез. Выявлены особенности дозозависимого действия на эритрофагоцитоз L-аргинина и нитропруссида натрия, в малых количествах обладающих выраженным активирующим эффектом без существенного его нарастания при увеличении концентрации.
Показано, что влиянию оксида азота подвержены и эритроциты, и макрофаги. Стимулирующий эффект на макрофаги проявляется лишь увеличением их адгезионных свойств, тогда как взаимодействие производных N0 с эритроцитами приводит к значительной активации всех стадий процесса фагоцитоза.
Проведено изучение становления эритрона в раннем постнатальном онтогенезе крыс с системных позиций. Исследовано состояние периферической крови, процессы эритропоэза и эритродиереза, что позволило выявить особенности эритроцитарного равновесия в динамике постнатального развития эритрона и показать роль эритродиереза в его формировании: клеточный гемолиз обеспечивает элиминацию неполноценных эритроцитов, одновременно способствуя становлению эритропоэтической функции костного мозга.
Выявлены особенности адаптации эритрона к острой нитритной интоксикации в раннем постнатальном онтогенезе, установлены периоды наибольшей чувствительности к повреждающему действию производных оксида азота.
"i
4 i.
Дана комплексная оценка эффектов хронической нитритной интоксикации на эритрон потомства матерей, получавших нитрит натрия в период беременности и лактации.
Показано, что у крысят, матери которых во время беременности подвергались иммобилизационному стрессу, снижена активность клеточного эритродиереза на фоне общей тенденции к замедлению развития эритрона.
Установлено, что как в норме, так и при действии адаптогенных факторов наиболее уязвимым периодом эритроцитарного системогенеза является 21-й день жизни крысят, когда происходят преобразования эритропоэза и эритродиереза, существенно влияющие на формирование эритрона и во многом определяющие характер его адаптации.
Дополнены представления о гематологических критериях стресса, которые кроме типичных симптомов включают в себя трансформацию эритроцитов по эхиноцитарному типу у интактных взрослых крыс, а также лейкопению и снижение показателя гематокрита у беременных животных.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Полученные данные дополняют представления о клеточных механизмах эритродиереза и его физиологическом значении у взрослого и развивающегося организма, позволяют на новом уровне охарактеризовать развитие эритрона в постнатальном периоде, раскрыть некоторые механизмы его адаптации и повреждения в зависимости от состояния материнского организма во время беременности и лактации, создать теоретическую основу антенатальной профилактики нарушений формирования эритрона и их коррекции в постнатальный период.
РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТО�
-
Голубева, Елена Константиновна
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.03.01
- Состояние эритрона при экспериментальной гемолитической анемии у белых крыс в раннем постнатальном онтогенезе
- Белки ядер и хроматина клеток в возрастном развитии животных
- Влияние регуляторных пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиях белых крыс в раннем периоде постнатального онтогенеза
- Постнатальная динамика структурных особенностей и некоторых функций печени белых крыс при питании диспергированной пищей
- Физиолого-биохимические параметры биологически активных веществ сыворотки крови у животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе
