Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок KRP как ингибитор фосфорилирования миозина: участие в регуляции сокращения гладких мышц

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белок KRP как ингибитор фосфорилирования миозина: участие в регуляции сокращения гладких мышц"

На правах рукописи

У

ЩЕРБАКОВА Ольга Владимировна

БЕЛОК КИР КАК ИНГИБИТОР ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИОЗИНА: УЧАСТИЕ В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАЩЕНИЯ ГЛАДКИХ МЫШЦ

03.01.04 - Биохимия

11 ноя 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2015

005564516

005564516

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Научный консультант:

профессор

кандидат биологических наук, доцент Воротников Александр Вячеславович

доктор биологических наук, Ширинский Владимир Павлович

Официальные оппоненты:

Авдонин Павел Владимирович, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией физиологии рецепторов и сигнальных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» Российской академии наук

Минин Александр Александрович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий отделом клеточной биологии, заместитель директора Института белка Российской академии наук

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Защита диссертации состоится 21 декабря 2015 года в 17 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д.1 стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_».

.2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Киселевский Дмитрий Борисович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гладкомышечные клетки являются основным компонентом стенок кровеносных сосудов и внутренних органов, и отвечают за динамические изменения диаметров сосудов и объёма полостей органов. Многие патологические процессы связаны с нарушениями сократительной активности гладких мышц [1]. Именно поэтому понимание процессов, лежащих в основе регуляции сокращения гладких мышц, представляется важным не только с теоретической, но и с практической точек зрения.

Считается общепринятым, что фосфорилирование регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина по Ser19 является необходимым условием для инициации сокращения гладких мышц. Фосфорилирование РЛЦ осуществляется киназой легких цепей миозина (КЛЦМ), которая активируется при повышении внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]i) и связывании насыщенного кальцием кальмодулина с ферментом. Дефосфорилирование РЛЦ миозина, катализируемое фосфатазой легких цепей миозина (ФЛЦМ), приводит к расслаблению гладких мышц [2].

Гормональная регуляция сократительной активности гладких мышц осуществляется не только путем изменения концентрации кальция ([Ca2+]i), но и путем изменения чувствительности сократительного аппарата к ионам кальция. Это позволяет регулировать силу сокращения в зависимости от конкретных физиологических или патофизиологических условий. Считается, что повышение чувствительности сократительного аппарата к Са2+ (т.н. Са2+-сенситизация), осуществляется преимущественно благодаря ингибированию активности ФЛЦМ [3]. Кроме того, Са2+"сенситизация может осуществляться за счет фосфорилирования миозина неканоническими киназами, активируемыми при воздействии определённых агонистов. В качестве таких неканонических киназ миозина могут выступать Rho-киназа, ZIPK и ILK [4, 5,6].

Некоторые гормоны и низкомолекулярные соединения (такие, например как NO) могут активировать циклонуклеотид-зависимые протеинкиназы (РКА и PKG) и это

Список сокращений: КЛЦМ — киназа легких цепей миозина, РЛЦ — регуляторные легкие цепи миозина, ФЛЦМ - фосфатаза легких цепей миозина, цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат, цАМФ - циклический аденозинмонофосфат, СаМ - кальмодулин, DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол, НММ - тяжёлый меромиозин, ILK - интегрин-связанная киназа, KRP - Kinase Related Protein (белок, родственный киназе), МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа, РКА -цАМФ-зависимая протеинкиназа, РКС — протеинкиназа С, PKG - цГМФ-зависимая протеинкиназа, ZIPK - Zipper Interacting Protein Kinase, WT - белок дикого типа

1

приводит к уменьшению чувствительности сократительного аппарата к ионам кальция (т.н. Са2+"десенситизации). Механизмы Са2+-десенситизации могут состоять в восстановлении различными путями ранее подавленной активности ФЛЦМ [7] или ингибировании ферментативной активности КЛЦМ [8]. Ещё одним известным Са2+-десенситизирующим агентом является белок KRP (Kinase Related Рго1ет)/телокин, который обнаружен преимущественно в фазных гладких мышцах [9]. KRP представляет собой независимо экспрессируемый С-концевой домен КЛЦМ с массой 17 кДа. KRP не обладает киназной активностью и связывается с миозином своим отрицательно-заряженным С-концевым участком. Высказывается предположение, что KRP ингибирует активность киназы легких цепей миозина, конкурируя с её KRP-доменом за связывание с миозином [10, 11]. Кроме того, известно, что участки связывания регуляторной цепи миозина и KRP с тяжелой цепью миозина расположены в непосредственной близости друг от друга [11, 12]. Это позволяет предположить, что KRP способен затруднять доступ субстрата (РЛЦ миозина) для любых протеинкиназ, а не только для КЛЦМ. Данное предположение до последнего времени не подвергалось экспериментальной проверке.

Следует отметить, что в гладких мышцах KRP фосфорилируется по нескольким участкам [9]. При этом МАРК способна фосфорилировать Ser19, а цАМФ/цГМФ-зависимое расслабление коррелирует с фосфорилированием Ser13 KRP [13]. В то же время причинно-следственные связи между фосфорилированием KRP и расслаблением гладких мышц остаются практически не исследованными. Все сказанное делает целесообразным подробное исследование участия KRP в регуляции расслабления гладких мышц.

Цель и задачи исследований. Целью работы было выяснить механизм регуляции сократительной активности гладких мышц под действием KRP. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить, способен ли KRP в условиях in vitro ингибировать фосфорилирование миозина киназой легких цепей миозина, лишенной KRP домена.

2. Исследовать влияние KRP на развитие сокращения скицированных волокон taenia coli, индуцированное микроцистином

3. Выяснить, каким образом фосфорилирование, катализируемое PKA/PKG и МАРК, влияет на регуляторную активность KRP в условиях in vitro и в модели скинированных волокон taenia coli

4. Определить роль С-коицевой последовательности, обеспечивающей связывание KRP с миозином, в осуществлении регуляторной активности KRP в условиях in vitro и в модели скинированных волокон taenia coli

Основные положения, выносимые на защиту.

1. KRP в условиях in vitro ингибирует фосфорилирование миозина под действием киназы легких цепей миозина, лишенной KRP-домена.

2. KRP замедляет развитие микроцистин-зависимого сокращения скинированных волокон taenia coli.

3. Фосфорилирование по Ser13 и по Ser19 не влияет на ингибиторный эффект KRP in vitro, а также на способность KRP ингибировать индуцированное микроцистином сокращение и вызывать расслабление после Са2+-зависимого сокращения гладких мышц.

4. С-концевая последовательность KRP, которая обеспечивает его связывание с миозином, необходима для расслабления скинированных гладкомышечных волокон, а также для ингибирования фосфорилирования миозина и сокращения, индуцированного микроцистином.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данные, полученные в нашей работе, свидетельствуют о том, что KRP является эффективным ингибитором фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина не только канонической киназой легких цепей миозина, но и других неканонических протеинкиназ. Установлено, что связывание KRP с миозином необходимо для ингибирования фосфорилирования РЛЦ миозина, а также для ингибирования сократительной активности гладких мышц. Предложен новый механизм регуляторной активности KRP. Согласно этому предположению KRP не только конкурирует с KRP-доменом КЛЦМ, как считалось ранее, но и, связываясь с миозином, затрудняет доступ каталитического домена киназы к регуляторным легким цепям миозина. Показано, что фосфорилирование KRP циклонуклеотид-зависимыми протеикиназами не влияет на расслабление гладких мышц в модели скинированных волокон. Показано, что фосфорилирование KRP под действием МАРК не изменяет его способности регулировать сократительную активность скинированных гладких мышц.

Результаты диссертации вносят вклад в понимание механизмов Са2+-десенситизации фазных гладких мышц, расширяют представление о роли KRP в регуляции активности сократительного аппарата. Результаты, полученные в работе, свидетельствуют о том, что KRP является

универсальным Са2+-десенситизирующим агентом в гладких мышцах. Вследствие этого можно предположить, что разный уровень экспрессии KRP в различных мышцах может определять их специфический сократительный фенотип. Полученные данные углубляют понимание молекулярных механизмов регуляции сократительной активности гладких мышц и могут представлять интерес при разработке новых лекарственных средств.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность: фундаментальные и прикладные исследования» (Пущино, Россия, 2006), «Биологическая подвижность: достижения и перспективы» (Пущино, Россия, 2008), «XXXVII European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research» (Oxford, UK, 2008).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 печатные работы в рецензируемых журналах из списка ВАК и 5 тезисов сообщений

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 28 рисунков и 4 таблиц. Список литературы включает 241 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Определение концентрации белков. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм, а также колориметрически [14].

Электрофорез и денсцтометрия. Препараты очищенных белков и экстракты тканей подвергали электрофорезу по методу Леммли [15]. Скинированные гладкомышечные волокна фиксировали в 15% ТХУ в течение 10 мин на льду. Волокна отмывали от ТХУ 95% ацетоном 3-4 раза по 5 мин. Ткань растирали в стеклянном гомогенизаторе (Micro, 200 мкл, Kimble-Kontes, США) на льду в минимальном объёме двукратного буфера для образцов, содержащего 3 мкМ апротинин, 10 мкМ лейпептин и 0,1 мМ ФМСФ. Полученные образцы кипятили (5 мин), охлаждали, добавляли мочевину до конечной концентрации 5М, инкубировали 30 мин на льду и центрифугировали (15000 g, 20 мин). Надосадочную жидкость использовали для электрофореза. При окраске гелей Кумасси R-250 на дорожку наносили 0,4—3 цг очищенных препаратов белка и 15-25 цг общего белка для образцов ткани. Для последующего иммуноблоттинга на гель наносили 2-250 нг очищенного белка, необходимое количество образца ткани подбирали

экспериментально. Денситометрический анализ проводили с использованием калиброванного денситометра BioRad GS800 и программы Quantity One 4.6.

Мочевинно-глииеуиновый электрофорез проводили согласно ранее описанному методу [16]. Для приготовления образцов волокна инкубировали 1 час при комнатной температуре в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 6,8, 9 М мочевину, 10 мМ ДТТ, 0,05% бромфеноловый синий, 3 мкМ апротинин, 10 мкМ лейпептин и 0,1 мМ ФМСФ. Полученный таким способом образец гомогенизировали, и продолжали инкубацию еще 1 час при комнатной температуре. Пробы подвергали центрифугированию (15000 g, 20 мин), супернатант использовали для электрофореза сразу после приготовления.

Иммуноблоттинг. Иммуноблоттинг проводили как это было описано ранее [17]. Электроперенос (350 мА, 1-3 ч) осуществляли на нитроцеллюлозные и PVDF-мембраны (Amersham, Великобритания). В качестве буфера для электропереноса KRP использовали 10 мМ Caps, pH 11,0, 10% этанол, 5мМ ß-меркаптоэтанол; остальные белки блоттировали в буфере, содержащем 25 мМ трис-180 мМ глицин, pH 8,3, 20% этанол, 0,02% ДСН. Мембраны инкубировали с 0,25% глутаровым альдегидом (15 мин), отмывали ТСБТ (трис-солевой буфер: 25 мМ трис-HCl, pH 7,4, 140 мМ NaCl, содержащий 0,1% Твин 20) и блокировали 5% раствором обезжиренного сухого молока в ТСБТ в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубацию, как с первичными, так и с вторичными антителами, проводили 1 час при комнатной температуре в растворе 1% обезжиренного молока в ТСБТ в разведениях, рекомендованных производителем. Использовали моноклональные антитела к РЛЦ миозина (клон MY-21, Sigma, США), поликлональные антитела к РЛЦ (MRLC3, Proteintech Group, США), антитела козы к PKGIa/ß (клон Т-19, Santa Cruz, США), антитела кролика, специфически узнающие фосфорилированные по Ser19 регуляторные легкие цепи миозина (Р-819-РЛЦ), аффинно-очищенные антитела козы к KRP и антитела кролика, специфически узнающие P-S13-KRP (R5) и P-S19-KRP (R8) [9, 14]. В качестве вторичных антител использовали антитела против IgG кролика, мыши и козы, а также вторичные антитела против IgM мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания и Pierce, США). Для выявления белковых полос применяли либо хемилюминесцентный (Amersham, Великобритания), либо колориметрический метод с использованием 3,3'-диаминобензидина (Sigma, США) согласно инструкциям производителей.

Трансформация бактериальных клеток. Трансформацию клеток Е. coli (штаммы BL21(DE3) или BL21(DE3)pLys) проводили согласно ранее описанному методу [18].

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Для экспрессии полноразмерного chiKRP-His6, AN-chiKRP-Hisr, и AC-chiKRP-Hise использовали клетки Е. coli штамма BL21(DE3)pLys, несущие ген устойчивости к левомицетину, трансформированные плазмидами

pET21d(+)/chiKRPl-157(His6), pET21d(+)/chíKRPl-138(His6) и

pET21 d(+)/chiKRP36-157(His6), соответственно. Для экспрессии p44erkl-МАР-киназы, полноразмерного hKRP и AC-hKRP использовали клетки Е. coli штамма BL21(DE3), трансформированные плазмидами pGEX-3X/p44erkl-МАРК, pET22b(+)/hKRP 1-154 и рЕТ28а(+)/ hKRPl-136, соответственно. Суспензию клеток растили (при 37°С, 250 об/мин) до достижения оптической плотности 0,4 - 0,6 при 600 нм, индуцировали экспрессию 3 мМ изопропил-ß-D-тиогалактопиранозидом. Через 3 часа клетки осаждали (5000g, 30 мин.). Осадок клеток, в случае KRP человека, ресуспендировали в буфере, содержащем 25% сахарозу, 0,2 М KCl, 30 мМ трис-HCl, pH 8,0, 0,2 мМ ТРСК, 0,5 мМ ФМСФ, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА. В случае рекомбинантных белков, содержащих последовательность Hisg или GST (глутатион-Б-трансфераза), осадок ресуспендировали в 20 мл соответствующего буфера для аффинной хроматографии. Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (Branson SONIFIER 450, Branson Ultrasonics Corp., США). Полученный лизат центрифугировали (9000g, 20 мин.) и супернатант использовали для выделения рекомбинантных белков. Для выделения wt-hKRP и ДС-hKRP использовали ранее описанный метод [19]. Рекомбинантный KRP курицы, содержащий С-концевой полигистидин, и GST-p44erkl МАР-киназу очищали аффинной хроматографией на TALON (Clontech, США) и глутатион-сефарозе (Pharmacia Biotech., Швеция), соответственно. Очищенные препараты белков диализовали против буфера МРВ (10 мМ Mops, pH 7,0, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭГТА, 20 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) и хранили при -20°С.

PKG выделяли из лёгких быка по методу Линкольна [20].

НММ выделяли из мускульных желудков курицы, как это было описано ранее [21].

Фрагмент KJIUM с массой 61 кДа (КЛЦМ-61). содержащий каталитический домен, но лишенный KRP домена, получали с помощью протеолиза полноразмерной КЛЦМ-108 [22].

Фосфоршцрование KRP in vitro и его очистка от киназ. Все реакции фосфорилирования проводили в буфере МРВ в присутствии 0,5 мМ АТФ и 5 мМ MgCh при 30°С. Рекомбинантный hKRP (2 мг/мл) фосфорилировали каталитической субъединицей РКА (Calbiochem, США) и/или GST-p44erkl-МАРК в молярном соотношении фермент:ККР - 1:100 и 1:20, соответственно, в течение 60 мин. GST-p44erkl-MAPK активировали фосфорилированием конститутивно активной формой киназы Hise-MEKl (любезно предоставлена Хапчаевым А.Ю., РКНПК) в течение 30 мин в соотношении (мг/мг) МАРК:МЕК - 20:1. В случае, когда hKRP фосфорилировали по двум участкам, сначала проводили фосфорилирование РКА, очищали полученный препарат P-S13-hKRP от киназы, и затем фосфорилировали МАР-киназой. Степень фосфорилирования hKRP определяли по изменению подвижности при электрофорезе по Лэммли [15] для hKRP, фосфорилированного по Ser19 (МАРК) и при мочевинно-

6

глицериновом электрофорезе для hKRP, фосфорилированного по Ser13 (РКА). В указанных условиях удается достичь полного фосфорилировния KRP как под действием РКА, так и МАРК.

P-S13-hKRP очищали от РКА с использованием ионообменной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой (Sigma, США), уравновешенной буфером, содержащим 15 мМ MES, pH 6,5, 0,1 мМ ФМСФ и 1 мМ ДТТ. Для очистки P-S19-hKRP от GST- p44erkl МАРК и His6-MEK1 использовали колонки с аффинными носителями, глутатион-сефарозой и TALON, соответственно.

Для оценки эффективности очистки определяли активность соответствующих киназ в полученных препаратах P-S13-hKRP, P-S19-hKRP и P-S13,P-S'9-hKRP. При этом в качестве субстрата протеинкиназ использовали нефосфорилированный ДС-hKRP. Для проверки эффективности очистки препаратов P-S19-hKRP и P-S13,P-S19-hKRP от МЕК, к ним добавляли неактивную МАРК в качестве субстрата. Различие молекулярных масс полноразмерного hKRP и белка, лишенного С-концевой последовательности (AC-hKRP), позволило разделить их с помощью денатурирующего электрофореза и отслеживать фосфорилирование только AC-hKRP. Фосфорилирование AC-hKRP определяли методом иммуноблоттинга с антителами, специфичными к P-S13-hKRP или P-S19-hKRP. Во всех проведенных опытах мы не обнаружили сигнала, соответствующего фосфорилированному AC-hKRP, что указывает на высокую эффективность очистки и полное отсутствие протеинкиназ в препаратах фосфорилированного hKRP.

Фосфорилирование НММ под действием KJIUM. 4 цМ НММ фосфорилировали КЛЦМ-108 (10 нМ) и КЛЦМ-61 (40 нМ) при 30°С в буфере МРВ, содержащем 20 или 150 мМ NaCl и 0,1 - 0,5 мМ АТФ в присутствии или отсутствие KRP человека или KRP курицы (20 и 50 цМ), KRP, фосфорилированного РКА и/или МАРК, или мутантных форм KRP. В случае КЛЦМ-108 в инкубационную среду добавляли 0,5 мМ Са2+ и 300 нМ кальмодулин. Реакцию инициировали добавлением НММ. Аликвоты реакционной смеси отбирали и растворяли буфере для образцов. Полноту прохождения реакции анализировали методом мочевинно-глицеринового электрофореза с последующим иммнуоблоттингом с фосфоспецифическими антителами к РЛЦ, или авторадиографией (в этом случае реакцию фосфорилирования проводили в присутствии у-[32Р]АТФ (1,5-2,5 кБк/мл)). Уровень фосфорилирования РЛЦ вычисляли как соотношение: фосфо-РЛЦ/(фосфо-РЛЦ + РЛЦ). В случае использования радиоактивной АТФ величины сигналов были нормированы на величину сигнала полностью фосфорилированных РЛЦ. В этом случае полноту фосфорилирования определяли с помощью мочевинно-глицеринового электрофореза.

Скинирование и измерение сократительной активности волокон taenia coli. Самцов и самок морских свинок (Cavia porcellus) возрастом 3-5 месяцев анестезировали изофлуораном (2 мл) и декапитировали. Извлекали taenia coli

и скинировали согласно ранее описанному методу [23] в присутствии 0,1% Тритона Х-100 на льду в течение 4 ч. Волокна переносили в раствор для расслабления, содержащий 50% глицерин, и хранили при -20°С не более двух недель. Раствор для расслабления содержал 20 мМ имидазол рН 6,7, 7,5 мМ Na2ATP, 10 мМ креатинфосфат, 140 Ед/мл креатинкиназы, 10 мМ MgCb, 4 мМ ЭГТА, 1 мМ NaN3, 2 мМ ДТТ, 1 цМ лейпептин и 1 цМ кальмодулин. Раствор для сокращения с необходимой концентрацией свободного кальция получали путём смешивания раствора для расслабления с таким же раствором, содержащим 4 мМ СаСЬ, в соответствующей пропорции [24]. Силу сокращения волокон измеряли при 22°С одновременно в 4-6 камерах (объемом 0,2-1 мл) с помощью изометрических тензодатчиков, оснащенных трансдьюсерами KG7 (Scientific Instruments, Германия). Волокна разделяли на продольные тонкие сегменты (100-200 мкм на 5 мм), закрепляли на датчиках, помещали в камеры с раствором для расслабления, растягивали на 5% длины и уравновешивали в течение 15-20 мин раствором для расслабления до достижения стационарного уровня базального натяжения. Регистрацию и анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Real View v 3.0.

Конфокальная микроскопия волокон taenia coll. Для оценки проникновения KRP в скицированные волокна taenia coli использовали конфокальную микроскопию. Рекомбинантный KRP человека последовательно метили по s-аминогруппам остатков лизина сукцинимидиловым эфиром Alexa Fluor® 488 (Molecular probes, США), a затем по SH-группам остатков цистеина С5 малеимидом Alexa Fluor® 488 (Molecular probes, США). Все процедуры проводили согласно инструкциям производителя. Волокна taenia coli, скицированные Тритоном Х-100, изометрически фиксировали на тензодатчике, инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин в релаксирующем растворе с 10 цМ меченым KRP или с буфером, использованным для диализа KRP. Меченый KRP, не связавшийся с волокнами, удаляли промыванием (2 раза, 2 мин) в релаксирующем растворе, содержащем 10 цМ немеченого KRP, или просто в релаксирующем растворе (контроль). Далее волокна фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин и дважды промывали ФСБ. Окрашивали ядра DAPI (Molecular Probes, США), а F-актин фаллоидином, меченым Alexa Fluor® 555 (Molecular Probes, США) согласно инструкциям производителя. Волокна фиксировали на предметных стёклах с помощью заливочной среды Mowiol 4-88 (Германия). Сигнал детектировали с помощью конфокального микроскопа Leica DMI6000В.

Статистический анализ. Для статистического анализа результатов использовали t-тест Стьюдента. Данные представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из п независимых экспериментов. Значение Р<0,05 принимали статистически достоверным. Для вычислений использовали программы Microsoft Excel, GraphPad и Statistica.

Результаты и их обсуждение

KRP ингибирует фосфорилирование НММ под действием киназы легких цепей миозина, лишенной KRP-домена. Киназа лёгких цепей миозина содержит два центра связывания с субстратом. Один центр расположен в каталитическом домене, другой, дополнительный центр связывания с миозином расположен на С-конце молекулы протеинкиназы, в области KRP-домена. Изолированный KRP связывается с тем же участком миозина, что и KRP-домен КЛЦМ. Вследствие этого KRP конкурирует с полноразмерной КЛЦМ и снижает её каталитическую активность, препятствуя связыванию фермента с субстратом [10, 11]. Однако близость участка связывания KRP и регуляторных легких цепей на молекуле миозина позволяет предположить, что KRP может не только конкурировать с KRP-доменом КЛЦМ за участок связывания на миозине, но способен помимо этого влиять на доступность участка фосфорилирования РЛЦ для КЛЦМ.

Для того чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали влияние рекомбинантного полноразмерного KRP курицы (chi-KRP-Hise) на активность КЛЦМ, лишенной KRP-домена (КЛЦМ-61). Оказалось, что chi-KRP-Hise ингибирует фосфорилирование регуляторной легкой цепи НММ под действием киназы, лишенной KRP домена (рис. 1). За 5 минут инкубации в отсутствие KRP КЛЦМ-61 осуществляет практически полное (95 ± 4% (п=7)) фосфорилирование регуляторных цепей НММ. В то время как в присутствии 50 (дМ KRP степень фосфорилирования составляет всего около 10% (10 ± 2% (п=3)).

Таким образом, KRP не только конкурирует с С-концевым KRP-доменом КЛЦМ за связывание с областью соединения субфрагментов S1 и S2 миозина, что было известно ранее [10, 11], но и препятствует фосфорилированию миозина каталитическим доменом КЛЦМ. Мы предполагаем, что связываясь вблизи регуляторной цепи, KRP ограничивает доступность Ser19 легкой цепи миозина для КЛЦМ, и таким образом препятствует фосфорилированию. Полученные результаты указывают на то, что KRP может ингибировать и неканонические (Са2+-независимые) киназы миозина, у которых нет KRP-домена. Считается, что такие ферменты играют важную роль в развитии тонического сокращения гладких мышц, в том числе гладких мышц сосудов, обеспечивая Са2+-независимое фосфорилирование миозина [25].

Рис. 1. Влияние KRP на фосфорилирование НММ под действием КЛЦМ-61. НММ

фосфорилировали КЛЦМ-61 в присутствии у-[32Р]АТФ. Реакцию проводили в отсутствие (контроль) или в присутствии 20 или 50 цМ chi-KRP-Hiss. Представлены авторадиограммы (верхние панели) и

электрофореграммы, окрашенные Кумасси R-250 (нижние панели). Гистограммы показывают средние значения (в % от полного) ± стандартная ошибка среднего (п = 3-6) степени фосфорилирования РЛЦ. *Р < 0,05 по отношению к контролю.

KRP тормозит развитие сокращения, индуцированного микроцистином. Для того чтобы проверить, ингибирует ли KRP сокращение под действием Са2+-независимых протеинкиназ, мы использовали скинированные Тритоном Х-100 гладкомышечные волокна taenia coli морской свинки. Эта модель широко используется при изучении регуляции сократительного аппарата [25, 26]. При скинировании Тритоном Х-100 происходит разрушение всех клеточных мембран, что приводит к вымыванию ряда белков, в том числе и KRP (см. рис. 2Б). Однако сократительный аппарат сохраняется интактным, и связанные с ним регуляторные белки частично остаются в волокнах. В то же время, отсутствие мембран и небольшой диаметр получаемых волокон (100 - 200 мкм) позволяет воздействовать на сократительный аппарат экзогенно добавленными веществами [2]. Так, при инкубации скицированных волокон в растворе, содержащем рекомбинантный KRP, белок равномерно проникает в волокна по всей толщине (см. рис. 2А и Б). Поэтому скинированные Тритоном Х-100 волокна taenia coli являются адекватной экспериментальной моделью, которая позволяет анализировать эффекты экзогенно добавленного KRP на индуцированное микроцистином сокращение без искажающего влияния эндогенного KRP.

Для выявления сокращения, опосредованного Са2+-независимыми киназами, необходимо блокировать КЛЦМ и ФЛЦМ. Поэтому мы проводили все эксперименты в среде с низкой концентрацией кальция (рСа>8) (что делало невозможным функционирование киназы легкой цепей миозина,

ю

контроль 20 цМ KRP 50yMKRP

----РЛЦ

1 5 20 1 5 20 1 5 20 мин

100

# 80 -

60 -

140 -

20 -0

□ контроль ■ KRP 20 цМ в KRP 50 цМ

_

1

—±—I l-h

*

20

время, мин

активность которой зависит от кальция и кальмодулина) и блокировали ФЛЦМ с помощью необратимого ингибитора фосфатаз типа 1 и 2А, микроцистина-LR. Возможными кандидатами, ответственными за индуцируемое микроцистином сокращение, являются неканонические Са2+-независимые протеинкиназы ILK и ZIPK [5, 6]. Эти киназы экспрессируются в taenia coli морской свинки, и после скинирования Тритоном Х-100 остаются в волокнах [28].

KRP, меченый

DAPI Фаллоидин Alexa Fluor488

taenia + wt-hKRP

taenia

3 4 5 6

50кДа —

Кумасси R-250

a-KRP

Рис. 2. Эндогенный KRP полностью вымывается из волокон taenia coli, а экзогенный KRP проникает в волокна по всей толщине. А. Верхние панели - волокна, инкубировавшиеся с 10 цМ hKRP, меченым Alexa Fluor®488, нижние панели - контрольные волокна. Ядра и F-актин покрашены DAPI и

фаллоидином, меченым Alexa Fluor®555, соответственно. Б. Дорожки: 1 — интактные волокна taenia coli; 2 - скинированные Тритоном Х-100 волокна; 3 - скинированные Тритоном Х-100 волокна, инкубировавшиеся 30 мин с 10 цМ KRP; 4-7 - 2, 5, 15 и 40 нг очищенного препарата hKRP.

t t I

2 5 15 40 нг KRP

«i?

VS

На рис. ЗА видно, что 10 цМ микpoциcтин-LR вызывает медленное продолжительное сокращение, которое после 40 минут инкубации достигает максимума: 91±1% максимальной силы (Ртах), измеренной при рСа 4,5. В

присутствии 10 цМ ЬКЯР, происходит существенное (р<0,05, 1-тсст

и

Стьюдента) торможение развития Са2+-независимого сокращения, вызванного добавлением 10 цМ микроцистина (см. рис. 3 Б, В). Под действием ККР увеличивается продолжительность лаг-периода, составляющего в контроле 2-3 мин, и достигающего 10 мин в присутствии 10 цМ К11Р. Одновременно с этим время, за которое достигалось 50% максимальной силы сокращения (и/2), увеличивалось с 8,4 ± 0,9 мин до 35,1 ± 2,5 мин. Сокращение в присутствии ККР не достигало плато даже после 40 минут инкубации с микроцистином. Его сила на 40 минуте инкубации составила 56 ± 4% от РП1ах (п=7), при этом, в контроле соответствующая величина составила 91 ± 4% (п=7).

10 мин

—и-

рСа >8 4,5

-н-

рСа >8 4.5

■ контроль - уЛ-КЯР

Рис. 3. КЛР ингиби-рует сокращение, индуцированное микроцистином..

Контрольный сократительный ответ вызывали добавлением раствора с рСа 4,5, затем волокна отмывали релаксирующим раствором до базального уровня

сокращения и инкубировали с 10 цМ \vt-hKRP (Б) или с соответствующим количеством буфера (А) в течение 40 время, мин мин, после чего

стимулировали сокращение гладкомышечных волокон добавлением 10 цМ микроцистина, в присутствии ККР или буфера (контроль). По прошествии 40 минут волокна помещали в раствор с рСа 4,5 для определения значения максимальной силы сокращения. В. Зависимость силы сокращения (% от максимальной при рСа 4,5), вызванного микроцистином, от времени. Данные представлены как среднее значение (п=7) ± стандартная ошибка среднего. Р < 0,05

Исследования, проведённые в нашей лаборатории, показали, что KRP снижал уровень фосфорилирования легких цепей миозина в ходе микроцистин-зависимого сокращения [28]. В совокупности, приведенные данные означают, что KRP тормозит развитие Са2+-независимого сокращения, индуцированного микроцистином, за счёт ингибирования фосфорилирования РЛЦ миозина.

В литературе высказываются предположения о том, что KRP вызывает расслабление, активируя фосфатазу миозина [29, 30], и/или ингибируя фосфорилирование миозина под действием киназы легких цепей миозина [10, 11, 31]. В нашей работе мы установили, что KRP не является специфическим ингибитором фосфорилирования под действием киназы легких цепей миозина, и способен ингибировать фосфорилирование РЛЦ миозина и под действием Са2+-независимых неканонических протеинкиназ.

Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его ингибиторный эффект. KRP подвергается активному фосфорилированию протеинкиназами в фазных гладких мышцах in vivo, причём KRP может фосфорилироваться по нескольким участкам [9]. Известно, что фосфорилирование KRP по Ser13 коррелирует с цАМФ/цГМФ-зависимым расслаблением гладких мышц [29, 13]. Однако остаётся невыясненным, имеется ли какая-то причинно-следственная связь между фосфорилированием Ser13 KRP и расслаблением, и, если такая связь существует, то каков механизм ее реализации. Функциональная значимость фосфорилирования KRP по Ser19, осуществляемого МАРК, вообще остается не изученной.

Мы предположили, что фосфорилирование KRP может усиливать его ингибиторные свойства в отношении фосфорилирования РЛЦ под действием КЛЦМ и Са2+-независимых киназ и тем самым ингибировать сокращение и усиливать расслабление. Для проверки этого предположения, мы исследовали влияние фосфорилирования KRP по Ser13 и Ser19 или по обоим этим участкам на его способность ингибировать фосфорилирование РЛЦ миозина под действием КЛЦМ in vitro, и сокращение скинированных гладкомышечных волокон taenia coli, индуцированное микроцистином.

Как видно из рис. 4 (А и Б), нефосфорилированный KRP и его фосфорилированные производные (P-S13-hKRP, P-S19-hKRP, P-S13,P-S19-hKRP) с одинаковой эффективностью ингибируют фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина НММ. Действительно, в присутствии 20 цМ нефосфорилированного KRP степень фосфорилирования РЛЦ через 3 мин после начала реакции составляет 62 ± 3% (п=3), что не отличается от

таковой для Р-Б^-ЫШ» (62 ± 9% (п=3)), Р-Б^-ЖИР (61 ± 8% (п=3)), и РР-КЯР (63 ± 6% (п=3)). Более того, удаление Ы-концевой последовательности КНР, которая содержит несколько потенциальных участков фосфорилирования, не лишает КЯР способности ингибировать фосфорилирование миозина (см. рис.7).

РЛЦ. Р-РЛЦ" РЛЦ. Р-РЛЦ" РЛЦ. Р-РЛЦ-

РЛЦ. Р-РЛЦ-

РЛЦ. Р-РЛЦ-

время 0 0.5 1.5 3 6 10

контроль уЛ-КИР

Р-\л*-КРР (Сер13) (РКА)

Р-\М-ККР (Сер19) (МАРК)

РР-уЛ-КИР (РКА, МАРК) мин

=Г с

а.

40

100

-•-контроль

-О-Р-ККР (РКА) -•- Р-КРР (МАРК) •¿••РР-КИР

время (мин)

Рис. 4. Фосфорилирование ККР не влияет на его способность ингибировать фосфорилирование НММ под действием КЛЦМ и подавлять микроцис-

тиновое сокращение. А, Б: НММ фосфорилировали КЛЦМ-61 в присутствии 20 цМ КРР или Р-ККР. Показаны репрезентативные результаты мочевинно-глицеринового электрофореза с последующим иммуноблоттингом с

15 20 25 30 35 ' время, мин

антителами против РЛЦ (А), и график зависимости степени фосфорилирования РЛЦ НММ (средние значения (в % от полного) ± стандартная ошибка среднего (п = 2 - 7)) (Б). *Р < 0,05 по отношению к контролю. (В) Зависимость силы сокращения (% от максимальной при рСа 4,5), вызванного микроцистином (10 дМ), от времени инкубации в присутствии 10 цМ КЯР, Р-813-КЯР, Р-319-КЯР, Р-813,Р-819-ККР или диализного буфера (контроль). Данные представлены как среднее значение (п=5-7) ± стандартная ошибка среднего.

МАРК)

*

-•-контроль -с-уЛ-КРР -е- Р-УЛ-КР!Р (РКА) -•■-Р-уЛ-КРР (МАРК) ■^••РР-у^-КЯР (РКА +

Фосфорилирование ККР, также не влияет и на его способность подавлять развитие сокращения, индуцированного микроцистином (см. рис.

14

4В). Контрольные эксперименты показали, что KRP не фосфорилируется в ходе сокращения, индуцированного микроцистином, а фосфорилированный KRP не дефосфорилируется. Поэтому мы можем заключить, что фосфорилирование N-концевых аминокислотных остатков KRP не влияет на его способность ингибировать фосфорилирование РЛЦ миозина in vitro и ингибировать сокращение скинированных гладкомышечных волокон, индуцированное микроцистином.

Можно предположить, что несколько субстратов PKA/PKG, включая KRP, действуют скоординировано, препятствуя развитию сокращения. Для того чтобы проверить это предположение, мы исследовали действие P-S13-hKRP на микроцистин-зависимое сокращение в присутствии очищенных препаратов РКА или PKG. Однако оказалось, что ни РКА, ни PKG не влияют на развитие микроцистин-зависимого сокращения волокон и не усиливают эффект KRP вне зависимости от его фосфорилирования.

Известно, что KRP усиливает расслабление гладкомышечных волокон. Более того, данные литературы указывают на то, что фосфорилирование KRP под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ усиливает его эффект именно на стадии расслабления [29, 30]. В этой связи, представлялось целесообразным исследовать причинно-следственную связь между расслаблением, индуцируемым PKA/PKG, и фосфорилированием KRP.

Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его способность расслаблять гладкие мышцы, сокращённые при субмаксимальной концентрации кальция. Для того, чтобы исследовать эффект фосфорилирования KRP на более полную систему регуляции фосфорилирования миозина, мы обратились к модели расслабления волокон после Са2+-зависимого сокращения. В отличие от модели сокращения, индуцированного микроцистином, помимо Са2+-независимых киназ, здесь задействованы фосфатаза и киназа легких цепей миозина.

В наших опытах мы подтвердили, что добавление KRP индуцирует расслабление после субмаксимального сокращения волокон taenia coli, индуцированного повышением концентрации кальция (см. рис. 5Б). При рСа 6,3 добавление 10[iM KRP приводило к уменьшению силы сокращения на 28±9% (п = 7) за 15 минут, в то время как в контрольных волокнах, к которым не добавлялся KRP, наблюдалось медленное увеличение силы сокращения, постепенно выходящее на плато (см. рис. 5А). Оказалось, что фосфорилированные формы KRP вызывали такое же расслабление, как и нефосфорилированный белок (см. рис. 5В). Если эффект

нефосфорилированной формы KRP составлял 28±9% (п = 7), то эффект расслабления P-S13-hKRP, P-Sl9-hKRP и P-S13,P-S19-hKRP составил 28±9% (п=5), 29±2% (п=3) и 28±8%, (п=4), соответственно.

А

10 мин

10 мин

рСа >8 4,5

рСа >8 4.5

Ф ё

Рис. 5. KRP вызывает расслабление после субмаксимального Са2+-сокращения скинированных волокон, но эффект KRP не зависит от его фосфорилирования. Препараты скинииро-, ванных волокон taenia coli помещали в раствор с рСа 4,5 для инду-KRP P-13SKRP P-19SKRP PF4<RP Шфования контрольного

сократительного ответа, затем волокна перемещали в релаксирующий раствор. После этого волокна перемещали в раствор с рСа 6,3 до достижения плато сокращения, а затем помещали в раствор с той же концентрацией Са2+, содержащий буфер (А), либо 10 цМ hKRP (Б). Далее волокна отмывали раствором с рСа 6,3, не содержащим KRP. (В). Гистограммы показывают средние значения степени расслабления, вызванного 10 цМ KRP и P-KRP, после 15 мин. инкубации (в % от силы сокращения до добавления KRP) ± стандартная ошибка среднего (п = 3-7). *Р < 0,01 по сравнению с контролем, t-тест Стьюдента. Отрицательные величины в контроле означают, что в этих условиях наблюдалось медленное увеличение натяжения.

контроль

В дополнительных контрольных экспериментах было показано, что инкубация со скицированными волокнами в условиях, соответствующих условиям проведения эксперимента, не сопровождается уменьшением степени фосфорилирования Р-813-ЫЖР и Р-819-ЬКЯР. Таким образом, можно заключить, что КЯР вызывает расслабление после субмаксимального Са2+" зависимого сокращения, и этот эффект КНР не зависит от фосфорилирования исследуемого белка.

Фосфорилированный по Ser13 KRP не является посредником цАМФ- и цГМФ-зависимого расслабления в модели скицированных гладких мышц. В многочисленных исследованиях было установлено, что РКА и PKG вызывают расслабление гладких мышц [32, 33]. При этом высказывается гипотеза о том, что индуцируемое циклонуклеотид-зависимыми протеикиназами расслабление гладких мышц, по крайней мере, частично обусловлено фосфорилированием KRP по остатку Ser13 [13, 29, 34]. Мы предприняли попытку проверить это предположение. Оказалось, что фосфорилированный по Ser13 и очищенный от цАМФ-зависимой протеинкиназы РКА KRP вызывает расслабление скинированных волокон taenia coli столь же эффективно как нефосфорилированный белок (см. выше). Мы предположили, что фосфорилированный KRP усиливает эффект PKG или РКА, взаимодействуя с какими-либо другими фосфорилируемыми субстратами этих протеинкиназ. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние смеси фосфорилированного KRP и циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ на расслабление скинированных волокон, сокращенных при субмаксимальной концентрации кальция.

Мы обнаружили, что PKG не усиливает релаксирующий эффект P-S13-KRP. При этом изолированная PKG (0,18 цМ PKG, 50 |дМ 8Вг-цГМФ) не влияла на расслабление сокращённых при субмаксимальной концентрации Са2+ волокон. Степень расслабления волокон под действием PKG составила 5±9% (п=4), что статистически не отличается от контроля (0±6% (п=4), Р>0,05). В присутствии PKG, добавление 10 цМ P-Sl3-hKRP вызывает расслабление на 31±10% (п=4) за 15 минут. Это значение соответствует эффекту расслабления, вызываемому нефосфорилированным KRP в отсутствие PKG. Таким образом, в нашей модели PKG не усиливает эффекта KRP.

Аналогичные данные были получены в случае РКА и фосфорилированного KRP. Действительно, через 30 минут инкубации изолированный фосфорилированный KRP вызывает расслабление, составляющее 36±14%, (п=3). В аналогичных условиях изолированная РКА вызывает расслабление, составляющее 20±6%, (п=4). Смесь двух белков вызывает расслабление составляющее 62±8 % (п=2), что близко к сумме релаксирующих эффектов, индуцируемых изолированными белками (36+20=56%) Более наглядно это можно видеть на графике зависимости степени расслабления от времени, представленном на рис. 6. Как видно на рис.6, кривая, соответствующая алгебраической сумме кривых расслабления, индуцируемых изолированными РКА и KRP (выделена серым цветом),

полностью совпадает с экспериментальной вызываемого добавлением смеси ККР и РКА.

кривой расслабления,

Рис. 6. Аддитивный эффект РКА и KRP на расслабление сокращённых при субмаксимальной концентрации Са2+ скицированных волокон taenia coli. Препараты taenia coli для

контрольного сократительного ответа помещали в раствор с рСа 4,5, затем перемещали в релаксирующий раствор. Далее инкубировали в растворе с рСа 6,3 до достижения плато сокращения, а затем помещали в раствор с той же концентрацией Са2+, содержащий либо контрольный буфер, либо 32000 Ед./мл РКА, либо ЮцМ KRP, либо смесь KRP и РКА, и инкубировали 30 мин. Представлена зависимость степени расслабления (в % от силы сокращения до добавления KRP) ± стандартная ошибка среднего (п = 2-4) от времени инкубации. Серым цветом выделена кривая, представляющая собой алгебраическую сумму кривых расслабления, вызываемых изолированными KRP и РКА.

Таким образом, мы подтвердили, что добавление РКА к скинированным волокнам приводит к их расслаблению. При этом данная протеинкиназа способна фосфорилировать KRP. Однако два этих эффекта не связаны между собой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование KRP не является главной причиной расслабления, вызываемого РКА. Хотя циклонуклеотид-зависимое расслабление фазных гладких мышц и сопровождается эффективным фосфорилированием KRP [13], P-S13-KRP не является посредником в этом механизме расслабления, по крайней мере, в модели скинированных волокон. Вероятно, фосфорилирование KRP в мышцах всего лишь является следствием активации PKG или РКА.

Удаление С-концевой последовательности KRP приводит к потере его регуляторного эффекта на сократительную активность мышц. Известно, что KRP связывается с миозином в области соединения субфрагментов S1 и S2, в непосредственной близости от участка связывания РЛЦ [11, 12]. При этом KRP не влияет на фосфорилирование изолированных РЛЦ [35], в отличие от миозина или НММ, в которых область соединения

0 5 10 15 20 25 30

субфрагментов SI и S2 присутствует [10]. Мы предположили, что связывание KRP с миозином является необходимым условием для проявления его ингибиторного эффекта в отношении фосфорилирования легких цепей миозина и регуляции сокращения мышечных волокон. Считается, что С-концевой участок KRP (со 139 по 157 аминокислотный остаток для KRP курицы) играет ключевую роль в связывании с тяжелыми цепями миозина [11]. Поэтому для проверки нашего предположения мы исследовали влияние мутантного KRP, лишённого С-концевого участка, на фосфорилирование РЛЦ миозина в условиях in vitro и на сократительную активность гладких мышц.

Оказалось, что удаление С-концевых аминокислотных остатков со 139 по 157 лишает KRP способности ингибировать фосфорилирование регуляторных легких цепей в составе НММ под действием каталитического домена КЛЦМ (рис. 7 А, Б). Действительно, в отсутствие KRP (в контрольной реакции), уже через 5 минут инкубации удается достичь практически полного фосфорилирования легких цепей миозина (95±4%, (п=7)). В присутствии 20 цМ полноразмерного KRP (chiKRP-His6), пятиминутная инкубация с ферментом приводит к фосфорилированию лёгких цепей лишь на 29±4% (п=5). В то же время добавление 20 цМ делеционного мутанта KRP курицы без С-концевого участка (ДС-chiKRP-Hisa) приводит к тому, что за 5 минут инкубации удается достичь степени фосфорилирования легких цепей миозина, составляющей 87±12% (п=5) за 5 мин, что статистически не отличается от результатов, полученных в отсутствие KRP (Р>0,05, см. рис. 7 А, Б). Это означает, что С-концевая последовательность KRP необходима для ингибирования фосфорилирования РЛЦ миозина под действием КЛЦМ.

Удаление N-концевых аминокислотных остатков с 1 по 35, напротив, не лишает КНР способности ингибировать фосфорилирование РЛЦ миозина в составе НММ. Так, степень фосфорилирования регуляторных лёгких цепей на 5 минуте в присутствии 20 цМ KRP без N-концевого участка (AN-chiKRP-Hisft) составила 49±9% (п=5; Р<0,05 по сравнению с контролем). Таким образом, не только фосфорилирование KRP в N-концевой области не влияет на его ингибиторные свойства, но даже удаление самого N-концевого участка не лишает KRP способности ингибировать фосфорилирование миозина. Наличие С-концевого участка KRP, важного для связывания с миозином, напротив, критично для ингибирования. Это указывает на то, что связывание KRP с миозином является необходимым для ингибирования процесса фосфорилирования.

Аналогичные результаты были получены и в модели микроцистин-зависимого сокращения. Как видно на рис. 7В, ЛС-ЫЖР не влияет на развитие сокращения, индуцируемого микроцистином. В присутствии 10 цМ ДС-ЫШР не происходит увеличения лаг фазы сокращения по сравнению с контрольными волокнами.

А

контроль

ДЫ-КЯР

ДС-КЯР

КЯР

— —

1 2,5 5 20 1 2,5 5 20 1 2,5 5 20 1 2,5 5 20

РЛЦ

мин

ГГ с; а о.

60

20

а контроль а ДС-КРР ■ К(?Р а ДЫ-КРР

№

шш

1

Рис. 7. С-концевой участок КИР необходим для ингиби-рования фосфорили-рования РЛЦ и сокращения, индуцированного микроцистином. А, Б: НММ фосфорилировали КЛЦМ-61 в присутствии У"[32Р]АТФ. Реакцию проводили в отсутствие (контроль) или в присутствии 20 дМ СЫКЯР-ЬПЯЙ, ДС-сЫКЯР-Шэб или ЛЫ-сЫКЯР-Швб. Репрезентативные авторадиограммы и соответствующие электрофоре-граммы, окрашенные Кумасси 11-250 (А). Гистограммы (Б) показывают средние значения (в % от полного) ± стандартная ошибка среднего (п = 57) степени фосфорили-рования РЛЦ. *Р < 0,05 по отношению к контролю, ** Р < 0,05 по отношению к сЫКИР-Швб. (В). Зависимость силы сокращения (% от максимальной при рСа 4,5), вызванного микроцистином (10 дМ), от времени инкубации. Опыты проводили либо в присутствии 10 дМ ДС-М<ЖР, либо в присутствии буфера в котором был растворен КЯР (контроль). Данные представлены как среднее значение (п=5) ± стандартная ошибка среднего.

2.5

20

В

время, мин

ю т'

о

: О.

а =

I!

в ¡9

о (3 га 2

С 5

100

о

£

15 20 25 время, мин

Время, за которое достигалось 50% максимальной силы сокращения \.т, в присутствии 10 |иМ АС-ЬККР составило 8,4 ± 1,6 мин, что не отличается от

контроля - 7,4 ± 0,6 мин (п=5; Р>0,05). Сила сокращения волокон после 40 мин инкубации с микроцистином в присутствии 10 цМ ДС-hKRP составила 92 ± 2% от Fmax по сравнению с 93 ± 3% в контрольных волокнах (п=5; Р>0,05).

Помимо этого оказалось, что ACKRP не вызывает расслабления предсокращенных под действием Са2+ гладкомышечных волокон taenia coli. После 15 минут инкубации волокон с 10 цМ AC-hKRP, степень расслабления составила (-8) ± 1%, по сравнению с (-6) ± 4% в контроле (п=3; р>0,05).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что С-концевой участок необходим для индуцированного белком KRP ингибирования фосфорилирования миозина и индуцированного микроцистином сокращения, а также для расслабления гладкомышечных волокон. Это свидетельствуют о том, что связывание KRP с миозином играет ключевую роль в расслаблении мышц. Мы предполагаем, что KRP, связываясь с миозином в непосредственной близости от регуляторных лёгких цепей, препятствует их фосфорилированию. Это приводит к смещению равновесия в сторону дефосфорилирования миозина и снижению сократительного ответа гладких мышц.

Заключение

Данные, полученные в ходе нашего исследования, говорят о том, что KRP является не специфичным к КЛЦМ, но более универсальным ингибитором фосфорилирования миозина. KRP предотвращает фосфорилирование легких цепей миозина как под действием киназы легких цепей миозина, так и неканонических Са2+-независимых протеинкиназ. Указанный эффект KRP обусловлен его связыванием с миозином и, вероятно, стерическим блокированием участка фосфорилирования легкой цепи миозина. Ингибирующий эффект KRP не зависит от его фосфорилирования по остаткам Ser13 или Ser19, катализируемым PKA/PKG или МАРК. Несмотря на то, что фосфорилирование по Ser13 коррелирует по времени с цАМФ- и цГМФ-зависимым расслаблением мышечных волокон [12, 35], фосфорилирование KRP не является необходимым условием для развития расслабления, индуцируемого циклонуклеотид-зависимыми

протеинкиназами, по крайней мере, в модели скинированных гладкомышечных волокон.

выводы

1. KRP в условиях in vitro иигибирует фосфорилирование миозина под действием киназы легких цепей миозина, лишённой KRP-домена.

2. KRP тормозит развитие индуцированного микроцистином сокращения скинированных волокон taenia coli, препятствуя фосфорилированию легких цепей миозина.

3. Фосфорилирование под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на способность KRP ингибировать фосфорилирование миозина in vitro, а также на способность KRP ингибировать индуцированное микроцистином сокращение и вызывать расслабление после Са2+-зависимого сокращения скинированных гладкомышечных волокон.

4. С-концевая последовательность KRP играет ключевую роль в способности этого белка ингибировать фосфорилирование легких цепей миозина, индуцированное микроцистином сокращение и вызывать расслабление после Са2+-зависимого сокращения скинированных гладких мышц.

5. Предложен новый механизм функционирования KRP, согласно которому этот белок иигибирует фосфорилирование миозина и сокращение гладких мышц, связываясь с миозином и затрудняя доступ протеинкиназ к регуляторным лёгким цепям миозина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Shcherbakova О.Y.. Serebryanaya D.V., Postnikov А. В., Schroeter M. M., Zittrich S., Noegel A. A., Shirinsky V. P., Vorotnikov A. V. and Pfitzer G. Kinase Related Protein / telokin inhibits microcystin-induced Ca2+-independent contraction in triton skinned guinea pig taenia coli.// Biochem. J. - 2010 -V.429-P.291-302

2. Воротников А. В., Щербакова О. В.. Кудряшова Т. В., Тарасова О. С., Ширинский В. П., Пфитцер Г., Ткачук В. А. Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции сокращения гладких мышц.//РФЖ - 2010 - Т.95 №10-С. 48-63

3. Секридова, А. В., Сидорова, М. В., Азьмуко, А. А., Молокоедов, А. С., Бушуев, В. Н., Марченко, А. В., Щербакова. О. В., Ширинский, В. П., Беспалова, Ж. Д. Пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина,

устойчивые к действию пеитидаз. // Биоорганическая химия — 2010 - Т.36 - №4 - С.461—467

4. Серебряная Д.В., Щербакова О.В.. Дуднакова Т.В., Ширинский В.П., Воротников A.B. KRP/телокин разнонаправлено регулирует филаментообразование и фосфорилирование лёгких цепей немышечного миозина II в фибробластах. // Биофизика. - (2006) - Т. 51 - №5 - С.866-874

Тезисы докладов

1. Shcherbakova О.У.. Serebryanaya D.V., Postnikov А. В., Shirinsky V. Р., Vorotnikov А. V. and Pfitzer G. (2008) Kinase-related protein (KRP, telokin) inhibits regulatory myosin light chain phosphorylation and Ca2+-independent skinned fiber contraction. Abstracts presented at the XXXVII European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research - Oxford (UK), J.Muscle Res Cell Motil, 29,289

2. Shcherbakova O.V.. Serebryanaya D.V., Postnikov A.B., Khapchev A.Yu., Shirinsky V.P., Pfitzer G., Vorotnikov A.V. (2008) Inhibition of myosin light chain phosphorylation and skinned fiber contraction by Kinase Related Protein (telokin). Abstracts of International Simposium "Biological Motility: achievements and perspectives", Pushchino, Russia, 10-11

3. Marchenko A.V., Shcherbakova O.V.. Stepanova O.V., Sidorova M.V., Bushuev V.N., Bushueva T.L., Bespalova Z.D., Shirinsky V.P. (2008) Effects of cell-permeant peptide inhibitor of Myosin Light Chain Kinase on endothelial and neutrophil motility. Abstracts of International Simposium "Biological Motility: achievements and perspectives", Pushchino, Russia, 238-240

4. Kulikova I.M., Shcherbakova O.V.. Serebryanaya D.V., Khapchaev A. Yu., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V. (2006) Contribution of N- and C-termini of Kinase Related Protein (KRP) to myosin activation and fibroblast motility, Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice", Pushchino, Russia, 81-83

5. Serebryanaya D.V., Chadin A.V., Kulikova I.M., Shcherbakova O.V.. Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V. (2006) Ectopic expression of KRP/ telokin accelerates 3T3 fibroblast motility at low levels of myosin II regulatory light chain phosphorylation, Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice", Pushchino, Russia, 108

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 08-04-01721); German Research Foundation (проекты SFB 612, ТР-В12) и DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Ogut, О., Brozovich, F.V.// J. Cell. Mol. Med. - 2008. - V.12. - P.2158-2164.

[2] Barany, M. Biochemistry of Smooth Muscle Contraction. / Academic Press: San Diego -1995.-418

Puetz, S. et al.// Physiology (Bethesda). - 2009. - V.24 - P.342-356. Kureishi, Y et al. //J. Biol. Chem. - 1997. - V.272. - P.12257-12260. Niiro, N., Ikebe, M. III. Biol. Chem. - 2001. - V.276. - P.29567-29574.. Deng, J. Т., et al.// J. Biol. Chem. - 2001. - V.276. - P. 16365-16373.. Murthy, K. S. //Annu. Rev. Physiol - 2006. - V.68. - P.345-374. Kamm, К. E., Stull, J. T.// J. Biol. Chem. - 2001. - V.276. - P.4527-4530. Krymsky, M. A. et al. J. Muscle Res. Cell Motil.. - 2001. - V.22. - P.425^437. Shirinsky, V. P. et al. III. Biol. Chem. - 1993. - V.268. - P. 16578-16583. Silver, D. L. et al.// J. Biol. Chem. - 1997. - V.272. - P.25353-25359. Masato, Т., Numata, T III. Biochem. - 1997. - V.121. - P.225-230.. Khapchaev, A. Y. et al. //Biochem. (Moscow) - 2004 - V.69. - P.789-798. Bradford, M. M. //Anal. Biochem. - 1976. - V.12. - P.248-254.. Laemmli, U. K. //Nature - 1970. - V.227. - P.680-685. Persechini, A. et al. III. Biol. Chem- 1986. - V.261. - P.6293-6299. Towbin, H. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1979. - V.76. - P.4350-4354. Cohen, S. N. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1972. - V.69 - P.2110-2114. I to, M„ et al.// J. Biol. Chem. - 1989. - V.264. - P.13971-13974. Lincoln, T. //Met. Enz. Academic Press, Inc. -1983. - 99. - P. 62-72. Sellers, J. R. et al. // J. Biol. Chem. - 1981. - V.256. - P.13137-13142. Ikebe, M. et al. // J. Biol. Chem. - 1989. - V.264 - P.6967-6971. Wirth, A. et al. // J. Physiol. - 2003. - V.549 - P.489-500. Fabiato, A., Fabiato, F. // J. Physiol. (Paris). - 1979. - V.75 - P.463-505. Ihara, E„ Macdonald, J. A. // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2007. - V.87. - P.79-87. Weber, L. P. et al.// J. Physiol. - 1999. - V.516 - Pt 3- P.805-824. Ihara, E. et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.. - 2007. - V.293. - P.G699-G710.

Серебряная, Д. В.: дисс. канд. биол. наук: 03.00.04/ - М. 2006. - 130 с. Wu, X. et al. et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273 - P.l 1362-11369. Khromov, A. S. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2006. - V.103. - P.2440-2445. Sobieszek, A. et al. // Biophys. Chem. - 2005. - V. 113. - P.25^0. Lincoln, Т. M. et al. // J. Appl. Physiol - 2001. - V. 91. - P. 1421-1430. Morgado, M. et al.//Cell. Mol. Life Sci. -2012,-V.69.-P.247-266. Walker, L. A. et al. // J. Biol. Chem. - 2001. - V.276 - P.24519^24524. Collinge, M. et al. // Mol. Cell. Biol. - 1992. - V.12. - P.2359-2371. Puetz, S. et al. // Acta Physiol. - 2010 - P.198.

Подписано в печать 19.10.2015 Бумага офсетная. Формат 60*90 1\16.Усл.печ.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ №1607 ФГБУ «Российская государственная библиотека» 119019, Москва, ул.Воздвиженка 3/5