Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц

Хапчаев, Аскер Юсуфович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц"

Хапчаев Аскер Юсуфович

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА И БЕЛКА

KRP В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Хапчаев Аскер Юсуфович

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА И БЕЛКА KRP В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности НИИ Экспериментальной Кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, А.В. Воротников

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В.П. Ширинский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Гусев

кандидат биологических наук, А.А. Минин

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 21 апреля 2004 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан марта 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В состав всех внутренних органов и кровеносных сосудов входят гладкие мышцы, нормальное функционирование которых немаловажно для поддержания работы всех систем организма. Поэтому развитие многих патологических состояний, таких как гипертоническая болезнь, инсульт, сосудистые дистонии и др., сопряжено с функциональными нарушениями сокращения гладких мышц. Для эффективной коррекции дисфункций гладких мышц необходимо понимание молекулярных основ регуляции их активности. Исследования в области регуляции сокращения гладких мышц актуальны как с фундаментальной научной, так и прикладной биомедицинской точек зрения.

Сокращение гладких мышц осуществляется за счет относительного скольжения тонких актиновых и толстых миозиновых филаментов аналогично сокращению поперечнополосатых мышц. Однако миозин гладких мышц требует дополнительной активации фос-форилированием, осуществляемой киназой легких цепей миозина (КЛЦМ). Возрастание цитоплазматической концентрации свободного Са2+ ([Са2*],) и связывание Са2+ с первичным акцептором кальциевого сигнала белком кальмодулином (СаМ) приводит к активации КЛЦМ и развитию сокращения. Генетический локус КЛЦМ кодирует несколько белковых продуктов: высокомолекулярную и низкомолекулярную изоформы КЛЦМ, а также миозин-связывающий белок КЯР, не обладающий протеинкиназной активностью. Как показали исследования последних лет, функция КЯР также тесно связана с регуляцией активности миозина, хотя механизм действия КЯР все еще до конца не ясен. В дополнение к прямому участию Са2+/СаМ, фосфорилирование белковых продуктов генного локуса КЛЦМ обеспечивает тонкую регуляцию их внутриклеточной активности. В последнее время появились данные об активации КЛЦМ ее фосфорилированием пролин-направлен-ными МАР-киназами и о роли фосфорилирования КЯР в регуляции расслабления гладких мышц. Кроме того, развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при пони-женой концентрации внутриклеточного Са2+ в ответ на стимуляцию форболовым эфиром (РББи) может быть связано с отсутствием в этой ткани КЯР и увеличением степени фосфорилирования КЛЦМ, тогда как отсутствие такой реакции у фазной висцеральной мускулатуры может объясняться наличием в этой ткани КЯР и/или отсутствием фосфорилирования КЛЦМ. В то же время остались неясными ни внутриклеточный механизм проведения сигнала к фосфорилированию этих белков, ни ключевые модифицируемые остатки, ни биологический смысл их фосфорилирования.

Данная работа сфокусирована на изучение значимости фосфорилирования КЛЦМ и КЯР в регуляции сократительного ответа тонических гладких мышц сосудов и фазных

мышц висцеральных органов. В частности, было исследовано фосфорилирование KRP в процессе сокращения-расслабления фазной гладкомышечной ткани, вклад МАР-киназ в обеспечение тонического ответа при пониженной [Са2+]„ а также фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназами и возможные последствия такого фосфорилирования.

Цель и задачи исследований. На основании вышесказанного целью настоящей работы являлось исследование роли МАР-киназ и фосфорилирования КЛЦМ и KRP в регуляции Са2+-чувствительности и сократительной активности гладких мышц. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать вклад МАР-киназ в развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов, зависимого от активации протеинкиназы С.

2. Определить остатки, фосфорилируемые в КЛЦМ и KRP МАР-киназами in vitro и участки фосфорилирования этих белков в гладкой мускулатуре, стимулированной PDBu.

3. Изучить связь между фосфорилированием индивидуальных остатков КЛЦМ и KRP и сократительной активностью гладких мышц.

4. Исследовать эффект МАР-киназ на каталитическую активность КЛЦМ и связывание КЛЦМ с актином и миозином in vitro.

5. Изучить влияние фосфорилирования КЛЦМ на ее взаимодействие с гладкомышечным сократительным аппаратом.

Научная новизна работы. Обнаружено, что ингибиторы каскадов и р38

МАР-киназ снижают развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при активации протеинкиназы С, что указывает на роль МАР-киназ в повышении Са2+-чувстви-тельности сократительного аппарата гладких мышц. Установлены остатки и возможные функциональные последствия фосфорилирования КЛЦМ МАР-киназами, в частности регуляция связывания КЛЦМ с актомиозином гладких мышц фосфорилированием. Исследована сайт-специфичная динамика фосфорилирования КЛЦМ и KRP при сокращении-расслаблении гладких мышц и установлена корреляция между фосфорилированием этих белков и развитием или отсутствием сократительного ответа ткани.

Практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции гладкомышечного сокращения при фосфо-рилировании регуляторных белков. Обнаруженные функциональные эффекты фосфорилирования КЛЦМ и корреляции между фосфорилированием КЛЦМ и KRP и сократительной активностью гладких мышц дают основу новым интересным гипотезам, описывающим регуляторный аппарат гладких мышц.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах "Биологическая подвижность: современные методы иссле-

дования" (Пущино, Россия, 2001), на 30-ой, 31-ой и 32-ой Европейских мышечных конференциях (Павия, Италия, 2001; Люнтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 245 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение концентрации белков. Концентрацию белков определяли методом (Lowry et al, 1951) или (Bradford, 1976).

Электрофорез и денситометрия. Препараты белков и экстракты тканей подвергали электрофорезу в пластинах 6-12% ПААГ по методу (Laemmli, 1970). Замороженные образцы ткани растирали под слоем жидкого азота с двукратным буфером для образцов по Лэмм-ли (20:1, v/w), кипятили 3 мин, центрифугировали (lOOOCg, 5 мин) и надосадочную жидкость использовали для электрофореза. Для окраски гелей Кумасси-К-250 нагрузка дорожек составляла 0,4—3 цг для очищенных препаратов белка и 15-25 цг общего белка для образцов ткани. Для последующего иммуноблоттинга наносили 50-250 нг очищенного белка, а необходимое количество тканевого образца подбирали экспериментально. Денситометрический анализ окрашенных Кумасси-Я-250 гелей проводили с помощью программы Scion Image после сканирования (сканер Hewlett-Packard HP-Hex).

Иммуноблоттинг проводили по методу (Towbin et al., 1970) с модификациями. Электроперенос (100В/350мА) проводили на фильтры PVDF (Amersham, Великобритания): KRP в течение 1 часа в 10 мМ Caps, рН 11,0, 10% этанол, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, а КЛЦМ и другие белки - 2 часа в 25 мМ трис, 180 мМ глицин, рН 8,3,20% этанол, 0,1% ДСН. Фильтр блокировали 1 час при комнатной температуре 5% раствором обезжиренного молока в буфере ТСБ-Т (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 165 мМ NaCl, 0,05% Твин-20). Инкубацию как с первичными, так и вторичными антителами проводили 1 час при комнатной температуре в ТСБ-Т в разведениях, рекомендованных производителем. Использовали моноклональные антитела к КЛЦМ (клон К36, Sigma, США), наборы антител к и р38 МАР-киназам и их фос-

фо-формам (New England Biolabs, США), вторичные антитела, конъюгированные с перокси-дазой хрена, (Amersham, Великобритания и Pierce, США). Белковые полосы выявляли хеми-люминесцентной детекцией (Amersham, Великобритания) или 3,3'-диаминобензидином (Sigma, США). Время экспозиции иммуноблотов варьировали в зависимости от интенсивности сигнала от 0,4 до 30 мин.

Коседиментационный анализ. При исследовании связывания КЛИМ и ее фрагментов с F-актином (10 цМ), миозином (2 цМ) или нативными миофиламентами эксперименты: проводили при 15°С в буфере МРВ (10 мМ Mops, рН 7,0, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭГТА, 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ). В этот же буфер переводили все использованные в работе белки. КЛЦМ (0,4-0,8 цМ) или ее фрагменты: (77кКЛЦМ, 0,6-1,2 рМ; KRP, 0,77,0 цМ; N75, 1-20 цМ) вносили в пробу (40 цл) последними, инкубировали 20 мин при < комнатной температуре и центрифугировали (100000g, 30 мин) в роторе LP42Ti (Beckman, США). Для анализа пучкования F-актина 10 цМ G-актин инкубировали 10 мин при комнатной температуре в 10 мМ Mops, рН 7,0,10 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА в присутствии N75 (0,5-16 цМ). Полимеризацию актина инициировали 5 мМ MgCb, инкубировали 40 мин и центрифугировали при 13000g. Распределение белков между надоса-дочной жидкостью и осадком анализировали иммуноблоттингом или электрофорезом и окрашиванием Кумасси R-250, а в случае фосфорилирования белков в присутствии у-[32Р]АТР - авторадиографией.

Фосфорилирование белков in vitro. Очищенные KRP, КЛЦМ и ее фрагменты N75 и 77кКЛЦМ фосфорилировали рекомбинантными GST-p44ctkl, GST-p38, MBP-XPAK1 и коммерчески приобретенными каталитической субъединицей РКА и GSK-3. Степень фос-форилирования определяли по включению радиоактивности, используя в ка-

честве субстрата, а для N75 и KRP также по изменению подвижности фосфобелков в ПААГ. Все реакции фосфорилирования проводили при 30°С в буфере РВ: 10 мМ Mops, рН 7,0, 20 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,2 мМ ЭГТА в присутствии 1 мМ АТР и 5 мМ MgCl2. В случае использования у-[32Р]АТР его содержание бышо 0,5-1,0х10б распадов/нмоль. Активацию GST-p38 и GST-p44<rtI МАР-киназ осуществляли фосфорилированием в течение 30 мин (20:1, мг/мг) соответственно конститутивно активными МВР-МКК6 или ddMeklca-His6. KRP (40 цМ) фосфорилировали в молярном соотношении фермент:KRP 1:100 для РКА, 1:10 для МВР-ХРАК1, 1:20 для GST-p44erkl и GST-p38 МАР-киназ. Фосфорилирование КЛЦМ (3 цМ) GST-p44Hkl МАР-киназой проводили в соотношении 10:1 (моль/ моль) в течение 90 мин. Затем добавляли 1 мМ АТР и инкубировали 90 мин. Делали еще одну добавку 1 мМ АТР и GST-p44CTkl МАР-киназы из расчета 20:1 (моль/моль) и инкубировали еще 90 мин. 77кКЛЦМ (6 цМ) фосфорилировали аналогично полноразмерной КЛЦМ. N75 (100 цМ) фосфорилировали GST-p44etl МАР-киназой в молярном соотношении фермет:Ш5 10:1.

Определение акт ивности КЛЦМ. Фосфорилирование НММ фосфорилированной или контрольной КЛЦМ (1,6 |1г/мл =13 нМ) проводили в буфере МРВ при 25°С в присут-

ствии 0,5 мМ АТР, 0,5 мМ Са2+, в конечном объеме 15 ил. При определении Км для СаМ в качестве субстрата КЛЦМ использовали 10 цМ НММ. Концентрацию СаМ при этом варьировали в пределах от 0,5 до 50 нМ. При определении Км для НММ концентрация СаМ была 300 нМ, а НММ варьировали от 1 до 10 иМ. Реакцию инициировали внесением НММ. Через 2,5 мин реакцию останавливали добавкой равного количества двукратного буфера образца. Образцы анализировали электрофорезом и авторадиографией.

Фосфоаминокислотный анализ. Фосфорилированные in vitro в присутствииу-[32Р]АТР белки диализовали против Н2О и подвергали частичному гидролизу в 10 цл 6N НС1 (110°С, 2 часа), образцы разбавляли в 10 раз и лиофилизовали. Процедуру повторяли 3 раза. Лиофи-лизат растворяли в минимальном объеме (5-6 цл) электродного буфера (5% НСООН, 15% СНзСООН), содержащего по 2 иг стандартных P-Ser, P-Thr и Р-Туг, и наносили на пластины DC-Plastikfolien Cellulose (Merck, Германия). Электрофорез (1000В, 4°С, 60-120 мин) проводили в горизонтальной камере Multiphor II (LKB, Швеция). Высушенные пластины окрашивали 0,25% раствором нингидрина в ацетоне и анализировали авторадиографией.

Двумерное фосфопептидное картирование. Белки, фосфорилированные в присутствии у-[32Р]АТР, разделяли электрофорезом и окрашивали Кумасси R-250. Полоски белка, содержащие радиоактивную метку, вырезали, отмывали последовательными промывками в 3-4 мл 25% изопропилового спирта, а затем в 3-4 мл 40% С2Н5ОН и гомогенизировали в 200-250 ил 40% С2Н5ОН. Полученные образцы лиофилизовали в системе SpeedVac SCI 10 (FTS Systems, США), суспендировали в 1 мл 100 мМ NH4HCO3 рН 8,0, и гидролизовали белок двукратным добавлением 25 цг трипсина, обработанного ТРСК (Worthington Biochem. Corp., США), при 37°С при перемешивании в течение 2 часов. Для полноты гидролиза добавляли еще 50 иг трипсина и инкубировали при тех же условиях 12 часов. Образцы дважды центрифугировали (9500g, 15 мин), удаляя осадок, и лиофилизовали. Образец смывали со стенок пробирки в 500 цл Н2О и повторяли лиофилизацию до полного удаления NH4HCO3. Полученный продукт растворяли в 10 цл 15% СНЦСООН и 5% НСООН. Электрофорез (первое направление) проводили на пластинах Silica Gel 60 (Merck, Германия) в горизонтальной камере Multiphor II (LKB, Швеция) при 1000В (75 мин, 10°С). После высыхания пластины проводили восходящую хроматографию в п-бутанол / пиридин / СЦСООН / Н2О (150/150/40/160, v/v). Фосфопептиды визуализировали авторадиографией на пленке Kodak Biomax.

Аффинная очистка антител R5 и R8. Рекомбинантный человеческий KRP (3 мг) кова-лентно пришивали к CNBr-активированной Sepharose 4B (Pharmacia Biotech., Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Сыворотку R5 (анти-фосфо-Ser13) размораживали, наносили на колонку, заполненную полученной KRP-Сефарозой, и в охлажденную про-

бирку собирали фракцию антител, проходящих в свободном объеме. Процедуру очистки повторяли 2 раза. Аналогично истощали сыворотку R8 (анти-фосфо-Ser19). Полученные аффинно очищенные антитела (RS и R8 соответственно) хранили при -20°С и использовали в иммуноблоттинге с разведением 1:1000-5000.

Очистка рекомбинантных белков. Бактериальную экспрессию белков проводили в клетках Е. coli штамм BL21 (DE3)pLys. Экспрессию индуцировали изопропил-Р-О-тиога-лактопиранозидом (З мМ) при достижении плотности культуры Agoo-0,6-0,8. Через З часа клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 мин), ресуспендировали в 20 мл буфера (25% сахароза, 0,2 M КО, З0 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,2 мМ ТРСК, 0,5 мМ PMSF, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА), а в случае рекомбинантных белков, содержащих Hise- или GST-таговую последовательность, осадок суспендировали в соответствующем буфере для аффинной хроматографии. Клетки разрушали с помощью обработки ультразвуком (Branson SONIFIER 450, Branson Ultrasonics Corp., США). Полученный ли-зат центрифугировали (9000g, 20 мин) и из надосадочной жидкости выделяли рекомби-нантный белок. KRP высаливали в диапазоне 40-60% насыщения (NH4)2SO4 Осадок диа-лизовали против З0 мМ КС1, З0 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ PMSF и наносили на колонку Q-Sepharose (Pharmacia Biotech., Швеция) и элюировали линейным 0,0-0,6 М градиентом NaCl. Фракции, содержащие KRP, объединяли, диализо-вали против 2 M (NH4)2SO4, 1 мМ СаС12, З0 мМ Tpnc-SO4, рН 7,5, 20 мМ 2-меркапто-этанол и проводили хроматографию на октил-сефарозе (Pharmacia Biotech., Швеция), элюируя ниспадающим 2-0 M градиентом (NH4)2SO4 Химерные GST (IлуIaтион-S-TpaHC-фераза)-, MBP (maltose-binding protein)- и His6-тaговые белки очищали, согласно протоколам производителей, аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе (Pharmacia Biotech., Швеция), Amilose-resin (New England Biolabs, США) и TALON (Clontech, США) соответственно. Рекомбинантные белки диализовали против МРВ и хранили при -20°С.

Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц (Spudich and Watt, 1971).

Нашивные миофиламенты из поперечного слоя гладких мышц тонкого кишечника (ileum) крысы получали как описано в Smith et al. (1999).

Конструирование фрагмента N75 КЛЦМдля бактериальной экспрессии. ДНК фрагмента получали полимеразной цепной реакцией (ПЦР), используя конструкт pEGFP/KJHJM-210 в качестве матрицы, со следующими праймерами: 5' праймер - 5'-tgcficatggacttccgagcaaacctgc и З' праймер - 5'-tatctcgaggctgccattctctgcagggg. Праймеры содержали участки рестрикции эндонуклеазами Ncol и Xhol соответственно (подчеркнуты). По данным участкам рестрикции клонировали ПЦР-продукт в вектор pET2ld(+)

(Novagen, США). ПЦР проводили в приборе фирмы Hybaid Omnigene (Великобритания), используя Püi-Ultia ДНК-полимеразу (Promega, США). Праймеры конструировали с помощью программы Vector NTI Suite 5.5 и синтезировали коммерчески.

Трансформацию бактериальныхклеток (BL2IpLys или DH5<X, 100 цл) осуществляли 10 нг плазмидной ДНК, подвергая клетки тепловому шоку (42°С) в течение 45 сек. Клетки инкубировали 1 час при 37°С при постоянном перемешивании, осаждали (4000g, 5 мин) и растирали на чашках с агаром с соответствующими антибиотиками. Репликацию плазмидной ДНК проводили в клетках Е. coli штамм DH5a. Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью наборов фирмы Qiagen (Германия) по протоколу производителя.

Точечные аминокислотныезамены вводили согласно протоколу QuikChange Site-Directed Mutagenasis Kit фирмы Stratagene (США). Для замены Ser19 KRP на Ala в конструкте pET22b(+)/KRP использовали праймеры 5'-cagggtcaccaaccgccccgctcaatgc и 5'-gcattgagcggggcggttggtgaccctg. Для замены Thr43 фрагмента КЛЦМ N75 на Ala использовали праймеры 5'-ggcaccccaaaggccccactgcc и 5'- ggcagtggggcctttggggtgcc.

Измерение сократительной активности мышц. В экспериментах использовали кольцевые препараты аорты 2-3 мм и полоски 3x6 мм Неит крысы. Ткань монтировали продольно мышечным волокнам в горизонтальную камеру прибора для измерения изометрического сокращения (WPI Instruments, США), содержащую раствор Тироде при постоянной подаче карбогена при 37°С, и растягивали в 1,3-1,4 раза, приводя базальное натяжение к стационарному уровню в 0,1-0,15 г. Силу сокращения регистрировали одновременно в двух камерах. Препараты Неит стимулировали 60 мМ КС1, 20 иМ карбамоилхолина, или 0,1-1 uM PDBu. После достижения плато максимального изометрического сокращения расслабление вызывали без смены среды, добавляя форсколин до 10 цМ. Сокращение препаратов аорты стимулировали 0,1 uM PDBu или 10 цМ фенилэфрина. После развития сокращения активатор отмывали раствором Тироде и инкубировали препараты 1 час в присутствии ингибиторов PD98059 (60 цМ) и/или SKF86002 (20 цМ) (Calbiochem, США). После этого стимулировали повторное сокращение 0,1 цМ PDBu.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В гладких мышцах не наблюдается прямой зависимости между увеличением [Са2+], и развиваемым сокращением. Это обусловлено наличием регуляторных механизмов, которые приводят к изменению чувствительности сократительного аппарата к Са2+ — так называемой Са2+-сенситизации сокращения. Модуляция Са2+-чувствительности присходит путем фосфо-рилирования регуляторных сократительных белков при активации различных сигнальных

каскадов. Форболовый эфир (PDBu) вызывает сокращение тонических гладких мышц сосудов в бескальциевой среде, но не фазных гладких мышц висцеральных органов. При этом в сосудистых гладких мышцах происходит увеличение степени фосфорилирования КЛЦМ и KRP, а в фазных - только KRP (Krymsky, 2001). Экспрессия KRP в тонических гладких мышцах чрезвычайно низка, что позволяет исключить его регуляторную роль в этом типе гладких мышц. Напротив, в фазных гладкомышечных тканях внутриклеточная концентрация KRP сопоставима с концентрацией миозина, единственной известной мишени, с которой взаимодействует KRP (Shirinsky et al., 1993).

Фосфо- и сайтоспецифичные антитела против КЛЦМ. KRP является мажорным фосфобелком in vivo, и фосфорилирование KRP и KRP-домена КЛЦМ изменяется при стимуляции гладкомышечных тканей PDBu (Krymsky, 2001). Фосфорилирование протекает по Ser13 и Ser19 KRP и соответствующим им Ser828 и Ser834 в КЛЦМ. Однако анализ фосфорилирования каждого из участков при различных физиологических состояниях ин-тактной гладкомышечной ткани затруднен их относительно близким расположением. В нашей лаборатории были получены антитела, специфично узнающие фосфорилированные РКА Ser13 KRP и Ser828 КЛЦМ (антитела R5) и фосфорилированные МАР-киназой Ser19 KRP и Ser834 КЛЦМ (антитела R8). После аффинной очистки антитела R5 в иммуноблот-тинге реагировали с KRP человека, фосфорилированным РКА или РКА и МАР-киназой вместе. В то же время они не окрашивали нефосфорилированный KRP и KRP, фосфори-лированный только МАР-киназой. Аналогичные результаты были получены для антител R8, которые специфично связывались с KRP, фосфорилированным МАР-киназой, и их связывание не изменялось при фосфорилировании Ser13 KRP. Оба типа интител избирательно взаимодействовали только с KRP и КЛЦМ в экстракте гладкомышечной ткани млекопитающих и, следовательно, были пригодны для анализа фосфорилирования Ser и Ser19 KRP и гомологичных им Ser828 и Ser834 КЛЦМ in vivo.

Динамика фосфорилирования Ser13 и Ser19 KRP при сокращении и расслаблении фазных гладких мышц была исследована в двух группах экспериментов с препаратами интактной мускулатуры ileum крысы, используя фосфоспецифичные антитела R5 и R8: 1) Са2+-зависимое сокращение под действием КС1 и карбамоилхолина с последующим расслаблением под действием активатора аденилатциклазы форсколина; 2) ileum последовательно стимулировали PDBu и форсколином. Уровень фосфорилирования KRP при развитии сокращения не претерпевал существенных изменений (рис. 1). В то же время, обработка ткани не вызывающим сокращения PDBu приводила к возрастанию фосфори-лирования Ser13 KRP в 4-5 раз. Аналогичное 4-5-кратное повышение степени фосфорили-

рования KRP по Ser13 вызывал форсколин, добавленный к ткани после сокращения под действием КС1 или карбамоилхолина. Внесение форсколина в присутствии PDBu не приводило к дальнейшему росту степени фосфорилирования Ser13, возможно, отражая полное фосфорилирование KRP по данному участку уже при активации РКС. Степень фосфорилирования Ser19 KRP изменялась незначительно и не превышала 1,5-кратного увеличения при стимуляции гладкой мышцы PDBu.

Рис. 1. Фосфорилирование КНР при стимуляции фазных гладких мышц к сокращению и расслаблению. Интакт-ный препарат ileum крысы стимулировали 60 мМ KCl (А), 20 цМ карбамоил-холином (Б), или 1 мМ PDBu (В). После достижения максимального сокращения (PDBu не вызывает сокращения фазных мышц по Krymsky et al, 2001) мышцу стимулировали к расслаблению 10 цМ форсколином. Фосфорилирование KRP в быстрозамороженных препаратах в обозначенных стрелками точках измеряли иммуноблоггингом экстрактов с помощью подоклональных и фосфоспе-цифических антител R5 и R8 как обозначено. Представлены механограм-мы (верхние панели) и репрезентативные иммуноблоты (нижние панели).

Обшая степень фосфорилирования КЛЦМ в фазной гладкой мышце остается неизменной при обработке PDBu (Крымский, 2001). В использованных нами физиологических моделях с Са2+-индуцируемой стимуляцией сокращения и последующим расслаблением мы обнаружили базальное фосфорилирование КЛЦМ по остаткам Ser828 и Ser834. Однако уровень фосфорилирования КЛЦМ при обработке ткани КС1, карбамоилхолином и PDBu не изменялся - обнаружено только 1,5-2-кратное увеличение фосфорилирования КЛЦМ при воздействии форсколина по Ser828, гомологичному Ser13 KRP. Следовательно, фосфорилирование Ser13 KRP изменяется in vivo при активации не только циклонуклеотид-зави-симых протеинкиназ, но и других сигнальных каскадов, связанных с активацией РКС — основной мишени действия форболовых эфиров. При этом фосфорилирование Ser19 KRP, Ser828 и Ser834 КЛЦМ изменяется незначительно.

Уровень эндогенного фосфорилирования Ser13 и Ser19 KRP in vivo мы определяли с помощью антител R5 и R8 на нестимулированном препарате ileum крысы, используя в качестве контроля сравнения рекомбинантный KRP человека, полностью фосфорилиро-ванный in vitro РКА или МАР-киназой. Различные количества мышечного экстракта и возрастающие количества стандартного KRP анализировали иммуноблотгингом с антителами R5, R8 и фосфонезависимыми поликлональными антителами. При сохранении линейной зависимости между количеством белка и интенсивностью сигнала мы опреде-

лили количество тотального KRP в в ileum крысы (рис.2), равным 500 нг на 1 мг сырой ткани. Считая плотность ткани, равной 1кг/л, концентрация KRP составляет около 30 цМ, а при учете внеклеточного матрикса, концентрация KRP внутри клетки будет сопоставима с определенной ранее для мышц мускульного желудка курицы (50-80 цМ) (Shirinsky et al., 1993). Аналогичным образом мы расчитали базальную степень фосфорилирования KRP по Ser13 (26,3+1,77%) и по Ser19(30,8±3,14%).

Используя KRP в качестве стандарта, мы также оценили степень фосфорилирования КЛЦМ по Ser828 и Ser834, соответствующим Ser13 и Ser19 KRP. В обоих случаях степень фосфорилирования составила ~0,1 моль фосфата/моль КЛЦМ.

Таким образом, определенное нами увеличение степени фосфорилирования Ser13 в 4 раза при обработке фазной ткани PDBu означает достижение практически полного фосфорилирования этого остатка KRP, что предполагает возможную регуляторную функцию этого фосфорилирования. Напротив, уровень фосфорилирования Ser19 не претерпевает существенных изменений и обнаруживает прирост только с 0,3 до 0,45-0,5 моль фосфата / моль. Вероятно, что фосфорилирование Ser19 KRP не является регуляторным в быстрых физиологических процессах. Однако около трети белка фосфорилировано по Ser19 in vivo и может быть важным для выполнения других, пока не известных функций KRP.

Рис. 2. Определение количеств» KRP в ileum крысы. Возрастающие количества рекомбинантного KRP человека (обозначено как стандарт), переносили на одну PVDF-мембрану вместе с возрастающими количествами экстракта ileum (экстракт). Мембраны анализировали лоликлонапышми антителами (сверху графика представлен репрезентативный иммуноблот). Полученные хемилюминесцеиг-ные сигналы сканировали и строили зависимости интенсивности окрашивания KRP (ось абсцисс) от количества стандартного KRP (левая ось ординат, заполненные прямоугольники) и количества экстракта (правая ось ординат, белые кружки), совмещая угол наклона и положение этих зависимостей. Любое пересечение горизонтальной прямой с осями ординат показывает количество KRP в данном объеме экстракта.

Проведенные нами количественные измерения позволяют считать, что остатки Ser13 и Ser19 являются основными участками фосфорилирования KRP в гладких мышцах. По сумме двух этих участков KRP фосфорилирован в покоящейся ткани приблизительно на одну четвертую часть от максимально возможного уровня. Считая, что только один из участков (Ser13) стимулируется в 4 раза, мы получим изменение общего фосфорилирования KRP в 2-2,5 раза. Именно такие изменения общего уровня и были обнаружены в ответ

на стимуляцию фазной ткани PDBu (Крымский, 2001). Повышение уровня фосфорилиро-вания Ser13 не связано с развитием сокращения, поскольку PDBu не вызывает сократительного ответа фазных гладких мышц. Скорее наоборот, фосфорилирование Ser13 коррелирует с расслаблением, так как оно происходит под действием форсколина. Поскольку прямое участие РКС в фосфорилировании KRP по этому остатку было ранее отвергнуто (Vorotnikov et aL, 1996), природа PDBu-стимулируемой киназы, фосфорилирующей Ser13 KRP в гладких мышцах, остается неясной. Однако, ее активация, скорее всего, также зависит от G-белков, так как фосфорилирование Ser13 KRP повышалось при обработке пермеабилизованной портальной вены кролика GTPyS (MacDonald et al., 2000).

МАР-киназы вовлечены в развитие РКС-зависимой Са2+-сенситизации сокращения. PDBu является аналогом диацилглицерола и приводит к прямой активации РКС (Horowitz et al., 1996), которая влечет за собой повышение Са2+-чувствительности гладко-мышечного сокращения (Krymsky, 2001); одной из наиболее вероятных мишеней РКС является МАР-киназный сигнальный модуль (Liebmann, 2001). Мы исследовали роль МАР-киназ в развитии Са2+-сенситизации сокращения тонических гладких мышц сосудов при < активации РКС форболовым эфиром PDBu. Нам удалось обнаружить, что стимуляция, ткани 0,1 рМ PDBu вызывает активацию р42/44е1к1'2 и р38 МАР-киназ (рис.3, вставка). Для. исследования вклада МАР-киназ в повышение Са Л-чувствительности сокращения в препаратах сонной артерии крысы истощали эндогенные запасы Са + несколькими последовательными стимуляциями фенилэфрином и вызывали PDBu-индуцируемое сокращение, которое происходит исключительно за счет включения механизмов Са2+-сенситизации. Регистрация изометрического сокращения двух препаратов ткани, один из которых был обработан ингибиторами р42/44еЛи (60 цМ PD98059) и р38 (20 рМ SKF86002) МАР-киназ, выявила значительное снижение сократительного ответа в присутствии ингибиторов (рис. 3). Только совместное добавление ингибиторов обоих МАР-киназных каскадов, приводило к эффективному снижению скорости и силы развиваемого тонического сокращения, указывая, что эффект PDBu может в равной степени реализоваться через р38 и p42/44CTkU МАР-киназные каскады.

Тем не менее, ингибиторы МАР-киназ не полностью подавляли сокращение тонической гладкой мышцы. Этот результат отражает наличие в ткани других РКС-индуцируе-мых механизмов, которые в дополнение к активации МАР-киназ также приводят к сенси-тизации гладких мышц и развитию сокращения. Наиболее вероятным является участие РКС в фосфорилировании и активации белка CPI-17, который ингибирует ФЛЦМ, повышая уровень фосфорилирования РЛЦ миозина и его активность (Li et aL, 1998).

Таким образом, МАР-киназы участвуют в обеспечении сократительного ответа тонической гладкой мышцы в ответ на PDBu. Одной из вероятных мишеней МАР-киназ является КЛИМ, фосфорилирование которой повышается при обработке ткани PDBu (Крымский, 2001). Поэтому мы определили участки действия МАР-киназ в КЛЦМ и исследовали влияние прямого фосфорилирования МАР-киназами на ферментативную активность КЛЦМ in vitro.

Определение участков фосфорилирования КЛЦМ МАР-киназами. В каждой из N- и С-концевых областей КЛЦМ располагается по два потенциальных участка фосфорилирования МАР-киназами. Для установления точных участков фосфорилирования мы сконструировали рекомбинантный фрагмент N75, включающий 75 N-концевых остатков КЛЦМ, а для идентификации фосфорилируемого остатка в С-концевой области использовали белок KRP, независимо экспрессируемый с гена КЛЦМ и поэтому идентичный KRP-домену КЛЦМ. Потенциальные фосфорилируемые остатки Thr43 во фрагменте N75 и Ser19 в KRP были заменены на нефосфорилируемые остатки Ala. Фосфорилирование реком-бинантных диких типов фрагментов и полученных мутантов исследовали in vitro. Оба мутантных фрагмента служили плохими субстратами для МАР-киназ в отличие от диких типов (рис. 4). Данное наблюдение позволяет идентифицировать в последовательности КЛЦМ участки фосфорилирования МАР-киназами как Thr43 в N-концевой области и Ser834 КЛЦМ, соответствующий Ser19 KRP.

_N75__KRP_

Д ИКИЙ ТИП Thr43>Ak ДИКИЙ ТИП Scrl9>Ala

-------------КумахиЯ-250

— — — — — — •»• •» Авгореддарамш

О ЭО 60 90120180 0 30 60 90120180 0 10 204060 0 10 3D 40 60 MUI

Рис. 4. Определение участков фосфорилирования N75 и KRP p42/44"UJ МАР-киназами in vitro. Дикий тип и мутант Thr">A1a N75, а также дикий тип и мутант Ser">Ala KRP фосфорилировали рекомбинангной p44"kl МАР-киназой в присутствии т-[иР]АТР хак описано в Материалах и методах. В указанное время аликвоты реакции приливали к буферу образца и кипятили 5 минут. Полученные образцы анализировали электрофорезом и последующим окрашиванием Кумасси R-250 (верхние панели) и авторадиографией (нижние панели)

Влияние фосфорилирования МАР-киназами на ферментативную активность КЛЦМ. Мы исследовали изменение каталитических свойств рекомбинантной КЛЦМ кролика, экспрессированной в эукариотических клетках с использованием бакуловирусной системы и любезно предоставленной д-ром 3. Грабареком (Бостон, США), при фосфо-рилировании p44wkl МАР-киназой in vitro. В качестве субстрата КЛЦМ мы использовали растворимый фрагмент двухголового миозина - НММ, как более полно отражающий

свойства миозина, по сравнению с изолированными РЛЦ, поскольку НММ включает участок связывания KRP-домена КЛЦМ. Фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназой приводило к снижению величины Км для НММ с 4 цМ до 2,8 цМ, отражая 1,5-кратное увеличение активности КЛЦМ, но не изменяло Vmax фосфотрансферазной реакции. Вместе с тем, мы не обнаружили эффекта фосфорилирования на сродство КЛЦМ к Са2+-кальмо-дулину. В абсолютном значении эти результаты согласуются с данными других исследователей, также показавших 1,5-кратную активацию КЛЦМ при фосфорилировании МАР-киназами (Klemke et aL, 1997; Morrison et al., 1996).

Ряс. 5. Влияние фосфорилирования р44°" МАР-киназой на кТПТМ взаимодействие КЛЦМ С миофиля-ментамн in vitro. Полно-

антИ-KJ 1ЦМ размерную КЛЦМ фосфорилировали in vitro в присутствии 7-

[°Р]АТР рехомбинантной р44м МАР-киназой. Смссь равных Аитлпатпттаммя количеств КЛЦМ и "Р-КЛЦМ инкубировали с гладкоыышеч-/увторадиограмма „щщ миофиламентами 15 мин при комнатной температуре и после цетрифугироваиия (lOOOOOg, 30 мин) анализировали

J J О осадки (О) н налосадочную жидкость (II) моноклональными ан-

тителами К36 к КЛЦМ или авторадиографией как обозначено.

Влияние фосфорилирования МАР-киназами на взаимодействие КЛЦМ с натив-ными миофиламентами. Фосфорилируемые МАР-киназой Ser834 и Thr43 расположены вдали от активного центра КЛЦМ, что делает маловероятным их прямое влияние на удельную активность КЛЦМ. Напротив, снижение Км фосфо-КЛЦМ к субстрату свидетельствует о более вероятном вкладе фосфорилирования остатка Ser834, расположенного рядом с миозин-связывающим KRP-доменом КЛЦМ. Мы исследовали взаимодействие фосфорилированной в присутствии у-[32Р]АТР p44akl МАР-киназой и контрольной полноразмерной КЛЦМ с нативными гладкомышечными миофиламентами. Смесь равных количеств фосфорилированной и контрольной КЛЦМ подвергали ультрацентрифугированию с нативными миофиламентами. При этом мы обнаружили, что распределение связанной и несвязанной КЛЦМ, определенное методом иммуноблоттинга, существенно отличается от распределения радиоактивно меченой КЛЦМ (рис. 5). Если суммарное распределение КЛЦМ было практически равным, свидетельствуя о 50%-ном связывании, то [32Р]-КЛЦМ практически вся была несвязанной и выявлялась в надосадочной жидкости. Количество эндогенной КЛЦМ, возможно присутствовавшей в составе миофиламентов, в использованных нами условиях было ниже уровня детекции иммуноблотгингом, что позволяет считать детектируемую КЛЦМ полностью экзогенной. Следовательно, фосфорили-рование КЛЦМ МАР-киназами приводит к снижению ее сродства к актомиозину.

Эффект фосфорилирования KRP-домена КЛЦМ. Установленной на данный момент функцией KRP-домена КЛЦМ и KRP является связывание с миозином (Shirinsky et

al., 1993). Для исследования влияния фосфорилирования С-концевого участка КЛИМ на миозин-связывающую активность KRP-домена мы использовали KRP. Ранее было установлено, что фосфорилирование KRP РКА и МАР-киназой не приводит к изменению его сродства к миозину in vitro (Vorotnikov et aL, 1996). В полном соответствии с этими наблюдениями, нам не удалось выявить существенных различий во взаимодействии контрольного и фосфорилированного РКА или МАР-киназой KRP человека с нативными мио-филаментами гладких мышц. Согласно недавним сообщениям, область КЛИМ, расположенная близ регуляторного участка фермента, может вносить дополнительный вклад во взаимодействие KRP-домена КЛЦМ с миозином (Gao et al., 2003). При анализе взаимодействия рекомбинантного фрагмента 77кКЛЦМ, содержащего каталитический центр и KRP-домен, но не обладающего актин-связывающей N-концевой последовательностью, с очищенным миозином мы обнаружили, что фосфорилирование 77кКЛЦМ МАР-киназой не влияет на связывание фрагмента и его соосаждение с миозином.

Таким образом, фосфорилирование МАР-киназой не оказывает существенного воздействия на взаимодействие KRP с нативными миофиламентами и связывание более протяженного фрагмента 77кКЛЦМ с миозином in vitro. Скорее всего, фосфорилирование KRP-домена также не будет иметь эффекта на связывание с миофиламентами полноразмерной КЛЦМ. Однако наши наблюдения не исключают возможности участия иных растворимых клеточных компонентов, удаленных при получении миофиламентов, в фос-фозависимой регуляции связывания КЛЦМ с сократительным аппаратом. Поэтому далее мы исследовали фосфозависимое перераспределение КЛЦМ и KRP между цитозольной и тритон-нерастворимой (цитоскелетной) фракциями гладкомышечных экстрактов.

Дифференциальная экстракция фосфорилированных KRP и КЛЦМ из гладко-мышечной ткани. Мы провели экстракцию КЛЦМ из гладкомышечной ткани буфером, содержащим тритон Х-100, и проанализировали количества экстрагированной и оставшейся связанной тотальной и фосфорилированной КЛЦМ методом иммуноблоттинга. Прочно связанной с нерастворимой фракцией остается около 60% КЛЦМ. Вместе с тем, анализ фракций фосфоспецифичными антителами R5 и R8 показал, что до 90% фосфо-рилированной КЛЦМ переходит в растворимую фракцию (рис. 6).

Аналогичным образом мы проанализировали распределение фосфорилированного KRP и обнаружили, что KRP практически полностью выявлялся в растворимой фракции, что не позволяло судить об эффекте его фосфорилирования. Таким образом, КЛЦМ, фос-форилированная как по Ser828 , так и по Ser834, успешнее экстрагируется из фазной гладкой мышцы, тогда как КЛЦМ, прочно связанная с нерастворимой фракцией, преимуществен-

Рис. 6. Экстракция КЛЦМ н KRP из ileum крысы. Препараты ileum крыш выделяли и инкубировали в присутствии 1% тритон Х-100 как описано в Материалах и методах. Содержание КЛЦМ и KRP анализировали в осадке (О) и надосадочной жидкости (Н) политональными и фосфоспецифичными антителами R5 или R8 к КЛЦМ и KRP как обозначено.

но содержащей сократительный аппарат, в основном не фосфорилирована по KRP-доме-ну. По-видимому, эффект фосфорилирования KRP-домена на связывание КЛЦМ с миозином проявляется только в клетке и не наблюдается в таких модельных системах, как изолированный миозин или нативные миофиламенты. Это предполагает существование белков, модулирующих взаимодействие KRP/КЛЦМ с миозином и способных специфично связываться с фосфорилированной последовательностью KRP-домена КЛЦМ, вызывая его диссоциацию от миозина. Недавно описаны несколько белков, способных к таким фосфозависимым взаимодействиям (Zhou et al., 1999; Verdecia et aL, 2000). К их представителям относятся 14-3-3 белки и белки, содержащие модульный WW-домен IV типа, например, пептидил-пролил-изомераза PIN1, которая связывает последовательности, фос-форилированные пролин-направленными киназами (Lu et al., 2002). Возможно, такое взаимодействие с участием PIN 1-подобных белков и реализуется в клетке, что остается предметом дальнейших исследований.

Эффект фосфорилирования Thr43 КЛЦМ МАР-киназами. В положениях 2-7, 3035 и 58-63 N-концевой области КЛЦМ располагаются мотивы DFRXXL, ответственные за связывание с актином (Smith et aL, 1999; Smith and StUL, 2000). Мы предположили, что включение фосфата в Thr43 КЛЦМ нарушит или изменит взаимодействие с актином обоих или, по крайней мере, одного из двух соседних DFRXXL-мотивов, результатом чего явится диссоциация КЛЦМ с актиновых филаментов. В клетке соотношение КЛЦМ к миозину составляет менее 1:20, фосфорилирование может приводить к увеличению ее внутриклеточной подвижности и более эффективной активации миозина. Полученный нами реком-бинатный N-концевой фрагмент КЛЦМ N75 включает все три участка связывания КЛЦМ с актином, а также фосфорилируемый Thr43. Поэтому эффект фосфорилирования на взаимодействие КЛЦМ с актином мы исследовали, используя N75.

Мы обнаружили, что полумаксимальное связывание нефосфорилированного фрагмента N75 (рис. 7, А) достигалось при его концентрации, равной 3 рМ, а фосфорилирование приводило к изменению этого параметра до 5,8 цМ. На рис.7, Б представлены ре-

презентативные иммуноблоты распеределения N75 и P-N75 между осадком и надоса-дочной жидкостью. Максимальное связывание N75 достигало 0,4 моль/моль актина, что хорошо согласуется с предположенным связыванием каждого DFRXXL-мотива с отдельным мономером актина (Smith et al., 1999; Smith and StuU, 2000). Подобно тому, как фосфорилирование фрагмента N75 приводит к снижению его способности связываться с актином, фосфорилирование полноразмерной КЛЦМ p44<lkl МАР-киназой in vitro снижало связывание КЛЦМ с F-актином и комплексом F-актина с тропомиозином. Известно, что сродство КЛЦМ к актиновым филаментам повышается в присутствии тропомиозина (Sellers and Pato, 1984). Однако мы обнаружили, что присутствие тропомиозина в реконструированных филаментах не сказывалось на ингибиторном эффекте фосфорилирования. Этот результат согласуется с данными Hatch et al. (2001), показавшими, что связывание КЛЦМ с актином происходит в области, отличной от мест взаимодействия других актин-связанных белков, таких как тропом иозин, кальдесмон, кальпонин и миозин.

Несколько DRFXXLAMOTHBOB КЛЦМ могут одновременно связывать и перешивать разные филаменты актина (Hayakawa et al., 1994; Kudryashov et al., 1999). Мы обнаружили, что N-концевой домен КЛЦМ, включающий три DRFXXL-мотива, также эффективно пучкует филаменты актина. При этом фосфорилирование Thr43 значительно подавляло пучкующую активность N75 (рис. 8). При относительно низком соотношении добавленного N75 или фосфол75 к актину, основная часть F-актина не пучкована и обнаруживается в надосадочной жидкости. При увеличении концентрации фрагментов до 4 цМ большая часть актина выявляется в осадке только в присутствии нефосфорилированного N75.

В настоящий момент трудно сказать, является ли эффект фосфорилирования ^г43 на пучкование актина независимым или следствием снижения сродства N75 к актину.

Взаимодействие КЛЦМ с СаМ и фосфорилирование Thr43 КЛИМ. В присутствии Са2+/СаМ происходит снижение сродства КЛЦМ и ее N-концевых фрагментов к актину (Sellers and Pato, 1984; Ye et aL, 1997). Предположительно, в дополнение к участку связывания Са2+/СаМ в регуляторном сегменте КЛЦМ в пределах N-концевых остатков 2-41 расположен второй участок связывания Са^/СаМ (Hayakawa et aL, 1999). Позиция Thr43 относительно N-концевого участка связывания Са2+/СаМ напоминает расположение Ser815 в регуляторном сегменте КЛЦМ. Фосфорилирование Ser815 значительно снижает сродство КЛЦМ к Са2+/СаМ (Conti and Adelstein, 1981). Мы предположили, что фосфорилирование Thr43 может аналогично регулировать связывание Са^/СаМ с N-концевой областью КЛЦМ. Однако при исследовании взаимодействия контрольного и фосфорилированного МАР-киназой N75 с зернами СаМ-сефарозы значительного изменения в связывании Р-N75 мы не обнаружили (данные не представлены). По-видимому, Thr43 не входит в состав N-концевого участка взаимодействия КЛЦМ с Са2+/СаМ.

Присутствие Са2+/СаМ в равной степени снижало связывание фосфорилированного и контрольного N75 с F-актином, при этом сохранялся обнаруженный нами эффект 2-кратного снижения константы связывания N75 с актином при фосфорилировании N75 МАР-киназами (данные не представлены). Другими словами, мы обнаружили, что фосфори-

лирование Thr43 МАР-киназой и связывание Са2+/СаМ независимо, но однонаправленно регулируют взаимодействие КЛЦМ с актином, вызывая диссоциацию этого комплекса. Эти результаты означают, что взаимодействие КЛЦМ с тонкими филаментами может независимо регулироваться в клетке как минимум двумя сигнальными путями. Один из них связан с повышением [Са2+], с последующей активацией Са2+/СаМ, тогда как другой -с Са2+-независимой активацией МАР-киназного каскада. Оба пути будут приводить к снижению сродства КЛЦМ к тонким филаментам, по-видимому, за счет ингибирования связывания одного и того же DFRXXL-мотива.

Фосфорилирование КЛЦМ при PDBu-стимулируемом сокращении тонических мышц. Изменения уровня фосфорилирования КЛЦМ при стимуляции PDBu кольцевых препаратов сонной артерии крысы детектировали с помощью антител R5 и R8 аналогично описанному для KRP (см. выше). PDBu вызывал 2-кратное увеличение степени фосфорилирования остатка Ser828, соответствующего Ser13 KRP, но не остатка Ser834, гомологичного Ser19 KRP. Данное наблюдение качественно (но не количественно) соответствует определенному нами характеру фосфорилирования KRP под действием PDBu в фазной гладкой мышце (см. выше). Количественно фосфорилирование Ser828 возрастает в 2 раза при стимуляции ткани PDBu. Это не может объяснить 2-кратного увеличения общего уровня фосфорилирования КЛЦМ, поскольку, как показано ранее (Крымский, 2001), КЛЦМ фосфорилирована по нескольким участкам в нестимулирован-ной ткани. По крайней мере два фосфоостатка расположены в пределах, а один - вне пределов KRP-домена КЛЦМ. Полученные нами результаты по фосфопептидному картированию N-концевого домена КЛЦМ (данные не представлены) позволяют предположить, что последним является Thr43, прямо фосфорилируемый МАР-киназой. Вероятно, суммарное возрастание степени фосфорилирования Thr4 и Ser828 количественно соответствует 2-кратному повышению общего уровня фосфорилирования КЛЦМ в обработанной PDBu ткани.

* * *

Способность к тоническому сокращению является отличительной чертой ряда гладких мышц, выделяемых по этому признаку в группу тонических. Для них характерно наличие и функционирование механизмов повышения чувствительности сократительного ответа к определенному уровню внутриклеточной концентрации Са2+, т.е. Са2+-сенси-тизации. Напротив, к фазным мышцам относятся ткани, сокращающиеся, главным образом, за счет Са2+-зависимых механизмов, способные к эффективному расслаблению и обладающие развитыми механизмами Са2+-десенситизации.

Описан целый ряд механизмов Са2+-сенситизации гладких мышц. Все они основаны на активации внутриклеточных каскадов, сопрягающих связывание агонистов с рецепторами клеточной мембраны и изменение активности регуляторных белков сократительного аппарата гладкомышечной клетки путем их фосфорилирования. Рецептор-зависимая активация мономерного G-белка Rho и активируемой им Rho-киназы считается в настоящее время основным физиологическим механизмом сенситизации. Другой путь предполагает участие Са2+-независимых изоформ РКС. Активируемые Rho и РКС каскады разветвляются и могут частично конвергировать на уровне белка CPI-17, фосфорилирование которого приводит к ингибированию фосфатазы легких цепей миозина (ФЛЦМ) и, соответственно, к фосфорилированию РЛЦ миозина и Са2+-независимой активации последнего. Иным способом ингибирования ФЛЦМ является прямое фосфорилирование ее миозин-связывающей субъединицы под действием Rho-киназы и РКС.

С помощью ингибиторного анализа мы продемонстрировали, что МАР-киназы вносят существенный вклад в развитие тонического сокращения в отсутствие изменений [Ca2+]j. Исследование фосфорилирования КЛЦМ при тоническом сокращении гладких мышц позволяет нам рассматривать КЛЦМ как одну из мишеней МАР-киназ, имеющей отношение к Са2+-сенситизации гладкомышечного сокращения. На основании наших данных можно предложить механизм активации КЛЦМ при фосфорилировании МАР-киназами. Вряд ли фосфорилирование Ser834 влияет на сродство KRP-домена КЛЦМ к НММ - по нашим данным фосфорилирование этого остатка в составе KRP или 77кКЛЦМ не изменяет их сродства к миозину. Мы предполагаем, что фосфорилирование Ser834 влияет на эффективность фосфорилирования РЛЦ в НММ и полной молекуле миозина. Известно, что фосфорилирование РЛЦ миозина является организованным процессом, т. е. КЛЦМ сначала фосфорилирует РЛЦ только одной из головок, а затем второй (Persechini and Hartshorne, 1981, 1983), по-видимому, из раствора. Такая избирательность КЛЦМ обусловлена, скорее всего, связыванием KRP-домена и направляемой им ориентацией каталитического центра по отношению к субстрату. По всей видимости, обнаруженное нами снижение величины Км для НММ у фосфорилированной КЛЦМ отражает повышение доступности РЛЦ и возможность их независимого фосфорилирования. В таком случае следовало бы ожидать относительно небольших изменений кинетических параметров КЛЦМ, что и было нами обнаружено. Отсутствие изменений в степени фосфорилирова-ния Ser834 при сокращении ткани и слабое влияние фосфорилирования на активность КЛЦМ in vitro позволяют исключить регуляторный характер фосфорилирования этого остатка в генерации тонического сокращения гладких мышц. Напротив, фосфорилирование

Thr43 MAP-киназами ингибирует взаимодействие КЛЦМ с тонкими филаментами in vitro. Возможно, именно с этим связан эффект диссоциации фосфорилированной КЛЦМ с акто-миозина, обнаруженный нами при анализе экстрактов гладких мышц. Мы предполагаем, что диссоциация КЛЦМ от актина приводит к расширению ее эффективного ареала в сократительном аппарате клетки, следствием чего может быть повышение внутриклеточной активности КЛЦМ без значительного изменения ее ферментативных свойств.

В фазной мускулатуре механизмы РКС-зависимой сенситизации представлены слабо. Фазная мышщ не генерирует сокращения в ответ на избирательную стимуляцию РКС, а также не обнаруживает увеличения степени фосфорилирования кальдесмона и КЛЦМ, хотя сохраняется РКС-зависимая активация МАР-киназ. Уровень экспрессии СРП 7 в фазной мускулатуре чрезвычайно низок. Вместе с тем, фазная мышца содержит много KRP. Известной на сегодняшний день активностью KRP является его взаимодействие с миозином, приводящее с одной стороны к стабилизации миозина в óS-конформации, а с другой стороны к конкурентному ингибированию фосфорилирования миозина КЛЦМ (Shirinsky et al., 1993; Silver et al., 1997). В связывании KRP с миозином основной вклад вносит его С-концевая область. По-видимому, именно с этим связано то, что фосфорилирование, протекающее в N-концевой области, не изменяет связывания KRP ни с очищенным миозином (Vorotnikov et al., 1996), ни с нативными миофиламентами в присутствии других актомиозин-связанных белков. Другим механизмом действия KRP может быть ускорение дефосфорилирования миозина, предположительно путем активации ФЛЦМ (Wu et aL, 1998). Хотя этот механизм во многом остается гипотетическим, он предполагает существенную роль фосфорилирова-ния остатка Ser13 KRP в усилении его релаксирующего действия (Wu et aL, 1998; Walker et al., 2001). Так, была выдвинута гипотеза о том, что циклонуклеотид-зависимое расслабление гладких мышц под действием, например, оксида азота или форсколина связано с фосфорилированием KRP цАМФ- или цГМФ-зависимой протеинкиназой по остатку Ser13 (MacDonald et al., 2000). По мнению этих же авторов, фосфорилирование KRP МАР-киназой по близлежащему остатку Ser19 обращает эффект фосфорилирования по Ser13 (Walker et al., 2001). Полученные нами в ходе выполнения данной работы результаты сог-ласуются с предполагаемой ролью фосфорилирования Ser13 KRP в расслаблении гладких мышц. Во-первых, уровень фосфорилирования Ser3 KRP не изменялся в процессе Са л-зависимого сокращения, но существенно возрастал при цАМФ-зависимом расслаблении. Во-вторых, PDBu стимулировал полное фосфорилирование Ser13 KRP в фазной ткани, что, с точки зрения упомянутой выше гипотезы, будет препятствовать развитию сокраще-ния. Таким образом, можно предполагать связь фосфорилирования KRP по Ser13 с десен-ситизацией

фазных мышц и с отсутствием сократительного ответа при стимуляции РКС. Напротив, отсутствие изменений в уровне фосфорилирования Ser 9 KRP демонстрирует, что этот процесс не участвует ни в регуляции сократительного ответа, ни в модуляции эффекта фосфорилирования Ser13.

Таким образом, мы показали, что один из механизмов Са2+-сенситизации сокращения -тонических гладких мышц сосудов включает активацию протеинкиназы С и МАР-киназ, что приводит к фосфорилированию КЛЦМ, ее частичной диссоциации с актиновых филаментов - и активации. Этот механизм не функционирует в фазной гладкой мускулатуре, где, напротив, повышенные экспрессия и фосфорилирование KRP обеспечивают отсутствие тонического сокращения и вносят вклад в расслабление.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что одновременное ингибирование каскадов p42/44erkl,2 и р38 МАР-киназ в 2 раза снижает развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при активации протеинкиназы С.

2. In vitro МАР-киназы фосфорилируют остатки Thr43 и Ser834 КЛЦМ и единственный. Ser19 KRP, соответствующий Ser834 КЛЦМ.

3. Тоническое сокращение, вызванное PDBu, сопровождается фосфорилированием КЛЦМ по Thr43 и Ser828, но не Ser834. При сокращении-расслаблении фазной мускулатуры степень фосфорилирования Ser19 KRP не изменяется и составляет 30%, но фосфори-лирование остатка Ser13 возрастает от 25 до 100% и коррелирует с расслаблением.

4.Фосфорилирование МАР-киназой активирует КЛЦМ в 1,5-2 раза, и ослабляет связывание КЛЦМ с сократительной системой в гладких мышцах. Фосфорилирование по Thr43 снижает связывание КЛЦМ с актином и миофиламентами in vitro, тогда как фосфорилирование по Ser834 не изменяет связывания КЛЦМ с миозином.

5. Сделан вывод о том, что фосфорилирование КЛЦМ может вносить вклад в повышение Са +-чувствительности и развитие тонического сокращения гладких мышц, тогда как фосфорилирование Ser13 KRP связано с расслаблением фазной мускулатуры.

Список публикаций по теме диссертации f А.Ю. Хапчаев, В.П. Ширинский, А.В. Воротников. (2003) Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина.

Усп.биоллимии 43 :365-420.

' у

2. А.Ю. Хапчаев, МА Крымский, М.В. Сидорова, Ж.Д. Беспалова, Ч.-ЛА Ванг, В.П. Ширинский, А.В. Воротников. (2004) Новые фосфоспецифичные антитела для анализа фосфорилирования белковых продуктов генетического локуса киназы лёгких цепей миозина. Биохимия, 69, в печати, рукопись ВМ 04-006.

3. Khapchaev AYu., Shirinsky V.P., and Vorotnikov A.V. (2003) Phosphorylation by MAP-kinase reduces myosin light chain kinase binding to actomyosin. J. Muscle Res. CellMotil., 24 (4-6): 357.

4. Khapchaev AYu., Krymsky MA, Vilitkevich EX., Sidorova M.V., Bespalova Zh.D., Wang C.-LA, Shirinsky V.P., and Vorotnikov A.V. (2002) Phosphorylation affects intracellular interactions of myosin light chain kinase and the kinase related protein (telokin). J. Muscle Res. Cell Mo til., 2 3 (1): 40.

5. Vorotnikov A.V., Krymsky MA, Khapchaev AYu., and Shirinsky V.P. (2001) Correlation between contraction and phosphorylation of caldesmon and myosin light chain kinase in tonic and phasic smooth muscles stimulated with phorbol ester. J.Muscle Res.CellMotil, 22 (7) : 597.

6. Krymsky MA, Khapchaev AYu., Sidorova M.V., Bespalova Zh.D., Shirinsky V.P., and Vorotnikov A.V. Correlation between phorbol ester-induced contraction and phosphorylation of caldesmon and myosin light chain kinase in smooth muscle. Abstracts of International Simposium "Biological Motility: New Trends in Research" - Pushchino (Russia), 2001.

7. Vilitkevich EX., Dudnakova T.V., Krymsky MA., Khapchaev AYu., Sidorova M.V., Bespalova Zh.DM Shirinsky V.P., and Vorotnikov A.V. Phosphorylation-dependent intracellular interactions of myosin light chain kinase and kinase related protein. Abstracts of International Simposium "Biological Motility: New Trends in Research" - Pushchino (Russia), 2001.

Р-69 12

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хапчаев, Аскер Юсуфович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Ультраструктура сократительного аппарата гладких мышц и немышечных клеток.

1.1. Миозин как основная мишень КЛЦМ и KRP.

2. Генетический локус КЛЦМ.

3. Киназа легких цепей миозина.

3.1. Субстратная специфичность КЛЦМ и кинетика фосфорилирования РЛЦ.

3.2. Каталитический домен.

3.3. Регуляторный сегмент.

3.4. Участки связывания актина и миозина.

3.5. Повторяющиеся структурные элементы.

3.6. Модель функционирования КЛЦМ в клетке.

4. Л-КЛЦМ.

5. KRP.

6. Фосфорилирование продуктов генетического локуса КЛЦМ.

6.1. Фосфорилирование /-КЛЦМ.

6.2. Фосфорилирование KRP.

7. Общие принципы регуляции сокращения гладких мышц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Биохимические методы. t 2.1.1 .Определение концентрации белков.

2.1.2.Приготовление образцов тканей для электрофореза.

2.1.3.Электрофорез белков в ПААГ и денситометрия.

2.1 АИммуноблоттинг.

2.1.5.Коседиментационный анализ.

2.1.6.0пределение активности КЛЦМ.

2.1.7.Фосфорилирование белков in vitro.

2.1.8.Фосфоаминокислотный анализ.

2.1.9. Двумерное фосфопептидное картирование.

2.1.10. Аффинная очистка антител R5 и R8.

2.1.11. Очистка рекомбинантных белков.

2.1.11.1. KRP.

2.1.11.2. GST-содержащие белки.

2.1.11.3. МВР-содержащие белки.

2.1.11.4. Швб-содержащие белки.

2.1.12. Выделение актина из скелетных мышц.

2.1.13. Получение нативных миофиламентов.

2.2. Молекулярно-биологические методы.

2.2.1.Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.2.Генетическое конструирование фрагмента N75 для бактериальной экспрессии.

2.2.3.Введение точечных аминокислотных замен.

2.2.3.1.Получение мутанта KRP S13>A.

2.2.3.2.Получение мутанта N75 Т43>А.

• 2.2.4.Трансформация клеток Е. coli.

2.2.5.Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

2.2.6.Бакгериальная экспрессия рекомбинантных белков.

2.3. Физиологические измерения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

1. Участки фосфорилирования KRP-домена КЛИМ.

1.1. Определение участка, фосфорилируемого p42/44erk1,2 и р38 МАР-киназами в KRP-домене КЛЦМ.

1.2. Фосфо- и сайтоспецифичные антитела против КЛЦМ.

2. Фосфорилирование КЛЦМ и KRP в фазных гладких мышцах. t 2.1. Форболовый эфир вызывает активацию МАР-киназ в фазных гладких мышцах.

2.2. Динамика фосфорилирования Ser13 и Ser19 KRP при сокращении и расслаблении фазных гладких мышц.

2.3. Уровень эндогенного фосфорилирования Ser и Ser19 KRP in vivo.

2.4. Фосфорилирование KRP р21-активируемой киназой in vitro.

2.5. Фосфорилирование KRP не влияет на его взаимодействие с миозином и нативными миофиламентами.

2.6. Фосфорилирование KRP-домена не влияет на взаимодействие

КЛЦМ с миозином.

2.7. Дифференциальная экстракция фосфорилированных KRP и

КЛЦМ из гладкомышечной ткани.

3. Фосфорилирование КЛЦМ в тонических гладких мышцах.

3.1. PDBu-зависимое сокращение тонической гладкой мышцы зависит от активации МАР-киназ.

3.2. Влияние фосфорилирования p44eikl МАР-киназой in vitro на ферментативную активность КЛЦМ.

3.3. Фосфорилирование КЛЦМ при PDBu-стимулируемом сокращении тонических мышц.

3.4. Определение остатка, фосфорилируемого МАР-киназами, в N-концевой области КЛЦМ.

3.5. Эффект фосфорилирования Thr43 КЛЦМ МАР-киназами.

3.5.1.Влияние фосфорилирования Thr43 на связывание N75 с актином.

3.5.2.Взаимодействие N75 с кальмодулином и эффект фосфорилирования Thr43.

3.6. Фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназой ослабляет ее взаимодействие с актином и нативными миофиламентами.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Фосфорилирование как способ модуляции сокращения гладких мышц.

Роль МАР-киназ.

Фосфорилирование KRP и десенситизация фазной мускулатуры.

Фосфорилирование КЛЦМ и сенситизация тонических мышц.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц"

В клетках эукариот Са2+ является ключевым компонентом многих сигнальных путей и инициирует целый ряд внутриклеточных процессов, в том числе зависимых от миозина II типа. Возрастание концентрации свободного Са2+ в цитоплазме ([Са2+]0 играет ведущую роль в инициации сокращения в мышечных тканях и активации подвижности в немышечных клетках. В скелетных и сердечной мышцах Са2+ связывается с тропониновым комплексом, расположенным на тонких актин-тропомиозиновых филаментах, что «включает» тонкие филамен-ты и позволяет им связываться с саркомерным миозином и активировать сокращение. Напротив, в гладкой мускулатуре и немышечных клетках первичным акцептором кальциевого сигнала является низкомолекулярный белок кальмодулин (СаМ), который далее связывает и активирует актомиозин-связанные регуляторные белки - киназу легких цепей миозина (КЛЦМ) и кальдесмон. Миозин гладких мышц и немышечных клеток находится в неактивной форме и требует дополнительной активации фосфорилированием. Основным ферментом, осуществляющим фосфорилирование и активацию миозина является КЛЦМ, тогда как кальдесмон «включает» тонкие филаменты аналогично тропониновому комплексу. (Воротников и соавт., 2002; Кашш and Grange, 1996; Sellers and Adelstein, 1987; Somlyo and Somlyo, 1994).

В геноме высших позвоночных обнаружено два гена КЛЦМ (Guerriero et al., 1986; Roush et al., 1988). Один кодирует КЛЦМ, экспрессирующуюся исключительно в сердечной и скелетных мышцах (уйКЛЦМ) (Nunnally and Stull, 1984). Другой представляет собой сложно организованный генетический локус, кодирующий несколько белковых продуктов: высокомолекулярную (А-КЛЦМ) и низкомолекулярную (/-КЛЦМ) изоформы КЛЦМ, а также мио-зин-связывающий белок KRP, не обладающий протеинкиназной активностью (Watterson et al., 1995). Все три продукта генетического локуса КЛЦМ используют единую рамку считывания и общий стоп-кодон. Как следствие такой организации, А-КЛЦМ содержит уникальный N-концевой домен, тогда как ее С-концевая часть полностью включает в себя последовательность /-КЛЦМ. С-концевые последовательности обеих КЛЦМ идентичны последовательности белка KRP. Как показали исследования последних лет, функция KRP также тесно связана с регуляцией активности миозина, хотя механизм действия KRP до конца не ясен.

В дополнение к прямому участию Са2+/СаМ, фосфорилирование белковых продуктов генного локуса КЛЦМ обеспечивает тонкую регуляцию внутриклеточной активности белковых продуктов генного локуса КЛЦМ. В последнее время появились данные об активации /-КЛЦМ ее фосфорилированием пролин-направленными протеинкиназами и о роли фосфори-лирования KRP в регуляции расслабления гладких мышц. Кроме того, предыдущее исследование, проведенное в нашей лаборатории (Крымский, 2001), показало, что развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов может быть связано с отсутствием в этой ткани KRP и увеличением степени фосфорилирования КЛЦМ, тогда как отсутствие такой реакции у фазной висцеральной мускулатуры может объясняться наличием в этой ткани KRP и/или отсутствием фосфорилирования КЛЦМ. В то же время, остались неясными ни внутриклеточный механизм проведения сигнала к фосфорилированию этих белков, ни ключевые модифицируемые остатки, ни биологический смысл их фосфорилирования.

Данная работа сфокусирована на изучение значимости фосфорилирования КЛЦМ и KRP и использует как основу упомянутую сравнительную модель фазных и тонических мышц. В тонической мускулатуре мы выявили прямой вклад МАР-киназ в обеспечение тонического ответа при пониженной [Ca2+]i и установили участки, фосфорилируемые в КЛЦМ МАР-киназами in vivo и in vitro. Нами определены вероятные регуляторные последствия фосфорилирования КЛЦМ МАР-киназой, установлена корреляция между фосфорилиро-ванием KRP и расслаблением фазной мускулатуры. Полученные результаты существенно расширяют понимание внутриклеточных механизмов функционирования белковых продуктов генного локуса КЛЦМ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хапчаев, Аскер Юсуфович

105 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что одновременное ингибирование каскадов p42/p44ericU и р38 МАР-кнназ в 2 раза снижает развитие тонического сокращения гладких мышц сосудов при активации протеинкиназы С.

2. In vitro МАР-киназы фосфорилируют остатки Thr43 и Ser834 КЛЦМ и единственный Ser19 KRP, соответствующий Ser834 КЛЦМ.

3. Тоническое сокращение, вызванное PDBu, сопровождается фосфорилированием КЛЦМ по Thr43 и Ser828, но не Ser834. При сокращении-расслаблении фазной мускулатуры степень фосфорилирования Ser19 KRP не изменяется и составляет 30%, но фосфорилирование остатка Ser13 возрастает от 25 до 100% и коррелирует с расслаблением.

4. Фосфорилирование МАР-киназой активирует КЛЦМ в 1,5-2 раза и ослабляет связывание КЛЦМ с сократительной системой в гладких мышцах. Фосфорилирование по Thr43 снижает связывание КЛЦМ с актином и миофиламентами in vitro, тогда как фосфорилирование Ser834 не изменяет связывания КЛЦМ с миозином.

5. Сделан вывод о том, что фосфорилирование КЛЦМ может вносить вклад в повышение Са2+-чувствительности и развитие тонического сокращения гладких мышц, тогда как фосфорилирование Ser13 KRP связано с расслаблением фазной мускулатуры.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Воротникову Александру Вячеславовичу за постоянную подцержку и неоценимую помощь в проведении данной работы.

Я искренне признателен моему научному консультанту профессору Ширинскому Владимиру Павловичу за помощь и участие в обсуждении полученных данных.

Сердечно благодарю своих коллег к.б.н. М.А. Крымского, Т.В. Кудряшову, А.В. Чадина, E.JI. Вилиткевич, к.б.н. Т.А. Никоненко, к.б.н. О.В. Степанову, Д.В. Серебряную, к.б.н. AJI. Брянцева за советы и помощь в проведении ряда экспериментов.

Выражаю признательность всем бывшим и настоящим сотрудникам лабораторий молекулярной эндокринологии и клеточной подвижности за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы.

Благодарю своих родных за веру, терпение и помощь, оказанную при подготовке работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность к тоническому сокращению является отличительной чертой ряда гладких мышц, выделяемых по этому признаку в группу тонических. Для них характерно функционирование механизмов повышения чувствительности сократительного ответа к внутриклеточной концентрации Са2+, т.е. Са2+-сенситизации. Напротив, к фазным мышцам относятся ткани, сокращающиеся преимущественно за счет Са -зависимых механизмов, способные

А . к эффективному расслаблению и обладающие развитыми механизмами Са -десенситизации.

В настоящей работе была исследована предполагаемая роль фосфорилирования КЛЦМ и KRP в модуляции сократительного ответа гладких мышц. Мы показали, что один из механизмов Са2+-сенситизации сокращения тонических гладких мышц сосудов включает активацию протеинкиназы С и МАР-киназ, что приводит к фосфорилированию КЛЦМ, ее частичной диссоциации от филаментов актина и активации. Этот механизм не функционирует в фазной гладкой мускулатуре, где, напротив, повышенные экспрессия и фосфорилирование KRP обеспечивают отсутствие тонического сокращения и вносят вклад в расслабление.

Следует подчеркнуть, что роль Са2+ в развитии сокращения гладких мышц является первостепенной. Сенситизация ткани приводит к поддержанию достигнутой силы сокращения на определенном уровне после снижения [Ca2+]i вплоть до околобазального уровня. Отсутствие сенситизации в фазной мускулатуре определяет ее расслабление при снижении [Ca2+]j, и этот процесс ускоряется при включении механизмов Са2+-десенситизации.

В настоящее время описан целый ряд механизмов Са2+-сенситизации гладких мышц. Все они основаны на активации внутриклеточных каскадов, сопрягающих связывание аго-нистов с рецепторами клеточной мембраны с изменением активности регуляторных белков сократительного аппарата гладкомышечной клетки путем их фосфорилирования (рис. 27). Рецептор-зависимая активация мономерного G-белка Rho и активируемой им Rho-киназы считается в настоящее время основным физиологическим механизмом сенситизации. Другой путь предполагает участие Са2+-независимых изоформ РКС. Как показано на рис. 27А активируемые Rho и РКС каскады разветвляются и могут частично конвергировать на уровне белка CPI-17. Фосфорилирование CPI-17 под действием РКС, Rho-киназы, а также зависимых от них ZIP-киназы и PKN, сообщает CPI-17 способность ингибировать ФЛЦМ, что приводит к повышению уровня фосфорилирования РЛЦ миозина и его Са -независимой активации. Иным способом ингибирования ФЛЦМ является прямое фосфорилирование ее миозин-связывающей субъединицы под действием Rho-киназы и РКС. Функционирование этих путей и их существенный вклад в Са2+-сенситизацию тонических гладких мышц были убедительно продемонстрированы в течение последнего десятилетия.

А: тоническая мускулатура

Б: фазная мускулатура мембрана 2 мембрана ^ сокращение расслабление

Рис. 27. Предполагаемые механизмы регуляция сократительной активности тонических (А) и фазных (Б) гладких мыши. Красным цветом выделены компоненты, исследованные в настоящей работе, остальные сигнальные механизмы показаны темным цветом. В тонической мускулатуре преобладают агонист-зави-снмые механизмы модуляция сократительного ответа, а в сокращении фазных мышц основную роль играет Са~-кальмодулин. Коричневым выделены сигнальные пути, связанные с кальдесмоном и фосфорилированием миозина, синим - связанные с регуляцией дефосфорилирования миозина. Белок CP 1-17 экспрессируется в тонических мышцах, тогда как KRP специфичен для фазной ткани. Детали и обсуждение см. в тексте. Фск - форсколин; АС - аденилатциклаза; Р - остаток фосфата; R. - рецептор; МАРК - МАР-киназы; RhoK Rho-киназа; PK.N - протеинкиназа N, гомолог Rho-киназы; Z1PK - zipper-interacting protein kinase, ZIP-киназа,

В настоящее время не вызывает сомнений, что активация РКС приводит к стимуляции эндогенных МАР-киназных каскадов. Однако, роль МАР-киназ в Са2+-сенситизации гладко-мышечного сокращения была изучена крайне слабо и поэтому стала предметом ряда исследований нашей лаборатории. Так, в диссертационной работе М.А. Крымского (2001) установлено, что фосфорилирование кальдесмона и КЛЦМ коррелирует с активацией МАР-киназ и развитием тонического сокращения. Фосфорилирование кальдесмона МАР-киназой in vitro приводит к устранению ингибирования им актиновых филаментов и повышению активности актомиозина. Эти данные позволили постулировать участие МАР-киназ в Са2+-сенситизации сокращения посредством инактивации кальдесмона (рис. 27, А).

В настоящей работе с помощью ингибиторного анализа мы продемонстрировали, что МАР-киназы участвуют в Са2+-сенситизации тонического сокращения. Мы детально исследовали фосфорилирование КЛЦМ при тоническом сокращении гладких мышц и показали, как оно стимулирует внутриклеточную активность КЛЦМ. Это позволяет нам рассматривать КЛЦМ как одну из мишеней МАР-киназ, имеющей отношение к Са2+-сенситизации гладко-мышечного сокращения (рис. 27, А).

Вместе с тем, ни активирующий эффект фосфорилирования КЛЦМ МАР-киназами, ни изменения степени фосфорилирования соответствующих остатков КЛЦМ в ткани не представляются очень глубокими. По-видимому, роль фосфорилирования КЛЦМ в тоническом сокращении носит достаточно модуляторный характер и не вносит значительного вклада как, например, фосфорилирование кальдесмона. Тем не менее, полученные результаты могут иметь крайне важное значение для понимания механизмов клеточной подвижности. По аналогии с кальдесмоном (Goncharova et al., 2002), фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназами может происходить интенсивнее в немышечных клетках (Klemke et al., 1997, Nguyen et al., 1998) и иметь прямое отношение к активации сократительного аппарата и регуляции динамики актина (по данным этой работы).

В фазной мускулатуре механизмы РКС-зависимой сенситизации представлены слабо. Фазная мышца не генерирует сокращения в ответ на избирательную стимуляцию РКС, а также не обнаруживает увеличения степени фосфорилирования кальдесмона и КЛЦМ, хотя РКС-зависимая активация МАР-киназ сохраняется (рис. 27, Б). Уровень экспрессии CPI-17 в фазной мускулатуре чрезвычайно низок. Вместе с тем, фазная мышца содержит много KRP, который вызывает Са2+-десенситизацию, снижая уровень фосфорилирования РЛЦ миозина и способствуя расслаблению (рис. 27, Б). Повышенное фосфорилирование KRP по остатку Ser13 коррелирует с расслаблением и может быть связано с отсутствием сократительного ответа при стимуляции РКС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хапчаев, Аскер Юсуфович, Москва

1. Воротников, А.В., Крымский, М.А., Ширинский, В.П. (2002) Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц. Биохимия, 67, 1587-1610.

2. Дуднакова Т.В. (2002) Экспрессия белка KRP в кардиомиоцитах и его роль в клеточной подвижности. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

3. Крымский, М.А. (2001) Фосфорилирование регуляторных белков при сокращении гладких мышц. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

4. Кудряшов Д.С. (2000) Функциональные свойства продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

5. Левицкий, Д.И. (1986) Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения. Усп. Биол. Химии, 27,74-101.

6. Чибалина, М.В., Кудряшов, Д.С., Шехонин, Б.В., Ширинский, В.П. (2000) Функциональные свойства и внутриклеточная локализация высокомолекулярной изоформы киназы легких цепей миозина. Цитология, 42,248-255.

7. Чибалина, М.В. (2000) Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

8. Abe, М., Hasegawa, К., Hosoya, Н. (1996) Activation of chicken gizzard myosin light chain kinase by Ca2+/calmodulin is inhibited by autophosphorylation. Cell Struct. Funct., 21, 183-188.

9. Adelstein, R.S., Conti, M.A., Hathaway, D.R., Klee, C.B. (1978) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by the catalytic subunit of adenosine 3': 5'-monophosphate-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 253, 8347-8350.

10. Adelstein, R.S., Conti, M.A., Pato, M.D. (1980) Regulation of myosin light chain kinase by reversible phosphorylation and calcium-calmodulin. Ann. NY Acad. Sci., 356,142-150.

11. Adelstein, R.S., Klee, C.B. (1981) Purification and characterization of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 256, 7501-7509.

12. Adelstein, R.S., Klee, C.B. (1982) Purification of smooth muscle myosin light-chain kinase. Meth. Enzymol., 85 Pt B, 298-308.

13. Araki, Y., Ikebe, M. (1991) Activation of smooth muscle myosin light chain kinase activity by a monoclonal antibody which recognizes the calmodulin-binding region. Biochem. J., 275, 679684.

14. Ausio, J., Malencik, D.A., Anderson, S.R. (1992) Analytical sedimentation studies of turkey gizzard myosin light chain kinase and telokin. Biophys. J., 61,1656-1663.

15. Babij, P., Periasamy, M. (1989) Myosin heavy chain isoform diversity in smooth muscle is produced by differential RNA processing. J. Mol. Biol., 210, 673-679.

16. Babiychuk, E.B., Babiychuk, V.S., Sobieszek, A. (1995) Modulation of smooth muscle• myosin light chain kinase activity by Ca2+/calmodulin-dependent, oligomeric-type modifications. Biochemistry, 34,6366-6372.

17. Bagby, R.M. (1983) Organization of contractile/cytoskeletal elements. In: Biochemistry of smooth muscle (Stephens, N. L., ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 4-84.

18. Bagchi, I.C., Huang, Q.H., Means, A.R. (1992a) Identification of amino acids essential for calmodulin binding and activation of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 267, 3024-9.

19. Bagchi, I.C., Kemp, B.E., Means, A.R. (1989) Myosin light chain kinase structure function• analysis using bacterial expression. J. Biol. Chem., 264,15843-15849.

20. Bagchi, I.C., Kemp, B.E., Means, A.R. (1992b) Intrasteric regulation of myosin light chain kinase: the pseudosubstrate prototope binds to the active site. Mol. Endocrinol., 6,621-626.

21. Barany, M. and Barany, K. (1996): Protein phosphorylation during contraction and relaxation. In: Biochemistry of smooth muscle contraction, editted by M. Barany, pp. 321-339.

22. Bradford M.M. A refined and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72,248

23. Cavadore, J.C., Molla, A., Harricane, M.C., Gabrion, J., Benyamin, Y., Demaille, J.G. (1982) Subcellular localization of myosin light chain kinase in skeletal, cardiac, and smooth muscles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,3475-3479.

24. Chen, B.-H., Tzen, J.T.C., Bresnick, A.R., Chen, H.-C. (2002) Roles of Rho-associated kinase and myosin light chain kinase in morphological and migratory defects of focal adhesion kinase-null cells. J. Biol. Chem., 277, 33857-33863.

25. Chin, D., Schreiber, J.L., Means, A.R. (1999) Calmodulin kinase II chimeras used to investigate the structural requirements for smooth muscle myosin light chain kinase autoinhibition and calmodulin-dependent activation. Biochemistry, 38,15061-15069.

26. Conti, M.A., Adelstein, R.S. (1981) The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the catalytic subunit of 3':5' cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 256, 3178-3181.

27. Craig, R., Smith, R., Kendrick-Jones, J. (1983) Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebrate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. Nature, 302, 436439.

28. Cross, R.A., Sobieszek, A. (1985) Influence of smooth muscle myosin conformation on myosin light chain kinase binding and on phosphorylation. FEBS Lett., 188, 367-374.

29. Dabrowska, R., Aromatorio, D., Sherry, J.M., Hartshorne, D.J. (1977) Composition of the myosin light chain kinase from chicken gizzard. Biochem. Biophys. Res. Commun., 78,1263-1272.

30. Dabrowska, R, Sherry, J.M., Aromatorio, D.K., Hartshorne, D.J. (1978) Modulator protein as a component of the myosin light chain kinase from chicken gizzard. Biochemistry, 17,253-258.

31. Dalla Libera, L., Mastroianni, M., Sobieszek, A. (1994) Heterogeneity of smooth muscle myosin light chain kinase. Characterization of isoelectric variants. FEBS Lett., 346,213-216.

32. Dudek, S.M., Birukov, K.G., Zhan, X., Garcia, J.G.N. (2002) Novel interaction of cortactin with endothelial cell myosin light chain kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 298,511-519.

33. Edelman, A.M., Takio, K., Blumenthal, D.K., Hansen, R.S., Walsh, K.A., Titani, K., Krebs, E.G. (1985) Characterization of the calmodulin-binding and catalytic domains in skeletal muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 260,11275-11285.

34. Edwards, R.A., Walsh, M.P., Sutherland, C., Vogel, H.J. (1998) Activation of calcineurin and smooth muscle myosin light chain kinase by Met-to-Leu mutants of calmodulin. Biochem. J., 331, 149-152.

35. Fasolo, M., Cavallini, P., Dalla Libera, L. (1991) Heterogeneity of smooth muscle myosin light chain kinase is revealed by anion-exchange high-performance liquid chromatography. Biochem. Biophys. Res. Commun., 175,277-284.

36. Filenko, A.M., Danilova, V.M., Sobieszek, A. (1997) Smooth muscle myosin light chain kinase, supramolecular organization, modulation of activity, and related conformational changes. Biophys. J., 73, 1593-1606.

37. Fisher, S.A., Ikebe, M. (1995) Developmental and tissue distribution of expression of nonmuscle and smooth muscle isoforms of myosin light chain kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 217,696-703.

38. Fitzsimons, D.P., Herring, B.P., Stull, J.T., Gallagher, P.J. (1992) Identification of basic residues involved in activation and calmodulin binding of rabbit smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 267,23903-23909.

39. Foster, C.J., Johnston, S.A., Sunday, В., Gaeta, F.C. (1990) Potent peptide inhibitors of smooth muscle myosin light chain kinase: mapping of the pseudosubstrate and calmodulin binding• domains. Arch. Biochem. Biophys., 280,397-404.

40. Foster, C., Van Fleet, M., Marshak, A. (1986) Tryptic digestion of myosin light chain kinase produces an inactive fragment that is activated on continued digestion. Arch. Biochem. Biophys., 251,616-623.

41. Foyt, H.L., Guerriero, V.Jr., Means, A.R. (1985) Functional domains of chicken gizzard myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 260,7765-7774.

42. Foyt, H.L., Means, A.R. (1985) Characterization and analysis of an apparent autophosphorylation of chicken gizzard myosin light chain kinase. J. Cyclic. Nucleotide Protein• Phosphorylation Res., 260, 8978-8983.

43. Gallagher, P.J., Garcia, J.G., Herring, B.P. (1995) Expression of a novel myosin light chain kinase in embryonic tissues and cultured cells. J. Biol. Chem., 270,29090-29095.

44. Gallagher, P.J., Herring, B.P. (1991) The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telokin. J. Biol. Chem., 266, 2394523952.

45. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Griffin, S.A., Stull, J.T. (1991) Molecular characterization of a mammalian smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 266,23936-23944.

46. Garcia, J.G., Davis, H.W., Patterson, C.E. (1995) Regulation of endothelial cell gap formation and barrier dysfunction: role of myosin light chain phosphorylation. J. Cell. Physiol. 163, 510-522.

47. Gerthoffer,W.T., Yamboliev,I.A., Pohl,J., Haynes,R., Dang,S., and McHugh,J. (1997) Activation of MAP kinases in airway smooth muscle. Am. J. Physiol., 272,244-252.

48. Geuss, U., Mayr, G.W., Heilmeyer, L.M. Jr. (1985) Steady-state kinetics of skeletal muscle myosin light chain kinase indicate a strong down regulation by products. Eur. J. Biochem., 153, 327-334.

49. Gillis, J.M., Cao, M.L., Godfraind-De Becker, A. (1988) Density of myosin filaments in the rat anococcygeus muscle, at rest and in contraction. II. J. Muscle. Res. Cell Motil.,, 9,18-29.

50. Goeckeler, Z.M., Masaracchia, R.A., Zeng, Q., Chew, T.L., Gallagher, P.J., Wysolmerski, R.B. (2000) Phosphorylation of myosin light chain kinase by p21-activated kinase PAK2. J. Biol. Chem., 275,18366-18374.

51. Greaser, M. (2001) Identification of new repeating motifs in titin. Proteins, 43,145-149.

52. Gregorio, C.C., Granzier, H., Sorimachi, H., Labeit, S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? Curr. Opin. Cell Biol., 11,18-25.

53. Guerriero, V. Jr., Rowley, D.R., Means, A.R. (1981) Production and characterization of an antibody to myosin light chain kinase and intracellular localization of the enzyme. Cell, 27, 449458.

54. Guerriero, V.Jr., Russo, M.A., Olson, N.J., Putkey, J.A., Means, A.R. (1986) Domain organization of chicken gizzard myosin light chain kinase deduced from a cloned cDNA. Biochemistry, 25, 8372-8381.

55. Hartshorne, D.J. (1998) Myosin phosphatase: subunit and interactions. Acta Physiol. Scand., 164,483-493.

56. Hartshorne, D.J., Ito, M., Erdodi, F. (1998) Myosin light chain phosphatase: subunit composition, interactions and regulations. J. Muscle Res. Cell Motil., 19,325-341.

57. Hashimoto, Y., Sasaki, H., Togo, M., Tsukamoto, K., Horie, Y., Fukata, H., Watanabe, Т., Kurokawa, K. (1994) Roles of myosin light-chain kinase in platelet shape change and aggregation. Biochim. Biophys. Acta, 1223,163-169.

58. Hashimoto, Y., Soderling, T.R. (1990) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II: comparative study of the phosphorylation sites. Arch. Biochem. Biophys., 278,41-45.

59. Hatch, V., Zhi, G., Smith, L., Stull, J.T., Craig, R., Lehman, W. (2001) Myosin light chain kinase binding to a unique site on F-actin revealed by three-dimensional image reconstruction. J. Cell. Biol., 154,611-617.

60. Hathaway, D.R., Adelstein, R.S. (1979) Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,1653-1657.

61. Hayakawa, K., Okagaki, Т., Higashi-Fujime, S., Kohama, K. (1994) Bundling of actin filaments by myosin light chain kinase from smooth muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun., 199,786-791.

62. Herring, B.P. (1991) Basic residues are important for Ca2+/calmodulin binding and activation but not autoinhibition of rabbit skeletal muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 266, 11838-11841.

63. Herring, B.P., Dixon, S., Gallagher, P.J. (2000) Smooth muscle myosin light chain kinase expression in cardiac and skeletal muscle. Am. J. Physiol., 279, C1656-C1664.

64. Herring, B.P., Fitzsimons, D.P., Stull, J.T., Gallagher, P.J. (1990b) Acidic residues comprise part of the myosin light chain-binding site on skeletal muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 265, 16588-16591.

65. Herring, B.P., Gallagher, P.J., Stull, J.T. (1992) Substrate specificity of myosin light chain kinases. J. Biol. Chem., 267,25945-25950.

66. Herring, B.P., Lyons, G.E., Hoggatt, A.M., Gallagher, P.J. (2001) Telokin expression is restricted to smooth muscle tissues during mouse development. Am. J. Physiol., 280, C12-C21.

67. Herring, B.P., Smith, A.F. (1996) Telokin expression is mediated by a smooth muscle specific promoter. Am. J. Physiol., 270, C1656-1665.

68. Herring, B.P., Stull, J.T., Gallagher, P.J. (1990a) Domain characterization of rabbit skeletal muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 265, 1724-1730.

69. Himpens, В., Matthijs, G., Somlyo, A.V., Butler, T.M., Somlyo, A.P. (1988) Cytoplasmic free calcium? Myosin light chain phosphorylation, and force in phasic and tonic smooth muscle. J. Gen. Physiol., 92, 713-729.

70. Holden, H.M., Ito, M., Hartshorne, D.J., Rayment, I. (1992) X-ray structure determination of telokin, the C-terminal domain of myosin light chain kinase, at 2.8 A resolution. J. Mol. Biol., 227, 840-851.

71. Horrowitz, A., Menice, C.B., Laporte, R., Morgan, K.G. (1996) Mechanisms of smooth muscle contraction. Physiol. Rev., 76,967-1003.

72. Johnson, J.D., Holroyde, M.J., Crouch, Т.Н., Solaro, R.J., Potter, J.D. (1981) Fluorescence studies of the interaction of calmodulin with myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 256,1219412198.

73. Johnson, J.D., Snyder, C., Walsh, M., Flynn, M. (1996) Effects of myosin light chain kinase and peptides on Ca2+ exchange with the N- and C-terminal Ca2+ binding sites of calmodulin. J. Biol. Chem., 271,761-767.

74. Kamisoyama, H., Araki, Y., Ikebe, M. (1994) Mutagenesis of the phosphorylation site (serine• 19) of smooth muscle myosin regulatory light chain and its effects on the properties of myosin. Biochemistry, 33, 840-847.

75. Kamm, K.E., Grange, R.W. (1996) Calcium sensitivity of contraction. In: Biochemistry of Smooth Muscle Contraction (Barany, M., ed.), Academic Press, NewYork, pp. 119-129.

76. Kanoh, S., Ito, M., Niwa, E., Kawano, Y., Hartshorne, D.J. (1993) Actin-binding peptide from smooth muscle myosin light chain kinase. Biochemistry, 32,8902-8907.

77. Kasturi, R., Vasulka, C., Johnson, J.D. (1993) Ca2+, caldesmon, and myosin light chain kinase exchange with calmodulin. J. Biol. Chem., 268,7958-7964.

78. Kelley, C.A., Takahashi, M., Yu, J.H., Adelstein, R.S. (1993) An insert of seven amino acids confers functional differences between smooth muscle myosins from the intestines and vasculature.• J. Biol. Chem., 268,12848-12854.

79. Kemp, B.E., Pearson, R.B. (1985) Spatial requirements for location of basic residues in peptide substrates for smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 260,3355-3359.

80. Kemp, B.E., Pearson, R.B., Guerriero, V.Jr., Bagchi, I.C., Means, A.R. (1987) The calmodulin binding domain of chicken smooth muscle myosin light chain kinase contains a pseudosubstrate sequence. J. Biol. Chem., 262,2542-2548.

81. Kemp, B.E., Pearson, R.B., House, C. (1983) Role of basic residues in the phosphorylation of synthetic peptides by myosin light chain kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,7471-7475.

82. Kerrick, W.G., Bourguignon, L.Y. (1984) Regulation of receptor capping in mouse lymphoma T cells by Ca2+-activated myosin light chain kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 165-169.

83. Klemke, R.L., Cai, S., Giannini, A.L., Gallagher, P.J., de Lanerolle, P., Cheresh, D.A. (1997) Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J. Cell. Biol., 137,481-492.

84. Kobayashi, H., Inoue, A., Mikawa, Т., Kuwayama, H., Hotta, Y., Masaki, Т., Ebashi, S. (1992) Isolation of cDNA for bovine stomach 155 kDa protein exhibiting myosin light chain kinase activity. J. Biochem., 112, 786-791.

85. Kolch, W. (2000) Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem J., 351,289-305.

86. Kolodney, M.S., Elson, E.L. (1995) Contraction due to microtubule disruption is associated with increased phosphorylation of myosin regulatory light chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10252-10256.

87. Krueger, J.K., Gallagher, S.C., Zhi, G., Geguchadze, R., Persechini, A., Stull, J.T., Trewhella, J. (2001) Activation of myosin light chain kinase requires translocation of bound calmodulin. J. Biol. Chem., 276,4535-4538.

88. Krueger, J.K., Olah, G.A., Rokop, S.E., Zhi, G., Stull, J.T., Trewhella, J. (1997) Structures of calmodulin and a functional myosin light chain kinase in the activated complex: a neutron scattering study. Biochemistry, 36,6017-6023.

89. Krueger, J.K., Padre, R.C., Stull, J.T. (1995) Intrasteric regulation of myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 270,16848-16853.

90. Krueger, J.K., Zhi, G., Stull, J.T., Trewhella, J. (1998) Neutron-scattering studies reveal further details of the Ca2+/calmodulin-dependent activation mechanism of myosin light chain kinase. Biochemistry, 37,13997-14004.

91. Krymsky, M.A., Kudryashov, D.S., Shirinsky, V.P., Lukas, T.J., Watterson, D.M., Vorotnikov, A.V. (2001) Phosphorylation of kinase-related protein (telokin) in tonic and phasic smooth muscles. J. Muscle Res. Cell Motil., 22,425-437.

92. MacDonald, J.A., Walker, L.A., Nakamoto, R.K., Gorenne, I., Somlyo, A.V., Somlyo, A.P. (2000) Phosphorylation of telokin by cyclic nucleotide kinases and the identification of in vivo phosphorylation sites in smooth muscle. FEBS Lett., 479,83-88.

93. Masato, Т., Numata, Т., Katoh, Т., Morita, F., Yazawa, M. (1997) Crosslinking of telokin to chicken gizzard smooth muscle myosin. J. Biochem. (Tokyo), 121,225-230.

94. Matsushima, S., Huang, Y.P., Dudas, C.V., Guerriero, V.Jr., Hartshorne, D.J. (1994) Mutants of smooth muscle myosin light chain kinase at tryptophan 800. Biochem. Biophys. Res. Commun., 202,1329-1336.

95. Meador, W.E., Means, A.R., Quiocho, F.A. (1992) Target enzyme recognition by calmodulin:• 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science, 257, 1251-1255.

96. Minajeva, A., Neagoe, C., Kulke, M., Linke, W.A. (2002) Titin-based contribution to shortening velocity of rabbit skeletal myofibrils. J. Physiol., 540,177-188.

97. Morgan, K.G., Khalil, R.A., Suematsu, E., Katsuyama, H. (1992) Calcium-dependent and calcium-independent pathways of signal transduction in smooth muscle. Jpn. J. Pharmacol., 58, Suppl 2,47P.

98. Morrison, D.L., Sanghera, J.S., Stewart, J., Sutherland, C., Walsh, M.P., Pelech, S.L. (1996) Phosphorylation and activation of smooth muscle myosin light chain kinase by MAP kinase and cyclin-dependent kinase-1. Biochem. Cell Biol., 74,549-557.

99. Mrwa, U. and Hartshorne, D.J. (1980) Phosphorylation of smooth muscle myosin and myosin• light chains. Fed. Proc., 39,1564-1568.

100. Murphy, R.A., Strauss, J.D. (1998) Ca2+, cross-bridge phosphorylation and vascular tone. Int. J. Cardiovasc. Med. Sci., 1,149-154.

101. Nieznanski, К., Sobieszek, A. (1997) Telokin (kinase-related protein) modulates the oligomeric state of smooth-muscle myosin light-chain kinase and its interaction with myosin filaments. Biochem. J., 322,65-71.

102. Nishikawa, M., Shirakawa, S., Adelstein, R.S. (1985) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by protein kinase C. Comparative study of the phosphorylated sites. J. Biol. Chem., 260, 8978-8983.

103. Numata, Т., Katoh, Т., Yazawa, M. (2001) Functional role of the C-terminal domain of smooth muscle myosin light chain kinase on the phosphorylation of smooth muscle myosin. J. Biochem. (Tokyo), 129,437-444.

104. Nunnally, M.H., Stull, J.T. (1984) Mammalian skeletal muscle myosin light chain kinases. A comparison by antiserum cross-reactivity. J. Biol. Chem., 259,1776-1780.

105. Okagaki, Т., Nakamura, A., Suzuki, Т., Ohmi, K., Kohama, K. (2000) Assembly of smooth muscle myosin by the 38k protein, a homologue of a subunit of pre-mRNA splicing factor-2. J. Cell Biol., 148,653-663.

106. Olson, N.J., Pearson, R.B., Needleman, D.S., Hurwitz, M.Y., Kemp, B.E., Means, A.R. (1990) Regulatory and structural motifs of chicken gizzard myosin light chain kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,2284-2288.

107. Olwin, B.B., Edelman, A.M., Krebs, E.G., Storm, D.R. (1984) Quantitation of energy coupling between Ca2+, calmodulin, skeletal muscle myosin light chain kinase, and kinase substrates. J. Biol. Chem., 259,10949-10955.

108. Padre, R.C., Stull, J.T. (2000) Conformational requirements for Ca(2+)/calmodulin binding and activation of myosin light chain kinase. FEBS Lett., 472,148-152.

109. Pato, M.D., Adelstein, R.S. (1980) Dephosphorylation of the 20,000-dalton light chain of myosin by two different phosphatases from smooth muscle. J. Biol. Chem., 255,6535-6538.

110. Pato, M.D., Kerc, E., Lye, S.J. (1995) Phosphorylation and partial sequence of pregnant sheep myometrium myosin light chain kinase. Mol. Cell. Biochem., 149/150,59-69.

111. Pearson, R.B., Misconi, L.Y., Kemp, B.E. (1986) Smooth muscle myosin kinase requires residues on the COOH-terminal side of the phosphorylation site. Peptide inhibitors. J. Biol. Chem., 261,25-27.

112. Pearson, R.B., Wettenhall, R.E., Means, A.R., Hartshorne, D.J., Kemp, B.E. (1988) Autoregulation of enzymes by pseudosubstrate prototopes: myosin light chain kinase. Science, 241, 970-973.

113. Persechini, A., Gansz, K.J., Paresi, R.J. (1996) A role in enzyme activation for the N-terminal leader sequence in calmodulin. J. Biol. Chem., 271,19279-19282.

114. Persechini, A. and Hartshorne, D.J. (1981) Phosphorylation of smooth muscle myosin: evidence for cooperativity between the myosin heads. Science, 213, 1383-1385.

115. Persechini, A. and Hartshorne, D.J. (1983) Ordered phosphorylation of the two 20 000 molecular weight light chains of smooth muscle myosin. Biochemistry, 22,470-476.

116. Persechini, A., McMillan, K., Leakey, P. (1994) Activation of myosin light chain kinase and nitric oxide synthase activities by calmodulin fragments. J. Biol. Chem., 269,16148-16154.

117. Pires, E., Perry, S.V., Thomas, M.A. (1974) Myosin light chain kinase, a new enzyme from striated muscle. FEBS Lett., 41,292-296.

118. Pires, E.M., Perry, S.V. (1977) Purification and properties of myosin light-chain kinase from fast skeletal muscle. Biochem. J., 167,137-146.

119. Poperechnaya, A., Varlamova, O., Lin, P.J., Stull, J.T., Bresnick, A.R. (2000) Localization and activity of myosin light chain kinase isoforms during the cell cycle. J. Cell. Biol., 151,697-708.

120. Potier, M.C., Chelot, E., Pekarsky, Y., Gardiner, K., Rossier, J., Turnell, W.G. (1995) The human myosin light chain kinase (MLCK) from hippocampus: cloning, sequencing, expression, and localization to 3qcen-q21. Genomics, 29,562-570.

121. Rasmussen, H., Forder, J., Kojima, I., Scriabine, A. (1984) TPA-induced contraction of isolated rabbit vascular smooth muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun., 122,776-784.

122. Rayment, I., Rypniewski, W.R., Schmidt-Base, K., Smith, R., Tomchick, D.R., Benning, M.M., Winkelmann, D.A., Wesenberg, G., Holden, H.M. (1993) Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: A molecular motor. Science, 261,50-58.

123. Rembold, C.M. (1992) Regulation of contraction and relaxation in arterial smooth muscle. Hypertension, 20, 129-137.

124. Roush, C.L., Kennelly, P.J., Glaccum, M.B., Helfman, D.M., Scott, J.D., Krebs, E.G. (1988) Isolation of the cDNA encoding rat skeletal muscle myosin light chain kinase. Sequence and tissue distribution. J. Biol. Chem., 263, 10510-10516.

125. Rusconi, F., Potier, M.C., Le Caer, J.P., Schmitter, J.M., Rossier, J. (1997) Characterization of the chicken telokin heterogeneity by time-of-flight mass spectrometry. Biochemistry, 36, 1102111026.

126. Samizo, K., Okagaki, Т., Kohama, K. (1999) Inhibitory effect of phosphorylated myosin light chain kinase on the ATP-dependent actin-myosin interaction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 261,95-99.

127. Sanders, L.C., Matsumura, F., Bokoch, G.M., de Lanerolle, P. (1999) Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase. Science, 283,2083-2085.

128. Sellers, J.R., Adelstein, R.S. (1987) Regulation of contractile activity. In: The Enzymes (Boyer, P.D., ed), Academic Press, Orlando, vol. XVIII, pp. 381-418.

129. Sellers, J.R., Pato, M.D. (1984) The binding of smooth muscle myosin light chain kinase and phosphatases to actin and myosin. J. Biol. Chem., 259,7740-7746.

130. Silver, D.L., Vorotnikov, A.V., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P., Sellers, J.R. (1997) Sites of interaction between kinase-related protein and smooth muscle myosin. J. Biol. Chem., 272, 2535325359.

131. Smith, J.L., Silveira, L.A., Spudich, J.A. (1996) Activation of Dictyostelium myosin light chain kinase A by phosphorylation of Thrl66. EMBO J., 15,6075-6083.

132. Smith, L., Parizi-Robinson, M., Zhu, M.S., Zhi, G., Fukui, R., Kamm, K.E., Stull, J.T. (2002) Properties of long myosin light chain kinase binding to F-actin in vitro and in vivo. J. Biol. Chem., 277,35597-35604.

133. Smith, L., Stull, J.T. (2000) Myosin light chain kinase binding to actin filaments. FEBS Lett., 480,298-300.

134. Smith, L., Su, X., Lin, P., Zhi, G., Stull, J.T. (1999) Identification of a novel actin binding motif in smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem., 274,29433-29438.

135. Sobieszek, A. (1977) Ca-linked phosphorylation of a light chain of vertebrate smooth-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 73,477-483.

136. Sobieszek, A. (1991) Regulation of smooth-muscle myosin-light-chain kinase. Steady-state kinetic studies of the reaction mechanism. Eur. J. Biochem., 199,735-743.

137. Somlyo, A.V., Butler, T.M., Bond, M., Somlyo, A.P. (1981) Myosin filaments have non-phosphorylated light chains in relaxed smooth muscle. Nature, 294,567-569.

138. Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. (1994) Signal transduction and regulation in smooth muscle. Nature, 372,231-236.

139. Somlyo, A.P., and Somlyo, A.V. (1998) From pharmacomechanical coupling to G-proteins and myosin phosphatase. Acta Physiol. Scand., 164,437-448.

140. Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. (2000) Signal transduction by G-proteins, rho-kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II. J. Physiol., 522, 177-185.

141. Spudich, J.A. and Watt, S. (1971) The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J. Biol. Chem., 246,4866-4871.

142. Stull, J.T., Hsu, L.C., Tansey, M.G., Kamm, K.E. (1990) Myosin light chain kinase phosphorylation in tracheal smooth muscle. J. Biol. Chem., 265, 16683-16690.

143. Stull, J.T., Tansey, M.G., Tang, D.-C., Word, R.A., Kamm, K.E., and Tang, D.C. (1993) Phosphorylation of myosin light chain kinase: a cellular mechanism for Ca2+-desensitization. Mol. Cell. Biochem., 127/128,229-237.

144. Suzuki, H., Onishi, H., Takahashi, K., Watanabe, S. (1978) Structure and function of chicken gizzard myosin. J. Biochem., (Tokyo), 84,1529-1542.

145. Sweeney, H.L., Bowman, B.F., Stull, J.T. (1993) Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function. Am. J. Physiol., 264, CI085-1095.

146. Takio, К., Blumenthal, D.K., Edelman, A.M., Walsh, K.A., Krebs, E.G., Titani, K. (1985) Amino acid sequence of an active fragment of rabbit skeletal muscle myosin light chain kinase. Biochemistry, 24, 6028-6037.

147. Tan, J.L., Spudich, J.A. (1991) Characterization and bacterial expression of the Dictyostelium myosin light chain kinase cDNA. Identification of an autoinhibitory domain. J. Biol. Chem., 266, 16044-16049.

148. Tanaka, M., Ikebe, R., Matsuura, M., Ikebe, M. (1995) Pseudosubstrate sequence may not be critical for auto inhibition of smooth muscle myosin light chain kinase. EMBO J., 14,2839-2846.

149. Tanaka, Т., Sobue, K., Owada, M.K., Hakura, A. (1985) Linear relationship between diphosphorylation of 20 kDa light chain of gizzard myosin and the actin-activated myosin ATPase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 131,987-993.

150. Taylor, S.S., Radzio-Andzelm, E. (1994) Three protein kinase structures define a common motif. Structure, 2,345-355.

151. Tokui, Т., Ando, S., Ikebe, M. (1995) Autophosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase at its regulatory domain. Biochemistry, 34, 5173-5179.

152. Totsukawa, G., Yamakita, Y., Yamashiro, S., Hosoya, H., Hartshorne, D.J., Matsumura, F. (1999) Activation of myosin phosphatase targeting subunit by mitosis-specific phosphorylation. J. Cell Biol., 144, 735-744.

153. Towbin, H., Staehlin, T. and Gordon, J. (1970) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76,4350-4354.

154. Toyoshima, Y.Y., Kron, S.J., McNally, E.M., Niebling, K.R., Toyoshima, C., Spudich, J.A. (1987) Myosin subfragment-1 is sufficient to move actin filaments in vitro. Nature, 328,536-539.

155. Trinick, J., Tskhovrebova, L. (1999) Titin: a molecular control freak. Trends Cell Biol., 9, 377-380.

156. Trotter, J.A., Adelstein, R.S. (1979) Macrophage myosin. Regulation of actin-activated ATPase, activity by phosphorylation of the 20,000-dalton light chain. J. Biol. Chem., 254, 87818785.

157. Trybus, K.M., Huiatt, T.W., Lowey, S. (1982) A bent monomelic conformation of myosin from smooth muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6151-6155.

158. Tsvetkov, P.O., Protasevich, I.I., Gilli, R., Lafitte, D., Lobachov, V.M., Haiech, J., Briand, C., Makarov, A.A. (1999) Apocalmodulin binds to the myosin light chain kinase calmodulin target site. J. Biol. Chem., 274,18161-18164.

159. Turner, J.R., Angle, J.M., Black, E.D., Joyal, J.L., Sacks, D.B., Madara, J.L. (1999) PKC-dependent regulation of transepithelial resistance: roles of MLC and MLC kinase. Am. J. Physiol., 277, C554-C562.

160. Verdecia MA, Bowman ME, Lu KP, Hunter T, Noel JP. (2000) Structural basis for phosphoserine-proline recognition by group IV WW domains. Nat. Struct. Biol. 7,639-643.

161. Venn, A.D., Lazar, V., Torry, R.J., Labarrere, C.A., Patterson, C.E., Garcia, J.G. (1998) Expression of a novel high molecular-weight myosin light chain kinase in endothelium. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 19,758-766.

162. Vorotnikov, A.V. (1997) Kinase-related protein: a smooth muscle myosin-binding protein. Int. J. Biochem. Cell Biol., 29,727-730.

163. Walsh, M.P. (1994) Calmodulin and the regulation of smooth muscle contraction. Mol. Cell Biochem., 135, 21-41.

164. Watterson, D.M., Collinge, M., Lukas, T.J., Van Eldik, L.J., Birukov, K.G., Stepanova, O.V., Shirinsky, V.P. (1995) Multiple gene products are produced from a novel protein kinase transcription region. FEBS Lett., 373, 217-220.

165. Wendt, Т., Taylor, D., Messier, Т., Trybus, K.M., Taylor, K.A. (1999) Visualization of head-head interactions in the inhibited state of smooth muscle myosin. J. Cell. Biol., 147,1385-1390.

166. Wysolmerski, R.B. and Lagunoff, D. (1990) Involvement of myosin light-chain kinase in• endothelial cell retraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,16-20.

167. Xie, X., Harrison, D.H., Schlichting, I., Sweet, R.M., Kalabokis, V.N., Szent-Gyorgyi, A.G., Cohen, C. (1994) Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 A resolution. Nature, 368,306-312.

168. Xu, J.-Q., Gillis, J.-M., Craig, R. (1997) Polymerization of myosin on activation of rat anococcygeus smooth muscle. J. Muscle Res. Cell Motil., 18,381-393.

169. Yamakita, Y., Yamashiro, S., Matsumura, F. (1994) In vivo phosphorylation of regulatory light chain of myosin II during mitosis of cultured cells. J. Cell. Biol., 124,129-137.

170. Yamashiro, S., Yamakita, Y., Hosoya, H., Matsumura, F. (1991) Phosphorylation of non-muscle caldesmon by p34cdc2 kinase during mitosis. Nature, 349,169-172.

171. Yamazaki, K., Itoh, K., Sobue, K., Mori, Т., Shibata, N. (1987) Purification of caldesmon and myosin light chain (MLC) kinase from arterial smooth muscle: comparisons with gizzard caldesmon and MLC kinase. J. Biochem. (Tokyo), 101,1-9.

172. Yang, K.X. and Black, J.L. (1996) Protein kinase С induced changes in human airway smooth muscle tone: the effects of Ca2+ and Na+ transport. Eur. J. Pharmacol., 315,65-71.

173. Yazawa, M., Yagi, K. (1978) Purification of modulator-deficient myosin light-chain kinase by modulator protein-Sepharose affinity chromatography. J. Biochem. (Tokyo), 84,1259-1265.

174. Yoshikay, S., Ikebe, M. (1992) Molecular cloning of the chicken gizzard telokin gene and cDNA. Arch. Biochem. Biophys., 299,242-247.

175. Zhi, G., Herring, B.P., Stull, J.T. (1994) Structural requirements for phosphorylation of myosin regulatory light chain from smooth muscle. J. Biol. Chem., 269,24723-24727.

176. Zhou, X.Z., Lu, P.J., Wulf, G., Lu, K.P. (1999) Phosphorylation-dependent prolyl isomerization: a novel signaling regulatory mechanism. Cell. Mol. Life. Sci. 56,788-806.

Информация о работе

Хапчаев, Аскер Юсуфович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы